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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIRIQUÍ

ESCUELA DE MEDICINA
BIOQUÍMICA MED 300
TERCER AÑO
LABORATORIO 9
DESHIDROGENASA SUCCINICA DEL HÍGADO
FACILITADORA: YOLANDA TEM
INTEGRANTES: AILYN RODRÍGUEZ 9-749-1910, NELSON DELGADO 8-921-2137, EIBAR
CAMARENA 4-778-2000 Y JONATHAN LEZCANO 4-770-475.
RESUMEN:

OBJETIVOS:

MARCO TEORICO:

MATERIALES Y REACTIVOS:
Tabla N.1 Materiales

Cantidad Descripción Capacidad


14 Tubos de ensayo -
1 Balanza -
1 Vaso químico 250 mL
1 Plancha -
1 licuadora 16 Oz
6 goteros ≈1mL
Tabla N.2. Reactivos

Nombre Fórmula Conc. Cant. Toxicidad


Fosfato monobásico de sodio Irritante
NaH2PO4 0,1M 25mL

2,6-diclorofenolindofenol Carcinógeno
0,02% 15mL irritante
C₁₂H₆Cl₂NNaO₂ * 2
H₂O,

Azul de Metileno Alergias


C16H18N3ClS 0,02% 15mL

Malonato de sodio Toxico en grandes


CH2(COO)22- 0,2M 15mL cantidades

Succinato de sodio 0,1M Irritante toxico


HOOC-(CH2)2- 15mL
COOH

Azida de sodio 0,2M Toxico por


NaN3 ingestión
15mL

Cianuro de sodio 0,2M Toxico por


NaCN 15mL ingestión e
inhalación

Aceite de cocina -- - 15mL Toxicidad leve

PROCEDIMIENTO:

1. Preparación del Homogenizado del hígado de pollo:

• Se corto y pesar 60g de hígado de pollo y luego se licuo


Paso 1

• Se homogenizo el hígado licuando junto con 100mL de agua


Paso 1

• Luego 40 mL del homogenizado se diluyo en 200mL de agua.


• Posteriormente se agito vigorosamente y la preparción resultante se empleo en
Paso 3 las pruebas.

2. Pruebas Cualitativas:
• 0.5 mL de amortiguador, 0 mL de sustrato, 1mL de agua destilada, 1mL de
Tubos homogenizado y 1mL de DICPIP (1) y 1mL de Azul de metileno (2)
1y1

• 0.5 mL de amortiguador, 0.5 mL de sustrato, 0.5mL de agua destilada, 1mL de


Tubos homogenizado y 1mL de DICPIP (1) y 1mL de Azul de metileno (2)
2y2

• 0.5 mL de amortiguador, 0.5 mL de sustrato, 0.5mL de agua destilada, 1mL de


Tubos homogenizado y 1mL de DICPIP (1) y 1mL de Azul de metileno (2) (Se
3y3
calientan a 52°C antes de la adicion del homogenizado).

• 0.5 mL de amortiguador, 0.5 mL de sustrato, 0.5 mL de malonato de sodio,


Tubos 1mL de homogenizado y 1mL de DICPIP (1) y 1mL de Azul de metileno (2)
4y4

• 0.5 mL de amortiguador, 0.5 mL de sustrato, 0.5 mL de azida de sodio, 1mL


Tubos de homogenizado y 1mL de DICPIP (1) y 1mL de Azul de metileno (2)
5y5

• 0.5 mL de amortiguador, 0.5 mL de sustrato, 0.5 mL de cianuro de sodio, 1mL


Tubos de homogenizado y 1mL de DICPIP (1) y 1mL de Azul de metileno (2)
6y6

RESULTADOS:

Imagen 1. Resultados de la prueba Imagen 2. Resultados de la prueba


utilizando como indicador el Azul de utilizando como indicador el 2,6-
Metileno. diclofenolindofenol 0,02%.

PRUEBA N.1 CON AZUL DE METILENO:

N. de Tiempo de cambio en la Inhibidor N. Efectividad Coloración


Tubo coloración de
tubo
1 No hubo decoloración Malonato 4 Efectivo Azul intenso
de sodio
2 36 minutos Azida de 5 Parcialmente Celeste-
sodio efectivo Turquesa
3 No hubo decoloración Cianuro 6 No efectivo Con un aspecto
de sodio crema
blancuzco
4 Prácticamente no hubo
decoloración 1:09:00
5 56 minutos
6 46 minutos
Efectividad de los Inhibidores adicionados en la
Prueba de acción catalítica de la Deshidrogenasa
succínica con el indicador: Azul de Metileno
Tiempos de cambios en la coloración en la
prueba de acción catalítica de la
Deshidrogenasa succínica con el indicador:
Azul de Metileno.

PRUEBA N.2 CON EL DICPIP:


N. de Tiempo de cambio Inhibidor N. de Efectividad Coloración
Tubo en la coloración tubo
1 No hubo decoloración Malonato de 4 Efectivo Azul intenso
sodio
2 8 minutos Azida de 5 Parcialmente Celeste-
sodio efectivo Turquesa
3 No hubo decoloración Cianuro de 6 No efectivo blanco
sodio
4 Prácticamente no
hubo decoloración
5 46 minutos
6 15 minutos

DISCUSIÓN:

Para nuestro experimento se preparó un homogenizado de hígado y se distribuyó a


diferentes tubos de ensayo con reactivos diferentes con el fin de observar la actividad
enzimática que se daba en cada uno.

Como se menciona en el marco teórico la deshidrogenasa succínica en presencia de


succinato y de un aceptor de hidrógenos adecuado, cataliza la reacción estereoespecífica
de succinato a fumarato mediante la siguiente reacción según Fornaguera & Gómez
(2005):
En nuestra experiencia para comprobar esta reacción se utilizó dos indicadores diferentes
el azul de metileno y el 2,6-diclorofenolindofenol que como explica Cifield & Donne (2011)
estos compuestos son indicadores redox que permiten identificar la sucesión de
reacciones por movimiento electrónico y así identificar la presencia de reacciones
reducción-oxidación, ambos mediante el paso de un color azulado puro a un color
aclarado, la única diferencia reside en la velocidad en la que captan hidrógenos ambos
indicadores siendo la del 2,6- diclorofenolindofenol un poco más lenta pero básicamente
igual al azul de metileno.
Se utilizaron 6 tubos con los reactivos en diferente cantidad donde:

En el tubo N.1 no hubo cambió en la coloración al añadirle el indicador, debido a la


ausencia de sustrato. así que para ninguno de los dos indicadores se mostró un cambio
al dejarlo en el tiempo y así como menciona Page & Williams (1987) las enzimas
actúan sobre sustratos, que son el activo o sustancia al cual catalizan, disminuyendo
su energía de activación y acelerando la formación de productos; si el sustrato no se
presenta la acción enzimática no se presenta.

El tubo N. 2 presentaba las condiciones necesarias para llevar a cabo la actividad de


la enzima y se observa el cambio de color más rápidamente, como explica Lowenstein
(1969) en el ciclo de Krebs se da la reacción de oxidación del succinato al fumarato,
en este proceso libera hidrógenos en el medio debido a esto si se cuenta con el
indicador redox adecuado este captara los hidrógenos del medio y se observara un
cambio de coloración característico de la reacción. El tiempo de reacción se debe a
su medio, el cual fue óptimo para que se diera la reacción tanto en pH como en
temperatura, el fundamento de reacción del indicador es el mismo que ocurre para los
siguientes tubos.

En el tubo N.3 se emplearon las mismas cantidades de reactivo, pero se usó una
enzima calentada previamente a 52°C; esto produce la desnaturalización de la enzima
en el hígado, esto es algo observado en previos laboratorios, la estructura proteica de
la enzima pierde su forma y esto provoca que su función se vea disminuida o detenida
en su totalidad según Macarulla (1994) que nos dice que el aumento de velocidad de
la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad
catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece
rápidamente hasta anularse.

Por otro lado, en los tubos 4, 5, 6 el tiempo necesario para el cambió de coloración se
vio afectados debido a que se añadió 3 inhibidores diferentes a cada uno, malonato
de sodio, azida de sodio y cianuro de sodio respectivamente para evaluar su efecto en
la reacción, se observó que el tubo # 6 con cianuro de sodio fue el primero en cambiar
de color por lo que demuestra ser un mal inhibidor para esta enzima. Mientras que el
tubo 5 decoloró menos y el 4 demostró que, si se había inhibido la reacción, tomando
en cuenta que el inhibidor en este tubo (ósea el más efectivo) según el resultado fue
el malonato de Sodio. Y lo comprobamos según Voet (2013) que nos dice que la
deshidrogenasa succínica es fuertemente inhibida por el malonato, un análogo
estructural del succinato, uniéndose al sitio activo de la enzima, por lo que es conocido
como un ejemplo de inhibidor competitivo. No obstante, los otros inhibidores (cianuro
y la azida de sodio) actúan como tóxico a través de la inhibición del complejo citocromo
c-oxidasa que según Voet (2013) se encuentra formando parte del complejo IV del
sistema de transporte de electrones y por ende bloqueara la cadena transportadora de
electrones, pero que no actúan directamente sobre el sitio activo de la enzima se
obtuvo un cambio de coloración demostrando la acción sobre el sustrato de la enzima.
Además, debemos saber que el succinato añadido se puede convertir en oxalacetato
por medio de los enzimas del ciclo y, por tanto, estimula la oxidación del piruvato, pero
el malonato es un inhibidor competitivo de la reacción del succinato deshidrogenasa y
bloquea la transformación del succinato a fumarato. Por esta razón Voet (2013)
bloquea el flujo de metabolitos a través del ciclo, porque se une al sitio activo del
succinato deshidrogenasa en el ciclo del ácido cítrico, pero no reacciona, compitiendo
con el succinato. Aunado a esto en la reacción de fosforilación oxidativa, según Voet
(2013) el malonato es un inhibidor del complejo II que, nuevamente, contiene succinato
deshidrogenasa, deteniendo completamente la oxidación del piruvato y esto fue
comprobado ya que el color de este tubo no cambio y siguió azul completamente dando
como resultado y comprobando su acción como inhibidor más efectivo.

Con lo que respecta al azul de metileno el resultado fue mucho más lento, pero los
cambios fueron similares al 2,6-diclorofenolindofenol. Y de esta manera
experimentalmente se comprobó cómo los inhibidores son substancias que se enlazan
a alguno de los componentes de la cadena de transporte de electrones bloqueando su
capacidad para cambiar de una forma reversible desde la forma oxidada a la forma
reducida y viceversa, según Horton (2008) lo que hace que no se libere energía y la
síntesis de ATP también se detenga.

CONCLUSIONES:

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
Voet, D. (2013). Fundamentos de Bioquímica. España: Médica Panamericana.
Azañero, C. (2009). Ciclo de Krebs. Recuperado el 23 de mayo de 2017 de:
https://www.slideshare.net/azanero33/ciclo-de-krebs-1652741.
Pérez, G. (2016). Ciclo de Krebs. Recuperado el 23 de mayo de 2017 de:
http://www.ciclodekrebs.com/etapas_del_ciclo_de_krebs.
Macarulla. J y Goñi. F. (1994). Bioquímica humana. Recuperado el 23 de mayo de
2017 de:
https://books.google.com.pa/books?id=4h_IosytGvkC&pg=PA229&dq=fermentacion+
anaerobia&hl=es&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q=fermentacion%20anaerobia&f=f
alse.
Cañas A. (2015). Manual de laboratorio. Bioquímica Recuperado el 23 de mayo de
2017 de: https://anacanas.files.wordpress.com/2015/09/prc3a1ctica-5.pdf.
González, M. (2010). Química. Indicador redox. Recuperado el 23 de mayo de 2017
de:http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/indicador-redox.
Fornaguera, J., & Gómez, G. (2005). Bioquímica. Costa Rica: Universidad Estatal a
Distancia.
Horton, H. (2008). Principios de Bioquímica. México: Pearson Education

CUESTIONARIO: