Termodinmica y Cintica Qumica

rea de Qumica Fsica

Prctica 5
ESTUDIO NUMRICO DE LA CINTICA DE UNA REACCIN
ENZIMTICA
1. Objetivo
Se emplear un programa informtico de clculo que permite obtener la variacin de las concentraciones
de reactivos, intermedios y productos de una reaccin enzimtica con el tiempo. A partir de esos datos
se obtendr la velocidad de reaccin, se verificar la ecuacin de Michaelis-Menten y se extraer la
correspondiente constante de Michaelis.
2. Fundamento terico
2.1. Actividad enzimtica
Los enzimas son protenas altamente especializadas que catalizan numerosas reacciones en los
sistemas biolgicos. Una propiedad importante es su especificidad a la hora de reaccionar con sustratos,
acelerando determinadas reacciones qumicas en disolucin.
En general, un enzima proporciona el ambiente en que una reaccin determinada es,
energticamente, ms favorable. El rasgo distintivo de una reaccin catalizada enzimticamente es que
ocurre en un lugar especfico del enzima, el sitio activo. La molcula fijada en el sitio activo y sobre la
que acta el enzima se denomina sustrato. El complejo enzima-sustrato formado es de vital
importancia para definir el comportamiento cintico de las reacciones catalizadas. Una reaccin
enzimtica sencilla puede formularse como sigue:

k1

k2

E + S
 ES
 E + P

[1]

k-1
donde E, S y P representan enzima, sustrato y producto, respectivamente. ES y EP son complejos del
enzima con el sustrato y con el producto.
La funcin del catalizador es aumentar la velocidad de una reaccin reduciendo la energa de
activacin de la misma, Ea. Los catalizadores no modifican los equilibrios de la reaccin ni se consumen
durante el proceso.

2.2. Velocidad de reaccin. Mecanismo de Michaelis-Menten

La velocidad de una reaccin cualquiera viene determinada por la concentracin de reactivo/s y
por una constante de velocidad, k, y expresada por una ley de velocidad. Por ejemplo para una reaccin
unimolecular o de primer orden, S P, la cantidad de S que ha reaccionado por unidad de tiempo viene
dado por la siguiente expresin:

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V =

d [S ] d [P ]
=
= k [S ]
dt
dt

[2]

donde k, tiene unidades de s-1 y S de moll-1. As pues, la concentracin de sustrato, [S], afecta a la
velocidad de una reaccin catalizada por un enzima.
No obstante, el estudio del efecto de [S] en una reaccin enzimtica no es simple. Este tipo de
comportamiento cintico es explicado por la teora de Michaelis y Menten, que postula que el enzima se
combina con el sustrato en un paso reversible rpido, para dar el complejo ES, segn se muestra en la
reaccin [4].

k1

k2

E + S
 ES E + P

[4]

k-1
La reaccin de esta forma alcanza rpidamente un estado estacionario en el que [ES] permanece
aproximadamente constante con el tiempo. El complejo ES se descompone seguidamente en un segundo
paso ms lento que limita la velocidad de la reaccin global dando el enzima libre E y el producto de
reaccin P. Por tanto la ley de velocidad para la reaccin global viene determinada por la etapa ms
lenta, segn indica la ecuacin [5]:

V = k 2 [ES ]

[5]

donde V se determina por la descomposicin de ES. Bajo las condiciones de estado estacionario
([ES]=cte) la velocidad del proceso se mantiene constante en los primeros estadios de la reaccin y
coincide con la velocidad inicial, Vo. Experimentalmente Vo puede determinarse calculando la pendiente
de la representacin de [P] frente al tiempo (ecuacin [2]).
Adems, a medida que la concentracin inicial de S aumenta, desplazando el equilibrio hacia la
formacin de ES, tambin lo hace Vo hasta alcanzar un valor constante. Este valor final se denomina
velocidad mxima, Vmax. Esto se observar cuando prcticamente todo el enzima est formando
complejo ES y la concentracin de E libre sea extremadamente pequea ([ES]=[Et], donde Et es la
concentracin total de enzima utilizada). En estas condiciones, el enzima est saturado por el sustrato, de
forma que un aumento adicional en la [S] ya no tiene efecto sobre la velocidad inicial del proceso. De
esta manera, se puede definir que Vmax = k2[Et], la cual vara de un enzima a otro, y donde k2 se define de
manera general como kcat, una constante de velocidad de primer orden que se denomina nmero de
recambio.
Utilizando la aproximacin del estado estacionario, se obtiene la Ecuacin de Michaelis-Menten:

Vo =

Vmax [ S ]
Km + [S ]

[6]

donde

Km =

k 1 + k 2
k1

[7]

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es la constante de Michaelis. Esta constante depende de las velocidades relativas de las dos etapas en
las que se divide el mecanismo de Michaelis-Mente. Valores pequeos de Km implican que el complejo
enzima-sustrato es muy estable y no se disocia fcilmente para formar el producto final.
La recoleccin de datos de velocidades iniciales frente a concentraciones variables de substrato permite
extraer la velocidad mxima y la constante de Michaelis. Tradicionalmente esto se hace mediante una
grfica de Lineweaver-Burk, en el que se representan los inversos de las velocidades iniciales frente al
inverso de la concentracin de sustrato. Sin embargo, resulta ms preciso utilizar una grfica de EadieHofstee. Este anlisis est basado en la siguiente ecuacin1:

V0 = K m

V0
+V
[S ] max

[7]

De esta forma, representando las velocidades iniciales frente al cociente de esas mismas velocidades
obtiene una lnea recta cuya pendiente es la constante de Michaelis cambiada de signo.
Los parmetros cinticos kcat y Km son tiles para el estudio y comparacin de los diversos enzimas a
travs de su eficiencia cataltica. La eficiencia cataltica se define como la relacin entre ambos (kcat/Km).
3. Procedimiento de clculo
Para resolver la cintica de la reaccin enzimtica [1] y mecanismos afines, se emplear el programa
Kintecus2. Este programa realiza una integracin numrica de las ecuaciones de velocidad a partir de un
determinado mecanismo de reaccin. A partir de una serie de datos de entrada (concentraciones
iniciales, constantes de velocidad, temperatura) obtiene las concentraciones de todas las especies
involucradas en funcin del tiempo.
3.1. Ejecucin del programa Kintecus
Sigue los siguientes pasos (debes tener un ordenador en Windows con el programa Excel en condiciones
de funcionamiento)
1) Descrgate de la pgina web de la asignatura el fichero comprimido ENZIMA.zip.
Descomprmelo en una carpeta abierta al efecto. Comprueba que tienes dos ficheros:
Kintecus.exe y CineticaEnzimatica.xls
2) Comprueba en la configuracin regional de tu ordenador (Panel de control) que est
seleccionado el punto como separador de decimales y la coma como separador de miles.
3) Abre el fichero de Excell CineticaEnzimatica.xls. Si pregunta por habilitar macros? contestar
SI. Si no permite habilitar los macros por cuestiones de seguridad ve en el men de Excell a
Herramientas
Macros y selecciona el nivel bajo de Seguridad.
4) Una vez est el fichero CineticaEnzimatica.xls abierto y con los macros habilitados dispones ya
del banco de trabajo donde realizar tus clculos. El fichero de Excell consta de las siguientes
hojas de clculo (comprueba en lneas generales lo que hay en ellas):

Una hoja o pgina de CONTROL desde donde se controla el programa y que es la

primera que aparece.

Para obtener esta ecuacin a partir de la frmula de Michaelis-Menten [6], invirtela y multiplica por
Vmax. Reordenando y despejando V0 llegas a [7]
2
Consulta la pgina www.kintecus.com
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Una hoja MODEL en el que se especifican todas las reacciones del mecanismo de tu
reaccin, incluyendo las constantes de velocidad.
Una hoja SPECIES en el que se especifican las concentraciones iniciales de las
especies qumicas involucradas
Una hoja PARM en el que se especifican parmetros numricos del clculo tales como
el tiempo total del clculo y el paso de tiempo.
Una hoja HELP con instrucciones de ayuda.

5) Ve a la hoja CONTROL e introduce en la casilla correspondiente (Kintecus PATH) la direccin

completa de la carpeta en la que te encuentras en tu ordenador (por ejemplo: C:\Documents and
Settings\Administrador\Escritorio\Practica)
6) Ve a la hoja PARM y selecciona las unidades de concentracin en Moles/litro y el tiempo total de
simulacin.
7) Ve a la hoja SPECIES y fija las concentraciones iniciales de todas las especies.
8) Ve a la hoja de CONTROL y presiona el botn RUN. Se abrir entonces una pantalla de
windows. Teclea entonces la tecla ENTER tres veces. El clculo se ejecutar en unos pocos
segundos. Si la ejecucin ha sido exitosa, en la carpeta se habrn creado una serie de ficheros
de los cuales el ms importante es uno llamado CONC.TXT. Comprueba que este fichero se ha
creado.
9) Para representar los resultados presiona en la hoja de control la tecla PLOT RESULTS. Se
crearn entonces dos nuevas hojas: una hoja denominada CONC en el que estn escritas todas
las concentraciones en funcin del tiempo y una hoja denominada CONCENTRATIONS en el
que se representan grficamente dichas concentraciones.
3.2. Ejecucin del programa para un ejemplo de referencia.
Con la ayuda del profesor ejecuta el programa para los siguientes datos3 (ejemplo sin inhibidor)
Mecanismo de reaccin: (E= enzima, S= substrato, I=inhibidor, P=producto)
Reaccin
Constantes de Velocidad Constantes de Equilibrio*
E+S==>ES
5.00E+06
75
ES ==> E+S
66666.66667
E+I==>EI
8.50E+06
1000
EI==>E+I
ES+I==>EIS
9.57E+06
1000
EIS==>ES+I
EI+S==>EIS
5.53E+07
1000
EIS==>EI+S
EI+P==>EIS
7.13E+06
1000
EIS==>EI+P
ES==>E+P
1.14E+05
*Las constantes de equilibrio fijan la constante de velocidad de la reaccin inversa (Keq = KD/KI)

Muchos de esos datos pueden aparecer ya por defecto en el fichero Excel que has descargado al inicio
de la prctica. En ese caso no modifiques nada.
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Tiempo total de simulacin: 30 minutos

Concentraciones iniciales(moles/litro):
E

4 10-9

EI e I

0.01

EIS

ES

Representa los resultados de las concentraciones y observa qu ocurre con cada una de las especies.
Cmo evoluciona la concentracin de sustrato y producto? Qu le pasa a la concentracin de enzima y
a la del complejo enzima-sustrato? Es vlida la aproximacin de estado estacionario en la cual se
sustenta la ecuacin de Michaelis-Menten?
3.3. Verificacin del mecanismo de Michaelis-Menten y extraccin de la constante y de la velocidad
mxima.
Repite el ejemplo del punto 3.2 para las siguientes concentraciones de sustrato: 0.01M (ya la tienes),
0.02M, 0.05M, 0.1M, 0.15M, 0.2M, 0.5M, 1.0M, 1.5M y 2.0 M. Anota las velocidades iniciales de formacin
de producto a partir de las pendientes iniciales de las correspondiente concentracin de producto en
funcin del tiempo.
Representa la velocidad inicial en funcin de la concentracin de sustrato. Qu observas?
Elabora la correspondiente grfica de Eadie-Hofstee, haz un ajuste lineal y extrae la constante de
Michaelis, la velocidad mxima y el coeficiente de correlacin.
3.4. Anlisis del efecto de un inhibidor
Repite los clculos del punto 3.3 pero para una concentracin inicial de inhibidor de 4 10-4 M.
Representa conjuntamente los datos de velocidad sin y con inhibidor frente a la concentracin de
substrato. Qu observas?. Elabora la grfica de Eadie-Hofstee para el caso con inhibidor y extrae de
nuevo la velocidad mxima y la constante de Michaelis. Representa conjuntamente los datos sin y con
inhibidor y comenta los resultados.
3.4. Anlisis del metabolismo del etanol en el hgado humano
El etanol se metaboliza en el hgado a travs de la enzima alcohol deshidrogenasa heptica (NADP+).
Conforme a la base de datos BRENDA4, una enzima similar humana (con el etanol como sustrato) tiene
una constante de Michaelis de 0.45 mM y un nmero de recambio de 30.7 s-1. Asumiendo la misma
concentracin de enzima que la que has tenido en cuenta hasta el momento, e ignorando el efecto de
inhibidores, realiza simulaciones con Kintecus para estudiar este proceso. Elabora una grfica en la que
se muestre la destruccin de alcohol con el tiempo en el hgado. Estima cual sera el tiempo de duracin
de una resaca si suponemos que ste es el tiempo necesario para que la concentracin de alcohol se
reduzca a un 10% de su valor inicial. Extiende el tiempo de simulacin si es necesario. Considera
tambin otros valores alternativos de las constantes cinticas tambin asumibles en este caso a partir de
la base de datos BRENDA.

http://www.brenda.uni-koeln.de
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