PRQ 301 L LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

M. Sc. VIRGINIA JUDITH ROJAS MERCADO

PRÁCTICA # 1
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE CONCENTRACIÓN CELULAR
1. OBJETIVO
Realizar la determinación cuantitativa de la concentración celular por diferentes
métodos 2. FUNDAMENTO TEÓRICO

La concentración de la biomasa microbiana es un parámetro importante que debe estimarse en

diversos bioprocesos. Existen diversos métodos directos e indirectos para estimar la biomasa
de un cultivo, entre estos:

a. Método turbidimétrico
b. Recuento directo en microscopio
c. Determinación de la masa seca
d. Método de centrifugación

MÉTODO TURBIDIMÉTRICO.-
Entre los métodos directos más comunes para cuantificar la biomasa microbiana en una
muestra líquida se encuentra la turbidimetría. La turbidez de una suspensión microbiana es el
resultado de la dispersión de la luz por las células. Como la cantidad de luz dispersada en una
suspensión es directamente proporcional al número de células, el crecimiento microbiano (que
implica un aumento en el número de células) se refleja en un aumento en la turbidez de la
suspensión. Los cambios en la turbidez de un líquido se determinan en un espectrofotómetro,
el cual mide la cantidad de luz que pasa a través de un medio líquido. El crecimiento se reporta
como un cambio en la densidad óptica (DO), el cual es directamente proporcional a la
concentración celular. Es posible relacionar la DO de una suspensión microbiana con el número
de células o la masa celular que hay en dicha muestra.

El proceso turbidimétrico está basado en la comparación de la absorbancia de una sustancia de

concentración desconocida con la de una solución de la misma sustancia cuya concentración se
conoce y a la cual se denomina solución patrón o estándar.

La absorción de luz por parte de las sustancias es una propiedad característica de ellas, que
puede ser utilizada para su cuantificación y/o identificación. Todas las sustancias absorben luz
en alguna región del espectro electromagnético (visible, UV.)

Lambert y Beer, demostraron que la absorbancia(A), también llamada densidad óptica de una
sustancia es directamente proporcional a la concentración(C) de la sustancia absorbente, la
longitud(l) del paso de la luz (espesor de la solución) y a una constante denominada coeficiente
de extinción específica (E), que es característico para cada sustancia a una longitud de onda,
determinada.

A=E * l *C = - log T
Donde T es la transmitancia.

Para medir la concentración de una sustancia se eligen en general la región de máxima

absorción del espectro, denominada longitud de onda analítica.
Para realizar estas determinaciones, se realiza previamente una curva de calibrado que consiste
en la determinación de la absorbancia o transmitancia de una serie de soluciones de
concentraciones conocidas de una misma sustancia tratadas con un mismo método y medida
en el mismo instrumento.
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RECUENTO DIRECTO EN MICROSCOPIO.-

Con la ayuda del microscopio y una cámara de recuento es posible contar el número de células
en un volumen determinado demuestra. Las cámaras de recuento sirven para cuantificar el
número de partículas (p.ej. bacterias, esporas fúngicas, polen) por unidad de volumen en un
líquido, a través de su conteo visual bajo un microscopio. A la fecha, el tipo de cámara más
utilizado para el recuento directo de células, es la cámara de Neubauer (o hemocitómetro); esta
es una pieza de cristal grueso con el tamaño de un portaobjetos, en donde se coloca un
pequeño volumen de la suspensión a analizar.

Este método y otros se verán más detalladamente en la clase

3. MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES:

• Matraz aforado de 250, 100, 50 y 10 ml.

• Pipeta volumétrica de 10, 5, 1 y 0,5 ml.
• Vaso de precipitado de 100 y 500 ml.
• Vidrio de reloj
• Espátula
• Hornilla
• Varilla de vidrio
• Tubos de centrífuga de 30 o 50 ml

EQUIPOS:
• Shaker
• Balanza Analítica
• Espectrofotómetro.
• Centrifugadora.

REACTIVOS:

• Agua destilada.
• Alcohol.
4. PROCEDIMIENTO

a. DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN EN EL PROCESO TURBIDIMÉTRICO

 Actividades:

1. Lavar material.
2. Colocar agua en un recipiente de acero inoxidable y calentar.
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3. Pesar (en un vaso de 50 ml) la cantidad suficiente de la levadura para preparar
250 ml de suspensión de concentración indicada por el docente x (g levadura
seca/l).
4. Colocar la levadura en un vaso de precipitado de 250 ml con agua destilada.
5. Desactivar la levadura de baño María en ebullición durante 5 min.
6. Dejar enfriar la suspensión.
7. Colocar la suspensión en matraz aforado de 250 ml.
8. Completar el volumen a 250 ml.
9. Por dilución preparar suspensiones de:

GRUPO 1
(g/l Dilución
)

0,1 5:50

0,3 15:50

0,5 25:50

0,7 35:50

0,9 45:50

TOTAL 125

GRUPO 2
(g/l Dilución
)

0,2 5:25

0,4 10:25

0,6 15:25

0,8 20:25

TOTAL 50
 10. Realizar la lectura en el espectrofotómetro.

b) MÉTODO DE CENTRIFUGACIÓN
1. Lavar material.
2. Secar los 8 tubos Falcon a una temperatura de 60°C en la estufa.
3. Colocar agua en un recipiente de acero inoxidable y calentar.
4. Pesar (en un vaso de 50 ml) la cantidad suficiente de levadura para preparar
250 ml de suspensión de concentración indicada por el docente (g de lev
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seca/litro).
5. Considerando que la levadura tiene 70,28 % de humedad expresada en base
húmeda.
1. Colocar la levadura en un vaso de precipitado de 250 ml con agua destilada
2. Desactivar la levadura en baño María en ebullición durante 5 minutos. 3.
Dejar enfriar la suspensión.
4. Colocar la suspensión en el matraz aforado de 250 ml.
5. Completar el volumen a 250 ml con agua destilada.
6. Por dilución preparar suspensiones de:
GRUPO 1
(g/l Dilución
)

2 40:100

3 60:100

4 80:100

TOTAL 180

7. Armar el equipo de centrifugado.

8. Sacar los tubos FALCON de la estufa de secado.
9. Colocarlas en el desecador para que enfríen.
10. Etiquetar los tubos.
11. Pesar cada tubo.
12. Registrar el peso.
13. Centrifugar por un tiempo de 10 minutos.
14. Desechar el sobrenadante.
15. Secar los tubos (en estufa) hasta peso constante.
16. Colocarlos en el desecador para que enfríen.
17. Pesar cada tubo.
18. Registrar el peso.
19. Por diferencia de peso calcular la concentración.
c) MÉTODO DE FILTRADO AL VACÍO O MASA SECA
 1. Lavar material.
2. Secar las membranas sobre cajas Petri a una temperatura de 60°C.
3. Colocar agua en la olla y calentar.
4. Pesar (en un vaso de 50 ml) la cantidad suficiente de levadura para
preparar 250 ml de suspensión de concentración indicada por el docente
(g de lev seca/litro).
5. Considerando que la levadura tiene 70,28 % de humedad expresada en
base húmeda.
6. Colocar la levadura en un vaso de precipitado de 250 ml con agua
destilada.
7. Desactivar la levadura en baño María en ebullición durante 5 minutos.
8. Dejar enfriar la suspensión.
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9. Colocar la suspensión en el matraz aforado de 250 ml.
10. Completar el volumen a 250 ml con agua destilada.
11. Por dilución preparar suspensiones de:
GRUPO 1
(g/l) Dilución

2 40:100

3 60:100

4 80:100

TOTAL 180

12. Armar el equipo de filtración al vacío.

13. Sacar las membranas de la estufa de secado.
14. Colocarlas en el desecador para que enfríen.
15. Enumerarlas con lápiz.
16. Pesar cada membrana.
17. Registrar el peso.
18. Filtrar 20 ml de cada suspensión (por duplicado).
19. Secar las membranas (en estufa a 60°C) hasta peso constante.
20. Colocarlas en el desecador para que enfríen.
21. Pesar cada membrana.
22. Registrar el peso.
23. Por diferencia de peso calcular la concentración.

d) MÉTODO DE MICROSCOPÍA
1. Homogeneizar la muestra, tomar un pequeño volumen con una pipeta o gotero y colocar
una gota cuidadosamente en la cámara de Neubauer, cubrir con el cubreobjetos y observar al
microscopio.

2. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel suave 3. Colocar
la cámara en la platina del microscopio y ubicar la cuadrícula con el objetivo 10X. Al observar el
cuadro central en el objetivo 40X, éste se encuentra dividido en una cuadrícula de 5X5 cuadros
más pequeños.
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4. Las células se cuantifican en el objetivo de 40X. En el caso de muestras muy concentradas,

deberán hacerse diluciones (1:2, 1:5, 1:10 etc.). El factor de dilución (FD) debe considerarse
para cada dilución realizada:
NOTA: Al finalizar, la cámara debe lavarse con agua destilada y secarse
cuidadosamente con papel suave

CUESTIONARIO
1. ¿Qué métodos de determinación cuantitativa de concentración celular existen?
Explique detalladamente.
2. ¿Puede utilizarse la curva patrón realizada en esta práctica para la determinación de
otros microorganismos viables?
3. ¿Qué tipo de errores se comete en el recuento en placa de microorganismos viables?
4. ¿En qué consiste el método de Breed? ¿Para qué microorganismos se utiliza? 5.
¿Cómo se determina la longitud de onda analítica?, ¿qué es la longitud de onda
analítica?
6. ¿Qué métodos indirectos de determinación cuantitativa de concentración celular
existen?, explique.
7. ¿Cómo se puede determinar cuantitativamente la concentración de Tiobacilos
ferrooxidans?
8. ¿En qué consiste el método de recuento en hemocitómetro?
9. ¿Cómo se determina la concentración de hongos que producen micelio?
10. ¿En qué consiste el método para la cuantificación indirecta de microorganismos
utilizando la luciferina y luciferasa como reactivos?. ¿En qué unidades se expresa?