Espectrofotometra y electroforesis

La mayora de las biomolculas poseen una carga elctrica, cuya magnitud

depende del pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se
desplazan cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se
denomina electroforesis a la tcnica mediante la cual se separan las biomolculas
en disolucin cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se trata de una
tcnica fundamentalmente analtica, aunque tambin se puede realizar con fines
preparativos. Cada molcula se desplaza por efecto del campo, alcanzando
rpidamente una velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza
del campo elctrico) con la resistencia al avance (fuerza de friccin o rozamiento)
impuesta por el medio en el que se desplaza.
Papel: sencillo, pero con elevada adsorcin debido a los grupos hidroxilo de la
celulosa.
Acetato de celulosa: los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la adsorcin;
baja tincin de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y
recuperar los componentes separados.
Almidn: pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn caliente
(se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.
Agarosa: polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar al agaragar). Se disuelve en caliente (50-60C) y al enfriar solidifica formando un gel, de
alta porosidad.
Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla
de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentracin de ambas y su
proporcin se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los
geles de agarosa.
En la espectrofotometra se aprovecha la absorcin de radiacin electromagntica
en la zona del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la
radiacin incidente en este espectro y promueve la transicin del analito hacia un
estado excitado, transmitiendo un haz de menor energa radiante. En esta tcnica
se mide la cantidad de luz absorbida como funcin de la longitud de onda utilizada.
La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la
estructura de las molculas, y es caracterstica de cada sustancia qumica.
La espectrofotometra ultravioleta-visible utiliza haces de radiacin del espectro
electromagntico, en el rango UV de 180 a 380 nm, y en el de la luz visible de 380

a 780 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la
regin ultravioleta y visible del espectro.

OBJETIVO GENERAL
Comprender el fundamento de la espectrometra a travs de la medicin de
absorbancia de soluciones de CuSO4 a diferentes concentraciones utilizando
una longitud de onda de mxima absorcin y elaborar una curva de calibracin
as como realizar una electroforesis a travs de la separacin de una mezcla de
aminocidos e identificar los componentes que poseen.
METODOLOGA
La indicada en el manual de Bioqumica Estructural correspondiente a la
prctica Espectrofotometra y Electroforesis, pagina 36.
OBSERVACIONES Y RESULTADOS
ESPECTROFOTOMETIA
CONCENTRACION DE LA MUESTRA
200
160
120
80
40
PROBLEMA

D.O.

ELECTROFORESIS
ELECTROFOREGRAMA REVELADO

Se observo en la tira la la separacion de tres componentes diferentes que al

ser reveladas mostraron tonalidades de morado y uva.
CALCULOS Y GRAFICOS

(40 mg)(5 mg)

mg
=1
(200 ml)
ml
(8 0 mg )(5 mg)
mg
=2
(200 ml)
ml
(12 0 mg)(5 mg)
mg
=3
(200 ml)
ml
(16 0 mg)( 5 mg)
mg
=4
(200 ml)
ml
(20 0 mg)(5 mg)
mg
=5
(200 ml)
ml
Barrido de la solucin
absorban
longitud de onda cia
380
0.06
410
0.027
440
0.029
470
0.096
500
0.103
530
0.097
560
0.022
590
0.056
620
0.133
650
0.243
680
0.412
710
0.516
740
0.559
770
0.566
800
0.37

Absorbancia en funcion de la logitud de onda para una solucion de CuSO4

0.6
0.5
0.4
Absorbancia

0.3

CuSO4

0.2
0.1
0

Curva de
300 400calibracion
500 600 700 800 900
0.6

Longitud de onda

0.5

f(x) = 0x + 0.07
R = 0.98

0.4

Curva de calibracin

D.O 0.3

concentracin
de la muestra

D.O
40
80

0.133
0.281

0.2
0.1
0
20

40

60

80 100 120 140 160 180 200 220

concentracion de la muestra

120
160
200

0.363
0.422
0.523

DISCUSIN DE RESULTADOS
Electroforesis
Se llev a cabo para para separar una serie de aminocidos, como ya sabemos
este mtodo nos ayuda a desplazar cierto tipo de partculas a partir de un
campo elctrico. Los compuestos separados son los siguientes aminocidos:
Alanina con un punto isoelctrico de 6.02 polaridad (-) P.M. 89,09 g/mol
Lisina con un punto isoelctrico de 9.74 polaridad (+) P.M. 146,19 g/mol
Ac. Glutamico con un punto isoelctrico de 3.22 polaridad (-) P.M. 147,13 g/mol
Como bien sabemos las biomolculas poseen una carga elctrica por lo tanto
tendrn grupos catinicos y anionicos disociables suponiendo que las
partculas que se mueven dentro de nuestro sistema sean esfricas entonces la
carga neta de cada una de las molculas depender del pH en el medio que lo
estamos sometiendo es decir que la molcula ser cargada ya sea
positivamente o negativamente y la migracin de una molcula ser influida
por el pH en su punto isoelctrico. Por lo tanto el movimiento electrofortico
ser reproducible.
Estos aminocidos estn formados por 19 aminocidos de color morado
intenso y 1 Prolina de color amarillo. El grado de entrecruzamiento ser dado
por la capacidad que tienen dichas molculas al ser desplazadas por el papel
aplicando el voltaje, por lo tanto a mayor recorrido menor peso molecular
teniendo en cuenta que el pH es bsico y la concentracin del buffer.
La ninhidrina es un agente reactivo para visualizar las bandas de separacin de
aminocidos por medio de la electroforesis, reacciona con todos los
aminocidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, dando una coloracin

violeta intenso pero esta coloracin es independiente de la coloracin original

de cada aminocido obtenido.

CONCLUSIONES