33

Ensayo de toxicidad aguda con

bulbos de cebolla Allium cepa L
mediante la evaluacin de
la inhibicin del crecimiento
promedio de races
Mara Consuelo Daz Bez, Alicia Ronco
y Yolanda Pica Granados

C lasificacin

del ensayo :

IC

Principio de la prueba
Cuando un bulbo de cebolla (Allium sp.) se rehidrata se produce una estimulacin del crecimiento de las clulas, lo cual permite la elongacin de las races
de la planta. Sin embargo, cuando la hidratacin se lleva a cabo en presencia
de sustancias txicas, la divisin celular de los meristemos radiculares puede
inhibirse, ya sea retardando el proceso de mitosis o destruyendo las clulas.
Este tipo de alteraciones generalmente impide el crecimiento normal de la
raz, y por tanto su elongacin (Fiskesj 1985, 1993, 1997).

Este ensayo apareci publicado originalmente en G. Castillo (ed.). 2004. Ensayos toxicolgicos y mtodos
de evaluacin de calidad de aguas. Estandarizacin, intercalibracin, resultados y aplicaciones. IDRC,
IMTA, Canad. 202 pp. Se reproduce con la autorizacin de la editorial.

33

Intercalibrados

Ensayos de toxicidad aguda con bulbos de cebolla

34

Ensayos para agua dulce

El efecto puede determinarse en forma indirecta, mediante la comparacin de

la elongacin de las races de cebollas expuestas al compuesto txico contra la de
cebollas no expuestas, luego de un perodo de 72 horas de prueba. La cuantificacin del efecto se realiza estableciendo el porcentaje de inhibicin del crecimiento
de las races respecto a la longitud promedio de las races del control.

Material
Tubos de ensayo de vidrio de 10 cm de largo y 1.5 cm de dimetro (o recipientes
de mayor tamao, dependiendo del tipo de bulbos a utilizar), gradillas o so-

portes para tubos, bistur y reglilla para hacer mediciones en cm o mm.

Reactivos y soluciones
Medio de crecimiento
El medio de crecimiento que se utiliza en el desarrollo del ensayo se prepara
de acuerdo con lo que se indica en la tabla 2.1.
Tabla 2.1. Medio de crecimiento para Allium sp.

Masa de sal para disolver en un litro de agua destilada

Reactivo
Cantidad (mg)
Ca(NO3)24H2O
KNO3
MgSO47H2O
KH2PO4
Fe EDTA3H2O

Reactivo
MnSO4
CuCl2
NaMnO4
ZnSO4
H3BO3

236.1
202
246
136.1
67.6
Elementos traza

Cantidad (mg)
0.55*
0.0645*
0.001*
0.0007*
0.23*

* Los componentes correspondientes a elementos traza deben ser

adicionados a partir de una solucin stock.

Ensayos de toxicidad aguda con bulbos de cebolla

35

La solucin madre, preparada de acuerdo con lo indicado, se diluye 10 veces

con agua destilada, y el pH se ajusta a 7.0 antes de utilizarla. Tambin se puede
utilizar agua dura o agua de la llave como medio de crecimiento. En el caso de usar
cualquiera de estas opciones, el control negativo y el agua utilizada para preparar
las diluciones de los compuestos o las muestras debern ser los mismos.

Organismos de prueba
Para la elaboracin de las pruebas se deben seleccionar bulbos de Allium sp.
(cebolla amarilla) de 1.5 cm de dimetro, secos y sin formacin de hojas o
raz. stos pueden ser obtenidos del mercado local o adquiridos a travs de
algn proveedor.
Previo al montaje de la prueba, los bulbos deben limpiarse eliminando la
epidermis seca y removiendo, con un bistur o instrumento punzante, los restos de tejido y races del rea radicular (figura 2.1 (1)). No se deben daar las
races primordiales. Con el fin de eliminar los restos de tejido, es conveniente
colocar los bulbos en agua destilada por 2 horas y dejar secar.
Almacenamiento de los bulbos de cebolla
Se recomienda adquirir los bulbos en vsperas de la realizacin de pruebas o,
en su defecto, almacenarlos en un lugar donde se puedan garantizar condiciones secas y una temperatura entre 10 y 20 C. En algunas regiones, los bulbos
pueden mantenerse almacenados hasta por un ao; sin embargo, en zonas
geogrficas donde la temperatura y la humedad son altas, el almacenamiento
est limitado a unos pocos das.
Control de calidad del material biolgico
Dado que la prueba con cebollas no requiere mantenimiento de un cultivo,
el control de calidad debe enfatizarse en la calidad de los lotes de material a
utilizar. Por esa razn, debe darse especial importancia al almacenamiento del
material, as como al control de hongos que pueden afectar la viabilidad de las
cebollas y su normal desarrollo. Es por ello que se recomienda disponer de
un nmero de cebollas por lo menos 3 o 4 veces mayor al requerido para las
pruebas. Su almacenamiento debe hacerse en ambiente exento de humedad, a
una temperatura entre 10 y 20 C.

36

Ensayos para agua dulce

Figura 2.1. Esquema grfico de los pasos a seguir en la prueba con Allium cepa L.
1) limpieza y pelado de bulbos; 2) ubicacin de bulbos en tubos para exposicin a las
soluciones de ensayo; 3) colocacin de tubos en soporte; 4) agregado de soluciones en los
tubos durante el ensayo; 5) medicin de longitud del haz de races al finalizar el tiempo de
exposicin de los bulbos

Procedimiento de la prueba
Control de calidad en las pruebas con A. cepa
Un elemento importante en la elaboracin de las pruebas es el proceso de
pelado de los bulbos. Durante este procedimiento debe evitarse el dao del
anillo radicular. Igualmente, se debe trabajar con un alto nmero de rplicas
para controlar la variabilidad de las pruebas. Se recomienda utilizar 12 rplicas por concentracin, con el fin de descartar por lo menos 2 de los valores

Ensayos de toxicidad aguda con bulbos de cebolla

37

ms extremos. En el caso que exista un bajo desarrollo radicular en ms de

2 bulbos del control, se considera que el lote de bulbos tiene problemas, por
tanto los resultados no sern vlidos.
Al igual que en todas las pruebas, se debe establecer la sensibilidad de los
bulbos a los compuestos de referencia; se recomienda el empleo de Cu(II)
a partir de sulfato de cobre y registrar registrar la sensibilidad mediante la
confeccin de una carta control con por lo menos veinte pruebas. Resultados
por encima o por debajo de la sensibilidad establecida son indicativos de
problemas con el material biolgico utilizado.
Preparacin de diluciones
Generalmente, se sugiere el empleo de una serie de 5 concentraciones, un
control negativo y 1 o 2 controles positivos; este ltimo contiene el compuesto
de referencia mencionado en el prrafo anterior.
Para su preparacin se emplea el mtodo de dilucin en forma secuencial
aplicando un factor de 0.2 o 0.3.
Cuando se va a llevar a cabo una evaluacin exploratoria, puede emplearse
una serie de diluciones logartmicas (por ejemplo: 100; 10; 1; 0.1; 0.01), lo
cual permitir establecer el intervalo de concentracin conveniente para la
determinacin de la Concentracin Inhibitoria Media (CI50).
Desarrollo de la prueba
Cuando se trabaja con bulbos de dimetro pequeo, las pruebas se realizan
en tubos de ensayo de 10 cm de longitud x 1.5 cm de ancho. En el caso de
bulbos de mayor dimetro pueden utilizarse tubos o recipientes de mayor
volumen, dependiendo del tamao de los mismos. Es importante destacar que
la profundidad de los recipientes debe ser tal que, al trmino de la prueba, la
elongacin mxima no alcance el fondo del recipiente (Fiskesj, 1985).
En la prueba se utilizan 5 concentraciones de la muestra, un control negativo y 1 o 2 controles positivos, cada una con 12 rplicas. El ensayo se inicia
con el llenado de los tubos con cada una de las diluciones y controles; este
llenado debe hacerse hasta el borde del tubo. A continuacin se colocan los
bulbos limpios sobre la boca del tubo, cuidando que la zona radicular quede
inmersa en el lquido (figura 2.1 (2)).
Los tubos se colocan en una gradilla, la cual se localiza sobre una
mesa que no presente vibraciones y se mantienen a temperatura ambiente

38

Ensayos para agua dulce

(20 C) durante un perodo de 72 horas. Debe evitarse la iluminacin

directa.
Dos veces al da durante el perodo de prueba, se debe reponer el volumen
perdido por evaporacin o absorcin. Para reponer este volumen se utiliza
la muestra o dilucin correspondiente. Se recomienda inclinar el bulbo sin
sacar las races del tubo, adicionando cuidadosamente el volumen con ayuda
de una pipeta Pasteur (figura2.1 (3 y 4)). En la tabla 2.2 y en las figuras 2.1

y 2.2 se resumen las condiciones de prueba.

Figura 2.2. Ensayo de toxicidad con Allium cepa L.

Condiciones de la prueba
Temperatura
20C

Iluminacin
indirecta

Tiempo de prueba
72 h

Control negativo
Agua dura o de la llave
o medio de crecimiento
12 rplicas

Control positivo
solucin de
Cu (II)
12 rplicas

Volumen de prueba
15-20 mL
Control positivo
Cu+2

Soluciones de prueba
5 concentraciones
12 rplicas

72 horas de incubacin
Control negativo
agua dura o de la llave
o medio de crecimiento
12 rplicas

Control positivo
solucin de
Cu (II)
12 rplicas

Soluciones de prueba
5 concentraciones
12 rplicas

Registro de signos de fitotoxicidad

Disminucin de la longitud de las races
Medicin de elongacin, descarte valores extremos

Control negativo

Clculo del % de inhibicin del

crecimiento de las races
Clculo de la CI50

Ensayos de toxicidad aguda con bulbos de cebolla

39

Tabla 2.2. Condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad con Allium cepa L.
Tipo de ensayo
Temperatura
Calidad de luz
Iluminacin
Recipientes de prueba
Nmero de rplicas
Material biolgico
Condicin de los bulbos

Agua de dilucin
Nmero de concentraciones
Duracin de la prueba
Efecto medido
Control negativo
Control positivo
Resultado final

Esttico
20 C, ambiente
Fluorescente, blanco-fro
Indirecta
Tubos de Ensayo de 10 cm x 1.5 cm dimetro
12
Bulbos de aproximadamente 1.5 cm de dimetro
Pelar los bulbos y la base, evitar daar el anillo
radicular
Agua de la llave o medio de crecimiento
5
72 horas
Inhibicin de crecimiento de las races
Agua de la llave o medio de crecimiento
Cobre (II) a partir de una solucin de CuSO4
CL50

Expresin de resultados
Medicin
Al trmino del perodo de exposicin se registra la longitud promedio de las
races, medicin que se lleva a cabo con ayuda de una regla comn con escala
en milmetros (figura 2.3). La medicin se lleva a cabo colocando la escala
en el margen del tubo, se ubica el valor de longitud mnimo y mximo donde
incide la mayora de las races y el punto medio se define como el promedio.
Se efecta la estimacin en cada tubo y se obtiene el promedio matemtico
de diez rplicas (los dos valores ms extremos se descartan). Para obtener el
porcentaje de efecto de inhibicin se debe realizar la siguiente operacin:
(longitud del control longitud de la muestra) x 100/longitud del control
Con estos valores se construye una grfica de concentracin en funcin
del porcentaje de inhibicin y se calcula la CI50 mediante cualquiera de los
siguientes mtodos: Probit, promedios mviles o Sperman y Karber.

40

Ensayos para agua dulce

Figura 2.3. Elongacin de las races de bulbos de cebolla

despus de un proceso de hidratacin

Bibliografa
Fiskesj, G. 1985. The Allium Test as Standard in Environmental Monitoring. Hereditas 102: 99-112.
. 1993. The Allium Test in Wastewater Monitoring. Environmental Toxicology
and Water Quality 8: 291-298.
. 1997. Allium Test for Screening Chemicals; Evaluation of Cytological Parameters. En: W. Wancheng, J. W. Gorsuch y J. S. Hughes (eds.). Plants for Environmental
Studies. CRC Press, Florida, pp. 308-329.