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XOCHIMII.CO SERVICIOS DE INFIIRMEI

ARCHIVO HISTORIÇQ

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD XOCHIMILCO

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE SISTEMAS BIOLÓGICOS

QUÍMICO FARMACÉUTICO BIOLOGO

INFORME DE ACTIVIDADES DEL SERVICIO SOCIAL

"Diseño y validación de un método analítico para la cuantificación de ácido valpróico en materia prima por electroforesis capilar"

PERTENECE AL PROYECTO GENÉRICO:

"Evaluación de productos relacionados con la salud".

Alumno: Agustín Flores Luna

Matrícula: 99345658

Asesores: M. en C. Ma. Luisa Margarita Vázquez Ramírez M. en C. Edilberto Pérez Montoya

LUGAR DE REALIZACIÓN: Departamento de Biofarmacia en la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional.

FECHA DE INICIO: Febrero, 2003 FECHA DE TÉRMINO: Octubre, 2003

Febrero, 2005

INTRODUCCIÓN MARCO TEÓRICO

INDICE

1. Características generales del ácido valproico

II.

Características generales de la electroforesis capilar

III. Validación de métodos analíticos en electroforesis capilar

OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS DESARROLLO EXPERIMENTAL RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS CONCLUSIONES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS RESUMEN ANEXOS

3

4

4

11

29

32

33

37

47

47

49

50

58

INTRODUCCIÓN

El ácido vaiproico (Ay), así como sus sales de sodio y magnesio han sido reconocidos como uno de los antiepilépticos de primer nivel, de amplio espectro activos frente a muy diversos tipos de crisis epilépticas (generalizadas convulsivas y no convulsivas).

El AV es uno de los antiepilépticos más utilizados en todo el mundo, principalmente en monoterapia, y a diferencia de otros fármacos está indicado en todos los tipos de epilepsia como medicamento de primera línea. (1)

Actualmente el método analítico para la valoración del AV como materia prima está reportado en la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (2) y en la farmacopea Europea por medio de una titulación con hidróxido de tetrabutil amonio e hidróxido de sodio respectivamente, las cuales son metodologías de baja especificidad y sensibilidad, así como baja precisión. En la farmacopea de los Estados Unidos de América (USP) se utiliza una metodología analítica desarrollada por cromatografía de gases, en la cual se emplean temperaturas elevadas, presiones de gas elevada y en donde se utilizan disolventes orgánicos para la preparación de la muestra, a diferencia de la metodología por electroforesis capilar, en la que se trabaja a temperatura ambiente, con agua como disolvente y en ocasiones bajas concentraciones de disolventes orgánicos, y sales inorgánicas; obteniendo electroferogramas de alta sensibilidad y eficiencia a tiempos de migración relativamente cortos y con bajos riesgos a la seguridad del analista.

Como en cualquier método analítico, es necesario tener bajo control las variables críticas, para obtener un método confiable, lo cual sólo se demuestra con la validación del mismo (4).

MARCO TEÓRICO

1.- CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL ÁCIDO VALPRÓICO

1.0 Descripción

El AV es un líquido ligeramente viscoso e incoloro y tiene un olor característico (5).

1.1 Nombres químicos

El AV es conocido como Ácido 2-propilpentanóico, ácido n-diropiI acético, ácido 2-propil valérico y DPA

1.2 Peso molecular, fórmula desarrollada y condensada.

P.M.: 144.21 g/mo!

H3C

 

COOH

H

H3C

C8H1602

2.0 Propiedades fisicoquímicas 2.1 Constante de disociación

En experimentos realizados (5), se demostró que el valor de pKa del

AV es de 4.6.

2.2 Solubilidad

Los siguientes valores de solubilidad han sido determinados para AV a temperatura ambiente:

N-Heptano

>10% y/y

Cloroformo

>10% y/y

Acetato de etilo

>10% y/y

Metanol

>10% y/y

Etanol 100%

>10%v/v

Acetona

>10% y/y

Dietil éter

>10%v/v

Benceno

>10% y/y

NaOH aq. 1 N

>10% y/y

HcI aq. 0.1 N

1.15 mg/mL

Agua

1.27 mg/mL

Fil

2.3 Espectro UI! e IR

El Espectro UY que se muestra a continuación es a partir de una solución de AV al 0.1% en metano!. El barrido se realizó de 400 a 205 nm y se encontró la

longitud de onda máxima a los 213 nm (E = 86). El experimento se llevó a cabo en im espectrofotómetro Beckman Acta V.

ESPECTRO UVNIS ÁCIDO VALPROICO

04

di. u.

1 ..

1(

al

Di

01

a

210

100

WÁVENQnI(n4

El espectro infrarrojo fue medido usando el método capilar.

ESPECTRO INFRARROJO ÁCIDO VALPROICO

4000

3500

1*

J5Ø:

  • 2.4 Índice de refracción

IÜ:

IDO: 7w

El AV tiene un índice de refracción de ND245: 1.425

  • 2.5 Gravedad específica

La gravedad específica del AV a 25 oc tiene un valor de 0.904 g/mL

3.0 Estabilidad

El AV es un compuesto muy estable. No se ha observado degradación por la acción del calor, la luz, soluciones alcalinas y ácidas fuertes. (5)

4.0 Usos

Es un ácido graso, con un perfil único de acción anticonvulsivante tanto desde el punto de vista experimental como clínico. En dosis no tóxicas es eficaz contra convulsiones tónicas inducidas por electroshock o por estricnina, así como contra convulsiones de umbral mínimo inducidas por petilenetetrazol, bicuculina o picrotoxina. La eficacia clínica confirma este amplio espectro de actividad anticonvulsivante. Es uno de los fármacos de elección en el manejo de las convulsiones con ausencias simples. De manera similar, responden bien las convulsiones con ausencias atípicas y las epilepsias mioclónicas y como no ha habido una droga completamente satisfactoria para estos tipos de epilepsia de la infancia, ésta constituye un importante avance. También es eficaz en convulsiones tónico-clónicas generalizadas. En algunos pacientes refractarios, ha sido utilizada eficazmente para tratar las convulsiones parciales con sintomatología compleja (temporales o psicomotoras) o convulsiones mioclónicas y acinéticas. A semejanza de la carbamazepina, el valproato ha sido empleado con algún éxito en el manejo de trastornos bipolares y en el tratamiento de la agresión o la violencia. (6)

5.0 Farmacocinética y metabolismo del fármaco

El AV es un fármaco que se une a las proteínas plasmáticas, el volumen de distribución oscila entre 0.1 a 0.5 L/kg (media 0.2 L/kg) y la vida media varía desde 6 hasta 17 h en los adultos y de 4 a 14 h en niños. El nivel plasmático terapéutico oscila entre 50 y 100sg/mL, los niveles superiores a lOOj.tg/mL son potencialmente tóxicos. En sangre y en orina humanas, se han identificado más de diez metabolitos. Sólo del 0.5 al 20% se elimina sin cambios por la orina. De los diferentes metabolitos, sólo el ácido 2-propil-2 pentanóico (2-en-VPA) se acumula

en el cerebro. El matabolito 2-en-VPA es aproximadamente 1.3 veces más potente que la droga original, y puede contribuir significativamente al efecto anticonvulsivante del vaiproato administrado crónicamente. (7)

El mecanismo preciso de su acción anticonvulsivante es aún desconocido. Se ha postulado que inhibe la GABA transminasa y, de ese modo, aumenta la concentración del GABA cerebral. Sin embargo, otros ácidos grasos de cadena lineal saturados (propiónico, butírico y pentanóico), que carecen de propiedades anticonvulsivantes, son inhibidores más potentes de la GABA transaminasa que el AV. También se ha comunicado una fuerte correlación entre la potencia anticonvulsivante del valproato y de otros ácidos grasos de cadena ramificada y la capacidad de reducir la concentración de aspartato cerebral. (7)

El AV puede disminuir la unión a proteínas séricas o bloquear el metabolismo hepático del fenobarbital. La administración del fármaco a pacientes en el estado de equilibrio mientras están medicados con fenobarbital (o primidorna, que se metaboliza a fenobarbital) puede aumentar los niveles séricos de fenobarbital del 35 al 200% y causar somnolencia excesiva. Evidencias actuales indican que esto se debe a una inmediata disminución en la velocidad de eliminación del fenobarbital. Esta droga interactúa impredeciblemente con la fenitoína, se la ha asociado no sólo con niveles séricos disminuidos de fenitoína y aumento de las frecuencias de las convulsiones, sino también con niveles aumenados de fenitoína libre y toxicidad por fenitomna. Se ha hallado que el valproato aumenta significativamente la depuración del felbamato y, por lo tanto, reduce su concentración plasmática. A la inversa, el fenobarbital, la primidona, la fenitoína y otros agentes pueden inducir enzimas que metabolizan este fármaco, y reducen su vida media. (7)

Por el contrario, el felbamato aumenta la concentración plásmática del valproato, cuando se administran simultáneamente.

Se han comunicado más de 40 casos de insuficiencia hepática fatal en pacientes que recibieron este tratamiento. El riesgo de insuficiencia hepática es extremadamente menor en pacientes con monoterapia (ca 1/37.000) que en los que reciben politerapia (1/6500). Por otra parte, la incidencia es mucho mayor en niños menores de 2 años y en politerapia (monoterapia 1.42/10.000 ; politerapia, ca

1/500).

Los efectos colaterales más frecuente en pacientes que reciben monoterapia (valproato) son aumento de peso (11%), sedación (10%), náuseas (6%), cefalea (3%), temblor (3%) , caída del cabello (1%) y mareos (1%). Otros efectos adversos poco frecuentes son erupciones cutáneas, enuresis, insomnio, ansiedad, fatiga y parestesias. Se han comunicado efectos teratogénicos en animales. Sin embargo, su uso para mujeres con epilepsia durante el primer trimestre (3 meses) del embarazo comunicado por el Centro para Control de las Enfermedades (Centers for Diseases Control, USPHS) parece estar asociado con un mayor riesgo (1.2%) de espina bífida en sus hijos.

Aunque la mayoría de las mujeres con epilepsia que toman esta medicación tienen hijos no afectados, se recomienda realizar las pruebas prenatales para evaluar los defectos de la médula espinal. (7)

6.0 Dosis

Adulto y pediátrico, inicialmente, 15 mg/kg/día; aumentar a intervalos de 1 semana de 5 a 10 mg/kg/día; dosis máxima diaria 30 mg/kg (algunos pacientes pueden necesitar hasta 60 mg/kg/día). Si la dosis diaria excede los 250 mg debe administrarse fraccionada. (6)

1101

7.0

FORMA FARMACÉUTICA

Cápsulas: 250 mg; jarabe: 250 mg en 5 mL.

II.- CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA ELECTROFORTESIS CAPILAR (EC)

  • 1.0 Definición de electroforesis

La electroforesis ha sido definida como el movimiento o desplazamiento diferencial de especies cargadas (iones), sustancias neutras o migración pasiva, por atracción o repulsión en un campo eléctrico. (3)

Las técnicas que más se han desarrollado están en la actualidad aplicadas al campo de las proteínas y productos de la biología molecular, como son los geles de agarosa y proliacrilamida en placas o películas de distinto espesor verticales u horizontales (figl).

Gel verdcal

Gel hoñzoxilal

Fig 1. Electroforesis en placa

1.1 Características de la EC

El empleo de capilares para la separación de sustancias neutras o iones cargados eléctricamente, apareció en 1967 en un experimento desarrollado por Hjerten empleando capilares milimétricos, los que eran cortados a través de su sección longitudinal para evitar los efectos de la convección. Virtanen y Mikkers en

1.

1979 desarrollaron las separaciones empleando electroforesis en capilares de 200 jim de diámetro interno en vidrio y teflón respectivamente.

En 1980, Jorgenson y Lukacs empleando técnicas avanzadas en la obtención de capilares de sílica fundida utilizan diámetros de 75 pm y Jorgenson clarifica teóricamente las relaciones entre los parámetros operacionales y las cualidades de la separación revelandó el elevado potencial analítico de esta técnica.

Los capilares de 75 a 100 cm de largo y con diámetros internos de 50-70-100 tm y de 300 a 400 im de diámetro externo son los que permiten una capacidad elevada de resolución. (3) N>200.000 platos /m.

La fuerza electroosmótica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie interna de capilar da como resultado una corriente plana del frente de liquido que contrasta con el frente parabólico de la cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) (fig. 2).

-ti

Frenteplanar -

2

Frente pwabókco - HPIC

rio. a comparación entre Ec y HF'LC

La EC separa iones de acuerdo a la movilidad del electrolito en lugar de una interacción con la fase estacionaria, por lo que se detectan primero los cationes pequeños mono y divalentes, posteriormente los cationes de mayor peso

molecular y moléculas neutras y por último los aniones mayor y menor peso

molecular.(8)

La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventana a través de ella que permite el paso de la luz U y de tal manera que la detección es en línea.

Con esta técnica descrita es posible separar cationes, aniones, proteínas, macromoléculas y sustancias no cargadas en forma simultánea. (3)

2.0 Aplicaciones

El explosivo avance de la electroforesis capilar se ha extendido al área biomédica, en el campo de las proteínas, ADN, análisis de líquidos de perfusión, monitoreo de fármacos, marcadores genéticos tumorales y neurobioquímicos, fármacos xenobióticos, de abuso, y pericias forenses.

En el área biofarmacéutica, para el control de calidad de productos farmacéuticos y biotecnológicos, quimioterápicos y de estructura quiral.

En el área de alimentos, se le aplica el fraccionamiento y cuantificación de aminoácidos, hidratos de carbono, ácidos orgánicos, aditivos y contaminantes.

En el área de control ambiental, permite la identificación de contaminantes y sus metabólitos, pesticidas, metales pesados e hidrocarburos.

Como todo desarrollo de un área analítica nueva, la incorporación de técnicas acopladas como la espectroscopía de masa, fluorescencia inducida por láser y otras variantes permiten augurar un promisorio futuro. (3)

3.0 Desarrollos tecnológicos que contribuyeron ala EC

Seis desarrollos tecnológicos han concurrido para el desarrollo comercial de la instrumentación, que constituye en la actualidad la EC.

  • 1. Los capilares de sílica fundido revolucionaron la cromatografía de gases (CC) y han producido la cámara de separación de la EC.

  • 2. La disponibilidad de fuentes de poder de alto voltaje (20 a 30 kV), altamente estabiIizads y automatizadas para el mantenimiento estable de la tensión y corriente.

  • 3. Los detectores desarrollados para HFLC, de absorbancia de alta sensibilidad pudieron ser aplicados con modificaciones ópticas al tubo capilar.

  • 4. Los desarrollos obtenidos por la electroforesis en geles de tamizado molecular como la poliacrilamida, agarosa y otros, en la separación de proteínas.

  • 5. El desarrollo de lo anfolitos, obtenidos por copulación de ácido acrílico y las polietilen poliaminas que han permitido generar ambientes de pH continuos y estables, donde se logra separar proteínas de puntos isoeléctricos (pI) muy próximos.

  • 6. El análisis computacional aplicado a la resolución de productos obtenidos por separación por HPLC o EC que pueden ser estudiados, espectralmente a través del software para tal fin.

4.0 Ventajas

Las separaciones se realizan empleando mecanismos tradicionales, en un ámbito capilar, que además ofrece más facilidad y velocidad que el HPLC.

Mientras elimina los problemas de los disolventes del HPLC, la toxicidad de los mismos y su costo, pues emplea soluciones acuosas en su gran mayoría con muy baja concentración iónica, incorpora los principios de la automatización a través de un hardware creado especialmente con un software altamente optimizado.

Las separaciones se obtienen en pocos minutos, en línea con la corrida, obteniéndose simultáneamente resultados cuantitativos. En oposición a los procedimientos tradicionales que utilizan horas o días.

La EC ofrece mayores ventajas para la separación de iones que la cromatografía iónica (IC), ya que la separación es más rápida y con mayor resolución, además la columna requerida para la separación por IC es más cara en comparación con el capilar de silica fundida. (10)

5.0 Fundamento

La separación por electroforesis esta basada en la diferencia de velocidad de solutos en un campo eléctrico. La velocidad de un ion esta dada por

Donde:

Y: Velocidad jónica

VteE

¡le: movilidad electroforética

E: Campo eléctrico

Existe una relación entre el voltaje aplicado y la longitud del capilar en volts /cm, la movilidad de un ion es una constante, la que puede ser determinada por el coeficiente friccional a través de un medio elegido

Fuerza Eléctrica (F[) Ftierza friécional

La fuerza eléctrica está representada en la siguiente ecuación

F E = qE

Y para un lón esférico la fuerza friccional esta determinada por la ecuación

FF-6lcflrv

Donde:

q:Carga jónica ip Viscosidad de la solución r:Radio iónico y: Velocidad del ión

En el estado estacionario, las fuerzas son iguales y opuestas:

qE = 6 It 11 r y

qE = 6 it ri r y ¡¡, E

k= qW6iti r

6 it t

r

= q

Con lo expuesto queda en evidencia que especies altamente cargadas tienen movilidades elevadas.

La movilidad electroforética se le encuentra usualmente en las tablas de constantes

físicas.(3)

6.0 Principio fisicoquímico

Las moléculas son separadas por las fuerzas del campo eléctrico aplicado y las muestras separadas en un capilar son monitoreadas por el detector (fig 3).

H Ók.

r

-'

  • - 1+)

t 2 ..

itYl

FIG.3 Representación del fenánienode polarización del

capilar, desplazamiento jónico y detección

Los picos del electroferograma son similares a los de HPLC, y se generan como consecuencia de la concentración de los analitos y de su velocidad de migración (fig 3 bis).

Eloctrotorear

12 ECWB -3 1.2 DIMM

Las muestras son introducidas en el capilar de dos modos, migración hidrostática y por electromigración. (8)

Durante la inyección electroforética (electromigración), el capilar está sumergido en la muestra y se aplica el alto voltaje.

Los iones de la muestra migran dentro del capilar en relación a sus movilidades electroforéticas.

Si la fuerza iónica de la solución muestra es más baja que el buffer electroforético, los cambios en el campo eléctrico de la interfase muestra-buffer producen un efecto de enfoque o stacking, en el cual los iones del analito aparecen concentradas alrededor de la zona de la interfase. Este proceso de delineamiento de la zona, puede producir incrementos en la detección de la sensibilidad y poder de resolución (fig 4).

uv

+—. +—+ —+ — + t;t -t-

+

uy

11

+ —

+ —

+

Mtenøol

Oesgnns del

FIG.4. ENFOQUE DE LA MUESTRA EN LA MIGRACIÓN ELECTROFORÉTICA

ita

El efecto de enfoque puede producir cambios sustanciales en la inyección electroforética (fig5).

C.p4ts Is *

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IÁL

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Fuøntt øe poder

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FIG.5 Condiciones experimentales.

7.0 Flujo electrosmótico (FEO)

El FEO es el componente efector más importante en la EC, surge con la consecuencia de aplicar un campo eléctrico que genera una doble capa eléctrica entre la solución y la pared del capilar.

En condiciones acuosas, la fase sólida posee un exceso de cargas negativas, como resultado de los procesos físicoquímicos, la ionización de la superficie (que es un equilibrio ácido-base) y por otra parte la adsorción de especies jónicas sobre la superficie del capilar. (10)

Estos procesos ocurren en el capilar al paso de la corriente eléctrica y la FEO se encuentra altamente controlada por los numerosos grupos silanoles (SiOH) que también pueden existir como Si-O -

El

tillE

mili

Ej

1

-

ji

11

ti L

E'

El

* Los cationes en la mayoría de los casos mantienen el balance de cargas; ese potencial se llama potencial zeta. Cuando se aplica el voltaje a través del capilar, los cationes que forman la doble capa eléctrica migran hacia el polo positivo(fig. 6).

e

Figura 6. flujo de cargas hacia el cátodo.

Por consiguiente, la doble capa eléctrica llene un balance que está a su vez en equilibrio con la pared que corresponde al potencial zeta.

La magnitud de la FEO puede ser expresada en términos de la movilidad y velocidad por la fórmula siguiente:

V FE0= ( c Ç ! fl) E

RFEO = (E Ç / 1)

Donde:

ó

Vo Velocidad po: Movilidad del flujo electroosmótico

e: Constante dielécfrica Ç: Potencial Z

8.0 Equipo de EC

El equipo está constituido por una fuente de poder de alto voltaje (20 a 30 kV) y de O a 200 jiA, y un capilar de sílica de 25 a 75 i.xm de diámetro interno y de 100 a 200 j.xm de diámetro externo, el que puede estar refrigerado por aire o líquido.

Los electrodos de platino se encuentran ubicados en el recipiente que contiene el buffer, que además de servir para su contacto recibe los extremos del capilar.

Es posible controlar la temperatura del carrusel que almacena las muestras y los buffer.

Los capilares de sílica dejan pasar la luz UV/ Visible a distintas longitudes de onda, generando por arreglos de diodos, los espectros para la identificación de los compuestos separados. (fig. 7).

 

lomocalizácmn

 

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FP

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Carrousffl de 'nue1ri

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J

F1G7 Esquema de un aparato deEc

Los aparatos desarrollados por la industria instrumental recién aparecieron en 1988, y el primer simposio internacional del año siguiente, permitió mostrar los avances extraordinarios de este logro analítico.

Los aparatos comerciales de FC comprenden dos compartimientos electroforéticos unidos por un compartimento que contiene un capilar, a una fuente de alta tensión de 20 a 30 kV, el que es sometido a la luz UV con detector unido con un registrador, que grafica las diferencias de absorbancia; a un sistema de

administración de datos. Las terminales de salida permiten, por su conexión, el registro de voltaje, tiempo de corrida, y registro de temperatura del capilar, a través de un software que está incluido en una computadora (fig 8).

±

Figura S. Carrousel para muestras en una EC

9.0 Tipo de inyecciones

La inyección electrocinética, consiste en introducir el material empleando una combinación de la bomba electroendosmótica y la movilidad electroforética. La inyección por desplazamiento puede ser realizada por aplicación de la muestra con gas inerte a presión (por ej. nitrógeno) o por vacío en el extremo del capilar.

Inyección por diferencia de altura. Idéntico efecto puede obtenerse por cambio en las alturas relativas de la muestra o de los viales de salida del buffer (inyección por gravedad).

La inyección electroforética, produce un desplazamiento iónico, debida a un campo eléctrico donde migran los iones

El efecto de enfoque, puede producir cambios sustanciales en la inyección electroforética. (FIG. 9)

Presión

,____

_±iidrodii1

Muestra

Sitonado

Ruifo,

1

Muestra

EPuçtrocinéica

Burisí

1

8:ffevI

FIG. 9 Diagrama de los tres métodos de introducción de muestra

10.0 Volúmenes empleados

El empleo de microvolúmenes y la rapidez de la EC en comparación al HPLC, consume microlitros de muestra y volúmenes del orden de los nanolitros para la soluciones electrolíticas, lo que la hace una técnica altamente versátil y económica.

TABLA 1 Volúmenes inyectados para varios capilares

 

AP

50prn

75 g

lOOgm

50

ml,ar

1.0

nL

5.2 nL

16.4 nL

75

mbar

1.5

nL

7.8 nL

24.6 nL

100 mbar

2.0 nL

10.4 nL

32.8 nL

11.0 Tipos de capilares

La eletroforesis se efectúa en capilares de sílica fundida, de 25- 75 jim de diámetro interno; los capilares son recubiertos externamente con una película de poliamhias, para protegerlos de los daños mecánicos y provistos de una ventana de detección. (3)

12.0 Voltaje

Las fuentes estabilizadas de corriente continua generan 10 a 30 kV y elevados campos eléctricos (100 a 500 V/cm.) al capilar, pueden variar de 25 a 75 jim. de diámetro interno, pudiendo llegar a 300 pm. de diámetro externo. Las longitudes pueden ser de 1 m,, pero normalmente no exceden los 75 cm. (FIG. 10).

LS

O

-e

\

it

'1

..

LLJ

FJG 10 Esquema de un capilar

25 um u 75 tm de 'gá,nMro nterno y

300 Otr, de diatn*c eateu'o

En algunos aparatos, el capilar se encuentra dentro de un soporte de plástico en el cual se ha prealineado el capilar con una lente de micro enfoque, para obtener una detección más sensible y estable. Los soportes de plástico que contienen el capilar son herméticos y en su interior se hacen circular líquidos refrigerantes.

Es imprescindible mantener la temperatura La elevada resistencia eléctrica del capilar limita la corriente y el calentamiento interno. Se logran campos eléctricos muy elevados (100 a 500 V/cm.) con mínima generación de calor. El empleo de campos eléctricos muy elevados permite reducir drásticamente el tiempo de

realización de la corrida, y la elevada relación del área al volumen disipa en forma eficaz el calor que se pueda producir.( 3)

13.0 Polaridad

La FC puede ser desarrollada empleando polaridad normal o invertida. El valor del pH permite definir el sentido de la migración a pH bajos, muchas proteínas y péptido son catiónicos y migran hacia el cátodo en el extremo del capilar. Inversamente, a pH elevados muchas bimoléculas tienen una carga neta negativa y migran hacia el ánodo.

El conocimiento del pK para distintos componentes de las muestras (péptidos y aminoácidos) como también el pi para las proteínas, permite seleccionar los buffer apropiados para determinar el sentido de la migración para que los compuestos se orienten hacia el detector; normalmente se emplean campos eléctricos de 200 a 400 y/cm.

Para muchas aplicaciones, el empleo de capilares de longitud elevada (hasta 1 m.) permite y requiere voltajes mayores de 20 kV para encontrar el campo eléctrico adecuado.

14.0 Detección

Una amplia variedad de detectores han sido desarrollados para la EC (incluyendo fluorescencia, electroquímica y conductividad) pero los detectores más usados comercialmente son los que emplean el UY/visible.

Los detectores son similares a los de I-[PLC, usando fuentes de deuterio con filtros o detección con longitudes de onda seleccionadas.

%IItH1MICÜ SERVICIOS BE 1NFORMAc1A

ARCHIVO UISTORIGQ

25

Las fuentes de luz generalmente provienen de un haz de luz entre un fotodiodo de referencia y un micro enfocado óptico en el estuche capilar.

El barrido es a través de un detector que ilumina el capilar con luz blanca luego dispersada y analizada a través de un policromador por arreglo de fotodiodos (detector PDA para óptica reversa).

Alternativamente, el sistema óptico convencional puede ser empleado por una banda espectral aislada por un monocromador colocado entre la fuente de luz y el capilar.

El barrido puede ser controlado rápidamente por un sistema computarizado que controla el movimiento del monocromador en el rango espectral en el tiempo de milisegundos.

Este sistema de detección produce menos ruido de fondo, y mucha más sensibilidad que el detector con arreglo de diodos PDA.

  • 15.0 Reactivos en EC

Una amplia variedad de buffer y aditivos puede ser usada para las separaciones; la mayoría de ellos son buffer no tóxicos, de fosfato, borato y TRIS. No emplea sustancias orgánicas, inflamables o tóxicas como acetonitrilo, hexano, metanol y tetrahidro furano, como en HPLC. Se requieren volúmenes muy pequeños de soluciones de electrolitos que no presentan los principios de toxicidad encontrados en I-JPLC.

  • 16.0 Selección de buffer

y.

Esta es una de las etapas básicas en la separación por EC. La sensibilidad de la FEO a un determinado pH requiere buffer que mantengan el pH constante.

Los sistemas buffer efectivos tienen un rango de aproximadamente dos unidades de pH alrededor del valor del pKa. Los buffer polibásicos como los de fosfato, y citrato tienen más de un pKa para usar, y pueden ser utilizados en un rango de pH más amplio.

El buffer que se emplea en EC debe reunir una serie de propiedades:

1) Buena capacidad amortiguadora en el rango encontrado

2) Baja absorbancia en la longitud de onda empleada en la detección.

3)Baja movilidad (para lo cual se necesita baja concentración iónica)

Las separaciones de proteínas y péptidos son regidas por las alteraciones del pH que están íntimamente ligadas al pl. Los cambios de pH afectan también al comportamiento del FEO, pues a pH próximos a 3 la superficie interna del capilar se encuentra cargada negativamente por los grupos silanol.

9--

El empleo de uniones covalentes en la superficie del capilar puede reducir dramáticamente el FEO, sobre todo en la separación de las proteínas (FIC.11).

lo

-

y

anodt:

pH FEO

t

FEO

FEO-

HG.11 Electroendoosmosis

Cátoda

Particular cobertura en la superficie interna del capilar, en condiciones de pH alcalino o neutro, permiten muy buenas separaciones.

El FEO puede ser afectada ajustando la concentración y la fuerza iónica del buffer; elevadas concentraciones del buffer son útiles para la limitación de las interacciones iónicas, por disminución de las alteraciones iónicas contra la pared, pero el calentamiento de los capilares limita el uso de las concentraciones elevadas de los buffer.

La concentración de los buffer debe oscilar entre 10 a 50 mM, aunque es posible emplear concentraciones entre 100 a 500 mM.

Las modificaciones del FEO pueden ser controladas alterando la cubierta dinámica, agregando aditivos al buffer, o con cubiertas covalentes.

III. VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS EN FC

1.0 Características generales

El uso de un método analítico, se justifica sólo después de haber descubierto que es válido (6).

El objetivo de validar un método analítico es demostrar que éste es apropiado para cuantificar lo que pretende. (4).

  • 2.0 Especificidad/ Selectividad

Es la habilidad de un método analítico para obtener una respuesta debida únicamente a la sustancia de interés y no a otros componentes de la muestra. (9)

  • 3.0 Precisión (repetibilidad)

La precisión de un método analítico es el grado de concordancia entre resultados analíticos individuales cuando el procedimiento se aplica repetidamente a diferentes muestreos de una muestra homogénea del producto. Usualmente se expresa en términos de Desviación Estándar o del Coeficiente de Variación. (9)

La precisión es una medida del grado de reproducibilidad y/o repetibilidad del método analítico bajo las condiciones normales de operación.

Se determina por el análisis sextuplicado de una misma solución estándar correspondiente al 100% establecido en la linearidad del sistema.

4.0 Linearidad

La linearidad de un sistema o método analítico es su habilidad para asegurar que los resultados analíticos, los cuales pueden ser obtenidos directamente o por medio de una transformación matemática bien definida, son proporcionales a la concentración de la sustancia dentro de un intervalo determinado. (9)

Se determina, construyendo una curva de calibración (concentración vs respuesta media) utilizando cuando menos 5 diluciones preparadas a partir de una misma solución patrón y haciendo análisis cuando menos por duplicado para cada dilución

4.1 Unearidad del sistema

En la linearidad del sistema se demuestra la relación lineal que existe entre la concentración de analíto adicionada y la respuesta del instrumento.

5.0 Exactitud

La exactitud de un método analítico es la concordancia entre un valor obtenido experimentalmente y el valor de referencia. Se expresa como el por ciento de recobro obtenido del análisis de muestras a las que se les ha adicionado cantidades conocidas de la sustancia. (9)

Se determina de, cuando menos, 6 muestras de manera independiente con la cantidad necesaria de la sustancia de interés para obtener la concentración del

100%, utilizando el método propuesto o bien, realizar la prueba a tres niveles de concentración por triplicado. Haciendo el análisis en las mismas condiciones de operación y por el mismo analista.

6.0 Otros parámetros a evaluar

Estabilidad de la muestra. Es la propiedad de una muestra preparada para su cuantificación, de conservar su integridad fisicoquímica y la concentración de la sustancia de interés, después de almacenarse durante un tiempo determinado bajo condiciones específicas.

Estabilidad del buffer. Es la propiedad de una sustancia amortiguadora de conservar sus características fisicoquímicas para llevar a cabo la separación de la muestra bajo condiciones precisas y exactas.

OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Objetivo General

Diseñar y validar un método analítico para la cuantificación de ácido valpróico como materia prima por Electroforesis Capilar.

Objetivos específicos:

Establecer las condiciones necesarias para la preparación de la muestra, como disolventes utilizados, concentración final, pH, temperatura, tiempo de agitación, y sonicación. Determinar las condiciones adecuadas para la conservación de la muestra y el sistema buffer empleado. Establecer las condiciones operacionales para el análisis en el equipo de CE, como tipo y diámetro interno del capilar, longitud total y efectiva del mismo, polaridad, temperatura, voltaje, corriente, volumen de inyección, tipo de separación, entre otros Establecer los parámetros de adecuabilidad del sistema como área bajo la curva, simetría del pico, resolución y eficiencia. Desarrollar un sistema buffer adecuado para la cuantificación del ácido valpróico de forma directa tomando en cuenta las propiedades ácido-básicas de la molécula y las condiciones operacionales del equipo para establecer el pH y concentración (fuerza iónica) del mismo. Evaluar la especificidad/selectividad del método demostrando que el método es capaz de cuantificar sólo el analíto de interés. Evaluar la precisión del sistema (repetibilidad) con una desviación estándar relativa no mayor a 2%.

• Evaluar la exactitud con un por ciento de recobro de 98 a 102% y una desviación estándar relativa no mayor a 2%. Evaluar la linearidad del sistema demostrando un coeficiente de determinación mayor a 0.98.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Para el desarrollo y validación del método analítico se empleó un equipo de Electroforesis capilar marca Beckman coulter modelo MDQ P/ACE equipado con una fuente de poder para generar los electroferogramas; un capilar negativo de siica de 75 ism de diametro interno y una longitud efectiva de 50 cm, para la detección se empleó un detector de arreglo de diodos con un filtro óptico a 200 nm y para la identificación un barrido de 190 a 400 nm. La inyección de la muestra fue de forma hidrodinámica. Se emplearon viales de borosilicato estándar de 2 mL para contener la muestra y el buffer de separación.

Además se emplearon reactivos y disolventes con las siguientes características:

Estándar de referencia y muestra:

Nombre

Identificación

Valoración (%)

Ácido Valpróico ST

5LR109863

99.98

Ácido Valpróico MTA

J100326

99.54

Reactivos:

Nombre Agua grado HPLC

Burdick

Marca

&Jackson

ACS/HPLC

Fosfato monobásico

de

J.T. BAKER

sodio Hidróxido de sodio

J.T. BAKER

Metanol

Burdick

&Jackson

ACS/ HPLC

Ácido bórico

JT. BAKER

Diseño del método analítico

En base a las características fisicoquímicas del analito, se realizaron las

siguientes pruebas:

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Se pesaron 20 mg de AV en un matraz Volumétrico de 100 mL aforando con

las siguientes mezclas de disolventes:

Agua 100%, agua-metanol 95:05, 90:10, 85:15 y 80:20; con agitación

constante.

Nota: Se adicionó en primera instancia el metanol y después, lentamente el agua con agitación constante.

SELECCIÓN DEL BUFFER DE SEPARACIÓN

Para garantizar que la molécula se encuentre ionizada, se trabajo a un pH

arriba de 4.6 (valor de pKa del Ay), por lo que se realizaron experimentos con

buffer de fosfatos a pH 7.2 y de boratos a pH 8.3.

El buffer de separación de fosfatos a pH 7.2 fue preparado a partir de

Fosfato monobásico de sodio monohidratado y ajustado el pH con hidróxido de

sodio 1 N y el buffer de boratos de pH 8.3 a partir de ácido bórito ajustado el pH

de igual forma con hidróxido de sodio 1 N.

Se inyectaron por duplicado utilizando cada buffer a polaridad normal e

invertida muestras de AV a una concentración de la muestra de 1 mg/mL y 75 mM

la concentración del buffer, a 20 kV con inyección hidrodinámica a 5 psi de

presión, con una temperatura de capilar ambiente en corridas de 20 minutos.

Todas las muestras y buffer de separación se sonicaron por 5 minutos y se filtraron

a través de un filtro Millipore de 0.22 jim antes de su uso. El buffer se preparó cada

día de experimentación.

AJUSTE DEL MÉTODO

De acuerdo al buffer de separación seleccionado, se ajustaron los siguientes

parámetros:

• Voltaje de separación

• Temperatura del capilar

o Concentración de la muestra

• Secuencia de lavado (acondicionado del capilar)

• Concentración del buffer

Se establecieron las condiciones de adecuabilidad del sistema para el

método (platos teóricos, asimetría, área y resolución, además del coeficiente de

variación para cada uno de estos parámetros), con lo que se demostró que el

equipo, reactivos utilizados y condiciones de trabajo no afectaron en los resultados.

Validación del método

Para realizar la validación se evaluó:

1.0 Especificidad/Selectividad:

Se inyectó por duplicado:

• Una solución de estándar de AV a 200 jig/mL

• Una muestra de materia prima de AV a 200 jig/mL

• Una solución blanco

• Solución Buffer

2.0

Linearidad del sistema

Se realizó por triplicado una solución stock, de la cual se obtuvieron las

siguientes concentraciones en la curva de calibración:

raáaa5

vaiproico (kg/mL)

100

150

200

250

300

Previamente verificados los parámetros de adecuabilidad del sistema de

electroforesis capilar, se realizaron dos inyecciones de cada nivel de concentración.

3.0 Exactitud del método

Se preparó de manera independiente 6 muestras de ácido valproico al 100% de

concentración (200 ig/mL) de materia prima de a cuerdo a la preparación de la

muestra, indicada en la metodología.

Una vez verificado el cumplimiento de los parámetros de adecuabilidad del

sistema se realizaron dos inyecciones de cada muestra.

4.0 Precisión (repetibilidad)

Se analizaron de manera independiente, pero de la misma solución patrón 6

muestras al 100% de la concentración de prueba (200 j.tg/mL), utilizando

soluciones estándar.

Una vez verificado el cumplimiento de los parámetros de adecuabilidad, se

inyectaron por duplicado las muestras en el equipo de electroforesis capilar.

5.0 Estabilidad del buffer de separación.

Se inyectó una misma muestra de AV varias veces, hasta que el buffer perdiera

la capacidad de mantener el voltaje y corriente de separación apropiados para

la separación.

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

DESARROLLO DEL MÉTODO

  • 1.0 Preparación de la muestra

Se observó rápida disolución de la muestra en la mezcla 95:5 agua-metanol, con un tiempo de agitación no mayor a 5 minutos.

  • 2.0 Sistema Buffer de separación

Experimento Buffer de boratos pH 8.3 con polaridad nornal Buffer de boratos pH 8.3 con polaridad invertida Buffer de fosfatos pH 7.2 con polaridad normal

Buffer de fosfatos pH 7.2 con polaridad invertida

Resultado No se observó respuesta

No se observó respuesta

Se observó respuesta del analito, lo que fue corroborado por medio de analisis espectral. No se observó respuesta

3.0 AJUSTE DEL MÉTODO

Se disminuyó la concentración de la muestra, para proporcionar mayor simetría al pico, al aumentar la temperatura del capilar y disminuir la concentración del buffer de separación, se logró disminuir el tiempo de migración de la molécula y de acuerdo a los resultados obtenidos, se estableció la secuencia apropiada de acondicionamiento del capilar previo a la inyección de la muestra, obteniendo las siguietes características del método analítico:

Preparación de la muestra: Pesar 20 mg de AV en un matraz volumétrico de 100 mL, adicionar 5 mL de metano! grado HPLC y lentamente aforar con agua.

Preparación del buffer de separación (fosfatos 5OmM): Pesar 1.2 g de fosfato monobásico de sodio y agregar 160 mL de agua a un matraz agitar hasta completa disolución, ajustar el pH con hidróxido de sodio 0.1 N a 7.2 y aforar a 200mL.

Condiciones de separación: Previo a la inyección de la muestra se acondiciona el capilar con el buffer de separación por 2 minutos a 20 psi de presión, se inyecta por 10 segundos a 1 psi de presión la muestra de AV y posteriormente se inyecta durante 5 segundos a 0.5 psi de presión buffer de separación (para asegurar la eficiencia de separación); Para la separación se aplica un voltaje de 26 kV con una temperatura de capilar de 30 oc en un capilar de 50 cm de longitud efectiva, con un diámetro interno de 75 jim. Las muestras son conservadas en el carrousel a 20 °c con un tiempo de corrida de 8 minutos y un tiempo de migración del AV de 5.5 minutos. La detección se realiza mediante un detector fotométrico UV sencillo a 200 nm.

Adecuabilidad del sistema. Después del ajuste del método, se observó que el método es consistente siempre y cuando se demuestre que el sistema cumple con los parámetro establecidos para la adecuabilidad del sistema

Área bajo a curva Platos teóricos Resolución Asimetría

>50,000

%cV c 2%

> 6,000

>1

de 0.5 a 1.5

VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

1.0 ESPECIFICIDAD/SELECTIVIDAD

1.1 Adecuabilidad del Sistema.

Parámetro de

Especificación

Resultado

-

Adecuabihdad

 

%PSD

 

Ácido _vaiproico

Inyección 1

Inyección 2

Inyección 3

Asimetría

05-1.5

Mayor a 6000

0.564

0.564

0.566

0.2

Eficiencia (N)

6996

14.115

69863

6837

14.087

68698

 

7029

1.5

Resolución

Mayor a 1

14.517

1.7

Mayor a 50.000

70295

1.2

Área bajo la curva

1.2 Prueba Analítica.

 

Figura No.

Coiícentración. F

-

E

 

Muestra

-final AY

/Árede pico

 

Observación

 

(iig/mL)

El

El espectro UV obtenido al tiempo de migración

 

Estándar AV

203.2

588452

58849.8

del AV es igual al reportado bibliográficamente.

E2

Muestra de AV

215.1

62352.1

62368.7

El espectro Uy obtenido

E3

es igual al del estándar. No se observa

 

Blanco de

interferencia del blanco

Disolventes

o

o

en el electroferograma

E4

Disolventes:

ni en el espectro. No se observa interferencia del fuifer

Buffer de

-------

O

o

separación

en el electroferograma m en el espectro.

Figura El. Estándar de AV a 200 RgImL.

D:\32KaraIData\AcidovaIproico\ESPECIFICIDAD STÓa-Repl

o

- —

-

lo

lo-

0

o1I<

4

min.

—.--

-lo -

Figura E2. Muestra de AV a 200 jsglmL.

D:\32KaraflDatacjdovaIproj\EspEcIF ,cloAo MTAa-Rep2

10

o

1

2

- ..

min.

.0

•---------

:

-,--

7

,.,.U-

..

--

¡1:

Ainn

—;--;;••

____

,ø

260

nm

200

lo

Figura S. Blanco de disolventes

O:32Karat\Data\AcjdovaIproico\EspEcIFlcIDAD BLANCOa-Rep2

o

-10

--

Figura E4. Buffer de separación

D:32Karat\Data\AcidovaIprojcoESPEcIFlciDAD BUFFa-Repl

lo-

o

-lo

-

-. -lv

-

2.0 LINEARIDAD DEL SISTEMA

 

Fci

2.1

Adecuabilidad del sistema

FJ

!ttS

 

!WÁ7cid6a1jiiók&P !

iIñ3/ecdóiill

}Iñédón 21 IPfohtédiól irsj

Asimetría

10.54.5

0.56119

0.0.55907

0.56013

0.268

Eficiencia (N)

Mayor a 6000

6999

6967

6983

0.323

Resolución

Mayor a 1

17.48246

14.70641

16.09443

12.197

Area bajo la

Mayor a 50.000

69686

69217

69452

0.478

curva

  • 2.2 Prueba Analítica

Peso Muestra 1: 258 mg

 

Peso Muestra 2: 247 mg

Peso Muestra 3: 252 mg

Peso teórico: 250 mg

Preparacón de los niveles de concentración:

 

Stock (250 mg/SO mL) x 6mL1I00mL

150%

Stock (250 mg/SO mL) x SmUlOOmL

125%

Stock (250 mg/SO mL) x 4mL1100mL=

100%

Stock (250 mg/SO mL) x 3mUI00mL=

75%

Stock (250 mg/SO mL) x 2mUI00mL

50%

 

Çncentrad óiJ

FÍnaIdeAV

Z(/L)

•fl -_

 
 

Muestra

.1

 

ftme dio

  • 1 103.2

88657

88781

88719.0

  • 2 98.8

87662

87425

87543.5

  • 3 100.8

85016

83903

84459.5

  • 1 154.8

66400

67770

67085.0

  • 2 148.2

73442

73100

73271.0

  • 3 151.2

70100

70651

70375.5

  • 1 206.4

58417

58795

58606.0

  • 2 197.6

56333

56077

56205.0

  • 3 201.6

56284

56917

56600.5

  • 1 258.0

41176

40975

41075.5

  • 2 247.0

41787

41024

41405.5

  • 3 252.0

41807

40707

41257.0

  • 1 309.6

29155

29000

29077.5

  • 2 296.4

27535

27306

27420.5

  • 3 302.4

27829

28194

28011.5

1.Ü

9Ü0.Ü

Linearidad del Sistema

70000.0

o =

cc

cc

-n

cc

50000.0

40000.0

+S2

-t-Stcdç3

+Promecio

Regresán lineal

30000.0

20000.0

icoco.a

0.0

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Nivel de Concentración

120%

140%

1601A

3.0 EXACTITUD

3.1 Adecuabilidad del sistema

3.2 Prueba analítica

4.0 Precisión (Repetibilidad)

4.1 Adecuabilidad del sistema

PaTámetro d

Especificación

:Adecuabihdad

Parámetro de

Especificación

Adecuabilidad

Ácido valpróico

Asimetría

0.5-1.5

Eficiencia (N)

Mayor a 6000

Resolución

Mayor a 1

Area bajo la

Mayor a 50.000

curva

Inyección 1

0.56036

8656

15.80802

55420

Resultado

v••:

Resultado

 

%RSD

Inyección 2:

Inyección 3

0.56866

0.56574

0.746

8209

8067

3.702

18.79032

18.57679

9.386

54383

54796

0.952

4.2 Prueba analítica

Area bajo la curva de AV

  • - Peso AV

Muestra

Cantidad Final

 

(mg)

de AV (j.tg/mL)

Rep 1

Rep 2

Promedio

1

20.7

207

54194

54190

54192.0

2

20.7

207

53439

52434

52936.5

3

20.7

207

54143

52788

53465.5

4

20.7

207

54174

52215

53194.5

5

20.7

207

52739

53359

53049.0

6

20.7

207

52399

52426

52412.5

Estándar

Promedio:

53208.3

de

801.56

referencia

Desv

St- 11

1.51

5.0

Estabilidad de buffer

  • 5.1 Adecuabilidad del sistema

PáfáffiéffbTdé1 E5édfkádóff

FAai Lsfr'Si

tSAcidó vaIFóicfl

Asimetría

Eficiencia (N)

Resolución

Área bajo la

curva

0.5-1.5

__

Mayor a 6000

Mayor a 1

Mayor a 50.000

 

Réii1tido

 

IIñyétEóff II lcióff

_

h

V

_

Iñ3 eccióñ 31

0.56853 0.57332

 

0.56490

0.742

8523

8495

8721

1.433

18.80345

18.69675

 

18.99162

0.793

51778

52825

51197

1.589

7.2 Prueba analítica. Muestra: 204 gg/mL

Un par de viales de buffer son estables para 23 corridas.

AE?N ..

REP1

104.67

REP2

103.48

REP3

103.29

REP 4

103.50

REP5

103.48

REP6

101.75

REP7

105.52

REP8

102.87

REP9

104.92

REPlO

103.78

REP11

104.23

REP12

104.62

REP13

105.49

REP14

104.18

REP1S

104.92

REP16

103.97

REP17

104.37

REP18

104.39

REP19

104.21

REP20

103.86

REP21

105.12

REP22

105.38

REP23

105.96

REP24

Sin señal

tt'nt"'fl Media

104 26WW

*aas_Desvést 0.97 SI

rtana.%Cv

093tL_-

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

Se logró diseñar un método analítico especifico para la cuantificación del

ácido valproico como materia prima por electroforesis capilar, mediante

detección fotométrica directa a 200 mu, con polaridad normal y tiempo de

corrida de 8 minutos, con un tiempo de migración del ácido valproico de 5.8

minutos.

Se establecieron los parámetros de adecuabilidad del sistema para el

método analítico.

Se estableció el número de inyecciones apropiadas para un mismo par de

viales de buffer de separación.

Se demostró, mediante la validación, que es un método especifico, exacto,

preciso (repetible) y lineal.

CONCLUSIONES

a. Diseño del Método

El método desarrollado está diseñado para cuantificar ácido vaiproico

como materia prima por electroforesis capilar.

Es un método sencillo, utiliza una mezcla agua-metano¡ 95:5 como disolvente del

ácido valproico, la temperatura de trabajo es de 30 °C durante la separación, se

emplea un buffer de fosfatos 50mM a pH de 7.2, con tiempos de corrida de 8

minutos y utilizando un detector UV sencillo a una longitud de onda de 200 nm,

obteniendo picos simétricos, con alta resolución y eficiencia.

r. nr

b. Validación del Método

El método analítico diseñado y validado para la cuantificación de ácido

valproico como materia prima por electroforesis capilar es específico, ya que el

análisis espectral el estándar al tiempo de migración del AV (5.8 mm) es similar

al reportado bibliográficamente para este fármaco, así como no se observa

interfer4encia del blanco de disolventes, ni del buffer de separación empleados;

es exacto, ya que se demostró un por ciento de recobro del 99.75%, con una

desviación estándar relativa de 1.10 0/o; es preciso, ya que se obtuvo una

desviación estándar relativa de 1.51%; y linear, ya que se obtuvo un coeficiente

de determinación (r2) de 0.9993.

El buffer es capaz de mantener la corriente y el voltaje, hasta en 23 inyecciones

un mismo par de viales.

PRUEBA

ESPECIFICIDAD

PRECISIÓN DEL SISTEMA EXACTITUD DEL MÉTODO

LINEARIDAD DEL SISTEMA ROBUSTEZ. ESTABILIDAD DEL BUFFER

RESULTADO El análisis espectral del AV demuestra que el método es específico para este fármaco. No interfieren ni disolventes de preparación, ni el buffer de separación

%CV = 1.51%

Recobro: 99.75%

%C.V.= 1.10%

r2=0.9993

El buffer de separación es estable hasta 23 inyecciones del mismo par de viales.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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12.United States Pharmacopeia. XXVII. 2004. CC [1225]. Validation of

Coinpendial Methods. p.2622-2625.

1

VoBo DEL CONTENIDO ACADEMICO

2 /JX

M. en C. Ma. Luisa Margarita

Vázquez Ramírez

e

M.en C. Edilberto Pérez

Montoya

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

UNIDAD XOCHIMILCO

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE SISTEMAS BIOLÓGICOS

QUÍMICO FARMACÉUTICO BIOLOGO

INFORME DE ACTIVIDADES DEL SERVICIO SOCIAL

"Diseño y validación de un método analítico para la cuantificación de

ácido valpróico en materia prima por electroforesis capilar"

PERTENECE AL PROYECTO GENÉRICO

"Evaluación de productos relacionados con la salud".

Alumno: Agustín Flores Luna

Matrícula: 99345658

Dirección: Diamante # 35 Col. Estrella, México D.F.

Teléfono: 57-59-60-38.

Asesores:

M. en C. Ma. Luisa Margarita Vázquez Ramírez

M. en C. Edilberto Pérez Montoya

LUGAR DE REALIZACIÓN: Departamento de Biofarmacia en la Escuela Nacional de

Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional

FECHA DE INICIO: Febrero, 2003

FECHA DE TERMINACIÓN: Octubre, 2003

Febrero, 2005

Introducción

El ácido valpróico (AV) y sus sales de magnesio y sodio son fármacos

antiepliépticos de primer nivel (Rabasseda, 1994).

El análisis de la pureza de este fármaco, en las distintas farmacopeas está

reportado por medio de titulación y cromatografía de gases (CG).

EL AV es una molécula muy pequeña, con una doble ligadura en el grupo

carboxilo, con un Xmax 213 nm, lo que dificulta su detección de manera directa

por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), ya que emplea

disolventes orgánicos que interfieren con la lectura a esa longitud de onda tan baja.

Con el avance tecnológico, una alternativa al uso de la cromatografía en separación

y cuantificación de macromomoléculas y micromoléculas es la Electroforesis

capilar (EC), la cual ofrece grandes ventajas con respecto a la cromatografía, ya que

para el manejo de las muestras no se requiere del empleo de grandes temperaturas,

uso de disolventes tóxicos y de alto costo, gases, tiempos de análisis prolongados,

muestra mayor selectividad y eficiencia en la separación, etc.; puesto que en su

gran mayoría, se emplean soluciones acuosas con muy baja concentración iónica.

La EC es una técnica moderna, en la que la separación se realiza por cargas y peso

molecular del analíto en una matriz sencilla o compleja, dentro de un capilar de

silice fundido, al aplicar cierto voltaje que propicie la migración de las moléculas

dependiendo de su tamaño y carga (positiva o negativa). Las moléculas migran del

ánodo al cátodo en fase normal. Las moléculas que se detectan primero son los

cationes pequeños, luego los cationes grandes, posteriormente las moléculas

neutras (sin carga) y al último los aniones grandes y pequeños.

El flujo electroosmótico (FEO) es un fenómeno fisicoquímico, que permite explicar

la capacidad de esta técnica para separar compuestos de cualquier tipo, incluso

moléculas neutras y está directamente relacionado con la estructura interna del

capilar.

Para la separación se usan buffer, por lo general iónicos, a concentraciones bajas y

la inyección de la muestra puede ser por presión, vacío o electrocinética.

Los componentes esenciales de un equipo de EC son una fuente de poder, capilar,

electrodos y el detector, controlados a través de una computadora. Se acondiciona

el capilar con el buffer de separación, después toma la muestra y posteriormente

inicia la separación al introducir los electrodos dentro del buffer de separación y al

aplicar voltaje, la señal es recibida por el detector y comienza a monitorear la

corrida, observándose así los electroferogramas.

Los parámetros críticos de la separación en EC son: el pH, que permite modificar la

fuerza del FEO y de esta manera inducir la movilidad de las moléculas neutras.

Permite también la ionización de las moléculas con características ácido-básicas; y

la fuerza iónica (concentración del buffer) que es el contenido de iones dentro del

buffer de separación. Su control permite modificar la corriente generada durante la

separación.

OBJETIVO GENERAL

Diseñar y validar un método analítico para la cuantificación de ácido valpróico como materia prima por Electroforesis Capilar.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Establecer las condiciones necesarias para la preparación de la muestra, como

disolventes utilizados, concentración final pH, temperatura, tiempo de

agitación, y sonicación.

Determinar las condiciones adecuadas para la conservación de la muestra y el

sistema buffer empleado.

Establecer las condiciones operacionales para el análisis en el equipo de CE,

como tipo y diámetro interno del capilar, longitud total y efectiva del mismo,

polaridad, temperatura, voltaje, corriente, volumen de inyección, tipo de

separación, entre otros

• Establecer los parámetros de adecuabilidad del sistema como tiempo de

migración, simetría del pico, resolución.

• Desarrollar un sistema buffer adecuado para la cuantificación del ácido

vaiproico de forma directa tomando en cuenta las propiedades ácido-básicas de

la molécula y las condiciones operacionales del equipo para establecer el pH y

concentración (fuerza iónica) del mismo.

• Evaluar la especificidad/selectividad del método demostrando que el método

es capaz de cuantificar sólo el analíto de interés.

Evaluar la precisión del sistema (repetibilidad) con una desviación estándar

relativa no mayor a 2%.

Evaluar la exactitud del método con un por ciento de recobro de 98 a 102% y

una desviación estándar relativa no mayor a 2%.

Evaluar la linearidad del sistema demostrando un coeficiente de

determinación mayor a 0.98.

METODOLOGÍA

Para el desarrollo y validación del método analítico se empleó un equipo de

Electroforesis capilar marca Beckman coulter modelo MDQ P/ACE equipado con

una fuente de poder para generar los electroferogramas; un capilar negativo de

silica de 75 p.m de diámetro interno y una longitud efectiva de 50 cm de largo, para

la detección se empleó un detector de arreglo de diodos con un filtro óptico a 200

nm y para la identificación un barrido de 190 a 400 nm. La inyección de la muestra

fue de forma hidrodinámica. Se emplearon viales de borosilicato estándar de 2 mL

para contener la muestra y el buffer de separación.

Todas las soluciones fueron preparadas usando agua grado HPLC marca Burdik &

Jackson, se sonicaron por 5 minutos y se filtraron a través de un filtro Millipore de

0.22 jim antes de su uso. El buffer se preparó cada día de experimentación.

Con el fin de ionizar la molécula de AV se realizaron experimentos con buffer de

separación de boratos y fosfatos a pH de S. y 7.2 respectivamente, con polaridad

normal e invertida, onservando fijas variables como: Voltaje de separación: 20 kV,

Temperatura de capilar: ambiente, Concentración del buffer: 75 mM,

Concentración de la muestra: lmg/mL y tiempo de corrida: 20 minutos.

Del resultado de estos experimentos se seleccionó el buffer más apropiado y se

realizaron los ajustes necesarios a las condiciones operacionales del método y del

equipo, para obtener las condiciones optimas del método y establecer los

parámetros de adecuabilidad del sitema.

El método analítico se validó bajo los parámetros de exactitud, precisión,

linearidad, robustez y especificidad.

RESULTADOS

Preparación de la muestra: Pesar 20 mg de AV en un matraz volumétrico de 100 mL, adicionar 5 mL de metano? grado H.PLC y lentamente aforar on agua.

Preparación del buffer de separación (fosfatos 50mM): Pesar 1.2 g de fosfato monobásico de sodio y agregar 160 mL de agua a un matraz agitar hasta completa disolución, ajustar el pH con hidróxido de sodio 0.1 N a 7.2 y aforar a 200mL.

Condiciones de separación: Previo a la inyección de la muestra se acondiciona el capilar con el buffer de separación por 2 minutos a 20 psi de presión, se inyecta por 10 segundos a 1 psi de presión la muestra de AV y posteriormente se inyecta durante 5 segundos a 0.5 psi de presión buffer de separación (para asegurar la eficiencia de separación); Para la separación se aplica un voltaje de 26 kV con una temperatura de capilar de 30 °C en un capilar de 50 cm de longitud efectiva, con un diámetro interno de 75 j.tm. Las muestras son conservadas en el carrousel a 20 °C con un tiempo de corrida de 8 minutos y un tiempo de migración del AV de 5.5 minutos. La detección se realiza mediante un detector fotométrico 11V sencillo a 200 nm.

Adecuabilidad del sistema. Después del ajuste del método, se observó que éste es consistente siempre y cuando se demuestre que el sistema cumple con los parámetro establecidos para la adecuabilidad del sistema

Área bajo acurva

>50,000

%CV c 2%

Platos teóricos

> 6,000

Resolución

>1

Asimetría

de 0.5 a 1.5

VALIDACIÓN DEL MÉTODO.

PRUEBA

ESPECIFICIDAD

PRECISIÓN DEL SISTEMÁ EXACTITUD

LINEARIDAD DEL SISTEMA ROBUSTEZ ESTABILIDAD DEL BUFFER

RESULTADO

El análisis espectral del AV demuestra que

el método es específico para este fármaco.

No interfieren ni disolventes de preparación,

ni el buffer de separación

%CV = 1.51%

Recobro: 99.75%

%C.V.= 1.10%

r20.9993

El buffer de separación es estable hasta 23

inyecciones del mismo par de viales.

CONCLUSIONES

  • a. Diseño del Método

El método desarrollado está diseñado para cuantificar ácido valproico como

materia prima por electroforesis capilar.

Es un método sencillo, utiliza una mezcla agua-metanol 95:5 como disolvente del

ácido valproico, la temperatura de trabajo es de 30 °C durante la separación, se

emplea un buffer de fosfatos 50mM a pH de 7.2, con tiempos de corrida de 8

minutos y utilizando un detector U y sencillo a una longitud de onda de 200 nm,

obteniendo picos simétricos, con alta resolución y eficiencia.

  • b. Validación del Método

El método analítico diseñado y validado para la cuantificación de ácido

valproico como materia prima por electroforesis capilar es específico, exacto,

preciso y linear.

'Iii

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Rabasseda, X. 1994. Drugs of today. Departamento de información y Documentación médica Prous Xcience, Barcelona. supi. 7.

  • 2. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. 2000. 7' ed Secretaría de Salud.

  • 3. ICI-I Steering Comittee 1996. Guidance for Industry. Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology.

  • 4. ICH Steering Comittee 1995. Guidance for Industry. Q2A Text on Validation of analytical procedures.

  • 5. Florey, K. 1982. Analytical Profiles of drug substances v.8. Ed. Academic Press Inc. USA.

  • 6. Gennaro A. R. 1999. Remington Farmacia. 19 ed. Ed.médica Panamericana. Buenos Aires, Arg.

  • 7. Giliman G. A. & Ggriffith, J . 1981. Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica. 6 ed. Ed Médica Panamericana. México.

  • 8. Castagnino, J . Miguel. 2000. Electroforesis Capilar.

Bioquímica. 25. 1-98.

  • 9. Gerard C. H. A Lft Cycle to the Validation of Pharmaceutical Product Developnient, part 1: The Inicial Method Validation Process. Pharmaceutical Technology. 1994.118-130.

10.United States Pharmacopeia. XXVII. 2004. GC [1225]. Validation of

Conipendial Ivlethods. p.2622-2625.

11. Heiger, D. 2003 Determination of Small Ions by Capillary Zone Electrophoresis with Indirect Photometric Detection. Agilent Technologies.

12.Jones, W. R. y Jandik, P. 1991.Controlled changes of selectivity in 11w separation of iones by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography, 546. 445-458.

VoBo DEL CONTENIDO ACADÉMICO

M. en C. Ma. Luisa Margarita Vázquez Ramírez

fi

M.eifÉ. Edilberto Pérez Montoya

ANEXOS

r.

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL DESARROLLO DEL METODO

0

30-

1.

20

10

2

4

6

2

4

6

6

iO

12

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8

10

12

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D c
D
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14

16

16

20

 

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-20

 

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-10

14

10

10

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91

91

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9

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1

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01

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9

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E

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REPORTE DE SERVICIO SOCIAL

VALORACIONI ACIDO VALPROICO

VALIDACION DEL METODO ANALITICO

ESPECIFICIDAD

Estabilidad del Buffer Mta: ESPECIFICIDAD BCO 1124105 5:21:06 PM

D

E

-

4

00

1

2

3

4

Minutes

5

6

7

D:32KaratData'iAcidovalproico\ESPECIFICtDAD BLANCOa-Repl

D

lo-

0

-lolo --

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL

VALORACION ACIDO VALPROICO

VALIDACION DEL MET000 ANALITICO

ESPECIFICIDAD

Estabilidad del Buffer Mta: ESPECIFICIDAD BUFF 1124105 4:55:34 PM

4 E

Minutes

D:\32Karat\Data\Acidovalproico\ESPECIFICIDAD BUFFa-Repl

lo

o

-lo

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL

VALORACION ACIDO VALPROICO

VALIDACION DEL METODO ANALITICO

ESPECIFICIDAD

Estabilidad del Buffer Mta: ESPECIFICIDAD STD 1124105 5:59:45 PM

7.5

5.0

D

E

2.5

D

E

0.0

-2.5

0

1

2

3

4

Minules

5

6

7

8

-5.0

D:\32Karat\Data\AcidovaIproicoESPECIFICIDAD STDa-Rep2

lo

o

-10

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL

VALORACION ACIDO VALPROICO

VALIDACION DEL METODO ANALITICO

ESPECIFICIDAD

Estabilidad del Buffer Mta: ESPECIFICIDAD MTA 1124105 6:12:46 PM

7-5 5.0 2.5 D E E 0.0 -2.5 0 1 2 3 4 5 6 7
7-5
5.0
2.5
D
E
E
0.0
-2.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8

Inutes

D:\32KaratData'iAcidovaIproico\ESPEClFlCIDAD MTAa-Repl

10

0

-10

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL VALORACION DE ACIDO VALPROICO

VALIDACION DEL METODO ANALITICO

 

System is

Suitable

UV -

Compound

Parameter

Min

Max

%RSD

200m

 

acido

asyrnm

0.5

1.5

vaiproico

 

tpusp

6000

arca

50000

2

resusp

1

Sample ID

Compound

Parameter

Average

Low

High

%RSD

Status

acido

asymm

0.56492

0.56036

0.56866

0.746

vaiproico

st!

0.56036

Passed

PREC 1510

NI

sU!

0.56866

Passed

PRECISIO

Ni

sU!

0.56574

Passed

PRECISIO

NI

 

tpusp

83111

8067

8656

3.702

sU!

8656

Passed

PRECISIO

NI

std

8209

Passed

PRECISIO

Ni

std

8067

Passed

PRECIS1

Ni

 

area

54866

54383

55420

0.952

sU!

55420

Pasaed

PRECISIO

NI

sU!

54383

Passed

PRECISIO

NI

std

54796

Passed

PRECISIO

NI

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL VALORACION DE ACIDO VALPROICO

VALIDACION DEL METODO ANALITICO

 

resusp

17.72504

15.80802

18.79032

9.386

std

15.80802

PREC LS LO

NI

std

18.79032

PRECISIO

NI

std

18.57679

PRECISIO

NI

Passed

Passed

Passed

VALIDACION DEL METODO

PRECISION DEL SISTEMA

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL

PRECISION1

54194.00

0.56

15.47

Ama

8271.26

5.64

94.22

PRECISION1

54190.00

0.57

15.39

Area

8128.92

5.62

94.21

PRECISION2

53439.00

0.57

18.57

Ama

8209.16

5.60

92.90

PRECISION2

52434.00

0.57

19.04

Ama

8679.78

5.59

91.16

PRECISION3

54143.00

0.57

15.11

Area

8010.50

5.54

94.13

PRECSION3

52788.00

0.57

15.42

Ama

8747.92

5.55

91.77

PRECISION4

54174.00

0.56

15.37

Area

7998.17

5.60

94.18

PRECISION4

52215.00

0.56

18.76

Area

8334.76

5.60

9178

PRECISION5

52739.00

0.57

15.91

Area

8662.20

5.58

91.69

PRECISION5

53359.00

0.57

19.31

Ama

8906.97

5.57

92.76

PRECISION6

52399.00

0.57

18.80

Area

8522.23

5.55

91.10

PRECISION6

52426.00

0.56

18.91

Ama

8640.47

5.54

91.14

 

Mm:

52215.00

0.56

15.11

7998.17

5.54

90.78

Max:

54194.00

0.57

19.31

8906.97

5.64

94.22

Mean:

53208.33

0.57

17.17

8426.03

5.58

92.50

SM 0ev:

801.56

0.00

1.82

306.54

0.03

1.39

%RSD:

1,51

0.79

10.59

Error!

Error!

1.51

01122105 02:13:29 PM

 

sgsetwq

111 -1

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL VALORACION ACIDO VALPROICO

VALIDACION DEL MET000 ANALITICO Precision del sistema Muestra PRECISIONI 1121/05 7:25:28 PM

D

D

0

1

2

3

4

5

6

7

8

 

Minutes

13V - 200nm

Results

Name

Migration

Área

ESTD

Theoretical

Resolution

Asymmetiy

Time

concentration plates (USP)

 

(USP)

acido

5.642

54194

94.216

8271

15.46990

0.56295

vaiproico

Totais

 

54194

94.216

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL VALORACION ACIDO VALPROICO

VALIDACION DEL METODO ANALITICO Precision del sistema Muestra PRECISION2 1/21105 7:51:41 PM

 

0.010

0.005

D

o

 

0.000

-0.005

0

1

2

3

4

5

6

7

8

 

Minutos

UV-200nm

Results

Name

Migration

Arta

ESTD

Theoretical

Resolution

Asynuaetiy

Time

concentration piales (USP)

(USP)

acido

5.600

53439

92.903

8209

18.57256

0.57282

vaiproico

Totais

 

53439

92.903

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL VALORACION ACIDO VALPROICO

VALIDACION DEL METODO ANALITICO Precision del sistema Muestra PRECISION3 1121105 8:18:40 PM

0-ole

0.005

o

0.000

-0.005

 

0

1

2

3

4

5

6

7

 

Mhutos

13V - 200nm

Results

Name

Migration

Área

ESTD

Theoretical

Resolution

Time

concentration plates (OSP)

(USP)

acido

5.542

54143

94.127

8010

15.10731

vaiproico

Totais

 

54143

94.127

J

8

Asymmetiy

037179

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL VALORACION ACIDO VALPROICO

VALIDACION DEL METODO ANALITICO Precision del sistema Muestra PRECISION4 1121/05 8:45:37 PM

4

o 4
o
4

0

1

2

3

4

5

6

7

8

 

Mtñes

15V - 20