Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Estudios Superiores Cuautitln

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRICOLAS

MANUAL DE LABORATORIO DE MICOLOGIA

AGRCOLA

. MARCOS ESPADAS RESENDIZ

M.C. GLORIA DE LOS ANGELES ZITA PADILLA

INDICE
PRACTICA 1. ................................................................................................................................................3

PRACTICA: 2 ................................................................................................................................................7

PRACTICA: 2 (CONTINUACIN).................................................................................................................9

PRACTICA 3 ...............................................................................................................................................12

PRACTICA.4 ...............................................................................................................................................14

PRACTICA: 5 ..............................................................................................................................................16

PRACTICA: 6 ..............................................................................................................................................18

PRACTICA 7 ...............................................................................................................................................22

PRACTICA 1.

COLECTA
Introduccin
La colecta de muestras en campo de tejidos vegetales enfermos por
hongos, son bastante tiles en el conocimiento y estudio de la
sintomatologa de enfermedades, as como en la formacin de
poblaciones representativas del patgeno. En laboratorio continuar con
la revisin y caracterizacin de sntomas ayudar a iniciar a hacer un
correcto diagnstico, el reconocimiento del signo en sus diferentes
manifestaciones estructurales como tipos de micelio, tipos de esporas,
tipos de fructificaciones del hongo sexuales o sexuales nos ayudaran a
hacer una correcta identificacin del patgeno en las malezas
afectadas.
Objetivos:
Conocer y manejar las tcnicas ms comunes de colecta, preservacin
y manejo de material de estudio fitopatolgico en cultivos de
importancia agrcola
Material y equipo utilizado en la colecta de plantas enfermas.
Pala recta, navaja de campo, tijeras de podar, lupa de campo,
serrucho, machete, cmara fotogrfica, bolsas de polietileno, etiquetas,
prensa, papel secante, peridico y cartn corrugado, libreta de campo,
hielera porttil, ligas, engrapadora manual, frascos de boca ancha,
soluciones fijadores.
Desarrollo:
Los problemas fitopatolgicos en los cultivos se pueden presentar en
hojas, races, tallos, frutos, etc. Se pueden identificar cuando:
a) Crecen anormalmente
b) Se secan o se mueren
c) Cuando disminuye la cosecha ao con ao y no se recupera an
con fertilizantes o combatiendo malezas.
d) Alteraciones en el crecimiento (achaparramiento, gigantismos, etc.)
e) Decoloraciones, sobre pigmentaciones, manchas, rayados, etc.

Es conveniente disponer del mayor nmero de elementos vegetales

colectados que permitan lograr la identificacin del agente causal. Las
partes vegetales que deben colectarse, dependen de la forma
biolgica del hospedante que se trate:
a) Hospedante anual. Se deber colectar varias plantas completas que
presenten sntomas iniciales y en diferentes etapas de desarrollo de la
enfermedad, pero que no estn en su totalidad muertas o en estado
de descomposicin, pues as no son tiles para el estudio en el
laboratorio. Si el cultivo ya esta muy desarrollado, colecte solo
proporciones de los rganos afectados. Es conveniente colectar
tambin una planta sana para que sirva de comparacin.
b) Hospedante perenne. Se colectan partes representativas, como raz,
tallo, hojas, flores, frutas, igualmente con sntomas iniciales y en
diferentes etapas de desarrollo de la enfermedad; as mismo, se
debern colectar partes que estn completamente muertas o en
estado de descomposicin.

En el caso de que la planta presente sntomas tipo marchitamiento, es

muy probable que se trate de infestaciones de hongos del suelo, por lo
que se deben tomar muestras del suelo que haya estado en contacto
con la raz. En el caso de que las plantas sean pequeas, se debe sacar
la planta entera, y sin sacudir el suelo de las races, se debe meter en
una bolsa de plstico junto con 250 gr. de suelo, (aproximadamente), y
cerrarla con una liga. .
Al recolectar el material en el campo, deben tomarse en consideracin
varios aspectos importantes, como son el estado fenolgico de la
planta al momento de la recoleccin, la parte de la planta que se va a
tomar, el desarrollo de la lesin y las condiciones ambientales en ese
momento. Para cada muestra deben anotarse los datos de
recoleccin, como localidad, fecha, junto con una descripcin de los
sntomas.
Es indispensable que todos los ejemplares que se colecten, vayan
acompaados con una hoja con los siguientes datos de campo
a) Datos generales.

Localidad

________________

Fecha

________________

Fase fonolgica

________________

Maleza
(hospedero)

________________

b) Apariencia general de la poblacin de maleza enferma

Marchitez

__________________ Tizones

Amarillamiento

________________

Desarrollo
anormal

________________

reas muertas

________________

Otros

________________

________________

Manchas foliares ________________

c) Partes atacadas de las plantas.

Raz

________________

Brotes o Tallos

________________

Hojas

________________

Flores

________________

Frutos

________________

d) Distribucin de la enfermedad

Plantas aisladas

________________

Manchones
grupos
plantas

reas grandes

________________

reas pequeas

Bandas o franjas ________________

o _______________
de

________________

Bordes de cultivo ________________

e) Condiciones prevalecientes durante la aparicin de los primeros

sntomas y el desarrollo de la enfermedad.

Precipitacin

________________

Humedad
relativa

________________

Vientos

________________

Heladas

________________

Granizo

________________

Otros

________________

a) Qumicos aplicados al cultivo en donde se colecto la maleza

(concentraciones y dosis).

Fertilizantes

________________

Fungicidas

________________

Herbicidas

________________

Insecticidas

________________

Defoliantes

________________

Otros

________________

a) Caractersticas del suelo.

Drenaje

________________

Textura

________________

pH

________________

Otros

________________

Datos del laboratorio que nos ayudarn al diagnstico de la

enfermedad y a la identificacin del agente causal.
a) Caractersticas de las lesiones.
b) Presencia de esporas, micelio, cuerpos fructferos o cualquier
estructura (hacer esquemas).
c) Exudaciones (color, consistencia etc.)
d) Presencia de insectos o caros.
e) Evidencia de daos mecnicos
Bibliografa.
1. Echandi, E. 1975. Manual de Laboratorio de Fitopatologa General. Herrero
Hnos. Mxico.
2. Gavio, G.G. y H. Figueroa. 1975. Tcnicas Biolgicas Selectas de
Laboratorio y Campo. Limusa. Mxico.
3. Gonzlez, L.C. 1977. Introduccin a la Fitopatologa. I.I.C.A. San Jose de
Costa Rica.
4. Lpez A.G. 1978. Tcnicas de uso comn en el manejo de Hongos
fitopatgenos. Tesis. E.N.A. Mx.
5. Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis.
Marcel Dekker Inc. 518 pp.

6. Roberts, G. y C. Boothroyd. 1972. Fundamentos de Patologa Vegetal.

Acribia. Zaragoza.
7. Tuite, J. 1964. Plant Pathological Methods, Fungi and Bacteria. Burges Pobl.
Co. Minneapolis.
8. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2008, Plant pathology,
Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York,
Washinton, D.C., 413 pp.

PRACTICA: 2
AISLAMIENTO
Introduccin
Para poder implantar mtodo de control de enfermedades en los
cultivos, es necesario conocer los enemigos fngicos de los cultivos de
importancia agrcola. Esto implica el aislamiento e identificacin de los
hongos que las enferman; para elaborar un inventario de los mismos, no
slo en su centro de origen sino tambin en el rea de distribucin dado
que las condiciones ambientales que prevalecen en una u otra zona
determinan el grado de control logrado por un organismo vivo.
Objetivos
Adiestrar a los alumnos en las tcnicas de aislamiento de hongos
fitopatgenos . y con esto contribuir, al desarrollo de nuevas tecnologas
de control.
Materiales y mtodos
2 Cajas de Petri con PDA para aislamiento, 1 caja de Petri con PDA y
una con jugo V8 agar para cepa pura, 2 cmaras humadas, Malezas
enfermas, mechero, campana de flujo alminar, microscopio
estereoscpico, microscopio compuesto, portaobjetos, azul de
lactofenol, azul de algodn, tijeras, pinzas de diseccin, cloro, envases
de plstico para desinfectar, pipeta, 250 ml de agua destilada estril,
alcohol
Aislamientos a partir de vegetales enfermos.
Aislamiento directo. Observe al microscopio de diseccin el ejemplar
enfermo; si encuentra fructificaciones, micelio, etc., tome una muestra

de este material con una aguja de diseccin estril y colquelo

directamente sobre el medio de cultivo solidificado. Incube a 24C y
observe durante los siguientes 7 das.
Cmara hmeda. Cuando la planta presenta micelio y no hay
fructificaciones o cuando no se aprecia el crecimiento del patgeno,
se recurre al uso de la cmara hmeda. Se toma porciones de tejido
enfermo se lava en agua corriente, se can los tejidos con papel
absorbente, y se desinfecta en una solucin 2:1de cloro, se lavan dos
veces con agua destilada estril y se eliminan excesos de agua, en el
interior de una caja de Petri estril que contenga papel filtro
esterilizado, finalmente en un dispositiva para cmara hmeda se
colocan pequeos trozos del vegetal enfermo lavados desinfectados,
secos y se cierra la caja, se humedece con agua destilada estril. Se
incuba a 24C durante 2 o 3 das, caracterice al patgeno que se
desarrolla durante este tiempo de observacin y anote estos resultados
en su libreta se laboratorio
Partes vegetales en medio de cultivo. Se toma porciones de tejido
enfermo se lava en agua corriente, se secan los tejidos con papel
absorbente, y se desinfecta en una solucin 2:1de cloro, se lavan dos
veces con agua destilada estril y se eliminan excesos de agua, en
colocan el interior de una caja de Petri estril que contenga papel filtro
esterilizado, este material lavado, desinfectado y seco se coloca en
cajas con PDA y/o Jugo v8 agar solidificado. Se incuba a 24C y se
observa se observa durante los siguientes 5 das, caracterice al
patgeno que se desarrolla durante este tiempo de observacin
Bibliografa
1. Agrios, G. N. 2005.Plant pathology. 5th ed. Elsevier academic Press.
Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San
Diego, san Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. 992 pp. *
2. Charudattan, R.1991 The mycohebicides approach with plant pathogens
pp24-57: In TeBeest,D. Microbial control of weeds. Chapman and Hall.
3. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC
Press. 355 pp
4. French, E.R. y Her. 1980. Mtodos de Investigacin Fitopatolgica. IICA.
Costa Rica.
5. Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis.
Marcel Dekker Inc., 518 pp.
6. Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant
pothogenic fungi. C A B International, 267 pp.
7. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2008, Plant pathology,
Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York,
Washinton, D.C., 413 pp.

PRACTICA: 2 (CONTINUACIN)
AISLAMIENTO
AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATGENOS DE
TALLOS Y HOJAS
(PLAQUEADO)
MATERIAL, EQUIPO Y SUSTANCIAS.
-

Plantas infectadas
Tijeras
Sobres de papel
Lpiz de carbn
Esquema de distribucin de las plantas para la toma de
muestras.
Bistur
Mechero de alcohol
Frascos de plstico para desinfectar tejidos
Cloro al 20%
Agua MQ
Cronometro con alarma
Aguar estril
Matraces para esterilizar agua
Papel aluminio
Rotulador
Pinzas de diseccin
Vaso de precipitado
Cajas de peri con PDA y antibitico
Campana de flujo laminar preparada
Papel parafim
Alcohol para quemar
Alcohol para desinfectar
Atomizador de alcohol
Rollo de papel

PROCEDIMIENTO

a) Corte de material vegetal en invernadero.

- Hacer los cortes en la parte basal de tallos.
- Colocar las muestras de tejido en sobres de papel
previamente etiquetados y se anota en el mapa de
distribucin las plantas de donde se tomaron las muestras.
b) Limpieza y corte de tallos y hojas.

Se eliminan las vainas foliares, para dejar el tallo limpio, se

flamea un bistur en el mechero, para hacer cortes de tallo
y hoja de 5 mm de longitud.
- Se colocan los trozos de tallo y/o hojas en frascos de
plstico previamente rotulados con cada una de las
muestras.
c) Desinfeccin
- Rotular los frascos
- Se le agrega del volumen del frasco de cloro al 20% y se
dejan las muestras en el desinfectante durante 20 minutos,
agitar el frasco de vez en cuando. Despus de los 20
minutos el desinfectante se decanta dejando solo los
tejidos en el frasco.
d) Lavado de tejidos en agua estril (en campana de flujo laminar)
- Se agrega de volumen del frasco de agua estril a los
tejidos desinfectados, agitar y decantar el agua a un
vaso. Todo este ltimo paso se hace dentro de la
campana de flujo laminar, previamente preparada.
* Ver anexo de equipo en: preparar campana
-

e) Plaqueado
- Rotular las cajas de petri con datos de la planta de donde
se aisl y fecha.
- En cajas de petri con PDA y antibitico se van colocando
los trozos de tejido con pinzas de diseccin, flamendolas
cada vez que se vaya a colocar un trozo de tejido del
recipiente que los contiene desinfectados para llevarlos a
la placa de medio de cultivo.
- Todo este plaqueado se hace dentro de la campana de
flujo laminar preparada.
BIBLIOGRAFA
1. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC
Press. 355 pp SB 732.5 D45

2. Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscpicos saprobios y parsitos:

Mtodos de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90pp. QK 603 M55.

3. Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of fungi inventory
and monitoring methods, Elsevier Academic Press. 777pp. C.B. QK600.3 M84
4. Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis.
Marcel Dekker Inc., 518 pp. C.B. SB731 N37

10

5. Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant
pothogenic fungi. C A B International, 267 pp. C.B. SB733 M63

6. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology,

Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York,
Washinton, D.C., 413 pp. C.B. SB732.56 P53

7. Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis.

Marcel Dekker Inc. 518 pp. SB 731 N37.

11

PRACTICA 3
LIMPIEZA Y REVISIN DE AISLAMIENTO DE HONGOS
FITOPATGENOS

MATERIAL, EQUIPOS Y SUSTANCIAS

-

Bistur
Mechero de alcohol
Pinzas de diseccin
Rotulador
Aislamientos a limpiar ya marcados
Alcohol en atomizador
Rollo de papel
Papel parafim
Campana de flujo laminar ya preparada
Caja de petri vaca
Microscopio estereoscpico y compuesto.

PROCEDIMIENTO

a)
b)
c)

d)

e)
f)

72 horas despus de iniciado el aislamiento, se recomienda

hacer la limpieza de posibles contaminaciones
Si las contaminaciones se presentan, delimitar el rea
contaminada con un rotulador.
La eliminacin del rea contaminada, se hace en la
campana de flujo laminar con el mechero de alcohol en
funcionamiento.
Con el bistur previamente flameado se hacen los cortes en
las lneas marcadas que rodean al contaminante y se retira
la zona contaminada; se deposita lo extrado en una caja
de petri vaca colocada en el interior de la campana de
flujo laminar.
Este procedimiento se repite para cada una de las cajas
contaminadas.
Una vez que estn limpios y puros, sellar las cajas con papel
parafina.

Nota: este procedimiento se ha de repetir a las 96 horas, 120 horas,

etc. hasta que las contaminaciones dejen de aparecer.

12

Bibliografa

1. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods.

CRC Press. 355 pp SB 732.5 D45

2. Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscpicos saprobios y

parsitos: Mtodos de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90pp. QK 603
M55.

3. Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of fungi

inventory and monitoring methods, Elsevier Academic Press. 777pp. C.B.
QK600.3 M84
4. Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease
diagnosis. Marcel Dekker Inc., 518 pp. C.B. SB731 N37

5. Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant
pothogenic fungi. C A B International, 267 pp. C.B. SB733 M63

6. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant

pathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London,
New York, Washinton, D.C., 413 pp. C.B. SB732.56 P53

7. Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases

diagnosis. Marcel Dekker Inc. 518 pp. SB 731 N37.

13

PRACTICA.4
CARACTERIZACIN DE HONGOS FITOPATGENOS
Introduccin
Para continuar con el segundo postulado de Koch y llevar a cabo la
identificacin de los agentes causales, es necesario iniciar el
reconocimiento del hongo que se aisl y se desarrollo en los medios de
cultivo por los diversos mtodos de aislamiento. Aqu es importante y
determinante comparar estos hongos aislados, con los hongos
reconocidos en los diversos signos que se colectaron, realizando
preparaciones temporales y usando o diferentes medios de montaje
facilitan la identificacin de los diferentes hongos fitopatgenos.
Objetivos. El alumno reconocer las diferentes estructuras somticas y
reproductivas representativas para la caracterizacin e identificacin
de las diferentes Clases hongos que atacan alas malezas
Actividades.
1. Elaboracin de preparaciones temporales y permanentes de
hongos, utilizando diferentes tcnicas de tincin.
2. Observacin de preparaciones permanentes de hongos.
3. Esquematizacin de lo observado, indicando los nombres de las
estructuras.
4. Mida cada una de las estructuras observadas y documntelas con
fotografas a diferentes aumentos

Matriales y mtodos.
Porta y cubreobjetos, azul de metileno, Mechero o lmpara de alcohol,
rojo congo, Caja de Petri, lugol Agujas de diseccin, preparaciones de
hongos,Tejidos vegetales enfermos, cultivos de hongos, Azul de
lactofenol, Azul de algodn
PREPARACIONES TEMPORALES DE HONGOS
1. Con una asa estril (o una aguja de diseccin ), tome una pequea
muestra de hongos y colquela en un portaobjetos con una gota de
agua destilada.
2. Extienda el micelio y agregue una gota de azul de metileno.
3. Coloque el cubreobjetos y observe al microscopio

14

Haga preparaciones temporales con cinta adhesiva transparente.

TINCION CON ROJO CONGO.
1.

Realice una preparacin temporal de hongos, usando lactofenol en

lugar de agua para colocar el micelio.
2. Coloque el cubreobjetos y por un extremo agregue una gota de
rojo congo*, permita que se difunda y observe al microscopio.
Esta tcnica se puede seguir, sustituyendo colorantes.

Bibliografa
1. Barne, H., and Hunter, B. B. 1987. Illustrated genera of imperfect fungi.
MacMillan Publishing Company. 218 pp. QK 625 D1 B3
2. Cummins, G. B., and Hiratsuka, Y. 2003. Illustrated genera of rust fungi. APS
Press. 225 pp. * OK 627. A1
3. Dhingra, O. D., and Sinclair, J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC
Press. 355 pp. * SB 732.5 D45
4. Hanlin, R. T. 1997. Illustrated genera of Ascomycetes. Volume 1. APS Press.
263 pp. *QK 623.A1 H35
5. Hanlin, R. T. 1997. Illustrated genera of Ascomycetes. Volume 2. APS Press.
258 pp. *QK 623.A1 H35
6. Len Gallegos, H. M., y Cummins, G. B. 1981. Uredinales (royas) de Mxico.
SARH. Vol 1. 440 pp. y Vol 2 492 pp. C13
7. Klman, Vnky. 2002. Illustrated genera of smut fungi. APS Press. 238 pp. *QK
628 A1 V35.
8. Muller, G. M., Bills, F. G., and Foster, S. M. 2004. Biodiversity of fungi inventory
and monitoring methods. Elsevier Academic Press. 777 pp. *QK600.3 M84
9. Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and disease diagnosis.
Marcel Dekker Inc. 518 pp. *SB731 N37
10. Trigiano, R. N., Windham, M. T., and Windham, A. S. 2008. Plant pathology,
concepts and laboratory. CRC Press, Boca Raton, 413 pp. *SB732.56 P53
11. Watanabe, Tsuneo. 2002. Pictorial atlas of soil and fungi: morfologies of
cultured fungi and key to species. CRC Press.486. pp

15

PRACTICA: 5
MICROCULTIVO
Introduccin.
Una vez que se tiene el resultado de las diferentes tcnicas de
aislamiento como lo es la obtencin de la cepa pura, el siguiente paso
para cumplir a cabalidad con el segundo postulado de Koch, es la
identificacin del agente causal y una herramienta ms para cumplir
con este objetivo, en caso que este agente causal sea un hongos como
en la mayora de las enfermedades que afectan a los cultivos: es la
tcnica de microcultivo; con esta tcnica se obtienen las distintas fases
del ciclo de vida de los hongos, que va de germinacin de la espora,
formacin del tubo germinativo, hifas, micelio, diferenciacin de las
estructuras reproductivas asexuales y sexuales. Se debe dar un manejo
de tiempos en el desarrollo de los hongos para poder observar las
estructuras desde el inicio de su formacin.
Por ejemplo esta tcnica resulta sumamente til para aquellos hongos
en los que es difcil observar la formacin de los condios sobre los
conidiforos y la forma y estructura de stos; porque, al efectuar el
preparado correspondiente, se desprenden y/o se rompen. Mediante
este mtodo se puede observar bajo el microscopio, su crecimiento y
esporulacin en todos sus detalles y as tener elementos morfolgicos de
estructuras somticas y reproductivas completas para as poder hacer
la identificacin con mayor confiabilidad y conocer a los hongos como
agentes causales de enfermedades en las diferentes cultivos Dhingra,
and Sinclair(1985) Trigiano, Windham,. and Windham,, (2008). En la
actualidad hay herramientas bibliogrficas en la biblioteca de la
Facultad de calidad y actualizadas: (Barne, H., and Hunter, B. B. 1987,
Cummins, G. B., and Hiratsuka, Y. 2003, Hanlin, R. T. 1997., Klman, Vnky.
2002, Watanabe, Tsuneo. 2002.); que facilitan la identificacin de las
diferentes Clase de hongos que atacan a las plantas.
Objetivo.

Conocer la tcnica de microcultivo para la caracterizacin de

estructuras
somticas
y
reproductivas
para
identificar
morfolgicamente a los hongos fitopatgenos.

Materiales y mtodos
Recipiente con alcohol al 96%, pinzas de diseccin, aguja de diseccin,
bistur, caja de Petri estril con PDA, cepa pura, dispositivo de
16

microcultivo, pipetas, puntas agua estril, papel parafin, una caja con
medio de cultivo
Con un bistur estril se cuadricula el medio de cultivo de la caja de Petri
con PDA en cuadros de aproximadamente 1 cm2. este paso se realiza
en el interior de una campana de flujo laminar preparada para trabajar
bajo condiciones aspticas
1. Dentro de la cmara de flujo laminar, con la ayuda de un bistur
estril, uno de los cuadros de PDA se transfiere al portaobjetos que
esta en la cmara de microcultivo ;este portaobjetos debe de
estar sobre el triangulo de vidrio
2. Con la aguja de diseccin estril o con una asa bacteriolgica
estril se lleva el inculo a las orillas superiores e inferiores del
cuadro de PDA
3. Se coloca el cubre objetos sobre el cuadro de PDA inoculado,
procurando que quede bien centrado.
4. Se agregan 2ml de agua estril, en el fondo de la cmara de
microcultivo para mantener la humedad, sin mojar el rea de
crecimiento del hongo. Los pasos 1-5 se llevan a cabo en el
interior de una campana de flujo laminar o en mesas de trabajo
en condiciones aspticas
5. Se sella el dispositivo de microcultivo con papel parafilm y se
rotula.
6. El crecimiento del hongo se detiene cada 24,
7. se repiten los pasos del 1 al 7 para mas microcultivos, y detener su
desarrollo a la 48, 72 y 96 hrs. Respectivamente
Bibliografa
1. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology
Methods. CRC Press. 355 pp SB 732.5 D45
2. Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscpicos saprobios y
parsitos: Mtodos de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90pp.
QK 603 M55.
3. Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of
fungi inventory and monitoring methods, Elsevier Academic
Press. 777pp. C.B. QK600.3 M84
4. Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease
diagnosis. Marcel Dekker Inc., 518 pp. C.B. SB731 N37
5. Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for
plant pothogenic fungi. C A B International, 267 pp. C.B. SB733
M63
6. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2008, Plant
pathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton,
London, New York, Washinton, D.C., 413 pp. C.B. SB732.56 P53
7. Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases
diagnosis. Marcel Dekker Inc. 518 pp. SB 731 N37.

17

PRACTICA: 6
MEDIDA DE ESTRUCTURAS DE AGENTES FITOPATGENOS
CON MICROSCOPIO PTICO *
Introduccin.
Para identificar a un agente fitopatgeno y cumplir cabalmente con el
segundo postulado de Koch de adems de los datos correspondientes
al aspecto de los sntomas que hayan causado en su hospedante, o de
las colonias que hayan formado sobre las placas en medios de cultivo,
de los datos morfolgicos que hayan resultado de la tcnica de
microcultivo es necesario saber las medidas de las estructuras somticas
y reproductivas que se observan en el microscopio ptico para tener
una identificacin confiable del agente causal. Por ejemplo si se habla
de hongos fitopatgenos las estructuras que se miden para identificarlos
son: picnidios, acrvulos, esporodoquios, sinemas, peritecios, apotecios,
clestotecios entre otras. La The American Phytopathological Society en
todas sus obras de enfermedades de los cultivos agrcolas, las claves
que usa para la identificacin de los diferentes grupos de hongos
fitopatgenos estn en funcin del tamao de las estructuras somticas
y de reproduccin de este grupo de fitopatgenos. La identificacin del
agente causal es bsica para precisar el diagnstico y as poder
establecer el mejor mtodo de control para estas limitantes biolgicas
en la produccin agrcola.
Objetivo..
Que el alumno aprenda a calibrar y medir clulas, estructuras
somticas y reproductivas de importancia taxonmica de
agentes fitopatgenos con el microscopio. ptico para su
identificacin morfolgica
Material.

Un microscopio ptico, Un micrmetro ocular, Un portaobjetos

micromtrico, Preparaciones permanentes y/o temporales de
estructuras fitopatgenos.
Metodologa.
Calibracin de los lentes objetivos.

18

1.- Se coloca en el ocular del microscopio ptico el micrmetro ocular

aunque a menudo se trabaja con el ocular micromtrico permanente
puesto en el microscopio. Hay que evitar que quede invertida la escala
(Ver Fig 1).

Fig 1.- A.- Colocacin de la reglilla ocular, y B.- Escala de la reglilla

ocular micromtrica

2.- Sobre la platina del microscopio se pone el micrmetro del objeto

similar portaobjeto como si fuese una preparacin.

Fig 2.- Escala de la reglilla portaobjeto

3.- Moviendo la platina se hace coincidir el margen de una raya del

ocular micromtrico con una del portaobjetos micromtrico. Puesto que
las rayas del portaobjetos aparecen tanto ms gruesas cuanto mayor
son los aumentos, la superposicin de las lneas ha de ser siempre al
comienzo del margen exterior de stas.
3.- Moviendo la platina se observa a travs de microscopio con ambas
reglillas colocadas se les puede ver superpuestas en el campo visual, y
se puede saber cuantas lneas del micrmetro ocular concuerdan con
cuantas lineas del micrmetro del objeto se hace coincidir el margen de
una raya del micrmetro ocular con una del micrmetro del objeto. Ver
figura 3

19

Fig 3.- Vista simultnea del ocular y de la reglilla micromtrica

4.- Cuando se observa a travs del microscopio con ambas reglillas

micromtricas colocadas, se les puede ver superpuestas en el campo
visual, y se puede saber cuntas lneas del micrmetro ocular
concuerdan con cuntas lneas del micrmetro del objeto. En el campo
visual, la reglilla ocular se encuentra graduada del 0 al 10 a un lado la
reglilla del objeto con 100 divisiones; como cada lnea del micrmetro
del objeto corresponde a 10 micras, se hacen coincidir ambas reglillas
en el cero, en el otro extremo de las reglillas se observa cual de las 100
lneas de la reglilla ocular coinciden con otra de la reglilla del
portaobjetos. Y se hacen los clculos correspondientes.

Ejemplos 1: Se hace coincidir los ceros de ambas reglillas (ver imagen

1) y se observa que en el otro extremo de las reglillas el 100 de la
reglilla ocular coincide con el 97 de los trazos de la reglilla del objeto,
es decir 0.97 mm; por lo tanto, una lnea del micrmetro ocular es
equivalente a 0.009 mm = 9 m y este valor es el que utilizamos para
definir el tamao de cada estructura que se mide, es obvio que esta
calibracin es para este microscopio, con ese ocular y objetivos
respectivamente. Esta operacin se deber repetir cuando se
cambie de microscopio o de objetivos para evitar errores.

Ejemplo 2: Se hace coincidir los ceros de ambas reglillas (ver imagen

2) y se observa que siete divisiones del ocular micromtrico coinciden
con dos divisiones del portaobjetos micromtrico. Puesto que cada
divisin de ste equivale a 10 m, el valor de cada divisin del ocular
se obtiene mediante una simple regla de tres: 7 divisiones del ocular
= 20 m; una divisin del ocular = 20/7 = 2.8 m (Ver Fig 4).

Fig 4.- Vista simultnea del ocular y de la reglilla micromtrica, donde

coinciden la primera lnea de las dos reglillas y la lnea 2 de la reglilla
portaobjetos con la siete de la ocular
20

b).- Medicin de ejemplares y estructuras de micromicetes.

1.- Una vez que se ha cuantificado el valor de cada lnea en la reglilla
del ocular ( 9 y 2.8 m en los ejemplos), se puede retirar el portaobjetos
micrmetro y en su lugar se puede colocar un portaobjetos normal con
el espcimen a medir y se deja colocado el micrmetro ocular, de
manera que se puede colocar una clula o estructura celular
cualquiera, en este caso, se hace coincidir una raya de la escala con
los mrgenes de la estructura fngica elegida, y se cuenta el nmero de
divisiones de la escala comprendidas en la longitud y en el ancho de
dicha estructura.

Ejemplo 3: Si la estructura del hongo se extiende a lo largo de 16

lneas y cada una de ellas vale 9 micras, segn se explic antes, por
tanto el tamao total de esta clula es de 16 x 9, es decir 144 micras.

2.- Si se llega a cambiar el objetivo por otro menor aumento se debe

repetir la operacin para encontrar nuevos valores en la reglilla, esta
medicin se puede realizar en un microscopio mono o binocular, pero
en este ltimo caso se tiene que mantener inalterada la distancia
interpupilar, puesto que el cambio altera la distancia mecnica y el
valor del micrmetro depende de ella.
Bibliografa
1. Barrera, E. H y R. Crdenas 1997 El microscopio ptico FES- IztacalaUNAM P y V editores. Estado de Mxico. 86pp.
2. Barthelemy, E. R. Dawson, R. J., y A. E. Lee. 1984. Tcnicas para el
Laboratorio de Biologa. 2. Edicin. CECSA editor. Mxico, D. F. Mxico.
148 pp.
3. Mateu, B. 1972. Atlas de Microscopia. 4. Edicin. Jover Ediciones.
Barcelona, Espaa. 96 pp.
4. Muntaola, M. 1999. Gua de los hongos microscpicos. 1. Edicin.
Omega editores. Barcelona, Espaa. 167 pp.
5. ____________. 1996. El Microscopio ptico. FES Zaragoza UNAM. Mxico,
D. F. Mxico
6. *S elaboro esta practica en colaboracin Javier Hernndez y Tania
Muoz alumnos del curso de micologa

21

PRACTICA 7
CUANTIFICACIN DE LA CONCENTRACIN DE
INCULO
Introduccin
Cuando se trata inocular hospedadores para cumplir con los postulados
de Koch y as efectuar el diagnstico fitosanitario, evaluar la resistencia
de las plantas a enfermedades, efectuar estudios especficos
(epidemiolgicos) del patgeno, o para desarrollar un micoherbicida,
es necesario recurrir a la inoculacin artificial, ya sea en invernadero o
en campo. Para esto se utiliza inculo a una concentracin especfica
(es decir, un nmero determinado de esporas por mililitro), segn el
patgeno y hospedero en estudio, con la finalidad de obtener una
buena infeccin que permita observar las diferencias entre los
materiales evaluados. Conocer el nmero de esporas por mililitro, para
el caso de micoherbicidas, adems de que se requiere en las pruebas
de patogenecidad, en las pruebas seguridad y en estudios
epidemiolgicos; el conocimiento de la concentracin de esporas por
ml. es bsico para el manejo del producto comercial y la aplicacin del
micoherbicidas en campo.
Para determinar la concentracin se usa una cmara Neubauer o
hemacitmetro, con el cual se hacen conteos de esporas en campos
de dimensiones conocidas, que darn el nmero de esporas por ml de
la suspensin inicial. De esta forma, por medio de diluciones se obtiene
el inculo en la concentracin deseada.
Objetivo: Conocer y manejar la cmara Neubauer para realizar el
calculo de la concentracin de inculo, para entender las
concentraciones comerciales y la aplicacin de micoherbicidas
Materiales y mtodos
Cultivos puros de hongos aislados de malezas enfermas, tubos falcn
de 15 ml. 100 ml. de agua destilada estril, agitadores de vidrio estriles,
Vortex, centrifuga, Tween 20,pipetas, colorantes, (solo en caso
necesario), Cmara de Neubauer, microscopio compuesto, matraz
erlenmeyer de 250ml.
1.-Prepare en agua destilada estril una suspensin de propgulos a
contar de mayor concentracin que la deseada (solucin madre).
a) Colocar un volumen conocido de agua destilada estril o solucin
fisiolgica en los cultivos de hongos en las cajas de Petri y raspar
los cultivos
22

b) Decantar el raspado en tubos de centrifuga, someterlos 1 minuto

en vortex y centrifugar de 3 a 5 minutos a una velocidad de 6000
revoluciones, separar el sobrenadante del precipitado. Si los
propgulos tienden a permanecer unidos o aglomerados
agregue Tween 20a razn de 60 ppm mezclando sin agitar
2.- Si los propgulos son hialinos y pequeos, tome una alcuota
pequea y agregue un tinte vital azul de algodn, fucsina acida que
indique las clulas vivas, el tinte facilita la observacin de las clulas
poco refractivas. Use el tinte en forma concentrada, o si no tome en
cuenta el factor de dilucin que interviene.
3.- Coloque el cubreobjetos especial sobre los rieles paralelos a ambos
lados de la cmara, frotando ligeramente para conseguir un buen
contacto, con una pipeta delgada (que no gotee) tome una muestra
de la suspensin y aplquela a la ranura al centro del margen de la
cmara donde ser rpidamente absorbida por la fuerza capilar,
qutela a tiempo para que no entre un exceso que se rebose en los
bordes, lo que introducira un factor de error.
4.- Monte al microscopio y ubique el rallado de la cmara con el
objetivo de menor aumento, girando luego el revolver para mayores
aumentos (no se debe usar el de inmersin). Deje el tiempo necesario
para que los propgulos se asienten en el fondo de la cmara (dos
minutos).

Fig. 1

5.- El fondo de la cmara tiene un rayado Nueubauer (Fig.I) de 9mm2

(3 mm por lado) dividido en 9 cuadrados principales (CP) de 1 mm por
lado. El campo de conteo que se debe utilizar depende del tamao de
los conidios del hongo con el que se est trabajando. Si stos son
grandes, lo ms conveniente es contar en los cuatro cuadros de las
esquinas (A, B, C, D) ms el cuadro del centro (E) (Fig.1). El conteo se

23

repite por lo menos seis veces y se saca un promedio.(Tabla 1). ste se

multiplica por una constante. De ese producto se obtendr la
concentracin en conidios/ml.

Tabla No. 1
Como el volumen sobre cada C.P. es 0.1mm3, para calcular la
concentracin por cc (10000 veces mayor), se procede en la forma
siguiente:
SUMA de 5 C.P.x 2000= nmero/cc
Cuando los propagulos son pequeos se usa el C.P. central que esta
dividido en 25 cuadros secundarios (C.S.) de 0.2 mm por lado, cada uno
de los cuales est dividido en 16 cuadrados menores de 0.05mm por
lado. Entonces la concentracin se calcula as:
NUMERO en el C.P. CENTRAL x 10000 = nmero/ cc.
Esta concentracin corresponde a la de la suspensin inicial. Cuando se
desea calcular una dilucin determinada, se aplica la frmula siguiente:
C1 V1 = C2 V2
Donde:
C1 = Concentracin inicial (conocida en el conteo)
V1 = Volumen inicial (establecido arbitrariamente al preparar el inculo)
C2 = Concentracin final deseada (segn el estudio a realizar)
V2 = Volumen final (desconocido)
3.- Limpie las superficies de la cmara entre cada observacin
enjuague con agua destilada estril y seque por contacto con papel
con papel o tela absorbente y por ultimo con papel seda. Se puede
utilizar un jabn suave o alcohol

Bibliografa
1.-Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC
Press. 355 pp
24

2.-French, E.R. y Her. 1980. Mtodos de Investigacin Fitopatolgica. IICA.

Costa Rica.287pp
3.-Douglas Bollete, C., Charles Quimby, P., Connick,Jr.,W., Daigle,D.,and
Fulgham,F.1991. Progress in the production, formulation, and application of
mycoherbicides.pp209-222. In TeBeest,D. Microbial control of weeds. Chapman
and Hall.
4.- Gilchrist-Saavedra, L., G. Fuentes-Dvila, C. Martnez-Cano, R.M. LpezAtilano, E. Duveiller, R.P. Singh, M. Henry e I. Garca A. 2005. Gua prctica para
la identificacin de algunas enfermedades de trigo y cebada. Segunda
edicin. Mxico, D.F.: CIMMYT 69pp
5.-Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis.
Marcel Dekker Inc., 518 pp.
6.-Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2008, Plant pathology,
Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York,
Washinton, D.C., 413 pp.

25