UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE

LA SELVA
FACULTAD DE INGENIERA DE INDUSTRIAS
ALIMENTARIAS

PRCTICA DE LABORATORIO N 02
CURSO

MICROBIOLOGA DE LOS ALIMENTOS I.

TEMA

ESTERILIZACIN.

DOCENTE

ALUMNO

Blga. M. Sc. ALCEDO ROMERO, Margarita.

CABRERA CARBAJAL, Gaby A.

GONZALES LOZANO, Yuleisi
GONZALES SOBRADO, Imer R.
HUAMANYALLI VARGAS, Wilner R.

I.

INTRODUCCIN

Los microorganismos pueden ser eliminados, inhibidos o muertos por

agentes fsicos o qumicos. Se dispone actualmente de una gran variedad
de tcnicas y agentes que actan de manera diferente y cada uno tiene sus
propios lmites de aplicacin de prctica.
Entre los agentes fsicos ms utilizados estn el calor, la presin, la
radiacin, los filtros y el ultrasonido. Entre los agentes qumicos se
encuentran los compuestos de cloro, yodo, flor y bromo; metales pesados
como el mercurio; as mismo alcoholes, fenoles, aldehdos y cetonas entre
otros.
Se denomina esterilizacin al proceso validado por medio del cual se
obtiene un producto libre de microorganismos viables. El proceso de
esterilizacin debe ser diseado, validado y llevado a cabo de modo de
asegurar que es capaz de eliminar la carga microbiana del producto o un
desafo ms resistente.
II.

OBJETIVOS
Proporcionar

al

estudiante

conocimientos

bsicos

sobre

los

principales mtodos empleados en la esterilizacin, tanto para la

eliminacin o destruccin completa de microorganismos contenidos
en objetos, productos, etc.
Impartir conocimiento de cmo prevenir el ingreso de los
microorganismos en un ambiente determinado estril.

III.
3.1.

REVISIN BIBLIOGRAFICA

CONCEPTO
Esterilizacin significa la eliminacin de toda forma de vida de un medio o

material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios fsicos, por ejemplo,
filtracin, o por muerte de los organismos por calor, productos qumicos u otra va.
Esta definicin excluye por lo tanto cualquier tcnica que resulte solamente en un
dao a los microorganismos o atenuacin de la actividad de cualquier tipo.
Es el proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de
vida microbianas, incluyendo bacterias y sus formas esporuladas altamente
resistentes, hongos y sus esporos, y virus. Se entiende por muerte, la prdida
irreversible de la capacidad reproductiva del microorganismo.
3.2.

METODOS DE ESTERILIZACION

A)

AGENTES FSICOS
1.

El calor: Probablemente este mtodo es comnmente empleado para

destruir los microorganismos. Los medios de cultivo, material de vidrio e

instrumentos mdicos son esterilizados normalmente por calor.
El calor no slo es el agente de esterilizacin ms ampliamente
utilizado y el ms eficaz sino tambin el ms econmico y el ms fcil de controlar.
En la esterilizacin por calor cabe tenerse en cuenta el grado de resistencia de las
bacterias a la temperatura. La resistencia al calor vara entre los diferentes
microorganismos; estas diferencias pueden expresarse a travs del concepto de
punto trmico de muerte.
a)

Accin directa:

flameado es el quemado directo.

b)

Calor seco:

aire caliente es el horno.

c)

Calor hmedo:

ebullicin, vapor fluente, vapor discontinuo o

tindalizacin y vapor saturado a presin.

a. Accin directa: Es cuando el material se somete a la accin directa de la
llama de un mechero, sin que se altere o sufra deterioro. Se esterilizan mediante
este mtodo: las asas de siembra, material de diseccin (previo a un bao de
alcohol), las bocas de los tubos, matraces, frascos, etc.
El calor por este mtodo se transmite por conduccin. Las asas o agujas
deben ser esterilizadas antes o despus de su uso, para ello se ponen en la flama
de un mechero bunsen hasta que se torne rojo y luego se deja enfriar unos 10 a15
segundos.
b. Calor seco: Este mtodo se utiliza muchas veces en el laboratorio de
microbiologa para esterilizar asas de siembra; todo lo que hay que hacer es
calentar el alambre al rojo y la eficacia es de 100%.
Los objetos a esterilizar por este mtodo se colocan en un horno, donde
una temperatura, generalmente de unos 170C, mantenida durante cerca de dos
horas asegura la esterilizacin. Se requiere un perodo de tiempo mayor y una
temperatura ms alta en comparacin con el calor hmedo, ya que el calor del
agua se transfiere ms rpidamente a un cuerpo fro que el calor del aire.
c. Calor hmedo: Es la ebullicin (100C al nivel del mar), que mata a las
formas vegetativas de las bacterias patgenas, muchos virus y hongos. Para
esterilizar en forma eficaz mediante calor hmedo se necesitan temperaturas
superiores a la ebullicin del agua. Estas altas temperaturas se consiguen
normalmente mediante vapor a presin en una autoclave.
Este es el mtodo preferido de esterilizacin y se utiliza a menos que el
material a esterilizar pueda resultar daado por el calor o la humedad. En una

autoclave el vapor a una atmsfera de sobre presin (121C) matar a todos los
microorganismos y a sus endosporas en unos 15 minutos o un poco ms,
dependiendo del tipo y volumen del material que est siendo esterilizado.
La autoclave se utiliza para esterilizar medios de cultivo, instrumentos,

soluciones, jeringas, equipos de transfusin y muchos otros artculos que

pueden soportar alta temperatura y presin.
2.

Filtracin: Se usan membranas filtrantes con poros de un tamao

determinado. El tamao del poro depender del uso al que se va a someter la

muestra. Los filtros que se utilizan no retienen virus ni micoplasmas.
3.

Centrifugacin: Es otro mtodo utilizado en el laboratorio de

microbiologa.
4.

Radiacin: Encontramos corpsculos ionizantes y longitud luz

ultravioleta y su accin depende del tiempo de radiacin, tiempo de exposicin y

la dosis tenemos a los rayos ultravioletas, rayos gamma, rayos x.

B)

POR AGENTES QUMICOS

Utilizando sustancias antispticas que varan en frmula y concentracin,

segn su accin bactericida. Los antibiticos y quimioterpicos no cumplen

siempre con un rol de completa esterilizacin, por que frenan o atenan el
desarrollo microbiano. Estos agentes dependen de las condiciones bajo las que
actan:

Concentracin: Vara con el tipo de agente y de microorganismo,

pues una misma concentracin del agente puede producir un efecto diferente en
distintos microorganismos.

Tiempo: Los microorganismos no son susceptibles a un agente en la

misma forma, por lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo.

pH: Afecta tanto a los microorganismos como a los agentes

qumicos. El aumento de pH por encima de 7 incrementa la carga negativa de los

microorganismos afectando la concentracin del agente sobre la clula. El pH
determina el grado de disociacin y la efectividad del agente qumico, pues a
menor disociacin mayor permeabilidad y mayor efectividad.
TABLA 1: Cuadro de agentes qumicos.
Alcoholes
Iodo
Antispticos

Agentes catinicos, aninicos y

anfteros
rgano Mercuriales
Colorantes
Cloro y Compuestos clorados
Aldehdos

Desinfectantes y/o
Esterilizantes

xido de Etileno
Compuestos Fenlicos
cidos y lcalis

C)

EL CALOR SE PROPAGA POR TRES MTODOS:

Por conduccin, cuando el calor se transmite a travs de la materia

sin movimiento aparente de la misma, estando en contacto el cuerpo ms

caliente con el ms fro (el calor se propaga de molcula a molcula).

Por conveccin, cuando el calor se propaga a travs de la materia,

con movimiento apreciable de la misma como sucede en masas liquidas o

corrientes areas al ser sometidas a calentamiento (ejemplo: gases
propagan el calor por este fenmeno).

Por radiacin, cuando el calor se transmite sin necesidad de

material intermedio y en forma de ondas. Ejemplo: foco de la luz, que por

estar al vaco permite el paso de la radiacin que va siempre en lnea recta,
a la misma velocidad de la luz.
1.

ESTERILIZACIN POR FLAMEADO

Es cuando el material se somete a la accin directa de la llama de un

mechero, sin que se altere o sufra deterioro.

Se esterilizan mediante este mtodo: las asas de siembra, material de
diseccin (previo a un bao de alcohol), las bocas de los tubos, matraces, frascos,
etc. el calor por este mtodo se transmite por conduccin.
Las asas o agujas deben ser esterilizadas antes o despus de su uso,
para ello se ponen en la flama de un mechero bunsen hasta que se torne rojo y
luego se deja enfriar unos 10-15 segundos.

Fig. 1: Esterilizacin por

flameado

Forma de esterilizar el asa de siembra

2.

ESTERILIZACIN POR CALOR SECO

Se hace actuar al aire caliente sobre el material a esterilizar. Mediante

este mtodo se pueden esterilizar material de vidrio y metlico. El tiempo de

esterilizacin depende de la temperatura que se emplea: 160C, por hora y media
a dos horas, 170C, por dos horas, 180C por medio hora o tres cuartos de hora.
El calor se inicia por conduccin y se propaga por conveccin. Los
aparatos ms usados son: el horno de Pasteur y estufas de aire caliente, se
conocen varios modelos modernos elctricos con funcionamiento automtico.
3.

ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO

Acta coagulando las protenas del protoplasma microbiano, en tiempo

menor a la esterilizacin por aire caliente. El calor se propaga por conveccin.

Puede ser:
a)

Ebullicin.- cuando el material es sometido a la accin directa del agua

hirviendo a 100C de temperatura, esta puede elevarse por adicin de ciertas

sustancias qumicas. Por este mtodo se pueden esterilizar: jeringas, guantes de
jebe, sondas, ropa, etc. Por 40 a 60 minutos.
b)

Vapor fluente.- Es cuando se hace actuar sobre el material a esterilizar un

chorro continuo de vapor de agua por 30 minutos a 1 hora. El vapor debe calentar

a 100C los objetos (es la temperatura que se consigue cuando el vapor no

contiene aire y es correcta la circulacin del vapor). Se esterilizan por este
mtodo, sustancias que se desnaturalizan a mayor temperatura, ejemplo: gelatina,
bilis, leche. El aparato que se usa es el aparato de Arnold.
c)

Vapor discontinuo o tindalizacin.- es cuando acta el calor en forma

fraccionada por tres das sucesivos a 100C durante 30-40 minutos. En el primer
da se destruirn las formas vegetativas, en el segundo da las formas mas activas
germinadas de las esporas y en el tercer da las formas esporuladas. Mediante
este mtodo se esterilizan: sustancias orgnicas que sufren descomposicin a
altas temperaturas. Los aparatos de Arnold y de Coch, son muy recomendados.
d)

Vapor de agua saturada a presin.- Es uno de los mtodos ms seguros

y efectivos. Permite una esterilizacin completa de la mayora de los medios de

cultivo y soluciones que no contienen sustancias de fcil desnaturalizacin. Se
emplea en este mtodo las autoclaves, las comunes son: modelo de
Chamberland, las actuales son elctricas y el funcionamiento es automtico.
En la autoclave se logran temperaturas superiores a la temperatura de ebullicin,
del agua mediante aumento de presin. La autoclave funciona a 10-15 libras de
presin, por encima de la temperatura atmosfrica normal, a esta presin el agua
hierve a 121C en lugar de 100C (a la presin atmosfrica normal). Manteniendo
la temperatura de 121C a una presin de 15 libras de presin durante 15 minutos,
posible la destruccin de toda forma viva en el material a esterilizar.

B) PREPARACION PARA LA LIMPIEZA Y ESTERILIZACION

El material de vidrio nuevo o usado, debe limpiarse en forma tal que elimine
toda huella de suciedad original, se evita as la precipitacin y depsito de los
agentes limpiadores. Por eso es importante:
1. Conocer el grado de dureza del agua.
2. Usar detergentes que no tengan lcalis, que sean fcilmente solubles en
agua tibia, que no precipite en agua fra, tibia o caliente.
3. Que limpie con facilidad y no irrite las manos.
4. No usar detergentes o jabn no garantizado.
LIMPIEZA DEL MATERIAL DE VIDRIO
1. Hacer la limpieza tan pronto sea posible.
2. Recipientes con cultivos o materiales contaminados, esterilizar con
autoclave antes de lavar, para ello quitarles los tapones, para pipetas,
colocar estas en una solucin bactericida por 24 horas.
3. Hacer hervir material en una olla con agua y detergente por lo menos media
hora.
4. Frotar el material con escobilla (tanto por dentro como por fuera), en
algunos casos remojar el material en detergente de un da para otro.
5. Enjuagar con agua de cao a chorro continuo hasta la eliminacin del
detergente, continuar el enjuague con agua tibia y luego enjuagar 2 o 3
veces con agua destilada.
6. Escurrir el material sobre soportes de madera o metal.
7. En casos de portaobjetos y cubreobjetos, pasarlos por alcohol al 70% para
su desengrase.
PREPARACION DEL MATERIAL DESPUES DE LA LIMPIEZA PARA SU
ESTERILIZACION

1. Confeccionar tapones de algodn para tubos y matraces, colocarlos cuando

se va a esterilizar.
2. Proteger el material de vidrio con papel o con recipientes de metal como en
el caso para pipetas y placas de Petri.

IV.

MATERIALES Y METODOS

1.

PREPARACION

PREVIA

DEL

MATERIAL

DE

VIDRIO

PARA

SU

ESTERILIZACION
MATERIALES

Materiales de vidrio como: placas de petri, pipeta, tubos de prueba,

jeringas descartables, balones, matraces, erlenmeyers, kitasato, etc.

Papel kraft, en tiras y en trozos rectangulares y cuadrados.

Algodn

Pedazo de papel engomado/pabilo.

Lpiz de cera o plumn indeleble.

PROCEDIMIENTO
1. LIMPIEZA
El material de vidrio lavar con detergente adecuado, con ayuda de escobillas o
esponjas, frotar las superficies internas, de los frascos y tubos.
Enjuagar con abundante agua hasta eliminar completamente el detergente.
Continuar el enjuague con agua destilada y dejar escurrir en soportes
especiales. Si es necesario hacer secar en el horno para luego ser envuelto
para la esterilizacin.

2. PREPARACION DEL MATERIAL PARA SU ESTERILIZACION

2.1.

Preparacin de tubos de prueba

Hacer tapones de algodn y colocarlos en los tubos de prueba a esterilizar.

Hacer manojos de tubos taponados (en numero de 10 a 12 tubos) sujetos

con pabilo, y cubrir por sus bordes con papel envolvente, asegurando el
paquete con pabilo o papel engomado.

Ubicar los tubos en las canastillas para facilitar su esterilizacin.

Fig. 2: Preparacin de tubos de prueba

2.2.

Preparacin de matraces, kitasatos, frascos y probetas

Despus de su taponamiento cubrirlos aisladamente con un capuchn

de papel y amarrarlo con pabilo (para matraces, probetas) para frascos
que tienen tapas, retirar las tapas y colocarles tapones de algodn.

En caso de kitasato, taponar la tubuladura con un poco de algodn y

ponerle un capuchn de papel para luego amarrarlo con pabilo.

Rotular datos del material y la fecha de la esterilizacin sobre el papel.

Fig. 3: Preparacin de matraces y kitasatos

Preparacin de pipetas serolgicas y volumtricas

2.3.

Colocar tapones de algodn a manera de filtros en las boquillas de las

pipetas.

Envolver las pipetas con papel kraft, deslizando en espiral sobre la

superficie de la pipeta, hasta la boquilla.

Rotular datos de la medida de la pipeta y fecha de la envoltura sobre el

papel.

2.4.

Preparacin de las placas de petri

Se pueden envolver aisladamente o en numero de 2 3 placas con
papel kraft.

Colocar las placas en posicin invertida, sobre el papel, y doblar los

mrgenes del papel unos sobre otros a manera de cubrirlos.

Luego amarrarlo con pabilo o colocar una cinta engomada.

Poner, numero de placas y feche de esterilizacin.

3. ESTERILIZACION
MATERIALES

Frascos o Erlenmeyer conteniendo caldo nutritivo.

Dos tubos de prueba.

Algodn para taponar.

Gradillas metlicas.

Papel kraf.

Plumn indeleble o lpiz de cera.

Autoclave / incubadora.
PROCEDIMIENTO

Distribuir el medio de cultivo (caldo nutritivo) en 2 tubos de prueba.

Poner uno de los tubos en la autoclave para esterilizar el medio de cultivo.

Despus del tiempo determinado sacar el tubo de la autoclave.

Los dos tubos poner en la estufa o incubadora (uno de ellos sin autoclavar),
donde permanecern hasta el da siguiente, en que sern observados.

Describir los resultados

V.

RESULTADOS

CUADRO 1: Resultados obtenidos en la prctica de laboratorio

esterilizacin.

Muestra

Observacin

Observacin microscpica

(caldo nutritivo)

macroscpica (24 h)

(24 h)

No

se

encontr No se puedo observar, ya que el

presencia
A
(autoclavado)

de microscopio estaba malogrado.

microorganismos vivos,
(no

presentan

movimiento).

Se

observa

presencia

de

Se observa un color microorganismos con movimiento

B
(sin autoclavar)

amarillento

plido

y (Bacillus).

tiene un mal olor, sin

sedimentos,

VI.

DISCUSION

Tenemos que en la primera muestra despus de haber transcurrido 24 horas

y haberlos dejado a temperatura ambiente, se pudo observar que hubo un
crecimiento microbiano, los microorganismos se pueden desarrollar dndoles los
factores de crecimiento que requieren como la temperatura, pH, etc.
En la segunda muestra despus de haber transcurrido 24 horas se observo
que los microorganismos se han muerto debido a la fuerte presin y temperatura
dentro del autoclave.
VII.

CONCLUSIONES

Comprendimos los mtodos de esterilizacin, ya sean fsicos o

qumicos, tambin llegamos a saber la importancia del auoclavado en
las dos muestras.

Logramos como prevenir el ingreso de microorganismos en los

materiales esterilizados
VIII.

CUESTINARIO

1. Temperatura y tiempo para secar material en este equipo

Temperatura es de 45C
Tiempo es de hora a 1 hora
2. Material que se puede esterilizar en este equipo
Solo de vidrio y de material de aceros.
3. Temperatura y tiempo para esterilizar material en este equipo
Temperatura es de 170c
Tiempo de 1 hora a 2 horas

IX.

BIBLIOGRAFIA

MANRIQUE RUBEN M. Manual de Laboratorio de Microbiologa

General. Universidad Nacional Agraria de la Selva.
Informacin de la separata de prcticas de la profesora Blga M. Sc
Margarita Alcedo Romero.
http://www.monografias.com/trabajos10/meste/meste.shtml#fi.