UNIVERSIDAD DE GRANADA

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA




Seleccin y caracterizacin de la patogenicidad de una cepa
de Bacillus pumilus activa contra la mosca de la fruta del Mediterrneo,
Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)




C. Alfonso Molina Hidalgo

TESIS DOCTORAL
Memoria presentada para optar al grado de Doctor en Biologa

2010



Editor: Editorial de la Universidad de Granada
Autor: C. Alfonso Molina Hidalgo
D.L.: GR 832-2011
ISBN: 978-84-694-0202-3







VB de los directores de Tesis







Dra. Susana Vilchez
Directora
Dr. Antonio Osuna
Co-director



Granada, 2010





UNIVERSITY OF GRANADA
INSTITUTE OF BIOTECHNOLOGY




Selection of a Bacillus pumilus strain and characterization of its
pathogenicity against the Mediterranean fruit fly,
Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)




C. Alfonso Molina Hidalgo

PhD THESIS
Submitted for the degree of Doctor of Philosophy in the subject of Biology

2010










APPROVED BY:







Dra. Susana Vilchez
Thesis supervisor
Dr. Antonio Osuna
Thesis co-supervisor



Granada, 2010





INDICE

Resumen.. 1
Abstract... 3
1. Introduccin..
1.1 Ceratitis capitata.
1.1.1 Ubicacin taxonmica
1.1.2 Origen y distribucin geogrfica
1.1.3 Descripcin.
1.1.4 Ciclo de vida...
1.1.5 Importancia econmica..
1.1.6 Mtodos de control de Ceratitis capitata...
1.1.6.1 Control Qumico....
1.1.6.2 Trampeo Masivo
1.1.6.3 Control Autocida
1.1.6.4 Control Biolgico...
1.2 Bacterias patgenas de insectos...
1.2.1 El gnero Bacillus...
1.2.2 Bacillus sphaericus
1.2.3 Paenibacillus popilliae...
1.2.4 Bacillus thuringiensis.
1.2.4.1 Resea Histrica
1.2.4.2 Biologa y ciclo de vida.
1.2.4.3 Familias de toxinas Cry y Cyt
1.2.4.4 Modo de accin de las protenas Cry.
1.2.4.5 Ecologa.
1.2.4.6 Aplicaciones en Control Biolgico
1.2.5 Bacillus pumilus.
1.2.5.1 Biologa..
1.2.5.2 Aplicaciones en Biotecnologa...
1.2.5.3 Aplicaciones en Control Biolgico
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2. Objectives...
3. Materiales y Mtodos
3.1 Mantenimiento de la colonia de Ceratits capitata..
3.2 Aislamiento y seleccin de cepas bacterianas.
3.2.1 Recoleccin de muestras de campo
3.2.1.1 rea de recoleccin....
3.2.2 Aislamiento y seleccin de cepas de Bacillus sp. a partir de muestras de
campo.
3.2.3 Aislamiento de cepas bacterianas a partir de larvas muertas de C. capitata
3.3 Medios de cultivo....
3.3.1 Medio rico..
3.3.2 Medio de esporulacin...
3.3.3 Medio de suspensin bacteriana.
3.4 Condiciones de cultivo....
3.5 Conservacin de cepas bacterianas.
3.6 Cepas bacterianas....
3.7 Antibiticos.....
3.7.1 Antibiograma.....
3.8 Curva de crecimiento bacteriano.
3.9 Bioensayos con aislados bacterianos: Rastreo (Screening)
3.9.1 Bioensayos con larvas....
3.9.2 Bioensayos con adultos..
3.10 Bioensayos estndar..
3.10.1 Bioensayos con larvas de primer estadio.
3.10.1.1 Clculo de la concentracin letal media (LC
50
)...
3.10.2 Bioensayos con larvas de tercer estadio...
3.10.3 Bioensayos con huevos....
3.10.4 Bioensayos con pupas..
3.10.5 Bioensayos con adultos....
3.10.6 Bioensayos en fruta..
3.10.7 Eliminacin de la comunidad bacteriana del intestino de larvas para
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bioensayos
3.11 Anlisis estadsticos..
3.12 Tcnicas moleculares....
3.12.1 Extraccin de ADN total..
3.12.1.1 Mtodo comercial Qiagen....
3.12.1.2 Mtodo CTAB..
3.12.1.3 Mtodo para la deteccin de elementos extracromosmicos...
3.12.2 Cuantificacin de ADN....
3.12.3 Amplificacin de ADN mediante PCR
3.12.3.1 Amplificacin del gen codificante para el ARN ribosmico 16S
3.12.3.2 Amplificacin del ADN de genes housekeeping.
3.12.3.3 Amplificacin de ADN a partir de colonia..
3.12.4 Electroforesis de ADN en gel de agarosa
3.12.5 Purificacin de ADN....
3.12.5.1 A partir de una banda de gel de agarosa..
3.12.5.2 A partir de una reaccin de PCR..
3.12.5.3 A partir de una reaccin de PCR en microplaca..
3.12.6. Electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacin (DGGE).
3.12.7 Secuenciacin de ADN....
3.12.8 Anlisis de secuencias..
3.12.8.1 Elaboracin de rboles filogenticos...
3.13 Curado de elementos extracromosmicos.
4. Resultados..
Capitulo 1. Aislamiento y seleccin de una cepa patgena para Ceratitis capitata...
4.1 Aislamiento y seleccin de cepas bacterianas.
4.2 Evaluacin de la toxicidad de los aislados bacterianos...
4.2.1 Bioensayos con adultos de C. capitata..
4.2.2 Bioensayos con larvas de C. capitata
4.3 Identificacin de la cepa 15.1..
Capitulo 2. Caracterizacin de la patogenicidad de B. pumilus 15.1 en larvas de primer
estadio de C. capitata...
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4.4 Caracterizacin de la relacin de la toxicidad de B. pumilus 15.1 con respecto
al fro..
4.5 Anlisis de la toxicidad de las clulas vegetativas de B. pumillus 15.1..
4.6 Determinacin de la fraccin txica del cultivo de B. pumilus 15.1...
4.7 Anlisis de la germinacin de esporas en la dieta de larvas de C. capitata
4.8 Crecimiento de B. pumilus 15.1 en diferentes condiciones de pH y concentracin
de solutos.
4.9 Dependencia de la entomopatogenicidad de B. pumilus 15.1 con la incubacin en
fro...
4.10 Estudio de la dependencia de la toxicidad de B. pumilus 15.1 en relacin a la
temperatura..
4.11 Dependencia de la toxicidad de B. pumilus 15.1 con el tiempo de exposicin de
los cultivos al fro. ..
4.12 Concentracin letal media (LC
50
).
4.13 Estudio preliminar de la naturaleza del factor de virulencia de B. pumilus 15.1..
Capitulo 3. Anlisis de la toxicidad de Bacillus pumilus 15.1 en diferentes
estadios de Ceratitis capitata y otros modelos experimentales
4.14 Estudio de la patogenicidad de B. pumilus 15.1 en adultos de C. capitata...
4.15 Estudio de la patogenicidad de B. pumilus 15.1 en larvas de tercer
estadio de C. capitata
4.16 Estudio de la patogenicidad de B. pumilus 15.1 en pupas de C. capitata.
4.17 Estudio de la patogenicidad de B. pumilus 15.1 en huevos de C. capitata...
4.18 Actividad de B. pumilus 15.1 en otros modelos experimentales:
bioensayos en fruta...
4.18.1 Bioensayos en Mangifera indica
4.18.2 Bioensayos en Prunus persica nucipersica
4.18.3 Bioensayos en Pyrus communis.
4.18.4 Bioensayos en Citrus sinensis
Capitulo 4. Caracterizacin preliminar a nivel fisiolgico, molecular y filogentico de la
cepa Bacillus pumilus 15.1
4.19 Crecimiento y tiempo de generacin de B. pumilus 15.1 en medio LB

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4.20 Determinacin de de la susceptibilidad de B. pumilus 15.1 a distintos antibiticos.
4.21 Deteccin de elementos extracromosmicos
4.22 Curado de elementos extracromosmicos.
4.23 Caracterizacin filogentica de B. pumilus 15.1...
4.23.1 Relacin filogentica de B. pumilus 15.1 con otras cepas entomopatgenas..
4.23.2 Relacin filogentica de B. pumilus 15.1 con cepas pertenecientes al grupo
taxonmico de B. subtilis..
4.23.3 Relacin filogentica de B. pumilus 15.1con otras cepas patgenas...
Capitulo 5. Estudio de la comunidad bacteriana del intestino de larvas de Ceratitis
capitata y su relacin con la patogenicidad de Bacillus pumilus 15.1.
4.24 Eliminacin de la microbiota del intestino de larvas de C. capitata.
4.25 Determinacin del papel de la comunidad bacteriana de larvas de
C. capitata en la patogenicidad de B. pumilus 15.1..
4.26 Estudio de la comunidad bacteriana del intestino de larvas de C. capitata
mediante mtodo cultivo-dependiente..
4.27 Estudio de la comunidad bacteriana del intestino de larvas de C. capitata
mediante mtodo cultivo-independiente...
5. Discussion...
5.1 Isolation and selection of a novel bacterial pathogen active against C. capitata
5.2 Bacillus pumilus as an entomopathogen.
5.3 Pathogenicity of B. pumilus 15.1 toward C. capitata first-instar larvae.
5.4 Pathogenicity of B. pumilus 15.1 toward different developmental
stages of C. capitata and other models...
5.5 Approaches to the identification of virulence factor of B. pumilus
5.6 Phylogenetic relationships of B. pumilus 15.1
5.7 The role of gut microbiota for the pathogenicity of B. pumilus 15.1
to larvae of Ceratitis capitata.
6. Conclusions
7. Bibliografa

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RESUMEN | 1


RESUMEN


Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae), la mosca de la fruta del Mediterrneo, es
considerada una de las plagas ms importantes a nivel mundial. Esta especie es extremadamente
polfaga, infestando varias especies de cultivos, lo que ocasiona enormes prdidas econmicas.
Las bacterias entomopatgenas pertenecientes al gnero Bacillus han probado ser herramientas
seguras, ambientalmente amigables, y rentables econmicamente para el control de poblaciones
de plagas. Debido a que hasta el momento no se ha desarrollado un mtodo de control para C.
capitata basado en bacterias del gnero Bacillus, el aislamiento de nuevas cepas bacterianas es
necesario. En este trabajo reportamos el aislamiento de 115 cepas bacterianas, as como los
resultados del rastreo llevado a cabo con adultos y larvas de C. capitata. Como resultado de este
anlisis, obtuvimos una nueva cepa de Bacillus pumilus, la cepa 15.1, que es altamente txica
para las larvas de C. capitata. La toxicidad de esta cepa frente a C. capitata est relacionada con
el proceso de esporulacin, y solamente fue observada cuando los cultivos fueron incubados a
bajas temperaturas antes de ser usados en los bioensayos. La tasa de mortalidad de larvas de C.
capitata oscil entre 68% y 94%, dependiendo de las condiciones en las que el cultivo fue
incubado antes del bioensayo. Se prob que la toxicidad es una caracterstica especial de esta
nueva cepa bacteriana, ya que otras cepas de B. pumilus no mostraron causar efectos txicos en
larvas de C. capitata.
En este trabajo tambin se llevaron a cabo experimentos para conocer la biologa de la cepa 15.1,
las principales caractersticas de su patogenicidad, y algunos aspectos de su modo de accin. As,
se llevaron a cabo ensayos de toxicidad con diferentes estadios de desarrollo de C. capitata,
cuyos resultados mostraron que la actividad de la cepa 15.1 es solamente larvicida, sin causar
efectos significativos en otros estadios. Tambin se describe el efecto de esta cepa en el
desarrollo de la mosca de la fruta del Mediterrneo en varias especies de frutas, mostrando
algunos efectos en ctricos. Tambin se caracterizaron los elementos extracromosmicos de B.
pumilus 15.1. Adems, los resultados de los anlisis filogenticos mostraron que la cepa 15.1
est relacionada con cepas analizadas pertenecientes al grupo de B. cereus. Finalmente, se
analiz la comunidad bacteriana del intestino de las larvas bajo diferentes condiciones,
2 | RESUMEN
mostrando que la eliminacin parcial de esta microbiota no afecta a la tasa de mortalidad causada
por B. pumilus 15.1
En el presente trabajo de investigacin se reporta por primera vez la actividad entomopatgena
de B. pumilus frente a la mosca de la fruta del Mediterrneo, y el aislamiento de una cepa de
Bacillus patgena para este insecto. Los resultados aqu presentados revelan que existen cepas
pertenecientes al gnero Bacillus con actividades an no exploradas y con varios usos
potenciales. No es de esperar que la cepa 15.1 provea total control en las poblaciones de C.
capitata, pero los hallazgos aqu presentados sugieren que esta bacteria debera ser considerada
como un buen candidato para el control biolgico de la mosca de la fruta del Mediterrneo. Sin
embargo, se requieren futuros estudios con el objeto de determinar la toxicidad de la cepa 15.1
frente a insectos de otros rdenes, as como para validar su efectividad en la disminucin de
poblaciones de C. capitata en condiciones de campo.








ABSTRACT | 3


ABSTRACT


Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae), the Mediterranean fruit fly (medfly), is
one of the most important fruit pests worldwide. The medfly is a polyphagous species that causes
losses in many crops, which leads to huge economic losses. Entomopathogenic bacteria
belonging to the genus Bacillus have been proven to be safe, environmentally friendly, and cost-
effective tools to control pest populations. As no control method for C. capitata based on these
bacteria has been developed, isolation of novel strains is needed. Here, we report the isolation of
115 bacterial strains and the results of toxicity screening with adults and larvae of C. capitata. As
a result of this analysis, we obtained a novel Bacillus pumilus strain, strain 15.1, that is highly
toxic to C. capitata larvae. The toxicity of this strain for C. capitata was related to the
sporulation process and was observed only when cultures were incubated at low temperatures
before they were used in a bioassay. The mortality rate for C. capitata larvae ranged from 68 to
94% depending on the conditions under which the culture was kept before the bioassay. Toxicity
was proven to be a special characteristic of the newly isolated strain, since other B. pumilus
strains did not have a toxic effect on C. capitata larvae.
Here we also show approaches in the biology of the 15.1 strain, in its principal pathogenicity
characteristics, and some aspects of its mode of action. Thus, toxicity assays of strain 15.1
against Medfly at different developmental stages were carried out; leading to the finding that
activity is larvicidal with no significant effects on other stages. The action of the strain on the
development of Medfly in various fruits is then described, showing some effects in citrus. The
pathogenic strain of B. pumilus was also characterized in terms of plasmid content and is
analyzed phylogenetically, showing similarities to B. cereus group strains. Finally, the bacterial
community of the Medfly larval gut was analyzed under different conditions, showing that
partial elimination of this microbiota did not affect the mortality rates caused by B. pumilus 15.1.
To our knowledge, the entomopathogenic activity of B. pumilus against Medfly, and the isolation
of a Bacillus strain pathogenic for C. capitata larvae are reported here for the first time. The
results of our study have revealed that there are strains of Bacillus genus with unexplored
activities and potential uses. We do not expect that B. pumilus will provide total control on C.
4 | ABSTRACT
capitata larvae, but the results of the present study suggest that B. pumilus 15.1 could be
considered as a strong candidate for the biological control of C. capitata. Moreover, these
findings represent an important starting point for the development of pest control strategies that
can help reduce economic losses in fruit crops. However, further studies are now required in
order to determine the toxicity against insects from other orders, and validate its effectiveness in
the suppression of Medfly populations under field conditions.


























1
1. . I I N N T T R R O O D D U U C C C C I I N N

































INTRODUCCI N | 7

1.1 CERATI TIS CAPI TATA (WIEDEMANN)
El nombre comn de esta especie es mosca de la fruta del Mediterrneo, ya que en los pases
mediterrneos es donde su incidencia econmica se ha hecho ms evidente. En ingls es
comnmente llamada Medfly. Es una de las plagas ms eficientes, destructivas, y ampliamente
distribuidas del mundo, afecta a numerosos cultivos, y por tanto es uno de los insectos con mayor
importancia econmica en agricultura. As, C. capitata es considerada como la plaga ms daina
de frutas comestibles. Se han realizado multitud de esfuerzos para reducir las potenciales
prdidas econmicas generadas por esta plaga; en trminos econmicos globales, se han
implementado programas encaminados a que minimicen el riesgo de introducciones en nuevos
territorios a travs de la comercializacin. Adems, se ha intentado controlar las poblaciones de
C. capitata, en sitios donde ya se ha establecido, mediante varios mtodos que sern detallados
posteriormente. Sin embargo, las prdidas econmicas causadas por esta plaga no se han
reducido, por lo que la bsqueda de nuevos mtodos de control es indispensable.


1.1.1 Ubicacin taxonmica
Ceratitis capitata pertenece al suborden Cyclorrhapha, en donde se agrupan los dpteros
superiores o ms evolucionados; y se incluye dentro de la familia Tephritidae, conocida como la
familia de las moscas de la fruta, muy importantes econmicamente debido a que la mayora de
ellas son plagas de gran relevancia agrcola. Est incluida dentro de la subfamilia Dacinae, la
tribu Ceratitidini, y dentro del grupo Ceratitis donde se incluyen adems otros 8 gneros de
origen africano: Capparymia Bezzi, Carpophthoromyia Austen, Eumictoxenus Munro,
Neoceratitis Hendel, Nippia Munro, Perilampsis Bezzi, Trirhithrum Bezzi, y Xanthorrachista
Hendel (White 1996, De Meyer 2000). Sus sinnimos son: Ceratitis citriperda MacLeay,
Ceratitis hispanica De Brme, Paradalaspis asparagi Bezzi y Tephritis capitata Wiedemann
(Thomas et al. 2001).


1.1.2 Origen y distribucin geogrfica
Ceratitis capitata es originaria de la costa noroccidental y mediterrnea de frica, donde
tambin habitan especies muy prximas (Gasparich et al. 1997). Estudios de gentica de
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poblaciones (Malacrida et al. 2007), sugieren que el origen de esta especie se encuentra en las
zonas tropicales del este sub-sahariano, especficamente en Kenia.
Desde su hbitat nativo se ha expandido en menos de 200 aos hasta llegar a ser considerada una
especie cosmopolita presente en los cinco continentes y 85 pases (CABI/EPPO 1998, Malacrida
et al. 2007). A travs del movimiento de fruta infestada durante los siglos XIX y XX, C. capitata
emigr, establecindose en casi todos los pases que se encuentran en zonas templadas,
subtropicales y tropicales del mundo, con especial nfasis en la cuenca mediterrnea (White and
Elson-Harris 1992) (Fig. 1).
Su amplia distribucin es atribuida, entre otras razones a su comportamiento altamente polfago
(Liquido et al. 1991), su resistencia a climas fros (Smith 2002), su establecimiento rpido y
exitoso, as como repetidas introducciones en determinadas zonas (He and Haymer 1999,
Meixner et al. 2002), como resultado del incremento en el comercio global.

En Espaa se distribuye fundamentalmente por toda la zona sur y regiones mediterrneas,
alcanzando condiciones ptimas en las regiones interiores de la pennsula Ibrica (Vera et al.
2002, Mau and Kessing 2007). Se encuentra ampliamente distribuida en frica, as como en
pases de la cuenca del Mediterrneo. En Amrica del Sur fue detectada por primera vez en
Brasil, en 1901, desde donde se dispers al resto de los pases del rea, con la excepcin de
Chile, pas que fue declarado libre de la plaga en 1995 (Diaz et al. 1999). En Norteamrica fue
detectada por primera vez en los Estados Unidos en el ao 1929, en el estado de Florida,
introduccin que fue erradicada exitosamente. Posteriormente, se han observado recurrentes
ingresos; actualmente est presente en California y Florida (USDA 1999). En Mxico fue
detectada por primera vez en 1977, desde entonces se encuentra amplia y densamente distribuida
en Amrica Central; el nico pas libre de esta plaga en esta regin es Belice.

En Asia se encuentra en Arabia Saudita, Irn, Israel, Jordania, Lbano, Siria, Turqua y Ucrania.
En Australia se encuentra en la porcin occidental de Australia, e Islas Marianas. En Europa se
encuentra establecida en Italia, Chipre, Creta, Espaa, Grecia, Malta, Portugal y est presente,
aunque no en poblaciones muy abundantes, en Austria, Francia, Suiza y Macedonia. Adems, se
ha reportado su presencia, aunque no ha logrado establecerse en Alemania, Blgica, Holanda,
Hungra y Luxemburgo (Roderick and Villablanca 1996, Vera et al. 2002, Mau and Kessing
INTRODUCCI N | 9
2007). Thomas et al. (2001) provee una lista detallada de los pases en donde se encuentra C.
capitata.




Figura 1. Distribucin mundial de Ceratitis capitata. El registro subnacional significa que su presencia no ha sido
reportada en todas las regiones del pas indicado. Tomado de
http://www.eppo.org/QUARANTINE/insects/Ceratitis_capitata/CERTCA_map.htm


1.1.3 Descripcin
La mosca de la fruta del Mediterrneo tiene metamorfosis completa, es decir es un insecto
holometbolo, ya que posee el estadio de pupa en el que se desarrollan las futuras estructuras
adultas. Este insecto tiene 4 estadios durante su ciclo de vida: huevo, larva, pupa y adulto
(Romoser and Stoffolano 1994).
El huevo es de color blanquecino, de forma elptica, casi plano en la superficie ventral y
ligeramente convexo en la superficie dorsal; el extremo ceflico es un poco ms largo que el
extremo posterior, el corin es liso y sin relieves (Fig. 2). Su tamao medio es de 1mm x 0.2
mm. La regin micropilar es tubercular (Thomas et al. 2001). La larva es blanquecina, con tonos
amarillo o amarillo crema (Fig. 2). El cuerpo es cnico anteriormente y casi cilndrico en su parte
posterior, un poco curvado, con la convexidad dorsal, con 11 segmentos de casi igual longitud.
La cabeza es pequea parcialmente retrctil, a ambos lados posee un rgano antenal quitinoso y
10 |
dos lbulos orales convexos. Los ganchos mandibulares son curvados, robustos. Los lbulos
anales son redondeados y grandes. Despus de efectuar dos mudas, alcanza su completo
desarrollo; el tercer instar o estadio larvario mide aproximadamente entre 7 y 9 mm de longitud,
con 8 reas fusiformes (Thomas et al. 2001, Mau and Kessing 2007).
La pupa es cilndrica, color de caf plido a caf rojizo profundo; con 11 segmentos bien
distinguidos, al igual que la larva (Fig. 2). Los espirculos anteriores son como los de la larva,
pero ms oscuros. Los espirculos posteriores son de tamao mediano, de color rojo amarillento
o rojo oscuro, localizados centralmente en la lnea media horizontal, cada uno con tres pequeas
entradas amarillentas, localizadas en un crecimiento en forma de plato. El plato es anal pequeo
y de un rojo oscuro. Mide 3-5 mm de longitud y 1.25-2.0 mm de dimetro (Christenson and
Foote 1960, Thomas et al. 2001)




Figura 2. Estadios de Ceratitis capitata. A) huevos, B) larva de tercer estadio, C) pupas, y D) macho adulto
emergiendo de una pupa.


INTRODUCCI N | 11
El tamao del adulto es algo menor que la mosca domstica (4-5 mm de longitud) y vivamente
coloreada; su trax es gris con bandas negras y largas cerdas, el abdomen presenta franjas
amarillas y grises, las patas son amarillentas, y las alas son irisadas, con varias bandas grises,
amarillas y negras (Fig. 3). Las hembras poseen un oviscapto muy puntiagudo y retrctil que
mide 1.2 mm de longitud, en el que se insertan abundantes sedas sensoriales. Los machos se
distinguen fcilmente de las hembras por la forma redondeada del abdomen, y por la presencia
en la cabeza de dos quetas orbitales que terminan en una paleta romboide de color negro,
carcter que diferencia del resto de especies de moscas de importancia agrcola pertenecientes a
la familia Tephritidae, y de donde proviene el nombre de la especie. En el abdomen, los tergitos
poseen una franja posterior gris. El abdomen es de color amarillo a grisceo con cerdas negras.
Los frceps del rgano copulador del macho tienen el proceso external de la lmina inferior
mucho ms largo que el de la lmina anterior, el cual es atenuado (Christenson and Foote 1960,
Romoser and Stoffolano 1994, Thomas et al. 2001, Mau and Kessing 2007).




Figura 3. Macho adulto de Ceratitis capitata. (Copyright 2007 Ron Hember, BugGuide).
Tomado de: http://bugguide.net/node/view/95901/bgimage


1.1.4 Ciclo de vida
La duracin del ciclo de C. capitata depende de las condiciones ambientales, principalmente de
la temperatura (Christenson and Foote 1960). En la regin Mediterrnea su actividad se reduce
en invierno, periodo que puede permanecer en estado de pupa. Por debajo de 12,5C no puede
12 |
realizar la ovoposicin; adems, el desarrollo de huevos, larvas y pupas se detiene por debajo de
los 10C. Si la temperatura sube por encima de 14C vuelven a estar activas. La hembra de C.
capitata puede poner unos 22 huevos por da y entre 300 y 800 en todo el periodo reproductivo
(Aluja 1993).

El ciclo de vida de C. capitata tiene bsicamente cinco fases:
1) la hembra adulta fecundada deposita los huevos en la fruta, atrada por el olor y el color
(prefieren el amarillo y naranja, por eso los frutos verdes no son atacados), perfora la piel de
la fruta o del vegetal con su largo ovipositor, y deposita de uno a 10 huevos;
2) dentro de la fruta, los huevos salen del corin y se convierten en larvas;
3) las larvas se alimentan de la pulpa de la fruta y luego se dejan caer a la tierra;
4) las larvas reducen su metabolismo, y pupan dentro en la tierra; y
5) las pupas maduran y emergen las moscas adultas que salen de la tierra.

El ciclo de vida se completa entre 28 y 34 das en condiciones de verano, y entre 60 a 115 das
bajo condiciones climticas de invierno (Christenson and Foote 1960, Vargas et al. 1983,
Chapman et al. 1998, Rigamonti 2004, Mau and Kessing 2007). El nmero de generaciones
alcanzadas por ao vara en funcin de factores ambientales como la temperatura, la humedad y
disponibilidad de especies hospedadoras. En zonas templadas con inviernos fros y sin presencia
de frutos desde otoo a primavera, C. capitata presenta de 3 a 4 generaciones anuales. El nmero
de generaciones se incrementa de 6 a 8 cuando las temperaturas mnimas invernales no bajan de
los 0C y es capaz de superar las 12 generaciones en las condiciones ambientales ms ptimas
(Aluja 1993, Rigamonti 2004).


1.1.5 Importancia econmica
C. capitata afecta a alrededor de 300 especies de cultivos de diferentes frutas, y vegetales, que
principalmente se encuentran en regiones tropicales, subtropicales y templadas (Liquido et al.
1991, De Meyer et al. 2002, Rigamonti 2004, Mau and Kessing 2007). Las prdidas econmicas
que produce esta especie no solamente son causadas por la disminucin del rendimiento de los
cultivos, que puede ir de 10 a 75%, sino tambin debido a las sanciones en las exportaciones,
INTRODUCCI N | 13
cuarentenas, prdida de mercado, y tratamientos costosos para su erradicacin (Mau and Kessing
2007).

Por lo mencionado anteriormente es considerada la mayor plaga de moscas de la fruta, y una de
las plagas ms dainas mundialmente, causando prdidas econmicas gigantescas en los pases
donde se encuentra establecida (Stibick 2004). Se ha discutido ampliamente sobre las razones
por las cuales C. capitata se ha convertido en plaga, siendo las principales:
1) Es capaz de resistir bajas temperaturas, y alargar estadios, principalmente el de larva (Smith
2002).
2) Por la evolucin de oportunidades, la ampliacin de las fronteras agrcolas ha ampliado el
hbitat de C. capitata (Bonizzoni et al. 2004).
3) El estadio larvario posee un amplio rango de hospedadores (De Meyer et al. 2002).
4) Posee alta variabilidad gentica en secuencias EPIC, que le confieren la capacidad de
adaptarse a nuevos ambientes (He and Haymer 1999, Meixner et al. 2002).
5) El transporte de cultivos ha facilitado su dispersin (Thomas et al. 2001).

La mosca de la fruta del Mediterrneo prefiere frutas maduras y suculentas de piel delgada, como
peras (Pyrus spp.), higos (Ficus indica), mangos (Mangifera indica), melocotones (Prunas
persica) y manzanas (Malus spp.); adems, de ctricos (Citrus spp.), que tambin se incluyen
dentro de sus principales especies hospedadoras (Quilici and Rivry 1996, Smith 2002). Una lista
de los hospedadores frecuentes, ocasionales y raros de C. capitata se detalla en Thomas et al.
(2001).

La preferencia de una especie u otra como hospedador de C. capitata, vara de regin a regin,
observndose cierta capacidad de la plaga para adaptarse a nuevas especies hospedadoras al
invadir nuevas reas (Jang and Light 1996, Thomas et al. 2001). La eleccin, al invadir una
nueva regin depender del grado de madurez de los frutos, de su abundancia, y de si existen
otras moscas frugvoras, que pueden ser posibles competidoras (Jang and Light 1996).

C. capitata produce dao a la fruta cuando la picadura que hace la hembra en la oviposicin
produce un pequeo orificio en la superficie del fruto, que forma a su alrededor una mancha de
14 |
color amarillo plido. Esta herida es una entrada de bacterias y hongos que provocan la pudricin
del fruto. Adicionalmente, las larvas excavan galeras en los tejidos internos del fruto,
alimentandose de la pulpa, favoreciendo los procesos de oxidacin y maduracin prematura de la
fruta, que origina una pudricin del fruto que queda inservible para el mercado, aumentando su
descomposicin y provocando su cada al suelo (Alfaro et al. 1999, Thomas et al. 2001, Pea et
al. 2002).

La importancia econmica de C. capitata en Espaa reside principalmente en las prdidas
producidas en los cultivos de ctricos, ya que Espaa es el mayor productor de ctricos de la
Unin Europea y el primer pas exportador a nivel mundial, con ms de la mitad de la
produccin destinada a la exportacin (Alfaro et al. 1999).


1.1.6 Mtodos de control de C. capitata
Al tratarse de una de las especies que ms daos econmicos produce a nivel mundial, ha sido
objeto de multitud de estudios, principalmente orientados a encontrar un mtodo para su control.
Sin embargo, al parecer, hasta ahora ninguna de estas tcnicas se ha acercado a una solucin
eficaz, no costosa y estable a largo plazo.

Aunque estrictamente no se considera un mtodo de control para la mosca de la fruta del
Mediterrneo, los programas preventivos asociados a los potenciales hospedadores pueden ser
eficaces, si se combinan con otros mtodos. Por ello es que los pases exportadores de fruta
deben poseer programas de deteccin temprana de la plaga y programas estrictos de cuarentena,
para evitar que esta especie se difunda en zonas libre de la misma (Follett and Armstrong 2004).
Los controles preventivos, usando atrayentes, deben comenzar a inicios de la primavera, cuando
las temperaturas se incrementan, los adultos empiezan a estar activos y las pupas emergen del
suelo (USDA 1999).
A continuacin se detallan los principales mtodos empleados para el control de C. capitata.




INTRODUCCI N | 15
1.1.6.1 Control Qumico
Para combatir las poblaciones de C. capitata se han utilizado fundamentalmente tratamientos
qumicos (organofosforados y piretroides), siendo necesario efectuar varias aplicaciones durante
el periodo de maduracin de los frutos, con los inconvenientes que ello conlleva (Alfaro et al.
1999, Berni et al. 2003). El insecticida qumico usado tradicionalmente para el control de los
daos causados por C. capitata es el malatin. Este insecticida pertenece al grupo de los
organofosforados, es neurotxico, se une irreversiblemente a la colinesterasa y su degradacin en
agua sucede mayormente por medio de fotolisis (Paris and Lewis 1973, Wolfe et al. 1977). A
pesar que el malatin tiene una toxicidad relativamente baja para los seres humanos, puede ser
eliminado por la orina.

Al igual que en otras regiones, el mtodo de control qumico que tradicionalmente ha sido
utilizado en Espaa es la aplicacin de malatin en combinacin con protena hidrolizada como
atrayente alimenticio, junto con aplicaciones areas de este insecticida (Navarro-Llopis et al.
2010). Mediante el empleo de esta tcnica se han intentado controlar y monitorizar las
poblaciones de la mosca de la fruta del Mediterrneo, principalmente en cultivos de ctricos de la
comunidad Valenciana. El uso continuado de malatin durante varias generaciones de la mosca
de la fruta del Mediterrneo ha originado la aparicin de poblaciones de C. capitata resistentes al
malatin. Poblaciones silvestres de C. capitata en diferentes reas geogrficas han desarrollado
tolerancia a este insecticida organofosforado, produciendo moscas de 6 a 201 veces ms
tolerantes que poblaciones de laboratorio, y de 2 a 30 veces ms resistentes que las poblaciones
silvestres no tratadas (Magana et al. 2007, Magaa et al. 2008). Por esta razn, adems de los
problemas ambientales ocasionados, la utilizacin de este tipo de insecticidas se encuentra cada
vez ms restringida por polticas globales. Como ejemplo, en el 2007 el uso de malatin fue
prohibido para aplicaciones agrcolas en la Comunidad Econmica Europea (Urbaneja et al.
2009).

Dados los inconvenientes que presenta el tratamiento qumico, se hace necesario reemplazar la
lucha qumica por estrategias ms respetuosas con el medio ambiente, y con menos efectos
colaterales.

16 |
1.1.6.2 Trampeo Masivo
Este mtodo de control se basa en la captura masiva de adultos de C. capitata, y combina el uso
de trampas con compuestos atrayentes, sexuales o alimenticios, que pueden estar mezclados con
insecticida. Los atrayentes utilizados, considerados eficaces y ecolgicamente aceptables, son la
base de esta mtodo de lucha (Katsoyannos et al. 1999, Broughton and De Lima 2002).
La estrategia de trampeo masivo consiste en capturar el mayor nmero posible de adultos para
evitar las picaduras de ovoposicin en los frutos hospedadores. Para ello, se distribuyen trampas
en las zonas de cultivo, a una densidad adecuada en funcin de la intensidad de la plaga, cebadas
con atrayentes alimenticios, o sexuales, que compiten con ventaja con los frutos en proceso de
maduracin. El mtodo puede ser utilizado de forma exclusiva para el control de la plaga, o bien,
ocasionalmente cuando el nivel de la poblacin lo justifica, puede complementarse con la
aplicacin de insecticidas, aunque se puede ajustar la tcnica para prescindir de los tratamientos
qumicos. Existen una gran cantidad de trampas y atrayentes diferentes en el mercado y su
seleccin puede tener una alta repercusin en el grado de eficacia de la tcnica (Escudero-
Colomar et al. 2008, Navarro-Llopis et al. 2008).

C. capitata es un caso singular, ya que el atrayente usado extensamente es Trimedlure, un
producto sinttico con una estructura no demasiado cercana a la de otras feromonas y especfico
para machos (Midgarden et al. 2004). Como atrayentes de hembras se usan algunas aminas que
se producen en la degradacin de protenas y que por tanto mimetizan un olor alimentario (Heath
et al. 1990, Katsoyannos and Papadopoulos 2004). Ha habido intentos de identificar la feromona
de machos de C. capitata para utilizarla como atrayente, pero nunca se ha conseguido conocer
con detalle su composicin y obtener atrayentes eficaces derivados de ella (McGovern et al.
1987, Jang et al. 2001, Jang et al. 2003). Las tcnicas de anlisis de compuestos voltiles han
avanzado sensiblemente; sin embargo, al no obtener un compuesto efectivo se han realizado
mezclas de otros previamente sintetizados, sin un resultado ptimo (Casana-Giner et al. 2001).

Ante la dificultad de conocer la composicin de la feromona sexual segregada por los machos
(Baker et al. 1985, Heath et al. 1990), se han llevado a cabo estudios sobre diversos tipos de
atrayentes sintticos para hembras combinando varios componentes alimenticios (Heath et al.
1997), algunos de ellos ensayados con xito en diferentes pases (Katsoyannos et al. 1999). El
INTRODUCCI N | 17
trampeo masivo utilizando estas sustancias est dando buenos resultados en ctricos y frutales
como naranjas, clementinas, melocotones, entre otros. Tambin se han ensayado otros atrayentes
alimenticios como el BioLure, que est compuesto por tres sustancias qumicas (acetato
amnico, putrescina y trimetilamina). Estos tres componentes han sido empleados juntos y por
separado, mostrando que en ninguno de los dos casos son capaces de causar un descenso en el
porcentaje de captura de adultos de C. capitata (Leblanc et al. 2010).

Los atrayentes son utilizados en combinacin con el trampeo, constituye una opcin para el
control de C. capitata, y es usado como tal. Existen trampas con tres diferentes objetivos: 1) slo
para machos, cebado con una feromona o una paraferomona, ms un insecticida; 2) slo para
hembras, cebado con un insecticida; y 3) las trampas hmedas que sirven para machos y
hembras, que consisten de una fuente de azcar o protena ms un insecticida. Sin embargo,
cuando se decide usar el trampeo como mtodo de control, es conveniente, tener en cuenta que
insectos beneficiosos tambin pueden ser capturados mediante estos mtodos (Stibick 2004).

El trampeo masivo necesita el seguimiento minucioso a lo largo de toda la temporada, para
conocer la distribucin, densidad y dinmica de la poblacin. Esta informacin permite aconsejar
sobre el momento idneo para la aplicacin de algn tratamiento qumico complementario
(Escudero-Colomar et al. 2008).

Este mtodo ha demostrado ser una eficaz herramienta en el control de C. capitata, y su
aplicacin en pases Mediterrneos se han incrementado notablemente como mtodo de control
(Navarro-Llopis et al. 2008). As, en la provincia de Granada (Espaa) se han evaluado
diferentes sistemas de trampeo con el propsito de monitorizar las poblaciones de C. capitata
(Campos et al. 1989). En Espaa esta estrategia se est empleando principalmente en la
Comunidad Valenciana, donde desde el ao 2004 existe un programa de trampeo masivo, aunque
restringido a reas citrcolas especficas que requieren una especial proteccin, ya que el
principal factor limitante de la aplicacin de este mtodo a gran escala es su elevado coste
(Castaera 2003).

18 |
En general, la estrategia de trampeo masivo es considerada beneficiosa ya que provee un control
eficaz de la plaga, respeta la fauna til y no deja residuos txicos en los frutos; sin embargo, el
mtodo solo consigue una proteccin adecuada cuando las poblaciones son bajas o moderadas
(Alonso and Garcia 2004).


1.1.6.3 Control Autocida
El principal mtodo de control, y probablemente el ms eficaz, que se ha ejercido en contra de la
mosca de la fruta del Mediterrneo es la Tcnica del Insecto Estril (SIT por sus siglas en ingls,
Sterile Insect Technique), o tambin llamado control autocida (Rossler et al. 2000). En este
mtodo, las pupas criadas en laboratorio son sometidas a un tratamiento de radiacin gamma
para esterilizar a los futuros machos; estos machos estriles compiten con los machos silvestres
por el acceso a las hembras silvestres. Los cruces de los machos estriles con las hembras
silvestres dan lugar a progenie no viable, producindose un impacto negativo sobre la poblacin
silvestre. Despus de un nmero de generaciones, la densidad de una poblacin de campo
disminuir notablemente (Gould and Schliekelman 2004). Los machos liberados deben estar en
una proporcin de 100 por cada macho silvestre; y si la liberacin es exitosa, el 99% de los
apareamientos no dar descendencia (Jang et al. 2003).

El xito de este mtodo depende de varios factores, uno de los ms importantes es que la mosca
criada en laboratorio sea compatible con la silvestre y sea competitiva en el apareamiento. Por
ejemplo, en las liberaciones realizadas en Hawai, se observ que las moscas de laboratorio eran
evitadas por las silvestres, evitando que se apareen, lo que oblig a reemplazarlas por otra cepa
de moscas (McInnis et al. 1996, Barry et al. 2003). Adems, se ha comprobado que los machos
estriles liberados en el campo solamente tienen capacidad de moverse unos cuantos cientos de
metros desde el punto de liberacin, obligando a hacer liberaciones geogrficamente muy
puntuales, lo que en grandes superficies infestadas puede presentar problemas de logstica, e
incremento en el costo de los programas de liberacin (Follett and Armstrong 2004, Meats et al.
2006).

La tcnica del insecto estril es un mtodo no invasivo de control de plagas. Al contrario de lo
que ocurre con otros mtodos de control, este no libera agentes exticos en nuevos ambientes, y
INTRODUCCI N | 19
no introduce nuevo material gentico en otro existente, debido a que los organismos
introducidos, no son por si mismos replicativos (Robinson 2002). Sin embargo, en el caso de C.
capitata, as como en el caso de otras plagas, el SIT es efectivo solamente cuando se ha
localizado el total de la poblacin (Hendrichs et al. 2002, Follett and Armstrong 2004, Meats et
al. 2006). Ha habido un considerable progreso en el desarrollo y aplicacin integrada del SIT en
contra de C. capitata, aunque se podra incrementar la efectividad de est mtodo combinndolo
con programas de manejo integrado de plagas. Adems es indispensable aumentar el
conocimiento del comportamiento sexual de este insecto, porque al contrario a lo que sucede en
otros insectos en los que el SIT ha sido aplicado satisfactoriamente, C. capitata posee un
complejo sistema de apareamiento basado en leks, que consiste en que los machos que competen
por el apareamiento con hembras se agrupan en lugares especficos para realizar exhibiciones
(Robinson et al. 1999, Hendrichs et al. 2002, Robinson 2002). Asmismo, la eficacia de esta
tcnica es mucho mayor cuando las poblaciones silvestres de C. capitata son bajas, por lo que su
utilizacin ha de ser complementada con otros mtodos de control (Barry et al. 2004).


1.1.6.4 Control Biolgico
Las poblaciones de todos los organismos vivos son, en alguna medida, reducidas por la accin
natural de sus depredadores, parsitos, antagonistas y patgenos. Este proceso es llamado
control natural; sin embargo, cuando la densidad de la poblacin de una plaga es manipulada
por el hombre se denomina control biolgico, y los agentes que llevan a cabo el control se
denominan enemigos naturales (Ruberson et al. 1999, Eilenberg et al. 2001). As, los humanos
pueden explotar el control biolgico de varias maneras para suprimir las poblaciones de las
plagas (Dent 2000).

Eilenberg et al. (2001) definen control biolgico como el uso de organismos vivos para suprimir
la poblacin de una plaga especfica, hacindola menos abundante o menos perjudicial de lo que
de otra manera podra ser.

Entre otras, las principales ventajas, y por lo tanto razones para usar mtodos de control
biolgico son: 1) es ambientalmente respetuoso, bastante especifico, sin efectos nocivos para los
organismos no-diana; 2) es un mtodo econmico, la relacin coste beneficio es muy favorable;
20 |
3) ausencia de residualidad; 4) una vez establecidos, los agentes naturales de control biolgico
pueden reproducirse por s solos, y en pocos casos se requiere de aplicaciones constantes (Dent
2000, Thacker 2002, Hajek 2004).

Los enemigos naturales usados en control biolgico de plagas de insectos son diversos tanto
taxonmicamente como funcionalmente. Incluyen los grupos de parasitoides, depredadores y
patgenos (Hajek 2004, van Emden and Service 2004). Solamente hay un objetivo relativo a las
interacciones entre los enemigos naturales y sus plagas, matar a sus hospedadores tan rpido
como sea posible, antes de que el nivel de dao econmico crezca; sin embargo, un enemigo
natural exitoso debe cumplir con ciertos atributos generales: 1) especificidad de hospedador; 2)
sincrona con la plaga; 3) alta tasa de natalidad; 4) habilidad para sobrevivir largos periodos de
tiempo con poco o ningn alimento; y 5) buena habilidad para buscar a su plaga (Beddington et
al. 1978, Hajek 2004). Antes de la implementacin de un mtodo de control biolgico para C.
capitata es fundamental evaluar si su relacin con el enemigo natural escogido es
evolutivamente estable o no, ya que este tipo de consideraciones han sido desatendidas en otras
plagas (Holt 1997).

La enorme dependencia que se tena por el malatin y su reciente prohibicin han obligado a la
bsqueda de materias activas alternativas con una eficacia comparable y de mayor selectividad.
As, varios han sido los intentos de aplicacin de mtodos de control biolgico clsico para
reducir las poblaciones de C. capitata, los principales han consistido bsicamente en liberaciones
inundativas de algunas de las 67 especies de parasitoides y depredadores, con diferentes grados
de xito, segn la regin geogrfica donde se ha aplicado (Kazimirova et al. 1997, Baeza-Larios
et al. 2002, Lopez et al. 2003). Sin embargo, este mtodo de control ha sido ensayado
principalmente en laboratorio, por lo que a pesar de todos estos intentos, el control de las
poblaciones de la mosca de la fruta del Mediterrneo no ha sido efectivo, y las perdidas
asociadas con esta plaga siguen incrementndose constantemente.

Hasta el final de la dcada de 1980, se crea que el parasitoide ms eficaz de la mosca de la fruta
del Mediterrneo era Fopius arisanus (Baeza-Larios et al. 2002). Aunque F. arisanus poda ser
un parasitoide facultativo de C. capitata, es un parasitoide asitico de pupas de la mosca oriental
INTRODUCCI N | 21
(Bactrocera dorsalis). De hecho, los parasitoides utilizados en aquel entonces para controlar a C.
capitata eran en su totalidad parasitoides descritos como enemigos naturales de la mosca oriental
(Wharton et al. 1981, Steck et al. 1986, Jiron and Mexzon 1989, Eskafi 1990).

Un inventario llevado a cabo en Kenya descubri 10 especies de parasitoides en el interior de
pupas y huevos de C. capitata reportndose una altsima tasa de parasitoidismo de Fopius
ceratitivorus, como parasitoide ovopupal (Lopez et al. 2003). En el proceso de colonizacin F.
ceratitivorus oviposita sobre los huevos y larvas recientemente eclosionadas, y que completa su
desarrollo en la pupa hospedadora. Esta caracterstica otorga a F. ceratitivorus el atractivo de
ampliar el espectro temporal en el cual pueden parasitar (Vargas et al. 2001). Adems, a
diferencia de otros parasitoides previamente usados en el control biolgico de la mosca de la
fruta del Mediterrneo (Kazimirova et al. 1997), F. ceratitivorus fue recolectado en la regin de
origen de C. capitata, al este de frica. Debido a que los huevos de C. capitata cercanos a la
superficie del fruto son particularmente vulnerables, ello podra contribuir a su xito como
agente de control biolgico (Vargas et al. 2001, Lopez et al. 2003).

Debido a que los resultados preliminares de la introduccin de F. ceratitivorus han revelado un
promedio de nivel de parasitoidismo del 4%, con picos de hasta el 21%, altsimos para este tipo
de insectos, la descripcin de este parasitoide ha sido considerado como un gran avance para el
control de C. capitata; aunque, por supuesto que para controlar a una mosca tan extendida
geogrficamente, ser necesario que este parasitoide posea la capacidad de adaptarse y atacar en
una gran variedad de ambientes (Vargas et al. 2001, Lopez et al. 2003). Sin embargo, a pesar de
su alta tasa de parasitoidismo, no es suficiente para mantener a C. capitata bajo el nivel de dao
econmico, sumado a la dificultad de crecer a los parasitoides en laboratorio para su posterior
liberacin en el campo, y a la ausencia de datos ecolgicos que aseguren su permanencia estable
en ambientes en los cuales an no se ha probado su introduccin, este mtodo no es an del todo
efectivo.

En Espaa se ha probado con la importacin de dos especies de parasitoides, Diachasmimorpha
tryoni, nativo de Australia y endoparasitoide de larvas, y F. arisanus, nativo del sur de Asia, y
parasitoide de huevos (Castaera 2003). En algunos pases como Mxico, Guatemala o Costa
22 |
Rica, el uso conjunto de parasitoides y machos estriles se est aplicando con cierto grado de
xito (Gurr and Kvedaras 2009).

Por otro lado, ya que parte del ciclo biolgico de C. capitata se desarrolla en el suelo (larvas de
tercer estadio, pupas y adultos recin emergidos, se han empleado algunas especies de insectos (y
en general artrpodos) depredadores polfagos que puedan actuar en contra de la mosca de la
fruta del Mediterrneo en este hbitat. La diversidad de organismos ensayados incluye a
escarabajos de las familias Carabidae y Staphylinidae, as como hormigas y algunas especies de
araas, entre otros (Eskafi and Kolbe 1990, Urbaneja et al. 2006, Monzo et al. 2009). Se ha
demostrado que estos depredadores muestran preferencia por un determinado estadio del
desarrollo de la mosca; de esta manera, por ejemplo, Pseudoophonus rufipes (Carabidae) se
alimenta solamente de pupas de C. capitata (Barbosa 1998).

Otros mtodos de control biolgico ensayados contra C. capitata incluyen extractos de plantas
utilizados como insecticidas biolgicos (Zapata et al. 2006), demostrando la gran variedad de
estrategias naturales ensayadas para controlar la mosca de la fruta del Mediterrneo. A pesar de
esta diversidad, sin duda, los insecticidas basados en agentes microbianos (bacterias, hongos y
virus) son la alternativa ms prometedora para el control de las poblaciones de C. capitata
(Burns et al. 2001, Dimbi et al. 2003, Konstantopoulou et al. 2006, Quesada-Moraga et al. 2006,
Ali et al. 2008). Sin embargo, hasta el momento ningn insecticida basado en microorganismos
ha alcanzado la fase comercial de manera exitosa. Como se seal anteriormente, una importante
ventaja de los agentes microbianos sobre los plaguicidas qumicos es su especificidad frente al
organismo diana, ya que su modo de accin est basado en interacciones ecolgicas patgeno-
hospedador preexistentes, y por lo tanto especificas. Otra ventaja importante, desde el punto de
vista prctico, es que los insecticidas basados en microorganismos pueden ser aplicados a travs
de mtodos convencionales como la difusin por espray.

Dentro de los microorganismos entomopatgenos, varias cepas de hongos como Beauveria
bassiana y Metarhizium anisopliae (Dimbi et al. 2003, Ekesi et al. 2003, Quesada-Moraga et al.
2006), as como metabolitos excretados por especies como Mucor hiemalis (Konstantopoulou et
al. 2006) ha demostrado tener actividad entomopatgena frente a larvas, pupas o adultos de la
INTRODUCCI N | 23
mosca de la fruta del Mediterrneo. La potencialidad de xito de estos agentes microbianos se
basa en su efecto directo sobre los tres estadios de desarrollo de C. capitata anteriormente
sealados, al ser aplicados mediante pulverizaciones de conidias (Mochi et al. 2006), o mediante
trampas selectivas atrayente-contaminante, estrategia que ha sido ensayada en condiciones de
campo.

Uno de los factores asociados a la utilizacin de hongos entomopatgenos, y que podra
representar una ventaja, es la posibilidad de su transmisin horizontal o auto-diseminacin desde
adultos contaminados a otros individuos sanos, lo que significara una expansin rpida de la
enfermedad en poblaciones silvestres (Quesada-Moraga et al. 2006). Esta caracterstica podra
convertir a las estrategias de control basadas en hongos como viables para ser integradas con
liberaciones de machos estriles; de esta manera, individuos machos estriles y contaminados
serviran de vectores de transmisin del hongo en poblaciones silvestres de la mosca de la fruta
del Mediterrneo; sin embargo, hasta el momento esta posibilidad ha sido ensayada en
laboratorio y semi-campo (Toledo et al. 2007), sin haber sido aplicada an en condiciones de
campo. Adems del efecto directo de las cepas de hongos entomopatgenos, se han reportado
efectos subletales que podran cambiar la dinmica poblacional de C. capitata (Quesada-Moraga
et al. 2006).

Por otro lado, las bacterias entomopatgenas han probado ser eficaces para regular poblaciones
de insectos, causando reducciones significativas de plagas (Kaya and Lacey 2000). Al parecer, el
nico acercamiento al control biolgico de C. capitata mediante el uso de bacterias
entomopatgenas ha sido el aislamiento de Enterobacter cloacae y Serratia marcesens de
individuos de la mosca de la fruta del mediterrneo; estas bacterias inducen mortalidad en su
hospedador inicial slo si es usada en concentraciones mucho ms altas que las naturales
(Campos et al. 2007). Adems, a pesar del rastreo llevado a cabo por Vidal-Quist et al. (2009),
cuyo estudio tuvo como objetivo encontrar una cepa de Bacillus thuringiensis con actividad
insecticida en contra de la mosca de la fruta del Mediterrneo, hasta el momento no se ha
reportado otra especie de bacteria patgena para C. capitata que pueda ser usada en el control de
sus poblaciones.

24 |
Recientemente, y durante la elaboracin de este trabajo de investigacin, se ha descrito una
protena toxica para larvas neonatas de C. capitata, la protena Cyt1Aa, obtenida a partir de una
cepa de B. thuringiensis israelensis. Esta protena es txica slo si ha sido previamente
solubilizada, y activada, mediante la incubacin con extractos intestinales de Culex pipiens
(Vidal-Quist et al. 2009). Esto representa la primera evidencia de actividad insecticida de una
toxina de B. thuringiensis activa frente a la mosca de la fruta del Mediterrneo. Sin embargo, sin
la solubilizacin mediada por los extractos de C. pipiens, esta protena no presenta toxicidad,
adems que los porcentajes de individuos que alcanzaron el tercer estadio larvario son menores
al 40%, bajo las condiciones ensayadas.

Hasta el momento, el mejor producto de origen bacteriano para reducir los prdidas econmicas
asociadas a las poblaciones de C. capitata parece ser el insecticida de origen microbiolgico
Spinosad (producido por la fermentacin de la bacteria del suelo Saccharopolyspora spinosa)
(Kaya and Lacey 2000). Por lo anterior, y por la variedad de cepas bacterianas entomopatgenas
descritas para otras especies de plagas (lo que le hace un mtodo de control prometedor), es
indispensable la evaluacin de cepas bacterianas aisladas de hbitats especficos de la mosca de
la fruta del Mediterrneo, con el objetivo de encontrar alguna cepa que sea enemigo natural de la
mosca y pueda utilizarse para el control de las poblaciones de C. capitata.

La mayora de mtodos de control biolgico para C. capitata no han sido probados an en
campo, por lo que todava se desconoce si son logstica o tecnolgicamente posibles en una
escala potencialmente grande. Adems, existen otros agentes naturales que potencialmente
podran ser usados para controlar a la mosca de la fruta del Mediterrneo (Tabla 1). Finalmente,
los trabajos de Stibick (2004) y USDA (1999) proveen compilaciones bastante completas acerca
de los posibles mtodos para controlar C. capitata









INTRODUCCI N | 25
Tabla 1. Organismos potenciales agentes biolgicos de Ceratitis capitata (USDA 1999)
Nombre Clasificacin taxonmica Etapa de vida
objetivo
Parsito

Steinernema carpocapsae
Steinernematidae:
Rhabditida: Nematoda
Larva, pupa, y
adultos
Parasitoides

Diachasmimorpha tryoni Braconidae: Hymenopetera Larva, pupa
Psyttalia humulis Braconidae: Hymenopetera Larva
Biosteres longicaudatus Braconidae: Hymenopetera Larva, pupa
Testrastichus giffardianus Eulophidae: Hymenoptera Larva

Patgenos

Picornavirus (V) Pircanoviridae Adultos
Reovirus (I) Reoviridae Adultos
Depredadores

Iridomyrmex humilis Formicidae: Hymenoptera Larva
Solenopsis geminata Formicidae: Hymenoptera Larva
Pheidole magacephala Formicidae: Hymenoptera Larva
Zygoptera Odonata: Insecta Adultos
Mantis religiosa Mantidae: Mantodea Adultos
Staphylinidae Coleoptera: Insecta Larva


1.2 BACTERIAS PATGENAS DE INSECTOS
Con ms de un milln de especies descritas, los insectos son el grupo ms diverso de animales en
la tierra (Romoser and Stoffolano 1994). Debido a esta alta diversidad y debido al largo tiempo
transcurrido desde su aparicin en la tierra, muchos parsitos se han adaptado especficamente a
los insectos como hospedadores o como fuente de alimento (Bode 2009). As, estos parsitos o
patgenos han desarrollado toxinas, principalmente proteicas, que actan especficamente frente
a insectos (de Maagd et al. 2003).

Relativamente pocas especies de bacterias han sido reportadas como patgenas de insectos, pero
han recibido una gran cantidad de atencin debido a su potencial para el control de plagas en
agricultura y para el control de vectores de enfermedades (van Emden and Service 2004).
Numerosas especies de bacterias son oportunistas, y puede matar insectos fcilmente si logran
entrar en el cuerpo y alcanzar el hemocele travs de una herida en el exoesqueleto. Sin embargo,
las bacterias que han evolucionado para aprovecharse de los nutrientes del cuerpo del insecto,
usualmente deben ser ingeridas por los hospedadores para entrar en el cuerpo a travs del
26 |
intestino. Una vez dentro del intestino, muchas bacterias no son capaces de entrar en el hemocele
directamente, aunque algunos patgenos muy virulentos han desarrollado formas de crear
aberturas en las paredes del intestino y matar al hospedador rpidamente (Priest 2000, Hajek
2004). Los cuerpos de los insectos infectados con bacterias patgenas pueden cambiar de color,
de blanco a rojo, mbar, negro o marrn; adems, estos cuerpos pueden ser un excelente medio
de crecimiento para bacterias saprfitas.

Algunos miembros de la familia Enterobacteriaceae son reconocidos como especies muy
patgenas para insectos (Priest 2000), como es el caso de Serratia entomophila, encontrada
durante investigaciones de muertes del escarabajo de pastizal en Nueva Zelanda. Esta especie es
la bacteria no esporulante que provoca mayor mortalidad, y mata bloqueando los intestinos de su
hospedador (Jackson et al. 1992). Otras especies de Enterobacteriaceae con actividad
entomopatogena incluyen a Photorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophilus (Forst and
Nealson 1996, Forst et al. 1997), y Yersinia enterocolitica (Bresolin et al. 2006) ente otras.
Otras especies bacterianas no incluidas dentro de la familia Enterobacteriaceae tambin poseen
actividad patgena para insectos, algunas de ellas son: Pseudomonas entomophila (Grimont et al.
1988), Erwinia carotovora (Basset et al. 2000), Dickeya dadantii (Grenier et al. 2006).

Sin embargo, las bacterias ms usadas para control biolgico son formadoras de esporas de la
familia Bacillaceae, en especial algunas especies del gnero Bacillus (Priest 2000, Hajek 2004).
La mortalidad causada por especies de bacterias esporulantes difiere significativamente, desde
hospedadores que mueren en cuestin de das a otros que mueren al cabo de meses.
ltimamente, el mayor inters por las bacterias entomopatgenas pertenecientes al gnero
Bacillus se ha dirigido hacia su produccin masiva, por su aptitud para ser tratados
industrialmente, y a su aplicacin en el campo como insecticidas microbiolgicos (van Emden
and Service 2004). Solamente cuatro especies de bacterias han sido producidas en masa y se
encuentran ampliamente comercializadas (Tabla 2); sin embargo, B. thuringiensis es la especie
ms usada en programas a gran escala, como agente de control biolgico.




INTRODUCCI N | 27

Tabla 2. Especies de bacterias producidas en masa para el control de artrpodos (Hajek 2004)
Especie Hospedadores
diana
Modo de accin Velocidad
para matar
Produccin en
masa in vitro
Bacillus popilliae larvas de
escarabajos
enfermedad
infecciosa
lento -
Bacillus sphaericus Larvas de mosquitos
(Culex y Anopheles)
toxina binaria en
cuerpo
paraesporal
rpido +
Bacillus thuringiensis orugas, escarabajos,
larvas de moscas
toxina en cuerpo
paraesporal
rpido +
Serratia entomophila larvas de
escarabajos
bloqueo del
intestino
lento +


1.2.1 El gnero Bacillus
Este gnero de bacterias descrito en 1872 por Ferdinand Cohn, un contemporneo de Robert
Koch, se encuentra dentro de la familia Bacillaceae (orden Bacillales: Divisin Firmicutes)
(Harwood 1989), e incluye 51 especies vlidas (Priest et al. 1988, Priest 1989, Pettersson et al.
1999). Son bacterias Gram-positivas que poseen una morfologa alargada simulando un bastn,
son ubicuas en la naturaleza (se encuentran en suelo, agua, polvo, etc.), pueden ser aerobias
estrictas o anaerobias facultativas; incluyen tanto especies de vida libre como especies
patgenas, y varias especies son parte natural de la flora intestinal humana (Todar 2006). La
caracterstica nica de estas bacterias es su habilidad para producir endosporas bajo condiciones
ambientales de estrs (fsicas o qumicas), capacidad que les permite mantenerse inactivas por
largos perodos de tiempo; esta caracterstica defini al gnero durante mucho tiempo, pero no
todas las especies estaban estrechamente relacionadas, y muchas han sido reubicadas en otros
gneros (Pettersson et al. 1999). Las nicas bacterias no incluidas en este gnero, capaces de
producir esporas son las pertenecientes al gnero Clostridium (Todar 2006).

Las tres especies de Bacillus ms importantes econmicamente son B. anthracis, B. cereus y B.
thuringiensis. Las dos primeras poseen relevancia mdica. B. anthracis causa ntrax, y B. cereus
causa intoxicaciones alimentarias e infecciones de rganos en mamferos. B. anthracis es
causante del ntrax o carbunco, enfermedad de animales herbvoros, ovinos y bovinos, equinos,
28 |
porcinos, caprinos y del ser humano, y ha adquirido importancia pblica por ser un agente
potencial de guerra biolgica (Ledermann 2003). La tercera especie, B. thuringiensis, es un
importante patgeno en insectos y usado como enemigo natural para el control de plagas
(Schnepf et al. 1998).

Las bacterias del gnero Bacillus producen toxinas que son diferentes entre especies, y han sido
usadas como caracteres diagnsticos para poder clasificarlas (e.g. B. cereus de B. thuringiensis);
estas toxinas lisan eritrocitos de diferentes especies de animales (hemolisinas), mientras otras
poseen propiedades patgenas para insectos (Turnbull and Kramer 1983, Hoult and Tuxford
1991, Schnepf et al. 1998). La ubicuidad de las especies de Bacillus en la naturaleza, la
formacin y resistencia de sus endoesporas, la produccin de antibiticos, la toxicidad de sus
esporas, y la produccin de cristales proteicos txicos para varios ordenes de insectos hacen a
este gnero importante en medicina, agricultura, bioqumica y en la empresa farmacutica (Todar
2006).

Las bacterias entomopatgenas pertenecientes al gnero Bacillus son agentes naturales de control
biolgico de plagas de insectos y son la base de varios insecticidas biolgicos comerciales. Las
especies del gnero Bacillus patgenas de insectos ms importantes, y por lo tanto
mayoritariamente usadas en control biolgico de plagas de insectos son: B. sphaericus (ahora
Lysinibacillus sphaericus) (Ahmed et al. 2007), B. laterosporus (ahora incluida en el gnero
Brevibacillus) (Shida et al. 1996), Paenibacillus larvae, P. lentimorbis, y P. popilliae (especies
descritas formalmente como Bacillus) que son patgenos invasivos, y B. thuringiensis que forma
un cuerpo paraesporal txico para insectos (Priest 1989, Smirnova et al. 1996, Todar 2006).
Todas ellas muestran un amplio espectro y niveles de actividad correlacionada con la naturaleza
de las toxinas, las cuales muy frecuentemente son producidas durante la esporulacin (Charles
and Nielsen-LeRoux 2000, de Maagd et al. 2003).


1.2.2 Bacillus sphaericus
Bacillus sphaericus es una bacteria esporulante aerobia, ubicua, cosmopolita, con un esporangio
terminal y una espora esfrica, que posee propiedades insecticidas (Baumann et al. 1991,
INTRODUCCI N | 29
Zhiming 2003). Todas las cepas han sido agrupadas en 49 serotipos, basndose en ensayos de
aglutinacin del flagelo. La mayora de las cepas no son entomopatgenas. Solo 9 serotipos (H1,
H2, H3, H5, H6, H9, H25, H26 y H48) presentan toxicidad contra larvas de mosquitos de
diferentes especies. Las cepas txicas producen dos tipos de toxinas. Una es una toxina binaria,
sintetizada durante la esporulacin (Yousten 1984, Zhiming 2003). Una vez terminada la
esporulacin, el cristal se mantiene asociado a la endoespora. Los mayores componentes del
cristal son dos proteinas de 51,4 kDa y 41,9 kDa; ninguna de estas protenas por independiente es
txica frente a insectos, siendo las dos indispensables para la toxicidad (Baumann et al. 1985,
Broadwell et al. 1990, Federici et al. 2003, Zhiming 2003).

Despus de la ingestin del cristal por la larva del mosquito, las protenas de 51,4 kDa y 41,9
kDa son solubilizadas y activadas por las proteasas del intestino medio del insecto diana, dando
como resultado pptidos de 43 kDa y 39 kDa, respectivamente, que son la forma activa de la
toxina (Baumann et al. 1991, Charles and Nielsen-LeRoux 2000). Estas protenas se unen a un
receptor, una -glucosidasa en las microvellosidades del intestino medio (Darboux et al. 2002),
causando la lisis de las clulas del intestino medio despus de la internalizacin (Yousten 1984,
Federici et al. 2003), destruyndolo y causando as la muerte del insecto. Estudios de
microscopia electrnica muestran que las clulas epiteliales del intestino medio es la diana
primaria de B. sphaericus.

B. sphaericus ha sido usado como control biolgico de especies de mosquito vectores de
importantes enfermedades humanas. Se ha demostrado que las cepas altamente txicas pueden
causar una alta mortalidad en Culex spp. (Silvafilha et al. 1995, Lacey 2007), seguido por
Anopheles spp. (Moser et al. 2002), pero presentan una toxicidad baja o nula frente a Aedes spp.
(Zhiming 2003).

Los productos larvicidas basados en B. sphaericus proveen un excelente y efectivo control de
vectores de enfermedades, incluyendo anophelinos vectores de la malaria, y culicinos vectores de
filariasis (Federici et al. 2003, Lacey 2007). Junto con B. thuringiensis israelensis, B. sphaericus
es una de las bacterias usadas predominantemente como tratamientos no qumicos para el control
de larvas de mosquitos en diferentes pases del mundo. Las cepas de B. sphaericus presentan
30 |
varias ventajas frente a cepas de B. thuringiensis israelensis, teniendo una accin larvicida de
larga duracin en ciertos ambientes. En las ltimas dcadas, el uso de B. sphaericus ha mostrado
ser exitoso como larvicida, por lo que es considerado un agente prometedor para el control de
mosquitos, especialmente para Culex spp. (Baumann et al. 1991, Zhiming 2003).

Varios factores biticos y abiticos influencian la actividad larvicida de B. sphaericus, entre
ellos se incluyen la especie de mosquito, su estrategia de alimentacin, la tasa de ingestin, la
edad y la densidad de las larvas, factores relacionados con el hbitat (temperatura, radiacin
solar, profundidad del agua, turbidez, contenido orgnico, presencia de vegetacin, etc.), y
factores de las formulaciones (tipo de formulacin, contenido de toxinas, que tan eficientemente
el material alcanza al insecto diana), condiciones de almacenamiento, factores asociados a la
produccin, maneras de aplicacin y frecuencia de los tratamientos. Debido a su eficacia, y
relativa especificidad, B. sphaericus es ideal como agente de control en programas integrados,
combinndose con otros mtodos de control (Baumann et al. 1991, Charles and Nielsen-LeRoux
2000).


1.2.3 Paenibacillus popilliae
Formalmente descrita como Bacillus popilliae, y luego transferida al gnero Paenibacillus
(Pettersson et al. 1999), es una especie bacteriana esporulante, Gram-positiva, que fue
inicialmente aislada a partir de una larva de escarabajo japons, en la dcada de 1930. Su nombre
refleja el nombre del escarabajo del cual fue aislada, Popillia japonica (Redmond and Potter
1995). La hemolinfa de una larva de escarabajo japons infectada con P. poplliae posee un color
blanco lechoso (Fig. 4), por lo que se le otorg el trmino de enfermedad lechosa (milky
disease) a la patologa causada por esta bacteria (Zhang et al. 1997). A pesar de no estar
ampliamente difundido como otros bioinsecticidas, P. popilliae fue el primer organismo
patgeno de insectos registrado en Estados Unidos como agente de control de plagas (Redmond
and Potter 1995).



INTRODUCCI N | 31




Figura 4. Larva sana de Popilllia japonica (izquierda); larva infectada con Bacillus popilliae (derecha).
Fotografa de Michael Klein, USDA, ARS, Horticultural Insects Research Lab en Wooster. Tomado de:
http://www.nysaes.cornell.edu/ent/biocontrol/pathogens/bacillus_popilliae.html


El adulto de Popillia japonica es una plaga econmicamente muy importante, porque se alimenta
de un amplio rango de cultivos y plantas ornamentales, causando grandes prdidas econmicas.
Es tambin un problema en el estadio larvario, porque los escarabajos adultos depositan sus
huevos en el csped y las larvas destruyen las races (Hajek 2004). El escarabajo japons es el
hospedador exclusivo de la cepa bacteriana de P. popilliae que se comercializa; sin embargo,
otras cepas de P. popilliae (incluida P. lentimorbus, que es considerada una cepa de P. popilliae),
tienen otros escarabajos hospedadores y son especficas frente a diferentes especies dentro de la
familia Scarabaeidae (Romoser and Stoffolano 1994).

Las larvas ingieren las esporas bacterianas cuando se alimentan de las races de las plantas. Se
puede decir que la enfermedad lechosa ocurre en cuatro fases. Primero, un estado de
incubacin en el intestino de las larvas (da 2), cuando pocas clulas bacterianas son encontradas
en la hemolinfa, seguida por una rpida proliferacin de las clulas vegetativas (da 3 a da 5). La
fase tres es caracterizada por la penetracin de las clulas vegetativas en el hemocele, lo que
significa que hay crecimiento bacteriano en la hemolinfa (da 5 a da 10). La fase cuatro es la
esporulacin, terminando con la muerte y desintegracin del cadver, liberando, de esta manera,
las esporas en el suelo (da 14 a da 21) (Harrison et al. 2000). Una vez las bacterias estn
32 |
establecidas en un rea geogrfica, hay una disminucin de adultos de Popillia japonica,
reduciendo de esta manera el dao causado en las plantas (Hajek 2004).

La causa de muerte de los escarabajos infectados con P. popilliae an no es del todo conocida.
La inanicin fisiolgica causada por el crecimiento de las clulas bacterianas en la hemolinfa
parece ser la explicacin ms probable, ya que las reservas de grasa en una larva infectada se
reducen, en comparacin con una larva sana. Sin embargo, al parecer tambin estn involucradas
la produccin de toxinas ya que cultivos bacterianos filtrados son letales al ser inyectados a las
larvas (Zhang et al. 1997). Recientemente, se han encontrado similitudes entre un cristal proteico
obtenido de las esporas de P. popilliae y las toxinas Cry de B. thuringiensis (Zhang et al. 1997,
de Maagd et al. 2003). Esta protena puede estar contribuyendo a la invasin patognica de las
paredes del intestino (de Maagd et al. 2001, de Maagd et al. 2003).

El control biolgico de Popillia. japonica usando P. popilliae podra ser fcil, menos costoso y
ecolgicamente mas sostenible que usar qumicos sintticos. Esta bacteria es muy especfica,
atacando solamente al insecto hospedador y dejando a los insectos beneficiosos sin dao alguno
(Quintiliani and Courvalin 1994).


1.2.4 Bacillus thuringiensis
1.2.4.1 Resea histrica
Bacillus thuringiensis fue descubierto en 1901 por Shigetane Ishiwata en Japn, quin aisl esta
especie a partir de una larva muerta del gusano de la seda (Bombix mori) denominndola
Bacillus soto, y llamando de esta manera soto a la enfermedad identificativa causada por esta
especie (Ishiwata 1901). Su actividad insecticida fue formalmente descrita por el alemn Berliner
en 1911 a partir de larvas muertas de la palomilla de la harina, Ephestia kuhniella; sin embargo,
no fue sino hasta 1915, cuando se describi la existencia de inclusiones paraesporales (Berliner
1915, Bajwa and Kogan 2001, Shelton et al. 2002). Tras los primeros ensayos de campo llevados
a cabo en Hungra y la ex Repblica de Yugoslavia en los aos 20 y 30 respectivamente, B.
thuringiensis hizo su debut en el mercado como insecticida biolgico a finales de la dcada de
INTRODUCCI N | 33
1930. Fue comercializado por primera vez en Francia, bajo el nombre de Sporeine; sin embargo,
su produccin no fue masiva debido al inicio de la Segunda Guerra Mundial (Lord 2005).

Pocos aos despus de su descubrimiento, en la dcada de 1950, ya se encontraba disponible a
nivel comercial, como formulaciones de esporas, y empez a ser utilizada por productores de
hortalizas para eliminar principalmente plagas causadas por larvas de lepidpteros (Schnepf et al.
1998, Bajwa and Kogan 2001). Durante muchos aos se pens que B. thuringiensis era un
patgeno exclusivo de lepidpteros; sin embargo, en 1978 se encontr una subespecie de B.
thuringiensis (israelensis) activa frente a mosquitos, y en 1983 se describi una cepa de B.
thuringiensis denominada tenebrionis activa frente a colepteros (Schnepf et al. 1998). Fue a
partir de entonces que un gran nmero de investigadores en todo el mundo se dedic a realizar
rastreos de cepas de esta especie bacteriana, encontrndose una gran cantidad de cepas con
espectros de accin varios.

B. thuringiensis era simplemente uno ms en el amplio arsenal de insecticidas naturales que eran
usados corrientemente, antes de que el DDT abriera las puertas a la era de los insecticidas
sintticos. No existe evidencia de su uso a gran escala en los primeros 50 aos de conocimiento
de su existencia. Durante unos veinte aos, B. thuringiensis slo interes a los agricultores que
no queran usar insecticidas sintticos; sin embargo, en el ao 2007 se estim que los productos
de B. thuringiensis constituan alrededor de un 80% del mercado de bioinsecticdas, aunque estos
productos slo representaban alrededor del 2% del mercado global de insecticidas (Roh et al.
2007).


1.2.4.2 Biologa y ciclo de vida
B. thuringiensis es una bacteria aerobia estricta, Gram-positiva, flagelada, ubicua, esporulante,
relacionada morfolgica y genticamente con B. cereus y B. anthracis, y ampliamente usada
como plaguicida biolgico para el control de insectos (Schnepf et al. 1998, Crickmore 2005).
Taxonmicamente, se incluye dentro de la clase Bacilli, orden Bacillates y familia Bacillaceae
(Joung and Ct 2001). B. thuringiensis es una bacteria esporulante, pues presenta dos fases
durante su ciclo de vida: la fase vegetativa y la fase esporulante (Schnepf et al. 1998). Es
considerada una bacteria ubicua, pues sus esporas se han aislado de suelo y agua (Meadows et al.
34 |
1992, Schnepf et al. 1998), de larvas de insectos muertos (Karamanlidou et al. 1991, Kaelin et al.
1994), hojas de rboles (Meadows et al. 1992, Snchez and Pea 1995), y telaraas (Schnepf et
al. 1998), aunque es ms frecuente aislarla de productos almacenados, pues las condiciones
ambientales del almacn permiten la persistencia de sus esporas (Meadows et al. 1992, Schnepf
et al. 1998).

A B. thuringiensis se le diferencia de B. cereus y B. anthracis (sus dos especies
filogenticamente ms relacionadas) por la presencia de un cristal proteico con propiedades
insecticidas (Helgason et al. 2000). Las protenas que lo componen se denominan -endotoxinas
y existen principalmente dos tipos: toxinas Cry y toxinas Cyt. Desde su descubrimiento, estos
cristales proteicos insecticidas han recibido considerable atencin, y un gran nmero de
subespecies han sido diferenciadas basndose principalmente en la presencia de estas protenas
(Schnepf et al. 1998).

Las -endotoxinas son protenas formadoras de poros en membranas, activas especficamente
frente a insectos (lepidpteros, colepteros y dpteros), caros, nemtodos, gusanos planos y
protozoarios (Schnepf et al. 1998, Lightwood et al. 2000, Li et al. 2001). Como otras protenas y
pptidos activos de membrana se unen a la superficie de la clula en su forma soluble y activa.
En la membrana sufren de una serie de cambios conformacionales para convertirse en una forma
capaz de insertarse en la membrana. Las -endotoxinas embebidas en la membrana crean poros
que son permeables para iones pequeos y solutos, pero que excluyen macromolculas, as
causan la lisis osmtica de las clulas intestinales de los insectos susceptibles, y
consecuentemente, la muerte del insecto. Esto es el modo general de accin de todas las -
endotoxinas y lo que les confiere su especificidad (Schnepf et al. 1998, Li et al. 2001).

Existe una gran variabilidad dentro de B. thuringiensis, el tamao de su genoma puede variar de
2.4 a 5.7 Mb (Carlson et al. 1994). B. thuringiensis se clasifica de acuerdo a su serotipo H-
flagelar, o sea por las protenas presentes en el flagelo, mtodo desarrollado en la dcada de 1960
(Debarjac and Bonnefoi 1968). Se han identificado 69 serotipos diferentes y 13 grupos sub-
antignicos, en total 82 serovares, que han sido clasificados en subespecies (Lecadet et al. 1999).
Aunque ste es un mtodo slido y fcil de aplicar, presenta limitaciones debido a que clasifica
INTRODUCCI N | 35
las cepas en base a un parmetro muy concreto, que es la composicin proteica de sus flagelos, y
por lo tanto no incide en otros factores que determinan la variabilidad de la especie. Esto puede
resultar en que cepas de un mismo serovar presenten espectros insecticidas muy dismiles, por
ejemplo existen cepas de B. thuringiensis morrisoni que presentan actividad sobre lepidpteros,
colepteros, dpteros, o ninguno de ellos (Roh et al. 2007). Adems, existen ciertas cepas para la
cuales no se puede determinar el serotipo-H, bien porque no poseen flagelos o porque son auto-
aglutinantes (Jensen et al. 1995).

Como se mencion anteriormente, B. thuringiensis tiene dos fases durante su ciclo de vida, la
fase de crecimiento vegetativo y la fase esporulante (Schnepf et al. 1998). Durante la fase
vegetativa, B. thuringiensis se duplica por biparticin (Bravo et al. 1992), a distinta velocidad
dependiendo del medio de cultivo. La evidencia apunta a que la fase de crecimiento vegetativa
slo se presenta en el interior de los insectos que infecta. Cuando consume los nutrientes del
insecto susceptible, esporula y es liberada al medio ambiente donde permanece en forma de
esporas, lo que explica su amplia distribucin (Schnepf et al. 1998, Li et al. 2001).

La fase vegetativa de crecimiento finaliza con el empobrecimiento de nutrientes en el medio que
da paso a la fase estacionaria en la que se forma la endospora y las inclusiones cristalinas
paraesporales caractersticas de la especie; en esta fase la clula es denominada esporangio y est
compuesta por dos compartimentos: la clula madre y la forespora (Agaisse and Lereclus 1995).
Las protenas con caractersticas insecticidas se sintetizan dentro de la clula madre durante el
proceso de esporulacin. La fase de esporulacin consta de siete estadios, y se inicia cuando la
bacteria se encuentra en limitacin de nutrientes, y se cierra con la fase ltica, en la que la
endospora se lisa, liberndose al medio la exospora y los cristales (Schnepf et al. 1998). En el
estadio I se inducen los genes que iniciarn la esporulacin, esto ocurre en ausencia de nutrientes
o en presencia de condiciones adversas para la bacteria; sin embargo, este punto puede ser
reversible si se adicionan nutrientes (Schnepf et al. 1998). A partir del estadio II de esporulacin,
el proceso es irreversible, con la formacin de un septo de divisin asimtrico. En el estadio III,
se inicia la sntesis del cristal insecticida, la cual continuar hasta el final de la esporulacin, en
un complejo proceso mediado por la expresin de los genes cry gracias a sus promotores Bt1 y
Bt2, que actan de manera secuencial en la sntesis del cristal insecticida. En el estadio VII se
36 |
liberan a las esporas y los cristales insecticidas (Brown and Whiteley 1990, Bravo et al. 1992,
Schnepf et al. 1998).

La espora es una forma de vida latente que puede permanecer en el ambiente por largos periodos
de tiempo en ausencia de humedad y nutrientes. Cuando la espora se encuentra de nuevo en un
medio con los nutrientes adecuados germina, para comenzar de nuevo su fase de crecimiento
vegetativo (Brown and Whiteley 1990).


1.2.4.3 Familias de toxinas Cry y Cyt
Las -endotoxinas de B. thuringiensis se clasifican en dos familias: las protenas Cry y las
protenas Cyt. Estas toxinas son los componentes mayoritarios de los cristales paraesporales de
B. thuringiensis, adems son los principales factores insecticidas de esta especie.

Hasta la fecha se han clonado y secuenciado 538 diferentes genes cry y 33 diferentes genes cyt
(Crickmore et al. 2010). La primera clasificacin de las -endotoxinas se bas en la especificidad
de la actividad insecticida (Whiteley and Schnepf 1986). Las -endotoxinas Cry poseen una
masa molecular de 60-70 kDa en su forma activa, y su estructura comprende 3 dominios
globulares. Un prerrequisito para su toxicidad insecticida es la unin a receptores de membrana
(protenas receptoras de membrana), fundamentalmente del tipo Aminopeptidasa N (APN) y
Caderina. Estos receptores se encuentran muy bien caracterizados, sobre todo en lepidpteros (Li
et al. 2001). Las -endotoxinas Cyt poseen una masa molecular de alrededor de 25 kDa en su
forma activa, y tiene un nico dominio. No ha sido identificada an una protena receptora para
estas toxinas. Se insertan rpidamente en membranas conteniendo fosfolpidos con una cadena
de cido graso no saturada en posicin syn-2 (Schnepf et al. 1998, Li et al. 2001).

La principal diferencia entre las endotoxinas Cry y Cyt, es que las endotoxinas Cry usan -
hlices para provocar poros en la membrana, mientras que las endotoxinas Cyt usan lminas
(Li et al. 2001).
La estructura tridimensional de la parte activada de las -endotoxinas Cry consta de tres
dominios de organizacin modular (Fig. 5). El dominio I es un ramillete de 7 -hlices. El
dominio II es un prisma, formado por 3 lminas antiparalelas empaquetadas alrededor de un
INTRODUCCI N | 37
centro hidrfobo. El dominio III est formado por dos lminas plegadas en forma de sndwich
una sobre otra (Schnepf et al. 1998, Li et al. 2001).




Figura 5. Estructura tridimensional de la toxina activada Cry1Aa. La toxina presenta tres dominios estructurales:
dominio I (azul), implicado en la insercin en la membrana y en la formacin del poro; dominio II (verde); y
dominio III (amarillo-rojo) implicado en el reconocimiento del receptor y en el anclaje. Tomado de de Maagd et al.
(2001).


1.2.4.4 Modo de accin de las protenas Cry
El mecanismo de accin de las toxinas Cry es un proceso complejo que se desarrolla en varias
etapas (Fig. 6). De manera resumida, este mecanismo implica al menos, 7 pasos: 1)
solubilizacin del cristal, 2) procesamiento de las protoxinas y activacin, 3) unin al receptor,
4) insercin a la membrana, 5) agregacin, 6) formacin de poro y 7) lisis celular.
Detalladamente, las esporas de la bacteria que poseen la protena con la toxina son colocadas
sobre las hojas de los cultivos que se desean proteger, una vez la larva se alimenta de la planta y
los cristales paraesporales son ingeridos por el insecto diana, se solubilizan gracias al pH alcalino
del intestino del insecto, liberndose as la protoxina (Gringorten et al. 1992). Las protoxinas son
activadas mediante la accin de proteasas presentes en el intestino medio del insecto. Las toxinas
activas se unen por su extremo C-terminal a una caderina en el extremo apical de la membrana
de las clulas epiteliales del intestino (Bravo et al. 2004), lo que desencadena una cascada de
I
II
II
I
38 |
sealizacin dependiente del in Magnesio (Schnepf et al. 1998). A la vez, la unin de la toxina
a la caderina facilita la escisin de 28 residuos del extremo N-terminal de la toxina, y se
establece una forma pre-poro de la toxina con una afinidad incrementada por un receptor
secundario que puede ser aminopeptidasa N o fosfatasa alcalina (Lu et al. 1994). La unin a este
segundo receptor, facilita la formacin del poro en el epitelio del intestino medio, lo cual
provoca un desequilibrio osmtico y la posterior lisis celular (Bravo et al. 2004). La larva pierde
la capacidad de digerir y asimilar nutrientes y muere.
En resumen, los sntomas causados por la ingestin de las toxinas puede resumirse en los
siguientes pasos: 1) cese de la ingesta, 2) parlisis del intestino, 3) excrecin de residuos (vmito
y diarrea), 4) parlisis total, y 6) la muerte. La larva intoxicada por B. thuringiensis presenta un
color negro caracterstico, debido a la necrosis de los tejidos (Bravo et al. 1992, Bajwa and
Kogan 2001).

El mecanismo de accin detallado anteriormente es el modelo que ha sido aceptado por la
comunidad cientfica durante dcadas; sin embargo, Broderick et al. (2006) sugirieron un nuevo
modo de accin, en el cual la toxicidad de B. thuringiensis depende de la presencia de la
comunidad bacteriana indgena del insecto hospedador. La eliminacin de esta microbiota
natural mediante la administracin oral de antibiticos aboli la actividad insecticida de B.
thuringiensis, y el restablecimiento de la comunidad bacteriana natural restableci la capacidad
de matar. Sin embargo, existen varios estudios con otros modelos de insectos que rechazan la
hiptesis de este nuevo modelo de accin propuesto (Johnston and Crickmore 2009, Raymond et
al. 2009).





INTRODUCCI N | 39


Figura 6. Esquema del modo de accin de las protenas Cry de B. thuringiensis.
Realizado por Juan Luis Jurat-Fuentes, Department of Entomology and Plant Pathology, the University of
Tennessee. Tomado de: http://web.utk.edu/~jurat/Btresearchtable.html


1.2.4.5 Ecologa
Despus de casi un siglo desde su descubrimiento, la biologa y ecologa de B. thuringiensis no
ha sido totalmente caracterizada (Jensen et al. 2003, Raymond et al. 2008), e incluso algunos
autores han considerado su ecologa como un enigma (Jensen et al. 2003).
La falta de correlacin entre la abundancia de insectos hospederos y la abundancia de cepas de B.
thuringiensis con actividad entomopatgena, entre otros factores (Martin and Travers 1989) han
creado un rompecabezas que ha permitido la especulacin del papel ecolgico de B.
thuringiensis en la naturaleza. De esta manera, se han sugerido varias hiptesis, entre ellas que B.
thuringiensis es microorganismo de suelo con actividad insecticida secundaria (Martin and
Travers 1989), que B., thuringiensis es parte de la comunidad bacteriana del filoplano y que ha
evolucionado para proveer proteccin simbionte contra el ataque de insectos (Smith and Couche
40 |
1991, Elliot et al. 2000), o que B. thuringiensis puede ser parte de la microbiota comensal del
intestino de algunos insectos sin causarles muerte (Jensen et al. 2003). Con la excepcin de un
estudio que analiz cuantitativamente la hiptesis que sostiene B. thuringiensis puede
reproducirse como organismo comensal (Raymond et al. 2007), todas las hiptesis anteriormente
enunciadas an no han sido ensayadas empricamente. Sin embargo, recientemente, Raymond et
al. (2010) demostraron experimentalmente que B. thuringiensis se comporta en el campo como
un patgeno especialista de insectos, que el hbitat normal de esta especie bacteriana es el suelo,
y que el movimiento entre el suelo (considerado reservorio) y las partes areas de la planta,
donde se encuentran sus hospederos susceptibles es una caracterstica clave de su ecologa (Fig.
7).



Figura 7. Diagrama de las relaciones ecologicas de B. thuringiensis. En el diagrama se muestran los lugares de
donde B. thuringiensis ha sido aislado y donde puede replicarse. Los sitios posibles para su reproduccin incluye el
suelo, la rizosfera, el filoplano, o dentro de insectos (u otros invertebrados) vivos o muertos. Se muestran tanto la
fase vegetativa (rectngulo rojo), como las esporas (valos amarillos). Tomado de Raymond et al. (2010).



INTRODUCCI N | 41

1.2.4.6 Aplicaciones en Control Biolgico
Los insecticidas biolgicos basadas en las toxinas producidas por B. thuringiensis son eficaces en
la proteccin de cultivos frente a plagas de insectos, y en el control de poblaciones de vectores de
enfermedades. La eficacia de estos productos es comparable a la de los insecticidas qumicos
sintticos. Varios han sido los factores que han hecho posible su xito como bioplaguicidas, entre
ellos, que tienen la ventaja de ser mucho ms especficos que los insecticidas qumicos sintticos
de amplio espectro, y adems son considerados agentes de control de insectos ambientalmente
ms respetuosos, incuos para mamferos, otros vertebrados, plantas e inclusive otros insectos
benficos (Schnepf et al. 1998, Siegel 2001). Adems, su produccin es econmicamente
competitiva gracias al desarrollo de sistemas de fermentacin a gran escala.

Desde inicios de la dcada de 1960 hasta la mitad de la dcada de 1990, en Estados Unidos, se
registraron 177 productos basados en B. thuringiensis. En el ao se reportaron ms de 120 tipos
distintos de formulaciones comerciales registradas en ms de 60 pases, principalmente para el
control de lepidpteros, colepteros y dpteros en agricultura, control sanitario y manejo forestal
(Zhou et al. 2005). Todas las caractersticas anteriormente sealadas, hacen de los productos
basados en las toxinas de B. thuringiensis una herramienta muy til, ventajosa y muy aplicable
para el control de plagas y vectores de enfermedades.

El desarrollo de plantas transgnicas productoras de toxinas de B. thuringiensis, descrito por
primera vez en 1987 (Vaeck et al. 1987), signific un punto de inflexin en la aplicacin de las
toxinas de esta bacteria en el control de plagas. La expresin de -endotoxinas in planta
solucion algunos problemas de la aplicabilidad de B. thuringiensis, como su baja persistencia en
el medio ambiente, adems, de permitir expresar las toxinas Cry de manera dirigida en rganos
especficos de la planta. Por ejemplo, se ha logrado expresar la protena Cry2Aa2 en los tejidos
verdes del tabaco transgnico Nicotiana tabacum cv. Xanthi (Zaidi et al. 2005).




42 |
1.2.5 Bacillus pumilus
1.2.5.1 Biologa
Es una bacteria esporulante, aerobia o anaerobia facultativa, Gram-positiva, con bajo contenido
en G y C en su genoma. Es una especie considerada mesfila, aunque tambin existen cepas que
pueden ser termfilas y alcalfilas (Moallic et al. 2006). Hasta el momento se han descrito 395
cepas pertenecientes a esta especie. Morfolgicamente, B. pumilus crece como una colonia lisa
que se vuelve amarilla conforme avanza el tiempo de incubacin. Es una especie mvil (posee
flagelo), -hemolitica en agar sangre, catalasa positiva, tolerante a las sales y susceptible a la
penicilina, y no crece bajo estrictas condiciones anaerbicas (Abram et al. 1970, Tena et al.
2007, Porwal et al. 2009).

B. pumilus posee propiedades txicas, efectos citopticos en clulas Vero, actividad hemoltica,
produce lectinasa, y actividad proteoltica en casena. From et al. (2005) han detectado una
toxina emtica que ha sido relacionada a incidentes de contaminacin de alimentos. Las
infecciones causadas por B. pumilus son excepcionales (Porwal et al. 2009). B. pumilus se
considera una bacteria no patgena, ni para invertebrados ni vertebrados; no obstante, algunas
cepas producen hemolisinas (Ouoba et al. 2004), molculas determinantes de virulencia
bacteriana, lo que hace que se la considere como una especie patgena oportunista.

Se considera como una bacteria ubicua en la naturaleza, ya que ha sido aislada de varios hbitats:
suelo (Priest 1993, Garbeva et al. 2003), plantas y restos vegetales (Cottyn et al. 2001, Thomas
2004, Choudhary and Johri 2008, Asraful Islam et al. 2010), asociada a animales (Shehata et al.
1983, Barbosa et al. 2005, Johnson et al. 2006, Coorevits et al. 2008, Porwal et al. 2009), mar y
sedimentos marinos (Banerjee et al. 2007, Beleneva 2008, Miranda et al. 2008), alimentos
fermentados (Ouoba et al. 2004, From et al. 2007, Meerak et al. 2008), varias superficies
ambientales (Priest 1993, Pirttijarvi et al. 1996, Silva et al. 2006, Porwal et al. 2009), adems de
sitios poco comunes para el aislamiento de microorganismos como es una aeronave espacial
(Nicholson et al. 2000, Venkateswaran et al. 2001, Kempf et al. 2005, Gioia et al. 2007).
Entre las relaciones ecolgicas que mantiene B. pumilus en los diversos hbitats en los que se
encuentra, una de las ms interesantes es la que mantiene con las plantas. Esta especie bacteriana
es frecuentemente encontrada en las races de plantas, a las que provee proteccin previniendo la
INTRODUCCI N | 43
germinacin de las esporas de algunos grupos de hongos como Rhizoctonia y Fusarium
(Anderson 2002).

En general, las esporas de Bacillus son notablemente resistentes a condiciones ambientales
desfavorables, como la escasez de nutrientres, desecacin extrema, radiacin UV, radiacin
gamma, o desinfeccin qumica (Nicholson et al. 2000); sin embargo, es bastante sorprendente la
elevada resistencia de las esporas de B. pumilus en comparacin con otras especies de Bacillus.
Las endoesporas de B. pumilus pueden sobrevivir a tratamientos de calor, y a radioaciones UV
fuertes, pudiendo posteriormente germinar y multiplicarse (Nicholson et al. 2000).
Se conoce el genoma completo de la cepa B. pumilus SAFR-032 (Gioia et al. 2007) (No. de
acceso al GenBank: NC_009848.1), lo cual sin duda representa una potente herramienta para la
caracterizacin molecular de esta bacteria.


1.2.5.2 Aplicaciones en Biotecnologa
B. pumilus posee un amplio rango de actividades, importantes desde un punto de vista
biotecnolgico e industrial.

As, algunas de cepas de B. pumilus tienen actividad fungicida y han sido usadas como agentes
de control biolgico de hongos fitopatgenos (Bottone 2000, Lehman 2001, Reynaldi et al. 2004,
de-Bashan et al. 2010). Esta propiedad ha sido una de las ms explotadas. As, por ejemplo,
Bottone & Peluso (2003) describen un compuesto producido por B. pumilus MSH que inhibe
especies de Mucoraceae y Aspergillus. El compuesto activo aislado inhibe la germinacin de las
esporas de estos dos generos de hongos, y evita la elongacin de las hifas, posiblemente
produciendo una lesin en la pared celular. As mismo, Reynaldi et al. (2004) describen la
actividad fungicida de B. pumilus y de otras especies de Bacillus y Paenibacillus contra
Ascosphaera apis, el hongo causante de la enfermedad de la cra yesificada, que causa enormes
perdidas econmicas a los apicultores en todo el mundo.

Una cepa de B. pumilus productora de antibiticos (NRRL No. B-30087), que exhibe
propiedades fungicidas contra ciertos patgenos especficos de plantas (y no contra bacterias),
fue patentado en el 2001 (Lehman 2001). En esta patente se identificaron todas las caractersticas
44 |
de esta cepa, y describen una metodologa capaz de proteger las races y las frutas de varias
especies de cultivos de infecciones fngicas, por la aplicacin de cantidades efectivas de los
metabolitos aislados de los sobrenadantes de cultivos de esta bacteria.

Por otro lado, algunas cepas de B. pumilus han sido reportadas como rizobacterias promotoras de
crecimiento vegetal (Raupach and Kloepper 1998, Yan et al. 2002, Joo et al. 2005, Forchetti et
al. 2007, Adesemoye et al. 2009, Udaya Shankar et al. 2009); mientras otras han sido usadas
como probiticos (Green et al. 1999, Caldini et al. 2002, Duc le et al. 2004, Sun et al. 2010).
Adems, B. pumilus produce una gran cantidad de enzimas de inters industrial, como proteasas
(Nagamori et al. 1990, Feng et al. 2001, Huang et al. 2003, Pan et al. 2004, Wang et al. 2007,
Kumar et al. 2008), lipasas (Rasool et al. 2005), y enzimas degradadoras de glcidos (Ahmadian
et al. 2007, Kapoor and Kuhad 2007, Ariffin et al. 2008). Algunas cepas de B. pumilus han sido
descritas como degradadoras de compuestos xenobioticos (Calvo et al. 2004, Hayase et al. 2004,
Toledo et al. 2006, Hua et al. 2007).

Otra de las importantes propiedades de B. pumilus, que la hace atractiva econmicamente, es la
produccin de nuevos, como es el caso de la pumilina (Bhate 1955), la pumilacidina (Naruse et
al. 1990) y la pumicilina (Aunpad and Na-Bangchang 2007).
Las aplicaciones biotecnolgicas detalladas aqu constituyen solamente un ejemplo de la
capacidad de B. pumilus para ser explotada industrialmente. Existen publicados cientos de
trabajos llevados a cabo con el fin de conocer, caracterizar u optimizar algunas de las
propiedades biolgicas de esta bacteria.


1.2.5.3 Aplicaciones en Control Biolgico
A pesar de la diversidad de actividades biolgicas tiles de B. pumilus, esta especie bacteriana no
ha sido considerada como un agente de control biolgico de plagas de insectos. Las aplicaciones
de B. pumilus en control biolgico se han orientado extensamente al uso de bioplaguicidas
basados en esta bacteria para la prevencin y tratamiento de enfermedades causadas por hongos
fitopatgenos en races de varias especies de cultivos, como se seal anteriormente. Esto se
debe a que B. pumilus, tradicionalmente, no ha sido considerada como una especie con
INTRODUCCI N | 45
propiedades entomopatgenas, como B. thuringiensis, B. sphaericus, Paenibacillus popilliae,
entre otras.

Solamente existen dos trabajos previos que reportan la actividad entomopatgena de B. pumilus.
El primero de ellos es una patente donde se describe la cepa B. pumilus AQ717, activa contra el
gusano de las races del maz (e.g., Diabrotica undecimpunctata, D. longicornis, D. virgifera),
la rosquilla verde o gusano de la remolacha (armyworm) (Spodoptera exigua) y algunas especies
de nematodos (Heins 1999).
Esta cepa de B. pumilus es productora de metabolitos txicos, que estn presentes en el
sobrenadante del cultivo. Estos metabolitos son los que hacen a esta cepa til como agente de
control biolgico en el tratamiento y prevencin de las infestaciones del gusano de las races del
maz y del gusano de la remolacha. En detalle la patente describe un metabolito txico y soluble
de bajo peso molecular (<10 kDa) producido por esta nueva cepa de B. pumilus. Tambin
incluye varios mtodos para proteger y tratar a las plantas contra las especies de plagas
anteriormente mencionadas, y una gua de recomendaciones de cmo combinar con otros
bioplaguicidas y plaguicidas qumicos (Heins 1999).

Adems, recientemente, B. pumilus fue aislado del escarabajo de la corteza del abeto
Dendroctonus micans (Coleoptera: Curculionidae, Scolytinae) (Yaman et al. 2010). Este insecto
constituye una importante plaga debido a que los adultos y las larvas causan serios dao al
alimentarse de la corteza de los rboles de abeto. En el estudio llevado a cabo por Yaman et al.
(2010) se realizaron ensayos de infeccin usando la cepa de B. pumilus aislada previamente,
tanto en larvas como en adultos de D. micans. Los resultados mostraron que esta cepa bacteriana
caus 69,4% y 40,9% de mortalidad en larvas y adultos, respectivamente. Sin embargo, es
importante sealar que la metodologa utilizada para la identificacin de la cepa de B. pumilus
objeto de estudio, se bas en anlisis bioqumicos, y no mediante la comparacin de secuencias
parciales del gen 16S rRNA, mtodo considerado ms consistente y confiable.

A pesar del escaso nmero de publicaciones, las propiedades insecticidas de B. pumilus se estn
poniendo de manifiesto con el transcurrir del tiempo. Se podra deducir que debido a la gran
cantidad de metabolitos (e.g., protenas y proteasas) excretados por las cepas de B. pumilus, a lo
46 |
largo de su ciclo de vida, algunas de estas molculas podran poseer actividad patgena para
especies de insectos, como los dos estudios mencionados anteriormente. As, se podra
considerar que la exploracin de la entomopatogenicidad de B. pumilus en diferentes especies de
insectos de importancia econmica, resultara la consideracin de esta bacteria como un fuerte
candidato de agente de control biolgico frente a plagas de insectos.


























2
2. . O O B B J J E E C C T T I I V V E E S S










OBJ ECTI VES | 49
The control of Ceratits capitata populations is a very serious problem, and apart from chemical
treatments, there is no efficient, environmentally friendly and cost effective method or strategy
for controlling the Mediterranean fruit fly. Species belonging to Bacillus genus containing
insecticidal toxins could represent a good alternative for the control of C. capitata. The
availability of a biological agent belonging to this genus could solve many of the toxicological,
environmental and resistance problems caused by chemical insecticides in controlling C. capitata
populations.
Based on this, and on the background detailed in the Introduction, the major objective of this
work was:

To search for novel bacteria belonging to the genus Bacillus, with insecticidal activity
against the Mediterranean fruit fly, C. capitata

This general objective can be broken down to six specific objectives that together achieved the
overall objective of this PhD thesis as follows:

1. To isolate bacteria belonging to the genus Bacillus, from environmental samples
collected at agricultural areas where C. capitata is well established.
2. To evaluate the insecticidal activity of the isolated bacterial strains against adults and
larvae of C. capitata, and to select and identify a novel Bacillus strain toxic to this insect
species.
3. To characterize the pathogenicity of B. pumilus 15.1, a newly isolated bacterial strain,
against different developmental stages of C. capitata.
4. To approach the nature of the virulence factor(s) of B. pumilus 15.1, as well as to
preliminary characterize some of the most important biological characteristics of this
bacterial strain.
5. To establish the relationships of B. pumilus 15.1 with closely related bacterial strains.
6. To analyze the effect of the presence of B. pumilus 15.1 on the natural bacterial
community in the gut of C. capitata larvae.



















































3
3. . M MA AT TE ER RI IA AL LE ES S Y Y M M T TO OD DO OS S













MATERI ALES Y MTODOS | 53

3.1 MANTENIMIENTO DE LA COLONIA DE CERATI TIS CAPI TATA
La colonia de mosca de la fruta del Mediterrneo utilizada en este trabajo de investigacin fue
establecida a partir de una colonia mantenida por el Centro de Ecologa Qumica Agrcola
(CEQA) de la Universidad Politcnica de Valencia.

En general, para el mantenimiento de la colonia de C. capitata se siguieron recomendaciones de
Chapman et al. (1998), Jaldo et al. (2001) y Gonzlez et al. (2003). Los adultos se mantuvieron
en una habitacin insectario en cajas de metacrilato (40 x 30 x 28 cm) (Fig. 8), bajo un
fotoperodo de 16 horas de luz y 8 de oscuridad, con una humedad relativa de 50 5% y
temperatura promedio de 25 2C. Las moscas adultas fueron alimentadas con dieta artificial
compuesta por autolisado de levadura y sacarosa, en una relacin de 1:4 (p/p), y fueron provistas
de agua a travs de una esponja amarilla hmeda (Fig. 8). Los huevos depositados a travs de
una tela fina (que simula la piel de las frutas) colocada en la pared frontal de la caja (Fig. 8), se
recogieron en contenedores de plstico con H
2
O destilada por un tiempo mximo de 24 horas. La
dieta artificial para larvas contuvo 200 g de salvado de trigo, 50 g de sacarosa, 25 g de levadura
de cerveza, 2 g de Nipagin (Metil 4-hidroxibenzoato, Sigma), 2 g de Nipasol (Propil 4-
hidroxibenzoato, Sigma), 7,5 ml de HCl 37% y 500 ml de H
2
O destilada. Esta cantidad de dieta
fue suficiente para alimentar las larvas procedentes de 0,5 ml de huevos de C. capitata. La
manipulacin de los huevos fue mnima.

Las larvas se desarrollaron en condiciones de densidad relajada. Aproximadamente entre 7 y 10
das despus de haber recogido los huevos, cuando las larvas alcanzaron el tercer estadio larvario
(6 a 8 mm de longitud) fueron transferidas a cajas de pupacin, cuyo suelo estaba cubierto con
aproximadamente 4 cm de arena tamizada y esterilizada, para permitir que las larvas saltaran del
medio donde crecieron, ingresaran en la arena y puparan. Despus de 7 a 10 das en la caja de
pupacin, y antes de que emergieran los adultos, las pupas fueron recogidas en un tamiz, y
colocadas en placas Petri, dentro de una nueva caja de cra para adultos, conteniendo dieta
artificial y agua destilada, si eran para continuar con la cra de la colonia, o en cajas de caza, sin
alimento y sin agua (a menos que se indique lo contrario), si los adultos se iban a utilizar en
54 |
bioensayos. El desarrollo del ciclo de vida desde huevo a adulto, bajo las condiciones
anteriormente descritas fue de aproximadamente 21 das.



Figura 8. Caja de cra donde se mantuvo la colonia de Ceratitis capitata


3.2 AISLAMIENTO Y SELECCIN DE CEPAS BACTERIANAS
3.2.1 Recoleccin de muestras de campo
Se recogieron 37 muestras de campo de distinta naturaleza tales como tierra de cultivo, frutas
frescas y en descomposicin, agua de acequia, polvo de carretera, insectos muertos, hojas de
plantas, restos vegetales, lodo seco, arena de playa, agua de mar, moluscos del suelo, cenizas,
etc. de zonas de cultivo. Tambin se obtuvieron frutas de un centro de comercializacin, que
presentaban orificios de ovoposicin de C. capitata. Las muestras se almacenaron en bolsas de
plstico hermticas previamente rotuladas, se llevaron al laboratorio y se almacenaron a 4C
hasta su procesamiento.


3.2.1.1 rea de recoleccin
Las muestras de campo se recogieron de varias zonas de un ecosistema agrcola alrededor de la
localidad de Almuecar (altitud: 25 m., 3644N, 0341O), en la Costa Tropical, provincia de
Granada, Espaa. Esta rea alberga una poblacin bien establecida de mosca de la fruta del
Mediterrneo en todas las estaciones, y es considerada la plaga de mayor importancia econmica
MATERI ALES Y MTODOS | 55
para la agricultura local. Las muestras fueron recogidas principalmente en los alrededores de
cultivos de frutales. La recoleccin de las muestras se realiz durante el mes de Abril del ao
2006.


3.2.2 Aislamiento y seleccin de cepas de Bacillus a partir de muestras de campo
Para el aislamiento de cepas de Bacillus spp. se sigui la metodologa propuesta por Travers et
al. (1987) con modificaciones menores. Este mtodo de seleccin se basa en que la germinacin
de las esporas de Bacillus thuringiensis es inhibida selectivamente por acetato de sodio
(CH
3
COONa), mientras que el resto de cepas bacterianas formadoras de esporas germinan en
medio rico en presencia de esta sal. Las cepas germinadas y las cepas no esporulantes son
eliminadas por un tratamiento de calor. Posteriormente, las esporas que han sobrevivido al
tratamiento de calor son seleccionadas en placas Petri con medio LB. Mediante este mtodo, del
20 al 96% de las colonias seleccionadas al azar son cepas formadoras de cristales pertenecientes
al gnero Bacillus, siendo la mayora pertenecientes a los gneros B. thuringiensis y B.
sphaericus (Travers et al. 1987).

Para el aislamiento de cepas de Bacillus spp. a partir de las muestras recolectadas en el campo, se
sigui el siguiente procedimiento: se colocaron 0,5 g de muestra en un matraz de 250 ml
conteniendo 10 ml de LB con 0,25 M de acetato sdico. La suspensin se mantuvo 4 horas en
agitacin a 250 rpm y 30C de temperatura para permitir la germinacin de todas las bacterias
esporulantes, excepto B. thuringiensis. En lugar de utilizar el dispositivo de pasteurizacin de
flujo (flowthrough pasterurisation device) usado por Travers et al. (1987), un mililitro de
suspensin se coloc en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se calent a 80C en un bao de agua
durante 10 min. De esta manera todas las bacterias no esporulantes y las clulas vegetativas
resultantes de la germinacin de bacterias esporulantes fueron eliminadas mediante tratamiento
con calor. Posteriormente, 100 l de la muestra tratada con calor, y 100 l de la muestra original,
se sembraron en placas de LB. Dichas placas fueron incubadas 12-24 horas a 30C.

Se realiz una primera seleccin visual eligiendo aquellas colonias que presentaron similitud
morfolgica con bacterias pertenecientes al gnero Bacillus. Una colonia aislada de cada una de
las cepas obtenidas se sembr por agotamiento en una placa fresca de LB con objeto de obtener
56 |
cultivos puros. A continuacin, una colonia de cada cepa seleccionada se utiliz para inocular 3
ml de medio de esporulacin T3 que se incub a 30C y 240 rpm durante 72 horas.


3.2.3 Aislamiento de cepas bacterianas a partir de larvas muertas de C. capitata
El aislamiento de bacterias del interior del cuerpo de 9 larvas muertas de C. capitata,
encontradas en nsperos (Prunus salicina) y chirimoyas (Annona cherimolla) recogidas en las
zonas de cultivo de Almuecar anteriormente descritas se realiz tal y como se detalla a
continuacin: en primer lugar, cada larva se esteriliz superficialmente sumergindola 5 min en 1
ml de etanol al 70%. Este proceso se repiti 3 veces con soluciones nuevas de etanol.
Posteriormente, cada larva se lav 3 veces durante 1 min utilizando 1 ml de H
2
O destilada estril
con objeto de eliminar el etanol. Cada larva se macer en condiciones estriles, usando
homogeneizadores de polipropileno (Sigma-Aldrich No. Cat. Z359947). El producto de la
maceracin se resuspendi en 1 ml de LB, se realizaron diluciones seriadas de la suspensin
original en medio M8 se sembraron en placas de LB. Las placas fueron incubadas a 30C durante
24 horas.


3.3 MEDIOS DE CULTIVO
Los medios utilizados para el cultivo de bacterias se describen a continuacin. Los medios
fueron esterilizados en autoclave por calor hmedo a 121C y una atmsfera de presin, antes de
su utilizacin.


3.3.1 Medio rico
Por su riqueza nutritiva, como medio habitual de crecimiento de las cepas bacterianas se utiliz
el medio LB, Luria-Bertani (Maniatis et al. 1982), cuya composicin fue: Triptona, 20 g;
Extracto de Levadura, 5 g; NaCl, 5 g; Agar, 15 g (si se requiere medio slido); H
2
O hasta 1 litro.


3.3.2 Medio de esporulacin
El medio habitual de esporulacin utilizado fue el medio T3 (Travers et al. 1987). La
composicin de este medio fue la siguiente: Triptona, 3 g; Triptosa, 2 g; Extracto de Levadura,
MATERI ALES Y MTODOS | 57
1,5 g; Fsfato sdico 0,5 M (pH 6,8), 100 ml; MnCl 5 g/l, 1 ml; Agar 15 g (si se requiere medio
slido); H
2
O hasta 1 litro.


3.3.3 Medio de suspensin bacteriana
El medio M8, un derivado del medio M9 (Maniatis et al. 1982) fue utilizado para resuspender
clulas y realizar diluciones seriadas. Su composicin fue la siguiente: Na
2
HPO
4
x 7H
2
O, 7 g;
KH
2
PO
4
, 3 g; NaCl, 0.5 g, H
2
O hasta 1 litro.


3.4 CONDICIONES DE CULTIVO
A menos que se indique lo contrario, las cepas de Bacillus fueron cultivadas aerbicamente a
30C en medio LB o en medio T3. La cepa de E. coli XL1Blue/pSVC10-wt (datos no
publicados) se cultiv a 37C. Los cultivos lquidos fueron incubados en un incubador orbital
(Lan Technics) con una agitacin de 240 rpm.


3.5 CONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS
Tanto las cepas aisladas de las muestras de campo, las aisladas de las larvas muertas de C.
capitata, como las provistas por otros laboratorios se conservaron en una solucin de glicerol al
40% (v/v) a -80C. La conservacin de las cepas bacterianas a corto plazo se realiz en cultivos
en placa con medio LB slido a 4C.


3.6 CEPAS BACTERIANAS
Las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo, junto con sus genotipos o caractersticas ms
relevantes se recogen en la Tabla 3.






58 |

Tabla 3. Cepas bacterianas ms relevantes utilizadas en este trabajo.
Especie Cepa Genotipo/Caractersticas Referencia/Fuente
Bacillus pumilus
15.1
Cepa txica frente a larvas de
C. capitata
Este trabajo
Molina et al., 2010
M1
Cepa degradadora de
compuestos aromticos
Uad et al., 2007
M2
Cepa degradadoras de
compuestos aromticos
Uad et al., 2007
Bacillus thuringiensis IPS 78/11 Spo+, Cry- Ward & Ellar, 1983
Escherichia coli XL1Blue/pSVC10-wt
endA1 gyrA96(nal
R
) thi-1
recA1 relA1 lac glnV44
F'[ ::Tn10 proAB
+
lacI
q

(lacZ)M15] hsdR17(r
K
-
m
K
+
)
Tc
r
Proteasa -, Lipasa
conteniendo el psmido
pSVC10-wt, plsmido
derivado del pHY300-PLK con
el gen cry1Ac1 insertado.
Datos no publicados.
Fuente: Susana
Vilchez Tornero,
Universidad de
Cambridge


3.7 ANTIBITICOS
Las soluciones de antibiticos se prepararon 1000 veces concentradas en H
2
O destilada, excepto
la rifampicina, la tetraciclina y el cloramfenicol que se prepararon en etanol absoluto, y el cido
nalidxico que se prepar en cloroformo. Las soluciones preparadas en H
2
O se esterilizaron por
filtracin. Todas las soluciones fueron almacenadas a -20C. Los antibiticos se utilizaron a las
concentraciones finales indicadas en g/ml: rifampicina (Rif), 5; ampicilina (Amp), 10 o 100;
cloramfenicol (Cm), 30; tetraciclina (Tc), 30; penicilina (Pen), 6; streptomicina (Sm), 10;
gentamicina (Gm), 20; kanamicina (Km), 30; y cido nalidxico, 10.


3.7.1 Antibiograma
La sensibilidad de las bacterias a los agentes antimicrobianos se valor in vitro, mediante la
realizacin de un antibiograma con el mtodo de difusin en agar, enfrentando la bacteria
inoculada sobre la superficie de un medio slido con una solucin antibitica absorbida en discos
de papel de filtro. Para ello, se parti de un cultivo 12-16 horas de la bacteria en medio LB
crecido bajo las condiciones estndar. Se colocaron 100 l del cultivo en el centro de la placa
MATERI ALES Y MTODOS | 59
Petri con LB y se distribuy homogneamente con una varilla de vidrio por toda la placa.
Posteriormente, se depositaron discos de papel de filtro de 5 mm de dimetro en el centro de la
superficie del agar con la ayuda de unas pinzas estriles, para por ltimo depositar 10 l de los
diversos antibiticos sobre los discos de papel. Las placas se incubaron a 30C durante 12-16
horas. La lectura se realiz midiendo el dimetro de los halos de inhibicin que se produjeron
alrededor de los discos, y expresando el resultado en milmetros. Se realizaron al menos dos
repeticiones por cada antibitico, y se tomaron al menos dos medidas de cada halo de inhibicin.


3.8 CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO
Para la realizacin de una curva de crecimiento sincronizada de un organismo esporulante se
inici un preinculo de 3 ml en medio T3 a partir de una colonia aislada de un cultivo en placa
de LB. El preinculo se incub durante 72 horas a 30C y 240 rpm hasta la esporulacin del
cultivo, tras lo cual se calent durante 10 minutos en un bao de agua a 70C, con el propsito de
eliminar todas aquellas clulas que no hubieran completado la esporulacin. Se usaron 500 l de
la suspensin de esporas para inocular 50 ml de LB, y este cultivo se mantuvo durante 72 horas
bajo las condiciones estndar de crecimiento. Peridicamente se determin la turbidez del cultivo
mediante la medida de la absorbancia a 600 nm, DO
600nm
, en un espectrofotmetro Milton Roy
modelo Spectronic 3000.


3.9 BIOENSAYOS CON AISLADOS BACTERIANOS: RASTREO (SCREENING)
Para la evaluacin de la toxicidad de los aislados bacterianos, tanto de los obtenidos a partir de
muestras de campo, como los aislados a partir de larvas muertas de C. capitata, se llevaron a
cabo bioensayos en laboratorio con larvas de primer estadio, y moscas adultas recin
eclosionadas.


3.9.1 Bioensayos con larvas
Los bioensayos con larvas se llevaron a cabo utilizando individuos de primer estadio, de tamao
uniforme, criados durante 72 horas en la dieta artificial anteriormente descrita.
Para estos bioensayos, los aislados bacterianos se inocularon en 3 ml de medio T3, y se
incubaron a 30C y 240 rpm durante 72 horas, hasta la esporulacin completa del cultivo. Cien
60 |
microlitros de cada cultivo se dispensaron en los pocillos de una Microplaca Cellstar

(Greiner
Bio-One), estril de 48 pocillos libre de ADNsas y RNasas (Fig. 9). Una vez colocados los 100
l del cultivo esporulado en cada uno de los pocillos, se aadieron 500 l de la dieta artificial
compuesta por las soluciones A y B, mezcladas inmediatamente antes de su uso. La mezcla A
tena la siguiente composicin: Salvado de trigo, 52 g; Sacarosa, 20 g; Levadura de cerveza, 10
g; HCl 37%, 1,5 ml; y H
2
O destilada, 100 ml; mientras que la mezcla B es una mezcla
homognea de Agar a una concentracin de 1,6 g en 100 ml de H
2
O destilada. Ambas
suspensiones se autoclavaron previamente a su uso.

Mientras se manipul y alicuot, la dieta se la mantuvo en un bao de agua a 50C, para evitar su
solidificacin. Una vez colocada la dieta junto al cultivo en los pocillos de la Microplaca, se us
un palillo estril para homogeneizar la mezcla, y se dejo solidificar a temperatura ambiente. Una
vez la dieta mezclada con el cultivo se solidific, se coloc una larva de primer estadio de C.
capitata sobre la dieta de cada pocillo tomada con la ayuda de un palillo estril. Posteriormente,
la microplaca se sell con plstico transparente tensado, para evitar que las larvas escapasen.
Finalmente, usando un alfiler entomolgico No. 3, se hizo un pequeo agujero sobre cada uno de
los pocillos para proveer a las larvas de suficiente aeracin.

Se utilizaron 24 larvas para la evaluacin de la entomopatogenicidad de cada una de los aislados
bacterianos, y esto se considero una repeticin. Se realizaron al menos dos repeticiones con cada
una de las cepas aisladas. Los bioensayos se mantuvieron en un incubador a 25C durante todo el
experimento; y se revisaron 4, 10 y 15 das despus del inicio del experimento para registrar la
mortalidad de las larvas. En cada grupo de bioensayos, un cultivo de la cepa B. thuringiensis IPS
78/11, negativa para la expresin de las toxinas Cry, un cultivo de E. coli XL1Blue/pSVC10-wt
(datos no publicados) expresando la toxina Cry1Ac1 activa frente lepidpteros, y medio T3 (sin
bacterias) se usaron como controles negativos.


MATERI ALES Y MTODOS | 61

Figura 9. Microplaca Cellstar

(Greiner Bio-One) utilizada en los bioensayos con larvas.

3.9.2 Bioensayos con adultos
Para la evaluacin de la toxicidad de los aislados bacterianos en adultos de C. capitata se usaron
individuos eclosionados en un perodo mximo de 24 horas antes de ser utilizados en el
bioensayo, y que haban estado completamente desprovistos de dieta y agua.

Para esta serie de bioensayos, se inocularon 7 ml de medio T3 con los aislados bacterianos, y se
incubaron a 30C y 240 rpm durante 144 horas, con el objetivo de obtener un cultivo
completamente esporulado. La presencia de esporas se monitoriz mediante un microscopio
ptico de contraste de fase. Todo el volumen del cultivo esporulado se coloc en frascos de
cristal estriles de 12 ml de volumen. Para que el cultivo pudiera ser bebido por las moscas
adultas sin ahogarse, se coloc una bayeta absorbente en la extremo de los frascos de cristal,
como se muestra en la Figura 10.

El bioensayo se llev a cabo en cajas de plstico agujereadas para permitir una aireacin
adecuada. Adems, en cada bioensayo se incluy dieta slida para adultos, preparada como se
describi anteriormente. Por cada aislado bacteriano se utilizaron 10 moscas adultas, 5 machos y
5 hembras, para evitar el posible efecto de atraccin diferencial por sexo. Todo el material usado
62 |
en el bioensayo se autoclav previamente. Al igual que en los bioensayos con larvas, en cada
conjunto de bioensayos, se incluyeron un cultivo de la cepa acristalfera B. thuringiensis IPS
78/11, un cultivo de E. coli XL1Blue/pSVC10-wt, medio T3 y H
2
O destilada.

Los bioensayos se revisaron diariamente durante 20 das para registrar la mortalidad. Se realiz
una repeticin con cada uno de los aislados bacterianos. Los bioensayos se mantuvieron en la
habitacin insectario, bajo las condiciones descritas anteriormente para las cajas de cra de
moscas.



Figura 10. Caja de bioensayo para adultos, utilizada durante el rastreo (screening) de los aislados bacterianos


3.10 BIOENSAYOS ESTNDAR
3.10.1 Bioensayos con larvas de primer estadio
Una vez finalizado el rastreo de los aislados bacterianos, la metodologa para la realizacin de
bioensayos detallada en el apartado 3.9.1 se modific ligeramente, con el objetivo de optimizar
la toxicidad de B. pumilus 15.1 frente a larvas de primer estadio de C. capitata.

MATERI ALES Y MTODOS | 63
Con el fin de acelerar el efecto entomopatgeno de B. pumilus 15.1, los cultivos se concentraron
10 veces mediante liofilizacin; de esta manera el/los factor/es de virulencia sintetizado/s en el
cultivo se concentraron. A menos que se indique lo contrario, los bioensayos con larvas descritos
en este trabajo se llevaron a cabo con cultivos liofilizados y concentrados 10 veces. Todos los
bioensayos se realizaron al menos por duplicado y se utilizaron 48 larvas en cada repeticin. La
mortalidad de las larvas se registr 4 y 10 das despus de haber iniciado el experimento; sin
embargo, los anlisis y grficos de mortalidad se realizaron con la mortalidad registrada a los 10
das.

Los bioensayos se llevaron a cabo con cultivos que fueron sometidos a un tratamiento de bajas
temperaturas, regularmente a 4C. Sin embargo, la incubacin en fro durante 96 horas (a menos
que se indique lo contrario) se realiz en la microplaca de bioensayos, con el cultivo 10x
mezclado con la dieta para larvas, o en los matraces de cultivo antes de ser liofilizados.

Cuando se requiri evaluar la toxicidad de las clulas vegetativas de B. pumilus 15.1, se
utilizaron cultivos de 10 horas en medio LB, incubados bajo las condiciones estndar de
crecimiento, sometidos al tratamiento de temperatura, y concentrados 10 veces por liofilizacin.

Para analizar por separado la toxicidad de las dos fracciones del cultivo, se parti de un cultivo
esporulado, y el sobrenadante y la fraccin sedimento (fraccin donde se encuentran las clulas
bacterianas) se separaron por centrifugacin a 35000 x g durante 20 min y 4C, usando una
centrifuga Beckman modelo J2-21M, y un rotor JA-20. Posteriormente, los sobrenadantes se
filtraron usando filtros de jeringa con membranas de acetato de celulosa con un tamao de poro
de 0,20 m (Sartorius, Goettingen, Germany). Seguidamente, los sobrenadantes se congelaron,
se liofilizaron y se resuspendieron en H
2
O destilada estril en una proporcin 1/10 de su
volumen original, antes de ser usados en los bioensayos. Los sedimentos se resuspendieron en 5
ml de H
2
O destilada estril, concentrndolos 10 veces, y se conservaron a 4C hasta ser usados
en los bioensayos.

Para establecer la relacin del tiempo de exposicin de los cultivos bacterianos a 4C con la
mortalidad causada en larvas de la mosca de la fruta se realizaron bioensayos con cultivos
64 |
esporulados y mantenidos a 4C durante 0, 24, 48, 72, 96 y 168 horas antes de ser liofilizados,
resuspendidos y dispensados en la microplaca de bioensayo de larvas.

Para establecer la relacin de la patogenicidad con respecto a la temperatura de exposicin de los
cultivos bacterianos, se realizaron ensayos de toxicidad con cultivos esporulados mantenidos
durante diferentes periodos de tiempo que oscilaron entre 0 y 168 horas a -20C, 25C y 37C,
antes de ser concentrados y usados en los bioensayo con larvas.

Para establecer el efecto de las proteasas en la toxicidad de la cepa 15.1, 50 ml de cultivos
esporulados, crecidos bajo las condiciones estndar en medio T3 se mantuvieron durante 96
horas a 4C. A continuacin, se aadieron 2 mg/ml de proteasa en cada uno de los matraces
conteniendo el cultivo. Posteriormente, las proteasas se dejaron actuar a 37C durante una hora.
Transcurrido este tiempo, los cultivos se liofilizaron y se utilizaron en los bioensayos.
Se ensay la accin de tres proteasas: tripsina (Sigma-Aldrich), pepsina (Sigma-Aldrich), y
proteasa de B. subtilis (Fluka). Adems se utiliz una lipasa (Sigma) tambin a 2 mg/ml, para
evaluar su posible efecto en la cepa 15.1. Se incluyeron como controles del experimento a un
cultivo de B. pumilus 15.1 el cual tambin se someti al mismo tratamiento al que fueron
sometidos los cultivos con proteasas (1 hora a 37C), y otro cultivo que no se someti a
tratamiento alguno. El efecto que cada proteasa tuvo en la entomopatogenicidad de B. pumilus
15.1 se registr despus de 10 das del inicio del experimento.


3.10.1.1 Clculo de la concentracin letal media (LC
50
)
La dosis letal media (LC
50
) y la dosis necesaria para matar al 90% de la poblacin (LC
90
) se
calcularon a partir de los datos de mortalidad de bioensayos con larvas de primer estadio, usando
6 concentraciones de cultivo comprendidas entre 20x y 0,625x del cultivo original (4,65 x 10
8
a
1,45 x 10
7
cfu/ml). Para esto, se parti de un cultivo esporulado de 250 ml, crecido bajo
condiciones estndar, a 30C y 240 rpm durante 72 horas, y antes de ser liofilizados se
mantuvieron durante 168 horas a -20C. Paralelamente se determin la LC
50
y LC
90
de cultivos
no expuestos a bajas temperaturas, para lo cual se usaron dos dosis: 1x y 10x.

MATERI ALES Y MTODOS | 65
La mortalidad de las larvas se registr 10 das despus del inicio del experimento. Se hicieron al
menos dos repeticiones por cada una de las dosis mencionadas, y se usaron 48 larvas por cada
repeticin. La correccin de Abbott (Abbott 1925) se aplic a todos los datos. Usando la dosis
letal media se realizaron grficos de la mortalidad probit versus el logaritmo de la dosis (Finney
1971), empleando el mtodo de los cuadrados mnimos y las predicciones inversas de los lmites
de confianza (fiducials ranges) al 95%. Para el clculo de la LC
50
, LC
90
y sus lmites de
confianza, los datos de promedio de la mortalidad larvaria fueron sometidos a anlisis Probit,
usando el programa Minitab versin 15.1.30.0.


3.10.2 Bioensayos con larvas de tercer estadio
En los bioensayos con larvas de tercer estadio de C. capitata se parti de cultivos esporulados
bajo las condiciones estndar. A continuacin, los cultivos se mantuvieron durante 96 horas a
4C y se concentraron 5 veces por liofilizacin.
Por otro lado, tierra previamente esterilizada en autoclave y tamizada, se coloc en una caja de
plstico agujereada (para su correcta aeracin), de manera que la tierra cubri una superficie de
65 cm
2
y aproximadamente la mitad de la profundidad de la caja. Diez mililitros de los cultivos
5x se rociaron en la tierra, usando un pulverizador, y se homogeniz la mezcla cultivo-tierra con
un palillo estril.
Finalmente, se colocaron 100 larvas de tercer estadio en cada caja, las cuales se mantuvieron en
la habitacin insectario, hasta que los adultos emergieron. Las larvas utilizadas en este
experimento se incubaron durante la semana previa en la dieta artificial descrita en el apartado
3.1 de Materiales y Mtodos. En este experimento, adems de B. pumilus 15.1, se utilizaron
como controles las cepas B. pumilus M1, B. pumilus M2, y H
2
O destilada estril.
Se registr el nmero de adultos que emergieron en cada uno de los tratamientos, as como el
nmero de machos y hembras por separado. Los adultos recin eclosionados se transfirieron a
cajas de cra, que se mantuvieron en la habitacin insectario, bajo las condiciones de humedad y
temperatura descritas anteriormente. Finalmente, se registr el nmero total de huevos puestos
durante los primeros seis das frtiles de las hembras de cada tratamiento. Estos datos se
sometieron a anlisis de variancia.


66 |
3.10.3 Bioensayo con huevos
Para la realizacin de bioensayos con huevos de C. capitata, cultivos esporulados bajo las
condiciones estndar (240 rpm, 30C y 72 horas) se mantuvieron durante 96 horas a 4C, se
liofilizaron y se concentraron 10 veces mediante resuspensin en H
2
O destilada estril. La dieta
utilizada en este ensayo, la proporcin del cultivo concentrado, as como sus volmenes y
procedimientos para su preparacin, fueron similares a los descritos en el apartado 3.10.1 de
Materiales y Mtodos. Los bioensayos con huevos se llevaron a cabo en Microplacas Cellstar

de 48 pocillos, las mismas que se utilizaron en los bioensayos con larvas. En cada pocillo se
colocaron 10 huevos recogidos la noche previa a la realizacin del bioensayo y se distribuyeron
cuidadosamente con una pipeta sobre la superficie de la mezcla de dieta y cultivo de cada
pocillo.
La eclosin de los huevos se revis diariamente hasta 10 das despus del inicio del experimento.
Los bioensayos con huevos se realizaron con las cepas B. pumilus 15.1, M1 y M2, y se incluy
medio T3 (10x) como control negativo. Cada tratamiento se realiz en una microplaca, y el
experimento se llev a cabo por duplicado.


3.10.4 Bioensayo con pupas
Cultivos de 50 ml en T3, incubados bajo condiciones estndar, se sometieron a un tratamiento de
4C durante 96 horas, y posteriormente se liofilizaron y concentraron 10 veces. Cinco mililitros
de cada cultivo 10x se mezclaron exhaustivamente con 200 g de tierra (previamente esterilizada
y tamizada). El ensayo se llev a cabo en contenedores de plstico agujereados para proveer una
aeracin adecuada. Posteriormente, se colocaron 200 pupas (provenientes de larvas de tercer
estadio que permanecieron 7 das en la caja de pupacin) en cada una de las cajas de bioensayo y
se removi la tierra cuidadosamente para enterrar las pupas, evitando causarles dao. Los
bioensayos se mantuvieron en la habitacin insectario, sin luz, a la espera de que los adultos
emergieran. El experimento se revis diariamente durante 20 das y se registr el nmero de
moscas adultas que emergieron.
El ensayo se realiz con B. pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. pumilus M2 y se incluyeron como
controles negativos H
2
O destilada estril, y tierra sin contaminar. El experimento se llevo a cabo
por duplicado. Los porcentajes de emergencia se sometieron a anlisis de variancia de una va.

MATERI ALES Y MTODOS | 67

3.10.5 Bioensayos con adultos
Los bioensayos de toxicidad frente a adultos de C. capitata se realizaron con alimentacin ad
libitum usando dos metodologas diferentes. En el primer caso, los cultivos esporulados en medio
T3 bajo las condiciones estndar de crecimiento se mantuvieron durante 96 horas a 4C, y se
liofilizaron. El lifilo de cada cultivo (50 ml) se coloc en contenedores de plstico de 3 cm de
dimetro y 1,5 cm de altura, y estos a su vez se colocaron dentro de las cajas de plstico en
donde se llevaron a cabo los bioensayos. Se incluyeron 30 moscas adultas (sin distincin de
sexo) en cada tratamiento. A las moscas se les suministr H
2
O destilada, pero no se les provey
de ninguna fuente de azcar ni de protenas adicional a los lifilos.
El ensayo se realiz con cultivos de B. pumilus 15.1, B. pumilus M1 y B. pumilus M2, y se
incluyeron como controles a un grupo de moscas alimentadas con medio T3 liofilizado, y a otro
grupo alimentadas con dieta slida para adultos. La mortalidad de las moscas adultas se revis y
registr diariamente.

Para la realizacin de los ensayos de toxicidad ad libitum con el segundo procedimiento se
obtuvieron 50 ml de cultivos esporulados en medio T3, los cuales se dividieron en dos alcuotas
de 25 ml. Estas dos alcuotas se liofilizaron por separado y cada una de ellas se mezcl y
homogeniz con 3,5 g dieta slida para adultos (autolisado de levadura y sacarosa), utilizando un
palillo estril. La mezcla del lifilo y la dieta se coloc contenedores de plstico, como los
utilizados en el procedimiento anterior, tras lo cual se cubrieron con Parafilm. Una de las
alcuotas se mantuvo a 4C, a la vez que la otra se almacen a 25C durante 96 horas. Tras el
tiempo de incubacin a diferentes temperaturas, los contenedores se colocaron en cajas de
plstico donde se llevaron a cabo los ensayos de toxicidad. Estos ensayos se realizaron con B.
pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. thuringiensis IPS 78/11, y medio T3 y dieta slida de adultos
como controles. Para cada tratamiento se utilizaron 40 moscas adultas recin eclosionadas (sin
distincin de sexo). A parte de la dieta mezclada con el lifilo, a las moscas utilizadas en el
bioensayo tambin se les suministr H
2
O destilada estril. Las cajas con los bioensayos se
mantuvieron en la habitacin insectario. Se registr la mortalidad de cada uno de los tratamientos
diariamente durante 8 desde el inicio del experimento.


68 |
3.10.6 Bioensayo en fruta
Para la realizacin de este tipo de ensayos, se inocularon 50 ml de medio T3 con las cepas
bacterianas y se incubaron bajo las condiciones estndar de crecimiento hasta su esporulacin. A
continuacin, los cultivos se mantuvieron durante 96 horas a 4C, y se liofilizaron. Por cada
cepa, dos cultivos liofilizados de 50 ml se resuspendieron en 5 ml de H
2
O destilada estril, de
forma que los cultivos se utilizaron 20 veces concentrados.

La fruta utilizada en los bioensayos se lav con detergente (Alconox 1%), con el propsito de
eliminar cualquier residuo de la superficie de la piel de la fruta, y disminuir la hidrofobicidad de
su piel. Posteriormente se realizaron dos lavados con H
2
O destilada para eliminar el detergente.
Los bioensayos se llevaron a cabo en cajas de plstico, previamente agujereadas, para proveer
una aeracin adecuada. Las cajas se lavaron dos veces con H
2
O destilada. A las moscas se les
provey de H
2
O destilada estril y dieta artificial para adultos.

La totalidad de la superficie de la fruta se cubri homogneamente con el cultivo 20x utilizando
un pincel estril. Se coloc una pieza de fruta en cada caja de bioensayo, se utilizaron 5 cajas por
cada cepa bacteriana (tratamiento), y cada caja se consider la repeticin de un tratamiento. De
esta manera, cada bioensayo consisti en 25 cajas de experimentacin, 5 por cada uno de los
tratamientos, incluyendo el control del experimento. En cada caja se colocaron entre 5 y 40
moscas hembras adultas sexualmente maduras, 6 das despus de haber emergido de sus pupas
en una caja de caza; este tiempo fue suficiente para la cpula y fecundacin de las hembras
(Rigamonti 2004), con el propsito de asegurar la ovoposicin. El nmero de hembras dependi
de la especie de fruta. El medio T3, utilizado como control del bioensayo, se someti al mismo
procedimiento que las cepas incluidas en el experimento.

Las cajas se mantuvieron en la habitacin insectario a lo largo de todo el experimento, bajo las
condiciones de temperatura y humedad descritas previamente. Los bioensayos se revisaron
peridicamente, y cuando se consider que haba transcurrido el tiempo suficiente para el
desarrollo de las larvas dentro de la fruta, se revis exhaustivamente el interior de cada una de
ellas, utilizando un escalpelo estril, y registrndose el nmero de larvas por pieza de fruta.
MATERI ALES Y MTODOS | 69
Estos ensayos se realizaron con las cepas B. pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. pumilus M2, B.
thuringiensis IPS 78/11, y medio T3, como control del experimento.
Se ensayaron cuatro especies (y variedades) de frutas:
Mangos (Mangifera indica L., var. lancetilla)
Nectarinas (Prunus persica nucipersica S., var. venus)
Peras (Pyrus communis L., var. limonera)
Naranjas (Citrus sinensis L., var. valencia)


3.10.7 Eliminacin de la comunidad bacteriana del intestino de larvas para bioensayos
Para el anlisis de la comunidad bacteriana de larvas de C. capitata y su papel en la
patogenicidad de B. pumilus 15.1, fue necesaria la obtencin de larvas aspticas. Con este
objetivo, se evalu la eficiencia de esterilizacin de huevos de C. capitata mediante cuatro
procedimientos. Para ello, 0,25 ml de huevos se esterilizaron mediante uno de los siguientes
tratamientos: 1) formaldehido 10% durante 10 min, 2) hipoclorito de sodio 2% durante 5 min, 3)
hipoclorito de sodio 2% durante 3 min, o 4) hipoclorito de sodio 2% durante 30 seg. Para el
clculo de la eficiencia de esterilizacin se usaron como control huevos sin esterilizar. Tras
someter a los huevos a los distintos tratamientos de esterilizacin, se realizaron cinco lavados
con H
2
O destilada estril. Posteriormente, los huevos se sembraron en dieta artificial para el
desarrollo de larvas.

Cuando se quiso probar el efecto de los antibiticos en la dieta de larvas, este procedimiento se
combin con el tratamiento de esterilizacin de hipoclorito de sodio 2% durante 3 min. De esta
manera, para este tipo de ensayos, las larvas crecieron tanto en dieta suplementada con cido
nalidxico (10 g/ml) y ampicilina (100 g/ml), como en dieta libre de antibiticos. La dieta se
esteriliz en autoclave por calor hmedo a 121C y una atmsfera de presin previamente a la
adicin de los antibiticos.

Posteriormente, las larvas provenientes de los huevos esterilizados fueron utilizadas en
bioensayos llevados a cabo bajo la metodologa estndar. Tras siete das del inicio del bioensayo,
se tom un nmero determinado de larvas por cada tratamiento, y se esterilizaron
superficialmente por inmersin en etanol 70% durante varios minutos. Luego, la longitud total
70 |
del tracto intestinal se removi por diseccin bajo un estereoscopio, y se mantuvo en 300 l de
tampn salino estril (PBS). Los intestinos se homogenizaron y se usaron para estimar el total de
bacterias cultivables por tratamiento, mediante mtodos dependientes de cultivo, o como
muestras para posterior extraccin de ADN (mediante el mtodo CTAB) y amplificacin por
PCR. El crecimiento bacteriano se revis despus de 24 horas de incubacin a 30C y se
realizaron al menos ocho rplicas por tratamiento. Todos los morfotipos cultivables aislados se
identificaron basndose en la homologa de la secuencia del gen 16S rRNA.

La composicin de las soluciones empleadas en este procedimiento fue la siguiente:
Tampn salino estril (Phosphate buffered saline, PBS): NaCl, 8 g; KCl, 0,2 g; Na
2
HPO
4
,

1,44
g; KH
2
PO
4
,

0,24 g.; H
2
O hasta 1 litro; el pH de esta solucin se ajust a 7,4.


3.11 ANLISIS ESTADSTICOS
Con los datos de mortalidad registrados durante las repeticiones de bioensayos con larvas, con
cada una de las 115 cepas evaluadas durante el rastreo (screening), se calcul la media,
desviacin estndar y coeficiente de variacin (CV: desviacin estndar/media) de las
repeticiones a 4, 10 y 15 das despus del inicio de los experimentos. Se tom en cuenta que ms
del 1,5 % en el CV se considera un valor elevado, lo que refleja que las repeticiones no son
fiables, y no podran ser consideradas rplicas (Quinn and Keough 2002, Snchez 2002, Sokal
and Rohlf 2003). Se utilizaron 24 larvas (o 24 pocillos de microplaca) por cada tratamiento; se
consideraron los 24 pocillos una repeticin, y se realizaron al menos dos repeticiones por cada
tratamiento. Cada aislado bacteriano se consider un tratamiento.

A menos de que se especifique lo contrario, todos los datos de mortalidad de los bioensayos de
toxicidad llevados a cabo durante esta investigacin se corrigieron usando la formula de Abbott
(Abbott 1925). Cuando fueron sometidos a anlisis de variancia (ANOVA), los datos de
mortalidad corregidos se transformaron previamente al arcoseno de la raz cuadrada para
normalizar su varianza. Cuando fue necesario, las medias de los tratamientos fueron separados
usando la prueba de significacin de Tukey, y los tratamientos se compararon con los controles
MATERI ALES Y MTODOS | 71
usando el test de Dunnett. Estos anlisis fueron llevados a cabo con el programa SPSS
(Statistical Program for Social Sciences) Versin 16.0.


3.12 TECNICAS MOLECULARES
3.12.1 Extraccin de ADN total
3.12.1.1 Mtodo comercial Qiagen
El aislamiento de ADN total se realiz a partir de 1 ml de cultivo bacteriano en LB, incubado
durante 12-14 horas a 240 rpm y 30C. La extraccin se realiz mediante el kit de QIAGEN
ADNeasy

Tissue (No. Cat. 69506) siguiendo el protocolo para bacterias Gram-positivas

detallado en el manual de instrucciones del fabricante. Una vez extrado el ADN se conserv a
4C hasta su uso posterior.


3.12.1.2 Mtodo CTAB
Para la preparacin de ADN total bacteriano a gran escala, as como para su aislamiento a partir
de tejidos de insecto, se utiliz el mtodo CTAB, o de bromuro de cetiltrimetilamonio (Ausubel
et al. 1999). Brevemente, las clulas se cultivaron en agitacin durante 10-14 horas a 30C en
medio LB, tras lo cual se centrifugaron en un tubo Eppendorf de 2 ml a 16.000 x g durante 10
min. Despus de eliminar el sobrenadante, las clulas se resuspendieron en 500 l de solucin de
lisis, cuya composicin se detalla abajo, y se incubaron durante 30-60 min a 37C, y
posteriormente a 55C durante 20 min. A continuacin, los cidos nucleicos se liberaron
adicionando 100 l de NaCl 5M y 80 l de CTAB 10% (p/v) (que contena NaCl 0,7 M)
previamente calentado a 60 C. A continuacin, se agit el tubo suavemente por inversin y se
incubo durante 20 min a 65C. Posteriormente, se aadieron 700 l de una mezcla de cloroformo
y alcohol isoamlico en proporcin (24:1) y se mezcl por inversin durante aproximadamente 2
min hasta la formacin de una emulsin. Tras centrifugar a 16.000 x g durante 10 min, se
transfirieron 600 l del sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf de 1,5 ml. Posteriormente, se
aadieron 360 l de isopropanol, se mezcl por inversin y se incubo a -20C durante 30 min. A
continuacin, se centrifug a 16.000 x g durante 10 min. Tras descartar el sobrenadante, se lav
el sedimento con 250 l de etanol 70% y se realiz otra centrifugacin similar al paso anterior.
El precipitado de ADN se sec a 37C durante 30-60 min y se resuspendi en 100 l de Tris 10
72 |
mM (pH 8,0) si las clulas provenan de un cultivo en LB, o en 10 l de la misma solucin si el
ADN se extrajo a partir de tejidos de insectos. Finalmente, se permiti que el sedimento se
disolviera dejndolo 12-14 horas a 4C, antes de ser usado.

La composicin de las soluciones empleadas en este procedimiento fue la siguiente:
Solucin de lisis: SDS, 0,5% (p/v); proteinasa K, 200 mg/l; lisozima, 0,1 mg/ml; y tampn TE
hasta 10 ml. Esta solucin fue de preparacin extempornea a partir de soluciones concentradas
de SDS al 10% (p/v), de proteinasa K 25 mg/ml, y de lisozima 10 mg/ml en tampn TE.
TE: Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM; y EDTA, 10mM. Esta solucin se esteriliz en autoclave y se
almaceno a 4C.


3.12.1.3 Mtodo para la deteccin de elementos extracromosmicos
Brevemente, cada cepa se cultiv en 3 ml de medio LB durante toda la noche, cultivo que se
diluy en una proporcin 1:50 en 50 ml de LB. Los cultivos se conservaron en agitacin a 30C y
240 rpm hasta una DO
600nm
de 0.5-1.1. Las clulas vegetativas se centrifugaron a 20.200 x g
durante 15 min a 4C. El sedimento se resuspendi en 20 ml de tampn TES previamente fro.
Tras centrifugar las clulas bajo las mismas condiciones, el sedimento se resuspendi en 2 ml de
tampn de lisis y se incubaron a 37C durante 90 min hasta que se observ (mediante
microscopio) la formacin de esferoplastos en ms del 90% de las clulas. A la suspensin de
esferoplastos se le aadieron 3 ml de SDS 8% (p/v) en tampn TES, y se incub a 68C durante
10 min. Seguidamente se aadieron 1,5 ml de acetato sdico 3M (pH 4,8), y la suspensin se
incub a -20C durante 30 min. A continuacin, la suspensin se centrifug a 20.200 x g durante
20 min a 4C. Si el sobrenadante recuperado no se observ completamente transparente, se
realiz una nueva centrifugacin.
Tras recuperar el sobrenadante en un tubo limpio, se aadieron dos volmenes de etanol
absoluto, previamente fro a 4C, tras lo cual la suspensin se incub durante toda la noche a -
20C. El ADN se obtuvo por centrifugacin a 20.200 x g durante 20 min a 4C. El sedimento se
resuspendi en 100 l de Tris-EDTA (pH 8,0) y se conserv a -20C hasta su uso.

La composicin de las soluciones utilizadas en este procedimiento fue la siguiente:
TES: Tris base, 30 mM; EDTA, 5 mM; NaCl, 50 mM; pH 8.0 ajustado con HCl 3M.
MATERI ALES Y MTODOS | 73
Tampn de lisis: sacarosa, 20% (p/v); lisozima, 2 mg/ml; RNasa, 1 l/ml de a partir de una
solucin stock 10 mg/ml; buffer TES.
Tris-EDTA (pH 8,0): Tris-HCl, 10 mM; EDTA, 1 mM.


3.12.2 Cuantificacin de ADN
La concentracin de ADN se determin espectrofotomtricamente en un espectofotmetro
NanoDrop (modelo ND-1000), mediante medida de la absorbancia del ADN (a una dilucin
adecuada) a 260 nm y 280 nm, frente a un blanco con H
2
O miliQ, siguiendo las recomendaciones
de Sambrook et al. (1989). La concentracin de ADN se calcul teniendo en cuenta que una
solucin de ADN bicatenario de 50 g/ml presenta un valor de absorbancia de 1 a 260 nm. La
relacin A
260
/A
280
se utiliz para estimar el grado de pureza de la preparacin. Los valores de
esta relacin por debajo de 1,8 se consideraron indicadores de contaminacin por protenas.


3.12.3 Amplificacin de ADN mediante PCR
La amplificacin del ADN bacteriano se realiz mediante la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR), para lo cual se utilizaron los cebadores (primers) detallados en la Tabla 4. Las
condiciones exactas para cada reaccin dependieron principalmente del propsito de la
amplificacin, de la fuente de ADN molde, de la longitud del fragmento a ser amplificado y la
temperatura de hibridacin (annealing) de los cebadores.


3.12.3.1 Amplificacin del gen codificante para el ARN ribosmico 16S
La amplificacin de gen 16S rRNA que codifica un ARN ribosmico bacteriano se realiz en
dos reacciones distintas de PCR usando los cebadores universales para Eubacterias 533F y
16SB1, y fd1 y rD2. Dichos fragmentos fueron solapantes.
La amplificacin de estos dos fragmentos se llev a cabo en 100 l de reaccin, que contuvo 3,3
l de cada cebador a una concentracin de 20 M, 10 l de una solucin 2 mM de dNTPs, 10 l
de tampn 10x (Dominion-MBL), 8 l de una solucin 25 mM de MgCl
2
(Dominion-MBL), 10
l de ADN molde y 0,5 l de una solucin 5 u/l de Taq polimerasa (Dominion-MBL). La
amplificacin se realiz en un Termociclador TC312 (TECHNE

) bajo las siguientes

condiciones: 1 ciclo de 5 min a 94C, 45 ciclos con 45 seg de desnaturalizacin a 94C, 45 seg de
74 |
annealing a 52C y 45 seg de extensin a 72C, seguido por un ciclo de extensin final de 5 min
a 72C.

Los cebadores GC-338f y 518r se usaron para amplificar parcialmente el gen 16S rRNA y
posteriormente analizar el producto de la amplificacin mediante electroforesis en gel de
gradiente desnaturalizante (DGGE). El cebador GC-338f posee una cola rica GC en el extremo
5, como se detalla en la Tabla 4. La amplificacin se realiz en un Termociclador PTC200 (MJ
Research). La reaccin se llev a cabo en un volumen final de 25 l, que contuvo 2 l de ADN
molde (~100 ng de ADN), 0,25 l de cada cebador a una concentracin de 100 pmol/l, 1 l de
una solucin 10 mM de dNTPs (Promega), 0,5 l de albmina de suero bovino a una
concentracin 10 mg/ml (New England Biolabs), 0,25 l de una solucin 5 u/l de Taq
polimerasa (Qiagen), y 2,5 l de de tampn 10x (Qiagen). Las condiciones de amplificacin
incluyeron temperaturas de desnaturalizacin descendientes, que permiten ciclos adicionales de
amplificacin, a la vez que incrementan la eficacia de la amplificacin de un bajo nmero de
copias del ADN molde. Las condiciones de amplificacin fueron las siguientes: 1 ciclo de 4 min
a 94C, 15 ciclos de 30 seg de desnaturalizacin a 94C, 30 seg de annealing a 55C y 30 seg de
extensin a 72C, 15 ciclos a 93C durante 30 seg, 55C por 30 seg y 72C durante 30 seg,
seguidos de 15 ciclos con 30 seg a 92C, 55C por 30 seg y 72C durante 30 seg; 10 ciclos con
30 seg a 91C, 30 seg a 55C y 30 seg a 72C, y finalmente de 7 min de extensin a 72C.


3.12.3.2 Amplificacin del ADN de genes housekeeping
Para la amplificacin de estas secuencias se siguieron las recomendaciones del sitio web del
MLST de Bacillus cereus (http://pubmlst.org/bcereus/) desarrollado por Keith Jolley (Jolley et
al., 2004) y alojado en el servidor de la Universidad de Oxford (UK).

Para el esquema MLST de las cepas de Bacillus incluidas en este anlisis, se usaron fragmentos
internos que amplificaron parcialmente siete genes housekeeping:
glpF (glycerol uptake facilitator protein)
gmk (guanylate kinase, putative)
ilvD (dihydroxy-acid dehydratase)
pta (phosphate acetyltransferase)
MATERI ALES Y MTODOS | 75
pur (phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide)
pycA (pyruvate carboxylase)
tpi (triosephosphate isomerase)

La amplificacin de estos fragmentos se llev a cabo en microplacas de 96 pocillos, en un
volumen final de 25 l de reaccin, que contuvo 0,25 l de cada cebador a una concentracin de
25 pmol/l, 0,5 l de una solucin 10 mM de dNTPs (Promega), 2,5 l de MgCl
2
15 mM
(Qiagen), 2 l de ADN molde (~100 ng de ADN) y 0,125 l de una solucin 5 u/l de Taq
polimerasa (Qiagen). La amplificacin se realiz en un Termociclador PTC200 (MJ Research).
Las condiciones para la amplificacin fueron las siguientes: 1 ciclo de 4 min a 94C, 10 ciclos de
30 seg de desnaturalizacin a 94C, 30 seg de annealing a 55C y 1 min y 20 seg de extensin a
72C, 15 ciclos a 93C durante 30 seg, 53C por 30 seg y 72C durante 1 min y 20 seg, seguidos
de 25 ciclos con 30 seg a 92C, 53C por 30 seg y 72C durante 1 min y 20 seg, y finalmente un
ciclo de extensin de 5 minutos a 72C
En todas las reacciones se incluyeron controles negativos, que consistieron en reacciones de PCR
sin ADN molde.

Los cebadores utilizados para la amplificacin y secuenciacin de ADN en esta investigacin
doctoral se detallan a continuacin (Tabla 4).












76 |

Tabla 4. Cebadores (primers) usados para la amplificacin de ADN mediante PCR y para la secuenciacin de
fragmentos de ADN
Nombre Secuencia (5 3) Referencia
533F GTCGCAGC(H)GCCGCGGTA Burggraf et al. 1997
16SB1 TACGC(Y)TACCTTGTTACGACTT Douglas et al. 2006
fD1 CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG Weisburg et al. 1991
rD2 GACTACCAGGGTATCTAATCC Coloqhoun 1997
GC-338f
a
CGCCCGCCGCGCCCCCGCCCCGGCCCGCCGCCCCC
GCCCACT CCTACGGGAGGCACG
Raymond et al. 2008
518r ATTACCGCGGCTGCTGG Muyzer et al. 1993
glpF f GCGTTTGTGCTGGTGTAAGT Jolley et al. 2004
glpF r CTGCAATCGGAAGGAAGAAG Jolley et al. 2004
gmk f ATTTAAGTGAGGAAGGGTAGG Jolley et al. 2004
gmk r GCAATGTTCACCAACCACAA Jolley et al. 2004
ilvD f CGGGGCAAACATTAAGAGAA Jolley et al. 2004
ilvD r GGTTCTGGTCGTTTCCATTC Jolley et al. 2004
pta f GCAGAGCGTTTAGCAAAAGAA Jolley et al. 2004
pta r TGCAATGCGAGTTGCTTCTA Jolley et al. 2004
pur f CTGCTGCGAAAAATCACAAA Jolley et al. 2004
pur r CTCACGATTCGCTGCAATAA Jolley et al. 2004
pycA f GCGTTAGGTGGAAACGAAAG Jolley et al. 2004
pycA r CGCGTCCAAGTTTATGGAAT Jolley et al. 2004
tpi f GCCCAGTAGCACTTAGCGAC Jolley et al. 2004
tpi r CCGAAACCGTCAAGAATGAT Jolley et al. 2004
a
El cebador 338f posee una cola rica en GC en el extremo 5 que se muestran en negrita.


3.12.3.3 Amplificacin de ADN a partir de colonia
En este caso se utiliz una variacin del mtodo anteriormente descrito, conocido comnmente
como PCR de colonia. En este mtodo la mezcla de la reaccin fue similar a las descritas
anteriormente, con la excepcin de que el ADN genmico se sustituy por la biomasa procedente
de una colonia recogida directamente de una placa de crecimiento usando un palillo estril. La
mezcla de reaccin se someti a las condiciones requeridas para que diera lugar la amplificacin
del fragmento deseado tras la lisis de las clulas producida por el uso de temperaturas elevadas.
MATERI ALES Y MTODOS | 77


3.12.4 Electroforesis de ADN en gel de agarosa
La separacin y visualizacin de fragmentos de ADN se realiz mediante electroforesis en gel de
agarosa con 0,5 g/ml de bromuro de etidio. Por cada 5 l de muestra a analizar se aadi 1 l
de tampn de carga. La mezcla se deposit en un pocillo del gel de agarosa al 0,8% (p/v) en
tampn TBE, sumergido en una cubeta con el mismo tampn. Cuando el fragmento de ADN era
inferior a 0,5 kb la concentracin de agarosa en el gel fue de 2% (p/v). La separacin se realiz
por electroforesis horizontal sumergida a un voltaje de 5-10 V/cm.
Para la visualizacin del ADN se utiliz un transiluminador con luz UV a 312 nm. El tamao
aproximado de los fragmentos de ADN fue estimado por comparacin visual con un marcador de
peso molecular (MPM) de 100 bp a 2000 bp (Dominion-MBL, No. Cat. MBL023), o de 100 bp a
1500 bp (New England Biolabs, No. Cat. N3231L), incluido en cada electroforesis.
(Coloqhoun 1997)
Cuando la electroforesis en gel de agarosa se realiz con el fin de separar y visualizar el patrn
de plsmidos de cepas bacterianas, las condiciones utilizadas fueron similares a las descritas
anteriormente, con algunas modificaciones. El gel se realiz a una concentracin de 0,8% (p/v)
en tampn TBE. La migracin se llev a cabo a 115 V durante 120-180 min. Se utiliz un
marcador de peso molecular de 250 bp a 12 kb (Stratagene, No. Cat. 201115).

La composicin de los tampones y soluciones empleados en este procedimiento fue la siguiente:
Tampn de carga: bromofenol, 0,05% (p/v); xileno cianol, 0,05% (p/v); glicerol en H
2
O, 6%
(v/v).
Tampn TBE pH 8,0 (5x): tris-base, 54 g/l; acido brico, 27,5 g/l; EDTA, 2,9 g/l. Este tampn
se prepar a partir de una solucin 5 veces concentrada y esterilizada por autoclave.


3.12.5 Purificacin de ADN
3.12.5.1 A partir de una banda en gel de agarosa
Tras la electroforesis, la banda de ADN de inters fue recortada del gel con un escalpelo y
recuperada en un tubo Eppendorf

de 1,5 ml. El ADN contenido en el fragmento de agarosa se

recuper mediante la utilizacin del kit de QIAGEN QIAquick

Gel Extraction (No. Cat.

78 |
28704), siguiendo las instrucciones del fabricante. Este mtodo est basado en la utilizacin de
columnas que presentan un polmero que retiene el ADN, cuando ste se encuentra en
determinadas condiciones salinas y de pH. Tras cada extraccin se comprob el xito de
recuperacin mediante electroforesis en gel de agarosa y cuantificacin espectrofotomtrica.


3.12.5.2 A partir de una reaccin de PCR
Con el fin de separar los fragmentos de ADN obtenidos mediante PCR de los otros productos
presentes en la reaccin (sales, nucletidos, cebadores, etc.), las mezclas de reaccin se
purificaron usando el kit de QIAGEN QIAquick

PCR Purification (No. Cat. 28104) siguiendo

las instrucciones del fabricante, y finalmente eluyendo el ADN en H
2
O miliQ estril. Este kit
est basado en el mismo principio de utilizacin de columnas descrito para el mtodo anterior.
Despus de cada purificacin se verific el xito de recuperacin realizando una electroforesis en
gel de agarosa.


3.12.5.3. A partir de una reaccin de PCR en microplaca
Este mtodo se utiliz para la purificacin de productos de PCR en aquellos casos en los que la
amplificacin se realiz en una microplaca de 96 pocillos, y con un volumen de 25 l por
reaccin. Brevemente, se aadieron 30 l de PEG 20% disueltos en 2,5 M NaCl a cada pocillo,
se cerr la placa con un sellador de aluminio trmico estril y se mezclaron usando un agitador.
Seguidamente, se centrifug durante 30 seg a 500 x g para recuperar la mezcla de las paredes de
los pocillos. Posteriormente la placa se incub a temperatura ambiente durante una hora, o
durante toda la noche a 4C. Tras centrifugar los productos de PCR durante 1 hora a 2.750 x g y
4C, se elimin el sobrenadante invirtiendo suavemente la microplaca sobre papel absorbente
Whatman

de 3 mm; en esta posicin se elimin el exceso de lquido por centrifugacin a 500 x

g durante 15 seg. El sedimento se lav con 150 l de etanol 70% (v/v) fro y se centrifug a
2.750 x g durante 10 min. El sobrenadante se elimin por inversin y centrifugacin a 500 x g
como se describi anteriormente. El ADN precipitado se resuspendi en 5-10 l de H
2
O miliQ, o
de acuerdo a la concentracin del producto de la PCR.



MATERI ALES Y MTODOS | 79
3.12.6 Electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacin (DGGE)
Una vez verificado el xito de las reacciones de PCR del gen 16S rRNA mediante una
electroforesis en gel de agarosa, los productos de PCR se analizaron en geles de poliacrilamida
con un gradiente qumico desnaturalizante (DGGE). El DGGE fue llevado a cabo usando el
equipo De-Code (Bio-Rad) con un gel de acrilamida al 10% (p/v) y con un gradiente
desnaturalizante de urea-formamida optimizado a un rango de concentraciones crecientes en el
sentido de migracin electrofortica, que oscilaron entre el 30% (parte superior del gel) y el 60%
(parte inferior del gel).

Para ello se hicieron dos soluciones de urea-formamida al 30 y 60% (p/v) respectivamente cuya
composicin fue la siguiente:
Solucin Urea-formamida 30%: urea, 12,6 g; formamida, 12 ml; acrilamida 10% (p/v), 25 ml;
tampn TAE, 2 ml; y H
2
O hasta 100 ml. La solucin se esteriliz mediante filtracin, usando un
filtro de 0,45 m, y se almacen en oscuridad a 4C hasta su uso.
Solucin Urea-formamida 60%: urea, 25,2 g; formamida, 24 ml; acrilamida 10% (p/v), 25 ml;
tampn TAE, 2 ml; y H
2
O hasta 100 ml. La solucin se esteriliz mediante filtracin, usando un
filtro de 0,45 m, y se almacen en oscuridad a 4C hasta su uso.
La composicin del tampn TAE fue la siguiente: Tris-base, 4,84 g; cido actico glacial, 1,14
ml; EDTA-Na
2
0,5 M; 8,2 ml y H
2
O hasta 1 litro. Este tampn se prepar a partir de una
solucin 50 veces concentrada y esterilizada en autoclave.

Una vez preparadas las soluciones de urea-formamida, se construy el gel de poliacrilamida y el
gradiente desnaturalizante en el soporte vertical del equipo DGGE-De-Code (Bio-Rad), mediante
el empleo de una bomba peristltica (Amersham Pharmacia Biotech) y una cubeta generadora de
gradientes lineales (Bio-Rad). Para ello se dispuso de 2 tubos: un tubo A que contena la solucin
de urea-formamida al 30% y un tubo B que contena la solucin urea-formamida al 60%. La
combinacin del contenido del tubo A y el tubo B se realiz en una cubeta generadora de
gradientes de concentracin lineal, acoplado a una bomba peristltica de salida, permitiendo la
carga de la acrilamida con el gradiente deseado en los cristales del soporte vertical, para formar
el gel de 0,75 mm de grosor

80 |
Antes de verter el gel, en cada uno de los tubos se aadieron 12 l de TEMED y 120 l de APS
10% como agentes polimerizantes. Los cristales utilizados como soporte, as como los
espaciadores y el peine se trataron previamente con acetona. El gel se dej polimerizar a
temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. En cada pocillo del gel se cargaron 10 l
de producto de PCR por muestra. Por cada 5 l de muestra a analizar se aadi 1 l de tampn
de carga. Las muestras migraron en el gel durante aproximadamente 4 horas a 200 V y 60C.

La composicin del tampn de carga fue la siguiente: bromofenol, 0,05% (p/v); xileno-cianol,
0,05% (p/v); ficoll en H
2
O, 4% (v/v).

Tras la electroforesis, los geles desnaturalizantes fueron teidos con SYBR Gold (Molecular
Probes, Inc.). Para ello se aadieron 2 l de una solucin comercial de SYBR Gold a 20 ml de
tampn TAE. La mezcla se extendi cuidadosamente sobre el gel, cubrindolo completamente,
incubndose durante 30 min a temperatura ambiente y en oscuridad. Posteriormente el gel se
lav suavemente con H
2
O destilada.
El gel se visualiz en un transiluminador, y se registr digitalmente usando un registrador
modelo Molecular Imager

Versadoc MP 4000 System (Bio-Rad).


3.12.7 Secuenciacin de ADN
La secuenciacin de ADN se realiz mediante el kit ABI Prism BigDye con Dideoxi
Nucletidos marcados de Applied Biosystems. Se llevaron a cabo dos tipos de reacciones de
secuenciacin.
En el primer tipo, cada reaccin de secuenciacin contuvo 3 l de PREMIX (suministrado por el
fabricante), 2 l de tampn 5x, 4 l del ADN molde, 3 l del cebador (1 M) usado para la
secuenciacin y 8 l de H
2
O miliQ. La reaccin de amplificacin consisti en un ciclo de
desnaturalizacin de 3 min a 94C y 25 ciclos con 10 seg de desnaturalizacin a 96C, 5 seg de
annealing a 50C y 4 min de extensin a 60C. Tras la reaccin, el ADN amplificado fue
precipitado para su purificacin siguiendo las instrucciones del fabricante. Por ltimo las
muestras fueron enviadas al Servicio de Secuenciacin de ADN, del Departamento de Gentica
de la Universidad de Granada en donde los productos de la secuenciacin fueron analizados en
MATERI ALES Y MTODOS | 81
un secuenciador automtico de cuatro capilares (modelo 3100-Avant Genetic Analyzer) de
Applied Biosystem/Hitachi.

El segundo tipo de reacciones de secuenciacin se llev a cabo en microplacas de 96 pocillos, en
un volumen de 10 l por reaccin, que contuvo: 2,08 l de tampn de secuenciacin 5x, 0,34 l
de BigDye Mix, 0,67 l de cebador 3,2 pmol l
-1
, 2 l de ADN molde y 5,25 l de H
2
O miliQ.
En este caso, las condiciones de la reaccin consistieron de un ciclo de desnaturalizacin a 96C
durante 1 min y 25 ciclos con 10 seg a 96C, annealing a 50C durante 5 seg y extensin durante
4 min a 60C.

La composicin del tampn de secuenciacin (5x) fue la siguiente: Tris-HCl 200 mM pH 7,5;
NaCl 250 mM; MgCl
2
100 mM.

Posterior a la amplificacin, el ADN se purific por precipitacin aadiendo a los 10 l de la
reaccin de secuenciacin, 2,5 l de EDTA 125 mM en cada pocillo de la microplaca,
asegurndose de que el EDTA alcanz el fondo del pocillo. Posteriormente se aadieron 30 l de
etanol 100%, se cerr la placa con un sellador de aluminio trmico estril, y se mezcl
invirtiendo la microplaca suavemente cuatro veces, tras lo cual se incub a temperatura ambiente
durante 15 min. Inmediatamente despus de centrifugar la mezcla durante 45 min a 2.000 x g, la
placa se invirti sobre papel absorbente y se centrifug nuevamente a 185 x g durante 1 min; a
continuacin se aadieron 30 l de etanol 70% a cada pocillo. Posteriormente, se centrifug la
muestra a 1.650 x g durante 15 min a 4C, tras lo cual la placa se invirti como se describi
anteriormente y se centrifug por 1 min a 185 x g.

Las muestras se conservaron a 4C, hasta que fueron analizadas en un secuenciador de 96
capilares (modelo 3730xl) de Applied Biosystems, en el Servicio de Secuenciacin del
Departamento de Zoologa de la Universidad de Oxford.




82 |
3.12.8 Anlisis de secuencias
Para la visualizacin de los electroferogramas se utiliz el programa Chromas (2.33). Para la
comparacin y bsqueda de secuencias homlogas se utiliz el algoritmo BLAST (Basis Local
Alignment Search Tool) disponible en el servidor del NCBI (National Center for Biotechnology
Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). BLAST encuentra regiones de
similitud entre secuencias; el programa compara secuencias nucleotdicas o de protenas con
secuencias existentes en las bases de datos, y calcula la significancia estadstica de las uniones.
Las secuencias directa (forward) y reversa (reverse) de los diferentes genes parcialmente
secuenciados se alinearon usando la herramienta on-line del programa CAP3 (Sequence
Assembly Program, http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php).


3.12.8.1 Elaboracin de rboles filogenticos
Para llevar a cabo los anlisis filogenticos, se obtuvieron las secuencias parciales (alrededor de
1500 bp) del gen 16S rRNA de las cepas seleccionadas de la base de datos del NCBI. Las
secuencias fueron alineadas usando la herramienta de alineamiento mltiple del programa
CLUSTALX, versin 2.0.12 (Larkin et al. 2007). Para estimar la matriz de distancias se us el
programa DNADIST del paquete PHYLIP 3.69 (Felsenstein 1993), el cual calcul las distancias
pareadas entre todo los taxa incluidos en el anlisis. La matriz de distancias resultante fue usada
para estimar un rbol usando el mtodo neighbor joining mediante el programa NEIGHBOR.
El programa SEQBOOT fue usado para comprobar estadsticamente los rboles, recalculando el
conjunto de datos 1000 veces (bootstrap). Finalmente, usando el programa CONSENSE, se
estim un rbol consenso mediante el mtodo de la regla de la mayora (majority-rule). Los
rboles fueron visualizados y editados usando FigTree versin 1.3.1 (Rambaut 2006-2009).

Por otro lado, para la elaboracin de rboles filogenticos de genes constitutivos, o genes
housekeeping, se utiliz el mtodo Multi-locus Sequence Typing (MLST), desarrollado por
Maiden et al. (1998). Este mtodo caracteriza aislados bacterianos mediante la comparacin de
las secuencias parciales de siete genes de expresin constitutiva (glpF, gmk, ilvD, pta, pur, pycA,
tpi). En los anlisis MLST, se asigna un nmero de alelo a cada una de las secuencias parciales
de los genes constitutivos mencionados. As, cada alelo est representado por un nmero y cada
cepa queda clasificada dentro de un perfil allico conocido con el trmino ST (sequence type)
MATERI ALES Y MTODOS | 83
tambin representado por un nmero (Urwin and Maiden 2003). Las relaciones entre aislados
bacterianos se realizan por comparaciones de perfiles allicos, de tal manera que aislados
cercanamente relacionados tienen idnticas STs, o STs que difieren en pocos loci.

Para la tipificacin de se usaron las herramientas on-line del sitio web MLST para B. cereus
(http://pubmlst.org/bcereus/) desarrollado por Keith Jolley (Jolley et al. 2004) y hospedado en la
Universidad de Oxford (UK). El anlisis filogentico se llevo a cabo utilizando los perfiles
allicos, para esto se utiliz la herramienta Tree drawing del sitio web MLST de B.cereus. Esta
herramienta usa el paquete de programas PHYLIP para generar rboles (neighbor-joining o
UPGMA) a partir de datos de perfiles allicos. En este anlisis se utiliz el mtodo UPGMA. El
archivo del rbol filogentico finalmente fue realizado usando el paquete Phylodendron, tambin
integrado en las herramienras on-line de la web MLST de B. cereus.


3.13 CURADO DE ELEMENTOS EXTRACROMOSMICOS
Para eliminar los elementos extracromosmicos de cepas bacterianas se utilizaron dos
estrategias.

La primera estrategia estuvo basada en el mtodo descrito por Sivropoulou et al. (2000) con
algunas modificaciones. La cepa parental se cultiv en 3 ml de LB suplementado con SDS
0.002% (p/v), durante 24 horas a 240 rpm y 42C. Posteriormente, y de manera sucesiva se
realizaron diluciones 1:100 en el mismo medio cada 12 horas durante 3 das. Finalmente, el
cultivo derivado se sembr en placas de LB. Las cepas derivadas potencialmente curadas se
seleccionaron por cambio en la morfologa de las colonias (e.g. tamao, forma, o apariencia de la
superficie) comparado con la cepa parental. El ADN total se aisl posteriormente tal y como se
describe en el apartado 3.12.1.3 de Materiales y Mtodos.

El segundo mtodo utilizado para el curado de los elementos extracromosmicos fue una
modificacin de las metodologas de Ward & Ellar (1983) y de Mahillon et al. (1988). Al igual
que en el procedimiento anterior, la cepa parental se cultiv en 3 ml de LB (esta vez sin SDS),
durante 24 horas a 240 rpm y 42C. Posteriormente, se realizaron diluciones sucesivas (1:100)
84 |
cada 12 horas durante 3 das. El cultivo derivado se sembr en placas con LB que creci durante
12-24 horas a 30C. Las cepas obtenidas se seleccionaron al azar de un grupo de colonias con
morfologa atpica, comparada con la cepa parental. Finalmente, se extrajo el ADN de las cepas
seleccionadas para comprobar el xito del procedimiento.




(Ward and Ellar 1983, Mahillon et al. 1988, Weisburg et al. 1991, Muyzer et al. 1993, Burggraf
et al. 1997, Chapman et al. 1998, Sivropoulou et al. 2000, Jaldo et al. 2001, Gonzalez et al. 2003,
Uad 2007, Molina et al. 2010)






























4
4. . R R E E S S U U L L T T A A D D O O S S
















CAPITULO 1



























RESULTADOS: CAPI TULO 1 | 89

4.1 AISLAMIENTO Y SELECCIN DE CEPAS BACTERIANAS
Para la obtencin de microorganismos naturales con actividad entomopatgena se recogieron
treinta y siete muestras de campo de diversa naturaleza (tierra de cultivo, restos vegetales, frutas
frescas y en descomposicin, polvo de carretera, insectos muertos, etc.) en una localidad agrcola
de la Costa Tropical de Granada (Almuecar), al sur de Espaa. En esta rea la poblacin de
Ceratitis capitata est bien establecida, y es considerada la plaga econmicamente ms
perjudicial de cultivos frutales. Debido a que la mayora de bacterias que presentan toxicidad
frente a insectos son ubicuas y estn bien adaptadas a explotar los recursos de una amplia
variedad de ambientes, como el caso de Bacillus thuringiensis (Martin and Travers 1989), se
realiz la hiptesis de que las muestras recolectadas en zonas de campo donde sta plaga est
presente de forma constante a lo largo del ao, son fuentes potenciales de enemigos naturales de
la mosca de la fruta del Mediterrneo. Tras llevar las muestras al laboratorio y conservarlas de
forma adecuada hasta su procesado, se llev a cabo un aislamiento especfico diseado para el
aislamiento de bacterias de la especie Bacillus thuringiensis.

En cada una de las muestras de campo se determin el nmero total de hetertrofos capaces de
crecer en medio LB, mediante diluciones seriadas de una suspensin obtenida mezclando cada
una de las 37 muestras en 10 ml de medio LB. En la Tabla 5 se detalla el nmero de hetertrofos
encontrados en cada una de las muestras. El nmero de hetertrofos totales oscil entre 10
5
a 10
7
cfu/ml en muestras de suelo, caracoles de tierra y de restos vegetales en descomposicin,
mientras que oscil entre 0 a 10
3
cfu/ml en frutas frescas y hojas recolectadas directamente de los
rboles.

Para el aislamiento de cepas bacterianas se us el mtodo selectivo descrito por Travers et al.
(1987), que se basa en que la germinacin de las esporas de B. thuringiensis es inhibida
selectivamente por el acetato de sodio aadido a un medio rico, mientras que el resto de cepas
formadoras de esporas mantienen su capacidad para germinar. Esta caracterstica permite contra-
seleccionar las cepas de B. thuringiensis de todas las bacterias no esporulantes, y esporulantes
que han germinado gracias a un tratamiento de calor (80C durante 10 min). Las esporas de B.
thuringiensis, resistentes al calor, son sembradas en un medio rico, permitindoles germinar y
90 | CAPTULO 1
crecer. Con este procedimiento se aislaron y seleccionaron un total de 110 colonias que
presentaban morfologa tpica de Bacillus. Dichas cepas se resembraron en placas de LB por
agotamiento varias veces hasta obtener cultivos puros. Despus de comprobar la capacidad de
estos organismos para crecer en medio lquido de esporulacin (T3), as como para formar
esporas (mediante visualizacin en microscopio de contraste de fase, datos no mostrados), se
seleccionaron 104 cepas a partir de las 37 muestras de campo, las cuales se usaron
posteriormente en las pruebas de toxicidad frente a adultos y larvas de C. capitata (Tabla 5).

Varias de las cepas de bacterias entomopatgenas descritas en la bibliografa han sido aisladas a
partir insectos muertos (Itoua-Apoyolo et al. 1995, Schnepf et al. 1998). Por esta razn, adems
de las cepas aisladas a partir de muestras de campo, se aislaron y seleccionaron 11 cepas
bacterianas a partir de dos larvas de tercer estadio de C. capitata encontradas muertas en el
interior de chirimoyos (Annona cherimola Mill.), recogidos en zonas de cultivo de la misma
localidad donde se recolectaron las muestras de campo. El aislamiento de dichas cepas se llev a
cabo mediante maceracin de las larvas previamentes esterilizadas superficialmente con etanol al
70%, y siembra de diluciones seriadas de la suspensin en placas de LB. Las cepas bacterianas
aisladas de larvas muertas se nombraron DLA y DLB (dead larvae) (Tabla 5).

En este trabajo se aislaron y seleccionaron un total de 115 cepas bacterianas, 104 a partir de
muestras de campo, y 11 a partir de larvas muertas de C. capitata. La actividad entomopatgena
de las 115 cepas aisladas se evalu tanto en adultos como en larvas de la mosca de la fruta del
Mediterrneo.








RESULTADOS: CAPI TULO 1 | 91
Tabla 5. Nmero de muestra, tipo de muestra, nmero de hetertrofos totales, resistentes al tratamiento de calor
(80C durante 10 min), y nomenclatura de las 115 cepas aisladas y seleccionadas de las muestras recolectadas en el
campo y a partir de larvas muertas de C. capitata.
No. de muestra Tipo de muestra CFUs totales CFUs despus
tratamiento
Cepas
aisladas
1 Tierra de cultivo de chirimoyo 6,3 x 10
5
4,4 x 10
2
1.1
1.2
1.3
1.4
1.6

2
Hojas secas de rbol de
chirimoyo
2,93 x 10
5
1 2.1

4
Hojas frescas de rbol de
chirimoyo
1,7 x 10
5
3 4.1

5
Corteza de chirimoyo en
descomposicin
1 x 10
7
2,8 x 10
2
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7

6 Agua estancada de acequia 3,9 x 10
2
2 x 10
1
6.1

7 Chirimoyo en descomposicin 3,2 x 10
6
2,1 x 10
2
7.1

8
Huesos de chirimoyo en
descomposicin
5,2 x 10
5
3,4 x 10
4
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
8.6
8.8
8.9
8.10

9

Hojas de chirimoyo en
descomposicin
4,7 x 10
5
9
9.1
9.2
9.3
9.5
9.6

10 Caracoles de tierra muertos 3 x 10
7
6,9 x 10
3
10.1
10.2
10.3

11
Suelo cercano a un rbol de
chirimoyo, con seales de
actividad de insectos
1 x 10
6
1 x 10
3
11.1
11.2
11.4
11.5
11.6

92 | CAPTULO 1
12
Tierra de campo de
chirimoyos
5 x 10
6
1,2 x 10
3
12.1
12.2
12.4
12.5
12.6
12.7

13 Caracoles de tierra muertos 1,13 x 10
7
1,8 x 10
1
13.1
13.2
13.3

15 Vegetacin de caa silvestre 5,6 x 10
4
7 x 10
3
15.1
15.2
15.3
15.4
15.5
15.6
15.7
15.9

16 Caracol de tierra muerto 3 x 10
7
2 x 10
2
16.2
16.3

17 Lodos secos de acequia 3 x 10
6
8,3 x 10
2
17.1
17.2
17.3
17.4
17.5

18 Cenizas de una hoguera 4,8 x 10
7
4,6 x 10
1
18.1

20 Polvo de camino de tierra 7,3 x 10
5
8 x 10
2
20.1
20.2
20.3
20.4
20.5
20.6
20.7
20.8

22 Polvo de tela de araa 3,2 x 10
7
6,7 x 10
2
22.1
22.2
22.3
22.4

27
Restos vegetales de rbol de
aguacate
2,1 x 10
7
2 x 10
1
27.1
27.2

29 Hoja seca de higo chumbo 5 x 10
5
3,1 x 10
2
29.1
29.2

30 Suelo debajo de chumbera 6,6 x 10
6
4 x 10
3
30.1
30.2
30.3
30.4
30.5
31
Cochinilla silvestre del nopal,
Dactylopius sp. afectadas con
1,4 x 10
4
1

31.1
RESULTADOS: CAPI TULO 1 | 93
hongos

33
Suelo y restos vegetales de una
chumbera
4,9 x 10
7
5,7 x 10
3
33.1
33.2
33.3
33.4
33.5

34
Restos vegetales de nsperos
apilados en una compostera
1 x 10
7
8,3 x 10
2
34.1
34.2
34.3
34.4
34.5
34.6

35
Tronco de chumbera seca en
descomposicin
4,4 x 10
5
4,4 x 10
1
35.1
35.2
35.3
35.4

36 Arena de playa 1,5 x 10
3
1 x 10
1
36.1
36.2

36.3

Larva 1
Larva muerta encontrada en
chirimoyo
1,8 x 10
6
2 x 10
3
DLA1
DLA4
DLA10

Larva 2
Larva muerta encontrada en
chirimoyo
1 x 10
5

DLB1
DLB2
DLB3
DLB5
DLB6
DLB7
DLB8


4.2 EVALUACIN DE LA TOXICIDAD DE LOS AISLADOS BACTERIANOS
4.2.1 Bioensayos con adultos de C. capitata
La actividad patgena de los 115 aislados bacterianos se ensay en adultos de C. capitata. Los
bioensayos con adultos se llevaron a cabo en cajas de plstico, donde a un grupo de 10 moscas
adultas (5 machos y 5 hembras) se les provey de 7 ml de cultivo esporulado de la cepa
ensayada, adems de de dieta slida para adultos. Los bioensayos se revisaron diariamente
durante los 20 das de duracin del experimento; en la Tabla 6 se muestra el porcentaje de
mortalidad a 5, 10, y 20 das despus de iniciados los bioensayos. En cada uno de los bioensayos
se incluyeron como controles negativos de toxicidad la cepa B. thuringiensis 78/11 (negativa
para la expresin de toxinas Cry), Escherichia coli XL1Blue/pSVC10-wt que expresa en gran
94 | CAPTULO 1
cantidad la toxina Cry1Ac1, activa frente lepidpteros, el medio T3 (medio de crecimiento
bacteriano) y H
2
O destilada estril.
La toxicidad de los aislados bacterianos en adultos de C. capitata se evalu en grupos de 20-26
cepas junto los controles antes mencionados, por lo que en la Tabla 6 se muestran las medias de
los porcentajes de mortalidad de los controles (n=6).

Ninguna de las 115 cepas bacterianas caus una mortalidad significativa en adultos de C.
capitata en comparacin con los controles negativos. La mortalidad corregida de las 115 aislados
bacterianos en adultos oscil entre el 0% y el 40% al final del experimento, mientras el
porcentaje de mortalidad de los controles negativos estuvo entre el 5% y el 30% (Tabla 6).
Los valores mximos de mortalidad fueron 10% (17 cepas), 30% (cepas 11.5 y 30.3), y 40%
(cepas 4.1, 8.3, 8.10, 22.1, 31.1 y DLB5) a 5, 10, y 20 das despus de haber iniciado los
bioensayos respectivamente.

Al comparar el valor mximo de porcentaje de mortalidad (40%) alcanzado por siete cepas
bacterianas tras 20 das de bioensayo (Tabla 6) con los porcentajes de mortalidad de los controles
en cada uno de los grupos de bioensayo por separado, se dedujo que la mortalidad causada no se
debe a la toxicidad de los aislados bacterianos, sino a otras variables del experimento, como
podra ser la edad de moscas. Estos resultados muestran que ninguna de las 115 cepas
bacterianas aisladas en este trabajo presenta actividad patgena frente a adultos de C. capitata.


4.2.2 Bioensayos con larvas de C. capitata
La susceptibilidad de larvas de primer estadio de C. capitata se ensay frente a cada uno de los
aislados bacterianos, en condiciones de laboratorio. Estos bioensayos se llevaron a cabo
utilizando los pocillos de una microplaca conteniendo 100 l de un cultivo bacteriano esporulado
y 500 l de dieta artificial para larvas. Una vez solidificada la mezcla, se coloc una larva de
primer estadio de C. capitata sobre la dieta de cada pocillo. Se realizaron dos repeticiones con
cada una de las 115 cepas evaluadas. Cada rplica consisti en un bioensayo con 24 larvas. Se
calcul la mortalidad media, desviacin estndar y coeficiente de variacin (CV: desviacin
estndar/media) entre las dos repeticiones 4, 10 y 15 das despus del inicio del experimento
(Tabla 6). En ninguna de las cepas, el coeficiente de variacin sobrepas el valor de 1,5
RESULTADOS: CAPI TULO 1 | 95
(considerado como valor limite estndar) (datos no mostrados), lo que significa que las dos
repeticiones se pueden considerar como rplicas fiables (Sokal and Rohlf 2003).

Los porcentajes de mortalidad obtenidos fueron similares a los obtenidos en los ensayos de
toxicidad con adultos (Tabla 6); ninguna de las 115 cepas evaluadas mostr alta toxicidad frente
a larvas de la mosca de la fruta del Mediterrneo. La mortalidad mxima corregida de los 115
aislados bacterianos oscil entre el 0% y el 36%, mientras que el promedio del porcentaje de
mortalidad de los controles negativos oscil entre el 1% y el 12% despus de 15 das del inicio
del experimento (Tabla 6).

Se llev a cabo un anlisis de varianza de una va, con las dos repeticiones de los bioensayos de
las 115 cepas bacterianas a 4, 10 y 15 das despus de iniciar el experimento con larvas. No se
registraron diferencias significativas en la mortalidad acumulativa de larvas alimentadas con
cultivos esporulados enteros de los 115 aislados bacterianos y sus controles despus de 4 das
(F
1, 118
= 1,27; P = 0,118), y despus de 10 das (F
1, 118
= 1,27; P = 0,083). Sin embargo, se
registr un efecto significativo despus de 15 das de haber iniciado el bioensayo (F
1, 118
= 1,33;
P = 0,048). No obstante, la prueba de rango estudentizado de Tukey determin que entre las
medias de la mortalidad de todos los tratamientos (aislados bacterianos y controles), a 15 das del
inicio del experimento, no existen diferencias significativas, por lo que se incluyeron en el
mismo grupo. Adems, la prueba de Dunnett determin que la mortalidad de los aislados
bacterianos no present diferencias frente a la mortalidad de los grupos control (P > 0,05),
corroborando de esta manera el resultado de la prueba de Tukey y de los ANOVAs.
Al igual que el caso de los ensayos de toxicidad con adultos, ninguna cepa se comport de forma
diferente a las otras en cuanto a la toxicidad causada en larvas de primer estadio de C. capitata.







96 | CAPTULO 1
Tabla 6. Porcentaje de mortalidad causada por 115 cepas bacterianas analizadas en este estudio (media DE) en
bioensayos con larvas de Ceratitis capitata despus de 4, 10 y 15 das despus de inicio del experimento, y en
bioensayos con adultos despus de 5, 10 y 20 das.
Cepa Mortalidad de larvas (%) Mortalidad de adultos (%)
4 das 10 das 15 das 5 das 10 das 20 das
1.1 8.70 4.35 7.14 7.14 5.26 5.26 10 10 10
1.2 10.87 2.17 9.52 4.76 5.43 0.16 10 10 10
1.3 13.33 4.06 8.16 6.12 6.28 4.24 10 10 20
1.4 2.27 2.08 4.76 4.76 0.00 0.00 0 0 0
1.6 4.55 4.15 4.76 4.76 0.00 0.00 0 20 20
2.1 4.63 4.63 2.38 2.38 0.00 0.00 0 0 0
4.1 4.74 0.40 2.38 2.38 0.00 0.00 0 0 40
5.1 4.73 4.54 4.44 1.15 8.44 8.44 0 0 20
5.2 2.17 2.17 11.90 11.90 10.53 10.53 0 0 0
5.3 6.52 6.52 9.65 0.13 10.53 10.53 10 20 20
5.4 6.52 2.17 12.41 1.88 36.03 25.51 0 10 10
5.5 8.70 0.00 7.14 7.14 31.36 10.31 0 0 0
5.6 15.04 6.70 14.18 4.18 13.45 2.34 0 10 20
5.7 15.05 1.62 28.33 5.00 26.85 10.65 0 10 30
6.1 11.44 11.44 10.25 10.25 8.81 8.81 0 0 0
7.1 16.94 3.89 13.59 4.06 12.50 12.50 0 20 30
8.1 18.80 5.00 14.16 8.57 13.73 12.59 0 0 0
8.2 19.40 5.60 9.94 4.35 7.50 7.50 0 0 0
8.3 17.39 8.70 14.29 9.52 12.91 8.15 10 20 40
8.4 15.22 2.17 11.90 11.90 13.65 7.40 0 10 10
8.5 17.34 3.71 16.67 16.67 22.73 22.73 0 0 10
8.6 15.79 15.79 23.33 23.33 23.33 23.33 0 0 0
8.8 17.06 12.10 14.58 14.58 16.04 13.12 0 0 20
8.9 23.30 14.20 25.62 20.21 25.87 19.96 0 0 20
8.10 26.01 7.32 21.74 21.74 21.74 21.74 0 0 40
9.1 21.02 8.14 14.58 14.58 14.58 14.58 10 20 20
9.2 12.50 8.33 12.50 12.50 18.85 18.65 0 0 20
9.3 23.48 9.85 23.54 18.13 21.83 19.84 0 0 20
9.5 16.76 8.24 19.05 2.69 19.89 1.70 10 10 10
9.6 10.42 10.42 13.12 7.71 20.59 0.24 0 0 20
10.1 14.76 6.07 21.32 3.68 19.58 9.58 0 0 20
10.2 8.70 4.35 8.70 4.35 11.28 1.76 0 0 30
10.3 12.50 4.17 16.94 3.89 21.11 8.06 0 0 20
11.1 8.33 4.17 14.58 6.25 14.58 6.25 0 0 10
11.2 6.25 2.08 8.51 0.18 8.51 0.18 0 0 20
11.4 8.33 4.17 11.31 2.98 11.31 2.98 0 0 10
11.5 13.75 7.08 20.83 12.50 20.83 12.50 10 30 30
11.6 4.17 4.17 8.33 8.33 8.33 8.33 0 10 10
12.1 10.42 10.42 12.50 12.50 15.00 10.00 10 10 30
12.2 16.94 3.89 21.38 4.71 23.27 0.54 0 0 10
12.4 8.13 1.88 5.56 5.56 2.78 2.78 0 0 0
12.5 10.87 10.87 0.00 0.00 0.00 0.00 0 0 0
12.6 9.17 0.83 2.78 2.78 2.78 2.78 0 0 10
12.7 13.75 1.25 7.14 1.59 5.56 5.56 0 0 10
13.1 8.33 8.33 7.14 7.14 0.00 0.00 0 0 0
13.2 4.17 4.17 5.19 5.19 0.00 0.00 0 0 0
13.3 6.25 6.25 4.37 4.37 0.00 0.00 0 0 0
15.1 6.25 6.25 2.08 2.08 0.00 0.00 0 0 10
15.2 2.17 2.17 0.00 0.00 0.00 0.00 0 0 0
15.3 6.52 6.52 4.76 4.76 0.99 0.99 0 0 10
15.4 2.17 2.17 0.00 0.00 3.33 3.33 0 0 0
15.5 5.22 0.87 4.39 4.39 14.44 14.44 0 0 0
15.6 5.00 5.00 0.00 0.00 18.75 18.75 0 0 0
RESULTADOS: CAPI TULO 1 | 97
15.7 2.50 2.50 0.00 0.00 0.00 0.00 0 0 0
15.9 16.67 8.33 10.42 6.25 8.33 8.33 0 10 10
16.2 11.25 1.25 2.08 2.08 0.00 0.00 0 0 0
16.3 13.37 8.37 10.90 5.35 2.78 2.78 0 0 0
17.1 6.67 1.67 3.23 2.32 2.78 2.78 0 0 0
17.2 4.17 4.17 0.00 0.00 0.00 0.00 0 0 0
17.3 6.67 1.67 0.00 0.00 0.00 0.00 0 0 0
17.4 14.58 10.42 14.58 10.42 16.76 12.41 10 10 10
17.5 8.33 4.17 10.42 6.25 18.75 14.58 0 0 0
18.1 6.25 2.08 6.67 1.67 4.17 4.17 10 10 30
20.1 14.95 2.45 11.46 5.21 17.56 3.27 0 0 20
20.2 14.58 10.42 15.00 10.00 15.00 10.00 0 0 0
20.3 10.42 2.08 10.42 2.08 10.80 1.70 0 0 10
20.4 8.33 4.17 12.95 8.79 12.95 8.79 0 0 30
20.5 10.42 6.25 10.51 6.16 10.51 6.16 0 10 20
20.6 20.83 4.17 27.08 6.25 19.26 4.26 0 0 10
20.7 8.33 4.17 12.99 4.66 8.01 0.32 0 0 30
20.8 4.17 0.00 2.08 2.08 2.08 2.08 0 0 0
22.1 6.25 6.25 12.50 12.50 12.50 12.50 0 0 40
22.2 6.25 6.25 8.33 8.33 8.33 8.33 0 0 0
22.3 2.08 2.08 4.17 4.17 4.17 4.17 0 0 0
22.4 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 0 10 30
27.1 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 0 0 0
27.2 2.08 2.08 2.08 2.08 4.36 0.19 0 0 0
29.1 2.08 2.08 2.08 2.08 2.08 2.08 0 0 0
29.2 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0 0 0
30.1 10.61 2.27 8.00 0.33 8.06 4.44 10 10 30
30.2 14.88 10.12 18.86 2.19 20.94 0.11 0 20 20
30.3 4.17 4.17 1.95 1.95 0.00 0.00 0 30 30
30.4 11.07 9.77 5.40 5.12 11.93 1.40 0 0 10
30.5 12.50 12.50 5.26 5.26 5.26 5.26 0 0 0
31.1 6.56 5.94 0.00 0.00 0.00 0.00 0 0 40
33.1 6.25 6.25 0.00 0.00 0.00 0.00 0 0 20
33.2 10.71 5.95 7.64 2.88 12.66 3.13 0 0 80
33.3 6.25 6.25 1.75 1.75 4.35 4.35 0 0 20
33.4 12.50 12.50 7.89 7.89 12.61 8.44 0 0 20
33.5 2.08 2.08 0.00 0.00 4.81 0.46 0 0 20
34.1 10.42 2.08 4.35 4.35 6.98 1.72 0 0 10
34.2 16.67 4.17 8.88 3.62 8.88 3.62 0 0 10
34.3 10.42 6.25 4.71 0.55 4.71 0.55 0 0 20
34.4 6.25 6.25 4.17 4.17 6.25 6.25 0 0 0
34.5 10.42 2.08 2.08 2.08 2.08 2.08 0 0 10
34.6 14.58 10.42 9.81 0.72 10.03 0.50 0 0 10
35.1 18.75 2.08 6.82 6.82 4.76 4.76 0 0 10
35.2 10.42 6.25 4.81 0.46 4.90 0.36 0 0 0
35.3 12.50 12.50 2.63 2.63 5.26 5.26 0 0 0
35.4 10.51 6.16 4.90 0.36 5.26 5.26 0 0 0
36.1 8.33 4.17 2.17 2.17 2.38 2.38 0 0 20
36.2 19.02 5.98 7.89 2.63 8.88 3.62 0 0 0
36.3 13.26 4.92 7.89 7.89 8.33 8.33 0 0 20
DLA1 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 10 10 20
DLA4 8.98 0.28 0.00 0.00 0.00 0.00 10 10 20
DLA10 8.70 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 10 10 30
DLB1 8.70 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0 0 20
DLB2 13.04 0.00 0.00 0.00 11.82 11.82 0 20 20
DLB3 8.70 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0 0 20
DLB4 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 10 10 10
DLB5 4.35 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0 0 40
DLB6 4.35 0.00 0.00 0.00 2.38 2.38 0 0 10
DLB7 8.70 0.00 2.38 2.38 2.38 2.38 10 20 30
DLB8 8.70 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0 10 10
T3 3.43 2.98 8.99 6.23 11.78 9.32 0 0 13.3
98 | CAPTULO 1
medium
Bt IPS
78/11
5.56 4.57 6.08 4.57 7.65 4.61 3.33 20
E. coli
pSVC10-
wt
1.54 2.21 1.02 1.62 1.30 2.09 3.33 30
H
2
O --- --- --- 1.67 5



A pesar de que ninguna de las cepas probadas fue txica para larvas o adultos de C. capitata, en
el transcurso de la segunda repeticin de los bioensayos con larvas se hizo una observacin
interesante. Debido a circunstancias ajenas a nuestro control, se introdujo una ligera
modificacin en la metodologa de un grupo de aislados bacterianos ensayados. El bioensayo de
las cepas comprendidas entre la 12.7 y 29.1 no se inici inmediatamente tal y como se haba
estado realizando hasta el momento, debido a que las larvas de C. capitata de primer estadio no
estaban disponibles. En lugar de iniciar el bioensayo inmediatamente despus de mezclar la dieta
con el cultivo bacteriano, las larvas se colocaron 96 horas ms tarde. Durante este tiempo, las
microplacas de los bioensayos, que contenan los cultivos mezclados con la dieta, se
mantuvieron a 4C a la espera de disponer de larvas de primer estadio de C. capitata. Debido a
esta ligera modificacin, la toxicidad de la cepa 15.1 cambi drsticamente mostrando una
mortalidad no corregida del 78% y 100% a 10 y 15 das despus del inicio del experimento,
respectivamente. En estas mismas condiciones el porcentaje de mortalidad de los controles, B.
thuringiensis IPS 78/11 y medio T3 fue 29,1% y 30,4% respectivamente, al final del bioensayo
(Fig. 11).







RESULTADOS: CAPI TULO 1 | 99

Fig. 11. Porcentaje de mortalidad de larvas de C. capitata despus de 4 (barras blancas), 10 (barras grises) y 15 das
(barras negras) causadas por un grupo de cepas bacterianas sometidas a una incubacin a 4C durante 96 horas. Bt =
B. thuringiensis 78/11, pSV = Escherichia coli pSVC10-wt, T3 = medio T3.


La Figura 11 muestra que, despus de la incubacin a 4C durante 96 horas, varias cepas (12.7,
15.2, 15.4 y 15.6) aumentaron la mortalidad causada en larvas de primer estadio de C. capitata
tras 15 das del inicio del experimento. Sin embargo, la cepa 15.1 mostr el incremento ms
drstico en su toxicidad despus de 10 das, adems de ser la cepa que mayor mortalidad caus al
final del bioensayo.
Al mismo tiempo, se observ que la mayora de larvas de este bioensayo mostraron necrosis
evidente en todo su cuerpo, como se muestra en la Figura 12.


0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
12.7 15.1 15.2 15.3 15.4 15.5 15.6 15.7 15.9 27.1 27.2 29.1 Bt pSV T3
%

m
o
r
t
a
l
i
d
a
d
100 | CAPTULO 1


Fig. 12. Detalle de una microplaca de bioensayo mostrando larvas necrosadas de C. capitata como efecto de la
toxicidad de B. pumilus 15.1


Con el objetivo de verificar este resultado tan sorprendente y comprobar que la exposicin de la
cepa 15.1 al fro efectivamente es la responsable del aumento de su toxicidad frente a larvas de
C. capitata, se llev a cabo un bioensayo con esta cepa usando dos condiciones. En un
bioensayo, despus de mezclar el cultivo bacteriano y la dieta, las larvas de primer estadio de C.
capitata se colocaron inmediatamente en una de las microplacas, mientras que la otra placa se
mantuvo a 4C durante 96 horas antes de colocar las larvas de primer estadio. El resultado fue
consistente con la observacin anterior, la mortalidad de larvas de C. capitata despus de 15 das
de haber iniciado el bioensayo fue significativamente mayor en la microplaca que haba sido
mantenida durante 96 horas a baja temperatura (94.44% 7.86%) comparada con la placa donde
se colocaron las larvas inmediatamente despus de mezclar el cultivo con la dieta (6.25%
4.66%). Debido al comportamiento inesperado de la cepa 15.1 junto con su potente efecto en
larvas de C. capitata, se decidi identificar y caracterizar la cepa 15.1.



RESULTADOS: CAPI TULO 1 | 101
4.3 IDENTIFICACIN DE LA CEPA 15.1
Debido a la alta toxicidad de la cepa 15.1 frente a larvas de C. capitata, esta cepa fue
seleccionada para su identificacin y posterior caracterizacin. La cepa 15.1 es una cepa
silvestre, que fue aislada a partir de una muestra de campo de una gramnea comn (Phragmites
australis). Las colonias de la cepa 15.1 poseen caractersticas morfolgicas que la hacen
distinguibles de otras cepas bacterianas. Entre las caractersticas ms conspicuas se encuentran la
rugosidad de sus colonias, sus bordes estriados, color cremoso, y anillos concntricos de
crecimiento en placas de medio LB o T3, como se detalla en la Figura 13 (a). Adems, con el
objeto de conocer la morfologa microscpica de la cepa 15.1, la Figura 13 muestra el detalle de
clulas de la cepa 15.1, mediante microscopa electrnica de barrido (Fig. 13b) y microscopa
electrnica de transmisin (Fig. 13c) (generosamente cedidas por Juan F. Caa-Roca), en
diferentes intervalos de tiempo durante su crecimiento en medio T3. La forma de una clula de la
cepa 15.1 es tpica bacilar donde un eje es mucho mayor que el otro; y su espora se forma en el
interior de la clula, como en el resto de especies de los gneros Bacillus y Chlostridium.


Fig. 13. Colonia y clulas de la cepa 15.1. a: colonias de 3-4 mm de dimetro con bordes estriados, mostrando los
anillos concntricos de crecimiento en medio LB. b: detalle de clulas vegetativas tras 6 horas de crecimiento en
medio T3, visualizadas bajo microscopa electrnica de barrido (Scanning). c: detalle de una espora en su
esporangio, tras 36 horas de crecimiento en medio T3, visualizada bajo microscopa electrnica de transmisin
(TEM). (Las preparaciones para microscopa electrnica de barrido y microscopa electrnica de transmisin han
sido generosamente cedidas por Juan F. Caa-Roca)


Para la identificacin de la cepa 15.1 se extrajo su ADN total y se utiliz como molde para la
amplificacin del gen 16S rRNA (rrsE) de la bacteria mediante PCR. El gen se amplific en dos
fragmentos solapantes de tamaos 780 y 1023 pares de bases respectivamente, utilizando los
102 | CAPTULO 1
cebadores 533F y 16SB1 en el primer amplicn y los cebadores fD1 y rD2 en el segundo
amplicn (Tabla 4 de Materiales y Mtodos). Los amplicones comprendieron desde la posicin 1
a la posicin 780 y desde la posicin 515 a la posicin 1538 de la secuencia del gen 16S rRNA
de Escherichia coli (No. de acceso al GenBank AE005174).

El ADN amplificado se visualiz mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, tras lo cual
el ADN se recuper cortando la banda de inters, y purificndolo mediante kits comerciales.
Posteriormente el fragmento purificado se cuantific espectofotomtricamente, obtenindose a
concentraciones de 28,3 ng/l y de ~25 ng/l para el primer y segundo amplicn
respectivamente. Una vez se recuper el ADN de las bandas de inters, tras cada extraccin se
comprob el xito de recuperacin, mediante otra electroforesis en gel de agarosa

Los fragmentos de ADN amplificados fueron secuenciados usando los mismos cebadores
utilizados en las PCRs. Estas reacciones se llevaron a cabo en el Servicio de Secuenciacin del
Departamento de Gentica de la Universidad de Granada. Las secuencias obtenidas fueron
visualizadas en el programa Chromas (Version 2.31). Ambas hebras de los dos productos de
PCR se secuenciaron, y la secuencia resultante del gen 16S rRNA fue comparada con las
secuencias depositadas en la base de datos del GenBank, mediante el programa BLAST
(Altschul et al. 1997), disponible en el servidor del Nacional Center for Biotechnology
Information de Estados Unidos.

La secuencia del gen 16S rRNA de la cepa 15.1 mostr 100% de identidad con el ARN
ribosmico 16S de varias cepas de Bacillus pumilus; especficamente con las cepas Van35 y
SCSSS10, aisladas en China (No. de acceso al GenBank GU290547.1 y FJ461466.1
respectivamente) y con otra cepa aislada en la India, la S8-09 (No. de acceso al GenBank
EU620416.1), entre otras.

La secuencia del gen 16S rRNA de la cepa B. pumilus 15.1 determinada en el presente estudio
que se detalla a continuacin se deposit en la base de datos del GenBank bajo el nmero de
acceso no. EU978469:

RESULTADOS: CAPI TULO 1 | 103
1 cctcggagag tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag
61 tcgagcggac agaagggagc ttgctcccgg atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt
121 gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggagctaata ccggatagtt
181 ccttgaaccg catggttcaa ggatgaaaga cggtttcggc tgtcacttac agatggaccc
241 gcggcgcatt agctagttgg tggggtaatg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc
301 tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc
361 agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa
421 ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa gtgcgagagt aactgctcgc
481 accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata
541 cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta
601 agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg ggaaacttga
661 gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga
721 acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg
781 gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta
841 gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg
901 gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg
961 tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctctga caaccctaga
1021 gatagggctt tcccttcggg gacagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg
1081 tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat
1141 tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc
1201 aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg
1261 ctgcaagacc gcaaggttta gccaatccca taaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct
1321 gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa
1381 tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttgca acacccgaag
1441 tcggtgaggt Aacctttatg gagccagccg ccgaaggtgg ggcaga


B. pumilus es una bacteria comn en el suelo, entre otros ambientes (e.g. plantas, alimentos
fermentados, sedimentos marinos, etc) (Priest 1993), que presenta actividad antagonista frente a
hongos, y que ha sido usada ampliamente como agente natural de control biolgico para proteger
cultivos de plagas frente hongos patgenos(Choudhary and Johri 2008). B. pumilus no est
considerada como una especie entomopatgena clsica como B. thuringiensis, o B. sphaericus.
Adems, tampoco es considerada como una bacteria patgena para vertebrados; sin embargo, la
produccin de hemolisinas (determinantes en la virulencia bacteriana) por parte de algunas
cepas, ha llevado a considerar a esta especie como un patgeno oportunista (Ouoba et al. 2004).











CAPITULO 2
























RESULTADOS: CAPI TULO 2 | 107

Despus del aislamiento de 115 cepas bacterianas y de la realizacin del rastreo llevado a cabo
para seleccionar una cepa perteneciente al gnero Bacillus que posea toxicidad frente a C.
capitata, se obtuvo una cepa patgena frente a larvas de primer estadio de este insecto. Esta
nueva cepa fue identificada como perteneciente a la especie B. pumilus. La entomopatogenicidad
de B. pumilus 15.1 se revela solamente cuando las placas en las que se llevan a cabo los
bioensayos son sometidos a un tratamiento a bajas temperaturas (4C). Debido a que tanto la
toxicidad de esta cepa, como la manera de revelarla no han sido descritas anteriormente, se
llevaron a cabo varios experimentos con el objetivo de caracterizar la patogenicidad de B.
pumilus 15.1 frente a larvas de C. capitata.

De esta manera, este captulo contiene ensayos de toxicidad llevados a cabo para determinar si la
entomopatogenicidad de la cepa 15.1 es una caracterstica nica de esta cepa, si las clulas
vegetativas de la cepa 15.1 tambin son patgenas, o en que fraccin del cultivo reside la
toxicidad. Adems, tambin se describen experimentos realizados para conocer cules son las
condiciones ptimas de exposicin a bajas temperaturas para obtener mayor mortalidad de larvas
de C. capitata.


4.4 CARACTERIZACIN DE LA RELACIN DE LA TOXICIDAD DE B. PUMI LUS 15.1 CON
RESPECTO AL FRO
Segn los resultados mostrados anteriormente, la toxicidad de B. pumilus 15.1 frente a larvas de
la mosca de la fruta del Mediterrneo se manifiesta nicamente cuando las placas de bioensayo
se someten a bajas temperaturas. Despus de la identificacin de la cepa 15.1 como perteneciente
a la especie B. pumilus mediante secuenciacin del gen 16S rRNA, y con el objetivo de
determinar si ste efecto de la temperatura en la toxicidad es una caracterstica de la cepa 15.1 o
es un comportamiento general de la especie B. pumilus se llev a cabo un bioensayo con la cepa
15.1, y las cepas de B. pumilus 15 y 17, proporcionadas por el laboratorio de la Dra. Calvo (Uad
2007) (Instituto del Agua, Universidad de Granada), y nombradas en este trabajo de ahora en
adelante como M1 y M2 respectivamente, ya que fueron aisladas de ambientes marinos. Para
ello, se realiz un ensayo de toxicidad en dos condiciones distintas. Un conjunto de placas se
108 | CAPTULO 2
utiliz para hacer un bioensayo inmediatamente despus de mezclar la dieta de larvas con cada
uno de los cultivos bacterianos, mientras que otro conjunto de placas se mantuvo durante 96
horas a 4C antes de iniciar el bioensayo.

Con el objeto de acelerar el efecto txico de la cepa B. pumilus 15.1 en larvas de primer estadio
de C. capitata, los cultivos usados en los bioensayos se concentraron 10 veces mediante
liofilizacin. De esta manera, al concentrar cualquier factor de virulencia sintetizado por la
bacteria se esperaba una mayor toxicidad de la bacteria. Una consecuencia directa de esta
modificacin fue que en 4 das se alcanz aproximadamente el 50% de la mortalidad de larvas de
una placa de bioensayo, en lugar de los 10 das necesarios cuando el cultivo no estaba
concentrado, tal y como se mostr previamente (Fig. 11). La introduccin de esta variacin en la
metodologa se aplic en todos los experimentos posteriores, a no ser que se especifique lo
contrario.

Los resultados de los ensayos de toxicidad de las tres cepas de B. pumilus se muestran en la
Figura 14. Al final del experimento (15 das despus del inicio), se obtuvo un alto porcentaje de
mortalidad en las placas de aquellos bioensayos con B. pumilus 15.1 que permanecieron 96 horas
a 4C (79,17% 15,79), mientras que en las placas que no fueron sometidas al tratamiento de
fro se obtuvo una baja toxicidad (33,63% 28,63) (Fig. 14). La toxicidad de las cepas B.
pumilus M1 y M2 no super el 40% en ninguna de las condiciones ensayadas (con o sin frio), 15
das despus de haber iniciado el bioensayo; este efecto se compar con la mortalidad causada
por el medio T3 (control negativo), mediante un ANOVA de una va, y no se registraron
diferencias significativas (F
1, 5
= 0,84; P = 0,59) entre la mortalidad en T3 (medio sin bacterias) y
las cepas M1 y M2.

La mortalidad causada por B. pumilus 15.1 en larvas de primer estado de C. capitata se compar
con la mortalidad de los tres controles negativos, las cepas M1, M2 y el medio T3, registrndose
diferencias significativas (F
1, 7
= 4,31; P = 0,005) (Fig. 14). Adems, los valores de mortalidad
causada por la cepa 15.1 qued clasificado en un grupo donde slo se incluy este tratamiento (P
< 0,05). Este resultado sugiere que la toxicidad de la cepa B. pumilus 15.1 es una caracterstica
propia de esta cepa y no una caracterstica compartida con otras cepas pertenecientes a la especie
RESULTADOS: CAPI TULO 2 | 109
B. pumilus. Debido a este resultado, las cepas M1 y M2 se incluyeron en los experimentos
posteriores de este trabajo como controles negativos.


0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Bp 15.1 Bp M1 Bp M2 T3 Bp 15.1 Bp M1 Bp M2 T3
%

m
o
r
t
a
l
i
d
a
d


Figura 14. Porcentaje de mortalidad de larvas de primer estadio de C. capitata causada por cultivos de B. pumilus
15.1, B. pumilus M1, B. pumilus M2 y medio T3 (control sin bacterias) usados inmediatamente despus del
crecimiento bacteriano (0 horas a 4C) o mantenidos en la placa de bioensayo mezclado con la dieta de larva durante
96 horas a 4C. Las barras blancas muestran la mortalidad despus de 4 das del inicio del bioensayo; las barras
grises la mortalidad despus de 10 das del inicio del bioensayo; y las barras negras la mortalidad despus de 15 das
del inicio del bioensayo. Las diferencias de la mortalidad registrada despus de 15 das de inicio del experimento
entre B. pumilus 15.1 y los controles se evaluaron mediante ANOVA (P < 0,01). La misma letra sobre las barras
indica que no existen diferencias significativas segn la prueba de rango estudentizado de Tukey. Bp = B. pumilus.


Adems, como ya se mencion anteriormente, la mayora de larvas que fueron tratadas con B.
pumilus 15.1 mostraron necrosis en todo su cuerpo (Fig. 15), que se increment conforme
transcurra el tiempo desde el inicio del bioensayo.

a
a
a
b
a
a
a
a
0 horas a 4C 96 horas a 4C
110 | CAPTULO 2


Fig. 15. Detalle de larvas necrosadas de C. capitata como efecto de la toxicidad de B. pumilus 15.1


4.5 ANLISIS DE LA TOXICIDAD DE LAS CLULAS VEGETATIVAS DE B. PUMILUS 15.1
B. pumilus, como todas las especies pertenecientes al gnero Bacillus, es un microorganismo
esporulante que, dependiendo de la disponibilidad de nutrientes en el medio donde se encuentre,
puede presentar dos formas celulares diferentes, la clula vegetativa y espora. Hasta el momento,
los resultados de este trabajo sugieren que el efecto entomopatgeno de B. pumilus 15.1 frente a
larvas de C. capitata se manifiesta en cultivos esporulados, y no se dispone de informacin sobre
si la fase vegetativa de la bacteria tambin es activa frente larvas de C. capitata. Con el objetivo
de caracterizar la toxicidad de la cepa 15.1 en C. capitata, se prob si las clulas vegetativas
presentan la misma toxicidad frente a larvas, o si el/los factor/es de virulencia son sintetizados
nicamente durante el proceso de esporulacin.

Con este propsito, se realiz un bioensayo con un cultivo de clulas vegetativas liofilizado, (que
contena 8 x 10
5
), tratado bajo las mismas condiciones para obtener la mxima mortalidad con un
cultivo esporulado (10x y mantenido 96 horas a 4C) en larvas de C. capitata. Como controles se
incluyeron las cepas B. pumilus M1, M2 y medio LB.
En este experimento la mortalidad se registr 15 das despus del inicio del experimento, para
descartar que la expresin de la toxicidad se pueda manifestar de manera tarda en cultivos
vegetativos en comparacin con cultivos esporulados. La mortalidad obtenida con un cultivo de
RESULTADOS: CAPI TULO 2 | 111
10-12 horas de B. pumilus 15.1, tratado a 4C, despus de 15 das no fueron significativamente
diferentes al compararse con las cepas control y el medio LB (F
1, 13
= 1,045; P = 0,436) (Fig. 16).
Al final del experimento, la cepa 15.1 no super el 30% de la mortalidad, y fue menor a la
mortalidad causada por las clulas vegetativas de B. pumilus M2 (Fig. 16). Este resultado parece
indicar que las clulas vegetativas no son activas frente a larvas de primer estadio de la mosca de
la fruta del Mediterrneo, lo cual sugiere que la toxicidad est relacionada con el proceso de
esporulacin, y que la incubacin de las clulas vegetativas a bajas temperaturas no resulta en un
cultivo txico para C. capitata.


0
20
40
60
80
100
Bp 15.1 Bp M1 Bp M2 LB
%

m
o
r
t
a
l
i
d
a
d


Figura 16. Porcentaje de mortalidad de larvas de primer estadio de C. capitata causada por cultivos vegetativos de
B. pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. pumilus M2 y medio LB (control sin bacterias) concentrados 10 veces y
mantenidos durante 96 horas a 4C. Barras blancas, mortalidad despus de 4 das del inicio del bioensayo; barras
grises, mortalidad despus de 10 das del inicio del bioensayo; barras negras, mortalidad despus de 15 das del
inicio del bioensayo. Las diferencias entre B. pumilus 15.1 y los controles se evaluaron por ANOVA con la
mortalidad a los 15 das (P > 0,05).


4.6 DETERMINACIN DE LA FRACCIN TXICA DEL CULTIVO DE B. PUMI LUS 15.1
Con el propsito de determinar en qu fraccin del cultivo esporulado de la cepa B. pumilus 15.1
reside la toxicidad frente a larvas de C. capitata, se llevaron a cabo tres bioensayos, uno usando
112 | CAPTULO 2
la fraccin sobrenadante, otro usando la fraccin sedimento (esporas), y otro usando una mezcla
que contena las fracciones sobrenadante y sedimento.
Antes de ser utilizados en los bioensayos, los sobrenadantes se congelaron, se liofilizaron y se
resuspendieron en H
2
O destilada estril en una proporcin 1/10 de su volumen original. Por otro
lado, los sedimentos se resuspendieron en 5 ml de H
2
O destilada estril, concentrndolos 10
veces, y se conservaron a 4C hasta ser usados en los bioensayos. Cada fraccin mezclada con la
dieta de larvas fue mantenida durante 96 horas a 4C antes de iniciar los bioensayos con larvas
de primer estadio.

Los resultados muestran que, al final del bioensayo (15 das despus de haberlo iniciado)
ninguna de las fracciones ensayadas (sedimento o sobrenadante) exhibe toxicidad significativa
comparadas entre s o comparadas con los controles (F
1, 28
= 2,254; P = 0,071) (Fig. 17).

0
20
40
60
80
100
Bp 15.1 Bp M1 Bp M2 Bp 15.1* T3
%

m
o
r
t
a
l
i
d
a
d

Figura 17. Porcentaje de mortalidad acumulativa de larvas de primer estadio de C. capitata 15 das despus del
inicio del bioensayo, causada por fracciones separadas de cultivos de B. pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. pumilus
M2, un cultivo reconstituido de la cepa 15.1 (mezcla de las fracciones sedimento y sobrenadante) (Bp 15.1*) y
medio T3 (control sin bacterias) mantenidos durante 96 horas a 4C. Las barras blancas muestran la mortalidad
obtenida con los sobrenadantes de los cultivos; las barras negras muestran mortalidad con los sedimentos; la barra
gris oscuro muestra la mortalidad de un cultivo reconstituido; la barra gris claro muestra mortalidad con medio T3.
El cultivo reconstituido exhibi toxicidad significativa (P < 0,05) comparada con las fracciones sobrenadante,
a
a
a
b
a
a
a
a
RESULTADOS: CAPI TULO 2 | 113
sedimento, cepas control, y medio T3. La misma letra sobre las barras indica que no existen diferencias
significativas. Bp = B. pumilus.

Adems, los porcentajes de mortalidad causados son menores, 28,58 % ( 10,70) para
sobrenadante, y 22,19 % ( 10,41) para sedimento de B. pumilus 15.1 que los producidos por un
cultivo completo de esta cepa bacteriana (93,61 % 1,94 b) (Fig. 14). El cultivo reconstituido
(mezcla de las fracciones sobrenadante y sedimento) mostr una toxicidad significativa
comparada con ambas fracciones y con las cepas control, segn la prueba del rango
estudentizado de Tukey, clasificndolo en un grupo en el que solamente se incluy este
tratamiento. Este resultado sugiere que ambas fracciones estn involucradas en la toxicidad,
hecho que se confirma con el restablecimiento de la toxicidad al mezclar las dos fracciones del
cultivo previamente separadas.


4.7 ANLISIS DE LA GERMINACIN DE ESPORAS EN LA DIETA DE LARVAS DE
C. CAPI TATA
Debido a que los cultivos esporulados de B. pumilus 15.1 requieren ser mantenidos por un
periodo mnimo de 96 horas a 4C, cuando son incubados junto con la dieta de larvas, para
mostrar toxicidad (Fig. 14), es posible que este ocurriendo en la dieta de las larvas algn tipo de
transformacin necesaria para producir patogenicidad en larvas de C. capitata. Las esporas son
formas resistentes de vida, caracterizadas por la falta de actividad metablica (Setlow 1992), y
dado que se ha demostrado que se requiere su presencia (sedimento) para causar toxicidad en C.
capitata (Fig. 17), se realiz la hiptesis de que las esporas podran germinar en la dieta de las
larvas, y ser esta germinacin la responsable de la toxicidad. De esta manera, el/los factor/es de
virulencia sera/n producido/s durante el proceso de germinacin de las esporas en contacto con
la dieta de larvas.

Aunque a priori la dieta utilizada en los bioensayos con larvas no es un ambiente apropiado para
la germinacin bacteriana, debido a su bajo pH (pH 3,0) alta concentracin de solutos (sacarosa
242 mM), junto con la baja temperatura a la que se incuba la placa de bioensayo (4C) se realiz
un estudio para descartar por completo la posibilidad de que B. pumilus 15.1 germinara en estas
condiciones. Para este anlisis, se prepar una versin lquida de la dieta usada en los bioensayos
114 | CAPTULO 2
con larvas, sin incluir el salvado de trigo ni el agar. Cultivos liofilizados de B. pumilus 15.1 y B.
pumilus M1 (control) se resuspendieron en la dieta lquida a la misma proporcin cultivo: dieta
(1:5 (v/v)) usada en los bioensayos estndar. Posteriormente, la suspensin bacteriana se dividi
en dos alcuotas, una de ellas se incub a 4C, para reproducir las condiciones necesarias en las
que se manifiesta la toxicidad, y la otra a 25C.

Se determin el nmero total de clulas viables y de esporas cada 24 horas, mediante siembra de
diluciones seriadas (realizadas en medio M8) de la suspensin original en placas de LB. Las
esporas se cuantificaron sometiendo 100 l de una fraccin alcuota a un tratamiento de calor a
80C durante 10 min en un bao de agua, con el objetivo de eliminar todas aquellas clulas que
no fueran esporas. A partir de estos datos, el nmero de clulas vegetativas se calcul para cada
uno de los puntos a lo largo del tiempo mediante diferencia entre el nmero total de clulas y el
nmero de esporas.

El nmero de esporas de B. pumilus 15.1 se mantuvo constante tanto a 4C (Fig. 18A) como a
25C (Fig. 18B) durante el experimento, indicando que no ocurre germinacin de las esporas en
la dieta de larvas de C. capitata a ninguna de las temperaturas ensayadas. Inesperadamente, el
comportamiento de la cepa control, B. pumilus M1, fue diferente; cuando esta cepa fue incubada
a 25C, el nmero de esporas y clulas totales decreci a lo largo del tiempo. Este descenso en el
nmero de clulas podra estar debido a la germinacin y posterior muerte de clulas vegetativas
debido a la hostilidad del medio por su bajo pH y su alta concentracin de solutos.
Este resultado parece indicar que la toxicidad de la cepa B. pumilus 15.1 se expresa durante el
proceso de esporulacin, y que ni las clulas vegetativas ni el proceso de germinacin de esporas
estn involucrados en la patogenicidad de esta cepa frente a larvas de C. capitata.





RESULTADOS: CAPI TULO 2 | 115


Figura 18. Nmero de clulas viables (smbolos cerrados) y esporas (smbolos abiertos) de B. pumilus 15.1
(crculos) y B. pumilus M1 (cuadrados) a lo largo del tiempo, en una versin lquida de la dieta de larvas. El conteo
de clulas se realiz en suspensiones bacterianas mantenidas a dos temperaturas diferentes, 4C (A) y 25C (B).


4.8 CRECIMIENTO DE B. PUMILUS 15.1 EN DIFERENTES CONDICIONES DE PH Y
CONCENTRACIN DE SOLUTOS
Una vez analizada la germinacin de esporas en dieta de larvas, se estudi la capacidad de
crecimiento bacteriano de la cepa 15.1 en distintos medios con diferentes condiciones de pH y
concentracin de solutos. El objetivo fue demostrar, bajo otro procedimiento, si la alta
concentracin de solutos en el medio y el bajo pH constituyen un medio adecuado para el
116 | CAPTULO 2
crecimiento de B. pumilus 15.1. Para ello, un preinculo esporulado en medio T3 fue sometido
durante 10 minutos a 80C. Luego se realiz una dilucin 1:100 en 50 ml en cada uno de los
medios a probar. Basndose en los ingredientes de la dieta usada en los bioensayos con larvas, se
realizaron cuatro medios diferentes. Las cepas bacterianas incluidas en este experimento
crecieron en los siguientes medios:
Sacarosa 25 mM, Extracto de Levadura 10% (p/v), pH 3,0
Sacarosa 25 mM, Extracto de Levadura 10% (p/v), pH 7,0
Sacarosa 242 mM, Extracto de Levadura 10% (p/v), pH 3,0
Sacarosa 242 mM, Extracto de Levadura 10% (p/v), pH 7,0
Cultivos de B. pumilus 15.1, B. pumilus M1 y B. pumilus M2 se mantuvieron durante 72 horas a
240 rpm y 30C en estos cuatro medios. Peridicamente se determin la turbidez del cultivo
mediante la medida de la densidad ptica a 600 nm.

La representacin grfica de la dinmica de crecimiento de B. pumilus 15.1 en los diferentes
medios con variacin en la concentracin de solutos (sacarosa) y pH se muestra en la Figura 19.
Este anlisis revel, que el crecimiento de la cepa 15.1, al igual que sus controles (M1 y M2), es
dependiente del pH e independiente de la concentracin de sacarosa presente en el medio.

En las tres cepas bacterianas ensayadas, las clulas cultivadas en medios con pH 7,0 mostraron
las fases caractersticas de crecimiento bacteriano (fase de latencia, de crecimiento exponencial,
y estacionaria); mientras que los cultivos realizados en medios con pH 3,0 nunca exhibieron
clara evidencia de divisin celular (Fig. 19). En los cultivos de B. pumilus 15.1 (Fig. 19A) y M2
(Fig. 19C) a pH 7,0, la fase inicial o fase de latencia comprendi desde el inicio del cultivo hasta
las 7 horas.



RESULTADOS: CAPI TULO 2 | 117
0.01
0.10
1.00
10.00
0 12 24 36 48 60 72
L
o
g

(
D
O
6
0
0

n
m
)
Tiempo (horas)


0.01
0.10
1.00
10.00
0 12 24 36 48 60 72
L
o
g

(
D
O
6
0
0

n
m
)
Tiempo (horas)

B
A
118 | CAPTULO 2
0.01
0.10
1.00
10.00
0 12 24 36 48 60 72
L
o
g

(
D
O
6
0
0

n
m
)
Tiempo (horas)


Figura 19. Dinmica de crecimiento de B. pumilus 15.1 (A), B. pumilus M1 (B), y B. pumilus M2 (C) en diferentes
medios. Sacarosa 242 mM pH 7,0: crculos abiertos; Sacarosa 25 mM pH 7,0: crculos cerrados; Sacarosa 25 mM
pH 3,0: cuadrados abiertos; Sacarosa 242 mM pH 3,0: cuadrados cerrados. Todos los medios incluyeron extracto de
levadura 10% (p/v).


La fase de crecimiento exponencial comprendi desde las 7 hasta las 13 horas. Transcurrido este
tiempo, el cultivo entr en fase estacionaria, ya que densidad ptica del cultivo se estabiliz. En
el caso de los cultivos de B. pumilus M1 a pH 7,0 (Fig. 19B), la fase de crecimiento exponencial
exhibi un retraso significativo comparado con las otras dos cepas, comenzando 13 horas
despus del inicio de la curva de crecimiento.

Estos resultados sugieren que el pH del medio es un factor determinante en el crecimiento de B.
pumilus, en comparacin con la concentracin de solutos. Adems, esto corrobora el hecho de
que las condiciones presentes en las placas de los bioensayos con larvas (pH 3,0; 242 mM de
sacarosa), no representan un ambiente adecuado para la divisin celular (Fig. 18), principalmente
debido a su bajo pH.

C
RESULTADOS: CAPI TULO 2 | 119
4.9 DEPENDENCIA DE LA ENTOMOPATOGENICIDAD DE B. PUMILUS 15.1 CON LA
INCUBACIN EN FRO
Una vez descartada la hiptesis de la germinacin de esporas en la dieta de los bioensayos, se
decidi probar si el proceso de activacin del factor de virulencia de B. pumilus 15.1 en fro es
independiente del contacto con la dieta de larvas. Para ello, en lugar de incubar los cultivos
esporulados dentro de la placa de los bioensayos, mezclados con la dieta, se incubaron los
cultivos durante en los matraces de crecimiento a 4C.

Despus de exponer los cultivos esporulados a 4C, fueron liofilizados, concentrados 10 veces,
mezclados con la dieta de larvas y usados directamente en los bioensayos. En estos experimentos
las larvas fueron colocadas en la dieta, tan pronto como la placa de bioensayo fue preparada. Este
cambio en la metodologa de los bioensayos tambin se introdujo en los experimentos
posteriores, a menos que se especifique lo contrario. Como controles se usaron cultivos de las
cepas ensayadas sin exposicin al frio, incluido el medio de T3.
Como control positivo del experimento se usaron las condiciones ensayadas anteriormente, es
decir cultivos mezclados con dieta de larvas y posteriormente expuestos a 4C (a 0 y 96 horas).
En este caso, los cultivos tambin se concentraron 10 veces mediante liofilizacin.

Los porcentajes de mortalidad obtenidos se detallan en la Tabla 7. Despus de 10 das del inicio
del bioensayo, los cultivos de B. pumilus 15.1 que fueron mantenidos durante 96 horas a 4C
causaron mayor mortalidad en larvas de C. capitata (F
1, 31
= 8,041; P = 0,001), tanto los que
fueron incubados dentro del matraz de crecimiento, como los que fueron mezclados con la dieta
de larvas antes de ser tratados con frio, alcanzando 93,61% ( 1,94) y 67,92% ( 12,19)
respectivamente, mientras los cultivos de los controles B. pumilus M1, B. pumilus M2 y medio
T3 no sobrepasaron 37,50% ( 4,17) de mortalidad.

Estos resultados sugieren que la activacin de la toxicidad es independiente del contacto con la
dieta de larvas; y adems confirman que la incubacin a 4C es necesaria para revelar la
toxicidad de B. pumilus 15.1.


120 | CAPTULO 2
Tabla 7. Porcentaje de mortalidad de larvas de C. capitata, despus de 10 das del inicio del experimento, causada
por cultivos de tres cepas de Bacillus mantenidos 0 o 96 horas a 4C.
Cepa bacteriana
Tiempo de
exposicin (horas)
Mortalidad (%)
a

Cultivo Cultivo + dieta

B. pumilus 15.1 0 22,92 0,00 b 16,37 14,45 a
96 93,61 1,94 c 67,92 12,19 c

B. pumilus M1 0 16,67 2,08 a 6,25 0,00 a
96 37,50 4,17 b 21,28 0,00 b

B. pumilus M2 0 8,29 1,04 a 16,67 4,25 a
96 21,88 4,44 b 37,50 2,90 b

Medio T3 0 11,11 0,00 a 8,61 4,44 a
96 9,25 2,98 a 15,09 2.,35 a

a
Los cultivos fueron sometidos al tratamiento de fro en los matraces de crecimiento (Cultivo) o en las microplacas
de bioensayo, mezclados con dieta de larvas (Cultivo + dieta). Los valores de mortalidad son las medias las
desviaciones estndar de al menos dos bioensayos diferentes. Los valores de porcentaje de mortalidad seguidos por
la misma letra no son significativamente diferentes. (P < 0,05).


4.10 ESTUDIO DE LA DEPENDENCIA DE LA TOXICIDAD DE B. PUMI LUS 15.1 EN
RELACIN A LA TEMPERATURA
Por el momento se ha demostrado que la patogenicidad de la cepa 15.1 en larvas de C. capitata
se manifiesta despus de incubar los cultivos esporulados a 4C. Con el propsito de establecer
la relacin de la toxicidad con la temperatura de incubacin y determinar la temperatura ptima
de incubacin de los cultivos, se ensayaron otras temperaturas. Con este objetivo se realizaron
bioensayos con cultivos esporulados mantenidos a tres diferentes temperaturas (-20C, 25C y
37C) durante diferentes periodos de tiempo que oscilaron entre 0 y 168 horas, antes de ser
liofilizados, resuspendidos y dispensados en la microplaca de bioensayo de larvas. Este
experimento se llev a cabo con B. pumilus 15.1, y la cepa control M1 (ensayada bajo algunas de
las condiciones ensayadas para la cepa 15.1); adems, se incluy como control positivo de la
toxicidad un cultivo la cepa 15.1 incubado durante 96 horas a 4C.

Los valores de la mortalidad media ( desviacin estndar) de los diferentes tratamientos
despus de 10 das del inicio el experimento se muestran en la Tabla 8 (F
1, 35
= 30,001; P =
0,000). La mortalidad ms alta se registr en los cultivos de la cepa 15.1 mantenidos durante 96
RESULTADOS: CAPI TULO 2 | 121
horas a 4C (88,54% 3,13), seguido de los cultuvos incubados durante 96 horas (84,10 %
2,85) y 168 horas (60,42 % 18,75) a -20C (Tabla 8). La mortalidad alcanzada por los
tratamientos de incubacin a altas temperaturas (25C y 37C) fue mxima a las 48 horas de
incubacin, aunque los valores obtenidos bajo estas condiciones solo alcanzaron el 39,58% (
2,08) y 40,63% ( 1,04) de mortalidad respectivamente (Tabla 8).
Tanto el tratamiento con el cual se ha obtenido mayor toxicidad (96 horas a 4C), como el
control negativo del medio T3 (11,46 % 3,13) se comportaron respecto a lo esperado.


Tabla 8. Porcentaje de mortalidad de larvas de C. capitata, despus de 10 das del inicio del experimento, causada
por cultivos de dos cepas de Bacillus mantenidos bajo distintas temperaturas.
Cepa bacteriana Temperatura (C)
Tiempo de
exposicin (horas)

Mortalidad (%)
a


B. pumilus 15.1 -20 0 22,92 0,00 b
96 84,10 2,85 e
168 60,42 18,75 d

B. pumilus M1 -20 0 16,67 2,08 a
96 30,21 3,12 c
168 16,67 6,25 a

B. pumilus 15.1 25 0 22,92 0,00 b
24 20,83 2,08 a
48 39,58 2,08 d
72 30,21 1,04 c
96 30,21 3,12 c

B. pumilus 15.1 37 0 22,92 0,00 b
24 23,96 3,13 b
48 40,63 1,04 d
72 25,00 0,00 b
96 34,38 1,04 c

B. pumilus 15.1 4 96 88,54 3,13 e

Medio T3 4 96 11,46 3,13 a

a
Los cultivos se mantuvieron a distintas temperaturas durante distintos periodos de incubacin. Se muestran los
valores de mortalidad medios las desviaciones estndar de al menos dos bioensayos. Los valores de porcentaje de
mortalidad seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes. (P < 0.05).


El test de rango estudentizado de Tukey clasific dentro del mismo grupo a los tratamientos de la
cepa 15.1 en el que los cultivos se mantuvieron 96 horas a -20C, y 96 horas a 4C, lo que
122 | CAPTULO 2
sugiere que este periodo de tiempo es tambin vlido para revelar la patogenicidad de B. pumilus
15.1 a -20C.
Estos resultados demuestran que la incubacin de los cultivos esporulados de B. pumilus 15.1 a
bajas temperaturas, ya sea a 4C o a -20C, es necesaria e igualmente efectiva para revelar la
toxicidad de esta cepa en larvas de C. capitata. El tratamiento a altas temperaturas (25C o 37C)
no caus un claro efecto de aumento de la mortalidad en larvas, al compararse con el control
negativo.


4.11 DEPENDENCIA DE LA TOXICIDAD DE B. PUMI LUS 15.1 CON EL TIEMPO DE
EXPOSICIN DE LOS CULTIVOS AL FRO
Los resultados hasta ahora mostrados en este trabajo demuestran que la exposicin del cultivo de
B. pumilus 15.1 a bajas temperaturas es necesaria para revelar la toxicidad de la bacteria. Con el
propsito de establecer la relacin entre la entomopatogenicidad y el tiempo de incubacin de los
cultivos a 4C, as como determinar el tiempo ptimo de incubacin, se realizaron ensayos de
toxicidad en larvas de primer estadio de C. capitata con cultivos mantenidos a esta temperatura
durante diferentes periodos de tiempo.

Despus de exponer los cultivos esporulados durante el tiempo especificado (24, 48, 72, o 168
horas) en los matraces de crecimiento a 4C, fueron liofilizados, concentrados 10 veces,
mezclados con la dieta de larvas y usados en los bioensayos. Como control de este experimento,
se incluyeron cultivos no sometidos a tratamiento de frio a 4C (0 horas).

Los resultados muestran que la toxicidad de la cepa 15.1 se incrementa al aumentar el tiempo de
incubacin de los cultivos a 4C (F
1, 41
= 18,464; P = 0,000) (Tabla 9). Al final del experimento,
B. pumilus 15.1 mantenida durante 96 horas a 4C caus mayor mortalidad, siendo este tiempo
de incubacin el ptimo para causar la mayor mortalidad en larvas de primer estadio de C.
capitata (Tabla 9). La mortalidad causada por los cultivos de la cepa 15.1 incubados durante 168
horas decreci 26,94% (en promedio) al compararse con la mortalidad de los cultivos incubados
durante 96 horas, sugiriendo que el factor de virulencia responsable de la toxicidad puede estar
RESULTADOS: CAPI TULO 2 | 123
sufriendo un proceso de transformacin o degradacin cuando est expuesto por ms de 96 horas
a 4C.


Tabla 9. Porcentaje de mortalidad de larvas de C. capitata, despus de 10 das del inicio del experimento, causada
por cultivos de tres cepas de Bacillus mantenidos bajo diferentes intervalos de tiempo a 4C.
Cepa bacteriana
Tiempo de
exposicin (horas)
Mortalidad (%)
a

B. pumilus 15.1 0 22,92 0,00 b
24 15,63 1,04 a
48 21,88 7,29 b
72 39,58 4,17 c
96 93,61 1,94 d
168 66,67 10,42 c

B. pumilus M1 0 16,67 2,08 a
24 11,46 1,04 a
48 11,46 3,13 a
72 12,50 2,08 a
96 37,50 4,17 b
168 17,71 1,04 a

B. pumilus M2 0 8,29 1,04 a
24 11,46 3,13 a
48 16,67 4,17 a
72 16,67 4,17 a
96 21,88 4,44 b

Medio T3 0 11,11 0,00 a
24 7,29 5,21 a
48 7,83 0,68 a
72 6,55 1,79 a
96 9,25 2,98 a

a
Los valores de mortalidad son las medias las desviaciones estndar de al menos dos bioensayos diferentes. Los
valores de porcentaje de mortalidad seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes. (P < 0.05).


Adems, se llevaron a cabo correlaciones paramtricas de Pearson con la mortalidad y el tiempo
de exposicin de los cultivos a 4C, para cada una de las cepas analizadas por separado. Este
anlisis mostr que la mortalidad causada por B. pumilus 15.1 en larvas de C. capitata y el
tiempo de incubacin de los cultivos a 4C estn relacionados significativamente (R = 0,644; P =
0.012); adems, por el signo del coeficiente se deduce que la toxicidad de esta cepa aumenta
conforme incrementa el nmero de horas de exposicin al tratamiento con fro. Esto no ocurre en
los controles, ya que no existe una relacin entre la mortalidad producida y el periodo de tiempo
124 | CAPTULO 2
que los cultivos de B. pumilus M1 (R = 0,348; P = 0.267), B. pumilus M2 (R = 0,479; P =
0.161), y medio T3 (R = -0,627; P = 0.627) permanecieron a 4C.
Este resultado indica, como ya se sugiri anteriormente, que la cepa 15.1 exhibe mayor
patogenicidad frente a larvas de la mosca de la fruta del Mediterrneo, cuando el cultivo es
mantenido a bajas temperaturas, en este caso a 4C, y que el aumento de esta toxicidad est
directamente relacionado con el aumento del periodo de incubacin en fro. Por otro lado, el
incremento del tiempo de exposicin a bajas temperaturas en las cepas control no tiene ninguna
relacin con la mortalidad causada por estas, lo que confirma que el fenmeno de aumento de la
toxicidad es caracterstico de la cepa 15.1 y no de la especie B. pumilus.

La prueba de rango estudentizado de Tukey determin que los valores medios de mortalidad de
cultivos incubados durante 96 horas por separado y mezclado con dieta se incluyan dentro del
mismo grupo, al igual que el valor medio de mortalidad del cultivo tratado durante 168 horas
(Tabla 9). El hecho de que estos tres tratamientos anteriormente mencionados estn incluidos
dentro del mismo grupo, sugiere que representan las condiciones en las que la cepa 15.1 produce
mayor mortalidad en larvas de C. capitata


4.12 CONCENTRACIN LETAL MEDIA (LC
50
)
La dosis letal media (LC
50
) y la LC
90
de B. pumilus 15.1 para larvas de primer estadio de C.
capitata se obtuvieron mediante la realizacin de ensayos de toxicidad usando 6 dosis
bacterianas diferentes. Al mismo tiempo tambin se estim la LC
50
y LC
90
de cultivos no tratados
con bajas temperaturas, considerados controles.

Para determinar la LC
50
y la LC
90
, los cultivos esporulados de B. pumilus 15.1 fueron tratados
durante 96 horas a -20C, con el objetivo de activar/ transformar el/los factor/es de virulencia. La
concentracin letal media se estim en unidades formadoras de colonia por mililitro (cfu/ml).
Para el anlisis se utiliz el modelo Probit (Finney 1971) que determin que la LC
50
para la cepa
15.1 es 4,18 x 10
7
cfu/ml, con intervalos de confianza al 95% entre 3,45 x 10
7
y 4,9 x 10
7
cfu/ml;
mientras que la LC
90
se determin en 1,56 x 10
8
cfu/ml, con intervalos de confianza al 95% entre
1,31 x 10
8
y 1,93 x 10
8
cfu/ml. Por otro lado, la LC
50
y LC
90
de los cultivos usados directamente
RESULTADOS: CAPI TULO 2 | 125
en los bioensayos, sin incubacin a baja temperatura se estimaron en 4,66 x 10
10
cfu/ml y 3,7 x
10
13
cfu/ml, respectivamente; estos valores se estimaron usando los datos experimentales de
mortalidad a concentraciones 1x y 10x disponibles.
Comparativamente, el valor de la LC
50
de los cultivos tratados con fro es menor en 3 rdenes de
magnitud que los que no fueron sometidos a este tratamiento; demostrando que se requiere de un
menor nmero de clulas bacterianas de la cepa 15.1 tratada con fro para causar la muerte en la
mitad de la poblacin de larvas de C. capitata.

Los valores de la mortalidad media registrada a en funcin del tiempo, a partir de las dos
repeticiones de los bioensayos para calcular la LC
50
y LC
90
, se muestran en la Figura 20. El
incremento de la mortalidad a lo largo del tiempo es bastante conspicuo en todas las
concentraciones ensayadas. Con los datos de la mortalidad probit se realiz un grfico de
dispersin versus el logaritmo de las concentraciones utilizadas en los ensayos de toxicidad
llevados a cabo para calcular la LC
50
, para esto se emple el mtodo de mxima probabilidad
(maximum likelihood) y las predicciones inversas del 95% de los limites de confianza. El modelo
Probit determin que el ajuste obtenido de la regresin lineal (R
2
) es 0,986, lo que sugiere que el
modelo utilizado es el adecuado. La Figura 21 muestra la lnea de regresin estimada en el
anlisis.




126 | CAPTULO 2

Figura 20. Porcentaje de mortalidad a lo largo del tiempo (das) para cada una de las 6 dosis utilizadas en la
determinacin de la concentracin letal media (LC
50
) y medio T3 (control sin bacterias). Crculos cerrados, dosis
20x; crculos abiertos, dosis 10x; cuadrados cerrados, dosis 5x; cuadrados abiertos, dosis 2,5x; tringulos cerrados,
dosis 1,25x; tringulos abiertos, dosis 0,625x; X = medio T3. Los valores representados son las medias de
mortalidad las desviaciones estndar de al menos dos bioensayos diferentes.



Figura 21. Grfico de dispersin Dosis (logaritmo) versus mortalidad Probit de la regresin lineal para calcular la
concentracin letal media (LC
50
) de B. pumilus 15.1 en larvas de primer estadio de C. capitata.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
%

m
o
r
t
a
l
i
d
a
d
Tiempo (das)
RESULTADOS: CAPI TULO 2 | 127
4.13 ESTUDIO PRELIMINAR DE LA NATURALEZA DEL FACTOR DE VIRULENCIA DE B.
PUMI LUS 15.1.
La mayora de bacterias entomopatgenas esporulantes Gram-positivas expresan una gran
variedad de factores de virulencia que utilizan para invadir, infectar y finalmente matar a su
insecto hospedador (de Maagd et al. 2003). La mayora de estos factores de virulencia son de
naturaleza proteica, por lo que decidi realizar una serie de estudios para determinar la
naturaleza del factor de virulencia de B. pumilus 15.1 causante de la toxicidad en larvas de C.
capitata, evaluando la posibilidad de ste pudiera ser de naturaleza proteica. Para ello, en primer
lugar se ensay el efecto que tenan la accin de varias proteasas sobre los cultivos esporulados
de la cepa 15.1, en relacin a la toxicidad frente C. capitata. Los cultivos fueron mantenidos
durante 96 horas a 4C y posteriormente tratados con proteasas antes de ser usados en
bioensayos con larvas de primer estadio.

Se ensay la accin de tres proteasas: tripsina (2 mg/ml), pepsina (2 mg/ml), y proteasa de B.
subtilis (20 l/ml); y adems tambin se prob la accin de una lipasa (2 mg/ml). Las proteasas y
la lipasa se dejaron actuar a 37C durante una hora. Posteriormente, todos los cultivos se
liofilizaron y se bioensayaron. Como controles del experimento se incluy un cultivo de B.
pumilus 15.1 incubado a 37C durante 1 hora sin la presencia de proteasas, otro cultivo que no se
someti a tratamiento alguno (control positivo) y medio T3.

Paralelamente se llev a cabo otro bioensayo, con el mismo objetivo de probar si el factor de
virulencia causante de la toxicidad es de naturaleza proteica. Este bioensayo consisti en un
cultivo esporulado de B. pumilus 15.1 mantenido a 4C durante 96 horas y autoclavado por calor
hmedo (121C y una atmsfera de presin). Los resultados de este ensayo se muestran en la
Figura 22 junto con los resultados de los bioensayos con proteasas.

El efecto que cada proteasa tuvo en la entomopatogenicidad de B. pumilus 15.1 se registr 10
das despus del inicio del experimento. El efecto de las enzimas ensayadas en la toxicidad de la
cepa 15.1 fue heterogneo, y present diferencias estadsticas entre tratamientos (F
1, 15
=
130,470; P = 0,000) (Fig. 22). La tripsina y la lipasa redujeron significativamente la mortalidad
(aproximadamente 65% en los dos tratamientos) al compararse con los dems tratamientos (P <
128 | CAPTULO 2
0,05), incluyndose dentro del mismo grupo (segn la prueba del rango estudentizado de Tukey);
sin embargo, tambin fueron significativamente diferentes al cultivo autoclavado de B. pumilus
15.1 y al medio T3 (control negativo) (P < 0,05). La pepsina y la proteasa de B. subtilis tambin
redujeron la mortalidad causada por la cepa 15.1 en larvas de C. capitata en relacin al control
positivo (20% y 40% respectivamente); adems, cada uno de estos tratamientos por separado
mostraron diferencias significativas respecto a los dems tratamientos y los controles incluidos
en el experimento (P < 0,05). Por otro lado, el cultivo de B. pumilus 15.1 tratado con fro y sin
posterior tratamiento enzimtico (control positivo), y el cultivo sometido a 37C durante 1 hora
causaron aproximadamente 90% de mortalidad de la poblacin de larvas al final del bioensayo;
estos dos tratamientos fueron incluidos en el mismo grupo.

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tripsina Pepsina Lipasa P. Bs Autocl. 37C (1h) Bp 15.1
(+)
T3
%

m
o
r
t
a
l
i
d
a
d


Figura 22. Porcentaje de mortalidad de larvas de primer estadio de C. capitata causada por cultivos de B. pumilus
15.1, mantenidos durante 96 horas a 4C y tratados posteriormente con diferentes enzimas. Barras blancas,
mortalidad despus de 4 das del inicio del bioensayo; barras negras, mortalidad despus de 10 das del inicio del
bioensayo. Las diferencias de mortalidad despus de 10 das del inicio del experimento entre los tratamientos y los
controles se evaluaron mediante ANOVA (P < 0,01). La misma letra sobre las barras indica que no existen
Tratamientos
d
e
d
c
a
a
b
e
RESULTADOS: CAPI TULO 2 | 129
diferencias significativas. P.BS = Proteasa de B. subtilis; Autocl. = Autoclavado; Bp 15.1 (+) = B. pumilus 15.1
tratado a 4C durante 96 horas (control positivo).


El resultado de este ensayo sugiere que el factor de virulencia de la cepa 15.1 puede ser de
naturaleza proteica, debido a la reduccin de la toxicidad en los cultivos tratados con tripsina, y a
la casi total prdida de la patogenicidad en el cultivo autoclavado. La reduccin de la toxicidad
de B. pumilus 15.1 al ser sometido a la accin de la lipasa, es un resultado sorprendente y podra
indicar (i) que el factor de virulencia consiste en un sistema binario en el que tambin est
presente un lpido, o (ii) que en el mecanismo de accin del factor de virulencia hay molculas
de naturaleza lipdica implicadas.

















CAPITULO 3






















RESULTADOS: CAPI TULO 3 | 133

Los ensayos descritos hasta el momento demuestran que B. pumilus 15.1 es patgena para larvas
de primer estadio de C. capitata; sin embargo, hasta el momento no existe informacin
disponible sobre si esta cepa bacteriana posee propiedades txicas frente a otros estadios del
ciclo biolgico de la mosca de la fruta del Mediterrneo. Este captulo contiene los ensayos de
toxicidad llevados a cabo frente a adultos, larvas de tercer estadio, pupas y huevos de C.
capitata, realizados con el objetivo de probar el efecto de la cepa 15.1. Adems, tambin se
describen experimentos realizados en otros modelos de bioensayo utilizando fruta, un modelo
ms cercano a la realidad que los bioensayos realizados con dieta artificial.

La mayora de enemigos naturales utilizados como agentes de control biolgico frente a plagas
de insectos son activos solamente frente a los estadios tempranos de desarrollo de estas especies,
y solo en ciertos casos son tambin patgenos para adultos (Scholte et al. 2004). Lo mismo
ocurre con las toxinas Cry, las cuales suelen ser activas para los estadios larvarios, y tener una
toxicidad reducida o no ser txica en absoluto para los adultos (Schnepf and Whiteley 1985). Por
esto, se consider indispensable analizar la toxicidad de B. pumilus 15.1 frente a adultos de C.
capitata.
Por otro lado, durante tres de sus estadios de desarrollo, huevos, larvas de tercer estadio y pupas,
la mosca de la fruta del Mediterrneo no se alimenta, por lo que ensayar la toxicidad en estos
estadios implica probar la hiptesis de que la toxicidad de B. pumilus 15.1 es causada por
infeccin tpica, como se ha reportado para otras bacterias entomopatgenas (Watson and
Petersen 1991), y no por ingestin de la bacteria. De esta manera, si la cepa 15.1 no es patgena
frente a estos tres estadios del ciclo biolgico de C. capitata, se descartara la posibilidad de que
la toxicidad se deba al contacto con la bacteria.


4.14 ESTUDIO DE LA PATOGENICIDAD DE B. PUMI LUS 15.1 EN ADULTOS DE C. CAPITATA
El efecto de B. pumilus 15.1 en adultos de C. capitata se ensay mediante alimentacin ad
libitum. En este tipo de ensayos las moscas adultas de C. capitata tuvieron acceso libre al
alimento, permitindoles autorregular el consumo del mismo de acuerdo a sus necesidades
biolgicas. Se utilizaron dos procedimientos distintos para realizar estos ensayos. Con el primer
134 | CAPTULO 3
procedimiento se ensay si un cultivo bacteriano esporulado, y tratado bajo las condiciones con
las que se obtiene mxima mortalidad en larvas, tena algn efecto en adultos de la mosca de la
fruta del Mediterrneo, cuando no se les provey de otra fuente de alimento.

Para ello, los cultivos se mantuvieron durante 96 horas a 4C, y posteriormente se liofilizaron.
Cada lifilo (proveniente de 50 ml de un cultivo esporulado) se coloc en contenedores de
plstico, los cuales a su vez estuvieron dentro de las cajas de plstico donde se realizaron los
experimentos. Adems del lifilo, las moscas fueron provistas de H
2
O destilada, pero no se les
suministr ningn tipo de dieta artificial. Los tratamientos incluidos en este experimento fueron
B. pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. pumilus M2, medio T3 liofilizado (control) y dieta slida
para adultos. La mortalidad de las moscas adultas se registr diariamente.

El porcentaje de mortalidad de cada uno de los tratamientos se muestra en la Tabla 10. La
mortalidad se registr hasta cuatro das despus del inicio del bioensayo, momento en que se
consider finalizado el experimento debido a que el 100% de las moscas alimentadas con lifilos
murieron. El nico grupo de moscas que sobrevivi al cuarto da del ensayo fue el control al que
se le suministr dieta slida; en este grupo no se registr mortalidad alguna.
Este resultado muestra que los adultos de C. capitata no pueden alimentarse del lifilo del
cultivo de que fueron provistas, ya fuese de bacterias o de medio T3. Por lo que, basndose en
los resultados de este bioensayo, no se puede obtener conclusiones acerca de la toxicidad de B.
pumilus 15.1 en adultos, cuando se les permite el libre acceso a las bacterias liofilizadas.


Tabla 10. Mortalidad de adultos de C. capitata a lo largo del tiempo causada por lifilos de tres cepas de Bacillus
ofrecidos ad libitum.
Cepa bacteriana % Mortalidad
1
er
da 2
do
da 3
er
da 4
to
da
B. pumilus 15.1 0,00 23,33 76,67 100,00
B. pumilus M1 0,00 16,67 70,00 100,00
B. pumilus M2 0,00 10,00 76,67 100,00
T3
0,00 30,00 80,00 100,00
Dieta slida para adultos 0,00 0,00 0,00 0,00
RESULTADOS: CAPI TULO 3 | 135

En el segundo procedimiento llevado a cabo para ensayar la toxicidad de B. pumilus 15.1 en
adultos de C. capitata, cultivos esporulados fueron tratados durante 96 horas a 4C, y a
continuacin fueron liofilizados. Seguidamente, el lifilo se mezcl con dieta slida para adultos
en una proporcin 1:1 (p:p). Las moscas adultas fueron provistas de esta mezcla, adems de H
2
O
destilada estril. La mortalidad se registr a lo largo del tiempo hasta el octavo da despus del
inicio del experimento.

La Tabla 11 muestra los porcentajes de mortalidad causados por la mezcla de lifilo con dieta
solida para adultos a partir del segundo da. Al final de los bioensayos, no se produjeron altos
porcentajes de mortalidad, al ser comparados con sus controles (F
1, 9
= 1,168; P = 0,424). La
mezcla de lifilo de B. pumilus 15.1 y dieta mostr un 9,38% de mortalidad al final del
experimento (Tabla 11), siendo el tratamiento bacteriano que mayor toxicidad exhibi en el
ensayo. Sin embargo, los controles de este experimento, la dieta slida y el medio T3 causaron
10% y 3,75% de mortalidad respectivamente (Tabla 11).


Tabla 11. Porcentaje de mortalidad de adultos de C. capitata a lo largo del tiempo, causada por lifilos de tres cepas
de Bacillus mantenidos durante 96 horas a 4C, mezclados con dieta slida, y ofrecidos ad libitum a las moscas.
Cepa bacteriana % Mortalidad ( DE)
2
o
d 3
o
d 4
o
d 5
o
d 6
o
d 7
o
d 8
o
d
B. pumilus 15.1 0,00 0,00 0,00 0,00 1,46 0,21 3,13 0,63 4,79 1,46 8,13 0,63 9,38 1,88
B. pumilus M1 1,25 1,25 1,25 1,25 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 6,25 3,75 8,75 3,75
B. thuringiensis IPS 78/11 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,50 2,50 6,25 3,75 7,50 2,50 8,75 3,75
T3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,50 2,50 2,50 2,50 3,75 1,25
Dieta slida 0,00 0,00 0,00 0,00 3,75 3,75 3,75 3,75 3,75 3,75 10,00 0,00 10,00 0,00


Los ensayos de toxicidad ad libitum para adultos, realizados con lifilos y mezclados con dieta
slida, sugieren que la baja temperatura no incrementa la patogenicidad de B. pumilus 15.1 frente
a adultos de C. capitata, como si ocurre frente a larvas. Con el diseo experimental utilizado se
puede concluir que B. pumilus 15.1 podra estar comportndose como lo hacen otras bacterias
con propiedades insecticidas, ya que es patgena frente a larvas, pero no frente a adultos de su
136 | CAPTULO 3
insecto hospedero. Sin embargo, es recomendable ensayar la toxicidad de la cepa 15.1 frente a
adultos de C. capitata utilizando otros procedimientos experimentales.


4.15 ESTUDIO DE LA PATOGENICIDAD DE B. PUMI LUS 15.1 EN LARVAS DE TERCER
ESTADIO
La patogenicidad de B. pumilus 15.1 se ensay en larvas de tercer estadio de C. capitata. El
tercer estadio es el ltimo del perodo larval de la mosca de la fruta del Mediterrneo, y es en el
cual la larva abandona el fruto, dirigindose al suelo mediante saltos caractersticos que provoca
al encorvar su cuerpo, buscando un lugar donde pupar. Usualmente, los insectos diana son ms
susceptibles a la accin de bacterias entomopatgenas en los primeros estadios de desarrollo
larvario (Schnepf and Whiteley 1985, Keller et al. 1996); sin embargo, en algunos casos la
actividad insecticida se manifiesta en varios o en todos los estadios larvarios de un insecto
(Carroll and Ellar 1993). Hasta el momento, se conoce que B. pumilus 15.1 es patgena
solamente para larvas de primer estadio de la mosca de la fruta del Mediterrneo, por lo que el
objetivo de este experimento fue ensayar la posibilidad de que esta cepa tambin cause toxicidad
al ltimo estadio larvario de C. capitata mediante infeccin tpica; dado que en este estadio
larvario el insecto no se alimenta. Adems, se ensay que, en caso de no ser txica, la presencia
de la cepa 15.1pudiera tener algn efecto en el fitness reproductivo de las moscas.

Para realizar este experimento, cultivos esporulados tratados con el procedimiento estndar para
mostrar toxicidad (96 horas a 4C) se concentraron 5 veces, y posteriormente fueron usados para
rociar tierra previamente esterilizada, y que estaba colocada en las cajas de plstico, donde se
llevaron a cabo los bioensayos. Se utilizaron 100 larvas de tercer estadio por cada tratamiento. Se
registr el nmero total de adultos que emergieron en cada una de las cepas ensayadas, as como
el nmero de machos y hembras por separado. Las moscas adultas recin emergidas fueron
transferidas a nuevas cajas, donde alcanzaron la madurez sexual. Posteriormente, se registr
diariamente, durante los primeros 6 das frtiles de las hembras recin eclosionadas, el nmero
de huevos ovopositados.

RESULTADOS: CAPI TULO 3 | 137
La Figura 23 muestra el porcentaje total de emergencia as como el porcentaje de machos y de
hembras por separado obtenidos en cada uno de los tratamientos. Todos los tratamientos,
incluyendo B. pumilus 15.1 y el control (H
2
O destilada) presentaron valores cercanos al 90% de
emergencia. Usando estos valores se llev a cabo un anlisis de variancia de una va; este
anlisis mostr que no existieron diferencias significativas entre las cepas analizadas y los
controles (F
1, 7
= 0,54; P = 0,981).


0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Bp 15.1 Bp M1 Bp M2 H2O
%


e
c
l
o
s
i

n

Figura 23. Porcentaje de emergencia de adultos de C. capitata a partir de larvas de tercer estadio que estuvieron en
contacto con cultivos de B. pumilus 15.1, B. pumilus M1 y B. pumilus M2 (mantenidos previamente durante 96
horas a 4C), y H
2
O destilada estril (control). Barras blancas, hembras; barras negras, machos. Las diferencias en
porcentaje de emergencia total entre los tratamientos con B. pumilus 15.1 y los controles se evaluaron mediante
ANOVA despus de 15 das del inicio del experimento (P > 0,05). Bp = B. pumilus.


El nmero de hembras emergidas en cada tratamiento, as como el de huevos recogidos se
detallan en la Tabla 12. Con estos datos se calcul el nmero de huevos recogidos por hembra, y
el nmero de huevos recogidos por hembra y da.

H
2
O
138 | CAPTULO 3
Tabla 12. Nmero de hembras emergidas a partir de larvas de tercer estadio tratadas con tres cepas de Bacillus, y
clculo de su capacidad reproductiva.
Cepa bacteriana Hembras Total huevos Huevos por
hembra
Huevos por
hembra/da
B. pumilus 15.1 45,5 3,5 7373,79 567,21 162,03 0,03 27,01 0,01
B. pumilus M1 39,5 9,5 5338,37 1090,63 114,90 0,10 19,07 0,07
B. pumilus M2 41,5 0,5 5247,00 5,00 126,52 1,48 20,92 0,08
H
2
O destilada 45,5 1,5 5070,15 167,15 111,22 0,22 18,29 0,029
Los valores muestran las medias las desviaciones estndar. Las diferencias en el nmero de huevos recogidos
entre los tratamientos con B. pumilus 15.1 y los controles se evaluaron mediante ANOVA (P > 0,05).


El anlisis mostr que no existen diferencias significativas en el nmero de huevos recogidos a
partir de hembras sometidas a los distintos tratamientos (F
1, 7
= 3,145; P = 0,149).
Los resultados de estos ensayos sugieren que las larvas de tercer estadio no son susceptibles a la
actividad insecticida que B. pumilus 15.1 exhibe en estadios ms tempranos de desarrollo de C.
capitata, as como tampoco afecta su desarrollo normal, ni su capacidad reproductiva.


4.16 ESTUDIO DE LA PATOGENICIDAD DE B. PUMI LUS 15.1 EN PUPAS DE C. CAPI TATA
Con el objetivo de continuar con el anlisis de la toxicidad de B. pumilus 15.1 en los diferentes
estadios de C. capitata, se ensay la toxicidad de esta cepa en pupas. Como se mencion
anteriormente, con este experimento se ensay la hiptesis de que la toxicidad estuviera
relacionada con una infeccin tpica. Si el porcentaje de emergencia de adultos provenientes de
pupas tratadas con la cepa 15.1 se redujese, podra interpretarse que B. pumilus 15.1 acta por
contacto y no por ingestin.
Para este experimento los cultivos esporulados (10x) se prepararon siguiendo el procedimiento
estndar. Cinco mililitros de cada cultivo 10x se mezclaron con 200 g de tierra, que estaban en
contenedores de plstico. Posteriormente, se colocaron 200 pupas en cada una de las cajas de
bioensayo y se removi la tierra cuidadosamente para enterrar las pupas. El bioensayo se revis
diariamente durante los 20 das siguientes a su inicio, para registrar el nmero de moscas recin
emergidas. Al final del experimento se calcul el porcentaje de emergencia en cada tratamiento.
Se ensayaron las cepas B. pumilus 15.1, B. pumilus M1 y B. pumilus M2; y se incluyeron dos
RESULTADOS: CAPI TULO 3 | 139
grupos control: uno de pupas mantenidas en tierra homogenizada con H
2
O destilada estril (en el
mismo volumen de los cultivos), y otro grupo en tierra sin contaminar.

Los resultados mostrados en la Figura 24 sugieren que ninguno de los tratamientos redujo el
porcentaje de emergencia de adultos. En todos los tratamientos emergieron aproximadamente el
60% de los adultos, incluyendo los grupos control; por lo que no se registraron diferencias
significativas entre las cepas ensayadas y los controles (F
1, 9
= 0,677; P = 0,637). En todos los
ensayos, alrededor del 40% de las moscas no emergieron, posiblemente debido a factores
asociados a la variacin intrapoblacional intrnseca de las pupas, la manipulacin de las mismas
durante la realizacin del bioensayo, o por las condiciones usadas en el bioensayo.


0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Bp 15.1 Bp M1 Bp M2 H2O Sin trat.
%

m
o
r
t
a
l
i
d
a
d

Figura 24. Porcentaje de emergencia de adultos de C. capitata a partir de pupas tratadas con cultivos de B. pumilus
15.1, B. pumilus M1 y B. pumilus M2 (mantenidos durante 96 horas a 4C) y H
2
O destilada estril (control), y pupas
sin tratar (Sin trat.) (control). Las diferencias entre B. pumilus 15.1 y los controles se evaluaron mediante ANOVA
para el porcentaje de emergencia registrado despus de 20 das de inicio del experimento (P > 0,05). Bp = B.
pumilus. Sin. trat. = control de tierra sin contaminacin bacteriana.



H
2
O
140 | CAPTULO 3
4.17 ESTUDIO DE LA PATOGENICIDAD DE B. PUMI LUS 15.1 EN HUEVOS DE C. CAPI TATA
Para caracterizar la patogenicidad de la cepa B. pumilus 15.1, se llevaron a cabo bioensayos con
huevos de C. capitata. Si la cepa 15.1 afectara al desarrollo y eclosin de los huevos podra
indicar que su toxicidad acta por contacto con los tejidos de estadios tempranos del insecto.
Estos ensayos de toxicidad se realizaron con cultivos esporulados (10x) y tratados con el
procedimiento estndar. En estos experimentos se utilizaron las mismas placas usadas en los
bioensayos con larvas, as como la misma dieta, proporciones y volmenes de dieta y cultivo. En
cada pocillo de la microplaca se colocaron 10 huevos, por lo que se usaron 480 huevos por
tratamiento. El experimento se llevo a cabo por duplicado. La eclosin de los huevos se revis
diariamente, utilizando un estereoscopio, hasta 15 das despus del inicio del experimento.

No se registr la eclosin de huevos en ninguno de los tratamientos ensayados (B. pumilus 15.1,
B. pumilus M1 y B. pumilus M2), incluido el control negativo sin bacterias (medio T3), el cual
tambin fue concentrado 10 veces para su uso en el experimento. La dieta donde se depositaron
los huevos, a la espera de su eclosin, fue inspeccionada detenidamente, encontrando huevos sin
eclosionar sobre la superficie de la misma. Claramente, la metodologa empleada para determinar
la actividad de la cepa 15.1 en huevos de C. capitata no fue adecuada ya que ninguno de los
huevos usados en el ensayo, ni siquiera en el control negativo de toxicidad (medio T3),
eclosion. El procedimiento del bioensayo incluy el uso de un volumen determinado de H
2
O
destilada, que facilit depositar los huevos en los pocillos de la placa. Es posible que dicho
volumen de H
2
O destilada fuera excesivo y la causa por la que, inesperadamente, los huevos no
siguieron su normal desarrollo ontogentico. Otra explicacin para la falta de xito del
experimento haya podido estar asociada a la manipulacin de los huevos o incluso que la
concentracin de sales de los medios de cultivo utilizados (10x) fuera excesivo.
No se pueden obtener conclusiones a partir de los resultados de este experimento, por lo que ser
necesario emplear otros procedimientos en el futuro para ensayar la patogenicidad de B. pumilus
15.1 en huevos de C. capitata.



RESULTADOS: CAPI TULO 3 | 141
4.18 ACTIVIDAD DE B. PUMI LUS 15.1 EN OTROS MODELOS EXPERIMENTALES:
BIOENSAYOS EN FRUTA
Dado que la cepa 15.1 ha mostrado ser activa solamente frente a larvas de primer estadio de C.
capitata, y que gran parte del ciclo de vida de la mosca de la fruta del Mediterrneo se desarrolla
en el interior de frutas, se decidi ensayar la actividad insecticida de B. pumilus 15.1 en fruta.
Este modelo experimental es ms cercano a la realidad, y aade complejidad a los bioensayos,
especialmente si se compara con los bioensayos de contaminacin de dieta artificial para larvas.
Aunque se trata de ensayos parcialmente artificiales, son sin duda una aproximacin a la
situacin natural.

Segn Aluja & Mangan (2008) los bioensayos parcialmente artificiales se clasifican en tres
categoras segn la metodologa empleada: a) cajas o invernaderos que cubren completamente
rboles frutales en el campo, b) ramas de rboles frutales totalmente cubiertas en el campo y c)
experimentos realizados dentro de cajas conteniendo fruta cosechada, y que se desarrollan
normalmente bajo condiciones controladas de laboratorio (aunque tambin puede adaptarse a
condiciones naturales). Debido a la recientemente descrita actividad entomopatgena de B.
pumilus 15.1, se decidi llevar a cabo los bioensayos de tipo C. Se ha comprobado que hembras
de especies polfagas (como C. capitata) criadas en laboratorio, bajo estas condiciones
artificiales, poseen la capacidad de poner huevos dentro de la fruta (Aluja and Mangan 2008).

Los objetivos de esta serie de bioensayos fueron: (i) ensayar diferentes condiciones
experimentales para la realizacin de ensayos en fruta contaminada con la cepa 15.1, y as
establecer la metodologa ms eficaz para ser aplicada en futuros experimentos, y (ii) probar el
efecto larvicida de B. pumilus 15.1 en un modelo experimental ms cercano a las condiciones
naturales.

Para llevar a cabo este tipo de experimentos con B. pumilus 15.1, se parti de un cultivo
esporulado que se incub bajo las condiciones estndar, tras lo cual se concentr 20 veces
mediante liofilizacin. El grado de madurez de la fruta fue homogneo para cada bioensayo. En
los primeros ensayos en fruta se utiliz tierra estril como sustrato para que las larvas pupen; sin
embargo, la tierra fue eliminada en posteriores experimentos debido a que se observ que era
142 | CAPTULO 3
innecesaria. En todos los bioensayos se provey a las moscas adultas de H
2
O destilada estril y
de dieta artificial para adultos. La fruta fue homogneamente cubierta con el cultivo bacteriano
(20x) utilizando un pincel estril. Se coloc una pieza de fruta en cada caja de bioensayo. En
cada ensayo, por cada uno de los tratamientos se utilizaron 5 piezas de frutas, cada una de las
cuales se considero una rplica.

Entre los factores que deben ser controlados adecuadamente en un bioensayo artificial de
ovoposicin est la edad del insecto, que dependiendo de la especie, debera ser 5-6 das (Aluja
and Mangan 2008), por lo que se utilizaron moscas hembras adultas sexualmente maduras de 6
das de edad. El nmero de moscas utilizadas en cada ensayo vari dependiendo del tipo de fruta
ensayada. Tras el tiempo adecuado para el desarrollo de los individuos se revis exhaustivamente
el interior de cada pieza, y se registr el nmero de larvas por pieza de fruta, o se esper el
tiempo suficiente para que las larvas salieran de la fruta, para entonces ser cuantificadas en forma
de pupas (Aluja et al. 2004). Los tratamientos que habitualmente se usaron en este tipo de
experimentos fueron: B. pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. pumilus M2, B. thuringiensis IPS
78/11, y medio T3, como control del experimento.

Se ensayaron cuatro especies (y variedades) hospedadoras distintas de frutas: mangos
(Mangifera indica L., var. lancetilla), nectarinas (Prunus persica nucipersica S., var. venus),
peras (Pyrus communis L., var. limonera) y naranjas (Citrus sinensis L., var. valencia).
En todos los casos, los datos de los conteos de individuos vivos (larvas o pupas) al final de los
bioensayos se transformaron a su raz cuadrada, para normalizar su varianza, y posteriormente
ser analizados mediante ANOVA de una va.


4.18.1 Bioensayos en Mangifera indica
En el primer bioensayo artificial de ovoposicin llevado a cabo en mangos (Mangifera indica L.,
var. lancetilla), se utilizaron 20 hembras adultas grvidas de C. capitata por tratamiento. El
tiempo de exposicin de la fruta a las moscas adultas fue de 4 das. El bioensayo se revis tras 15
das del inicio del experimento.
RESULTADOS: CAPI TULO 3 | 143
Los resultados del bioensayo en mangos se muestran en la Figura 25. No existieron diferencias
significativas en el nmero de individuos vivos registrados entre los tratamientos ensayados. (F
1,
24
= 2,521; P = 0,073). Asimismo, en ninguna de las cajas de bioensayo de B. pumilus M1 se
registraron individuos vivos; mientras que en el control del experimento (medio T3) hubo 17,12
individuos vivos de promedio (Fig. 25).



Figura 25. Nmero de individuos vivos de C. capitata registrados a partir de frutos de mango (Mangifera indica L.,
var. lancetilla), de un bioensayo realizado con 20 hembras ovopositando durante 4 das. La fruta se cubri
completamente con cultivos de B. pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. pumilus M2, B. thuringiensis IPS 78/11 y medio
T3 (control sin bacterias). Las diferencias en el nmero de individuos vivos al final del experimento entre B. pumilus
15.1 y los controles se evaluaron mediante ANOVA (P > 0,05). Bp = B. pumilus; Bt = B. thuringiensis IPS 78/11.


Debido a que el nmero de individuos de la siguiente generacin fue muy bajo en los controles y
en las condiciones ensayadas se realiz un segundo bioensayo de ovoposicin en mangos
utilizando 30 hembras por tratamiento, y al igual que en el primer ensayo con esta fruta, el
tiempo de exposicin a las moscas fue de 4 das. Las frutas se revisaron despus de 15 das del
inicio del bioensayo, en bsqueda de larvas. Transcurrido este tiempo, no se observaron
diferencias en el nmero de larvas encontradas en los ensayos de las distintas cepas bacterianas y
el control del experimento (F
1, 24
= 0,560; P = 0,694), a pesar de que T3 presenta el mayor
nmero de larvas al final del experimento (Fig. 26).

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Bp 15.1 Bp M1 Bp M2 Bt T3
N
o
.

l
a
r
v
a
s

144 | CAPTULO 3

Figura 26. Nmero de individuos vivos de C. capitata registrados a partir de frutos de mango (Mangifera indica L.,
var. lancetilla), de un bioensayo realizado con 30 hembras ovopositando durante 4 das. La fruta se cubri
completamente con cultivos de B. pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. pumilus M2, B. thuringiensis IPS 78/11 y medio
T3 (control sin bacterias). Las diferencias en el nmero de individuos vivos al final del experimento entre B. pumilus
15.1 y los controles se evaluaron mediante ANOVA (P > 0,05). Bp = B. pumilus; Bt = B. thuringiensis IPS 78/11.


Bajo las condiciones experimentales ensayadas en mango, se sugiere que B. pumilus 15.1 no
afecta al desarrollo de los huevos puestos por las hembras de C. capitata. De la misma manera,
se puede afirmar que en las condiciones parcialmente artificiales en las que se llevaron a cabo los
bioensayos, las hembras de la mosca de la fruta del Mediterrneo son atradas por el mango
como hospedero para la ovoposicin, como ocurre en condiciones naturales. La diferencia en el
nmero de individuos vivos registrados en cada tratamiento entre el primero y segundo
bioensayo llevado a cabo en mango, podra explicarse por la procedencia de la fruta utilizada, y
no por la diferencia en el nmero de hembras (10 ms en el segundo experimento). El primer
ensayo se realiz con mangos procedentes de Brasil, mientras que los mangos utilizados en el
segundo bioensayo fueron cultivados en la Costa Tropical de la provincia de Granada (Espaa).
Debido a que su origen es distinto, cabe la posibilidad de que en alguno de los dos casos, la fruta
haya sido sometida a un tratamiento post-cosecha que pueda alterar la atraccin de las hembras a
la misma, o el desarrollo de los huevos depositados.
La Figura 27 muestra un ejemplo de la capacidad de ovoposicin de las hembras de C. capitata
en mango.

0
200
400
600
800
1000
Bp 15.1 Bp M1 Bp M2 Bt T3
N
o
.

l
a
r
v
a
s

RESULTADOS: CAPI TULO 3 | 145


Figura 27. Detalle del agujero de salida de una larva de C. capitata que se desarrollo en el interior de un fruto de
mango (Mangifera indica L., var. lancetilla), utilizado en el bioensayo realizado con 30 hembras ovopositando
durante 4 das durante. La superficie del fruto fue completamente cubierta con medio T3 (control sin bacterias).


4.18.2 Bioensayos en Prunus persica nucipersica
Con respecto a las nectarinas (Prunus persica nucipersica S., var. venus), el primer bioensayo
de ovoposicin en esta fruta se llev a cabo usando 10 hembras adultas grvidas. Las moscas se
mantuvieron durante 4 das en las cajas de bioensayos, tras lo cual fueron eliminadas. Las frutas
fueron revisadas para el conteo de individuos vivos tras 9 das del inicio del experimento. Al
igual que en los ensayos en mangos, no hubo diferencias entre el nmero de individuos vivos
registrados para cada cepa ensayada en el primer bioensayo en nectarinas (F
1, 24
= 0,602; P =
0,665) (Fig. 28).


146 | CAPTULO 3

Figura 28. Nmero de individuos vivos de C. capitata registrados a partir de frutos de nectarinas (Prunus persica
nucipersica S., var. venus), de un bioensayo realizado con 10 hembras ovopositando durante 4 das. La fruta se
cubri completamente con cultivos de B. pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. pumilus M2, B. thuringiensis IPS 78/11 y
medio T3 (control sin bacterias). Las diferencias en el nmero de individuos vivos al final del experimento entre B.
pumilus 15.1 y los controles se evaluaron mediante ANOVA (P > 0,05). Bp = B. pumilus; Bt = B. thuringiensis IPS
78/11.


Con el objeto de disminuir el nmero de individuos de la siguiente generacin, se redujo el
nmero de hembras y el tiempo de exposicin de las nectarinas a las hembras de C. capitata, en
comparacin con el primer bioensayo. As, en el segundo bioensayo en nectarinas, se usaron 5
hembras por tratamiento. El tiempo de exposicin de la fruta a las moscas fue de 29 horas.
Comparativamente, el nmero de individuos vivos registrados en cada tratamiento se redujo en el
segundo ensayo (Fig. 28, 29). La mayor cantidad de individuos vivos se registr en la fruta
tratada con B. pumilus M2 (Fig. 29); sin embargo, en este bioensayo tampoco se observaron
diferencias entre los tratamientos para la tasa de eclosin de larvas (F
1, 24
= 0,861; P = 0,504).


0
100
200
300
400
500
600
Bp 15.1 Bp M1 Bp M2 Bt T3
N
o
.

l
a
r
v
a
s

RESULTADOS: CAPI TULO 3 | 147


Figura 29. Nmero de individuos vivos de C. capitata registrados a partir de frutos de nectarinas (Prunus persica
nucipersica S., var. venus), de un bioensayo realizado con 5 hembras ovopositando durante 29 horas. La fruta se
cubri completamente con cultivos de B. pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. pumilus M2, B. thuringiensis IPS 78/11 y
medio T3 (control sin bacterias). Las diferencias en el nmero de individuos vivos al final del experimento entre B.
pumilus 15.1 y los controles se evaluaron mediante ANOVA (P > 0,05). Bp = B. pumilus; Bt = B. thuringiensis IPS
78/11.


La Figura 30 muestra el corte de un fruto de nectarina utilizado en el primer bioensayo, donde
son visibles huevos depositados por hembras de C. capitata. Junto con los resultados de los dos
bioensayos en nectarina, la Figura 30 pone de manifiesto que, similar a lo que ocurre en mangos,
el hecho de que la fruta est recubierta por bacterias, o por medio T3 (sin bacterias) no afecta a la
atraccin existente por hembras de la mosca de la fruta del Mediterrneo hacia uno de sus
hospedadores naturales. Asimismo, la cepa 15.1 parece no afectar el desarrollo larvario de los
huevos depositados en P. persica nucipersica bajo las condiciones ensayadas.
Las dos condiciones experimentales ensayadas en nectarinas parecen ser adecuadas, para
garantizar el desarrollo larvario dentro de la fruta, y para cuantificar el nmero de individuos
vivos por cada tratamiento; no obstante, el procedimiento utilizado en el segundo grupo de
bioensayos implica reducir el tiempo de realizacin del experimento, lo que resulta beneficioso
desde un punto de vista prctico.


0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Bp 15.1 Bp M1 Bp M2 Bt T3
N
o
.

l
a
r
v
a
s

148 | CAPTULO 3

Figura 30. Vista interior (seccin transversal) de un fruto de nectarina (Prunus persica nucipersica S., var. venus)
utilizado en el bioensayo realizado con 5 hembras durante 29 horas. Se muestran los huevos de C. capitata
depositados por la hembra y los tneles formados durante la ovoposicin. La superficie del fruto fue completamente
cubierta con medio T3 (control sin bacterias).


4.18.3 Bioensayos en Pyrus communis
En el primer bioensayo con peras (Pyrus communis L., var. limonera), se utilizaron 10
hembras sexualmente maduras por cada tratamiento, y la fruta estuvo expuesta durante 4 das a
las moscas, para la ovoposicin. La fruta fue examinada detalladamente despus de 8 das del
inicio del experimento, para la bsqueda de individuos vivos. Al final del bioensayo, en B.
pumilus 15.1 se registraron 44,8 larvas (en promedio), en contraste con las 147,2 encontradas en
el control de medio T3 (Fig. 31). No obstante de esta diferencia de ms de 100 larvas,
estadsticamente ninguno de los tratamientos, inclusive el de la cepa 15.1, muestra diferencias
significativas entre s, ni respecto al control (F
1, 24
= 2,271; P = 0,098).



RESULTADOS: CAPI TULO 3 | 149

Figura 31. Nmero de individuos vivos de C. capitata registrados a partir de frutos de peras (Pyrus communis L.,
var. limonera), de un bioensayo realizado con 10 hembras ovopositando durante 4 das. La fruta se cubri
completamente con cultivos de B. pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. pumilus M2, B. thuringiensis IPS 78/11 y medio
T3 (control sin bacterias). Las diferencias en el nmero de individuos vivos al final del experimento entre B. pumilus
15.1 y los controles se evaluaron mediante ANOVA (P > 0,05). Bp = B. pumilus; Bt = B. thuringiensis IPS 78/11.


El segundo bioensayo en peras se llev a cabo exponiendo la fruta a 5 hembras de C. capitata,
por tratamiento, durante 24 horas. La fruta fue revisada tras 8 das de la realizacin del
experimento. La Figura 32 muestra que en la fruta tratada con B. pumilus M1 y medio T3 se
registraron ms individuos vivos que en el resto de tratamientos, mientras que en B. pumilus 15.1
hubo menor nmero de larvas. A pesar de las diferencias entre el nmero de individuos vivos
registrados en las frutas contaminadas con la cepa 15.1 y dos de los controles (B. thuringiensis
IPS 78/11 y medio T3), bajo las condiciones experimentales ensayadas, el anlisis estadstico no
mostr diferencias entre tratamientos (F
1, 24
= 1,658; P = 0,199).



0
50
100
150
200
250
300
Bp 15.1 Bp M1 Bp M2 Bt T3
N
o
.

l
a
r
v
a
s

150 | CAPTULO 3

Figura 32. Nmero de individuos vivos de C. capitata registrados a partir de frutos de peras (Pyrus communis L.,
var. limonera), de un bioensayo realizado con 5 hembras ovopositando durante 24 horas. La fruta se cubri
completamente con cultivos de B. pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. pumilus M2, B. thuringiensis IPS 78/11 y medio
T3 (control sin bacterias). Las diferencias en el nmero de individuos vivos al final del experimento entre B. pumilus
15.1 y los controles se evaluaron mediante ANOVA (P > 0,05). Bp = B. pumilus; Bt = B. thuringiensis IPS 78/11.


4.18.4 Bioensayos en Citrus sinensis
En los experimentos con naranja (Citrus sinensis L., var. valencia), se utilizaron 40 hembras
adultas grvidas de C. capitata por cada tratamiento. Debido a que el proceso de descomposicin
de las naranjas es ms lento que las especies de frutas ensayadas anteriormente, los bioensayos
fueron revisados despus de 30 das, para que permitir que las larvas se desarrollasen en el
interior de la fruta, y se pudiesen recoger las pupas a partir de la tierra depositadas para este
propsito en las cajas de bioensayo. Adems, se revis exhaustivamente el interior de cada pieza
fruta para registrar el nmero de individuos vivos. La Figura 33 muestra los detalles de la
realizacin de los bioensayos en condiciones parcialmente artificiales llevados a cabo en naranja.




0
10
20
30
40
50
60
70
Bp 15.1 Bp M1 Bp M2 Bt T3
N
o
.

l
a
r
v
a
s

RESULTADOS: CAPI TULO 3 | 151

Figura 33. Bioensayo en naranja en condiciones parcialmente artificiales (Citrus sinensis L., var. valencia). Todas
las frutas mostradas en esta figura pertenecieron al control de medio T3 (sin bacterias). A: caja de bioensayo con
fruta. B: hembra de C. capitata depositando huevos en el interior de una naranja. C: naranja con varias picaduras,
donde hembras de C. capitata depositaron sus huevos dentro de la fruta. D: detalle interno del dao causado por
larvas de C. capitata en naranja.


Los resultados de los ensayos en naranja se muestran en la Figura 34. Esta figura muestra que en
las naranjas tratadas con B. pumilus 15.1 se registr un menor nmero de individuos vivos, en
comparacin con el resto de tratamientos bacterianos y el control sin bacterias (medio T3).
Los dos bioensayos con naranja se realizaron utilizando el mismo procedimiento y bajo las
mismas condiciones experimentales, por lo que el valor de cada tratamiento mostrado en la
Figura 34 corresponde a la media aritmtica de 10 repeticiones (5 rplicas por tratamiento, en
dos bioensayos realizados por separado). Transcurridos los 30 das desde el inicio del bioensayo,
se observaron pocas larvas y pupas, sugiriendo que bajo las condiciones experimentales
ensayadas, las frutas de Citrus sinensis no son infestadas por un alto nmero de larvas, como
152 | CAPTULO 3
ocurre en las frutas ensayadas anteriormente. Adems, casi la totalidad de larvas registradas en
estos experimentos se encontraron dentro de la fruta; indicando un mayor tiempo de desarrollo
comparado con el resto de especies de fruta anteriormente ensayadas.

El resultado del ANOVA llevado a cabo con el nmero de individuos vivos registrados en el
experimento mostr que existen diferencias significativas entre tratamientos (F
1, 49
= 4,353; P =
0,005). As, la prueba post hoc (rango estudentizado de Tukey) incluy a B. pumilus 15.1 y B.
pumilus M2 en el mismo grupo (P < 0,05); los dos tratamientos bacterianos en los que se
registraron menos individuos vivos (Fig. 34).
Los valores de las desviaciones estndar mostradas en la Figura 34 se podran considerar valores
altos respecto a sus promedios (B. pumilus 15.1: 1,20; B. pumilus M1: 7,20; B. pumilus M2:
1,92; B. thuringiensis IPS 78/11: 4,82; T3: 4,32). A pesar de esta variacin, la prueba de
homogeneidad de varianzas realizada para el ANOVA no fue significativa (Sign. = 0,103), por lo
que los tratamientos se compararon estadsticamente.


Figura 34. Nmero de individuos vivos de C. capitata registrados a partir de frutos de naranja (Citrus sinensis L.,
var. valencia). La fruta se cubri completamente con cultivos de B. pumilus 15.1, B. pumilus M1, B. pumilus M2,
B. thuringiensis IPS 78/11 y medio T3 (control sin bacterias). Las diferencias en el nmero de individuos vivos al
final del experimento entre B. pumilus 15.1 y los controles se evaluaron mediante ANOVA (P < 0,01). La misma
letra sobre las barras indica que no existen diferencias significativas. Bp = B. pumilus; Bt = B. thuringiensis IPS
78/11.


0
2
4
6
8
10
12
14
Bp 15.1 Bp M1 Bp M2 Bt T3
N
o
.

l
a
r
v
a
s

a
a
b
b
b
RESULTADOS: CAPI TULO 3 | 153
Este resultado sugiere que B. pumilus 15.1 podra estar afectando al desarrollo larvario en el
interior de la naranja, debido a su ya comprobado efecto larvicida; sin embargo, la cepa 15.1
tambin podra estar influyendo, de alguna manera, en la cantidad de huevos depositados por las
hembras adultas en naranja. Es notable que de los bioensayos realizados en condiciones
parcialmente artificiales en fruta, solamente en naranja se hayan registrado diferencias
estadsticamente significativas entre tratamientos, lo que podra sugerir que los procedimientos
empleados en las otras frutas podran necesitar ser optimizados, o que la naranja representa un
excelente modelo para ensayar el efecto de B. pumilus 15.1 como potencial agente de control
biolgico de C. capitata. Adems, el hecho de que la cepa 15.1 disminuya la presencia de
individuos vivos de la mosca de la fruta del Mediterrneo en naranja, ya sea interfiriendo con el
desarrollo larvario o de otra manera, representa un resultado prometedor desde el punto de vista
prctico, ya que los ctricos son uno de los tipos de las frutas ms atacadas por C. capitata en
Espaa.















CAPITULO 4





















RESULTADOS: CAPI TULO 4 | 157

Una vez caracterizada la patogenicidad de la cepa B. pumilus 15.1 frente a todos los estadios del
desarrollo de la mosca de la fruta del Mediterrneo, as como en otros modelos experimentales,
se decidi hacer una caracterizacin preliminar de la cepa a nivel fisiolgico, molecular y
filogentico. Toda la informacin contenida en este captulo supone un avance en el
conocimiento de las caractersticas de esta cepa bacteriana, de gran utilidad en futuros estudios
de la toxicidad frente a a C. capitata y de su modo de accin.


4.19 CRECIMIENTO Y TIEMPO DE GENERACIN DE B. PUMI LUS 15.1 EN MEDIO LB
Se determin la dinmica de crecimiento y el tiempo de generacin de una poblacin de la cepa
15.1. Para esto, se llev a cabo una curva de crecimiento de un cultivo en medio lquido LB,
registrndose la medida de absorbancia (a 600 nm) a lo largo del tiempo, de acuerdo a las
condiciones establecidas en el apartado 3.8 de Materiales y Mtodos.

La Figura 35 muestra la dinmica de crecimiento de B. pumilus 15.1, representada por el
logaritmo de la densidad ptica (D.O.) a lo largo del tiempo, donde cada punto representa el
promedio de 2-4 datos. En la curva de crecimiento de B. pumilus 15.1 (Fig. 35) se distinguen dos
de las fases de crecimiento tpicas de un cultivo bacteriano; la fase logartmica o de crecimiento
exponencial, que comprendi entre la hora 6 hasta la hora 14; durante este perodo las clulas se
dividieron rpidamente. Despus de la hora 14 de crecimiento, el cultivo alcanz la fase
estacionaria en la que la tasa de divisin (o crecimiento) celular se encontr balanceada con la
tasa de muerte celular.

El tiempo de generacin (g) de la cepa B. pumilus 15.1 en medio LB, bajo las condiciones del
ensayo de 30C y 240 rpm de agitacin, fue determinado a travs de la siguiente frmula (Powell
1956):
g = log 2/m
Donde, g es el tiempo de generacin y m es la pendiente de la recta en la fase exponencial.
158 | CAPTULO 4
La regresin lineal se llev a cabo usando los datos de la densidad ptica de la fase exponencial
de la curva de crecimiento (6 h - 14 h). De esta manera, se determin que el tiempo de
generacin de la cepa 15.1 en medio LB es 1 hora y 19 minutos.


0.00
0.01
0.10
1.00
10.00
0 12 24 36 48 60 72
L
o
g

(
D
O

6
0
0

n
m
)
Tiempo (horas)


Figura 35. Curva de crecimiento (log D.O. vs. tiempo) de un cultivo de B. pumilus 15.1 en medio LB.


4.20 DETERMINACIN DE LA SUSCEPTIBILIDAD DE B. PUMI LUS 15.1 A DISTINTOS
ANTIBITICOS
La determinacin in vitro de la susceptibilidad bacteriana ante agentes microbianos se llev a
cabo mediante el test de difusin en agar. El patrn de sensibilidad antimicrobiana de la cepa
15.1, se estableci mediante un antibiograma utilizando un grupo de antibiticos empleados
frecuentemente en el laboratorio. Este mtodo de difusin en disco, descrito inicialmente por
Bauer et al. (1966), genera un perfil global de susceptibilidad de una bacteria a un conjunto de
agentes antimicrobianos.

RESULTADOS: CAPI TULO 4 | 159
En la Tabla 13 se muestran los antibiticos ensayados, las concentraciones utilizadas, y el
tamao de los halos de inhibicin (media desviacin estndar) causados por cada antibitico en
un csped de B. pumilus 15.1. Esta cepa mostr alta sensibilidad a la penicilina, tetraciclina,
cloranfenicol, y ampicilina, ya que estos antibiticos produjeron halos de inhibicin de mayor
dimetro. Por otra parte, la cepa 15.1 fue menos sensible a la streptomicina y la rifampicina, ya
que estos antibiticos produjeron halos de inhibicin de menor tamao (Tabla 13).


Tabla 13. Patrn de inhibicin del crecimiento de B. pumilus 15.1 frente a los antibiticos ensayados.
Antibitico Cantidad de
antibitico (g)
Halo de inhibicin
(cm) SD
No. de colonias
resistentes
Rifampicina (Rif) 5 1,93 0,17 0
Ampicilina (Amp) 10 2,85 0,40 167
Cloranfenicol (Cm) 30 2,88 0,03 0
Tetraciclina (Tc) 30 2,93 0,42 1
Penicilina (Pen) 6 3,35 0,60 97
Streptomicina (Sm) 10 1,58 0,03 8
Gentamicina (Gm) 20 2,15 0,30 0
Kanamicina (Km) 3 2,10 0,05 7


En ocasiones, dentro de los halos de inhibicin causados por la difusin de los antibiticos en el
agar y accin sobre el crecimiento bacteriano se observaron colonias aisladas, consideradas
como colonias resistentes espontneas. El nmero de colonias resistentes espontneas obtenidas
en cada uno de los antibiticos ensayados fue registrado y se muestra en la Tabla 13. Despus de
12-24 horas de crecimiento a 30C, se registr el mayor nmero de resistentes en las placas con
ampicilina y con penicilina. Comparativamente, el nmero de resistentes de B. pumilus 15.1
obtenidos espontneamente frente a estos dos antibiticos, fue muy superior al resto de los
dems agentes antimicrobianos ensayados. (Tabla 13). Tanto la ampicilina como la penicilina
pertenecen al grupo de los antibiticos betalactmicos, por lo que se sugiere que la cepa 15.1
pudiera exhibir el mismo mecanismo de resistencia para evitar la accin de los dos antibiticos y
con la misma frecuencia de mutacin.

160 | CAPTULO 4
Por otro lado, el dimetro de la zona de inhibicin es inversamente proporcional a la
concentracin inhibitoria mnima (MIC) de una bacteria. En general, zonas de inhibicin grandes
estn correlacionadas con concentraciones (MIC) pequeas de antibiticos para cada bacteria.
Paralelamente a este trabajo, en nuestro grupo de investigacin se determinaron los valores de
concentracin mnima inhibitoria (MIC) de B. pumilus 15.1, por lo que se llev a cabo una
correlacin paramtrica bivariada de Pearson entre el MIC y el dimetro de las zonas de
inhibicin (Fig. 36). La correlacin sugiri que la concentracin mnima inhibitoria y la zona de
inhibicin (R = -0,280) estn relacionados negativamente. Es decir, como se esperaba, conforme
el valor MIC se reduce, el tamao de la zona de inhibicin de los antibiticos aumenta (Fig. 36).

Dimetro de zona de inhibicin (cm)
2.00 3.00 2.50
0.00
6.00
4.00
2.00


Figura 36. Grfico de dispersin de la correlacin bivariada de Pearson para determinar la relacin entre la
concentracin mnima inhibitoria (MIC) y los dimetros de la zona de inhibicin de la prueba de difusin con disco
para los antibiticos ensayados en B. pumilus 15.1.



RESULTADOS: CAPI TULO 4 | 161
4.21 DETECCIN DE ELEMENTOS EXTRACROMOSMICOS
Frecuentemente las toxinas bacterianas, incluidas las que poseen propiedades insecticidas del
tipo de las toxinas Cry, producidas por B. thuringiensis, son de codificacin plasmdica (de
Maagd et al. 2003, DeNap and Hergenrother 2005). Adems del inters por los plsmidos y
megaplsmidos y su asociacin con la produccin de diferentes toxinas, el patrn de plsmidos
ha sido frecuentemente usado para caracterizar cepas bacterianas, ya que el patrn de plsmidos
parece estar relacionado con cada cepa, serotipo, o grupo especifico (Reyes-Ramirez and Ibarra
2008).
Con el fin de conocer si estos elementos extracromosmicos (plsmidos y/o megaplsmidos)
estaban presentes en la cepa B. pumilus 15.1, se analiz el ADN total de dicha cepa. Para ello se
sigui la metodologa propuesta por Reyes-Ramrez & Ibarra (2008) para la deteccin del patrn
de plsmidos de B. thuringiensis, con algunas modificaciones.

Despus de la extraccin de ADN total, el contenido gentico se separ y se visualiz mediante
electroforesis en gel de agarosa. El resultado se muestra en la Figura 37. En la calles 2, 3 y 4,
correspondientes a extracciones independientes de ADN total a partir de B. pumilus 15.1, se
observaron dos elementos extracromosmicos, uno de mayor tamao que el cromosoma
bacteriano (>23 Kb), y otro menor que el cromosoma bacteriano (~6 Kb) (Fig. 37), indicando
que la cepa B. pumilus 15.1 posee al menos dos elementos extracromosmicos, un megaplsmido
y un plsmido. Estos elementos extracromosmicos no estn presentes en las cepas de B. pumilus
usadas en este trabajo como controles negativos de toxicidad, B. pumilus M1 (calle 5) y B.
pumilus M2 (calle 6), por lo que cabe la posibilidad de que el factor de virulencia responsable de
la muerte de larvas de C. capitata podra estar codificado por alguno de estos elementos
extracromosmicos.

Como control de la ausencia de elementos extracromosmicos se utiliz la cepa B. thuringiensis
IPS 78/11, ya que esta cepa fue curada de sus plsmidos naturales previamente por otros
investigadores (Ward and Ellar 1983). Tal y como se esperaba, B. thuringiensis IPS 78/11 (calle
6, Fig. 37) mostr nicamente una banda correspondiente al ADN cromosmico.

162 | CAPTULO 4
Normalmente la comparacin del patrn de bandas de megaplsmidos (plsmidos que migran
por encima de la banda correspondiente al ADN cromosmico) en este tipo de geles de agarosa
resulta complicada debido al bajo nmero de copias de este tipo de elementos
extracromosmicos, y por tanto la intensidad de las bandas (Reyes-Ramirez and Ibarra 2008).
Sin embargo, la banda sobre el ADN cromosmico presente en las calles 1, 2 y 3 (B. pumilus
15.1) es claramente diferenciable del resto de calles del gel.


M 2 1 4 3 5 6
12-
Kb
6-
4-
3-
2-
Crom-


Figura 37. Electroforesis en gel de agarosa (0.8%) del ADN total extrado a partir de varias cepas bacterianas. M:
Marcador de peso molecular: 250 bp a 12 Kb (Stratagene); Calles 1, 2 y 3: B. pumilus 15.1 (distintas extracciones);
Calle 4: B. pumilus M1; Calle 5: B. pumilus M2; Calle 6: B. thuringiensis IPS 78/11 (cepa acristalfera curada de
plsmidos).


4.22 CURADO DE ELEMENTOS EXTRACROMOSMICOS
En la mayora de bacterias entomopatgenas los genes que codifican para los factores de
virulencia tienen localizacin plasmdica. La localizacin de estos genes en elementos
extracromosmicos ha sido revelado mediante la tcnica de curado de plsmidos (Roh et al.
2007), especialmente en B. thuringiensis. Adems, usando esta metodologa se han obtenido
RESULTADOS: CAPI TULO 4 | 163
varias cepas acristalferas de B. thuringiensis (siendo as fenotpicamente indistinguibles de B.
cereus). El procedimiento de curado de plsmidos se considera una metodologa estndar para
revelar si las protenas responsables de la toxicidad bacteriana son codificadas por plsmidos. De
entre los varios procedimientos utilizados para curar plsmidos (Spengler et al. 2006), se
utilizaron dos estrategias para eliminar estos elementos extracromosomales de la cepa B. pumilus
15.1.

El primer procedimiento utilizado fue una variacin del mtodo descrito por Sivropoulou et al.
(2000). La cepa parental se cultiv en LB suplementado con SDS 0.002% (p/v), durante 24 horas
a 42C. Luego, se realizaron diluciones en el mismo medio cada 12 horas durante 3 das. Al final
del proceso, el cultivo derivado se sembr en placas de LB para su posterior anlisis. La segunda
estrategia empleada para el curado de los plsmidos detectados en B. pumilus 15.1 fue una
modificacin de los mtodos propuestos por Ward & Ellar (1983) y Mahillon et al. (2000). Este
procedimiento es similar al primero descrito, excepto que el LB no fue suplementado con SDS.
Las cepas derivadas resultantes de los dos tratamientos se seleccionaron por cambio en la
morfologa con respecto a la cepa parental (e.g. cambio en el tamao, la forma, o la apariencia de
la superficie de las colonias).

Para la comprobacin de la prdida de los plsmidos naturales de B. pumilus 15.1, se extrajo el
ADN total a partir de las colonias seleccionadas y se visualiz en un gel de agarosa (0,8% p/v)
(Fig. 38).



164 | CAPTULO 4
M 1
12-
Kb
6-
4-
3-
2-
Crom-
9 8 7 6 5 4 3 2


Figura 38. Electroforesis en gel de agarosa (0.8%) del ADN total extrado de varias cepas. M: Marcador de peso
molecular (250 bp a 12 Kb, Stratagene); Calles 1, 2 y 6: B. pumilus 15.1 (distintas extracciones); Calle 3: B. pumilus
15.1 tratada con SDS 0,002% y 42C; Calle 4: B. pumilus 15.1 tratada a 42C; Calle 5: B. pumilus 15.1 resistente a
ampicilina (calle no relevante); Calle 7: B. pumilus M1; Calle 8: B. pumilus M2; Calle 9: B. thuringiensis IPS 78/11
(curada de plsmido).


Ninguno de los dos procedimientos empleados con el objetivo de curar la cepa 15.1 de sus
plsmidos consigui el resultado esperado. Tanto en la calle 3 (B. pumilus 15.1 tratada con SDS
0,002% y 42C), como en la calle 4 (B. pumilus 15.1 tratada a 42C) estn presentes las bandas
del plsmido de aproximadamente 6 Kb, y del megaplsmido (sobre la banda del ADN
cromosmico). Los resultados muestran que los elementos extracromosmicos de la cepa 15.1 no
se curan por los procedimientos estndar empleados, siendo necesaria la aplicacin de otros
procedimientos metodolgicos en futuros estudios. Debido a estos resultados no se pudo
comprobar la hiptesis planteada al inicio del experimento de que el factor de virulencia de B.
pumilus 15.1 podra ser de codificacin plasmdica.



RESULTADOS: CAPI TULO 4 | 165
4.23 CARACTERIZACIN FILOGENTICA DE B. PUMILUS 15.1
4.23.1 Relacin filogentica de B. pumilus 15.1 con otras cepas entomopatgenas
Las cepas bacterianas entomopatgenas comparten la caracterstica de producir factores de
virulencia que les permiten invadir el cuerpo del insecto susceptible y aprovechar los nutrientes
presentes en l. Este carcter homlogo es mayoritariamente codificado por genes plasmdicos
(Roh et al. 2007); sin embargo, genes cromosmicos altamente conservados, como el 16S rRNA,
podran proveer informacin sobre esta caracterstica compartida y de las relaciones entre las
cepas productoras. Los anlisis filogenticos pueden proporcionar una aproximacin de cmo
estas cepas productoras de toxinas insecticidas podran haber evolucionado a partir de ancestros
comunes, o como han explotado caractersticas y mecanismos comunes para llegar a esta
actividad biolgica, que les ha servido para aprovechar/usar nuevos nichos ecolgicos.

Como se mencion anteriormente, la propiedad insecticida de B. pumilus 15.1 frente a C.
capitata no es una caracterstica comn con otras cepas de B. pumilus (M1 y M2). Sin embargo,
la capacidad txica de la cepa 15.1 frente a larvas de mosca de la fruta del Mediterrneo se
asemeja a la caracterstica de toxicidad de otras cepas entomopatgenas; pudiendo tratarse de
una caracterstica sinapomrfica. Con el propsito de conocer las relaciones filogenticas de B.
pumilus 15.1 con otras cepas entomopatgenas se llev a cabo un anlisis filogentico basndose
en secuencias parciales (de alrededor 1500 bp) del gen 16S rRNA.

Para llevar a cabo este estudio filogentico, las secuencias de las cepas seleccionadas fueron
obtenidas en la base de datos del NCBI, excepto B. pumilus 15.1, cuya secuencia se detalla en el
Capitulo 1 de resultados de esta tesis doctoral. Las cepas incluidas en este anlisis, junto con su
nmero de acceso al GenBank se encuentran detalladas en la Tabla 14. Aparte de cepas
bacterianas con propiedades insecticidas, se incluyeron cepas de B. subtilis, B, cereus y B.
anthracis como grupos externos.




166 | CAPTULO 4
Tabla 14. Cepas bacterianas y nmeros de acceso al GenBank incluidas en el anlisis filogentico, llevado a cabo
con secuencias parciales del gen 16S rRNA, para comparar B. pumilus 15.1 con otras cepas entomopatgenas.
Especie subespecie Cepa Nmero de acceso
Bacillus pumilus SAFR-032
AY167879.1
B. thuringiensis israelensis
AY461762.2
B. thuringiensis kurstaki AR-14
GQ202000.1
B. thuringiensis entomocidus IEBC-T06 001
EF210312.1
B. thuringiensis morrisoni
EU429670.1
B. thuringiensis tenebrionis
EU429671.1
B. thuringiensis aizawai
AY461760.2
B. thuringiensis galleriae
EU429662.1
B. thuringiensis sotto
EU429667.1
B. thuringiensis thompsoni
EF210310.1
B. thuringiensis finitimus IEBC-T02 001
EF210292.1
B. thuringiensis fukuokaensis IEBC-T03C001
EF210301.1
Brevibacillus laterosporus S62-9
EU709016.1
Paenibacillus lentimorbus Cb1
EF190506.1
P. popilliae BPHD
EF190495.1
P. larvae
EF187246.1
Serratia entomophila Mor4.1
EU250329.1
Bacillus sphaericus ATCC 14577
DQ286299.1
B. subtilis 407D3
HM099655.1
B. cereus ZH16
HM103336.1
B. anthracis H13
GU826150.1


El anlisis filogentico de las secuencias parciales del gen 16S rRNA de bacterias
entomopatgenas (Fig. 39), muestra que B. pumilus 15.1 se agrupa con cepas relacionadas (B.
pumilus SAFR-032 y B. subtilis), ratificando as la correcta identificacin de la cepa 15.1, y la
pertenencia al grupo taxonmico de B. subtilis. Las tres cepas antes mencionadas forman un
clado separado y la rama de la que parte este cluster est soportada por el 100% de los rboles
del bootstrap, lo que indica que su posicin respecto al resto de cepas incluidas en el rbol es
significativa.

El dendrograma de la Figura 39 muestra que todas las cepas de los distintos serovares analizados
de B. thuringiensis forman un clado, con 100% de los rboles del bootstrap, a pesar de la
inclusin de B. cereus y B. anthracis dentro de este grupo. Por otro lado, segn el resultado de
este anlisis, las cepas analizadas no mostraron relaciones filogenticas cercanas en secuencias
RESULTADOS: CAPI TULO 4 | 167
del gen 16S rRNA, respecto a la actividad insecticida que poseen; ya que por ejemplo, B.
thuringiensis israelensis, B. thuringiensis kurstaki, B. sphaericus y B. pumilus 15.1, que son
patgenas frente a dpteros, se ubican en distintos clados.
Adems, este anlisis filogentico proporciona un resultado que aunque no est directamente
relacionado con el objetivo para el que fue llevado a cabo, es destacable. Las tres especies
analizadas pertenecientes al gnero Paenibacillus (P. lentimorbus, P. popilliae y P. larvae) se
agrupan dentro del mismo clado (con valor de bootstrap de 1000), lo que concuerda con la
reorganizacin taxonmica de estas especies antes incluidas dentro del gnero Bacillus (Priest
2000, Porwal et al. 2009).


4.23.2 Relacin filogentica de B. pumilus 15.1 con cepas pertenecientes al grupo
taxonmico de B. subtilis
Tradicionalmente, B. pumilus ha sido incluido dentro del grupo de B. subtilis, colocndola en la
base de la filogenia de este grupo. En la actualidad las especies de bacterias que pertenecen al
grupo de B. subtilis son: B. pumilus, B. atropheus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens y B.
subtilis (Buchanan 1974, Skerman et al. 1989, Porwal et al. 2009, Rooney et al. 2009). Sin
embargo, algunos autores sugieren que al analizar un gran nmero de cepas de B. pumilus se
debera considerar a esta especie como una variedad de B. subtilis, y no como una especie
separada (Gordon et al. 1973). Adems, los resultados del estudio llevado a cabo por Rooney et
al. (2009), sugieren que B. pumilus forma un clado distinto al de B. subtilis. A pesar de la
diversidad de evidencias respecto a las relaciones filogenticas de B. pumilus, es claro que esta
especie bacteriana no se encuentra dentro de un grupo monofiltico, y que est cercanamente
relacionada con B. subtilis y B. licheniformis (Gioia et al. 2007).

Debido a la reciente descripcin de la cepa B. pumilus 15.1, se decidi establecer las relaciones
filogenticas de esta cepa con las especies tradicionalmente incluidas dentro del grupo
taxonmico de B. subtilis. Para esto, se realiz un rbol filogentico basndose en secuencias
parciales del gen 16S rRNA, de dos cepas por cada especie, incluyendo B. thuringiensis, B.
cereus y B. anthracis, utilizados como grupos externos. La Tabla 15 detalla las cepas utilizadas
168 | CAPTULO 4
en este estudio filogentico, y sus nmeros de acceso al GenBank, de donde se obtuvieron las
secuencias analizadas.


Tabla 15. Cepas bacterianas y nmeros de acceso al GenBank incluidas en el anlisis filogentico, llevado a cabo
con secuencias parciales del gen 16S rRNA, para comparar B. pumilus 15.1 con otras cepas pertenecientes al grupo
taxonmico de B. subtilis.
Especie subespecie Cepa Nmero de acceso
Bacillus pumilus SAFR-032
AY167879.1
B. subtilis (1) 407D3
HM099655.1
B subtilis (2) CICC 10025
AY881635.1
B. licheniformis (1) GMCC 2876
GQ148817.1
B. licheniformis (2) M1-1
AB039328.1
B. amyloliquefaciens (1) 5YN11
GU549437.1
B. amyloliquefaciens (2) JS
HM055608.1
B. atropheus (1) BCRC 17123
EF433409.1
B. atropheus (2) RJGP6
GU969134.1
B. thuringiensis israelensis
AY461762.2
B. thuringiensis kurstaki AR-14
GQ202000.1
B. cereus (1) ZH16
HM103336.1
B. cereus (2) HCY01
DQ372919.1
B. anthracis (1) H13
GU826150.1
B. anthracis (2) Sterne
AE017225.1


Al igual que en el anlisis filogentico llevado a cabo con cepas entomopatgenas, el rbol
construido con cepas del grupo taxonmico de B. subtilis (Fig. 40) muestra que la secuencia del
gen 16S rRNA de B. pumilus 15.1 se agrupa, en primera instancia, con la secuencia de la otra
cepa de B. pumilus (SAFR-032) incluida en el anlisis. Sin embargo, el dendrograma de la
Figura 40 tambin muestra que la cepa 15.1 se encuentra ms cercanamente relacionada a las tres
especies pertenecientes al grupo de B. cereus (B. thuringiensis, B. anthracis, y B. cereus),
utilizadas en la construccin de este rbol como grupos externos, formando un clado que posee el
soporte del 97,7% de los rplicas del bootstrap, lo cual es muy significativo. Las dos cepas de B.
licheniformis y las dos cepas de B. atropheus se agruparon entre s, mientras que las dos cepas de
B. amyloliquefaciens y B. subtilis se encuentran separadas, formando clusters distintos.
Adems, los altos valores de bootstrap presentes en todos los nodos del rbol sugieren que los
clados formados en este anlisis son altamente consistentes y significativos.

RESULTADOS: CAPI TULO 4 | 169

Figura 39. rbol filogentico basado en 22 secuencias del gen 16S rRNA de 11 especies bacterianas entomopatgenas. Se realiz un anlisis neighbor-joining
con soporte bootstrap de las secuencias. Los valores bootstrap estn especificados en los nodos; se realizaron 1000 rplicas bootstrap. La cepa B. pumilus 15.1,
objeto de este estudio, se encuentra resaltada en amarillo.
Brevibacillus laterosporus
Serratia entomophila
Bacillus sphaericus
Bt finitimus
Bacillus cereus
Bt tenebrionis
Bt sotto
Bt israelensis
Bt entomocidus
Bt fukuokaensis
Bt morrisoni
Bt galleriae
Bt thompsoni
Bt kurstaki
Bt aizawai
Bacillus anthracis
Bacillus subtilis
Bacillus pumilus15.1
Bacillus pumilus SAFR032
Paenibacillus larvae
Paenibacillus popilliae
Paenibacillus lentimorbus
100.0
Brevibacillus laterosporus
170 | CAPTULO 4

Figura 40. rbol filogentico basado en 16 secuencias del gen 16S rRNA de 8 especies pertenecientes al grupo de Bacillus subtilis. Se realiz un anlisis
neighbor-joining con soporte bootstrap de las secuencias. Los valores bootstrap estn especificados en los nodos; se realizaron 1000 rplicas bootstrap. La cepa
B. pumilus 15.1, objeto de este estudio, se encuentra resaltada en amarillo.
Bt israelensis
Bt kurstaki
Bacillus pumilus15.1
Bacillus pumilus SAFR032
Bacillus anthracis (1)
Bacillus anthracis (2)
Bacillus cereus (2)
Bacillus cereus (1)
Bacillus licheniformis (1)
Bacillus licheniformis (2)
Bacillus atropheus (1)
Bacillus atropheus (2)
Bacillus amyloliquefaciens (1)
Bacillus amyloliquefaciens (2)
Bacillus subtilis (1)
Bacillus subtilis (2)
100.0
RESULTADOS: CAPI TULO 4 | 171
4.23.3 Relacin filogentica de B. pumilus 15.1 con otras cepas patgenas
B. pumilus es una bacteria perteneciente al gnero Bacillus no considerada como un
entomopatgeno clsico, como es el caso de B. thuringiensis. Sin embargo, el anlisis
filogentico llevado a cabo anteriormente (Fig. 40) mostr que la cepa 15.1 est ms
cercanamente relacionada a cepas del grupo de B. cereus (e incluidas en el anlisis como grupos
externos) que a cepas pertenecientes al grupo de B. subtilis, grupo en el que la especie B. pumilus
tradicionalmente ha sido incluida. Por este motivo, se contextualiz cepa B. pumilus 15.1 con el
resto de cepas pertenecientes al grupo de B. cereus (grupo al que pertenece B. thuringiensis)
utilizando el mtodo propuesto por Maiden et al. (1998), conocido con el nombre de Multi-locus
Sequence Typing (MLST). MLST es un mtodo de genotipado cada vez ms usado, que permite
la caracterizacin inequvoca de aislados microbianos pertenecientes a la misma especie. El
mtodo se basa en la comparacin de las secuencias parciales de siete genes de expresin
constitutiva (glpF, gmk, ilvD, pta, pur, pycA, tpi). Los genes constitutivos, o genes housekeeping,
se caracterizan por estar constantemente expresados debido a que son responsables del
mantenimiento y la actividad celular, y sus productos son por lo tanto esenciales para la
fisiologa general de la clula; adems, se asume que su expresin no se encuentra afectada por
las diferentes condiciones experimentales.

Para la tipificacin de B. pumilus 15.1 y comparacin con otros aislados bacterianos, se usaron
las herramientas on-line del sitio web MLST para B. cereus (http://pubmlst.org/bcereus/)
desarrollado por Keith Jolley (Jolley et al. 2004) y hospedado en la Universidad de Oxford (UK).

En los anlisis MLST, se asigna un nmero de alelo a cada una de las secuencias parciales de los
genes anteriormente mencionados. As, cada alelo est representado por un nmero y cada cepa
queda clasificada dentro de un perfil allico conocido con el trmino ST (sequence type) tambin
representado por un nmero (Urwin and Maiden 2003). Las relaciones entre aislados bacterianos
se realizan por comparaciones de perfiles allicos, de tal manera que aislados cercanamente
relacionados tienen idnticas STs, o STs que difieren en pocos loci.

El perfil allico de la cepa 15.1 se compar con otras cepas patgenas pertenecientes al grupo de
B. cereus, debido a que B. pumilus 15.1 ha mostrado estar cercanamente relacionada con
172 | CAPTULO 4
bacterias de este grupo, y a la disponibilidad de la base de datos especializada para este cluster
taxonmico. Aparte de B. pumilus 15.1, tambin se analiz la cepa B. pumilus M1 con el
esquema MLST, ya que esta cepa fue usada habitualmente como control negativo de toxicidad
frente a C. capitata.
Los genes glpF, gmk, ilvD, pta, pur, pycA, y tpi fueron amplificados parcialmente mediante
PCR, utilizando los cebadores (primers) y procedimientos descritos en Materiales y Mtodos.
Las secuencias obtenidas para los siete loci de B. pumilus 15.1 y B. pumilus M1 se detallan en las
Tablas 16 y 17, respectivamente.

Tabla 16. Secuencias obtenidas para los siete loci de B. pumilus 15.1 utilizados en el anlisis MLST.
glpF (glycerol uptake facilitator protein) - locus 7
GCAGCATATGCGGTTGGATCAATTAGTGGGGCACATTTGAATCCAGCTTTAACAATAGGATTAGCATTTA
AGGGAGCGTTCCCATGGAGTGACGTACCTGGTTATATCGCAGCACAAATGATTGGGGCAATTATCGGGGC
AGTTATCGTATATTTACATTACTTACCACACTGGAAAGAAACAGAAGATCCAGGAACAAAGTTAGGTGTA
TTTGCAACAGGTCCAGCAATTCCGAACACATTTGCAAACCTTTTAAGTGAAATGATTGGAACATTCGTTT
TAGTATTTGGTATATTAGCAATTGGTGCAAATAAATTTGCAGATGGATTAAATCCATTTATCGTAGGTTT
CTTAATTGTAAGTATTGGTTTA
ilvD (dihydroxy-acid dehydratase) - locus 16
GAGGAAGGAGGATTGCGTATATTAAAAGGCAACCTTGCGAAAGATGGAGCGGTTATTAAAAGCGGTGCAA
CAGAGGTAAAGCGTTTTGAAGGACCTTGCGTTATTTTTAATTCACAAGATGAGGCACTTGCTGGCATTAT
GCTTGGGAAAGTGAAAAAAGGAGATGTAGTTGTCATTCGTTACGAAGGACCAAGAGGTGGCCCTGGTATG
CCAGAAATGTTAGCACCAACATCAGCAATTGCTGGAATGGGATTAGGTGCTGAGGTTGCATTATTAACGG
ATGGACGTTTCTCTGGAGCTTCACGTGGAATTTCAGTAGGACATATTTCACCAGAAGCAGCAGCTGGTGG
AACAATCGCACTTCTTGAACAAGGGGATATTGTATGTATTGAT
pur (phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide) - locus 2
AAACGTAAACTAGCAGCGAAAGTATTCCGTCATACAGCAGCGTATGATGCGTTAATTTCTAACTACTTAA
CAGAGCAAATGGGTGAAGAAAGTCCAGAAACATTAACTGTGACATTTGAGAAAAAGCAAGACTTACGCTA
TGGCGAGAACCCACATCAAAAAGCAACTTTCTATAAAGCGCCATTCGCAGCAACGTCTTCTGTTGCATAC
GCAGAACAATTACACGGTAAGGAATTATCGTATAACAATATTAATGATGCAGACGCAGCGCTTAGCATCG
TAAAAGAATTTACAGAACCAGCAGTAGTAGCAGTAAAGCATATGAATCCATGTGGTGTTGGAGTAGGA
tpi (triosephosphate isomerase) - locus 7
GAGTCAGTAAACAAAAAGACTATCGCAGCATTTGAACATGGTTTAACACCAATCGTATGTTGTGGTGAGA
CTTTAGAAGAGCGCGAAAGCGGAAAAACATTTGATCTAGTAGCAGGTCAAGTGACAAAAGCACTTGCAGG
TTTAACAGAAGAGCAAGTTAAAGCAACTGTTATCGCTTATGAGCCAATCTGGGCTATCGGTACAGGTAAA
TCTTCTTCTTCTGCAGATGCAAACGAAGTATGTGCGCACATCCGTAAAGTTGTTGCAGAAGCTGTTTCTC
CAGAAGCTGCAGAAGCTGTTCGTATCCAATACGGCGGTAGCGTAAAACCAGAAAACATTAAAGAGTATAT
GGCACAATCTGACATCGACGGCGCTTTAGTTGGCGGTGCTAGCTTAGAGCCTGCTTCGTTCTTAGGTCTT
CTGGGGGCGGTAAAA
gmk (guanylate kinase, putative) - locus 8
GTTCTTTCAGGGCCTTCTGGGGTTGGAAAAGGGACGGTTCGTAAAGAGCTGTTTAGCCATGAGGATACAC
GTTTTCAGTACTCTATTTCAGTAACGACACGTAAGCCGCGTGAAGGTGAAGTAGATGGTGTGGATTATTT
CTTTAAAGAAAGAGAAGAATTCGAGGAAATGATTCGTAATGAAAAATTACTTGAGTGGGCTGAGTTCGTA
GGTAATTATTACGGAACACCGATTGACTATGTTGAAAAAACATTACAAGAAGGAAAAGATGTATTCTTAG
AAATTGAAGTGCAAGGAGCAATTCAAGTTAAGAAAGCTTTCCCAGAAGGTGTATTTATTTTCTTAGCACC
TCCAAGTTTATCTGAACTAAAGAGCCGTATTGTCGGACGTGGTACAGAGACTGAAGATGTTATTGAAAAT
RESULTADOS: CAPI TULO 4 | 173
CGTTTAACTGTAGCGAAAGAAGAAATCGAGATGATGGACGCTTACGACTATGTAGTAGAAAACGATCAAG
TTGAATTAGCTTGT
pta (phosphate acetyltransferase) - locus 13
AATTTAACATTAGCAGGCGTTGATATTTACGACCCAGCTACATACGAAGAAATGGATGCGATGGTAGCAT
CTTTCGTTGAACGCCGTAAAGGTAAAGCAACTGAAGAAGACGCTCGCAAAATCCTTAAAGACGAAAACTA
CTTCGGTACAATGCTTGTATACATGGGCAAAGCACACGGTCTAGTAAGTGGTGCAGCTCACTCTACAGCT
GATACAGTTCGTCCAGCACTTCAAATTATTAAAACAAAACCAGGTGTTACAAAAACTTCTGGCGTATTCA
TCATGGTACGTGAAGAAGAGAAATATGTATTCGCTGATTGCGCAATTAACATTGCACCAAACAGCCAAGA
TTTAGCTGAAATCGGTATCGAAAGTGCGAAAACTGCTGAGTTATTCGGCATTGATCCACGCGTT
pycA (pyruvate carboxylase) - locus 16
TACTATGCACCGTTTGAAAGTGGTATGAATGCGCCTCATACAGAGGTATATATGCATGAAATGCCGGGTG
GGCAGTATAGTAATCTTCAGCAACAAGCGAAGGCGGTTGGTTTAGGAGATCGCTTCGATGAAGTGAAAGT
AATGTACCGCCGTGTGAATGACATGTTTGGAGATATTGTAAAAGTAACACCATCATCAAAAGTTGTTGGT
GATATGGCATTATTTATGGTTCAAAACCATCTAACAGAACAAGATGTTTTAGAGCGTGGACATGCGATGG
ACTTCCCAGGGTCTGTTGTTGAAATGTTCTCTGGTGATTTAGGTCAACCGTACGGTGGTTTCCCGAAAGA
ATTACAAAAGATT


Tabla 17. Secuencias obtenidas para los siete loci de B. pumilus M1 utilizados en el anlisis MLST.
glpF (glycerol uptake facilitator protein) - locus 7
GCAGCATATGCGGTTGGATCAATTAGTGGGGCACATTTGAATCCAGCTTTAACAATAGGATTAGCATTTA
AGGGAGCGTTCCCATGGAGTGACGTACCTGGTTATATCGCAGCACAAATGATTGGGGCAATTATCGGGGC
AGTTATCGTATATTTACATTACTTACCACACTGGAAAGAAACAGAAGATCCAGGAACAAAGTTAGGTGTA
TTTGCAACAGGTCCAGCAATTCCGAACACATTTGCAAACCTTTTAAGTGAAATGATTGGAACATTCGTTT
TAGTATTTGGTATATTAGCAATTGGTGCAAATAAATTTGCAGATGGATTAAATCCATTTATCGTAGGTTT
CTTAATTGTAAGTATTGGTTTA
ilvD (dihydroxy-acid dehydratase) - locus 16
GAGGAAGGAGGATTGCGTATATTAAAAGGCAACCTTGCGAAAGATGGAGCGGTTATTAAAAGCGGTGCAA
CAGAGGTAAAGCGTTTTGAAGGACCTTGCGTTATTTTTAATTCACAAGATGAGGCACTTGCTGGCATTAT
GCTTGGGAAAGTGAAAAAAGGAGATGTAGTTGTCATTCGTTACGAAGGACCAAGAGGTGGCCCTGGTATG
CCAGAAATGTTAGCACCAACATCAGCAATTGCTGGAATGGGATTAGGTGCTGAGGTTGCATTATTAACGG
ATGGACGTTTCTCTGGAGCTTCACGTGGAATTTCAGTAGGACATATTTCACCAGAAGCAGCAGCTGGTGG
AACAATCGCACTTCTTGAACAAGGGGATATTGTATGTATTGAT
pur (phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide) - locus 2
AAACGTAAACTAGCAGCGAAAGTATTCCGTCATACAGCAGCGTATGATGCGTTAATTTCTAACTACTTAA
CAGAGCAAATGGGTGAAGAAAGTCCAGAAACATTAACTGTGACATTTGAGAAAAAGCAAGACTTACGCTA
TGGCGAGAACCCACATCAAAAAGCAACTTTCTATAAAGCGCCATTCGCAGCAACGTCTTCTGTTGCATAC
GCAGAACAATTACACGGTAAGGAATTATCGTATAACAATATTAATGATGCAGACGCAGCGCTTAGCATCG
TAAAAGAATTTACAGAACCAGCAGTAGTAGCAGTAAAGCATATGAATCCATGTGGTGTTGGAGTAGGA
tpi (triosephosphate isomerase) - locus 7
GAGTCAGTAAACAAAAAGACTATCGCAGCATTTGAACATGGTTTAACACCAATCGTATGTTGTGGTGAGA
CTTTAGAAGAGCGCGAAAGCGGAAAAACATTTGATCTAGTAGCAGGTCAAGTGACAAAAGCACTTGCAGG
TTTAACAGAAGAGCAAGTTAAAGCAACTGTTATCGCTTATGAGCCAATCTGGGCTATCGGTACAGGTAAA
TCTTCTTCTTCTGCAGATGCAAACGAAGTATGTGCGCACATCCGTAAAGTTGTTGCAGAAGCTGTTTCTC
CAGAAGCTGCAGAAGCTGTTCGTATCCAATACGGCGGTAGCGTAAAACCAGAAAACATTAAAGAGTATAT
GGCACAATCTGACATCGACGGCGCTTTAGTTGGCGGTGCTAGCTTAGAGCCTGCTTCGTTCTTAGGTCTT
CTGGGGGCGGTAAAA
gmk (guanylate kinase, putative) - locus 71
GTTCTTTCAGGGCCTTCTGGGGTTGGAAAAGGGACGGTTCGTAAAGAGCTGTTTAGCCATGAGGATACAC
174 | CAPTULO 4
GTTTTCAGTACTCTATTTCAGTAACGACACGTAAGCCGCGTGAAGGTGAAGTAGATGGTGTGGATTATTT
CTTTAAAGAAAGAGAAGAATTCGAGGAAATGATTCGTAATGAAAAATTACTTGAGTGGGCTGAGTTCGTA
GGTAATTATTACGGAACACCGATTGACTATGTTGAAAAAACATTACAAGAAGGAAAAGATGTATTCTTAG
AAATTGAAGTGCAAGGAGCAATTCAAGTTAAGAAAGCTTTCCCAGAAGGTGTATTTATTTTCTTAGCACC
TCCAAGTTTATCTGAACTAAAAAGCCGTATTGTCGGACGTGGTACAGAGACTGAAGATGTTATTGAAAAT
CGTTTAACTGTAGCGAAAGAAGAAATCGAGATGATGGACGCTTACGACTATGTAGTAGAAAATGATCAAG
TTGAATTAGCTTGT
pta (phosphate acetyltransferase) - locus 26
AATTTAACATTAGCAGGCGTTGATATTTACGACCCAGCTACATACGAAGAAATGGATGCAATGGTAGCAT
CTTTCGTTGAACGCCGTAAAGGTAAAGCAACTGAAGAAGACGCTCGCAAAATCCTTAAAGACGAAAACTA
CTTCGGTACAATGCTTGTATACATGGGCAAAGCACACGGTCTAGTAAGTGGTGCAGCTCACTCTACAGCT
GATACAGTTCGTCCAGCACTTCAAATTATTAAAACAAAACCAGGTGTTACAAAAACTTCTGGCGTATTCA
TCATGGTACGTGAAGAAGAGAAATATGTATTCGCTGATTGCGCAATTAACATTGCACCAAACAGCCAAGA
TTTAGCTGAAATCGGTATCGAAAGTGCGAAAACTGCTGAGTTATTCGGCATTGATCCACGCGTT
pycA (pyruvate carboxylase) - locus 16
TACTATGCACCGTTTGAAAGTGGTATGAATGCGCCTCATACAGAGGTATATATGCATGAAATGCCGGGTG
GGCAGTATAGTAATCTTCAGCAACAAGCGAAGGCGGTTGGTTTAGGAGATCGCTTCGATGAAGTGAAAGT
AATGTACCGCCGTGTGAATGACATGTTTGGAGATATTGTAAAAGTAACACCATCATCAAAAGTTGTTGGT
GATATGGCATTATTTATGGTTCAAAACCATCTAACAGAACAAGATGTTTTAGAGCGTGGACATGCGATGG
ACTTCCCAGGGTCTGTTGTTGAAATGTTCTCTGGTGATTTAGGTCAACCGTACGGTGGTTTCCCGAAAGA
ATTACAAAAGATT

El perfil MLST de B. pumilus 15.1 coincide perfectamente en todos los loci, con el ST8 (Tabla
18), por lo que inequvocamente fue clasificada dentro de este tipo de secuencia. El perfil de B.
pumilus M1 no coincidi en todos los loci con el perfil allico ST8, variando en los loci de los
genes gmk y pta (Tabla 18); sin embargo, esta cepa tambin fue tipificada como perteneciente al
ST8, segn el criterio propuesto por Urwin & Maiden (2003), el cual menciona que una cepa
debe compartir cuatro o mas loci con un perfil allico para ser incluida dentro de un ST.
El ST8 incluye a cepas de B. thuringiensis, B. thuringiensis kurstaki, B. cereus y otros aislados
bacterianos sin clasificacin, siendo definido como un genotipo mayoritariamente
entomopatgeno (Raymond et al. 2010).

Tabla 18. Perfil allico MLST de siete genes housekeeping de B. pumilus 15.1 y B. pumilus M1, para la
identificacin genotpica de su tipo de secuencia (ST).
Cepas
bacterianas
Genes - Loci
STs
glp gmk ilv pta pur pyc tpi
B. pumilus 15.1 7 8 16 13 2 16 7 8
B. pumilus M1 7 71 16 26 2 16 7 8
a
a
B. pumilus M1 fue asignada dentro del ST8, a pesar de diferir en dos loci, ya que una cepa debe compartir cuatro o
mas loci con un perfil allico para ser incluida dentro de un ST.
RESULTADOS: CAPI TULO 4 | 175

La Tabla 19 detalla las cepas incluidas en este anlisis filogentico y sus correspondientes tipos
de secuencias.

Tabla 19. Cepas bacterianas y sus tipos de secuencias (STs) incluidas en el anlisis filogentico realizado utilizando
el esquema MLST para el grupo de B. cereus.
Especie - serovar STs
B. thuringiensis
9, 10, 64, 114, 192, 195, 200, 518, 534,
540
B. thuringiensis tenebrionis 23
B. thuringiensis kurstaki 10, 545
B. thuringiensis israelensis 16, 65
B. thuringiensis entomocidus 14
B. thuringiensis sotto 12, 49
B. thuringiensis aizawai 15 (aislada de Espaa)
B. cereus 223
B. anthracis 3


El anlisis filogentico basado en el mtodo MLST de diferentes cepas patgenas muestra que B.
pumilus 15.1 esta cercanamente relacionada con el ST195 (Fig. 41). El ST195 incluye
mayoritariamente a aislados de B. thuringiensis (sin clasificacin de serovar). B. pumilus M1,
que difiere en dos loci con B. pumilus 15.1, y por lo tanto con el ST8, est tambin cercanamente
relacionada con la cepa 15.1 (Fig. 41). Curiosamente, una cepa de B. thuringiensis aizawai,
representada por el ST15 en el anlisis filogentico, aislada en Espaa (Tabla 19), se encuentra
en una posicin cercana a B. pumilus 15.1 y B. pumilus M1, las cuales tambin fueron aisladas
en Espaa.

176 | CAPTULO 4


Figura 41. Relacin filogentica de B. pumilus 15.1 y B. pumilus M1 con otras cepas patgenas, basada en los
perfiles allicos de siete genes housekeeping. La distancia del vnculo est indicada por la escala en la parte inferior
de la figura.


Las STs 16 y 65 de B. thuringiensis israelensis, patgena para dpteros, no se encuentran en una
posicin prxima a B. pumilus 15.1. De igual manera, el ST545, que representa a B.
thuringiensis kurstaki, tambin con propiedades insecticidas frente a especies de dpteros
(Widner and Whiteley 1989, 1990), se encuentra relativamente alejado del clado donde est B.
B. pumilus
15.1
RESULTADOS: CAPI TULO 4 | 177
pumilus 15.1. Este resultado sugiere que la patogenicidad frente a un grupo de insectos, a
dpteros en este caso, al parecer no est directamente relacionada con el perfil allico MLST.

Los STs 223 y 3, que representan a cepas de B. cereus y B. anthracis respectivamente, se
encuentran alejados de la posicin de B. pumilus 15.1 y B. pumilus M1. Se eligi la inclusin de
estos dos tipos de secuencias como grupos externos, debido a que son las nicas cepas del
anlisis que no patgenas para insectos.


(Bauer et al. 1966)

















CAPITULO 5
























RESULTADOS: CAPI TULO 5 | 181

El modelo actual existente para explicar el mecanismo de accin que B. thuringiensis tiene para
invadir y provocar la muerte de insectos susceptibles, implica un proceso inicial de lisis de las
clulas epiteliales del intestino, producida por la accin de las toxinas Cry. Esta lisis desencadena
la muerte por inanicin, o septicemia. Sin embargo, recientemente se ha sugerido que la
comunidad microbiana del intestino de algunos insectos podra jugar un papel importante en el
proceso de invasin de B. thuringiensis a su hospedador. Broderick et al. (2006) demostraron que
B. thuringiensis no es capaz de matar a las larvas de Lymantria dispar en ausencia de las
bacterias naturales del intestino medio del insecto (eliminadas por administracin oral de
antibiticos), sugiriendo que la mortalidad inducida por B. thuringiensis depende de la presencia
de las bacterias entricas; y proponiendo, de esta manera, una nueva hiptesis en el modo de
accin de B. thuringiensis. Un trabajo posterior extendi la idea de este nuevo mecanismo de
accin a un amplio rango de insectos hospedadores (Broderick et al. 2009).

Despus de la publicacin del estudio de Broderick et al. (2006), ha habido un creciente nmero
de trabajos realizados por otros grupos de investigacin para evaluar la validez de esta hiptesis
en otros insectos, obtenindose resultados contradictorios. As por ejemplo, el estudio realizado
por Raymond et al. (2009) concluy que las bacterias del intestino medio no son necesarias para
la patogenicidad de B. thuringiensis en larvas de Plutella xylostella. Este contexto demuestra que
la patogenicidad de bacterias en insectos es un mecanismo complejo, lo que hace necesario el
estudio de cada caso en particular, debido a la alta diversidad de variables.

Ceratitis capitata posee una comunidad bacteriana en su sistema digestivo dominada por la
familia Enterobacteriaciae, y cuyas especies poseen propiedades diazotrficas y pectinolcticas
(Behar et al. 2005, Behar et al. 2008b). Esta comunidad bacteriana est presente en todos los
estadios del ciclo de vida de la mosca, contribuye a la toma de nitrgeno, al metabolismo del
carbono, y la eliminacin de esta comunidad puede causar problemas fisiolgicos y de
comportamiento (Ben-Yosef et al. 2008). Debido a la importancia de la microbiota natural de C.
capitata y a lo anteriormente sugerido para B. thuringiensis, se quiso comprobar si la comunidad
bacteriana nativa de larvas de C. capitata est involucrada en el mecanismo de patogenicidad de
B. pumilus 15.1.
182 | CAPTULO 5

En este captulo se detallan los estudios realizados para determinar la comunidad bacteriana
presente en el intestino de larvas de C. capitata de una poblacin moscas criadas en laboratorio,
su posible papel en la invasin por un patgeno, y el efecto de la presencia de B. pumilus 15.1
sobre esta comunidad microbiana. Este estudio se llev a cabo mediante mtodos cultivo-
dependientes y tcnicas moleculares.


4.24 ELIMINACIN DE LA MICROBIOTA DEL INTESTINO DE LARVAS DE C. CAPITATA
Con el propsito de determinar el papel de la comunidad bacteriana del intestino de C. capitata
en la patogenicidad de B. pumilus 15.1, se procedi a obtener larvas aspticas. Para ello, se
esterilizaron huevos con cuatro tratamientos diferentes, utilizando formaldehdo e hipoclorito de
sodio a diferentes concentraciones y tiempos de exposicin. Posteriormente, los huevos se
sembraron en dieta artificial estril para larvas.

Despus de siete das, 10 larvas recogidas de cada uno de los tratamientos se desinfectaron
superficialmente sumergindolas en etanol 70%, se les extrajeron los intestinos mediante
diseccin bajo estereoscopio y se mantuvieron en 300 l de tampn salino estril (PBS) a
temperatura ambiente. Los intestinos se homogenizaron y se sembraron en placas con medio LB,
o se utilizaron como material de partida para la extraccin de ADN y posterior amplificacin por
PCR. La eficiencia de los tratamientos para eliminar la comunidad bacteriana nativa del intestino
medio se estim sembrando diluciones seriadas de los intestinos homogenizados en placas de
LB. El crecimiento bacteriano se revis despus de 24 horas de incubacin a 30C.

El tratamiento con hipoclorito de sodio al 2% durante 3 min redujo varios rdenes de magnitud
la comunidad bacteriana del intestino de 10
9
CFUs/intestino a 10
4
CFUs/intestino (en promedio),
mientras que las larvas tratadas con hipoclorito de sodio al 2% durante 30 seg no mostraron
diferencias con las larvas no esterilizadas (10
9
CFUs/intestino). Se observ que los huevos
tratados con formaldehdo e hipoclorito de sodio al 2% durante 5 min no eclosionaron; sin
embargo estas huevos tambin fueron analizados mediante tcnicas moleculares para comprobar
su eficiencia en eliminar la microbiota nativa del intestino. En estos dos ltimos tratamientos se
homogenizaron los huevos para su posterior anlisis.
RESULTADOS: CAPI TULO 5 | 183
La eficacia de eliminacin de la comunidad bacteriana presente en las larvas de C. capitata en
los tratamientos de esterilizacin anteriormente mencionados se comprob tambin mediante
mtodos moleculares. Para ello, se aisl el ADN total del intestino de las larvas usando el
mtodo CTAB (Ausubel et al. 1999) y se us como molde para la amplificacin por PCR. La
amplificacin fue realizada usando el par de primers para eubacterias 968f-1401r que amplifican
parcialmente (~433 bp) el gen 16S rRNA (Heuer et al. 1997). La amplificacin fue comprobada
por electroforesis en un gel de agarosa 2% (p/v) en buffer TAE. La Figura 42 muestra que todas
las muestras de ADN total procedente de los intestinos de larvas de C. capitata crecidas en
condiciones estriles contenan bacterias suficientes para su deteccin por mtodos moleculares.
En otras palabras, ninguno de los tratamientos utilizados elimin completamente la comunidad
bacteriana (Fig. 42).




Figura 42. Electroforesis en gel de agarosa (2,0%) de productos de PCR realizada para amplificar parcialmente el
gen 16S rRNA de la comunidad bacteriana del intestino de larvas de C. capitata. Las muestras corresponden a larvas
sometidas al tratamiento indicado. M: Marcador de peso molecular. Calles 1 y 2: formaldehdo al 10% durante 10
min; Calles 3 y 4: NaClO al 2% durante 3 min; Calle 5: NaClO al 2% durante 5 min; Calles 6 y 7: NaClO al 2%
durante 30 seg; Calles 8-10: sin tratamiento de esterilizacin.


Debido a que ninguno de los tratamientos de desinfeccin de huevos de C. capitata utilizados
tuvo xito en la completa eliminacin de la microbiota natural del intestino, se procedi a
emplear otras estrategias. Para ello se decidi combinar el tratamiento de esterilizacin
superficial de huevos ms eficiente (hipoclorito de sodio al 2% durante 3 min) con la
incorporacin de antibiticos en la dieta de larvas, con el propsito intensificar la eliminacin de
la comunidad bacteriana del intestino de las larvas de C. capitata. La susceptibilidad a
antibiticos de las bacterias asociadas al intestino de C. capitata se encuentra documentada en el
184 | CAPTULO 5

trabajo de Ben-Yosef et al. (2008). Basndonos en este trabajo, los huevos de C. capitata,
previamente tratados con hipoclorito de sodio al 2% durante 3 min, se sembraron en dieta
suplementada con cido nalidxico (10 g/ml) y ampicilina (100 g/ml), o en dieta libre de
antibiticos. Las mezclas de dieta fueron esterilizadas previamente a la adicin de los
antibiticos. Despus de la esterilizacin superficial de los huevos de C. capitata y la
alimentacin de las larvas en presencia de antibiticos, la comunidad bacteriana se redujo de 10
9
CFUs/intestino a 10
1
CFUs/intestino.

Congruente con el resultado del conteo de bacterias cultivables, el anlisis por PCR de la
presencia de la comunidad bacteriana demostr que el tratamiento de esterilizacin combinado
con antibiticos reduce a la misma, pero no la elimina completamente. El tratamiento de
hipoclorito de sodio al 2% durante 3 min en combinacin con los antibiticos incorporados en la
dieta de larvas elimin la comunidad bacteriana slo en algunas de las muestras, mostrando la
ausencia de bandas claramente detectables en una de las cuatro muestras de intestino analizadas
(Calle 5, Fig. 43).


Figura 43. Electroforesis en gel de agarosa (2,0%) de productos de PCR realizada para amplificar parcialmente el
gen 16S rRNA de la comunidad bacteriana del intestino de larvas de C. capitata. Las muestras corresponden a larvas
sometidas al tratamiento indicado. M: Marcador de peso molecular; Calle 1: control positivo de la reaccin (ADN
total del intestino de larva de Plutella xylostella); Calle 2: control negativo de la reaccin; Calles 3-6: larvas tratadas
con hipoclorito de sodio 2% durante 3 min y criadas en dieta estril suplementada con antibiticos.


4.25 DETERMINACIN DEL PAPEL DE LA COMUNIDAD BACTERIANA DE LARVAS DE C.
CAPI TATA EN LA PATOGENICIDAD DE B. PUMI LUS 15.1
Con el propsito de evaluar el papel de la comunidad bacteriana del intestino de larvas de C.
capitata en la patogenicidad causada por B. pumilus 15.1, se llevaron a cabo bioensayos con
RESULTADOS: CAPI TULO 5 | 185
larvas de primer estadio, bajo la metodologa estndar. Quinientos microlitros de dieta artificial
fueron mezclados con 100 l de un cultivo esporulado a tres diferentes concentraciones (3x, 10x
y 30x), para llevar a cabo anlisis de supervivencia. El cultivo esporulado fue tratado bajo las
condiciones necesarias para que la toxicidad de B. pumilus 15.1 fuera revelada (96 horas a 4C).
Se usaron 72 larvas en cada dosis. Se incluyeron como controles a la cepa no entomopatgena
M1, y dieta no contaminada con bacterias (medio T3).

Adems, en los bioensayos llevados a cabo con el objetivo de determinar el papel de la
comunidad bacteriana en la toxicidad de B. pumilus 15.1, se incluyeron como tratamientos a
larvas tratadas con hipoclorito de sodio al 2% durante 3 min y alimentadas con dieta estril
suplementada con cido nalidxico y ampicilina, as como larvas procendentes de huevos
tratados con hipoclorito de sodio al 2% durante 3 min, y alimentadas con dieta no estril. Se
ensayaron un mnimo de doce larvas por dosis en estos dos tratamientos.
La mortalidad se registr 4, 7 y 10 das despus del inicio del bioensayo. Con estos datos, se
llev a cabo un anlisis de supervivencia y un anlisis de variancia usando el programa R
(http://www.r-project.org/). Para llevar a cabo el anlisis de supervivencia se usaron los datos de
la mortalidad acumulativa de larvas, y se aplicaron los modelos de riesgo proporcional de Cox
(Cox proportional hazard models), los cuales se basan en la asuncin de probabilidad constante
de muerte.

La Tabla 20 muestra el porcentaje de mortalidad al final del experimento (10 das). Los anlisis
realizados mostraron diferencias significativas en la probabilidad de supervivencia (P < 0,01),
indicando que las larvas de los controles negativos, la cepa no patgena B. pumilus M1 y el
medio T3, poseen mayor probabilidad de sobrevivir en comparacin con las larvas tratadas con
la cepa 15.1. Por otro lado, en estos experimentos, el aumento de la dosis de B. pumilus 15.1,
tuvo efecto en la mortalidad de las larvas (P < 0,05), sugiriendo que a dosis ms altas (30x) los
tratamientos bacterianos producen una mayor mortalidad en larvas de C. capitata. Lo mismo
ocurri con B. pumilus M1. Sin embargo, como ha ocurrido en bioensayos anteriores, B. pumilus
15.1 (10x) es el tratamiento que mayor mortalidad caus despus de 10 das del inicio del
experimento (85,42%), seguido por el cultivo concentrado 30 veces (83,33%) (Tabla 20).

186 | CAPTULO 5

Tabla 20. Porcentaje de mortalidad de larvas de C. capitata, despus de 10 das del inicio del bioensayo, causada
por cultivos de dos cepas de B. pumilus a tres concentraciones distintas. Las larvas utilizadas en los bioensayos
fueron sometidas previamente a diferentes tratamientos de esterilizacin, por lo que la densidad de la comunidad
bacteriana de estas larvas fue distinta para cada tratamiento.
Tratamiento
bacteriano
Dosis Tratamiento de esterilizacin (N =
888)
Mortalidad (%)
B. pumilus 15.1
3x
Sin tratamiento (72) 63,89
NaClO 2% 3 min (12) 58,33
NaClO 2% 3 min + ant. (12) 75,00
10x
Sin tratamiento (96) 85,42
NaClO 2% 3 min (24) 70,83
NaClO 2% 3 min + ant. (24) 41,67
30x
Sin tratamiento (72) 83,33
NaClO 2% 3 min (12) 66,67
NaClO 2% 3 min + ant. (12) 75,00
B. pumilus M1
3x
Sin tratamiento (72) 20,83
NaClO 2% 3 min (12) 33,33
NaClO 2% 3 min + ant. (12) 16,67
10x
Sin tratamiento (96) 20,83
NaClO 2% 3 min (24) 33,33
NaClO 2% 3 min + ant. (24) 12,50
30x
Sin tratamiento (72) 26,39
NaClO 2% 3 min (12) 25,00
NaClO 2% 3 min + ant. (12) 8,33
Medio T3
3x
Sin tratamiento (48) 20,83
NaClO 2% 3 min (12) 25,00
NaClO 2% 3 min + ant. (12) 16,67
10x
Sin tratamiento (48) 18,75
NaClO 2% 3 min (12) 25,00
NaClO 2% 3 min + ant. (12) 16,67
30x
Sin tratamiento (48) 20,83
NaClO 2% 3 min (12) 16,67
NaClO 2% 3 min + ant. (12) 16,67
ant: antibiticos.


El tratamiento previo de los huevos de C. capitata con hipoclorito de sodio al 2% durante 3 min
redujo ligeramente el porcentaje de mortalidad causado por B. pumilus 15.1, en las tres
concentraciones ensayadas comparado con los bioensayos sin esterilidad; lo mismo ocurri
cuando este tratamiento se realiz en combinacin con antibiticos suplementados en la dieta de
larvas. Sin embargo el anlisis realizado con los tratamientos de esterilizacin no mostraron
diferencias significativas en la tasa de mortalidad de larvas (P > 0,05), sugiriendo que la
presencia de la totalidad de la microbiota natural del intestino, o su reduccin no afecta a la
RESULTADOS: CAPI TULO 5 | 187
actividad insecticida de B. pumilus 15.1 en C. capitata. Sin embargo, al dividir los tratamientos
de esterilizacin, segn si la dieta en la que crecieron las larvas hubiera sido suplementada con
antibiticos o no, se registraron diferencias significativas en la supervivencia (P < 0,05); lo cual
podra sugerir que la presencia de antibiticos en la dieta incrementa la probabilidad de
supervivencia de larvas de C. capitata, o que los antibiticos podran estar afectando de alguna
manera la actividad entomopatgena de B. pumilus 15.1.


4.26. ESTUDIO DE LA COMUNIDAD BACTERIANA DEL INTESTINO DE LARVAS DE C.
CAPI TATA MEDIANTE MTODO CULTIVO-DEPENDIENTE
Tras 7 das del inicio del bioensayo, se tomaron separadamente larvas muertas y supervivientes
al efecto de B. pumilus 15.1. Las larvas se esterilizaron superficialmente, como se describi
anteriormente, por inmersin en etanol 70% durante varios minutos, tras lo cual fueron
disectadas individualmente, tomando su intestino y homogeneizndolo en PBS estril. El
homogenado fue usado para estimar numricamente la comunidad bacteriana cultivable mediante
siembra en placa, de un total de 90 intestinos de larvas.

La estimacin del total de bacterias cultivables se realiz mediante la siembra de diluciones
seriadas de los homogenados de cada intestino. Se realizaron al menos ocho rplicas por cada
tratamiento bacteriano. En algunos casos fue necesario el aislamiento de colonias a partir de un
csped de crecimiento bacteriano en la superficie de las placas, tras lo cual se llevaron a cabo al
menos tres ciclos de seleccin (por resiembra en placas con LB). Aunque se ensayaron tres
concentraciones de cultivo diferentes, se tom una nica una muestra de cada concentracin, ya
que no hubo diferencias en el orden de magnitud del nmero de CFUs entre concentraciones del
mismo tratamiento (datos no mostrados).

La Tabla 21 muestra el promedio de CFUs obtenidas por intestino en larvas sometidas a
diferentes tratamientos. El mayor nmero de bacterias cultivables se registr en intestinos de
larvas alimentadas nicamente con medio T3 (10
10
CFUs/intestino). Por otro lado, y como se
seal anteriormente, el tratamiento en el que se registr menor nmero de bacterias cultivables
fue el de hipoclorito de sodio al 2% durante 3 min en combinacin con antibiticos incorporados
188 | CAPTULO 5

en la dieta (10
1
CFUs/intestino). La comunidad bacteriana presente en cadveres de larvas
tratadas con B. pumilus 15.1 fue comparativamente menor, en dos rdenes de magnitud, a la de
las larvas supervivientes del mismo tratamiento; sin embargo, esto no ocurri al comparar los
cadveres y larvas supervivientes del bioensayo con B. pumilus M1. Este resultado podra sugerir
que B. pumilus 15.1 se ha multiplicado dentro de los cadveres de larvas tratadas con esta cepa
entomopatgena, reduciendo su microbiota nativa; mientras que B. pumilus M1, en su condicin
de cepa no patgena, no aprovechara los nutrientes presentes en las larvas de C. capitata.


Tabla 21. Conteo del nmero total de bacterias cultivables presentes en los intestinos de larvas de C. capitata de los
diferentes tratamientos bacterianos y de esterilizacin. Las larvas utilizadas para el conteo de bacterias cultivables
fueron sometidas al tratamiento bacteriano o al tratamiento de esterilizacin indicado.
Tratamientos (bacteriano
esterilizacin)
Estado de las larvas (n) CFUs/intestino ( DE)
B. pumilus 15.1
Supervivientes (8) 1,15 x 10
10
6.35 x 10
9

Cadveres (4) 7,60 x 10
6
1,29 x 10
7

B. pumilus M1
Supervivientes (6) 9,05 x 10
9
1,52 x 10
9

Cadveres (2) 8,20 x 10
9
8,60 x 10
9

NaClO 2% - 3 min Supervivientes (8) 1,79 x 10
4
2,19 x 10
4

NaClO 2% - 3 min + antibiticos Supervivientes (8) 2,56 x 10
1
2,90 x 10
1

Medio T3 T3 (8) 3,24 x 10
10
2,38 x 10
10



Del total de bacterias seleccionadas en la siembra en placas a partir de los homogenados de los
intestino, se aislaron 11 morfotipos cultivables en LB (y bsicamente diferenciables de la
morfologa tpica de colonia de B. pumilus). Todos los morfotipos aislados se identificaron
mediante amplificacin por PCR de colonia de la secuencia del gen 16S rRNA, usando los
cebadores (primers) 338f y 518r. La identificacin de los 11 morfotipos cultivables, el
tratamiento del cual se obtuvieron las larvas, as como el nmero de acceso al GenBank de la
cepa que mostr mayor identidad, se detallan en la Tabla 22.








RESULTADOS: CAPI TULO 5 | 189
Tabla 22. Morfotipos bacterianos cultivables aislados de los intestinos de larvas de C. capitata.
Morfotipo Estado de la larva
Clasificacin (% Identidad) Nmero de acceso
en GenBank
Tratamiento (bacteriano
esterilizacin)
1 cadver Bacillus sp. GTB-52 (98) AM400894.1 B. pumilus 15.1
2 cadver
Bacteria no clasificada 53
(97)
DQ235570.1 B. pumilus 15.1
3 cadver Bacillus pumilus B1 (98) HM224386.1 B. pumilus 15.1
4 superviviente Bacillus cereus PGS2 (97) AY803744.1 B. pumilus 15.1
5 superviviente Klebsiella sp. A36 (98) GU428702.1 B. pumilus 15.1
6 superviviente Bacillus pumilus C40 (98) FJ577662.1
B. pumilus 15.1 - NaClO
2% 3 min
7 cadver Bacillus pumilus AaH-1 (98) EU368170.1 B. pumilus M1
8 superviviente Enterobacter sp. IR16 (94) GU726503.1 NaClO 2% - 3 min + ant.
9 superviviente Kocuria sp. M2T9B2 (97) GQ246714.1 NaClO 2% - 3 min + ant.
10 superviviente Klebsiella pneumoniae (90) AY736552.1 EtOH 70% - 5 min
11 superviviente
Bacteria no clasificada
nbw1175d03c1 (81)
GQ078927.1 Sin tratamiento
Los morfotipos cultivables fueron identificados usando la secuencia del gen 16S rRNA comparndola con la
herramienta BLASTn.
ant: antibiticos


Tres de los morfotipos bacterianos aislados fueron clasificados como B. pumilus; estas cepas
corresponden a larvas alimentadas con dieta contaminada con B. pumilus 15.1 o M1, lo que
sugiere que la seleccin visual de aislados que diferan morfolgicamente de esta especie no fue
exitosa. Adems, al realizar un alineamiento (utilizando el programa CLUSTALX) de la
secuencia parcial del gen 16S rRNA de B. pumilus 15.1, con las secuencias de los morfotipos 1 y
6, se obtuvieron valores de 99% en los dos casos. Esto sugiere que dos de los morfotipos
seleccionados podran corresponder a B. pumilus 15.1 recuperada a partir de larvas muertas y
supervivientes de C. capitata. Otra de las muestras fue identificada como B. cereus. Por otro
lado, cuatro de los aislados fueron identificados como bacterias pertenecientes a gneros
anteriormente descritos como simbiontes facultativos de insectos (Klebsiella sp., K. pneumoniae,
Enterobacter sp. y Kocuria sp.) (Wenzel et al. 2002, Behar et al. 2005). Adems, curiosamente,
dos de los aislados bacterianos presentaron elevado porcentaje de identidad con cepas
consideradas no cultivables, a pesar de que se obtuvieron a travs de cultivo.


190 | CAPTULO 5

4.27. ESTUDIO DE LA COMUNIDAD BACTERIANA DEL INTESTINO DE LARVAS DE C.
CAPI TATA MEDIANTE MTODO CULTIVO-INDEPENDIENTE
Para este estudio se extrajo el ADN total de un homogenado del intestino de las larvas
seleccionadas en los bioensayos. El ADN total extrado de la comunidad bacteriana nativa fue
usado como molde en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), usando un par de cebadores
para amplificar parcialmente el gen 16S rRNA (Raymond et al. 2008). Los cebadores usados
fueron GC-338f (que posee una cola rica en GC) y 518r. Como controles negativos se incluyeron
muestras que no contenan ADN molde. El xito de la amplificacin se comprob mediante
electroforesis en geles de agarosa al 2% (p/v) (Fig. 44).




Figura 44. Electroforesis en gel de agarosa (2,0%) de productos de PCR resultante de amplificar parcialmente el
gen 16S rRNA a partir del ADN total extrado de la comunidad bacteriana del intestino de larvas de C. capitata. Si
no se especifica lo contrario, las muestras corresponden a larvas supervivientes sometidas al tratamiento indicado.
M: Marcador de peso molecular. Calles 1-6: larvas sin esterilizar en presencia de Bp 15.1; Calles 7 y 8: cadveres,
sin tratamiento de esterilizacin en presencia de Bp 15.1; Calles 9-12: larvas de huevos tratados con NaClO al 2%
durante 3 min mas antibiticos en presencia de Bp 15.1; Calles 13-18: larvas sin esterilizar en presencia de Bp M1;
Calles 19 y 20: cadveres, sin esterilizar en presencia de Bp M1; Calles 21-24: larvas de huevos tratados con NaClO
al 2% durante 3 min mas antibiticos en presencia de Bp M1; Calles 25-30: larvas sin esterilizar y en asuencia de
cultivo bacteriano (medio T3); Calles 31 y 32: cadveres, sin esterilizar y en asuencia de cultivo bacteriano (medio
T3); Calles 33-36: larvas de huevos tratados con NaClO al 2% durante 3 min, en asuencia de cultivo bacteriano;
Calles 37-40: larvas de huevos tratados con NaClO al 2% durante 3 min mas antibiticos en asuencia de cultivo
RESULTADOS: CAPI TULO 5 | 191
bacteriano; Calle 41: control negativo de la reaccin; Calle 42: control positivo de la reaccin (ADN total del
intestino de larva de Plutella xylostella). Bp: B. pumilus.


Una vez comprobado el xito de la reaccin, los productos de PCR fueron separados mediante
electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacin (DGGE). El DGGE es una tcnica
electrofortica realizada en geles de poliacrilamida que permite separar molculas de ADN de
igual tamao, de hasta 700 pares de bases, pero de secuencia distinta. Con esta tcnica se pueden
separar molculas con tan slo una base de diferencia en condiciones de gradiente de
concentracin optimizado de formamida-urea (Muyzer and Smalla 1998). La separacin de las
molculas de ADN se consigue porque durante su migracin por el gel de poliacrilamida, el
ADN se encuentra con concentraciones crecientes de los agentes desnaturalizantes formamida y
urea, lo que genera diferentes horquillas de desnaturalizacin, segn la secuencia de las
molculas de ADN, traducindose en una variacin en la velocidad de migracin y una
separacin de fragmentos de ADN con migracin electrofortica diferente. Esta tcnica es de
gran utilidad en el estudio de comunidades bacterianas complejas y tiene la ventaja de que es
independiente de que la bacteria pueda ser cultivable. Una vez las molculas de ADN quedan
separadas en el gel, es posible recortarlas, recuperar el ADN y secuenciarlo, con el propsito de
identificar las bacterias que existen en la comunidad bajo estudio o someter las imgenes
digitalizadas de los geles a anlisis densitomtricos para estudiar el cambio de la comunidad
bacteriana que ocurre al modificar las condiciones ambientales.

Mediante la utilizacin de la tcnica de DGGE se compar la microbiota nativa del intestino de
larvas de C. capitata en presencia y ausencia de B. pumilus, tanto de la cepa patgena 15.1 como
de la no virulenta M1. El anlisis del ADN amplificado mediante PCR en geles
desnaturalizantes, llevado a cabo a partir de larvas supervivientes de los bioensayos (Fig. 45),
revel que la comunidad bacteriana que habita en el intestino de larvas demostr gran estabilidad
en los tratamientos con la cepa control, no patgena (B. pumilus M1), tanto en larvas sometidas a
tratamiento de esterilizacin, como las no sometidas a tratamiento de esterilizacin. Justo lo
contrario se observ en la comunidad de bacterias aislada de larvas tratadas con B. pumilus 15.1
(Fig. 45, calles 1-10). Este resultado sugiere que la comunidad de bacterias residente en el
intestino est profundamente afectada por la presencia de B. pumilus 15.1.

192 | CAPTULO 5


1 2 3 5 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 20 17 19 18 23 22 21 25 24 27 27 26 31 28 29 30 32
Figura 45. Electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacin de productos de PCR del gen 16S rRNA de
bacterias procedentes de intestinos de larvas de C. capitata supervivientes a los bioensayos de contaminacin de
dieta. Calles 1-6: Comunidad bacteriana de larvas no esterilizadas y tratadas con B. pumilus 15.1; Calles 7-10:
Comunidad bacteriana de larvas esterilizadas con NaClO al 2% durante 3 min ms antibiticos, y tratadas con B.
pumilus 15.1; Calle 11: Cultivo de B. pumilus 15.1; Calle 12: Cultivo de B. pumilus M1; Calles 13-18: Comunidad
bacteriana de larvas no esterilizadas y tratadas con B. pumilus M1; Calles 19-22: Comunidad bacteriana de larvas
esterilizadas con NaClO al 2% durante 3 min ms antibiticos y tratadas con B. pumilus M1; Calles 23-28:
Comunidad bacteriana de larvas no esterilizadas y tratadas con medio T3 (sin bacterias incorporadas en la dieta);
Calles 29-32: Comunidad bacteriana de larvas esterilizadas con NaClO al 2% durante 3 min ms antibiticos y
tratadas con medio T3 (sin bacterias incorporadas en la dieta).


Este anlisis tambin demostr que la variabilidad (en trminos de presencia) de la comunidad
microbiana en larvas sometidas al mismo tratamiento no es muy elevada, encontrndose
similitud en los patrones entre intestinos de larvas tratadas de la misma manera. Adems, es
evidente que en las larvas sometidas a tratamiento de esterilizacin (NaClO al 2% durante 3 min
ms antibiticos incorporados en la dieta) hay menor diversidad microbiana que en las larvas no
sometidas a dicho tratamiento (e.g. comparar calles 1-6 vs. calles 7-10, Fig. 45). De la misma
RESULTADOS: CAPI TULO 5 | 193
manera, este gel revel que el nmero de bandas presentes, y por lo tanto la diversidad
bacteriana, es mayor en larvas no tratadas con bacterias (medio T3), que en larvas sometidas a
cualquiera de los dos tratamientos bacterianos (15.1 o M1).

Por otro lado, la comparacin de los patrones de bandas en intestinos de larvas de C. capitata sin
tratamiento bacteriano, e intestinos de larvas de C. capitata contaminada con B. pumilus
mostraron evidencia limitada de que los cultivos puros dominen la comunidad bacteriana del
intestino en alguno de los tratamientos. Las bandas de B. pumilus 15.1 y B. pumilus M1 no estn
comnmente presentes en la comunidad bacteriana de larvas supervivientes (Fig. 45) ni en larvas
muertas (Fig. 46). Sin embargo, es posible detectar la presencia de B. pumilus 15.1 en algunas de
las muestras previamente tratadas con esta bacteria (e.g. calle 9, Fig. 45).


1 2 3 5 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 20 17 19 18 23 22 21 25 24 27 26

194 | CAPTULO 5

Figura 46. Electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacin de productos de PCR del gen 16S rRNA, de
bacterias procedentes de intestinos de larvas de C. capitata muertas (calles 1-17) y supervivientes (calles 18-27).
Calles 1-5: Comunidad bacteriana de larvas no esterilizadas y tratadas con B. pumilus 15.1; Calle 6: Cultivo de B.
pumilus 15.1; Calle 7: Cultivo de B. pumilus M1; Calles 8-13: Comunidad bacteriana de larvas no esterilizadas y
tratadas con B. pumilus M1; Calles 14-17: Comunidad bacteriana de larvas no esterilizadas y tratadas con medio T3
(sin bacterias incorporadas en la dieta); Calles 18-27: Comunidad bacteriana de larvas supervivientes esterilizadas
con NaClO al 2% durante 3 min ms antibiticos, y tratadas con medio T3 (sin bacterias incorporadas en la dieta).


La comparacin de las comunidades bacterianas de larvas sometidas a tratamientos de
esterilizacin versus larvas no estriles sugiere que en aquellas larvas tratadas para eliminar la
comunidad bacteriana, hay menos diversidad bacteriana y ms variabilidad; aunque, no fuera
posible eliminarla por completo. Sin embargo, el tratamiento de esterilizacin parece eliminar
ciertos taxa (e.g. las dos bandas inferiores sealadas en la Fig. 45).



























5
5. . D D I I S S C C U U S S S S I I O O N N





















DI SCUSSI ON | 197

The control of Ceratitis capitata populations to reduce its economical impact has been
approached by numerous methods. Insecticide treatment is the most widely used strategy for
field control of this insect pest, mainly based on aerial and ground treatments with
organophosphates. Chemical insecticide treatment not only is environmental unfriendly for its
unspecific action but also worrying for the resistance phenomenon observed on fields. Moreover,
this type of control has been ineffective over the long-term, and losses associated with C.
capitata worldwide are constantly increasing. Biological control offers an attractive alternative to
synthetic chemical pesticides. Biopesticides based on entomopathogenic bacteria (e.g. Bacillus
strains) and naturally-ocurring compounds produced by these organisms, can be safer, more
biodegradable, and less expensive to develop. However, there is not any commercialized product
based on bacterial strain exhibiting insecticidal activity against C. capitata.

This work aims to search for novel bacterial strains, belonging to the genus Bacillus, with
insecticidal activity against the Mediterranean fruit fly, which could be the base for the future
developing of a biological control agent. Isolation of 115 bacterial strains, evaluation of the
insecticidal activities of these strains, and identification of a novel strain of Bacillus pumilus that
is highly toxic to C. capitata larvae are described here. In addition, we found that toxicity was
only observed when cultures of B. pumilus strain 15.1 were exposed to low temperatures. This
dissertation also shows approaches in the biology of the 15.1 strain, in its principal pathogenicity
characteristics, and some aspects of its mode of action. To our knowledge, the entomopathogenic
activity of B. pumilus against Medfly, and the isolation of a Bacillus strain pathogenic for C.
capitata larvae are reported here for the first time. These findings represent an important starting
point for the development of pest control strategies that can help reduce economic losses in fruit
crops.

The results of our study have revealed that there are strains of Bacillus genus with unexplored
activities and potential uses. We do not expect that B. pumilus will provide total control on C.
capitata larvae, but the results of the present study suggest that B. pumilus 15.1 could be
considered as a strong candidate for the biological control of C. capitata. However, further
198 |

studies are now required in order to determine the toxicity against insects from other orders, and
validate its effectiveness in the suppression of Medfly populations under field conditions.


5.1 ISOLATION AND SELECTION OF A NOVEL BACTERIAL PATHOGEN ACTIVE AGAINST
C. CAPI TATA
Chemical treatment is the most common method used to reduce the economic impact that C.
capitata has on crops in spite of the fact that this kind of pest control is not specific and
environmentally harmful. Moreover, field populations of C. capitata in different geographical
areas show a tolerance to organophosphorus insecticides, such as malathion, that produced 6 to
201 fold more tolerant flies compared with laboratory populations, and 2 to 30 fold more tolerant
than populations from non-treated fields (Magana et al. 2007). Besides, these available chemical
tools are increasingly restricted by global policies. For instance, in 2007, malathion was banned
for agricultural application in the European Economic Community (Urbaneja et al. 2009).

Due the economic importance of C. capitata, new control methods are required. Biological
control of C. capitata using microorganisms could overcome the disadvantages of chemical
control since microorganisms are safer and there are fewer resistance problems. Unfortunately,
very few microorganisms that exhibit activity against C. capitata have been described. This is
the case of the fungi Mucor hiemalis (Konstantopoulou et al. 2006), Metarhizium anisopliae, and
Beauveria bassiana (Ekesi et al. 2002, Dimbi et al. 2003, Ekesi et al. 2003, Konstantopoulou and
Mazomenos 2005, Mochi et al. 2006, Quesada-Moraga et al. 2006, Ali et al. 2008), the bacteria
Serratia marcescens (Briceo 2004) and Saccharopolyspora spinosa (Mertz and Yao 1990), the
microsporidian parasite Octosporea muscaedomesticae (Ormieres et al. 1977), and the
entomopathogenic nematodes Heterorhabditis bacteriophora, H. zealandica, and Steinernema
khoisanae (Malan and Manrakhan 2009). Notwithstanding these reports, no efficient product that
can be applied in the field is commercially available yet. Therefore, a search for new
microorganisms is necessary.

The entomopathogenic bacteria from Bacillus genus are natural agents for biological control of
invertebrate pests and are the basis of many commercial insecticides. The Bacillus-based
DI SCUSSI ON | 199
insecticides that have been described are specific for their targets, harmless to humans and higher
vertebrates (Siegel 2001, Roh et al. 2007), and easy to store and apply. Hence, we focused on a
search for natural occurring bacteria belonging to the genus Bacillus (in particular B.
thuringiensis), using the selective method proposed by Travers et al. (1987). A wide range of
field samples were taken from the natural habitat of C. capitata and used as a source of
microorganisms that could be a natural enemy of this fly. Typical Bacillus sp. colonies were
selected for screening their activity against, both adult and larvae of Medfly.

From the 115 bacterial strains screened, only one, a strain (15.1) isolated from a partially
decomposed common reed plant (Phragmites australis), was highly pathogenic for first-instar
larvae of C. capitata. The 16S rRNA of the 15.1 strain was 100% identical to the 16S rRNA of
several B. pumilus strains whose sequences have been deposited in the GenBank database. Based
on the colony appearance, including concentric rings of growth, and the requirement for biotin
when the strain is grown in a minimal medium (Molina et al. 2010), we concluded, undoubtedly,
that the 15.1 strain belongs to Bacillus pumilus species (Lovett and Young 1969, Bottone and
Peluso 2003).

The method described for Travers et al. (1987) is selective, and routinely able to isolate 20% to
96% of crystal-forming (entomopathogenic) Bacillus species, such as B. thuringiensis and B.
sphaericus strains. This selection method eliminates most sporeforming bacteria and all
nonsporeforming organisms in a soil sample. The method allows the spores of unwanted
bacterial species to germinate while preventing the desired bacteria from germinating. Then, the
unwanted bacteria, which enter the vegetative state, are eliminated by a controlled heat
treatment. This method was developed in order to isolate B. thuringiensis from soil samples to a
level of one spore per gram of soil. By using this process, our purpose was to isolate B.
thuringiensis strains from the 37 field samples collected, and then test their potential insecticidal
activity against C. capitata. Despite the fact that we isolated 104 bacterial strains from field
samples, we only identified one strain. This result could suggest that the method of Travers et al.
(1987) is able to isolate not only B. thuringiensis strains, but also other Bacillus species not
typically recognized as toxin producers. This is interesting as, this method could be useful for the
200 |

isolation of bacterial strains with potential insecticidal activity, and not yet recognized as toxic
bacteria.

This research is not the first attempt to find a pathogenic bacterium against C. capitata, or
against other flies belonging to family Tephritidae. There are studies that report more than 80%
of mortality when B. thuringiensis isolates were tested against larvae of the olive fruit fly,
Bactrocera oleae (Karamanlidou et al. 1991, Alberola et al. 1999). Robacker et al. (1996) also
reported five B. thuringiensis strains showing 65-80% of mortality against the Mexican fruit fly
Anastrepha ludens, by the synthesis of delta endotoxins. (Robacker et al. 1996)

In another study, Bel et al. (1997) isolated B. thuringiensis strains from samples collected from
olive tree habitats of different olive producing regions in Spain. In this work 72 samples were
analyzed, and a total of 188 bacterial strains were isolated; however, only three of these strains
exhibited mortality higher than 70% against the olive fly B. oleae. Also, evidence from Toledo et
al. (1999) demonstrated the toxicity of B. thuringiensis exotoxin to three species of fruit flies (A.
ludens, A. obliqua, and A. serpentina). (Bel et al. 1997, Toledo et al. 1999)

Vidal-Quist et al. (2009) performed a survey of B. thuringiensis strains isolated from Spanish
citrus orchards. These strains were tested for insecticidal activity against the Mediterranean fruit
fly, in which 376 isolates were selected from a total of 150 environmental samples. Screening for
toxicity against C. capitata adults was performed using both spore-crystal and soluble fractions
and mortality levels were less than 30%. The authors concluded that the Mediterranean fruit fly
is not susceptible to the B. thuringiensis tested.
Here, we report the isolation and screening of 115 bacterial strains (3 times less isolates than
Vidal-Quist et al. 2009) for insecticidal activity against the Mediterranean fruit fly. As result of
this screening, we found one isolate pathogenic against larvae of C. capitata. As far as we know,
this is the first Bacillus strain with insecticidal activity against larvae of this insect species.

The present study indicates that it is possible to find natural strains of Bacillus genus toxic for
larvae of C. capitata containing novel insecticidal toxins.

DI SCUSSI ON | 201
5.2 BACI LLUS PUMI LUS AS AN ENTOMOPATHOGEN
B. pumilus is a ubiquitous bacterium with a wide range of activities important from a
biotechnological point of view. Some B. pumilus strains have fungicidal activity and have been
used as biological control agents against phytopathogenic fungi (Bottone 2000, Lehman 2001,
de-Bashan et al. 2010). Other B. pumilus strains have been reported to be plant growth-
promoting rhizobacteria (Raupach and Kloepper 1998, Yan et al. 2002, Joo et al. 2005, Forchetti
et al. 2007), while some others showed potent antibacterial activity (Aunpad and Na-Bangchang
2007). Still others have been used as probiotics (Green et al. 1999, Caldini et al. 2002, Duc le et
al. 2004).

Despite of these useful biological activities, B. pumilus is not considered a classical insect
pathogen like other members of the genus Bacillus, such as B. thuringiensis or B. sphaericus. As
far as we know, there have been only two reports of B. pumilus strains active against insects. The
first study demonstrating the entomopathogenicity of B. pumilus is a patent of a strain active
against the corn rootworm (e.g., Diabrotica undecimpunctata, Diabotrica longicornis), the
armyworm (Spodoptera exigua) and nematodes (Heins 1999). This B. pumilus strain produces a
metabolite in the supernatant of a whole broth culture that is useful as a biological control agent
in the treatment and prevention of corn rootworm infestation of plants.

In addition, very recently, B. pumilus was isolated from the great spruce bark beetle,
Dendroctonus micans (Coleoptera: Curculionidae, Scolytinae) (Yaman et al. 2010). This insect
species is an important pest in Turkey where adults and larvae damage entire forests when
feeding under the bark of spruce trees. Infection assays using this B. pumilus isolate were
performed with D. micans larvae and adults. The results showed that this bacterium caused
69.4% and 40.9% mortality on the larvae and adults, respectively. However, this pathogenic
strain of B. pumilus was identified on the basis of fatty acid methyl ester analysis and carbon
utilization profile, and not using a 16S rRNA sequence comparison. Interestingly, another B.
pumilus strain was found from bark beetles, specifically from Scolytus multistriatus, but this
isolate did not show insecticidal activity against this insect species (French et al. 1984).

202 |

The special conditions required to obtain toxicity against C. capitata could explain why this
bacterium is not considered a traditional entomopathogen, since incubation of cultures at low
temperatures is not part of any standard toxicity bioassay. This can explain why no other strains
of B. pumilus have been documented exhibiting pesticidal activity against C. capitata, or against
any other insect species.
To better understand the entomopathogenicity of the strain B. pumilus 15.1, complementary
toxicity experiments with other insect species belonging to different orders of insects are
required.

Since B. pumilus is not a classical entomopathogenic bacterium, the origin and possible
evolutionary pathway to insecticidal activity of strain 15.1 is a fairly interesting topic that could
help us to explain the whole pathogenicity process. The specific case of B. thuringiensis, where
information about its ecology is available, could represent the best analogy example for the
discussion of this topic. Thus, we will concentrate on B. thuringiensis active against leaf-eating
insects, in order to explain the probable origin of the entomopathogenicity of B. pumilus 15.1,
given that this is the best studied case.

The normal role of B. thuringiensis, in the environment remains unclear, partially due to a lack
of manipulative field experiments (Travers et al. 1987, Raymond et al. 2010). One of the many
hypotheses that try to explain its role suggests that B. thuringiensis provides protection against
plants, being part of the normal phylloplane microbiota which has evolved to provide symbiotic
protection (Smith and Couche 1991, Elliot et al. 2000).

Another hypothesis proposes that B. thuringiensis is a soil micro-organism with incidental
insecticidal activity (Martin and Travers 1989). This hypothesis states that except for the fact that
B. thuringiensis was previously found in association with insects; there is no reason to believe
that this association is vital. The ubiquity of B. thuringiensis in soil is consistent with this idea,
and further supports the hypothesis of Dulmage and Aizawa (1982), that proposes that the soil is
the normal environment of B. thuringiensis; nonetheless, this bacterium is not normally toxic to
insect larvae that live in the soil, but is toxic to insects that have aerial or water-borne larvae.
(Dulmage and Aizawa 1982)
DI SCUSSI ON | 203
On the other hand, Jensen et al. 2003 suggests that B. thuringiensis may be part of the
commensal gut flora of various insect species without causing obvious disease or death.
However, recently Raymond et al. (2010) provided the first experimental demonstration that B.
thuringiensis behaves as a specialized insect pathogen in the field. This study suggests that the
normal habitat of B. thuringiensis is the soil, and that the movement from the soil reservoir to the
aerial parts of plants, where susceptible hosts are present is a key feature of its ecology.

Similar to B. thuringiensis, B. pumilus is an ubiquitous bacterium with soil as a typical habitat.
However, strain B. pumilus 15.1 was isolated from a partially decomposed common reed plant,
suggesting that plants could also form part of the natural habitat of this bacterium. Besides, as
stated before, other B. pumilus strains have been reported to have several roles. First, as a plant
growth-promoting rhizobacteria, second, as a protection to plants due to its antifungal properties
against phytopathogenic fungi and finally even playing a role in plant defense reactions
(Benhamou et al. 1996, Kloepper et al. 2004).

It is a fact that B. pumilus interacts with plants, and there is evidence suggesting that this
ecological relationship is beneficial for both organisms. Smith and Couche (1991) proposed an
explanation for this type of interaction between a plant and an entomopathogenic bacterium.
They argued that high population densities of B. thuringiensis on the phylloplanes of trees and
other plants may serve as insect larval antifeedants, thereby offering a degree of plant protection
from phytophagous insect larvae. This situation may be a symbiotic relationship in which B.
thuringiensis also benefits from being a phylloplane epiphyte. Thus, the plant may provide
nutrients from leaf exudates and associated microflora and also provide a niche free from
competition with other soil-borne spore-forming bacteria. On the phylloplane, B. thuringiensis is
accessible to leaf-feeding insect larvae. If the larvae ingest sufficient toxin spore and/or crystals
to perturb feeding, host plant protection may result in reduced defoliation. This hypothesis for
plant-entomopathogenic bacterium association could also explain the origin of the relationship
between B. pumilus and plants. Furthermore, this hypothesis does not exclude other concepts of
the ecological role of B. pumilus, for instance, that they may serve as antifungal or antibacterial
agents in soil microcosms.

204 |

Elliot et al. (2000) extended the bodyguard hypothesis of plants (originally described for
predators and parasitoids) to entomopathogens, and essentially coincide with Smith and Couche
(1991). For an entomopathogen to be employed as a bodyguard by a plant, it must represent a
good return on the investment (the benefits of the trait must outweigh the cost), it must
complement the plants other defenses (Price et al. 1980, Elliot et al. 2000). The bodyguard
hypothesis that a bacterium acts as a plant mutualist could explain why B. thuringiensis may be
maintained by the plant on the phylloplane and in the soil, while the plant benefits from the
bacterium killing insects before they reach large numbers (Carroll 1988, Elliot et al. 2000).

Based on the case of B. thuringiensis mentioned above, the fact that B. pumilus is an ubiquitous
bacterium with soil as a typical habitat, and its ecological relationships with plants, we suggest
that the bodyguard hypothesis could also explain the entomopathogenicity of B. pumilus 15.1.
Larvae of C. capitata are not leaf-eating, but it is considered phytophagous; therefore, the
application of the bodyguard hypothesis could be feasible; also due to the relationships between
B. pumilus and plants. This hypothesis might represent the best explanation to the unknown
insecticidal activity of B. pumilus; in spite of the fact that it is a different strain, B. pumilus was
reported as pathogenic to the armyworm, Spodoptera exigua (Heins 1999), species that has leaf-
eating larvae.

The ecology of B. thuringiensis is still not completely known, even after almost a century of its
discovery (Raymond et al. 2010). This makes clear that, at the moment, the origin of the
entomopathogenicity and all ecological aspects of B. pumilus 15.1 related with this phenomenon,
are only assumptions. Future field experiments and studies using genome sequencing or other
techniques should fully elucidate the role of B. pumilus in nature, and the relationship between
its ecological niche and its insecticidal activity.


5.3 PATHOGENICITY OF B. PUMI LUS 15.1 TOWARD C. CAPI TATA FIRST-INSTAR LARVAE
One of the objectives of this study was to explore the pathogenic characteristics of B. pumilus
15.1 against first-instar larvae of C. capitata.
DI SCUSSI ON | 205
One of the most important issues related with the pathogenicity of the strain 15.1 is its
relationship with temperature. B. pumilus 15.1 did not exhibit toxicity under standard bioassay
conditions. Toxicity on first-instar larvae of Medfly was observed only when a bacterial culture
(on a bioassay plate or in a growth flask) was incubated at a low temperature for at least 96 hours
before initiation of the bioassay. The activation of toxicity seems to be a time-dependent effect of
low temperature, because the toxicity increased up to the maximal value at 96 hours and
decreased slightly after the cultures were incubated for 168 hours. An experiment with narrower
low-temperature incubation time course confirmed this previous observation. Bioassays with
cultures kept less than 96 hours at 4C did not achieve the maximum mortality, suggesting that
the optimal time of incubation at 4C is 96 hours. Moreover, incubation at different temperatures
(25C and 37C) did not increase the toxicity of B. pumilus 15.1 against larvae of C. capitata.
Only cultures kept at -20C for 96 hours show more than 80% of mortality; however, as stated
above, toxicity of B. pumilus 15.1 on first-instar larvae is best revealed when cultures are
exposed to 4C, confirming this low-temperature phenomenon.

The effect of low temperature on toxicity is a surprising phenomenon, and it has only been
described for B. thuringiensis strain Ormilia isolated from Greece (Karamanlidou et al. 1991),
although the behavior was slightly different to B. pumilus 15.1 strain, the B. thuringiensis
Ormilia strain showed significant toxicity against Dacus oleae in standard bioassays, but its
toxicity increased dramatically when a culture is kept for 11 days at 4C before it is used in a
bioassay. So far, the mechanism of this increase in toxicity has not been studied.
There have been previous reports of activities of some enzymes increasing when they are
exposed to low temperatures; e.g., nitrite reductase from Alcaligenes sp. was studied by Masuko
et al. (1985), who found that the enzymatic activity increased 2.5- to 4.5-fold when the enzyme
was incubated at a low temperature (-20C), and it was demonstrated that the increase on activity
was related to minor conformational changes in the molecule, particularly in the hydrophobic
region of the protein, which could also be true for any virulence factor or enzyme in B. pumilus
15.1. A conformational change in the virulence factor induced by low temperature might have
occurred, although the possibility that there are other mechanisms (e.g., protease activation)
cannot be ruled out. This finding opens the door for exploration of novel entomopathogenic
activities under conditions that have not been tested to date. (Masuko et al. 1985)
206 |


The fact that the sporulated culture of B. pumilus 15.1 requires incubation for at least 96 hours at
4C in the larva diet to show toxicity against C. capitata, led us to consider the possibility that
spore germination could take place and that germination could be responsible for toxicity.
Although the C. capitata larvae diet is not a suitable environment for bacterial germination due
to its low pH (pH 3) and high concentration of solutes (242 mM sucrose), we checked this
hypothesis to rule out the possibility that toxicity could be linked to spore germination. Toxicity
was not related to germination of the spores in the insect diet, since (i) the number of spores in
the diet was constant during the bioassay (no germination was observed) and (ii) the virulence
factor could be activated when sporulated cultures were kept at low temperatures in the growth
flasks. Likewise, it would be interesting to investigate why both the supernatant and bacterial
fractions are needed for full activation of toxicity, and to identify the virulence factor and the
mechanisms by which this factor is activated.

Besides, based on our results, it is likely that the virulence factor responsible for the toxicity of
B. pumilus 15.1 is synthesized during sporulation (cultures with vegetative cells are not toxic,
even after incubation at low temperatures), and is further activated or processed when the
organism is incubated at a low temperature (4C or -20C). Hypothetical virulence factor
synthesis of B. pumilus 15.1 could be similar to B. thuringiensis that produces insecticidal
proteins (-endotoxins) during the sporulation phase as parasporal crystals (Schnepf et al. 1998).
What is more, most of the gram-positive entomopathogenic bacteria also produce toxins in large
amounts during sporulation, forming parasporal crystalline inclusions containing one or more
insecticidal proteins (de Maagd et al. 2003). This aspect will be further discussed in this work.


5.4 PATHOGENICITY OF B. PUMI LUS 15.1 TOWARD DIFFERENT DEVELOPMENTAL
STAGES OF C. CAPI TATA AND OTHER MODELS
The toxicity of sporulated cultures of B. pumilus 15.1 against first instar larvae of C. capitata
was observed in the larvae screening bioassays and not in the adults bioassays (performed first).
It was possible that the virulence factor might have a broad spectrum of action for other stages of
Medflys life cycle when the activation at low temperature was included as part of the bioassay.
DI SCUSSI ON | 207
Consequently, the entomopathogenic activity of B. pumilus 15.1 was assayed against eggs,
pupating larvae (third-instar larvae), pupae and adults of C. capitata with cultures activated with
low temperature.

It was not possible to obtain conclusions from the results of the bioassays carried out with eggs.
The experiment was checked daily, and after ten days of the initiation of the bioassays, none of
the eggs hatched, even in the control groups. Unfortunately, the experiment had a number of
limitations that could be have been remedied; therefore, it is difficult to obtain conclusions from
this test and discuss this result. Our procedure included the use of distilled water to dispense ten
eggs (using a pipette) in each well of the microplate. The volume of the distilled water could be
one of the limitations of this experiment. Therefore, results of this experiment are liable to
contain errors. Since a better experimental design would enable greater insight into the
possibility of pathogenicity of B. pumilus 15.1 toward eggs of C. capitata, it is needed to perform
these bioassays again, using another methodological procedure.

The experiment of toxicity with third-instar C. capitata larvae showed that B. pumilus 15.1 did
not cause a different percentage of adult emergence compared with the negative controls.
Emergence of pupating larvae was determined from the number of larvae that failed to pupate
and did not develop into adult; and fitness of the newly emerged adults was calculated
comparing the number of eggs laid by flies treated with bacteria and flies from the control
without bacterial treatment. B. pumilus 15.1 did not reduce fitness and sexual performance of
adult flies emerged from pupating larvae treated with this bacterium. There was no statistical
difference between treatments in the number of eggs collected. These results suggest that third-
instar larvae are not susceptible to the 15.1 strain.
We also found that B. pumilus 15.1 is not toxic against pupae of the Medfly; since the results of
the bioassays showed that the total number of adults emerged from the pupae treated with the
15.1 strain was not different to the number of flies emerged from control groups.

The bioassays with pupae, third-instar larvae, and eggs were carried out with the purpose to test
whether the pathogencity of B. pumilus 15.1 is due to oral or topical infection. Therefore, we
suggest that the toxicity of the strain 15.1 might need to be activated by oral contamination.
208 |


The data does show that B. pumilus 15.1 has toxic properties against first-instar larvae, but not
toward eggs, third-instar larvae, or pupae of C. capitata. This type of pathogenic phenomenon
was observed previously in other insect species. For example, in certain lepidopteran insects, the
first and second instars were found to be more susceptible to endotoxins of B. thuringiensis than
the advanced instar larvae (Sneh et al. 1981, Bai et al. 1993, Keller et al. 1996); this also occurs
in various species of flies and mosquitoes (Lee et al. 2005, Floore and Ward 2009, Lysyk et al.
2010).

Moreover, the 15.1 strain seems to be specific for the larval stage, since no toxicity for C.
capitata adults was observed when the same conditions that resulted in maximum toxicity for
larvae were used. Activity against only one of the possible insect stages has been observed
previously for B. thuringiensis isolates that exhibit activity against larvae of other fruit flies
(Robacker et al. 1996, Alberola et al. 1999). Specifically, Robacker et al. (1996) stated that B.
thuringiensis isolates that were most toxic to larvae of Anastrepha ludens were not necessarily
toxic to adults. Karamanlidou et al. (1991) found similar results; mortality levels of Dacus oleae
caused by the toxins from different B. thuringiensis isolates were always higher if the
experiments carried out in larvae than in those carried out in adults. All this shows that toxicity
against larvae and adults did not always coexist in the same isolates of B. thuringiensis. Indeed,
in the majority of isolates, activity was found only against adults or only against larvae (Alberola
et al. 1999).

Furthermore, it has been suggested that B. thuringiensis genes responsible for toxicity against
two developmental stages of the insect may be different, or that there are different chemical
conditions in the gut of the two stages that can influence the activation or activity of the protoxin
(de Maagd et al. 2003). This explanation could also be true for B. pumilus 15.1. The overall
interpretation of these results could be that the hypothetical toxin of B. pumilus 15.1 is highly
specific only toward the first instar-larvae of the Medfly. However, due to methodological
difficulties it is mandatory to test again the toxicity of the strain 15.1 against eggs of C. capitata.

DI SCUSSI ON | 209
On the other hand, it has been suggested that any new natural enemy isolated under laboratory
conditions requires to be tested under more natural circumstances before being commercialized
as biopesticidal preparations (Aluja and Mangan 2008). We have already tested the pathogenic
activity of B. pumilus 15.1 against all developmental stages of C. capitata, being necessary
information about the relationship of both, Medfly and the strain 15.1 with fruit hosts. Hence, we
have carried out bioassays with adults of C. capitata on four fruit species.
The first objective for these series of experiments was to determine if our methodological
procedures allow eggs to hatch and sustains larval development. In order to achieve this
objective, we tested at least two types of experimental conditions per fruit species. The
determination of the best methodological conditions will be useful for further experiments in
laboratory and in the field. The second objective was to test if B. pumilus 15.1 can protect a fruit
from C. capitata infestations in more realistic models. The resulting information from this series
of experiments was of significant importance for understanding the larvicidal potential of B.
pumilus 15.1.

We tested four fruit species in these bioassays: mangoes (Mangifera indica L., var. lancetilla),
nectarines (Prunus persica nucipersica S., var. venus), pears (Pyrus communis L., var.
limonera) and oranges (Citrus sinensis L., var. valencia). Statistical differences were
detected only in bioassays performed with oranges, suggesting that B. pumilus 15.1 can offer
protection against Medfly infestation in this fruit host. From a practical point of view, this result
is extremely useful, since citrus fruits are considered among the most damaged crops by the
Medfly in Spain (Navarro-Llopis et al. 2004, Urbaneja et al. 2006). However, despite of the
statistical results, by comparing the number of larvae found on fruits treated with the strain 15.1
and larvae found in control groups, B. pumilus 15.1 also appears to protect pears. Further
experiments with pears are needed in order to clarify the effect of the strain 15.1 on this fruit
host.

The results from bioassays with oranges are in agreement with the findings of Navrozidis et al.
(2000), who analyzed the number of eggs and hatch percentage of Bactrocera oleae on olive
fruit dipped on cultures of B. thuringiensis 114A. They reported that the after exposure of fruit
fly to bacterial cultures, the number of eggs and egg hatch percentage decreased. Also the
210 |

percentage of pupation and emergence was reduced when olive fruits with eggs in their mesocarp
were dipped in the solution of spores and crystals. Field applications with the toxins of this B.
thuringiensis strain have resulted in significant protection of the olive production. So, it is
possible that applications of B. pumilus 15.1 in the field could also result in reduction of eggs
hatched and further protection in fruit crops. (Navrozidis et al. 2000)

Bioassays with mangos and nectarines might be carried out under new methods, because in this
type of experiments, the methodological procedure is a key factor that influences directly the
results. Thus, Aluja and Magan (2008) advised that any test under partial artificial conditions
would entail the danger of elicitating aberrant behaviors in flies, potentially leading investigators
to reach flawed conclusions at least from a biological perspective. A number of experimental
factors can affect the outcome of this type of tests. For example, Oi and Mau (1989)
demonstrated that tree-attached Sharwil avocados could be infested by B. dorsalis and C.
capitata, whereas Armstrong et al. (1983) reported that no infestation by these species occurred;
the differences were based in the number of females released and exposure time to the fruit.
(Armstrong et al. 1983, Oi and Mau 1989)
Methods of holding and evaluating fruits can also vary among tests. For example, Aluja et al.
(2004) removed larvae of Mexican fruit fly from both Hass avocados and the preferred hosts
(mango, sapodilla, guava, and grapefruit) in their caged tree tests after 22 days (when fruit were
totally rotten and all living larvae had exited). In contrast, Ohto et al. (1991) showed that
development time (egg to adult) for cage-infested mangos and grapefruit was 36 days and for
their avocado samples the development time was 52 days. Though laborious, it is essential to
determine when to dissect the fruits for accurate assessment of infestation rates than rely solely
on number of collected larvae. This would facilitate acquisition of a more reliable estimate of the
rate of infestation. The design of the experiment may, therefore, have a deep impact on
conclusions obtained. (Ohto et al. 1991)

Experimental infections of new isolated bacteria, such as B. pumilus 15.1, are very important to
confirm their possibility as biological control in the field. We experimentally verified that, under
different methodological procedures, sexually mature, gravid females of C. capitata respond to
the fruit volatiles and lay eggs into a particular host. Therefore, the results of this study suggest
DI SCUSSI ON | 211
that the potential use of the strain 15.1 under more natural circumstances would, hypothetically,
contribute to a citrus crop damage reduction.


5.5 APPROACHES TO THE IDENTIFICATION OF VIRULENCE FACTOR OF B. PUMI LUS
Entomopathogenic bacilli have evolved a large amount of toxins, as well as other virulence
factors, to invade their host species (de Maagd et al. 2003). Since, the majority of virulence
factors of Gram-positive spore-forming bacteria have proteic nature with diverse structures and
modes of action; we tested by different procedures the hypothesis that the virulence factor of B.
pumilus 15.1 against C. capitata is a protein.

First of all, toxicity bioassays were performed using bacterial cultures of the strain 15.1
previously treated with proteases. The mortality caused by B. pumilus 15.1 on C. capitata larvae
decreased noticeably when the bioassays were carried out with cultures previously subjected to
the action of trypsin. A similar result was obtained from bacterial cultures treated with lipase.
The toxicity of the strain 15.1 diminished around 65% when its sporulated cultures were exposed
to either trypsin. This is interesting as, trypsin belongs to serine proteases, and this group of
proteases is the main digestive proteases of Diptera (de Maagd et al. 2003, Kaiser-Alexnat 2009).
Assuming that B. pumilus toxin acts as Cry proteins, and taking into account that the B.
thuringiensis toxins in their active form are processed by proteases in the midgut, there is a
possibility that the larvicidal protein of B. pumilus 15.1 was inactivated by trypsin, resulting in
the loss of toxicity toward larvae of the Medfly.

Secondly, when whole bacterial cultures were autoclaved (121C for 20 minutes) before being
used in a larvae bioassay, the toxic activity of B. pumilus 15.1 was completely abolished.
Comparing the mortality caused by the positive control (an unautoclaved culture of the strain
15.1) to the autoclaved culture we observed a ~70% reduction on mortality of C. capitata larvae.
Autoclaving has been shown to inactivate protein crystal toxins of B. thuringiensis but not to -
exotoxin (Gough et al. 2005). Therefore, our results suggest that (i) B. pumilus 15.1 does not
produce exotoxins, or (ii) the endotoxin produced by this bacterial strain was inactivated.

212 |

Our results show that the toxic factor(s) of B. pumilus 15.1 might be inactivated either by heat or
by proteases, suggesting that a protein might be involved in the pathogenicity. However, the
possibility that other non-protein factors might participate in toxicity is not discarded, since our
results has shown that bacterial cultures treated with lipase were not toxic either toward larvae of
C. capitata. Therefore, it is possible that B. pumilus 15.1 may produce multiple toxins and other
virulence factors that act at different levels, some of which could have toxic activity in the insect
gut after oral inoculation and others that could have toxic activity once they have reached the
insect hemocoel.

Thirdly, as part of the studies being carried out in our research group, observations under
transmission electron microscope of a B. pumilus 15.1 revealed electrodense geometric structures
(Caa-Roca et al., unpublished) resembling to those observed in a sporulated B. thuringiensis
culture and composed by Cry and Cyt toxins (Fig. 47). Such structures were observed not only
inside the cells but also liberated into the medium. Similar to crystals produced by B.
thuringiensis, the inclusion crystals of B. pumilus 15.1 were composed by strikingly uniformly
spaced grids, which were clearly observable by electron microscopy.

Crystal inclusions are produced by members of the spore-forming Bacillus genus. The best
known example is B. thuringiensis, which produces parasporal protein crystals with insecticidal
activity (Schnepf et al. 1998). Interestingly, only few other strains from Bacillus species have
been reported to form crystals, and all of them have insecticidal properties. These include
Bacillus sphaericus (Kalfon et al. 1984, Yuan et al. 2001) (now Lysinibacillus), B. popilliae
(now included in the genus Paenibacillus) (Zhang et al. 1997), B. laterosporus (now included in
the genus Brevibacillus) (Smirnova et al. 1996). And recently, Yan et al. (2007) reported that B.
licheniformis (strain ATCC 9945a) produces crystal inclusions in a manner reminiscent of B.
thuringiensis. Electron microscopy showed large crystal inclusions in B. licheniformis cells that
had reached the end of their vegetative cell growth cycle (Fig. 47).
(Yan et al. 2007)


DI SCUSSI ON | 213

Figure 47. Transmission electron microscopy of cultures from three Bacillus species. (A) Crystals formed by B.
thuringiensis Cry2Aa2 (taken from Cosa et al. 2001). (B) Bipyramidal crystal produced by the strain B.
thuringiensis IB5 (taken from Bravo et al. 1998). (C and D) Crystal inclusions formed by B. licheniformis ATCC
9945a; C shows details of grid pattern (taken from Yan et al. 2007). (E and F) Crystals formed by B. pumilus 15.1;
white arrows indicate the crystalline structures from a 50h culture (Caa-Roca et al. unpublished).
(Bravo et al. 1998, Cosa et al. 2001)

Undoubtedly, the parasporal crystals of B. pumilus 15.1 closely resemble those of B.
thuringiensis. This also occurs with crystals produced by B. licheniformis ATCC 9945a. Because
crystal inclusions have not been previously reported in strains of B. licheniformis, Yan et al.
(2007) verified that the strain ATCC 9945a truly belongs to the B. licheniformis species or it
could be a strain of B. thuringiensis. This was checked by 16S rRNA gene sequencing. We also
tested this hypothesis, and doubled checked the taxonomic identity of the strain 15.1 as B.
214 |

pumilus by 16S rRNA gene sequencing and by biochemical test using biotin. Both, 16S rRNA
gene sequencing and the biotin test confirmed that the crystal producing B. pumilus 15.1 strain
indeed belongs to the species of B. pumilus and not B. thuringiensis. Thus far, the role of crystal
inclusions in B. pumilus 15.1 is unknown, but these crystalline structures could be linked to
toxicity and it is a topic of ongoing investigation.

In fourth place, to investigate whether the newly identified crystal inclusions proteins of B. pumilus
15.1 were encoded by plasmids, we checked for the presence of extrachromosomal elements,
isolating total bacterial DNA. In B. thuringiensis, it has long been recognized that the toxic
crystal proteins of most entomopathogenic bacterial strains are generally encoded by plasmids
(Schnepf et al. 1998, de Maagd et al. 2003). Our results show that B. pumilus 15.1 strain contains
one plasmid of approximate 6-8 kb, and one mega plasmid. The controls strains (including other
B. pumilus) did not show any plasmid, suggesting that the virulence factor in B. pumilus 15.1
could reside in one of the plasmids.

In other Bacillus isolates the presence of plasmid DNA has frequently been associated with
antibiotic resistance determinants and the production of toxins (Hu et al. 2009). In B.
thuringiensis, the presence of plasmids is an important feature, since the highly specific
insecticidal Cry proteins are frequently synthesized from plasmid-encoded genes (Aronson
2002). Nonetheless, additional studies, such as sequencing, will be required to determine the
exact nature of the extrachromosomal elements detected in this study.

On the other hand, plasmids can be exchanged between strains by a conjugation-like process, and
virulence, secretion and horizontal mobility are closely associated in bacterial genomes (Smith
2001). Potentially there can be 5 or 6 different plasmids in a single B. thuringiensis strain, and these
plasmids can encode different toxin proteins (Schnepf et al. 1998, Aronson 2002). Besides, it is
known that bacteria have obtained a significant proportion of their genetic diversity through the
acquisition of sequences from distantly related organisms (Ochman et al. 2000). All these
properties possibly complicated the identification of our newly discovered crystalline inclusions in
B. pumilus 15.1. Because of the close morphologic resemblance of the B. pumilus 15.1 crystals to
those of B. thuringiensis, it is possible that crystal inclusions may be due to a plasmid transferred
DI SCUSSI ON | 215
from B. thuringiensis, endowing it with the ability to produce crystals. This hypothesis is in
agreement with Reyes and Ibarra (2008), who stated that B. thuringiensis strains may
spontaneously lose some of their plasmids. Interestingly, as proposed early in this discussion, the
conjugation process can be associated to the close relationship that both B. thuringiensis and B.
pumilus have with plants.
Moreover, another interesting phenomenon was that infected larvae of C. capitata exhibited
different levels of necrosis that was associated with the presence of the15.1 strain; this necrotic
effect is also found in insects killed by B. thuringiensis.


5.6 PHYLOGENETIC RELATIONSHIPS OF B. PUMI LUS 15.1
DNA similarity analysis was used to elucidate the phylogenetic relationships between B. pumilus
15.1 and related bacterial strains, therefore three phylogenetic analyses were performed.
The two first analyses were carried out using 16S rRNA sequences. Traditionally, numerical
classification based on series of phenetic characters was used. But, after 1990, 16S rRNA has
been successfully applied in determining phylogenetic relationships of the aerobic, endospore-
forming bacteria (Ash et al. 1991). Nowadays, 16S rRNA is a vital standard tool for taxonomy
and phylogeny of the bacteria, and all relevant studies have used this method. So, 16S rRNA
gene sequencing is often used as a method to classify microbes at species level. However, it has
been recently proposed that even with the information of whole genomic sequences available, the
boundaries between a species and its ecotypes, may not always be unequivocal (Bavykin et al.
2004).

We analyzed the relationship of the strain 15.1 with other entomopathogenic strains, based on
16S rRNA. A total of 22 sequences of entomopathogenic bacterial strains were included in this
analysis. These strains were selected on the basis of their pathogenicity to different groups of
insects. Also, two non-entomopathogenic Bacillus strains, B. subtilis and B. cereus, were
included as external groups.

Our previous data showed that the toxicity of B. pumilus 15.1 is a characteristic of this strain and
not a characteristic of the species B. pumilus. The toxicity of the strain 15.1 against one insect
216 |

species is a shared characteristic with other entomopathogenic strains. Hence, the aim of this
phylogenetic study was to determine if the relationships between entomopathogenic bacteria are
in accordance with their target group of insects.

The phylogenetic tree obtained shows that B. pumilus 15.1 and closely related strains, B. pumilus
SAFR-032 and B. subtilis form a separated clade. This result is in agreement with the hypothesis
that includes B. pumilus in the B. subtilis group (Gioia et al. 2007). In the same way, all B.
thuringiensis serovars were grouped together, despite of the presence of B. cereus and B.
anthracis in this clade. Previous analysis using 16S rRNA gene restriction band pattern suggest
that many of the B. thuringiensis serovars are genetically distinct but closely related (Nakamura
1994, Joung and Ct 2001). Analysis of 16S rRNA gene fingerprinting cannot only be used for
the classification of B. thuringiensis strains amenable or not to serotyping, but can also reveal
phylogenetic relationships between strains (Joung and Ct 2001). Moreover, Bourque et al.
(1995) examined strains of B. thuringiensis belonging to seven serovars and two closely-related
species, B. anthracis and B. cereus, by comparative analysis of the 16S to 23S ribosomal
intergenic spacer sequences. They found minor sequence differences among the B. thuringiensis
strains and the related species, concluding that there were not enough sequence differences.
All these previous studies also reveal that the phylogenetic relationships among B. thuringiensis
serovars are not associated to their insect target group. In spite that we have carried out analyses
using 16S rRNA sequences, and not by fingerprinting methods, our results concord with these
observations, since strains pathogenic against diptera species, such as B. thuringiensis
israelensis, B. thuringiensis kurstaki, B. sphaericus and B. pumilus 15.1, were clustered in
different groups. Therefore, it appears that although all the bacterial strains analyzed are
entomopathogens, they do not maintain phylogenetic relationships based on this characteristic.
This could be due to the fact that our analyses were performed using a chromosomal gene, and
the toxic crystal proteins of most entomopathogenic bacterial strains are generally encoded by
plasmids (Schnepf et al. 1998, de Maagd et al. 2003). (Bourque et al. 1995)

In the second phylogenetic study, ten bacterial strains belonging to the B. subtilis group were
analyzed. Three additional species, B. thuringiensis, B. cereus and B. anthracis, members of the
B. cereus group were also included as external group. The objective of this analysis was to
DI SCUSSI ON | 217
establish the relationships of the newly isolated strain 15.1 with other bacterial strains
traditionally included in the B. subtilis group. In this analysis, 16S rRNA sequences were also
used.

As well as the first phylogenetic tree, in this analysis B. pumilus strain 15.1 was grouped together
with the other B. pumilus strain (SAFR-032), forming a separated clade, with a bootstrap value
of 100%. However, this clade was more related to species belonging to B. cereus group (B.
thuringiensis, B. cereus and B. anthracis) than to species included in B. subtilis group.
Interestingly, species included in B. cereus group were clustered together. On the other hand,
both strains of B. licheniformis were grouped together, and this also occurs with B. atropheus
strains. All branches of the phylogenetic tree have high bootstrap values (more than 50%), which
means that all clades are significant. However, there were no apparent grouping patterns
accordingly to previous phylogenetic analysis performed with strains belonging to the B. subtilis
group.

Despite of some modifications, B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. atropheus,
and B. pumilus are described as members of a single taxon, the B. subtilis group (Buchanan
1974, Skerman et al. 1989, Porwal et al. 2009). B. pumilus was found at the base of the B.
subtilis species complex phylogeny (Rooney et al. 2009). Nonetheless, interestingly, Gordon et
al. (1973) speculated that it might one day be considered a variety of B. subtilis rather than a
separate species. Phenotypic characterization, limited to DNA relatedness studies, and 16s rRNA
sequencing data have indicated that B. pumilus and B. subtilis are closely related (Xu and Cote
2003, Porwal et al. 2009). However, Rooney et al. (2009) proposed that B. pumilus forms a clade
distinct from B. subtilis. Alcaraz et al. (2010) found that B. pumilus (SAFR-032) is closely
related to B. subtilis and B. licheniformis, due to the fact they formed a separated clade, either
analyzing the core genome or analyzing 16S rRNA sequences. This indicates the extent of
similarity with species belonging to B. subtilis group. The facts mentioned above revealed that,
regardless of the differences in phylogenetic analysis, it is a fact that B. pumilus 15.1 is closely
related to the B. subtilis group. (Alcaraz et al. 2010)

218 |

Moreover, other types of evidence suggest that B. subtilis group has a reduced number of genes
involved in replication, recombination and repair (Moran and Mira 2001, Dufresne et al. 2005).
Interestingly, B. pumilus has a reduced number of genes involved in DNA repair and oxidative
stress as well as small acid soluble proteins that mitigate DNA damage and are involved in the
desiccation and UV resistance of spores as compared to B. subtilis and close relatives (Setlow
2006).

The third phylogenetic analysis was carried out using the MLST technique. Multilocus sequence
typing (MLST) is an unambiguous procedure for characterizing bacterial isolates belonging to
the same species by using the sequences of internal fragments of seven house-keeping genes
(Jolley et al. 2004). The sequences of each house-keeping gene are assigned as distinct alleles,
and for each isolate, the alleles define the allelic profile or sequence type (ST) (Maiden et al.
1998, Urwin and Maiden 2003). This technique is useful for understanding population dynamics,
recombinations, and pathogen diagnosis.

We sequenced seven house-keeping genes of two strains, B. pumilus 15.1 and the non-
pathogenic B. pumilus M1. The alleles of the seven loci defined that both bacterial strains have
been assigned to belong to sequence type 8 (ST8). Once the STs were defined, other 20 sequence
types were included in a phylogenetic analysis. The STs analyzed in this study were highly
diverse both with respect to geographic origin and target host.

The sequence type 8 has been recognized as an entomopathogenic genotype, particularly
considered a successful specialist pathogen of Lepidoptera (Raymond et al. 2010). What is more,
in spite of the 50 isolates included in the ST8, this sequence type has never been associated with
a clinical infection and is therefore strictly an invertebrate pathogen.
The fact that B. pumilus 15.1 has been placed in the ST8 clade using MLST also means that it is
closely related to some strains of B. thuringiensis kurstaki and B. cereus, included in this
sequence type. Besides, evidence suggests that the ST8 genotype has host-specific adaptations,
and dominates the natural community in field soil.

DI SCUSSI ON | 219
Our results of MLST-based phylogeny shows that B. pumilus 15.1 and B. pumilus M1 are closely
related to ST195. Sequence type 195 includes B. thuringiensis isolates without serovar
classification. Both of these bacterial strains, as well as ST195 were clustered together with
ST15, which includes some B. thuringiensis aizawai. Similar to our analysis based on 16S
rRNA, this MLST analysis supports the suggestion that the phylogenetic relationships among
STs are not associated to their insect target group.

Since no published results are known on the literature or public databases, this study is the first
MLST analysis performed with B. pumilus strains. However, MLST can be applied to almost all
bacterial species and other haploid organisms, including those that are difficult to cultivate. The
overwhelming advantage of MLST over other molecular typing methods is that sequence data
are truly portable between laboratories, enabling one expanding global database per species to be
placed on-line (Maiden et al. 1998, Urwin and Maiden 2003).


5.7 THE ROLE OF GUT MICROBIOTA FOR THE PATHOGENICITY OF B. PUMI LUS 15.1 TO
LARVAE OF C. CAPI TATA
Given that the mechanism of larvae killing of B. pumilus 15.1 is unknown, we have performed a
molecular approach on the pathogenicity mode of action of this bacterium species, testing a new
hypothesis. Recently, it has been suggested that the gut microbial community of some insects
plays an important role when the widely used biopesticide, B. thuringiensis invades its host.
Broderick et al. (2006) demonstrated that B. thuringiensis does not kill larvae of the gypsy moth
(Lymantria dispar) in the absence of indigenous midgut bacteria (eliminated by oral
administration of antibiotics), indicating that B. thuringiensis-induced mortality depends on
enteric bacteria; thus, suggesting a new hypothesis in the mode of action of B. thuringiensis.

Traditionally, there are two proposed models of insect killing of B. thuringiensis that have been
cited many times in literature. The first proposed mechanism involves the solubilization of the
protoxin by the high pH present in the insect gut (specially in leaf-eating caterpillars).
Afterwards, the solubilized protoxins are activated by midgut proteases and bind to receptors on
the epithelial surface. Then, the toxins insert in the membranes of gut cells, where they form
220 |

pores that lead to cell lysis (Schnepf et al. 1998). The disruption of the midgut epithelium results
in a prolonged cessation of feeding and death by starvation. The second proposed mechanism of
killing comprises activation of protoxins, and extensive cell lysis that provides spores access to
the more favorable environment of the hemocoel, where they germinate and reproduce, leading
to septicemia and death (Schnepf et al. 1998). However, a more recent work has extended the
hypothesis of dependence of midgut bacteria to a wide range of lepidopteran hosts, including
Manduca sexta, Pieris rapae, and Vanessa cardui (Broderick et al. 2009).

On the other hand, Johnston and Crickmore (2009), using similar methods, established that gut
bacteria are not required for B. thuringiensis insecticidal activity toward M. sexta. However, they
found that B. thuringiensis lethality is reduced in larvae that are continuously exposed to
antibiotics before bioassay. Besides, there is evidence showing that mid-gut bacteria are not
required for the pathogenicity of B. thuringiensis to diamondback moth larvae, Plutella xylostella
(Raymond et al. 2009). All these cases demonstrate that bacterial insect pathogenicity is a
complex mechanism where it is necessary to study each case in particular because effects are
very diverse.

Mediterranean fruit fly harbors a community of diazotrophic and pectinolytic Enterobacteriaceae
in its digestive system which maintains a mutualistic association (Behar et al. 2005, Behar et al.
2008b, Ben-Yosef et al. 2008). This bacterial community is present in all stages of the flys life
cycle, and contributes to the flys nitrogen, carbon metabolism, and its removal can cause
measurable physiological and behavioral problems (Ben-Yosef et al. 2008), suggesting that this
microbiota may have an important function on the flys fitness. Moreover, sterile insect
technique (SIT) experiments suggest that regenerating the original microbiota community could
result in enhanced competitiveness of the sterile flies (Ami et al. 2009). In order to determine the
role of this bacterial community in the pathogenicity of B. pumilus 15.1 strain, we needed to
know how the natural bacterial community is affected when B. pumilus is ingested.

The partial elimination of the microbial community of C. capitata larvae did not affect the
mortality rates, suggesting that the presence or the partial absence of the natural gut bacteria does
not affect the B. pumilus 15.1 insecticidal activity. Besides, the presence of antibiotics in the
DI SCUSSI ON | 221
larvae diet increases the survival of the larvae; this could be caused by residual antibiotics in
insect tissues, enhancing the fitness of the Medfly larvae.

We compared natural microbial gut community of the Medflys larvae in the presence and the
absence of B. pumilus 15.1 using denaturing gradient gel electrophoresis. These analyses were
performed with PCR products of 16S gene amplification; although some species may produce
multiple bands because of the high copy number of 16S genes within the genome, some of which
vary in sequence (Ferris et al. 1996). PCR-DGGE analyses, carried out in surviving larvae,
revealed that the gut bacterial community, as expressed by the total number of bands appearing
in the gel, demonstrated greater stability in larvae treated with non-pathogenic bacteria (B.
pumilus M1), in both sterile and non-sterile larvae when compared with the pathogenic treatment
(B. pumilus 15.1). DGGE profiles in larvae that had ingested B. pumilus 15.1 showed a change in
the community. Nevertheless, pure isolates of B. pumilus 15.1 and B. pumilus M1 did not have
similar DGGE profiles.

Our results could suggest that the native gut bacteria are affected by the presence of B. pumilus
15.1, and that natural gut community is not required for the insecticidal activity (based on
statistical analysis of mortality rate), in contrast to previous investigations (Broderick et al. 2006,
Broderick et al. 2009). Nonetheless, our results are in agreement with the findings of Johnston
and Crickmore (2009), Raymond et al. (2009), and Frankenhuyzen et al. (2010).
(Frankenhuyzen et al. 2010)
As stated before, Broderick et al. (2006), and Broderick et al. (2009) reported the importance of
gut microbiota for the pathogenicity of B. thuringiensis in a wide range of hosts, but this is in
contrast with our findings. They used antibiotics in order to obtain aseptic lepidopteran hosts,
and found that treating larvae with antibiotics inhibited the pathogenicity of B. thuringiensis in
five insect species. We also reared C. capitata larvae on diet supplemented with antibiotics. The
direct effect of this was that the abundance and diversity of the gut microbiota was reduced, and
this did not translate in a change in B. pumilus 15.1 pathogenicity on the Medfly. Previous
reports demonstrated that fly fitness is not affected by ingesting antibiotics (Behar et al. 2008a,
Ben-Yosef et al. 2008); so, the mortality rate antibiotic treatment did not affect the mortality rate
of the flies subsequently fed on bacteria.
222 |


In competitive terms, gut microbiota invading the cadaver directly compete with
entomopathogenic bacteria for the limited resources offered by the insect host. It would therefore
make poor adaptive logic for a pathogen to rely upon its competitors for full pathogenicity
(Raymond et al. 2008). This suggests that suppression of the gut bacteria community would
represent an evolutionary benefit for B. thuringiensis, by reducing the number of competitors
within any resulting cadaver.

Comparison of the two paterns, C. capitata guts and C. capitata plus B. pumilus guts, showed
limited evidence of inocula dominating the gut community in any treatments. Neither B. pumilus
15.1, nor B. pumilus M1 bands are commonly present in the bacterial community of the
surviving and dead larvae. Comparison of the larvae subjected to sterilization treatment versus
non-sterile larvae suggests that less diversity (expressed in number of bands) and more
variability (in each treatment) are present in sterilised treatments, even though it was not possible
to eliminate all the bacterial populations present. However, sterilization treatment seems to
knock out certain taxa.

We have isolated and identified eleven colony morphotypes from the insect guts of C. capitata;
although the majority of the morphological differences between strains isolated in this
experiment were not confirmed by identification based on 16S rRNA gene sequences. Four
colony morphotypes isolated from larvae treated either with B. pumilus 15.1 or B. pumilus M1
were identified as Bacillus strains, including B. pumilus, suggesting that the bacterial cells
survive in the gut of C. capitata larvae. Besides, two morphotypes isolated from guts treated with
B. pumilus 15.1 were found to be Klebsiella sp. and B. cereus. This is interesting as, in the gut of
the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens, B. cereus was also found (Kuzina et al. 2001).
On the other hand, three morphotypes originally isolated from guts not treated with bacteria were
assigned as Enterobacter sp., Kocuria sp., and Klebsiella pneumoniae. Our results are consistent
with studies that have analyzed the bacterial community of Medfly using molecular methods. In
these previous studies, the genera Enterobacter and Klebsiella were also reported, being the most
representative groups in wild and laboratory Medfly populations (Behar et al. 2005, 2008a), and
also were associated to other Tephritids (Lauzon et al. 1998). The genus Kocuria was not found
DI SCUSSI ON | 223
previously related to C. capitata, or even associated with other fruit fly species, meaning that this
study represents the first report of the presence of this taxonomic group in the Medfly.

Kocuria is a genus of gram-positive, strictly aerobic microorganisms. Previously they were
classified into genus Micrococcus, but have now been removed from Micrococcus based on
phylogenetic and chemotaxonomic analysis (Stackebrandt et al. 1995). This bacterial cluster
consists of nine species and is generally considered to be non-pathogenic commensals that
colonize the skin in humans and other mammals. However, they can be opportunistic pathogens
in humans, though documented cases of infections are rare (Tsai et al. 2010). To our knowledge,
there is only one previous report of Kocuria associated with insects, specifically Kocuria varians
was found in the gut of the termite Zootermopsis angusticollis (Wenzel et al. 2002).

Overall the results from culture-independent and culture-dependent methods are consistent.
However, culture-independent methods may better represent the overall picture in which
ingestion of B. pumilus 15.1 produced in the natural gut flora. With respect to the medflys gut
community, this study demonstrates the effects of pathogen invasion on symbionts, which are
increasingly recognized as major players in the ecology of species interactions.


Concluding remarks
The phenomena outlined here is under study in order to understand the mechanisms by which
activation of the toxicity/virulence factor takes place. Is B. pumilus 15.1 a broad-host-range
pathogen with the potential to be used as a biological control agent against insect pests of fruit
crops? Why is the toxicity revealed only when the bacterial culture is incubated at low
temperatures? It will be interesting in future studies to investigate the potential interactions of B.
pumilus 15.1 with other agriculturally relevant insect pests in order to answer such questions.
Moreover, a consideration of other metabolic bacterial factors is necessary to fully understand
the new described phenomenon.































6
6. . C C O O N N C C L L U U S S I I O O N N S S













CONCLUSI ONS | 227

1. Biological samples taken from agricultural areas where the Mediterranean fruit fly,
Ceratitis capitata is well established are good sources of natural enemies for this insect
species, and for the isolation of bacterial strains belonging to Bacillus genus.

2. It is possible to find natural strains of Bacillus genus with toxic activity against
economically important insects (e.g. C. capitata), revealing that there are bacterial strains
with novel insecticidal toxins and other naturally-ocurring compounds with unexplored
activities and potential uses.

3. The selective method of Travers et al. (1987) is useful to isolate not only B. thuringiensis
strains, as they argued, but also other Bacillus species not typically recognized as toxin
producers, such as B. pumilus 15.1, meaning that this method could be helpful for the
isolation of bacterial strains with potential insecticidal activity.

4. B. pumilus 15.1, isolated from a partially decomposed common reed plant, is highly toxic
to C. capitata larvae; and the special conditions required to obtain this toxicity would be
the reason why this bacterium is not considered a traditional entomopathogen.

5. Toxicity toward C. capitata larvae was observed only when cultures of B. pumilus strain
15.1 were exposed to low temperatures, with an optimal time of incubation of 96 hours at
4C; bringing out the fact that exploration of novel entomopathogenic activities under
conditions that have not been tested to date would result in the discovery of toxic
activities.

6. The hypothetical virulence factor responsible for the toxicity of B. pumilus 15.1 is
synthesized during sporulation, similar to B. thuringiensis that produces insecticidal
proteins during the sporulation phase.

228 |

7. B. pumilus 15.1 seems to have specific toxic properties against first-instar larvae, since no
toxicity for C. capitata eggs, third-instar larvae, pupae, or adults was observed when the
same conditions that resulted in maximum toxicity for larvae were used.

8. There is evidence suggesting that the virulence factor produced by B. pumilus 15.1 is a
protein, and the possibility that other non-protein factors might participate in toxicity is
not discarded.

9. Parasporal bodies are present in sporulated cultures of B. pumilus 15.1, and these
crystalline structures closely resemble those of B. thuringiensis. The role of crystal
inclusions in strain 15.1 is unknown, but these structures could be linked to toxicity.

10. B. pumilus 15.1 and other entomopathogenic bacterial strains analyzed do not have
phylogenetic relationships associated to their insect target group

11. Mid-gut bacteria of C. capitata larvae are not required for the pathogenicity of B. pumilus
15.1. Despite of the fact that a new hypothesis was proposed for the role played by the
mid-gut bacterial community on the mode of action entomopathogenic bacteria, the
reduction of gut microbiota of C. capitata larvae does not lead to a reduction in mortality
caused by B. pumilus 15.1, implying that the natural gut bacteria is not required for
pathogenicity of the strain 15.1.

12. B. pumilus 15.1 might be considered as a strong candidate for the biological control of C.
capitata, since in fruit models contribute to the decrease of Medfly infestation, specially
in a citrus fruit. Further studies are required in order to validate its effectiveness in the
suppression of Medfly populations under field conditions.


























7
7. . B B I I B B L L I I O O G G R R A A F F A A







230 |







BI BLI OGRAF A | 231

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