Prctica n 18

09/01/2014

RESISTENCIA OSMTICA ERITROCITARIA

FUNDAMENTO Determinar la Fragilidad Osmtica de los eritrocitos a determinadas concentraciones decrecientes de NaCl (entre 0.9% y 0%) midiendo la hemlisis que se produce en cada una de ellas. La ruptura de la membrana celular produce la salida del contenido de hemoglobina, por lo que se puede medir la ruptura de los eritrocitos midiendo y cuantificando la cantidad de hemoglobina liberada al medio mediante tcnicas espectrofotomtricas Por lo tanto, la ROE permite evaluar la resistencia y estabilidad de la membrana del eritrocito frente a un estrs osmtico. Es una prueba indirecta realizada para el estudio de las membranopatas eritrocitarias.

MATERIAL -Tubos de ensayo -Pipetas 19,5 y 2 ml -Micropipeta de 50l -Cubetas -Pipetas pasteur -Puntas de micropipeta -Espectrofotmetro -Excel

REACTIVOS -Solucin salina 0.9% -Agua destilada

MUESTRA Sangre venosa anticoagulada con EDTA

TCNICA En condiciones normales existe un equilibrio osmtico entre el contenido de los eritrocitos y el plasma. El movimiento del agua a travs de la membrana semi-permeable genera una presin hidrosttica llamada presin osmtica. La presin osmtica es la presin necesaria para prevenir el movimiento neto del agua a travs de una membrana semi-permeable que separa dos soluciones de diferentes concentraciones.

Para mantener la forma de un hemate, este debe estar rodeada de una solucin isotnica, lo que quiere decir que la concentracin de agua de esta solucin es la misma que la del interior de la clula. En condiciones normales, el suero salino normal (0.9% de NaCl) es isotnico para los hemates

Si se colocan glbulos rojos en una solucin hipertnica, es decir, de concentracin inica superior en el exterior de la clula a la del interior de esta misma, se produce un flujo de agua desde el interior de la clula hacia el exterior, por lo tanto pierde agua y de deshidrata, esto produce crenacin de las clulas, es decir adquiere un aspecto dentado por diminucin de su volumen

Si se colocan glbulos rojos en una solucin hipotnica, es decir, de concentracin inica menor en el exterior de la clula a la del interior de esta misma, se produce un flujo de agua desde el exterior de la clula hacia el interior por lo tanto las clulas se hinchan y adquieren una forma esfrica, hasta que se rompen y la hemoglobina se libera. El proceso de ruptura de la pared celular se denomina hemolisis. En condiciones normales, un eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una entrada de agua que incremente su volumen en un 70% como mximo.

Por estos motivos es importante cuando una persona requiere que se le suministren soluciones intravenosas que estas sean isotnicas con los fluidos intracelulares. Si esta precaucin no es tenida en cuenta se puede producir la crenacin o la hemolisis con graves consecuencias para la salud.

Llamamos ROE a la medida realizada para determinar la capacidad de una poblacin de eritrocitos para resistir el efecto hipotnico del medio, y se expresa como aquella concentracin de NaCl (en g/L) necesaria para producir el 50% de hemlisis (H50).Para cada eritrocito, la ROE depende de la relacin que existe entre su superficie (S) y su volumen (V). Debido a su forma bicncava, los eritrocitos pueden aceptar, sin producir hemlisis, una entrada de agua capaz de aumentar su volumen hasta un 70%. Una vez rebasado este lmite, sobreviene la hemlisis. Cuando existe un defecto en la forma del eritrocito que disminuye la relacin S/V, como ocurre en la esferocitosis hereditaria, este lmite disminuye, y la hemlisis comienza en presencia de soluciones menos hipotnicas, disminuyendo la ROE (o lo que es lo mismo, aumenta el valor de H50)

DESARROLLO Y RESULTADOS

1. Preparar 9 tubos de ensayo y rotularlos

Se prepara una batera de 9 tubos y se enumeran.

2. Preparar 9 cubetas del mismo modelo para espectrofotometra y rotularlas

3. Preparacin de diluciones de NaCl para cada tubo: Se aade una cantidad determinada de agua destilada y NaCl siguiendo la tabla. Diucin (Tubo) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Volumen de NaCl (Solucin salina al 0,9%) 9 ml 8 ml 7 ml 6 ml 5 ml 4 ml 3 ml 1 ml 0 ml Volumen H2O (agua destilada) 0 ml 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml 6 ml 8 ml 9 ml Concentracin 0,9% 0,8% 0,7% 0,6% 0,5% 0,4% 0,3% 0,1% 0,0%

4. A cada uno de los tubos se le aade 50 l de sangre. No hay que enjuagar la micropipeta. 5. Se mezclan y se dejan incubar/reposar 30 minutos a temperatura ambiente 6. Centrifugar los tubos a 3000 rpm durante 5 min

Cuidado al sacar los tubos, no moverlos bruscamente

Tubos de los compaeros de la lnea 4

El tubo 1 contiene mxima concentracin de NaCl, es una solucin hipertnica por lo tanto los hemates pierden agua y se arrugan. La hemlisis es 0% y se observa ausencia de color en la solucin y un botn rojo de hemates en el fondo. El tubo 9 contiene cero concentracin de NaCl, es una solucin hipotnica por lo tanto los hemates han aumentado de tamao hasta romperse. La hemlisis es 100% y se percibe por un intenso color rojo en la solucin y escaso o ningn sedimento de hemates La hemlisis va aumentando segn disminuye la concentracin.

Tubos de nuestra lnea

7. Con pipetas Pasteur se aspira el sobrenadante de cada tubo y se pasa a su cubeta correspondiente.

8. Leer la absorbancia a 540nm. El tubo 1 es el que no tiene hemlisis y se usar como blanco para hacer el cero.

Dilucin 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Absorbancia 0,0 0,027 0,082 0,282 0,357 0,414 0,430 0,472 0,506

9. Calculo del % de hemlisis. Para hallar el % de hemlisis se tendr en cuenta que la absorbancia del tubo 9 corresponde al 100% de hemlisis, as pues mediante regla de tres se determinarn el resto

TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9

% Hemlisis 0% 5,33% 16,20% 55,63% 70,55% 81,81% 84,98% 93,28% 100%

10. Realizacin de la curva de los valores de hemlisis en % contra la concentracin de NaCl. Sobre la grfica se determina el valor de NaCl para el que le corresponda una hemlisis del 50%. H50.

Curva de Resistencia Osmtica Eritrocitaria

100 90 80 70 % Hemlisis 60 50 40 30 20 10 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Concentracin NaCl (%)

COMENTARIOS Y CONCLUSIONES La medicin de la ROE nos da una informacin valiosa sobre la normalidad de los hemates. Cuando la ROE baja, aumenta la hemlisis en los tubos que contienen solucin salina a mayor concentracin. Esto sucede en la esferocitosis hereditaria, en la ovalocitosis congnita y en la estomatocitosis hereditaria, debido a que en estas enfermedades la superficie de los hemates esta disminuida con respecto a su volumen, por lo que estos toleran peor la entrada de agua y tienen aumentada su fragilidad osmtica. Cuando la ROE sube, la aparici6n de la hemlisis se retarda y empieza a nivel de tubos que contienen solucin salina a una concentracin menor que lo previsto. Esto acontece con los reticulocitos y con los glbulos rojos propios de la talasemia menor y de la anemia ferropenica, debido a que estas clulas tienen incrementada su superficie en relacin con su volumen, por lo que toleran mejor la entrada de agua y tienen disminuida su fragilidad osmtica.