Prctica 5. Determinacin actividades metablicas en bacterias.

Introduccin El metabolismo bacteriano consiste en el conjunto de reacciones que realizan las bacterias durante su crecimiento. Todas estas reacciones son catalizadas principalmente por endoenzimas, que funcionan dentro de la clula, o bien por exoenzimas que son liberadas al medio externo para catalizar reacciones fuera de la clula bacteriana, principalmente reacciones hidrolticas. En esta prctica se determinarn las actividades amilasa y gelatinasa, que consisten en la produccin de exoenzimas hidrolticas para degradar compuestos complejos como el almidn y la gelatina respectivamente. Por otra parte, el agua es esencial para todos los procesos bioqumicos. Para las bacterias, tres factores crticos son la presin osmtica, la disponibilidad del agua y la desecacin. El total de agua realmente disponible para uso microbiano se expresa como la actividad del agua (aw). Cada vez que se disuelven sustancias en el agua pura aumenta la presin osmtica y disminuye la cantidad de agua disponible. En esta prctica se determinar el efecto de la presin osmtica y la actividad del agua sobre el crecimiento bacteriano. Adems se evaluar el efecto de la desecacin.

Objetivos 1. Realizar pruebas para demostrar actividades metablicas en bacterias. 2. Determinar el efecto de la presin osmtica, la actividad del agua y la desecacin sobre el crecimiento bacteriano.

Materiales y mtodos I. Materiales Cultivos bacterianos de prueba Marcador permanente Placas con agar almidn (10 g/l almidn; 5 g/l peptona; 8 g/l NaCl; 3 g/l extracto de carne; 15 g/l agar; pH 6.5-7) Mechero Asa bacteriolgica Lugol Gotero Determinacin de la actividad amilasa

Procedimiento

1. Utilizando un marcador permanente, divida la placa agar almidn por la parte de atrs en tres secciones. 2. Inocule dos secciones por estra simple con dos cepas diferentes y deje una seccin sin inocular. Rotule adecuadamente la placa. 3. Incube a 35oC durante 24 h, o bien a temperatura ambiente durante 72 h. 4. Transcurrido el tiempo de incubacin, determine la actividad de amilasas en las placas agar almidn por la aparicin de zonas claras alrededor de las colonias. Para visualizar mejor dichas zonas claras, agregue unas gotas de lugol a la placa. Compare las secciones inoculadas con la zona sin inocular. II. Materiales Cultivos bacterianos de prueba 3 tubos con 7ml de agar gelatina (5 g/l peptona; 3 g/l extracto de carne; 120 g/l gelatina; pH 6.8) solidificados en forma recta Mechero Asa de punta cido tricloroactico al 5% (TCA) Gotero Determinacin de la actividad gelatinasa

Procedimiento: 1. Inocule dos tubos de agar gelatina con los cultivos de prueba por picadura recta y deje un tubo sin inocular. 2. Rotule adecuadamente e incube a 35oC durante 24 h, o bien a temperatura ambiente por 72 h. 3. Transcurrido el tiempo de incubacin, observe la licuefaccin del medio y agregue unas gotas de solucin de TCA al 5%. Observe la aparicin de zonas claras o nubosidad en el medio. Compare con el tubo sin inocular. III. Efecto de la presin osmtica, la actividad del agua y la desecacin en el crecimiento bacteriano

Materiales Cultivos bacterianos de prueba Asa bacteriolgica 3 tubos de ensayo con 7ml de CN +10% sacacosa (p/v) 3 tubos de ensayo con 7ml de CN +30% sacacosa (p/v) 3 tubos de ensayo con 7ml de CN +60% sacacosa (p/v)

3 tubos de ensayo con 7ml de CN + 1% NaCl (p/v) 3 tubos de ensayo con 7ml de CN + 5% NaCl (p/v) 3 tubos de ensayo con 7ml de CN + 10% NaCl (p/v) 3 tubos de ensayo estriles vacos CN estril Micropipetas Puntas azules para micropipeta estriles Procedimiento 1. Para evaluar el efecto de la presin osmtica y la actividad del agua, inocule los cultivos de prueba en dos de los tres tubos de CN con diferentes concentraciones de NaCl y de sacarosa. Deje un tubo de cada concentracin sin inocular. Rotule adecuadamente. Incube todos los tubos a temperatura ambiente durante una semana, realizando observaciones diarias. Compare los inoculados con el tubo sin inocular. 2. Para evaluar el efecto de la desecacin, en dos de los tres tubos vacos, inocule una gota de los cultivos de prueba. Deje uno de los tres tubos sin inocular. Incube los tres tubos a temperatura ambiente durante una semana. Transcurrido el tiempo de incubacin, agregue 3 ml de CN estril a cada uno de los tres tubos. Reincube todos los tubos a 35 C por 24 h o bien a temperatura ambiente por 72 h. Observe y compare los tubos inoculados con el tubo sin inocular. Resultados I. Determinacin de la actividad amilasa

Complete el siguiente cuadro segn se indica a continuacin: No hay crecimiento (-), poco crecimiento (+), crecimiento intermedio (++), crecimiento abundante (+++), Actividad sobre sustratos (+ -). Parmetro Crecimiento Color del medio con Lugol Hidrlisis del almidn Cultivos de prueba Tubo control sin inocular

II.

Determinacin de la actividad gelatinasa

Complete el siguiente cuadro segn se indica a continuacin: No hay crecimiento (-), poco crecimiento (+), crecimiento intermedio (++), crecimiento abundante (+++), Actividad sobre sustratos (+ -).

Parmetro Crecimiento Licuefaccin del medio Formacin de nubosidad al agregar TCA 5% Hidrlisis de gelatina

Cultivo de prueba

Tubo control sin inocular

III.

Efecto de la presin osmtica y la actividad del agua en el crecimiento bacteriano

Complete el siguiente cuadro segn segn se indica a continuacin: No hay crecimiento (-), crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (+++). Parmetro Cultivo de prueba Tubo control sin inocular

aw=0.990

Sacarosa 10% NaCl 1%

Presin osmtica y actividad del agua

aw=0.970

Sacarosa 30% NaCl 5%

aw=0.970

Sacarosa 60% NaCl 10%

Desecacin Cuestionario 1. Cules macronutrientes pueden ser aprovechados en el almidn y en la gelatina? 2. Qu relacin hay entre aw y la humedad relativa? Bibliografa Aquiahuati, M. y Prez, M. 2004. Manual de Prcticas del Laboratorio de Microbiologa General. Universidad Autnoma Metropolitana. Mxico D.F., Mxico. 116p.