Universidad Autnoma de Chihuahua.

Facultad de Ciencias Qumicas.

TECNICAS DE SEPRACION.

Separacin de aminocidos por Cromatografa en capa fina y deteccin mediante reaccin con Ninhidrina

TECNICAS DE SEPARACION.
DRA. MARIA DE LOURDES BALLINAS CASARRUBIAS.

Laboratorio de Qumica Analtica III

Carolina Garca Ponce 245468. Melissa Valenzuela Armenta 245374. Miche Gonzlez Duran 245577.

Viernes 31 de Mayo de 2013

Introduccin
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que los componentes que se han de separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales est en reposo (fase estacionaria, F.E.) mientras que la otra (fase mvil, F.M.) se mueve en una direccin definida. Es utilizada en la actualidad para lograr una purificacin, separacin e identificacin de distinto tipo de sustancias ya sean orgnicas o inorgnicas. Las tcnicas cromatogrficas se basan en la afinidad que presentan los componentes de las muestras por alguna fase inmiscible con la que estarn en contacto, dependiendo del proceso en el cual se vaya a llevar a cabo la separacin, se pueden clasificar los diferentes mtodos cromatogrficos. Algunos de estos mtodos son los de capa fina y columna. La cromatografa en capa fina se basa en una fase mvil la cual es un lquido y una fase estacionaria que es un slido absorbente, ste solido se aplica sobre una placa de vidrio (una capa muy delgada de aproximadamente 0.25mm). Existen variables que influyen en la eficacia de la separacin en cromatografa de capa fina y cromatografa de columna: a) A menor temperatura las sustancias se adsorben ms en la fase estacionaria. b) Las corrientes de aire que afectan la cromatografa. c) Limpieza de las placas. d) La pureza y eleccin de los disolventes. e) El Dimetro de la columna y cantidad de gel de slice. La cromatografia en capa fina (CCF), es una de los tipos de tcnicas cromatogrficas. La fase estacionaria es una capa uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. Una de las mayores ventajas del uso la cromatografa, es que es capaz de separar componentes para obtenerlos mas puros y posteriormente ser utilizadas. Puede abarcar escalas microanalticas hasta escalas industriales y es una tcnica poco o nada destructiva que puede aplicarse a sustancias lbiles.

La cromatografa constituye una metodologa imprescindible en estudios bioqumicos, toxicolgicos, estructurales, ya que adems de utilizarse como tcnica de separacin e identificacin, se usa como un mtodo preparatorio. Los aminocidos son las unidades qumicas o elementos constitutivos de las protenas que a diferencia de los dems nutrientes contienen nitrgeno. Los aminocidos son biomolculas formadas por (C) Carbono, (H) Hidrogeno, (O) Oxgeno y (S) Azufre. Estos, son la nica fuente aprovechable de nitrgeno para el ser humano, adems son elementos fundamentales para la sntesis de las protenas, y son precursores de otros compuestos nitrogenados. Dentro de los 20 amincidos destacaremos cuatro de ellos: arginina, cistena, lisina y glicina. La arginina (arg o R) es uno de los 20 aminocidos que se encuentran formando parte de las protenas. En el tejido heptico, la arginina puede ser sintetizada en el ciclo de la ornitina (o ciclo de la urea). Se clasifica, en poblacin peditrica, como un aminocido esencial. Este aminocido se encuentra involucrado en muchas de las actividades de las glndulas endocrinas. La cistena es un -aminocido con la frmula qumica HO2CCH(NH2)CH2SH. Se trata de un aminocido no esencial, lo que significa que puede ser sintetizado por los humanos. Los codones que codifican a la cistena son UGU y UGC. La parte de la cadena donde se encuentra la cistena es el tiol que es no polar y por esto la cistena se clasifica normalmente como un aminocido hidroflico. La parte tiol de la cadena suele participar en reacciones enzimticas, actuando como nuclefilo. El tiol es susceptible a la oxidacin para dar lugar a puentes disulfuros derivados de las cistena que tienen un importante papel estructural en muchas protenas. La cistena tambin es llamada cistina, pero esta ltima se trata de un dmero de dos cistenas a travs de un puente disulfuro. La lisina es un aminocido componente de las protenas sintetizadas por los seres vivos. Es uno de los 10 aminocidos esenciales para los seres humanos. En la cromatografa para la separacin de aminocidos, los componentes en una mezcla se separan en base a la fase mvil y la fase estacionaria. Las molculas se mueven a lo largo del cromatograma y dan como resultado un equilibrio entre fuerzas de transmisin o arrastre ejercido por la fase mvil al momento de desplazarse por la fase estacionaria. en general, si se encuentra un soluto y tiene contacto con dos fases inmiscibles que estn en contacto una con otra, ste se distribuir entre ambas fases a favor de sus solubilidades relativas.

En esta cromatografa se tiene un soporte unido a la fase estacionaria liquida. La mezcla que se pretende separar se hace avanzar junto con la fase mvil por la fase estacionaria por medio de capilaridad. En este avance se arrastrarn las molculas de cada componente que se desea separar de acuerdo con los coeficientes de reparto. En la cromatografa de reparto tenemos un soporte inerte al que est unida la fase estacionaria lquida. La mezcla a separar junto con la fase mvil se hace avanzar a lo largo de la fase estacionaria por capilaridad. En dicho avance, la fase mvil arrastrar consigo un porcentaje de molculas de cada componente a separar de acuerdo con los respectivos coeficientes de reparto. La distancia recorrida por cada uno de los componentes de la muestra depender de la cantidad de solvente o eluyente que se haga pasar y de los coeficientes de reparto, de manera que si stos son diferentes aqulla tambin lo ser, siendo posible la separacin si se utiliza el volumen de eluyente apropiado. En su desplazamiento, las molculas de soluto se distribuirn no puntualmente, sino formando un rea debido a que son parcialmente solubles en las dos fases y a otros fenmenos tales como la difusin.

Objetivo
Aprender, conocer y aplicar las distintas tcnicas de cromatografa y lograr la separacin de los cuatro aminocidos mencionados llevando a cabo los diferentes mtodos.

Materiales y Mtodos
Material, equipo y reactivos Bureta de 25 ml. Propipetero. 3 vidrios reloj 10 tubos de ensaye Fibra de vidrio Capilares 2 matraces aforados 25ml. Pipeta 10ml. Pesafiltro Gradilla. Esptula 3 vasos de precipitados 250ml Reactivos Resina intercambiadora (GOLDEN BELL Reactivos) Alcohol Etlico Absoluto (FagaLab) cido actico (J.T. Barker) Arginina Cistena (Analytyca) Glicina (FagaLab) Lisina (Analytyka) Ninhidrina (HYCEL Reactivos qumicos)

Mtodo Cromatografa de capa fina. 1. Cortar o preparar las placas de gel slica dibujando crculos en las extremidades 2. Tomar muestras usando capilares y ponerlas en la placa de silica gel (diferenciar la muestra del aminocido). 3. Dejar secar la muestra. 4. Agregar el eluyente en la cmara de reaccin con una altura de aproxumadamente 1 centmetro. 5. Colocar la placa de silica gel dentro de la cmara y dejar correr la cromatografa, hasta que eluyente llegue al borde. 6. Retirar la placa de silica gel (terminada la cromatografa) y dejar secar 7. Rociar con un pulverizador la solucin reveladora 8. Meter la tira de silica gel al horno 9. Interpretar los resultados.

Metodos decapa fina en columna de intercambio inico. 1. Preparar la columna de intercambio inico y colocar la resina en aproximadamente 9 ml de una bureta, colocando en la parte del fondo un tapn de fibra de vidrio, para no permitir el paso de la resina de intercambio inico. 2. FIjar la columna y dejar el nivel de lquido lo ms cerca posible a la resina (tomar el tiempo para preparar las muestras de aminocidos). 3. Adicionar alrededor de 2 a 3 ml de la muestra de aminocidos) y vovler a fijar la columna. 4. Adicionar 25 ml de agua destilada, 5. Repartir los 25 ml en 5 tubos de ensaye de 5 mil cada uno. 6. Repetir los dos pasos anteriores con NaOH. 7. Poner una pequea cantidad de la muestra (menos de una gota) en papel filtro 8. Adicionar inhidrina y meter al horno por un perodo de tiempo de 15 a 20 min.

9. Correr por cromatografa de capa fina las muestras con resultados positivos aadiendo una pequea cantidad de la muestra en placa por un lado, y del otro lado otra pequea cantidad de solucin de aminocidos. 10. Interpretar resultados.

Resultados y Discusin.

Tabla 1. Distancia recorrida por cada aminocido y calculo de RF (cromatografa capa fina ) Aminoacido Arginina Glicina Cistena Lisina Distancia recorrida (cm) .5 2.5 2.1 2.3 Rf .0603 .6076 .8 .4731

Tabla 2. Distancia recorrida por cada aminocido y calculo de RF (cromatografa capa fina columna de intercambio inico ) Muestra A B C D Distancia 0 2.5 2 2.3 Rf 0 .5914 .6 .5060 Salida 1(H2O destilada) 2(NaOH) 4 (NaOH) 5 (NaOH)

Se puede observar que en la cromatografa de capa fina la presencia de aminoacidos como la cistena, glicina, arginina y lisina comparando las distancias de los estndares de los aminocidos mismos en estado puro con la muestra de aminocidos; de esta manera se pueden determinar los aminocidos presentes en ella. En el clculo de los factores de retencin se observa una correlacin entre ellos y la forma en que los aminoacidos fueron presentandose. Los aminocidos en contacto con la nihidrina son los que presentan una reaccion colorimetrica pues sta reacciona con los aminoacidos que tienen el grupo amino libres dando lugar a la formacin de amoniaco y anhdrido carbnico, con reduccin del reactivo a hidrindatina, esta reacciona a su vez con el amoniaco y otro molcula ninhidrina para dar un compuesto de adicin doble que presenta un coloracin azul-purpura.

Conclusin
Se llev a cabo el cumplimiento efectivo del objetivo general de la prctica que fue aprender conocer y aplicar las distintas tcnicas de cromatografa y se logr la separacin de los cuatro aminocidos mencionados llevando a cabo esos diferentes mtodos.

Bibliografa

Tcnicas de bioqumica y biologa molecular. Jorge David Roriguez Miranda. Editorial Revert, 1991. ISBN: 8429118195. Cap. 8: Cromatografa. Pg. 179 La cromatografa. Fundamentos de tecnologa de productos fitoteraputicos. Nikolai Sharapin. Editorrial Convenio Andrs Bello, 2000. ISBN: 9586980014. Pg. 159-190.l Glosario de los trminos ms usados en cromatografa. Introduccin a la Cromatagrafa. Stella Torres de Young. Ediciones de la Univ. Nacional de Colombia. ISBN: 9581701192. Pg. 15 Devlin, T. M. 2004. Bioqumica, 4 edicin. Revert, Barcelona. ISBN 84-291-7208-4