Prctica N9: Determinacin de Transaminasa Glutmico Pirvica (TGP)

Objetivo:
a) Obtencin b) Manejo

de las muestras y procesamiento para cuantificar la concentracin de transaminasa TGP en suero del Mtodo Enzimtico

Teora: La alaninoaminotransferasa (ALT TGP) y la aspartatoaminotransferasa (AST TGO) son enzimas que se encuentran en los hepatocitos. Son marcadores sensibles de lesin heptica, pero slo la ALT es especfica (AST tambin est en msculo cardaco y esqueltico, rin, cerebro, pncreas, pulmones, leucocitos y hemates). Las transaminasas son enzimas ampliamente difundidas en el organismo, que catalizan la transferencia de un grupo amino de un aminocido a un cetocido, en una de las ms importantes reacciones del metabolismo proteico.

TGP

La coenzima que participa en esta reaccin es el Piridoxal fosfato que se transforma en piridoxamina fosfato. Al final de la reaccin, la piridoxamina fosfato lleva pues el grupo NH2 desprendido del aminocido inicial: lo perder transfirindolo a otro cido -cetnico, y de esta forma se regenerar el piridoxal fosfato: ste es el principio de la transaminacin. En la tcnica a utilizar, el piruvato formado reacciona con la 2,4 dinitrofenilhidrazina producindose en un medio alcalino, un compuesto coloreado que se mide a 505 nm. Material y Reactivos:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Estndar: solucin de piruvato de sodio 2 mmol/L. Se utiliza para efectuar una curva patrn. Sustrato TGP: solucin conteniendo 100 mmol/L de dL-alanina y 2 mmol/L de cetoglutarato en buffer fosfato 100 mmol/L, pH 7.4. Reactivo 2,4-DNFH. Solucin conteniendo 1 mmol/L de 2,4 dinitrofenilhidrazina en cido clohdrico 1 mmol/L. Diluyente para enzimas: Solucin de hidrxido de sodio 0.4 mol/L. Agua destilada Tubos y pipetas Espectrofotmetro

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Procedimiento: 1. Preparacin de la Muestras: Si es sangre total: centrifugar a 3000 rpm/15 min. A temperatura ambiente para obtener el suero. En estas condiciones la muestra es estable durante 8 horas a temperatura ambiente o refrigerada hasta 5 das (2-10 C). Los sueros hemolizados producen resultados falsamente elevados ya que los glbulos rojos contienen 3 a 5 veces ms enzimas que el suero.
2. Determinacin de la Actividad de la Transaminasa (TGP) en la Muestra:

Reactivos (mL)

Blanco

Muestra GPT

Sustrato GPT 1 1 Muestra ---0.2 Agua destilada 0.2 ---Mezclar por agitacin suave e INCUBAR a 37C por 30 minutos Reactivo 2,4 DNFH 0.5 0.5 Mezclar. Dejar 10 minutos a 37C. Diluyente de Enzima 5.0 5.0 (NaOH 0.4 N) Despus de 2 minutos, leer a 505 nm. Calibrar el equipo a cero con el blanco.
3. Curva de Calibracin

Tubo 1 2 3 4 5 6 7

Estndar Sustrato piruvato 0 1 0.05 0.95 0.10 0.90 0.20 0.80 0.30 0.70 0.40 0.60 0.50 0.50

Agua destilada 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

TGP U/L ---9 18 37 56 79 113

Mezclar y agregar a cada tubo 0.5 mL del Reactivo 2,4 DNFH. Incubar 10 minutos a 37C. Luego agregar 5 mL del diluyente para enzimas. Mezclar y retirar del bao mara. Leer a 505 nm. Restar a cada lectura la obtenida en el tubo 1 (blanco). Graficar y encontrar el factor de calibracin. U/L = Am x Factor Los resultados pueden ser expresados en U/L o en Unidades Kamen/mL U/L = U. Kamen/mL x 0.482 U. Kamen/mL = U/L x 2.07

4. Clculos de los resultados:

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5. Valores de referencia:

Suero Transaminasas (GOT) (ASAT): 5-32 mU/ml Transaminasas (GPT) (ALAT): 7-33 mU/ml Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
6. Cuestionario:

a) Anote sus resultados y realice sus clculos Tubo 1 2 3 4 5 6 7 TGP U/L ---9 18 37 56 79 113 [Estandar priruvato ] Abs. Abs. real

b) Grafique la curva y halle el factor de calibracin. c) Mencione en qu compartimento celular ocurre la transaminacin. d) Mencionar los tejidos donde se puede encontrar mayor presencia de GOT y GPT b) Explique el comportamiento de estas enzimas en el ayuno. a) Indique que factores modifican los niveles de transaminasas sin existir dao. c) Indique en qu casos encontrar valores elevados de transaminasa en el suero. Explique al menos en uno de ellos cual sera su mecanismo de participacin.
7. Referencias bibliogrficas:

Reitman, S. & Frankel, F. 1957. Determination of alanin amino transferasa in serumA. J. Clin. Path. 28:56. Frankel, S. 1970. Graswohls Clinical laboratory methods and diagnostic. Vol. 1 pg. 123 Ed. Por Frankel, Reitman y Sonnenwirth. 7ma Ed. Johnston D.E., Special considerations in interpreting liver function test. Am Fam Physician 1999; 59: 2223-30 [Texto completo] Moitinho Puigserver E., Bruguera Cortada M. Protocolo diagnstico de las elevaciones agudas de las transaminasas. Medicine (Madrid) 1996;(7 serie; n 9): 379-381 Pratt DS, Kaplan MM. Evaluation of abnormal liver-enzyme results in asymptomatic patients. N Engl J Med 2000; 342: 1266-1271 [Medline] Sort i Jan P., Protocolo diagnstico ante elevacin crnica de las transaminasas. Medicine (Madrid) 1996 ; (7 serie; n 9): 382-5

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