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REACCIONES DE PRECIPITACIN SOBRE GELES Corresponde a una forma de visualizacin de molculas que precipitan en un medio semislido como el gel de almidn, agar, agarosa, poliacrilamida, etc. Revisaremos en primer lugar las reacciones para visualizar una electroforesis y luego algunas reacciones para visualizar reacciones Ag-Ac como la inmunoelectroforesis, inmunodifusin radial, electroforesis en cohete. 1) Electroforesis. El trmino electroforesis (EF) se usa para referirse a la migracin de molculas o partculas ionizadas bajo la influencia de un campo elctrico. Las aplicaciones ms difundidas pero no exclusivas son la separacin de mezclas de protenas y de cidos nucleicos. El proceso electrofortico se lleva a cabo sobre un soporte inerte que puede ser papel de nitrocelulosa, gel de agar, agarosa, almidn o poliacrilamida los cuales son tamponados a un pH requerido. La separacin depende esencialmente de la carga neta de las molculas influenciada por el pH del buffer y es independiente del tamao, con excepcin de la electroforesis realizada sobre una gradiente de poliacrilamida, en la cual al aumentar la concentracin del gel disminuye la separacin entre las molculas del soporte impidiendo el paso a molculas de mayor tamao, en consecuencia este tipo de electroforesis permite la separacin en funcin de la carga y tamao molecular. Electroforesis en gel de agar. Ha sido utilizada ampliamente en el estudio de las protenas plasmticas y otros lquidos biolgicos, desde el punto de vista de la utilidad clnica sirve para tener una visin global del estado de las fracciones proteicas y si estas se encuentran en concentraciones normales, aumentadas o disminuidas. Tiene especial utilidad para detectar protenas anormales (paraprotenas) como las protenas monoclonales del mieloma mltiple y otras gammapatas. Se utiliza un gel de agar purificado o de agarosa de bajo efecto electro-endosmtico al 1 % en buffer adecuado, en el caso del estudio de protenas sricas se usa un pH 8.6 ya que las protenas sricas tienen puntos isoelctricos (P.I.) inferiores con excepcin de las globulinas que tienen P.I. 8.6 razn por la cual a este pH tienen carga neta cero y no migran en la electroforesis, aunque un ligero y generalmente deseable desplazamiento hacia el polo negativo es posible gracias al efecto electroendosmtico. Este tipo de EF tiene una resolucin que permite visualizar 5 a 6 fracciones. Desde el polo positivo o frente de migracin estas son la Albmina, globulinas 1, globulinas 2, globulinas y globulinas, en esta ltima fraccin se encuentran la mayora de los Acs (Fig.1) y se conoce tambin como fraccin de las inmunoglobulinas. A veces se observa una fraccin 2 a continuacin de la fraccin y una fraccin de pre albmina antes de la banda de albmina.

La electroforesis cualitativa suele ser suficiente, pero se puede cuantificar a) cortando y eluyendo las bandas en una solucin ligeramente alcalina (Ej. NaOH 0.01 N) y leyndolas espectrofotomtricamente para obtener la absorbancia y concentracin relativa o porcentual de cada fraccin, o b) en un aparato llamado densitmetro que lee, grafica e interpreta en funcin de la intensidad de la coloracin despus de teir. Para ello el densitmetro utiliza una adaptacin de la espectrofotometra.

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa de protenas del suero. A) Patrn de electroforesis normal de protenas sricas. B) Fracciones de las diferentes protenas sricas.

El resultado de la electroforesis puede ser influenciado por varios factores a tener en cuenta, tales como: Naturaleza del soporte. Debe ser inerte con mnima adsorcin de protenas, tamao del poro adecuado, por ejemplo: el papel ya no es til por lento y poco resolutivo, mientras que el agar y acetato de celulosa presentan caractersticas parecidas aunque el primero es ms usado, y el gel de poliacrilamida tiene gran poder de resolucin (ms de 25 bandas) pero no se usa para estudiar las protenas sricas aunque es de esencial en procedimientos de transferencia de geles (Blotting). Naturaleza o tipo de buffer. Obviamente, el buffer a utilizar depende del pH al cual se requiere trabajar; en el caso de las protenas del suero el pH es 8.6 y el buffer de eleccin es el buffer Barbital, par cido dietilbarbitrico barbiturato de sodio o Barbital cido clorhdrico. En definitiva el pH es un factor muy importante ya que determinar la carga neta de la molcula y por lo tanto su migracin.

La fuerza inica dada por la concentracin de iones. Es fundamental para una buena conduccin elctrica pero concentraciones no adecuadas interfieren con las molculas en migracin. Se suele usar una fuerza entre 0.025 a 0.075. Fuerzas inicas bajas como esta aumentan la velocidad de migracin pero tienden a disminuir la resolucin. Fuerzas inica altas mejoran la resolucin pero hacen ms lenta la migracin a la vez que generan ms resistencia y ms calor. Efecto electro-endosmtico. Consiste en el desplazamiento de las molculas en sentido contrario al de la migracin. Este efecto es producto de las impurezas que puede contener el soporte y que se cargan negativamente (en el caso del pH 8.6) estas impurezas al formar parte del soporte no se pueden desplazar pero atraen cargas positivas generando un desplazamiento de iones H3O hacia el ctodo retardando la migracin de la mayor parte de las protenas y un desplazamiento por detrs del punto de siembra en el caso de las protenas que no migran como el caso de las gammaglobulinas. Un ligero efecto electro-endosmtico es generalmente deseable. Intensidad de la corriente elctrica. El voltaje aplicado debe ser relativamente bajo para producir la menor resistencia y calentamiento del gel. A mayor intensidad de corriente mayor velocidad de migracin pero esto tiene un lmite ya que se tiende a calentar el gel con el peligro de denaturalizar las protenas. La evolucin de la migracin electrofortica puede seguirse agregando una pequea cantidad de azul de bromofenol a la muestra, lo que teir slo a la albmina de modo que el frente de migracin se puede observar como una banda azul que se desplaza. Terminada la electroforesis se sumerge la placa de agar en cido tricloroactico 2 g/dL o cido actico glacial 10 g/dL durante 30 a 60 minutos, con el objeto de precipitar las protenas en el punto de migracin. Seguidamente se debe deshidratar el gel haciendo presin sobre l entre dos papeles absorbentes o simplemente cubrindolo con papel filtro y dejndolo en una estufa a 37C durante la noche. Finalmente el portaobjetos conteniendo el agar deshidratado se tie con colorantes de protenas como el negro amido, azul de coomasie, etc. 2) Inmunodifusin doble de Ouchterlony o reaccin de identidad. Este procedimiento se ha utilizado para estudiar la relacin entre dos molculas antignicas. Para esto se disponen pocillos cortados en un soporte de agar o agarosa. En dos de ellos se ubican las soluciones con los antgenos a estudiar y en un pocillo ubicado en forma central y equidistante frente a ellos, se deposita el antisuero. Los reactantes difundirn a travs del agar hasta alcanzar concentraciones proporcionales, punto en el cual los complejos Ag-Ac precipitarn formando arcos los que pueden presentar tres patrones o formas de reaccin distintas a interpretar (Fig. 2). a) Reaccin de identidad: los arcos de precipitacin son idnticos, por lo que tienen idntica difusin y uno de sus extremos se fusionan como si fueran un solo arco, indicando que las molculas son iguales desde el punto de vista inmunolgico.

b) Reaccin de no-identidad: Aqu los arcos de precipitacin de los antgenos son diferentes y se cruzan en uno de sus extremos, indicando que se trata de molculas inmunolgicamente diferentes. c) Reaccin de identidad parcial: Los arcos de precipitacin parecen fusionarse pero uno de ellos forma una prolongacin como una espuela lo que sugiere de las molculas en estudio estn parcialmente relacionadas desde el punto de vista inmunolgico, esto es, comparten algunos eptopes. Las reacciones de Ouchterlony no tienen buena resolucin cuando se trabaja con mezclas complejas, para ello es preciso realizar una separacin previa de los antgenos. Cuando esta separacin se hace por electroforesis, el procedimiento completo se llama inmunoelectroforesis (IEF) y tiene aplicaciones adicionales como explicamos a continuacin.

Figura 2. Inmunodifusin doble de Ouchterlony. A) esquema identidad epitopes antignicos. B) esquema sin identidad epitopes antignicos. C) esquema identidad parcial de epitopes antignico

3) Inmunoelectroforesis (IEF). Combina la migracin de la electroforesis con una reaccin inmunolgica de reactantes que difunden preferentemente sobre un gel de agar o agarosa. En este caso el encuentro entre Ag y Ac, dependiendo de sus concentraciones relativas, produce un complejo Ag-Ac que precipita por su tamao (ver seccin dedicada al fenmeno de pro zona) lo cual le impide continuar difundiendo lo que se hace evidente por la presencia de un llamado arco de precipitacin. Este procedimiento permite la identificacin y estudio cualitativo de la concentracin de antgenos o anticuerpos, para lo cual se debe disponer de uno de ellos. En inmunologa se ha utilizado para la identificacin de inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM, componentes C3 y C4 del complemento, etc. En la primera etapa se realiza una electroforesis del suero en estudio en forma similar como se indic para la electroforesis en agar pero la muestra de suero problema se ubica en un pocillo circular, de modo que posteriormente se pueda hacer una canaleta al costado. Terminada la EF que permite la separacin de las fracciones proteicas, se omite la precipitacin en medio cido, en cambio se realiza una canaleta frente y a lo largo de la zona donde se produjo la migracin. En esta canaleta se vierte un antisuero que puede ser mono especfico o poli especfico (por ejemplo si se quiere estudiar la fraccin IgM debe usarse un antisuero anti IgM) y se permite que ocurra una doble difusin, esto es del antisuero y de las protenas sricas. Despus de 18 horas se observar un arco de precipitacin en la zona correspondiente a la protena correspondiente. Este tipo de reaccin se puede teir pero los arcos son suficientemente claros para estudiarlos directamente. Para la interpretacin se debe tener en consideracin no solo el tamao del arco comparndolo con un control normal, sino tambin (debido al fenmeno de pro zona) la posicin o distancia relativa del arco de precipitacin respecto de la canaleta. 4) Inmunodifusin Radial. La inmunodifusin radial simple (IDR) o inmunodifusin de Manzini, corresponde a una variante de las reacciones de inmunodifusin que permite la cuantificacin de antgenos o anticuerpos. Fue diseada por Mancini en 1965, en esta tcnica el agar o agarosa fundido y enfriado a 56 C se mezcla con un antisuero mono-especfico, se vierte rpidamente sobre una lmina de vidrio y se deja enfriar hasta que se forme el gel, quedando el anticuerpo homogneamente distribuido en el agar. Se practican una serie de pocillos o perforaciones los que se llenan con volmenes iguales soluciones estndares que contienen concentraciones conocidas del antgeno en estudio y otros pocillos se pone la muestra a analizar que contiene el antgeno en concentraciones desconocidas. Las molculas de las soluciones estndares y problemas difunden en forma radial a partir del punto de aplicacin formando complejos Ag-Ac con el anticuerpo incluido en el agar, los que precipitan formando un halo alrededor del pocillo (Fig. 3), el que seguir creciendo hasta que se consuma el antgeno que difunde y su concentracin sea insuficiente para mantener la proporcin Ag Ac necesaria para la visualizacin del precipitado. El dimetro del halo es proporcional a la concentracin del antgeno, pero debe tenerse presente que

molculas de gran tamao como la IgM pueden demorar ms en migrar por lo que las lecturas finales se hacen a las 48 horas para lograr una mxima difusin. Con los dimetros de las soluciones estndares graficados en el eje de las abscisas y las concentraciones correspondientes en el eje de las ordenadas cuando se usa papel semi-logartmico (tambin se puede usar papel milimetrado, pero en ese caso el dimetro del halo se eleva al cuadrado) se traza una curva de calibracin sobre la cual se puede interpolar la concentracin de cada muestra problema (Fig. 3). An cuando la IDR es un procedimiento bastante sensible, ya que puede detectar hasta 1 mg/dL de antgeno, no sirve para detectar inmunoglobulinas por debajo de ese rango de concentracin como ocurre con la concentracin de IgE. Tiene adems otras limitaciones que han de tenerse en cuenta, por ejemplo se puede obtener valores falsamente disminuidos cuando circulan protenas polimerizadas como en el caso del mieloma o complejos Ag-Ac como en el lupus eritematoso y artritis reumatoide, debido a una lenta difusin. Variantes de bajo peso molecular en el caso de la IgM monomrica pueden dar valores falsamente aumentados debido a que difunden ms rpido que el estndar.

Dimetro

Estndares: A-B-C-D y E Muestras Problemas: F y G

Figura 3. Inmunodifusin radial (IDR). A) Esquema sembrado sueros problemas y estndares. B) Ejemplo de curva de calibracin y grfico del dimetro v/s
concentraciones de estndares conocidos en papel semilogaritmico.

Los valores de referencia (a veces mal llamados valores normales) pueden variar especialmente segn la edad y la regin geogrfica. Por ejemplo los niveles de inmunoglobulinas a una misma edad son menores en un pas desarrollado que en uno subdesarrollado, por lo que cada laboratorio debera establecer sus propios valores de referencia. En la tabla indicada a continuacin se muestran los valores de referencia sricos en funcin de la edad, de las inmunoglobulinas y componente C3 del complemento determinados para nuestras de poblacin y publicados por el Instituto de Salud Pblica de Chile.

Tabla. VALORES DE REFERENCIA DE INMUNOGLOBULINAS Y COMPLEMENTO C3 EN UNA POBLACIN CHILENA. DISTRIBUCIN POR GRUPOS ETARIOS. Edad Recin nacido 3 meses 6 meses 9 meses 12 meses 18 meses 2 aos 3 aos 4 aos 6 aos 12 aos Adulto IgG (mg/dL) Media Rango 1.045 804 -1.238 * 603 426 764 * 804 450 -1.125 * 868 659 -1.077 * 884 651 -1.125 * 965 756 -1.190 * 1.045 788 -1.343 ** 1.254 667 -2.348 ** 1.254 667 -2.348 ** 1.254 667 -2.348 ** 1.254 667 2.348** 1.254 667 -2.348** IgA (mg/dL) Media Rango 6 0 -11 * 23 17 -27 * 54 27 -80 * 61 38 82 * 78 48 106 * 88 50 128 * 88 50 128 * 131 71 192 * 146 81 207 * 172 104 240 * 233 157 -306 * 231 104 518 ** IgM (mg/dL) Media Rango 15 7 22 * 72 44 - 100 * 105 55 152 * 114 85 147 * 106 76 137 * 97 53 140 * 108 80 135 * 134 92 193 ** 134 92 193 ** 134 92 193 ** 134 92 193 ** 134 92 193 ** C3 (mg/dL) Media Rango 110 96 -126 * 150 120 -184 * 140 108 180 * 128 88 170 * 130 90 178 * 128 85 170 * 148 117 180 * 199 142 267 ** 199 142 267 ** 199 142 - 267 ** 199 142 - 267 ** 199 142 -267 **

* desviacin estndar ** 95 % lmite de confianza

5) Nefelometra. Se trata de un procedimiento basado en el fenmeno de Tyndall, en el cual los complejos Ag-Ac formados dispersan la luz de una fuente de rayos lser que proporciona luz de longitud de onda corta, en comparacin a la dispersin realizada por la solucin inicial del reactivo (Fig. 4). A diferencia de la clsica reaccin de precipitacin en este caso la reaccin se desarrolla en presencia de exceso de anticuerpos (pro-zona) y los complejos formados son suficientemente pequeos para mantenerse en solucin, pero suficientemente grandes para dispersar la luz en un determinado ngulo. La cantidad de luz dispersada es proporcional a la cantidad de complejos formados y por lo tanto a la concentracin del antgeno. Entre los requerimientos de esta tcnica est la necesidad de una alta afinidad del Ac por el Ag., la solucin del Ac debe ser muy transparente, y el tiempo de lectura despus de la reaccin es crtico. Tambin se requiere contar con un nefelmetro confiable. Entre las ventajas de esta metodologa se encuentran la rapidez con que se puede obtener los resultados.

6) Turbidimetra. El principio es semejante a la nefelometra pero se mide la luz absorbida y reflejada (es decir no transmitida) cuando un rayo de luz atraviesa una suspensin homognea de partculas, por ejemplo de complejos Ag-Ac. Los procedimientos de Turbidimetra requieren de un turbidmetro pero tambin pueden ser desarrollados en la mayor parte de los espectrofotmetros que proporcionen una longitud de onda de unos 340 nm.

Figura 4. Principio de la nefelometra. La fuente luminosa es de tipo laser.