TecnicBasicas Cuenta Mohos Levaduras 6530

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed.
Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.

OBJETIVOS
Realizar adecuadamente mediante el mtodo de cuenta en placa, el nmero de
mohos y levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano. Evaluar la calidad microbiolgica de un alimento, que sea factible de estar contaminado con estos microorganismos, tomando como referencia la NOM-111SSA1-1994. Comprender el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin y cuantificacin de mohos y levaduras en alimentos. GENERALIDADES Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son tiles en la elaboracin de algunos alimentos, sin embargo tambin pueden ser causantes de la descomposicin de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibiticos, o la exposicin del alimento a la irradiacin. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lcteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias, etc. Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos como polisacridos, cidos orgnicos, protenas y lpidos. Tambin pueden causar problemas a travs de: (a) sntesis de metabolitos txicos (micotoxinas), (b) resistencia al calor, congelamiento, antibiticos o irradiacin y (c) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patgenas. Pueden tambin causar malos olores y sabores y la decoloracin de las superficies de alimentos. El trmino moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer fcilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo. La identificacin y clasificacin de los mohos se basa en observaciones macroscpicas y microscpicas.
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Hifas y micelio. El talo de los mohos est formado por una masa de filamentos ramificados, llamados hifas, llamndose micelio al conjunto de las hifas. Las hifas pueden ser sumergidas o areas. Tambin se pueden clasificar en hifas vegetativas o en crecimiento, las cuales se encargan de la nutricin del moho, y en hifas frtiles o hifas que producen los rganos reproductores. Los mohos se dividen en dos grupos: septados, es decir, provistos de tabiques transversales que dividen a las hifas, y no septados cenocticos, cuyas hifas estn formadas por cilindros sin tabiques transversales. Este tipo de hifas posee ncleos diseminados a lo largo del cilindro y se les denomina multicelular. Determinadas estructuras del micelio o determinados rganos ayudan a identificar a los mohos. Por ejemplo los rizoides o anclajes de los gneros Rhizopus o Absidia, la clula basal del gnero Aspergillus y la ramificacin dicotmica, o en forma de Y, del gnero Geotrichum. rganos o estructuras reproductoras. Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas asexuales. Algunos mohos tambin producen esporas sexuales. A tales hongos se les denomina perfectos, los cuales se dividen en Oomycetes y Zygomycetes si no son septados, o bien en Ascomycetes y Basidiomycetes si son septados, en contraposicin a los mohos imperfectos, Fungi Imperfecti, los cuales slo poseen esporas asexuales. Esporas asexuales. Los mohos producen gran cantidad de esporas asexuales, son pequeas, ligeras y resistentes a la desecacin. Se diseminan fcilmente por la atmsfera para sedimentar y originar el talo de un nuevo moho. Los tres tipos principales de esporas asexuales son: (1) conidios, (2) artrosporas u oidios y (3) esporangiosporas. Los conidios se separan, o crecen, en determinadas hifas frtiles denominadas conidiforos y generalmente son libres, es decir, no se encuentran dentro de ningn receptculo, en contraposicin a las esporangiosporas, las cuales se encuentran dentro de un esporangio o receptculo, situado en el extremo de una hifa frtil, el esporangiforo. Las artrosporas se forman por fragmentacin de una hifa. El extremo engrosado del esporangiforo se denomina columnela y adopta formas tpicas en cada una de las distintas especies de mohos. Algunos mohos poseen conidios comprimidos uno contra otro, dispuestos en cadenas, y que nacen de una clula especializada, el esterigma o filide situada en el extremo del conidiforo. Propiedades fisiolgicas. En comparacin con la mayora de las levaduras y de las bacterias, la mayora de los mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible. Un porcentaje total de humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en algunos frutos secos impedir o retardar mucho el crecimiento de los mohos. Los mohos podran considerarse mesfilos, es decir, que son capaces de crecer bien a temperaturas normales. La temperatura ptima de la mayora se encuentra alrededor de los 25 a 30 aunque algunos son psicrtrofos y algunos son termfilos. Son C, aerobios, esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie de los alimentos. Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH (pH comprendido entre 2 y 8.5), aunque la mayora crece mejor a pH cido. Son capaces de utilizar muchos tipos de alimentos, que van desde sencillos a complejos. Poseen enzimas hidrolticas, y de aqu que algunos se utilicen para la produccin industrial de las amilasas, pectinasas, proteasas y lipasas.
Algunos gneros de mohos importantes en alimentos. Mucor. Intervienen en la alteracin de algunos alimentos y se utilizan en la fabricacin de otros. M. rouxii se utiliza para la sacarificacin del almidn, para la maduracin de quesos y para la fabricacin de algunos alimentos orientales. Rhizopus. La especie R. stolonifer, o moho del pan, es muy comn e interviene en la alteracin de algunos alimentos: bayas, frutas, hortalizas, pan, etc. Aspergillus. Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen en las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otros son de utilidad para preparar determinados alimentos. A. niger se utiliza para la produccin industrial de cido ctrico y glucnico y de algunas enzimas. A. flavus se utiliza para la fabricacin de ciertos alimentos orientales y en la obtencin de enzimas. Se han reportado casi 50 especies de Aspergillus como productores de metabolitos txicos denominados en general micotoxinas. Las de mayor importancia son: las denominadas aflatoxinas (producidas por A. flavus, A. parasiticus y A. nomius); la ocratoxina A producida por A. ochraceus, A. carbonarius y A. niger; sterigmatocistina producida principalmente por A. versicolor; el cido ciclopiaznico producidas por A. flavus y A. tamarii. La citrinina, patulina y cido peniclico tambin son producidas por especies de Aspergillus, las txinas tremorgnicas son producidas por A. terreus (territremas), A. fumigatus (fumitremorgenas) y A. clavatus (triptoquivalina). Las aflatoxinas son derivados de la difurancumarina. Las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 se producen en la naturaleza por los mohos ya mencionados. Las letras B y G se refieren a los colores de flurescencia por sus nombres en ingls ( azul y verde, respectivamente) observados bajo longitudes de onda en la regin UV, y los subndices 1 y 2 se refieren a sus patrones de separacin cromatogrficos. Las aflatoxinas M1 y M2 se producen por la hidroxilacin de las respectivas aflatoxinas B. La aflatoxina B1 tal vez sea el carcingeno de hgado ms potente para animales incluyendo al humano. La ocratoxina A y la citrinina afectan la funcin renal. Las toxinas tremorgnicas afectan el sistema nervioso central. Penicillium. Es otro gnero de mohos de frecuente incidencia y de importancia en los alimentos, P. expansum produce la podredumbre blanda de las frutas; P. digitatum y P italicum producen la podredumbre de frutas ctricas. Las especies P. camemberti, P. roqueforti se utilizan en la maduracin de quesos. Se han reportado ms de 80 especies de Penicillium como productores de micotoxinas. Estas micotoxinas pueden dividirse en dos grupos: las que afectan la funcin del heptica o renal, y las neurotoxinas. Las principales micotoxinas producidas por Penicillium son, ocratoxina A, citrinina, patulina, cido ciclopiaznico, citreoviridina, penitremo A, toxina PR y roquefortina y el cido secalnico. De stas la ocratoxina A es sin duda la ms importante, es un carcingeno renal y es producida por P. citrinum, P. viridicatum, P. verrucosum. La principal fuente de esta toxina es el pan de centeno o
trigo, o a travs de cerdos alimentados con estos cereales cuya carne es posteriormente consumida por humanos. Se recomienda consultar la bibliografa para conocer otros gneros de mohos con importancia en los alimentos. Levaduras y hongos levaduriformes. El trmino levadura se refiere a aquellos hongos que generalmente no son filamentosos, sino unicelulares y de forma ovoide o esferoide, y que se reproducen por gemacin o por fisin. Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benficas o perjudiciales. Las levaduras se utilizan en la elaboracin de alimentos como el pan, la cerveza, vinos, vinagre y quesos, tambin se utilizan en la obtencin de enzimas y alimentos fermentados. Las levaduras son perjudiciales cuando producen la alteracin del sauerkraut, de los zumos de frutas, de los jarabes, de la melaza, de la miel, de las carnes, del vino, de la cerveza y de otros alimentos. Los caracteres morfolgicos de las levaduras se determinan mediante su observacin microscpica. Su forma puede ser desde esfrica a ovoide, alimonada, piriforme, cilndrica, triangular e incluso alargada. La mayora se reproducen asexualmente por gemacin multicelular o por gemacin polar. Unas pocas especies se reproducen por fisin. En los cultivos en placas de agar es difcil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas; la observacin microscpica de los microorganismos es la nica forma segura de diferenciarlas. La mayora de las colonias jvenes de levaduras son hmedas y algo mucosas; la mayora de las colonias son blancuzcas, aunque algunas tienen un color crema o rosado. Son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metablica es a la vez de ambos tipos. La mayora de las levaduras crecen mejor con un alto contenido de humedad. No obstante, crecen mejor que la mayora de las bacterias en sustratos que contienen elevadas concentraciones de solutos (por ejemplo carbohidratos o cloruro de sodio), es decir son osmotolerantes. Sin embargo la mayora de las levaduras necesitan mayor humedad que los mohos. Para la mayora de las levaduras la Aw mnima de crecimiento oscila entre 0.88 y 0.94. El intervalo de temperaturas de crecimiento es parecido al de los mohos, con una temperatura ptima en torno a los 25 a 30 y una temperatura C mxima en torno a los 35 a 47 Crecen mejor en aerobiosis, aunque las especies de C. tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. Los azcares son la fuente energtica ms apropiada para las levaduras, aunque las oxidativas, pueden oxidar los cidos orgnicos y el alcohol.
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Algunos gneros de importancia en alimentos son: Schizosaccharomyces. Levaduras de este gnero se han encontrado en frutas tropicales, en la melaza y en la miel. Saccharomyces. La especie S. cerevisiae se emplea en muchas industrias alimentarias, como en la fermentacin del pan, fermentacin de la cerveza, fermentacin de los vinos, en la produccin de alcohol, glicerol e invertasa. Kluyveromyces. K. marxianus (antes Saccharomyces fragilis) se utiliza en la obtencin de productos lcteos por su capacidad de fermentar la lactosa. Zygosaccharomyces. Las levaduras de este gnero son importantes por su capacidad para crecer en medios con elevadas concentraciones de azcar (osmfilas), intervienen en la alteracin de la miel, jarabes y melazas, y tambin en la fermentacin de la salsa de soya y de algunos vinos. Pichia. Crecen en la superficie de los lquidos formando una pelcula. P. membranafaciens produce una pelcula en la superficie de las cervezas y vinos. Debaromyces. Forman pelcula en la superficie de las salmueras. D. kloeckeri crece en la superficie de los quesos y de los embutidos. Hanseniaspora. Estas levaduras tienen forma de limn y crecen en los zumos de frutas. Torulopsis. Originan problemas en las fbricas de cervezas. T. sphaerica fermenta la lactosa, alterando productos lcteos. Otras especies alteran la leche condensada azucarada, los concentrados de zumos de frutas y los alimentos cidos. Candida. La especie C. utilis se cultiva para la obtencin de protena unicelular para incorporarla tanto a alimentos destinados al consumo humano como a piensos. La especie C. krusei se utiliza junto con los cultivos iniciadores de productos lcteos. C. lipolytica produce alteracin de la mantequilla y margarina. Brettanomyces. Producen grandes cantidades de cido e intervienen en la fermentacin de la cerveza belga de tipo lambic, de las cervezas inglesas y de los vinos franceses. Trichosporon. Estas levaduras crecen mejor a temperaturas bajas, encontrndose en las fbricas cerveza y en la superficie de vacuno refrigerada. Rhodotorula. Estas levaduras de color rojo, rosa o amarillo, pueden producir manchas en la superficie de los alimentos como en la superficie de las carnes, o zonas de color rosado en el sauerkraut.
FUNDAMENTO El mtodo se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo selectivo especfico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como nutrientes a los polisacridos que contiene el medio. La hidrlisis de estos compuestos se efecta por enzimas que poseen estos microorganismos. La sobrevivencia de los hongos y levaduras a pH cidos se pone de manifiesto al inocularlos en el medio de cultivo acidificado a un pH de 3.5. As mismo, la acidificacin permite la eliminacin de la mayora de las bacterias. Finalmente, las condiciones de aerobiosis y la incubacin a una temperatura de 25 1 C da como resultado el crecimiento de colonias caractersticas para este tipo de microorganismos. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%, estril a. 3 tubos de 16 x 150 mm, conteniendo 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%, estriles con tapn de algodn a. 4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosaa . 4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar extracto de malta a. NOTA La Norma Oficial Mexicana utiliza nicamente el agar papa dextrosa para la deteccin y cuantificacin de estos grupos de microorganismos. Sin embargo se sugiere para la cuantificacin de las levaduras, la utilizacin del agar extracto de malta acidificado ya que es un medio ms rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo microbiano. SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, conteniendo 90.0 mL de solucin
Solucin colorante de lactofenol azul de algodn b. Colorantes para tincin de Gram b. Solucin estril de cido tartrico al 10.0 % a.
MATERIAL Y EQUIPO
Vaso de licuadora estril o bolsa para Stomachera. Motor para licuadora o Stomachera. Pipetas graduadas estriles de 1 mL con tapn de algodn a.
Pipetas graduadas estriles de 10 mL con tapn de algodn a. Pipetas Pasteur estriles a, b Propipetaa, b Cajas de Petri estriles (una se utiliza para pesar la muestra) a. Utensilios estriles para la manipulacin de muestras: cuchillos, cucharas, tenedores, etc. a Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 251 a. C Bao de agua con control de temperatura y circulacin mecnica mantenida a 451 a. C Portaobjetos, cubreobjetos, diurex b. Microscopio ptico b. Asa bacteriolgica y asa micolgicab. Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador b.
NOTAS
a b
Material necesario para el inicio de la prctica. Material necesario para los 3, 4 y/o 5 das despus de iniciada la prctica.
DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

1.0 mL 1.0 mL
Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 ml de solucin diluyente
1.0 mL
Pesar 10 g de muestra en condiciones de asepsia
Homogenizar con 90 .0 mL de solucin
10-1
10-2
10-3
10-4
Adicionar de 15 a 20 mL de agar papa dextrosa y/ agar extracto de malta acidificados con 0.3 mL cido tartrico 10 % enfriado a 45 en cada placa C
Depositar por duplicado 1.0 mL de cada dilucin en cajas de Petri estriles
Homogeneizar la muestra con el agar mediante movimientos rotatorios
Incubar las cajas en posicin invertida
3,4 5 das / 28 C Versin para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Qumica, UNAM
Contar aquellas placas que tengan entre 10 a 150 colonias de hongos y/o levaduras y reportar por separado como UFC/g o mL de muestra, indicando tiempo de incubacin
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PROCEDIMIENTO 1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estril y pasarla a un matraz Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de una solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%. 2. Homogeneizar la muestra con la solucin anterior en un vaso de licuadora estril o pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0 seg en el caso de la licuadora a velocidad mnima, 30.0 seg en el Stomacher a una velocidad normal. Esta es la dilucin primaria. 3. De la suspensin o solucin anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de ensayo que contenga 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2, agitar y repetir esta operacin tantas veces como diluciones sean necesarias. Se debe utilizar una pipeta estril para cada dilucin. NOTA Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o de un fragmento de hifa o de un cmulo de hifas. Debido a esto, el nmero de UFC/mL puede variar dependiendo de las condiciones de homogeneizacin de la muestra (a mayor tiempo de homogeneizacin mayor ser la ruptura de las hifas y por lo tanto se aumentaran las UFC / mL), por lo que se debe poner especial cuidado en esta etapa. Los tiempos de homogeneizacin citados en esta metodologa son los recomendados en la Norma Oficial Mexicana para este grupo microbiano. 4. Colocar por duplicado en cajas Petri estriles, 1.0 mL de cada una de las diluciones de la muestra, utilizando una pipeta estril. 5. Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosa y/o de agar extracto de malta estriles. Enfriarlos y mantenerlos a 45 C. 6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL de agar, 1.4 mL de cido tartrico al 10% esterilizado por filtracin en membrana, o bien esterilizar la solucin a 121 C1 durante 15 minutos. C Esto significa que a cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a 45 se le deber adicionar 0.3 mL del cido, o colocarlas en C la caja de Petri teniendo precaucin de que no toque la muestra antes de agregar el medio de cultivo. 7. Despus de la acidificacin, utilizar un tubo de medio acidificado como testigo y medir el pH para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un potencimetro. 8. En cada caja de Petri con inculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y mantenidos a 45C. El tiempo transcurrido entre la preparacin de las diluciones y el momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min. 9. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrs hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo
cuidado de no humedecer con el medio la tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejndolas reposar sobre una superficie horizontal fra. 10. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verter en una caja de Petri sin inculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada y/o agar extracto de malta acidificado. Despus de la incubacin estas cajas no debern presentar desarrollo de colonias. 11. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 251C. 12. Contar las colonias de cada placa despus de 3, 4 y 5 das de incubacin. Despus de 5 das, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es difcil contar colonias bien aisladas, considerar la cuantificacin de 4 das de incubacin o incluso las de 3 das. En este caso, se informa el perodo de incubacin en los resultados de los anlisis. 13. Realizar una tincin hmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de algodn, para un examen microscpico y una posible identificacin de los mohos que se hayan desarrollado. 14. Realizar una tincin de Gram para la observacin microscpica de las levaduras obtenidas. 15. Contar las colonias de cada placa representativa, despus de 3, 4 y 5 das de incubacin (a 26 1C o a temperatura ambiente). 16. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilucin. 17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a 251C durante 5 das. 18. Describir las caractersticas macroscpicas y microscpicas observadas, de los mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada. 19. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es difcil contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 das de incubacin y an a los 3 das. En este caso se debe informar el periodo de incubacin de 3 4 das, en los resultados del anlisis. CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Para elaborar un informe de resultados se sugiere seguir las indicaciones que a continuacin se expresan: ANLISIS CUANTITATIVO Para hacer un reporte de la parte cuantitativa de este anlisis, se deben seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias (representatividad estadstica). Posteriormente, contar las colonias presentes y calcular el nmero de hongos y levaduras por separado. De esta manera se puede calcular las unidades formadoras de colonias por gramo o por mililitro dependiendo del estado fsico de la muestra analizada. Esto se logra
multiplicando el nmero de UFC encontradas en una caja representativa, por el inverso de la dilucin correspondiente a esa caja. En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos y/o levaduras, se debe reportar el nmero obtenido de UFC indicando la dilucin correspondiente. En el caso de no encontrar colonias caractersticas de hongos y/o levaduras, el resultado a reportar es: menos de 10 UFC/g bien menos de 10 UFC/mL (Sensibilidad del Mtodo) Para cualquiera de los casos citados se deber reportar el tiempo de incubacin en el que se realiz la cuantificacin. Para cualquiera de los casos citados se deber reportar por separado el resultado de la cuantificacin de hongos y de levaduras. Reportar las observaciones macroscpicas y microscpicas de los diferentes tipos de colonias de mohos y levaduras obtenidas durante el anlisis. Si es posible reportar el o los gneros probables. BIBLIOGRAFA. Norma Oficial Mexicana. NOM-111-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. Frazier W. & Westhoff D. (1994) Microbiologa de los Alimentos. 4. ed. Acribia, Espaa. 23-50. Beuchat L.R. & Cousin M.A. (2001) Yeasts and Molds. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 209-215. Pierson M. & Smoot L. (2001) Indicator Microorganisms and Microbiological Criteria. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 71-87. Hocking A. (2001) Toxigenic Aspergillus Species. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 451-465. Pitt J. (2001) Toxigenic Penicillium Species. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 467-480. Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC.
International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005) Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

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Pesar 10 g de muestra en condiciones de asepsia

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Homogeneizar la muestra con el agar mediante movimientos rotatorios

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