Titulacin de Aminocidos Pgina 1

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS & MATEMTICAS

Bioqumica
LABORATORIO: TITULACION DE AMINOACIDOS Prof. Harry Alices-Villanueva, Ph.D.

Los aminocidos alfa son los bloques constituyentes de las protenas. Casi todas las protenas consisten de varias combinaciones de los mismos 20 aminocidos. Los aminocidos son compuestos que contienen un grupo amino, NH2, y un grupo carboxilo, COOH. En adicin hay un grupo R que es diferente para cada aminocido. El smbolo R se utiliza aqu para representar una abreviatura generalizada para indicar un grupo orgnico.
NH2 | RCH | COOH

En sistemas fisiolgicos donde el pH es casi neutral, el grupo amino de un aminocido estar protonado y el grupo carboxilo estar ionizado.
NH3+ | RCH | COO-

Esto se conoce como la forma zwitterion del aminocido.

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En soluciones fuertemente cidas, el grupo carboxilo estar tambin protonado, mientras en soluciones muy bsicas ambos grupos, el carboxlico y el amino, estarn en forma no-protonada.
NH3+ | RCH | COOH cido NH2 | RCH | COOBsico

EL comportamiento cido-base de los aminocidos se describe mejor con la teora de Bronsted de cidos y bases. Un aminocido simple (que no tenga un grupo ionizable cido o bsico en el grupo R) es un cido bibsico en su forma totalmente protonada; puede donar dos protones durante su titulacin completa con una base. La titulacin con NaOH es una titulacin en dos pasos representada como:
+

NH3CHRCOOH + OHNH3CHRCOOH + OH-

NH3CHRCOO- + H2O

NH2CHRCOO- + H2O

La sal hidrocloruro de un aminocido simple contiene un mol de HCl por cada mol de aminocido tal que el mismo est totalmente protonado.
+

NH3CHRCOOH + Cl-

La curva de titulacin ser bifsica (vea diagrama abajo). Habr dos porciones separada o inflexiones en la curva de titulacin. El punto medio de la primera inflexin (B) es donde el aminocido est mitad en forma cida y mitad en forma zwitterion. EL punto de inflexin C ocurre cuando todo el aminocido original ya est en forma de zwitterion. El pH al cual esto ocurre se denomina el pH isoelctrico (punto isolelctrico) y se le da el smbolo pI (asumiendo que el grupo R no tiene carga). En la titulacin de pH de un aminocido con un grupo no ionizable R, el punto de equivalencia ocurre en el pI del aminocido. En el punto medio de la segunda inflexin (D), la mitad del aminocido est en forma de zwitterion y la otra mitad est en forma bsica.

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A: 100% +NH3CHRCOOH B: 50% +NH3CHRCOOH y 50% +NH3CHRCOOC: 100% +NH3CHRCOOD: 50% +NH3CHRCOO- y 50% NH2CHRCOOH E: 100% NH2CHRCOOLos valores aparentes de pK par alas dos etapas de disociacin pueden ser extrapolados de los puntos medio de cada inflexin. Esto se puede demostrar con la ecuacin de Henderson-Hasselbach:

pH = pK a + log

[anin] [cido]

El pKcido (el pK del grupo carboxlico) es el punto (B) donde la mitad del grupo cido ha sido titulado. En este punto la ecuacin se vuelve:

pH = pKa
Del mismo modo, el punto (D) nos da el valor del pKamino. En este experimento, usted titular una muestra de un aminocido desconocido y determinar su pI, pKcido, y el pKamino y comparar estos valores con los valores reales (tericos).

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Buretas de 50 mL Barras magnticas Agitador magntico Medidor de pH con su electrodo Bulbo de pipeta
SOLUCIONES

Tres beakers de 150 mL Tres beakers de 100 mL Pipeta de 25 mL Pipeta de 10 mL Kimwipes

Solucin de NaOH, 0.3 M Solucin de la sal de cloruro de un aminocido A, 0.1 M Solucin de la sal de cloruro de un aminocido B, 0.1 M Soluciones amortiguadoras (buffers) para calibrar los medidores de pH.
PROCEDIMIENTO

Usted habr de titular una sola de las soluciones de aminocidos, A o B, tres veces. Titulacin de la solucin del aminocido 1. Mantenga el electrodo de pH en agua destilada mientras prepara la solucin de aminocido y monta la bureta. 2. Enjuague bien la bureta con dH2O. Repita. 3. Obtenga aproximadamente 100 mL de la solucin de NaOH. Anote la concentracin. Enjuague y entonces llene la bureta (hasta la marca graduada en el nivel superior) con la solucin de NaOH. Remueve cualquier burbuja de aire que pueda estar presente, especialmente en la punta de la bureta. Anote el volumen con qu va a comenzar. 4. Obtenga aproximadamente 35 mL de una de las soluciones de aminocido; anote la letra que la identifica. Enjuague la pipeta de 10 mL con dH2O y luego con dos pequeas porciones de su solucin de aminocido. Pipetee 10 mL de su solucin de aminocido a un beaker limpio de 100 mL. Aada 25 mL de dH2O (para un volumen total en su beaker de 35 mL. 5. Calibre su medidor de pH. EL medidor permanecer calibrado mientras no se apage.

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6. Coloque una barra magntica en el beaker con el electrodo. Ajuste el electrodo para que no tropiece con la barra magntica. Si el electrodo no est debidamente sumergido, las lecturas de pH sern errticas. 7. Titule la solucin de aminocido con el NaOH en la bureta. Esta corrida se hace aadiendo NaOH a intervalos de ~1.0 mL hasta que pase el primer punto de equivalencia; es decir, se mantendr aadiendo incrementos de 1.0 mL hasta que el pH suba abruptamente (el punto C en la grfica). Anote toda esta data en la tabla al final de este trabajo, Note que usted puede fcilmente calcular el volumen de NaOH requerido para llegar al segundo punto terico de equivalencia con solo duplicar el volumen que tom llegar al primer punto. 8. Llene nuevamente la bureta con NaOH. Tome otro beaker limpio y seco de 150 mL y pipetee 10 mL de su solucin de aminocido al beaker. Aada 25 mL de dH2O. Titule la solucin de aminocido nuevamente (Tabla de datos Titulacin 1 ); esta vez use intervalos de 0.5 mL justo hasta antes de llegar a cada punto de equivalencia y luego gota a gota hasta llegar a cada punto. Esta ser la data real para construir su grfica. Contine hasta que se hayan aadido 2.5 equivalentes de NaOH o el pH lea 12.5. 9. Vuelva a llenar la bureta y repita el proceso de titulacin (Tabla de data Titulacin 2) con una nueva solucin de su aminocido.
DISPOSICION DE DESPERDICIOS

Las soluciones deben estar a un pH entre 5 y 12 antes de ser descartadas. Se puede bajar el pH aadiendo HCl o subirlo con peuqeas porciones de bicarbonato de sodio.
TABLAS DE DATOS

Concentracin de la solucin de NaOH _________ Aminocido (letra) _____ Primera Titulacin (alicuotas de 1 mL) mL de NaOH aadidos pH

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Por supuesto que la tabla tendr ms filas, al menos 12. Primer punto de equivalencia _____ mL Segundo punto de equivalencia ______ mL (esto tal vez sea mejor calcularlo que medirlo)

Titulacin 1 mL NaOH aadidos

pH

Titulacin 2 mL NaOH aadidos

pH

(De nuevo, va a necesitar ms filas).

INFORME DE LABORATORIO

1. Escriba un objetivo de dos oraciones para este experimento. 2. Los aminocidos A y B utilizados en este laboratorio estn incluidos en la lista siguiente: glicina, cido asprtico, cido glutmico, lisina). Vea la estructura en su texto. Identifique el grupo R y dibuje la formula estructural (cida, bsica y zwitterinica) mientras la titulacin procede. Note que algunos aminocidos tendrn tres formas y otros cuatro. 3. Explique si pueden coexistir el grupo amino y el grupo carboxilo sin carga al mismo pH. 4. Prepare una grfica con sus resultados, graficando mL de NaOH versus pH. Construya cada grfica en papeles separados; recomiendo usar Excel para esto. Recuerde rotular los ejes y dle un ttulo apropiado a su grfica. 5. A partir de la curva de titulacin, determine los puntos de inflexin, pI. Este es el punto en donde 1.0 equivalentes de base han sido aadidos. En este experimento usted usar 10 mL de NaOH 0.1 M
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0 1.0 milimoles del aminocido (totalmente protonado). Como se dijo en la introduccin, la forma totalmente protonada del aminocido puede donar dos protones durante la titulacin. Tomar entonces un equivalente (1.0 milimoles) de base para titular el primer protn en el grupo cido y otro equivalente para titular el protn del grupo amino. Localice el pI y mrquelo en la grfica. 6. Como el pKcido es el punto medio de la primera inflexin, puede hallar el pKcido a 0.5 equivalentes de base. As mismo, el pKamino se puede hallar a 1.5 equivalentes de base. Rotule estos puntos en su grfica. 7. Calcule un promedio de los valores de pKcdio de las ltimas dos grficas. 8. Calcule un promedio de los valores de pKamino de las ltimas dos grficas (si posible). 9. Promedio los valores de pI de las ltimas dos grficas. 10. Si posible, calcule el pI hallando el promedio entre el pKcido promedio y el pKamino promedio. Este es un mejor mtodo para hallar el pI del aminocido. Compare los nmeros obtenidos en el paso 9 con el de este paso 10. Identifique su aminocido de los mencionados en la lista: glicina, asprtico, glutmico o lisina. Compare con los valores reales del pI y calcule un porcentaje de error. Comente sobre la efectividad de este mtodo para identificare aminocidos; especficamente, si no hubiera tenido una lista de donde escoger, sera capaz de diferenciar entre los veinte aminocidos? Si no pudo determinar el valor de pKamino, mencione alguna razn.

11.

12.

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Los 20 Aminocidos Standard

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