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Metodos de Enumeracion

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Métodos de enumeración viables

BIOL4029 Dr. Héctor L. Ayala del Río

Determinar la densidad de procariotas en una muestra desconocida

1

Enumeración viable
• Principio: crecimiento como indicador de densidad
– Separación de microorganismos en unidades independientes – Probabilistico

• Medio de Cultivo (sólido o líquido) • Estrategias principales
– Crecimiento y enumeración en platos – El número mas probable (NMP o MPN)

Separación: Diluciones en serie
• Base de todos los métodos • Solución salina -- evitar choque osmótica • Aspectos técnicos
– – – – – Procedimientos asépticos Cambiar pipetas / dilución Pipetas TD/TC Mezclar cada tubo Factor de 10 a diferentes escalas – Rango amplio

2

Como medimos 0.1 ml

Crecimiento y enumeración en platos
• Crecimiento sobre o dentro del agar • Asumpción básica: cada colonia surge de un solo microorganismo. • Límites de conteo: 30-300 colonias/plato • Medida: Unidades Formadoras de Colonia (ufc)/unidad de materia

3

Spread Plate (Plato disperso)

Pour Plate (Plato vertido)

4

Pour plate

Filtración en membrana

5

6

Dilución en agar

Rolling chips

muestra

“boilling chips” estériles

Rotar placa

Remover asépticamente los “boiling chips”

invertir placa

7

Ventajas/Desventajas
• Ventajas
– Sencillos – Estima células viables – Sensitividad – Medio selectivo

• Desventajas
– 1 col -> célula – Sobrevivencia – Patrón de crecimiento – Laboriosos – Selectividad medio de cultivo

El número mas probable (MPN)
• Atributos fisiológicos • Método basado en probabilidad que requiere:
– diluciones – replicación de inoculo – criterio positivos / negativos

• Crecimiento en medio líquido • Mas laborioso

8

Factores importantes
• Número de diluciones • Número de replicas • Tamaño del inoculo

MPN en agar
10-1 10-2

10-4

10-3

9

MPN en agar
10-1 10-2

10-4

10-3

• Anotar # de colonias que crecieron y las que no

Como leer los resultados de el Número más probable (MPN)
• • • • • Determinar el numero de tubos positivos Codificar numéricamente Identificar diluciones con menos de 5 pero > 0 Buscar # en la tabla de MPN Calcular densidad utilizando correcciones
Dilución
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9

Replica

1 2 3 4 5

5

5

5

5

5

5

2

1

0

10

Estimados de densidad utilizando MPN
1. Leer número de la tabla: 69,148 2. Identificar factor de dilución en el que comenzamos a contar: 10-3 3. Volumen del inóculo usado / replica: 0.1 ml
1. Factor de dilución 1/0.1 = 1/10

4. Calculo:
1. 69,148 x 103 x 10 = 6.9 x 108

11

Ventajas / Desventajas
• Ventajas
– Medio liquido – Selectivo / Diferencial – Atributos fisiológicos

• Desventajas
– Aproximado – ¿Que es un positivo? – Tiempo y material si no es miniaturizado

Resumen Factores que afectan la enumeración viable
• • • • • • Tamaño del inoculo Condiciones de cultivo (medio temperatura) Tiempo de incubación Tamaño de las colonias Diluciones Patrón de crecimiento del organismo

12

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