Métodos de enumeración

viables
BIOL4029
Dr. Héctor L. Ayala del Río

Determinar la densidad de procariotas

en una muestra desconocida

1
 Enumeración viable
• Principio: crecimiento como indicador
de densidad
– Separación de microorganismos en
unidades independientes
– Probabilistico
• Medio de Cultivo (sólido o líquido)
• Estrategias principales
– Crecimiento y enumeración en platos
– El número mas probable (NMP o MPN)

Separación: Diluciones en serie

• Base de todos los
métodos
• Solución salina -- evitar
choque osmótica
• Aspectos técnicos
– Procedimientos asépticos
– Cambiar pipetas / dilución
– Pipetas TD/TC
– Mezclar cada tubo
– Factor de 10 a diferentes
escalas
– Rango amplio

2
 Como medimos 0.1 ml

Crecimiento y enumeración en
platos
• Crecimiento sobre o dentro del agar
• Asumpción básica: cada colonia surge
de un solo microorganismo.
• Límites de conteo: 30-300
colonias/plato
• Medida: Unidades Formadoras de
Colonia (ufc)/unidad de materia

3
Spread Plate (Plato disperso)

Pour Plate (Plato vertido)

4
 Pour plate

Filtración en membrana

5
6
 Dilución en agar

Rolling chips

“boilling
muestra chips” estériles

Remover
asépticamente los invertir
Rotar placa placa
“boiling chips”

7
 Ventajas/Desventajas

• Ventajas • Desventajas
– Sencillos – 1 col -> célula
– Estima células – Sobrevivencia
viables – Patrón de
– Sensitividad crecimiento
– Medio selectivo – Laboriosos
– Selectividad medio
de cultivo

El número mas probable

(MPN)
• Atributos fisiológicos
• Método basado en probabilidad que
requiere:
– diluciones
– replicación de inoculo
– criterio positivos / negativos
• Crecimiento en medio líquido
• Mas laborioso

8
 Factores importantes

• Número de diluciones
• Número de replicas
• Tamaño del inoculo

MPN en agar
10-1
10-2

10-3
10-4

9
 MPN en agar
10-1
10-2

10-3
10-4

• Anotar # de colonias que crecieron y las

que no

Como leer los resultados de el

Número más probable (MPN)
• Determinar el numero de tubos positivos
• Codificar numéricamente
• Identificar diluciones con menos de 5 pero > 0
• Buscar # en la tabla de MPN
• Calcular densidad utilizando correcciones
Dilución
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9
Replica

1
2
3
4
5

5 5 5 5 5 5 2 1 0

10
 Estimados de densidad
utilizando MPN
1. Leer número de la tabla: 69,148
2. Identificar factor de dilución en el que
comenzamos a contar: 10-3
3. Volumen del inóculo usado / replica:
0.1 ml
1. Factor de dilución 1/0.1 = 1/10
4. Calculo:
1. 69,148 x 103 x 10 = 6.9 x 108

11
 Ventajas / Desventajas

• Ventajas • Desventajas
– Medio liquido – Aproximado
– Selectivo / – ¿Que es un positivo?
Diferencial – Tiempo y material si
– Atributos fisiológicos no es miniaturizado

Resumen
Factores que afectan la
enumeración viable
• Tamaño del inoculo
• Condiciones de cultivo (medio temperatura)
• Tiempo de incubación
• Tamaño de las colonias
• Diluciones
• Patrón de crecimiento del organismo

12