Programa de consulta al experto.

Coordinadora: Dra Graciela Len de Gonzlez SEROLOGA DE GRUPOS SANGUNEOS: GEL-CENTRIfUGACIN y LAS TCNICAS EN TUbO
PROFESOR INVITADO: Dr Alisson Dos Santos - Consultor de Inmunohematologa Belo Horizonte MG Brasil jalisson@uol.com.br
1. Introduccin:
La medicina transfusional, as como, las terapias celulares, los trasplantes de rganos, empiezan a definir la compatibilidad principalmente en bases funcionales, es decir a la base del resultado de una respuesta inmune. Las interacciones inmunes capaces de inducir una respuesta inmune, ocurren en un contexto biolgico complejo y dinmico donde la estructura no predice necesariamente la funcin. Con base en esta premisa, grupos de importantes profesionales en el mundo estudian las interacciones y respuestas inmunes en todos sus aspectos, as como las posibilidades de control de estas respuestas (inmunomodulacin). La comprensin de los mecanismos reguladores que determinan el reconocimiento apropiado de los antgenos de grupos sanguneos en los niveles celulares y humorales del sistema inmunolgico permitir que la inmunohematologa considere los aspectos funcionales adems de los estructurales, en la compatibilidad transfusional. Hoy da, la immunohematologa define la compatibilidad transfusional con base en las estructuras, es decir que la compatibilidad es dependiente de los componentes estructurales de las clulas, los anticuerpos y su interaccin. Las tcnicas serolgicas, actualmente disponibles, permiten determinar a un muy alto grado de resolucin la estructura de los antgenos celulares, de los anticuerpos, las interacciones entre clulas y las interacciones entre clulas y anticuerpos. En casos muy particulares se puede mismo utilizar herramientas de biologa molecular para determinacin de los genes productores de las protenas portadoras de antgenos de grupos sanguneos, as La aglutinacin de glbulos rojos en suspensiones fisiolgicas puede ocurrir por dos mecanismos bsicos: especfico y inespecfico. En inmunohematologa eritrocitaria, el fenmeno de aglutinacin de los glbulos rojos producido por la reaccin entre anticuerpos y antgenos de grupos sanguneos, constituye la base de casi todas las tcnicas aplicadas en la serologia de los grupos sanguneos. Si producimos ciertos cambios fsico-qumicos en suspensiones de partculas de coloides o de clulas como bacterias o glbulos rojos, estas suspensiones pierden la estabilidad y los coloides o clulas se aglutinan, formando grumos a los cuales llamamos aglutinados. Discutiremos en este trabajo el fenmeno de aglutinacin eritrocitaria, una vez que las tcnicas de serologa de grupos sanguneos se basan en este fenmeno y las tcnicas serolgicas ms utilizadas para el estudio de los grupos sanguneos y anticuerpos anti-eritrocitarios, o sea, las pruebas hechas en tubo y la tcnica de Gelcentrifugacin. como, posibles mutaciones genticas que llevaran a cambios estructurales de estos antgenos.

Aglutinacin especfica:
Sabemos que una suspensin de glbulos rojos en solucin salina fisiolgica (NaCl 0,85%) constituye un sistema estable, o sea, las clulas se mantienen a una cierta distancia unas de las otras. Esta estabilidad puede ser cambiada por la introduccin de anticuerpos especficos que se fijarn en antgenos de membrana eritrocitaria, produciendo la aglutinacin de estas clulas.

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De acuerdo con la teora de los puentes, las molculas de anticuerpos son capaces de fijarse sobre sitios antignicos de clulas adyacentes formando puentes entre ellas. La aglutinacin sera observable, tan luego la red as constituida, tenga una dimensin importante. veremos que esta concepcin resulta de una simple analoga con los fenmenos de precipitacin. La teora de los puentes es un modelo simplista del fenmeno de aglutinacin de glbulos rojos en suspensin y no permite comprender los ejemplos de aglutinaciones inespecficas, o sea, en la ausencia de anticuerpos.

2-Procesos fsico-qumicos de la aglutinacin (Potencial Zeta):

Para la comprensin de los fenmenos de hemoaglutinacin especfica y no especfica, necesitamos de un modelo ms complejo, con base en procesos fsico-qumicos, donde el factor ms importante a ser considerado es la distancia media que separa los glbulos en suspensin. Esta distancia puede ser disminuida por la adicin de anticuerpos u otras substancias al medio, hasta un punto crtico en que la aglutinacin ocurre. Los glbulos rojos se comportan como partculas electronegativas en estudios de migracin electrofortica. Los grupos carboxlicos de las sialo-glucoprotenas de la membrana eritrocitaria son los mayores responsables por esta electronegatividad. En medio salino (NaCl al 0,85%), iones positivos de sodio (Na+) son atrados para cerca de los glbulos rojos, creando una doble camada de cargas positivas, que genera una fuerte repulsin interglobular. La nube de iones positivos que involucra cada glbulo, se vuelve menos densa mientras se aleja del glbulo. La diferencia de potencial elctrico creada entre la doble camada de iones positivos (Na+) cerca del glbulo y el medio con iones de sodio y cloruro en equilibrio (neutro), se llama Potencial Zeta. La fuerza de repulsin entre los glbulos rojos, en medio salino, depende del valor del potencial zeta.

Aglutinacin inespecfica:
Este fenmeno, llamado de panaglutinacin, corresponde a la aglutinacin de glbulos rojos normales (no sensibilizados por anticuerpos) por substancias presentes en el medio de la suspensin, como: detergentes, slice coloidal, iones metlicos y macromolculas (albmina, polibreno, ficol, dextran). Algunas lectinas (fito-aglutininas) (anti-A1, anti-H) son capaces de reaccionar contra receptores presentes en los glbulos rojos humanos, produciendo un fenmeno que se acerca mucho de la aglutinacin por anticuerpos.

Considerando la carga elctrica del glbulo rojo , la fuerza inica del medio de la suspensin ( ) y la constante dielctrica del medio , Pollack desarroll la siguiente expresin del potencial zeta (Z): Z = f , o sea, la diferencia del potencial zeta es una funcin que varia directamente con la electronegatividad de la membrana eritrocitaria ( ) e inversamente con la constante dielctrica del medio de suspensin (D) y con la raz cuadrada de su fuerza inica ( ).

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Desde el punto de vista fsico-qumico, la aglutinacin ocurre por la agregacin de los glbulos rojos (aglutinados), cuando la distancia media entre ellos se reduce hasta un valor mnimo. Esta distancia depende de los valores de dos fuerzas antagnicas: la tensin interfacial (fuerza de cohesin), que tiende a agregar los glbulos rojos y la fuerza de repulsin, debida a los escudos de cargas positivas creados alrededor de los glbulos (cargas iguales se repelen). En la ausencia de agentes aglutinantes, la fuerza de repulsin predomina y mantienen la suspensin globular estable en medio salino.

La nocin de Potencial Zeta Crtico (Zc) definida por Abramson, muestra que para valores elevados del potencial Zeta (en valores absolutos), los glbulos rojos no se aglutinan, incluso en la presencia de anticuerpos especficos. Disminuyndose lentamente el potencial Zeta del sistema, se constata que la aglutinacin ocurre en un valor determinado, que denominamos el Potencial Zeta Crtico. El potencial Zeta de un sistema puede ser cambiado de dos maneras: Por la reduccin de la carga elctrica de la

membrana eritrocitaria: Incluimos en esta categora, los efectos debidos al tratamiento de los glbulos rojos con enzimas proteolticas, que sacan fragmentos de glucoprotenas de la membrana, reduciendo su electronegatividad y al efecto de la fijacin de anticuerpos sobre la membrana eritrocitaria. Cambios en la composicin del medio: Los efectos debidos a los cambios de la fuerza inica y de la constante dielctrica del sistema. La aglutinabilidad de un sistema es ms alta mientras ms bajo sea el valor del potencial

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anti-RhD, se observa que los glbulos rojos tienden a aglutinarse espontneamente, al alcanzar el potencial Zeta crtico (Zc) alrededor de -7 mV. Este valor para el potencial zeta crtico, donde ocurre una aglutinacin inespecfica de los glbulos roZeta. Pollack as relacion los trminos de su ecuacin: Esta ecuacin nos muestra que el potencial Zeta puede bajar y aumentar la aglutinabilidad del sistema, o hasta puede promover la aglutinacin de los glbulos rojos en suspensin, si el potencial zeta crtico (Zc) es alcanzado, en tres condiciones: Podemos rehacer los mismos ajustes anteriores, con la presencia de anticuerpos anti-RhD de las clases IgG y IgM. Suspensiones de glbulos rojos RhD positivos fueron tratadas con anticuerpos anti-RhD de las clases IgG y IgM y, despus fragmentos de glucoprotenas de la membrana, reduciendo su electronegatividad y al efecto de la fijacin de anticuerpos sobre Las condiciones mencionadas son los principales parmetros utilizados para comprender las reacciones de aglutinacin y los mtodos de produccin de aglutinaciones artificiales utilizados en los laboratorios de inmunohematologa. Como el potencial Zeta crtico (Zc) de la suspensin de glbulos rojos sensibilizados por anticuerpos anti-RhD (IgM) es superior en valor absoluto al de la propia suspensin en NaCl al 0,85%, estos anticuerpos son llamados aglutinantes. Al contrario, el potencial Zeta crtico (Zc) en la presencia de anticuerpos anti-RhD de clase IgG, que es inferior al de la suspensin en NaCl 0,85%, no ocurre aglutinacin de los glbulos rojos y estos anticuerpos son dichos no aglutinantes. La ventaja de las molculas de IgM sobre las de IgG est ligada a su peso molecular y a su estructura pentamrica mejor adaptada a la funcin aglutinante. la membrana eritrocitaria. jos, no varia con diferentes suspensiones celulares y, debido a esto, permite avaluar el valor de la tensin interfacial (fuerza de cohesin) entre glbulos rojos en suspensin salina (NaCl al 0,85%).

si la carga elctrica del glbulo rojo ( ) disminuye. si la constante dielctrica (D) del sistema aumenta. si la fuerza inica del medio () aumenta.

4-Influencia de los antgenos en la aglutinacin de los glbulos rojos: 3-El potencial zeta crtico (Zc) y las clases de anticuerpos:
Pollack explic en bases fsico-qumicas las diferencias de comportamiento de los anticuerpos de clase IgG y de clase IgM en la aglutinacin de los glbulos rojos, cuando reaccionan con antgenos de grupos sanguneos. Se estima en -15 mV (mV= mili-volts), el potencial zeta de una suspensin de glbulos rojos RhD positivos en NaCl al 0,85%. Por el ajuste de la fuerza inica () y/o de la constante dielctrica (D) del medio de la suspensin, se puede hacer variar el valor del potencial Zeta del sistema y en ausencia de anticuerpos
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La aglutinacin de los glbulos rojos, en una suspensin, no est relacionada simplemente con las clases de los anticuerpos,

sino tambin con el nmero y ubicacin de los antgenos. Anticuerpos anti-A de clase IgM, por ejemplo, aglutinan glbulos rojos A1 o A2 en suspensin de NaCl al 0,85%, pero no aglutinan glbulos Am. De la misma manera, anticuerpos antiRhD, de clase IgG, no aglutinan glbulos RhD positivos en suspensin de NaCl al 0,85%, pero aglutinan glbulos del fenotipo D--/D-- (variante rara del sistema Rh). El nmero de antgenos es responsable por las diferencias de comportamientos de los anticuerpos anti-A y anti-RhD en presencia de glbulos rojos Am y D--/D--, respectivamente. Los glbulos Am poseen un nmero de sitios antignicos A alrededor de 1.000 receptores por membrana, mientras que los glbulos A1 poseen alrededor de 1.000.000. Los fenotipos RhD ms comunes poseen entre 10.000 hasta 30.000 sitios por membrana, mientras que el fenotipo D--/D-- posee alrededor de 100.000. Existe una relacin clara entre aglutinabilidad de los glbulos rojos y el nmero de sitios antignicos presentes en la membrana. Existe un nmero crtico de antgenos para producir la aglutinacin, cuyo valor depende del sistema de grupos sanguneos estudiado y de las condiciones experimentales. En el sistema ABO, el nmero crtico de antgenos A es alrededor de 2 hasta 3.000 receptores por clula, lo que explica el hecho de no producirse aglutinaciones directas con los glbulos Am. La ubicacin de los antgenos en la membrana del glbulo rojo es otro factor importante en la reaccin de aglutinacin. Los antgenos pueden estar total o parcialmente involucrados (cripto-antgenos) e inaccesibles a los anticuerpos. El ejemplo ms conocido es el antgeno T que, normalmente, no es reactivo en glbulos ntegros, pero que despus de la accin de enzimas proteolticas bacterianas (pacientes con septicemia), quedan accesibles y poliaglutinables, una vez que los sueros humanos contienen auto-anticuerpos anti-T.

Los anticuerpos dichos no aglutinantes se fijan sobre las membranas de los glbulos rojos sin producir aglutinacin. Por esto, la visualizacin de las reacciones de estos anticuerpos con sus respectivos antgenos, depende de artificios tcnicos para produccin de aglutinacin. En inmunohematologa, estas tcnicas son esenciales en la deteccin e identificacin de alo-anticuerpos anti-eritrocitarios, en el fenotipaje del glbulo rojo, en el diagnstico de las anemias hemolticas auto-inmunes (AHAI) y en el diagnstico de las enfermedades hemolticas del recin-nacido (EHRN). Discutiremos las tcnicas ms importantes bajo la ecuacin de Pollack para el potencial zeta:

Tratamiento de los glbulos rojos por enzimas proteolticas:

La tripsina, la papana, la bromelina y la ficina son las principales enzimas proteolticas utilizadas en las tcnicas enzimticas de aglutinacin artificial. Estas enzimas son capaces de sacar de la membrana eritrocitaria, fragmentos peptdicos de glucoprotenas de membrana conteniendo molculas de cido silico (electronegativas), disminuyendo la carga negativa de los glbulos rojos. Como consecuencia de la disminucin de la electronegatividad de los glbulos, los escudos de iones positivos (Na+), atrados para cerca de las membranas eritrocitarias disminuyen y el valor de la diferencia de potencial elctrico (potencial zeta) entre estos escudos y el medio de suspensin en equilibrio (neutro), tambin disminuye. Para valores ms bajos del potencial zeta, las suspensiones de glbulos se quedan ms aglutinables. Esto est de acuerdo con el modelo electrosttico de Pollack, donde

5- Tcnicas de produccin artificial de la aglutinacin de glbulos rojos:

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el potencial Zeta (Z) es directamente proporcional a la electronegatividad del glbulo rojo (). Como ejemplo, glbulos rojos RhD positivos tratados por las enzimas proteolticas citadas, pueden ser aglutinadas, en medio salino, por anticuerpos anti-RhD de clase IgG (no aglutinantes). El cuadro arriba, muestra los efectos de la reduccin del potencial zeta, producidos por las enzimas proteolticas ms utilizadas en los laboratorios de inmunohematologa.

los glbulos rojos, aumenta su constante dielctrica (D). Estas molculas poseen una extremidad positiva (amnica) y otra negativa (carboxlica) y se polarizan en el campo elctrico de los glbulos rojos en suspensin. Una vez que son pesadas, son atradas para cerca de los glbulos neutralizando sus cargas negativas y promoviendo la dispersin de iones positivos (Na+) cerca de ellos. La disminucin de este escudo de cargas positivas, baja el valor del potencial zeta y disminuye la fuerza de repulsin interglobular. Esto est de acuerdo con la ecuacin de Pollack, donde el potencial Zeta (Z) es inversamente proporcional a la constante dielctrica (D) del medio de suspensin. La albmina (al 20 30%) y el polietilenoglicol (PEG) son los medios macromoleculares ms utilizados y su eficacia depende del contenido de polmeros.

Adicin de substancias macro-moleculares:

Pollack fue el primero en ofrecer un modelo fsico-qumico de la aglutinacin en medio macromolecular, o sea, del rol de la constante dielctrica (D) del medio de suspensin. Macromolculas hidrosolubles como albmina, PVP, dextran, ficol, PEG, etc, cuando aadidas al medio de suspensin de

Reacciones falsas-positivas pueden ser producidas por el propio medio macromolecular, cuando un exceso de polmeros aumenta la constante dielctrica (D) hasta un punto donde el potencial Zeta crtico (Zc) es alcanzado y el fenmeno de la

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aglutinacin ocurre espontneamente, an en la ausencia de anticuerpos (panaglutinacin). Las reacciones falsas-positivas pueden ser evidenciadas por la utilizacin de sueros-control producidos por el mismo fabricante y conteniendo el mismo medio macromolecular de los sueros de clasificacin sangunea. El uso de estos controles es obligatorio por las normas tcnicas vigentes.

de una serie de lavados de los glbulos rojos con salina (NaCl al 0,85%) que es un medio de fuerza inica normal. En la tcnica de Gel-centrifugacin, las reacciones de LISS/ Coombs no presentan la etapa de lavados de los glbulos rojos despus de la etapa de incubacin. En estos casos, la solucin de baja fuerza inica es cambiada (LISS mod.) por un pequeo aumento de su constante dielctrica (D), para compensar el efecto de la disminucin de la fuerza inica del medio de la suspensin () sobre el potencial zeta (Z). Observen que se puede trabajar en ms de una variante de la ecuacin del potencial zeta (Z) de Pollack.

Cambio de la fuerza inica del medio:

Una concentracin muy elevada de ciertos cationes (Cr3+, Al3+, Fe3+) puede producir una panaglutinacin de una suspensin de glbulos rojos no sensibilizados. Los cationes introducidos en el medio cambia poco la nube inica alrededor de los glbulos, una vez que la densidad de esta nube de cationes depende de la carga negativa de los glbulos. Sin embargo, la diferencia de potencial (potencial zeta) disminuye entre los escudos de cargas positivas alrededor de los glbulos rojos y el medio de suspensin que se queda ms inico por el exceso de cationes, resultando en una disminucin de la fuerza de repulsin interglobular. Esto est en acuerdo con la ecuacin de Pollack, donde un aumento de la fuerza inica () lleva a una disminucin del potencial Zeta de la suspensin de glbulos rojos en NaCl al 0,85%, lo que favorece la aparicin del fenmeno de aglutinacin. La fuerza inica desempea un rol importante en el equilibrio primario de la reaccin antgeno-anticuerpo, sendo su efecto manifestado bajo dos aspectos antagnicos. Si un aumento de lleva a un aumento de la aglutinabilidad (segn la ecuacin de Pollack), en la prctica, concentraciones inicas elevadas compiten con los anticuerpos e inhiben su fijacin inicial sobre los antgenos, llevando a un efecto inverso al deseado. Tcnicamente, en reacciones hechas en dos tiempos (LISS/Coombs), la etapa de sensibilizacin ocurre en medio isotnico de baja fuerza inica (LISS), aumentando la fijacin inicial de los anticuerpos sobre los antgenos de membrana correspondientes (ms alta sensibilidad de la reaccin), adems de reducir el tiempo de incubacin. La etapa de revelacin de los anticuerpos fijados sobre la membrana eritrocitaria, por la adicin de la antiglobulina humana (suero de Coombs), es ejecutada despus
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Prueba de la antiglobulina humana o prueba de Coombs:

La prueba de la antiglobulina humana o prueba de Coombs representa la tcnica ms importante de aglutinacin artificial en inmunohematologa. Por un procedimiento inmunolgico, esta reaccin nos permite revelar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en la membrana eritrocitaria. Decimos procedimiento inmunolgico, porque los sueros de Coombs son compuestos de anticuerpos contra anticuerpos humanos. Son producidos por la inyeccin de cadenas leves y pesadas de IgGs humanas en animales (conejos u ovejas), que producen anticuerpos contra las fracciones Fc de las inmunoglobulinas humanas. Estos anticuerpos pueden reconocer cualquier inmunoglobulina humana, por esto en la ejecucin de la prueba de Coombs es necesario lavar los glbulos rojos, despus de la etapa de sensibilizacin (incubacin) y antes de se aadir el suero de Coombs, con el propsito de se remover los anticuerpos libres. Los glbulos rojos quedan involucrados solamente con los anticuerpos que se ligaron especficamente con antgenos de membrana. En la tcnica de Gel-centrifugacin, la separacin de los anticuerpos libres de los fijados sobre antgenos de membrana, ocurre por un gradiente de centrifugacin. Cuando aadimos el suero de Coombs, los anticuerpos antiglobulinas humanas (AGH), se ligan en las fracciones Fc de los anticuerpos anti-eritrocitarios fijados en la membrana eritrocitaria. Considerando su estructura tridimensional, observamos que cada fraccin FC de un anticuerpo fijado en la membrana

moltica del Recin-Nacido (EHRN), de la Anemia Hemoltica Auto-Inmune (AHAI), de la hemlisis inducida por drogas y en el diagnstico de las reacciones hemolticas pos transfusionales. La prueba de Coombs indirecto (PCI) representa la reaccin-clave y de ms grandes posibilidades en inmunohematologa y nos permite ejecutar una serie de pruebas como: investigacin y identificacin de anticuerpos antieritrocitarios, pruebas de compatibilidad pre-transfusionales y determinacin de antgenos eritrocitarios que no pueden ser evidenciados por aglutinacin directa (ejemplos: variantes dbiles de RhD, antgenos Duffy, Kidd, Kell, etc). La sensibilidad de la prueba de Coombs indirecto (PCI) puede ser aumentada por procedimientos que cambian la primera etapa de la reaccin, o sea, de la fijacin de los anticuerpos durante la incubacin. Los ms utilizados eritrocitaria, puede reaccionar con diversas molculas de antiglobulinas humanas (AGH). De esta manera se queda ms grande y ms pesado. Como se puede observar en el grfico del experimento arriba, la capacidad de aglutinacin de los anticuerpos de la clase IgG ligados a la AGH es similar a de los de clase IgM que son naturalmente aglutinantes. Los sueros de Coombs pueden ser poliespecficos o monoespecficos. Los llamados poliespecficos contienen, adems de los anticuerpos contra fracciones Fc de las inmunoglobulinas humanas, anticuerpos contra la fraccin C3d del Complemento que puede estar presente sensibilizando la membrana eritrocitaria, en la presencia o ausencia de anticuerpos fijados. Los sueros monoespecficos contienen anticuerpos contra solamente un tipo de inmunoglobulina (IgG, IgM o IgA) o contra fracciones del Complemento (C3c o C3d). Los anticuerpos contra la fraccin C4 no deben estar presentes en los sueros poliespecficos, para evitarse reacciones cruzadas con antgenos del grupo sanguneo Chido/Rodgers (ISBT= 017- CH/RG). La prueba de Coombs puede ser realizada de dos maneras: Coombs directo e indirecto. Por la prueba de Coombs directo (PCD), demostramos glbulos rojos sensibilizados in vivo por anticuerpos y/o fracciones del complemento. Se usa en el diagnstico de la Enfermedad Heson: adicin de albmina al 22% (BSA) o polietilenoglicol (PEG) al medio, uso de medios de baja fuerza inica (LISS) y la utilizacin de glbulos rojos ya tratados por enzimas proteolticas. La adicin de albmina o polietilenoglicol (PEG) aumenta la constante dielctrica (D) del medio de suspensin y baja el valor del potencial zeta (Z), favoreciendo la aglutinacin de los glbulos rojos. Favorece tambin, la fijacin inicial de los anticuerpos a la membrana eritrocitaria por la disipacin de iones positivos cerca de la membrana, sin embargo este procedimiento es menos eficaz que la disminucin de la fuerza inica del medio. El uso de un medio isotnico de baja fuerza inica (LISS), en la etapa de sensibilizacin de los glbulos rojos, aumenta considerablemente la velocidad de fijacin y la cantidad de anticuerpos fijados sobre la membrana eritrocitaria. Este hecho nos permite aumentar la sensibilidad y disminuir el tiempo de incubacin de la prueba. El uso de glbulos rojos pre-tratados con enzimas proteolticas (tripsina o papana) en prueba de Coombs indirecto (PCI), es un procedimiento indicado para mejorar la deteccin de anticuerpos anti-Kidd.

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6- Otros factores que influencian la reaccin de aglutinacin de los glbulos rojos:

La temperatura de la reaccin y el pH del medio de suspensin, influencian la fijacin primaria de los anticuerpos sobre sus antgenos y sobre el fenmeno de aglutinacin, ya que los dos aspectos de la reaccin no son disociables. Como se ha discutido anteriormente, distinguimos dos temperaturas de reaccin: un primer grupo presenta reacciones ptimas en bajas temperaturas y un segundo grupo presenta reacciones ptimas en temperaturas ms elevadas.

Las pruebas serolgicas en tubo representaran un avance tcnico en relacin a las pruebas en lminas y placas de opalina. Adems, ampliaron la gama de pruebas realizadas en el laboratorio de inmunohematologa y siguen utilizndose hasta hoy da en la mayora de los laboratorios clnicos y bancos de sangre. Todava, la ejecucin de esta tcnica presenta aspectos bsicos de no estandarizacin y subjetividad que pueden comprometer la calidad de los resultados: Variacin de los volmenes de reactivos pipetados y de la con-

Los anticuerpos activos en temperaturas bajas (4oC), tambin llamados anticuerpos fros corresponden, principalmente, a las especificidades anti-I, -H, -A, -B, -AB, -Le, -M, -N e P1. Se trata, normalmente, de anticuerpos naturales regulares o irregulares. Los anticuerpos dichos inmunes reaccionan mejor en 37oC y son, tambin, llamados anticuerpos calientes. Este es el caso, por ejemplo, de los anticuerpos de los sistemas Rh, Kell, Duffy, Kidd, MNS, Diego, etc. Los cambios de pH entre 6,0 y 8,0 tienen poca o ninguna influencia sobre la reactividad de los anticuerpos. Fuera de estos lmites se puede observar hemlisis de los glbulos rojos para valores extremos del pH, o una inhibicin de la aglutinacin debida a una disminucin importante de la constante de asociacin de los anticuerpos.

centracin de las suspensiones celulares llevan a una variacin de la relacin antgeno-anticuerpo de una prueba a otra y de un servicio a otro. Los lavados ejecutados en las pruebas de Coombs, si demasiados producen elucin de anticuerpos disminuyendo la sensibilidad de la prueba. Si insuficientes producen resultados falsosnegativos, por la neutralizacin de la antiglobulina humana (suero de Coombs) por anticuerpos libres non removidos. La centrifugacin de los tubos en alta rotacin antes de la interpretacin de las pruebas pueden producir resultados falsospositivos. La interpretacin de los resultados vara de un profesional a otro, principalmente si las reacciones son dbiles. Los profesionales necesitan ser muy bien entrenados para evitar errores advenidos de la subjetividad de las pruebas en tubo. La tcnica llamada gel-centrifugacin desarrollada por el Dr. Yves Lapierre (Lion-Francia) se utiliza de una matriz de gel (sephadex) en microtubos para atrapar aglutinatos (glbulos rojos aglutinados) producidos por la reaccin entre antgenos de la membrana eritrocitaria y anticuerpos anti-eritrocitarios, despus de una centrifugacin en baja rotacin.

7-Las pruebas serolgicas en tubo y la gel-centrifugacin para estudios inmunohematolgicos:

Basadas en el fenmeno de aglutinacin que estudiamos arriba, las pruebas serolgicas en tubo y gel-centrifugacin representan las tcnicas ms utilizadas en el laboratorio de inmunohematologa. Por las dos tcnicas se puede realizar todas las pruebas serolgicas de control inmunohematolgico de las transfusiones sanguneas y de la relacin feto-materna, o sea, determinacin de antgenos de grupos sanguneos, investigacin y identificacin de anticuerpos anti-eritrocitarios.

Existen 3 formulaciones bsicas del gel:

-Gel neutro: solo contiene la matriz de gel-sephadex pero sin adicin de anticuerpos, para deteccin de aglutinados produci-

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8-Conclusiones:
Las tcnicas serolgicas para estudios de los grupos sanguneos y anticuerpos anti-eritrocitarios en tubo y gel-centrifugacin hacen parte de un desarrollo histrico en la bsqueda de una estandarizacin de procesos en el laboratorio de inmunohematologa, facilitando la implementacin de programas de control de la calidad. El conocimiento de los procesos fsico-qumicos involucrados con la hemoaglutinacin especfica y inespecfica son extremados por anticuerpos aglutinantes. Utilizados en la prueba inversa ABO, en la investigacin de anticuerpos fros y pruebas enzimticas. -Gel especfico: es una mezcla de gel-sephadex con un anticuerpo contra un antgeno de grupo sanguneo. Se utiliza para determinacin de antgenos de grupos sanguneos. -Gel antiglobulina: es una mezcla de gel-sephadex con antiglobulinas humanas y/o fracciones del complemento. Se utiliza en las pruebas de Coombs para investigacin e identificacin de anticuerpos anti-eritrocitarios incapaces de producir aglutinaciones directas. La gel-centrifugacin representa un avance tcnico sobre la tcnica en tubos por algunas razones fundamentales: Estandarizacin de procedimientos, reacciones e interpretaciones de resultados. Sin aspectos subjetivos. La prueba de Coombs sin lavados disminuye las posibilidades de errores tcnicos, aumenta la sensibilidad de la prueba y permite el procesamiento de una grande cantidad de muestras simultneamente. Utiliza bajos volmenes de muestras (micro-tcnica). Las reacciones son estables permitiendo lecturas posteriores y por diferentes profesionales. Adems las reacciones pueden ser fotocopiadas o ledas por lectores automticos. Formacin tcnica muy simplificada. El entrenamiento de profesionales es rpido y seguro. - M.Goudemand, Ch.Salmon; Immuno hmatologie et Immunogntique Paris: Flammarion Mdecine Sciences -Ph.Rouger, Ch.Salmon; La Pratique de lagglutination des rythrocytes et le test de Coombs Paris: Masson,d. -Ph.Rouger, Ch.Salmon; La Pratique des Groupes et Groupages Erythrocytaires Paris: Masson,d. -Ph.Rouger, Ch.Salmon; La Pratique des Allo et Auto anticorps Anti Erythrocytes Paris: Masson,d. -B.Genetet, G.Andreu,J.M.Bidet; Aide Mmoire de Transfusion Sanguine Paris: Flammarion Mdecine Sciences -Technical Manual of AABB; USA: Bethesda, Maryland (2006) Jos Alisson dos Santos Consultor de Inmunohematologa Belo Horizonte MG - Brasil mente importantes para que los profesionales inmunohematlogos sean capaces de comprender las pruebas que ejecutan todos los das. De esta manera, se quedan ms crticos y pueden evitar errores tcnicos, principalmente cuando se utiliza tcnicas subjetivas que dependen mucho ms de la capacidad tcnica de los profesionales.

9-Referencias:

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