Gentica 1

Gua de
Problemas
Segundo Cuatrimestre de 2007

Profesores responsables:
Dres. Esteban Hopp, Beatriz Saidman y Liliana Mola

1. CONCEPTOS Y TCNICAS BSICOS DE GENTICA MOLECULAR

Bibliografa: Repaso IBMyC, Alberts, Griffiths
Cap 1 y Recombinant DNA (Watson et al.).

Gua terica:
1) Qu son, de dnde se obtienen y para qu sirven
las enzimas (mejor llamadas endonucleasas) de restriccin? Cmo hacen las bacterias que producen ER
para evitar que su genoma se vea afectado por las
mismas? Qu tipos de especificidad presentan? Qu
tipos de extremos pueden generar en el ADN sustrato?
R: Las endonucleasas de restriccin son producidas
por bacterias como mecanismo de defensa contra los
fagos. El genoma se encuentra protegido por metilacin especfica del sitio de restriccin mediante una
metilasa con igual especificidad que la endonucleasa.
Cortan el ADN en sitios especficos (secuencias definidas de ADN de 4 6 bases, generalmente). Algunos
dejan extremos cohesivos, otros dejan extremos romos. Siempre el sitio blanco (de reconocimiento) es
un palndrome, aunque el sitio de corte puede no coincidir con el sitio de reconocimiento. Los fragmentos
generados se pueden separar fcilmente mediante
electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La
velocidad de los fragmentos depende de su longitud:
los ms pequeos migran ms rpido.
2) En qu consiste la tcnica de secuenciacin de
Sanger? Qu trascendencia tuvo y tiene en Gentica
y Genmica? Porqu desplaz a la tcnica de Maxam
& Gilbert? Cul es la ventaja de la secuenciacin
automtica y en qu se diferencia de la manual?
R: En la secuenciacin manual, se suele marcar con
radioistopos y se corren 4 calles por secuencia (una
para cada nucletido). Se revela por autoradiografa.
Secuenciacin de Sanger (ver esquema de libro): secuenciacin por dideoxinucletidos
- ADN simple cadena
- Oligonucletido iniciador (primer)
- Incubacin c/ 4 diferentes dideoxinucletidos
(uno para cada calle)
- (Mono)deoxinucletidos (uno de ellos marcado,
usualmente [32P]dCTP)
- Electroforesis en gel de poliacrilamida
Existen mtodos no radiactivos (como tincin con
nitrato de plata), pero son menos utilizados. En la secuenciacin automtica se marca con fluorocromos
(aqu se marca el primer, con un color distinto para
cada nucletido a detectar) y se corren las cuatro reacciones en el mismo carril (que suele ser un capilar).
Los fragmentos se detectan mediante un lser a la salida del gel que distingue los 4 fluorocromos. No requiere detener la corrida electrofortica, por lo que
revela un mayor nmero de nucletidos. Permiti la

secuenciacin masiva de genes y genomas posibilitando el advenimiento de la genmica y proyectos

como el genoma humano.
La tcnica de M&G es un mtodo degradativo y tiene
2 reacciones de terminaciones de nucletidos inespecficas (revela 2 nucletidos y el verdadero se saca
por comparacin con otra calle del gel). Esta razn
dificulta, adems, la automatizacin. Por otro lado
resultan ms difciles de controlar las condiciones.
3) En qu consiste la PCR de punto final? Es una
tcnica cualitativa o cuantitativa? Qu diferencias
existen entre PCR de punto final y PCR de tiempo
real? Es posible hacer una PCR a partir de RNA?
Cmo? Puede utilizarse para diagnstico (la deteccin de HIV, por ejemplo)? Qu ventajas o desventajas tendra respecto a otras tcnicas diagnsticas como
el ELISA?
R: PCR: polymerase chain reaction (esquema del Recombinant DNA de Watson et al.)
- Utiliza la Taq polimerasa: Thermus aquaticus
- Permite amplificar segmentos especficos de ADN.
- No requiere digestin del ADN.
- No requiere clonar el segmento
- Se requiere poca cantidad de ADN.
Es una tcnica fundamentalmente cualitativa, debido a
que llega a una meseta de amplificacin por limitantes
que no suelen ser la concentracin del templado. La
PCR en tiempo real va siguiendo la cintica de amplificacin permitiendo comparar las fases logartmicas
de amplificacin entre s y as cuantificar con precisin los templados frente a una referencia o estndar.
Para realizar una PCR a partir de RNA se debe hacer
RT-PCR (se llama igual que la otra una por RetroTranscriptasa y la otra por Real Time). Se realiza la
primera reaccin con retrotranscriptasa y despus se
continua con Taq pol.
Es posible utilizar PCR para diagnstico y tiene como
ventaja que se trata de un mtodo directo (detecta al
virus y no los anticuerpos con los que reacciona el
paciente). Por eso sirve para la deteccin en recin
nacidos o personal mdico de alto riesgo que trabaja
con pacientes, antes de los 6 meses que tarda en detectarse una respuesta inmunolgica. No da falsos positivos (salvo por contaminacin de amplicones: un problema general de las PCRs). Desventajas: ms complejo, caro y menos automatizable que un ELISA. Hay
que purificar RNA e implica mayor exposicin al virus por parte del personal que hace el diagnstico.
4) En qu consiste un Southern blot? y el northern?
y el western? Para qu se usan y qu tipo de molculas se detectan en cada caso? Qu relacin tiene el
Southern con los RFLPs? Mencione 4 aplicaciones de
los RFLPs. Compare la utilizacin de Southern vs.
PCR, northern vs. RT-PCR y western vs. ELISA.
R: Southern blotting:

- Se parte de ADN (genmico de alto peso molecular

en el caso de los RFLP) y se lo digiere con enzimas
de restriccin.
- Los fragmentos de ADN se separan por electroforesis en gel de agarosa.
- Se transfiere a un filtro de nylon o nitrocelulosa y se
desnaturaliza el ADN.
- Se incuba con una sonda marcada especfica de la
secuencia en estudio.
- Lavado y exposicin del filtro.
- Deteccin autoradiogrfica o fluorogrfica.
Esta tcnica permite determinar:
a) Presencia y nmero de sitios de corte con una determinada enzima de restriccin en un fragmento
de ADN dado y establecer la existencia de polimorfismos para fines diagnsticos o de estudio
gentico (RFLP).
b) Nmero de copias (aproximado) del gen en el genoma, por ejemplo cuando se hacen transgnicos.
Los RFLP surgen de comparar los patrones de restriccin de Southern blot entre distintos individuos, especies, etc. observando diferencias (polimorfismos) en
sitios de corte.
Aplicaciones de los RFLP:
- mapeo gentico
- diagnstico prenatal
- diferenciacin de individuos (fingerprinting)
- estudios evolutivos
Northern blotting:
- El ARN celular total o mRNA se separa por tamao
utilizando electroforesis en gel de agarosa (en presencia de un agente desnaturalizante como el formaldedo para evitar la formacin de estructuras secundarias en el ARN durante la corrida).
- Se transfiere a un filtro de nitrocelulosa o a un papel
tratado qumicamente.
- Hibridacin con una sonda apropiada marcada seguida por autoradiografa. Se revelan bandas que indican el nmero y tamao de los tipos de ARN complementarios a la sonda.
Permite cuantificar aproximadamente y evaluar niveles de expresin de genes (para mejor precisin se usa
RT-PCR en tiempo real). Tambin es til, entre otras
cosas, como auxiliar del clonado de cDNA porque el
tamao de un mRNA especfico puede compararse
con el tamao de los cDNA copiados de ese mRNA, y
revela si este cDNA est completo.
En el Western blotting se transfieren protenas corridas en un gel de poliacrilamida a una membrana de
nitrocelulosa o PVDF y luego se las visualiza por su
reaccin con anticuerpos especficos.
La PCR ha desplazado, paulatinamente, al Southern
para varias de sus aplicaciones (por ser menos complejo, tener menos requerimientos de cantidad de templado, y porque puede automatizarse mejor) pero no
en todos los casos (por ej., comparaciones evolutivas).
Pero an en este ltimo caso, hoy en da empiezan a
ser reemplazados por los SNPs o por comparacin
directa de la secuencia nucleotdica de genes dia-

gnsticos. En algunos casos, se puede tener una sonda

pero no conocer la secuencia nucleotdica para disear
los iniciadores, por lo que se puede hacer un Southern
si no se tiene la informacin como para hacer PCR.
Northern y RT-PCR, dem que con Southern. La PCR
comn (denominada de punto final) no es cuantitativa, para ello se debe hacer PCR de tiempo real cuantitativa (qRT-PCR).
El western es ms especfico que el ELISA (se identifica la banda). No da falsos positivos. Es ms complejo y caro. Se utiliza para confirmacin del HIV, por ej.
5) Indique si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas y justifique su respuesta:
a) Un experimento de northern requiere desnaturalizacin de la doble cadena de ADN.
b) En una reaccin de PCR estndar se utilizan dos
primers complementarios a la cadena codificante.
c) La secuenciacin por el mtodo de Sanger no requiere, en ningn paso la desnaturalizacin de la doble cadena del ADN.
d) Al leer una autoradiografa en una secuenciacin
de Sanger el extremo 5 del fragmento secuenciado se
encuentra ms cerca del polo positivo y el extremo 3
ms cerca del polo negativo.
R: a) FALSO. Se trata de ARN de simple cadena el
que se somete a electroforesis.
b) FALSO. Se utilizan dos primers complementarios a
las dos cadenas.
c) FALSO. En esta secuenciacin se requiere la desnaturalizacin del ADN.
d) VERDADERO: Dado que es un mtodo de secuenciacin por sntesis, los fragmentos ms pequeos correspondern a la regin 5 del fragmento a secuenciar. Estos fragmentos pequeos migran ms y lo
hacen hacia el polo positivo (ya que el ADN tiene
carga negativa).

Problemas:
1) Suponiendo un alineamiento al azar de nucletidos
en un fragmento de ADN, cul es la probabilidad de
que una endonucleasa de restriccin cuyo sitio de reconocimiento consta de cuatro bases pueda cortar el
ADN? y para una enzima de seis bases? y para una
de ocho?
R:
A
T
C
G
4 bases
X X X *
( )4 = 3.9 10-3
*(probabilidad de que c/base se encuentre y que al
lado se encuentre una base cualquiera)
6 bases
( )6 = 2.4 10-4
8 bases
( )8 = 1.5 10-5
Frmula general: (1/4)n, donde n = longitud de la secuencia que se busca.
A medida que aumenta el nmero de bases disminuye
la probabilidad de encontrar un sitio blanco de restriccin.
2) Un fragmento de ADN clonado, con extremos cohesivos generados por EcoRI, lleva el gen que codifica para un polipptido de la cpside de un virus que
infecta a humanos, pero que enferma slo a personas

que tienen las defensas inmunolgicas disminuidas.

Ese fragmento de ADN, que tiene 8 kpb de longitud,
se inserta en el plsmido bacteriano pBR322 en su
nico sitio para EcoRI. El plsmido recombinante es
clivado por dos endonucleasas de restriccin (por separado o juntas) y luego es sometido a electroforesis
en un gel de agarosa y teido con bromuro de etidio.
En la figura se muestra el patrn de bandas (visualizadas por medio de luz UV) originado por cada uno de
los tratamientos:
A) EcoRI

B) BamHI

C) E + B

5,5 kpb
4,5 kpb
4 kpb

4 kpb
3,5 kpb
3 kpb
2,5 kpb
1 kpb

Al realizar Southern blots de los geles "B" y "C", qu

fragmentos hibridarn con una sonda del gen de la
cpside del virus?
R:
EcoRI

BamHI

3
2,5

5,5

BamHI

4,5
3,5
1

BamHI

EcoRI

Aclaracin: Las distancias que se encuentran dentro

del crculo son las correspondientes a los sitios de cortes BamHI. Las subrayadas, ms externas, marcan la
distancia entre los dos sitios EcoR I y las que estn en
negrita corresponden a las distancias entre cada sitio
de corte (representado por las flechas). Los fragmentos de 3, 4 y 1 kpb del gel C estn dentro del segmento
de 8 kpb, y estos hibridan con la sonda del gen de la
cpside del virus. Dado que todos los fragmentos del
gel B contienen una porcin del gen viral todos los
fragmentos de este gel hibridarn con la sonda.
3) Un investigador est estudiando un polimorfismo
en el largo de los fragmentos de restriccin (RFLP)
ubicado en el cromosoma 7, que presenta dos alelos.
El sitio de corte para EcoRI indicado con la flecha
est presente en uno de los alelos (A1) y ausente en el
otro (A2).
Sonda 1
Sonda 2
EcoRI

4 kpb

R:

Sonda 1

Sonda 2

A1A1 A2A2 A1A2

6 kpb
4 kpb

A1A1 A2A2 A1A2

6 kpb
4 kpb
2 kpb

8 kpb
6 kpb

EcoRI

a) Cul ser el patrn de bandas del RFLP para un

individuo A1A1 utilizando la sonda 1? Y para uno
A2A2? Y para el heterocigota?
b) Y con la sonda 2?

2 kpb

EcoRI

4) Un investigador est estudiando gen bacteriano que

presenta tres dominios y desea introducirle mutaciones a dicho gen con el fin de estudiar su funcionalidad. Para ello parte del gen, del cual conoce su secuencia completa, clonado en un plsmido para su
expresin en bacterias.
a) Cmo hara para delecionar el dominio intermedio
del gen?
b) Cmo hara para verificar que el vector generado
porta la delecin?
c) Qu elementos de secuencia debe tener el plsmido para poder mantenerse, amplificarse y expresarse
en bacterias?
R: a) Un mtodo posible es cortando con una misma
enzima de restriccin (o dos enzimas distintas que
dejen extremos compatibles) flanqueando el dominio
intermedio. Luego se religa el vector al cual le faltar
el domino intermedio. En caso de que no se encuentren dichos sitios de restriccin se pueden generar mediante mutagnesis sitio dirigida.
b) Para verificar que el vector porta la delecin se
puede hacer una PCR con primers flanqueado la secuencia del dominio intermedio. Si est deletado dar
un producto de PCR de menor tamao.
c) El vector deber tener un origen de replicacin para
poder duplicarse en la bacteria y un marcador de seleccin (generalmente un gen de resistencia a antibitico) de forma de poder seleccionar a las bacterias
transformadas. En el caso de un vector cuya finalidad
sea la expresin en bacterias, deber tener adems una
secuencia promotora ro arriba del sitio mltiple de
clonado (regin con sitios nicos de corte para muchas enzimas de restriccin).
5) El interfern est codificado por un gen que no
contiene intrones. Por clivaje con BamHI, se genera
un nico fragmento de restriccin conteniendo al gen
completo, que puede ser identificado en un Southern
blot con una sonda de cDNA marcada radiactivamente. Para determinar la posible causa de una inmunodeficiencia, muestras de sangre de pacientes y de personas no afectadas fueron utilizadas para estudiar el gen
del interfern y la expresin del mismo. Se muestran a continuacin autorradiografas de Southern y
northern de dichos experimentos, as como tambin un

western bloot representattivo utilizanddo anticuerppos anti-interfernn . Los indiividuos 1 y 2 no son afeectados
(sanos). Enn base a los resultados obtenidos
o
enn Southern, northeern y westernn:
Southern

1 2

3 4

Nortthern

1 2

3 4

W
Western

1 2

3 4

a) Cul sera la posibble causa de la

l inmunodeficiencia en los paacientes 3, 4, y 5?
b) Qu caaracterstica particular tiiene el individuo 2
para el gen del interfern ?
c) Importaa a partir de qu tejido se
s realiz ell Southern? Y el Northern y el Western?
R: a) Pacieente 3: En baase al northeern notamos que el
paciente 3 no presentta mensajeroo funcional. Esto
podra debeerse a una muutacin punttual en el proomotor
del gen, quue inhibe su expresin. Dado que el fragmento de reestriccin ess de mayor tamao
t
(corrre menos en el Southern)
S
poodra tratarsee de una muutacin
puntual en el promotorr perdindosse un sitio blanco
b
para la enzzima de resstriccin utiilizada en para
p
el
Southern. Tambin
T
pueede ser inserrcin en la regin
promotora y por lo tantto no dar mRNA.
m
El heccho de
no presentaar mensajeroo trae comoo consecuenncia la

ausencia de protena lo cuaal puede obsservarse a paartir

del western.
o normal enn el
Paaciente 4: preesenta el aleelo de tama
So
outhern, mennsajero de tam
mao salvajee, pero una prop
tena defectuossa de menorr tamao. Po
odra debersse a
un
na mutacin puntual
p
que genera un codn
c
Stop prep
maaturo y una protena
p
de m
menor tamao
o.
Paaciente 5: el tamao
t
del fr
fragmento dee restriccin, del
meensajero y laa protena parecieran ser normales, sin
em
mbargo, pressenta inmunnodeficienciaa. Esto poddra
exp
plicarse por una mutacin puntual que
q provoca un
cam
mbio aminoaacdico y la pprotena pierrde su actividdad
(caambio confoormacional) o bien que el origen dee la
enfermedad noo tenga relaccin con estta protena. Por
ejeemplo podraa tratarse de uuna mutacin en el recepptor
de interfern lo cual darra un fenotip
po similar all de
loss otros pacieentes. Habraa que demostrar, en un sigu
uiente paso, si
s la protenaa es o no fun
ncional. Se les
ocu
urre como haacerlo?
b) El individuuo 2 es heterrocigota para dos varianntes
allicas del genn del interferrn , mienttras que los resr
tan
ntes son hom
mocigotas parra uno (indiv
viduos 1, 4 y 5)
u otro
o alelo (inndividuo 3).
c) Dado que el
e Southern se hace a partir de DN
NA
gen
nmico y toodas las cluulas tienen el
e mismo DN
NA
enttonces no im
mporta a parrtir de qu tejido
t
se exttrae
miismo. En cam
mbio en el nnorthern y en
e el westernn s
im
mporta dado que se est evaluando la
l expresinn de
loss genes, la cuual puede serr tejido especfica (comoo en
estte caso).

1. DIVIS
SIN CEL
LULAR
b) mitosis y meiosis II
c) meiossis I y meiosiis II
Co
onsidere las diferencias
d
taanto en el mecanismo coomo
en los productoos finales.
3) El grfico representa
r
la variacin del contenidoo de
AD
DN durante el
e ciclo vital de una clulla:

Bibliograffa:

Alberts y col. Cap. 17. Seccionees: La estrateegia

general del ciclo cellular, Cap. 200 Clulas gerrminales y fertilizacinn: Beneficios del sexo, Meiosis
Griffithhs y col Cap.3: Mitosis y meiosis, Coomportamientto paralelo de genes autoosmicos y cromoc
somas, Gentica meendeliana y ciclo
c
de vida..
# problemass opcionales
#1) Culess son los mecanismos quue generan variabiv
lidad en los organismos?
2) Enumeree al menos 4 diferencias entre:
e
a) miitosis y meiosis I

Qu ocurrre en el intervvalo de tiemp

po de 2 a 3?
C
Cmo se denoomina la fasee que transcu
urre entre 3 y 4?
E
Este grfico corresponde
c
a un ciclo miittico o a unno
meeitico?
Si la cantidadd de ADN no se ha modifficado al finaal
del ciclo, qu utilidad tienne este processo?.
4) Si C es laa cantidad dee ADN conteenida en un gameeto, cul seer la cantiddad de ADN
N (C, 2C, 4C),
4

cromosomas y cromtidas en los siguientes perodos

del ciclo celular en la especie humana? Marque con H
D si la clula es haploide o diploide.
valor Ncromo- N crom- H/D
C somas
tidas
G1 premittica
G2 premittica
Profase mittica
Metafase mittica
Telofase mittica (en
c/ncleo)
Espermatozoide
Profase meitica I
leptoteno
Metafase meitica I
Anafase meitica I
Metafase meitica II
Telofase meitica II
(cada polo)
Interfase premeitica (antes S)
Interfase premeitica (despus S)

#5) Albert y Swift (1953) encontraron las siguientes

cantidades relativas de ADN (en unidades arbitrarias)
por ncleo en varios tipos de clulas del anlido Sabellaria:
a) Primer cuerpo polar:
127 + 3
b) Esperma:
61 + 1
c) Profase mittica:
263 + 10
d) Telofase mittica:
124 + 3
Explique estas diferencias.
6) Una especie animal tiene 2n cromosomas: Qu
proporcin de las gametas formadas tendrn los
centrmeros:
i) de origen paterno nicamente;
ii) de origen materno nicamente;
iii) de origen materno y paterno simultneamente?
7) Una cigota posee un 2n = 8; en el primer par de
cromosomas homlogos uno de los miembros presenta un abultamiento ("knob") intersticial; en el segundo
par uno de los miembros posee un satlite en posicin
terminal, en el tercero uno de los cromosomas presenta un segmento heterocromtico terminal y el cuarto
par es acrocntrico. Realice un esquema de las siguientes etapas de la mitosis y meiosis.
a) metafase mittica
b) metafase de meiosis I
c) metafase de meiosis II
d) anafase de mitosis
e) anafase de meiosis I (dibuje los ordenamientos posibles en anafase I e indique qu probabilidad tiene
cada uno de producirse).
f) anafase de meiosis II

8) Otra cigota posee un complemento de dos pares de

cromosomas homlogos A y a, B y b:
a) cules de los siguientes complementos cabra esperar en las clulas somticas durante el crecimiento:
AaBB, AABb, AABB o aabb?
b) Podra encontrarse ms de una combinacin?
Cuando este individuo llegue a adulto:
c) cules de las siguientes combinaciones de cromosomas cabra esperar en las gametas?:
Aa, AA, aa, Bb, BB, bb;
Aa, Bb;
A, a, B, b; AB, Ab, aB, ab;
Aa, Ab, aB, Bb.
9) Dibuje la configuracin de los bivalentes en Paquitene, *Diplotene, Diacinesis y Metafase I de una especie con 2n= 4, donde uno de los pares es metacntrico
y muestra regularmente durante toda la meiosis un
quiasma intersticial a cada lado del centrmero; el
otro es un acrocntrico con un nico quiasma intersticial en el brazo largo. Use lpices de colores para diferenciar a los dos homlogos.
10) Los conceptos de divisin reduccional o divisin
ecuacional se refieren a:
a) fenmenos citolgicos o genticos?
b) Hay paralelismo entre dichos aspectos citolgicos
y genticos?
Si se tiene un par de cromosomas homlogos acrocntricos donde se ubican los genes A y a:
c) En qu estadio efecta reduccin el segmento que
contiene el gen A si ocurre un intercambio en la regin I?
d) Realice el mismo razonamiento si el intercambio
ocurre en II.

I
II
__________A____________
_______________________
A
__________a____________
_______________________
I
a
II
#10) En qu organismos esperara la mayor variabilidad:
a) en los que se reproducen asexualmente en los que
lo hacen sexualmente?
b) Suponga que el proceso meitico nunca hubiera
aparecido en la evolucin biolgica: cul piensa Ud.
que habra sido la consecuencia?
c) En las especies animales que poseen una meiosis
masculina aquiasmtica, hay recombinacin gentica
en esas especies?
11) IMPORTANTE La direccin
www.biologia.arizona.edu/cell/tutor/mitosis/01q.html
contiene problemas relacionados al tema de divisin
celular y cada uno de ellos trae cuatro opciones de
respuesta siendo solo una la correcta. Es til como
mtodo de ejercitacin y de autoevaluacin.

2. LEYES
S DE MEND
DEL Y EXTENSIONES DEL ANLISIS
A
M
MENDELI
IANO I
Bibliografa: Griffiths y col. Cap. 2 y 4
Gua tericca
1) Seale la importanncia del conncepto de seegregacin, por unn lado, e inddependencia,, por el otro, de la
herencia dee caracteres derivada
d
de las leyes dee Mendel. Cul es la importtancia de la diploida enn todo
esto? Seraa lo mismo si
s las arvejass fueran monnoploides en vez de
d diploides??
R: Adems de repasar las
l leyes de Mendel, se resalta
que la segreegacin e inndependenciaa de la herenncia de
los caracterres es, valga la redundanncia, indepenndiente
de si los orrganismos soon haploides o diploides y permite la recoombinacin, entendida como
c
nuevass combinaciones de alelos de
d distintos genes. Se puede
hacer, comoo ejercicio, qu
q hubiese pasado
p
con las
l generaciones paternales,
p

F1
y F2 si las arvejaas fueran haploides. Ahora biien, la segreggacin de aleelos se
ve enmascaarada en los diploides poor las interaccciones
de dominanncia-recesividdad. Por eso, antes de Mendel,
M
no se le enccontraba lgiica a que 2 inndividuos dee fenotipo dominaante, tuvieraan descendieentes con feenotipo
recesivo, por ejemplo. Destacar la importanccia del
anlisis num
mrico-estaddstico para establecer
e
esstas leyes y que poocos aplicaroon previamennte.
2) Por quu procesos recombinann los genes en la
meiosis?
R: Despus de Mendeel se pudierron incorporrar los
conceptos derivados
d
dee los avancees en citogeentica
(teora crom
mosmica dee la herenciaa) y reformuular, en
su acepcinn moderna que
q los gennes situados sobre
diferentes cromosomas
c
recombinann mediante la segregacin al
a azar de los cromosom
mas en la anaafase y
los genes siituados en ell mismo crom
mosoma se recomr
binan por medio
m
del enttrecruzamiennto.
3) a) Qu es un monohhbrido? Quu es un hbrrido en
h
sentido agrronmico o comercial (ppor ej. un hbrido
superrendiddor para Claarn Rural)? b) Qu siggnifica
hacer un cruuzamiento diihbrido o triihbrido?
R:a) Monohbrido es sinnimo
s
de heterocigotta para
un nico gen.
g
Un hbrrido comercial es tambiin un
heterocigotaa (pero con sobredomina
s
ancia para el carcter rendimieento). No se lo debe conffundir con hbridos
interespecfficos que soon resultadoss de cruzam
mientos
interespecfficos y se verrn en la guaa de alteracioones.
b) Hacer unn cruzamientoo dihbrido o trihbrido siignifica analizar varios
v
pares de alelos, doos (Aa Bb) o 3 (Aa
Bb Cc) resppectivamentee, siempre heeterocigotas.
4) Qu es retrocruza?
r
cruzamiennto prueba?
Y
R: Un cruzaamiento prueeba es un cruuzamiento enntre un
heterocigotaa y el padre recesivo paara las caractersticas en estuddio
AA x aa
A
Aa
Se hace
h
Aa x aa (cruzamientto prueba)

Laa retrocruza es
e un cruzam
miento entre el
e heterocigoota
(F1) o cualquieera de las sigguientes geneeraciones y
cualquiera de los padres originales.
5)En qu conssiste la pruebba de compleementacin?
R: Cruzamientto entre dos mutantes ho
omocigotas con
c
fen
notipo similaar (por ejempplo albino) para
p
determiinar
si la F1 tiene fenotipo sallvaje (indicaativa de que las
mu
utaciones esttn localizaddas en distintos genes). Es el
casso tpico dee una va m
metablica dee varios passos.
Taanto si hay una
u mutacinn para el priimer paso dee la
vaa, como paraa el segundo, la consecueencia es quee no
se formar el producto finnal (por ejem
mplo antociaanas
de color rojo, dando albinismo). Si se cruza una mum
tan
nte para el geen codificantte para la prim
mera enzimaa de
la va metabliica con otro para la segu
unda, la F1 ser
s
hetterocigota para ambos ggenes. Como
o generalmeente
loss alelos salvvajes (enzimaa normal acttiva) son dominan
ntes, las ennzimas sintettizadas se complementa
c
arn
parra restaurar la va metabblica, indep
pendientemeente
de que los allelos salvajees estn en
n repulsin (en
ans). El 100% de la F1 es salvaje. Esta pruebaa se
tra
con
ntrasta con la prueba de recombinaciin (lo que conc
fun
nde a los aluumnos). En la prueba de recombinaciin,
pu
uede ocurrir que las mutaantes indepeendientes se correespondan al mismo gen pero en nuccletidos disttintoss, lo que possibilita que se produzca un entrecruuzamiiento entre las 2 posicioones mutadass generando un
reccombinante salvaje.
s
En eeste caso, la F1
F ser de feenotip
po mutante en un 100%
% (los alelo
os mutados del
miismo gen no se pueden coomplementarr, salvo algunos
cassos muy exccepcionales llamados dee complemenntaci
n intragnicca). En la F
F2, en una proporcin
p
m
muy
pequea (por ejemplo 1x110-4) apareceen salvajes por
reccombinacinn. Claramennte, no son
n proporcioones
meendelianas. Este
E tipo de experimento
os le sirvieroon a

Benzer para establecer las distancias mnimas o problemas que se refieren a estos ejemplos dado que,
unidades de recombinacin en sus experimentos con experimentalmente, cuando se obtiene una progenie
fagos. Hoy sabemos que esta distancia o unidad es el segregante, normalmente no se sabe de antemano si el
comportamiento es de tipo episttico y menos an a
nucletido.
6) Qu ventajas tiene el uso de caracteres, genes o qu variante de epstasis se corresponde. En este conmarcadores codominantes (respecto a los dominantes) texto, resulta til disponer del cuadrito de abajo que
muestra algunos ejemplos del tipo de proporciones
en un anlisis gentico de segregacin?
R: Se puede distinguir los heterocigotas de los homo- fenotpicas posibles.
cigotas, por lo que se dispone de mayor informacin Problemas:
(estadstica) en una
Tipo de interaccin gnica
9
3
3
1
Razn
F2, por ejemplo. ReA-BA-bb
aaBaabb
fenotpica
trocruzar F1 con el
Ninguna (cuatro fenotipos distintos)
9
3
3
1
9:3:3:1
doble recesivo (cruAccin
gnica
complementaria
9
7
9:7
zamiento prueba), en
Supresin
dominante
de
A
sobre
el
alelo
dominante
B
12
3
1
13:3
vez de autofecundar.
Epstasis recesiva de aa sobre los alelos B y b
9
3
4
9:3:4
7) Cul es la base
Epstasis dominante de A sobre los alelos B y b
12
3
1
12:3:1
molecular de las inGenes duplicados
15
1
15:1
teracciones gnicas,
1)
Si
dispone
de
las
siguientes
cepas
de
Drosophila
dominancia, semidominancia, codominancia, sobreii) salvaje y
iii) bw_vg ;
dominancia (=heterosis o vigor hbrido), y dominancia i) bw e ;
bw e
bw vg
incompleta?
R: Repasar concepto un gen-un polipptido y qu im- y desea comprobar las leyes de Mendel, indique:
plica a nivel de fenotipo (ej. grupos sanguneos). Es a) Todos los cruzamientos que le permitiran hacerlo y
la segregacin de qu carcter (o caracteres) estudiara
decir, en la codominancia se expresan los dos alelos.
La sobredominancia implica que la F1 supera en el en cada caso.
carcter estudiado (usualmente rendimiento agron- b) Es equivalente el cruzamiento directo al recproco?
mico) a ambos padres.
Dominancia incompleta: el heterocigota presenta ras- c) Deben usarse hembras vrgenes en todos los cagos intermedios entre cada tipo de homocigota, no es sos?
2) Si dos pares de genes A:a y B:b se transmiten inigual a ninguno de ellos.
dependientemente y se sabe que A es dominante sobre
8) Normalmente, de un carcter autosmico doa
y B dominante sobre b, cul es la probabilidad de
minante relacionado con alguna enfermedad se
obtener:
espera que cada individuo afectado tenga al menos un progenitor tambin afectado. Pero, puede a) una gameta AB a partir de un individuo AaBb?
b) una gameta Ab a partir de un individuo AA Bb?
suceder que ambos padres no manifiesten la enc) una cigota AABB a partir de aabb X AABB?
fermedad?
d) un fenotipo AB a partir de AaBb X AaBb?
R: Penetrancia (incompleta)
e) un fenotipo AB a partir de AABB X aabb?
f) un fenotipo aB a partir de AaBb X AaBB?
3) Considere el cruzamiento AaBbCcDdEe x
aa
aaBbccDdee. (a) Qu proporcin de la descendencia
ser fenotpicamente como: 1) el primer parental, 2) el
segundo parental, 3) cualquiera de los dos parentales y
Aa
4) ninguno de ellos? (b) y genotpicamente? Suponga
9) A qu se denomina interacciones gnicas?
que la segregacin es independiente.
R: Interaccin entre dos o ms genes de distintos loci
4) Enumere las proporciones genotpicas y fenotpicas
en la que uno interfiere o modifica la expresin feque puede formar el trihbrido AaBbDd cuando es
notpica de otro. Generalmente se denomina hiposttiautofecundado (o cruzado por uno de constitucin
co al gen que slo se manifiesta fenotpicamente
genotpica similar) suponiendo que A y B son domicuando otro locus (episttico) presenta determinado
nantes y que D tiene dominancia incompleta sobre d.
genotipo.
Epstasis = modificaciones de las proporciones fe- 5) Se sabe que existe una serie de 4 alelos en determinada especie diploide (2n); cuntos estaran presentes
notpicas debidas a interaccin gnica
b) un par cromosmico?
Los casos de epstasis son muy numerosos en genti- en: a) un cromosoma?
c)
un
individuo
de
la
especie?
ca, muchos ms de los que aparecen en los libros de
texto. Sin embargo, varios textos tratan con detalle e d) sobre la misma base: cuntas combinaciones difeincluso dan definiciones de algunos de estos ejemplos. rentes de alelos se espera que ocurran en la poblacin
No es de inters para esta materia que los estudiantes completa?
memoricen estos ejemplos y mucho menos las defini- 6) En el ratn, el gen para el albinismo presenta una
ciones de cada uno de ellos. Sin embargo, hay algunos serie de alelos mltiples. Cuatro de estos alelos (clasi-

ficados de acuerdo con la disminucin de intensidad

del color de pelo de los homocigotas) son:
C = color completo (tipo salvaje)
cch= chinchilla
cd = dilucin extrema
c = albino
Las relaciones de dominancia son C> cch> cd> c.
a) Haga un esquema de un cruzamiento entre un ratn
salvaje heterocigota para dilucin extrema y un ratn
chinchilla heterocigota para el albinismo.
b) Otro gen que afecta el color del pelo en el ratn
tiene su locus en otro cromosoma, y presenta los alelos B para pelo negro (tipo salvaje) y b para castao.
Ampliar el esquema anterior incluyendo el dato de
que los dos ratones que se cruzan son heterocigotas
para ese gen.
7) Un fitopatlogo llamado Flor vio que algunas variedades de lino presentan diferente resistencia a distintas razas de un hongo, Melampsora lini. La variedad de lino 770B es resistente a la raza 24 y susceptible a la raza 22, mientras que la raza Bombay es resistente a la 22 y susceptible a la 24. Si se cruzan las variedades 770B y Bombay, el hbrido obtenido es resistente a ambas razas 22 y 24. Cuando autofecund la
F1 se produjo una F2 con las siguientes proporciones
fenotpicas:
RAZA 22
RAZA 24
Resistente Susceptible
Resistente
110
43
Susceptible
32
9
a) Proponga una hiptesis para explicar la base gentica de la resistencia del lino a estas razas particulares
de hongos.
b) En base a su hiptesis, qu nmero de cada una
de las cuatro categoras aparece en F2?
c) Pruebe su hiptesis usando 2.
LEYES DE MENDEL Y EXTENSIONES DEL
ANLISIS MENDELIANO II
8) Si el carcter antenas largas (a) est ligado al sexo
(determinacin XX-XY) en el mosquito Sinospica
rascaremus, qu probabilidad hay de obtener un mosquito macho y con antenas largas en el cruce A/a x
A/Y?.
9) Averiguar si el modelo de herencia del rasgo definido en el siguiente pedigr, se corresponde con un
tipo de herencia autosmica dominante, autosmica
recesiva, dominante ligada a X, recesiva ligada a X o
ligada a Y. Podra ser vlida ms de una hiptesis?

9) En una especie cultivada se realiz un cruzamiento

entre plantas de flores rojas y plantas de flores blancas. La progenie F1 fue roja. En la F2 los resultados

fueron los siguientes: 92 rojas, 30 cremas, 41 blancas.

Explique.
10) En el ratn hay un alelo mutante que causa encorvamiento de la cola. A partir de los resultados de los
cruzamientos que se indican a continuacin deduzca
el tipo de herencia de este carcter:
a) Es recesivo o dominante?
b) Es autosmico o ligado al sexo?
c) Cules son los genotipos de los progenitores y de
las progenies en cada uno de los cruzamientos?
Cruza Progenitores
Progenie
1

Madre Padre
Normal Curva

Curva

3
4
5

Curva
Norma
Curva

Curva

Hijas
Hijos
Todas curvas Todas normales
0,5 curvas
0,5 curvas
Normal
0,5 normales
0,5 normales
Normal Todas curvas
Todas curvas
Normal Todas normales Todas normales
Curva Todas curvas
Todas curvas
0,5 curvas
Curva Todas curvas
0,5 normales

11) En Drosophila se aparearon 2 moscas de fenotipo

"alas curvadas" (Curly) y "setas anormales" (Stubble).
Se analiz un gran nmero de descendientes adultos y
la proporcin fue la siguiente: 4 CySb: 2 CySb+: 2
Cy+Sb: 1 Cy+Sb+. Explique estos resultados.
12) El color del pelaje en los perros depende de la accin de por lo menos 2 genes. En un locus, un inhibidor episttico dominante (I) de la pigmentacin evita
la expresin de los alelos del color que se ubican en
otro locus de segregacin independiente y en consecuencia produce pelaje blanco. Cuando se da la condicin recesiva ii , los alelos del locus hipoststico pueden expresarse: iiN_ produce color negro, iinn produce color caf. En un cruzamiento dihbrido para ambos loci, determine:
a) proporciones fenotpicas esperadas en la progenie.
b) probabilidad de hallar, en la progenie de color blanco, un individuo que sea homocigota para ambos loci.
13) En una especie cultivada se realiz un cruzamiento entre plantas de flores rojas y plantas de flores
blancas. La totalidad de la F1 present flores rojas. En
la F2 los resultados fueron los siguientes: 92 rojas, 30
cremas, 41 blancas. Qu procesos explicaran estos
resultados?
14) Se cruzaron dos cultivares de arveja con flores
blancas y se obtuvo una F1 homognea con flores moradas. El cruzamiento al azar entre individuos de la F1
produjo 96 plantas hijas, de las cuales 53 presentaron
flores moradas y 43 presentaron flores blancas. En
este ejemplo:
a) A qu proporcin fenotpica se aproxima la F2?
b) Qu tipo de interaccin participa?
c) Cules seran los genotipos probables de las cepas
progenitoras?
15) Las gallinas Black Langshan tienen patas con
plumas, mientras que las patas de las Buff Rock no
son emplumadas. Del cruzamiento entre ambas se obtiene una F2 integrada por 15 individuos con patas

10

emplumadas y slo 1 sin plumas. Diagrame los cruzamientos y explique los resultados.
16) En la rata, dos parejas allicas A:a y R:r interactan de la siguiente forma:
A_R_: pelaje gris.
aaR_: pelaje negro.
A_rr: pelaje amarillo. aarr: pelaje color crema.
Estos genotipos slo pueden expresarse en presencia
de un alelo dominante de un tercer gen, D, mientras
que su alelo recesivo d causa albinismo. Cuatro lneas
albinas homocigotas diferentes fueron cruzadas con
una lnea pura de color gris, y estos cruzamientos produjeron las correspondientes F1 grises. Estas F1 produjeron las siguientes F2:
Lneas Cantidad de individuos en las distintas F2
albinas Gris Amarillo Negro Crema Albino
174
0
65
0
80
1
48
0
0
0
16
2
104
33
0
0
44
3
292
87
88
32
171
4
a) Cul es el genotipo de cada lnea albina?
b) Qu tipo de interaccin -si la hay- est implicada
en estos cruzamientos?
IMPORTANTE: Una vez resueltos los problemas de
la gua, las siguientes direcciones de Internet contienen problemas que, a manera de repaso, permiten incursionar en las tcnicas de autoaprendizaje con autoevaluacin.
http://www.biologia.arizona.edu/mendel/sets/mono/m
ono.html (cruza monohbrida)
http://www.biologa.arizona.edu/mendel/sets/di/02Q.h
tml (cruza dihbrida)

3. MAPEO CROMOSMICO
Bibliografa: Griffiths o cualquier otro libro de gentica.
Gua Terica:
1) Cmo y cuando se encontr el fenmeno de ligamiento entre genes? Por qu contradice las leyes de
Mendel?
R: A principios del siglo XX se encontraron genes
que no respondan a la segunda ley de Mendel. En ese
momento no se conoca la base fsica (teora cromosmica de la herencia) pero el descubrimiento del
ligamiento ayud mucho a postular esta hiptesis,
luego comprobada. Actualmente se sabe que, en los
organismos diploides, hay 2 copias homlogas de cada cromosoma que pueden llevar alelos distintos del
mismo gen. Estas copias segregan en igual proporcin
que las gametas, de acuerdo a la primera ley de Mendel. Si consideramos 2 genes ubicados en cromosomas
diferentes, stos segregarn al azar, obtenindose proporciones similares de gametas parentales y recombinantes (primera ley de Mendel). Si, en cambio, los 2
genes se ubican en el mismo cromosoma, no segregan
en forma independiente sino que tendern a segregar
juntos. Se dice, entonces, que estos genes se encuentran ligados. En este caso las gametas sern nicamente parentales, no formndose recombinantes. Es como

si los dos genes fueran en realidad uno slo. Sin embargo, durante la primera fase de la meiosis, se producen entrecruzamientos entre cromosomas homlogos
que resulta en un intercambio fsico como lo demostraron Creighton y Mc Clintock en 1931 utilizando
marcadores citolgicos combinados con marcadores
genticos. Estos entrecruzamientos se visualizan como
quiasmas a nivel citolgico. Si imaginamos una distribucin aleatoria de los entrecruzamientos a lo largo
del cromosoma, la probabilidad de que ocurra un entrecruzamiento es aproximadamente proporcional a la
distancia que separa a los genes en el cromosoma:
cuanto ms separados se encuentren, ms probable es
que ocurra un entrecruzamiento entre ellos. En consecuencia, determinando la frecuencia de recombinantes, podemos obtener una medida de la distancia entre
los genes ligados. Esta es la base para la construccin
de mapas genticos.
El mapeo gentico se realiza mediante anlisis de cruzamientos planificados, pruebas de progenie y anlisis
de pedigr. Es decir, mediante el anlisis comparativo
de fenotipos recombinantes. El mapeo fsico se realiza mediante el anlisis de clones genmicos (mediante
mapeo de contigs de los cuales se conocen, por ejemplo, sus mapas de restriccin), combinado con secuenciacin nucleotdica, por hibridacin in situ, u
otros mtodos que no involucran cruzamientos y anlisis de recombinantes. En este caso, las distancias se
calculan en nucletidos o mediante medicin de cromosomas.
2) Cundo se dice que 2 genes estn en acoplamiento o en repulsin?
R: Alelos mutantes ubicados en el mismo cromosoma
o separados en los 2 cromosomas homlogos.
Acoplamiento: AB ; Repulsin: Ab
ab
aB
3) Qu relacin existe entre ligamiento y mapeo?
R: Establecer el ligamiento y calcular la distancia
permite en base a las distancias relativas de muchos
genes establecer un mapa gentico.
4) Cul es la base fsica del mapeo gentico? Qu
relacin tienen los estudios de mapeo gentico con los
entrecruzamientos y quiasmas que se observan en las
meiosis? Qu similitutes, relaciones y diferencias
existen entre el mapeo gentico y el mapeo fsico o
genmico?
R: Los genes son segmentos de ADN pertenecientes a
una larga molcula que constituye un cromosoma. Los
recombinantes para genes pertenecientes al mismo
cromosoma surgen porque en la meiosis hay entrecruzamientos (que se pueden visualizar microscpicamente en la forma de quiasmas) entre cromosomas
homlogos.
El mapeo gentico se realiza mediante anlisis de cruzamientos planificados, pruebas de progenie y anlisis
de pedigr. Es decir, mediante el anlisis comparativo
de fenotipos recombinantes. El mapeo fsico se realiza
mediante el anlisis de clones genmicos mediante
mapeo de contigs (de los cuales se conocen, por ejem-

11

plo, sus mapas de restriccin), combinado con secuenciacin nucleotdica, por hibridacin in situ, u
otros mtodos que no involucran cruzamientos y anlisis de recombinantes.
Las distancias se calculan en nucletidos o mediante
medicin de cromosomas.
El orden fsico de los genes en el cromosoma coincide
con el orden que surge de su mapeo gentico. Existe,
adems, una correspondencia proporcional relativa
entre distancia gentica y distancia calculada en nucletidos, aunque la correspondencia no es absoluta y
vara en distintas partes del cromosoma. Es decir, una
unidad de mapa significa un nmero distinto de nucletidos cerca del centrmero que cerca del telmero,
porque las frecuencias de entrecruzamiento (formacin de quiasmas) son distintas. La vecindad de regiones heterocromticas tambin afecta la frecuencia de
aparicin de quiasmas y la relacin absoluta entre distancia gentica/distancia fsica.
5) Qu es y cmo se hace una prueba de 2 puntos?
Qu significa la palabra punto en prueba de 2 puntos? Implica ligamiento?
R: Se estudia el ligamiento en cruzamientos de dobles
heterocigotas por dobles recesivos (Ver libro para una
explicacin ms completa)
6) Qu es una unidad de mapa? Es sinnimo de
centiMorgan, frecuencia de recombinacin o de unidad de recombinacin? A cuntos nucletidos equivale una unidad de mapa?
R: Se define como unidad de mapa a la distancia entre
genes (o marcadores) para los cuales se observa un
recombinante con una probabilidad de uno en 100
productos de la meiosis. Una unidad de mapa sera,
entonces, equivalente a una frecuencia de recombinacin del 1%. Es decir, que se calcula mediante la
frmula del % de recombinantes sobre totales y es
sinnimo de unidad de recombinacin. Los cM tienen
otra frmula de clculo que toma en cuenta la posible
existencia de dobles entrecruzamientos y la interferencia. No siempre coinciden. Como se mencion, la
unidad de mapa gentico vara (en nmero de nucletidos) segn la especie, el cromosoma y localizacin
dentro del mismo cromosoma. Groseramente, 1 cM
equivale a 1 megabase (un milln de pares de bases)
en humanos.
7) Pueden 2 genes estar ligados a ms de 50 u.m.?
Por ejemplo, pueden estar a una distancia de 200
u.m.? Qu es un grupo de ligamiento y a qu se corresponde fsicamente?
R: Primero, hay que ver de dnde sale este lmite de
50 u.m. Al momento de la meiosis, cada cromosoma
del par de homlogos se halla conformado por 2
cromtides. Es decir, al momento del apareamiento en
el que se produce el entrecruzamiento tenemos 4 cadenas de ADN vecinas. Sin embargo, slo 2 de las 4
hebras participa en el entrecruzamiento, por lo que,
como resultado, slo la mitad de las gametas podrn
ser recombinantes. O sea que entre 2 genes ubicados
en el mismo cromosoma que estn lo suficientemente

lejos como para que siempre exista un entrecruzamiento entre ellos, la mxima proporcin de recombinantes ser del 50%.
Por lo tanto, 2 genes pueden estar ligados a ms de 50
u.m., pero no lo puedo determinar mediante una simple prueba de 2 puntos entre ambos genes analizados,
porque la mxima distancia determinable por este
mtodo es de 50 u.m. Necesito un gen puente (o
varios) para poder integrar a los dos genes en el mismo grupo de ligamiento. Por lo tanto, un grupo de
ligamiento est formado por el conjunto de genes (o
marcadores genticos) que se comportan como ligados
entre s en forma directa o a travs de otros genes
puente. El grupo de ligamiento se corresponde a
todos los genes o marcadores genticos localizados en
el mismo cromosoma o molcula de ADN. Se llama
desequilibrio de ligamiento al fenmeno que se da
entre dos alelos de dos genes distintos que se heredan
juntos con una probabilidad mayor que la dada por el
azar. Esto se debe en general a que los genes estn
ligados.
8) Qu es una prueba de 3 puntos? En una prueba
de 2 puntos, se puede establecer un orden de los genes? y en una de 3? hasta qu punto?
R: Cuando se estudia el ligamiento simultneo entre 3
genes (por ej. A, B y C), se puede establecer un orden
ya que (suponiendo que el orden sea ABC), la distancia (prueba de 2 puntos) entre A y C es aproximadamente igual a la suma de la distancia entre A-B + B-C.
En una prueba de 2 ptos. no se puede establecer un
orden, slo distancias relativas. En la de 3 s, pero no
se sabe si los 2 puntos extremos (A y C) estn a la
derecha o a la izquierda.
9) Porqu no hacer 2 o 3 pruebas de 2 puntos? Dan
distintos resultados? Por qu? Qu es interferencia y
cmo se calcula el coeficiente de coincidencia?
R: Pueden dar resultados distintos por el fenmeno de
subestimacin de dobles entrecruzamientos y/o de
interferencia. En el ejemplo de arriba, la distancia entre A y C (medida como prueba de dos puntos) suele
ser menor a la de A-B + B-C. Esto se debe a la presencia de de entrecruzamientos dobles entre Ay C cuyo resultado final es la formacin de gametas parentales AC y ac para estos 2 genes que se computan como
No recombinantes, cuando en realidad lo son. Si nosotros no hubiramos mapeado el gen B nunca hubiramos detectado estos dobles entrecruzamientos (ni triples, ni cudruples). Si extendemos este pensamiento,
en realidad tampoco sabemos si entre A-B hubo entrecruzamientos dobles y si tambin estamos subestimando la proporcin de recombinantes entre A y B.
Cuanto ms grande la distancia entre 2 marcadores,
ms inexacta ser la frecuencia de recombinantes como medida de la distancia entre los genes. Adems,
est el fenmeno de interferencia que se relaciona con
un impedimento estrico o fsico que reduce la probabilidad de que se produzcan Adems, est el fenmeno de interferencia que se relaciona con un impedimento estrico o fsico que reduce la probabilidad de

12

que se produzcan quiasmas muy cercanos entre s (se

interfieren) por lo que el nmero de recombinantes
entre genes muy cercanos entre s es menor al probabilsticamente esperado. Algunas funciones de mapeo
ms refinadas, toman en cuenta este fenmeno. Estas
funciones se derivan de la funcin de Poisson y son,
fundamentalmente, dos: la de Haldane (que considera
los dobles entrecruzamientos pero no considera la interferencia) y la de Kosambi (que considera ambas).
Por lo general, todos los mapas que se publican se
basan en la funcin de Kosambi.
10) Por qu, en una prueba de 3 puntos, realizar un
cruzamiento prueba facilita el anlisis?
R: Porque el cruzamiento con el homocigota recesivo
permite concentrarse directamente en las gametas de
la F1 permitiendo distinguir las gametas que portan
alelos recesivos de dominantes mediante una sencilla
relacin de 1 a 1. Esto es particularmente til para
genes en los que no se puede distinguir el fenotipo
heterocigota del homocigota dominante. Toda la progenie segregante ser homocigota recesiva o heterocigota (no habrn homocigotas dominantes)
11) Es sencillo aplicar los sistemas arriba mencionados para mapeo en humanos? Por qu? Es posible
utilizar informacin de pedigr para hacer estudios de
ligamiento? Existen otros mtodos alternativos de
mapeo? En qu consiste el mtodo de mapeo con
hbridos somticos (fusin interespecfica de clulas)?
En qu consiste la hibridacin in situ?
R: No se pueden planificar cruzamientos en humanos, obtener lneas puras (depresin por endocra) y
las progenies son poco numerosas (estadsticamente
problemticas). El mapeo preciso y fino se realiza
mediante tcnicas fsicas como la utilizacin de hbridos somticos (libro). Lo que se utiliza es la informacin de pedigr con funciones de mapeo basadas en
Lod score. El ndice Lod score es la medida estadstica del ligamiento. Cuando las familias son numerosas
y se encuentran individuos recombinantes en ellas, el
anlisis es simple. Pero esto no siempre es as. Las
familias con enfermedades interesantes no suelen ser
numerosas, y no sirven para realizar un anlisis estadsticamente significativo. Por lo tanto, se deben
tomar los datos de varias familias. El lod score, Z, es
el logaritmo de la probabilidad de que dos loci estn
ligados respecto de que no lo estn. La probabilidad
general de ligamiento en un grupo de familias, es el
producto de las probabilidades de cada familia individual, por lo que los lods scores al ser logaritmos permiten que se sumen los datos para esas familias.
12) Qu significa ndice Lod o Lod score? En qu
casos se utiliza?Por qu en los ltimos aos prcticamente todos los estudios de mapeo gentico en todas las especies se realizan con marc. moleculares?
R: Probabilidad de ligamiento (ver Griffitts). El Lod
es el logaritmo en base 10 del cociente entre:
Probabilidad de obtener los datos observados si los
loci estuvieran ligados/ Probabilidad de obtener los
datos observados si no estuviesen ligados. Por ej. un

Lod = 3 para un par de genes indica que es mil veces

ms probable que los genes estn ligados respecto a
que no lo estn. Programas como el MapMaker tambin utiliza Lod Scores para comparar diferentes
rdenes posibles entre varios genes. Al orden ms
probable le asigna un 0 y a los restantes le asigna valores negativos.
Porque permiten una cobertura del genoma que no
permiten los caracteres morfolgicos.
13) Qu similitudes y diferencias existen entre los
clculos de distancias usando las frmulas vistas arriba y los algoritmos de programas como el Mapmaker?
R: Las frmulas son un distintas porque los algoritmos del Mapmaker estn basados en Lod score (clculo de probabilidades). Estos clculos probabilsticos
estn basados, sin embargo, en el mismo concepto y la
misma lgica que existe atrs de las funciones de mapeo en pruebas de dos o tres puntos. Sin embargo, son
ms poderosas, porque al tratarse de una prueba de
muchos puntos simultneamente, permite afinar
mucho ms el clculo minimizando errores debidos a
dobles entrecruzamientos e interferencias.

Problemas:
1) En el gusano de seda Bombix mori, el gen recesivo
l produce color amarillo limn en la larva, mientras
que el L da color blanco. El dominante B, produce
bandas negras transversales, mientras que el recesivo
b no las produce. Ambos loci estn ligados y su distancia gentica es de 30 unidades de recombinacin.
Se cruz una hembra homocigota blanca y con bandas
con un macho amarillo sin bandas negras. Los machos
de la F1 se utilizaron para fecundar hembras amarillas
y sin bandas negras. Qu segregacin fenotpica y
genotpica se obtuvo?
2) a) En Drosophila y para caracteres autosmicos,
cuando se quiere realizar un cruce de prueba se utilizan hembras heterocigotas y machos homocigotas recesivos. Por qu no se hace el cruzamiento recproco?
b) En D. melanogaster se encuentra un gen letal a que
produce, en homocigosis, la muerte de la larva, y est
ligado con un 40% de sobrecruzamiento al locus B/b.
El alelo B produce un abdomen deforme y el b un abdomen normal. Se pide la segregacin fenotpica y
genotpica observable en los adultos en un cruzamiento entre un macho heterocigota en fase de acoplamiento y una hembra heterocigota en fase de repulsin.
3) Una mosca de la fruta con genotipo B R/ b r es
retrocruzada con una de genotipo b r/ b r. En el 84%
de las meiosis no ocurren quiasmas entre los pares de
genes ligados; en el 16% ocurre un solo quiasma entre
ellos. Qu porcentaje de la progenie ser Bbrr? a)
50%; b) 4%; c) 84%; d) 25% ; e) 16%. Explique.
4) En Lathirus odoratus hay un locus que codifica
para el color de las flores: P = prpura, p = rosa, y
otro locus para la forma de la semilla: R = semilla
redonda, r = semilla alargada. En la polinizacin de
una planta, resultado del cruce de lneas puras prpura
redonda por rosa alargada, con otra descendiente del

13

cruce rosa redonda por prpura alargada, se obtuvieron los resultados indicados: PR=99, Pr=44, pR=44,
pr=3. Existe ligamiento entre ambos loci?
5) En la descendencia de un cruzamiento prueba de un
triheterocigota se obtuvieron los siguientes resultados:
Fenotipos
Frec. abs.
ABD
50
ABd
32
AbD
538
aBd
600
abD
28
abd
62
Se desea saber: a) la fase del genotipo parental;
b) el locus central; c) las distancias genticas;
d) el valor de la interferencia.
6) En los ovarios de plantas superiores se forman
ncleos haploides que resultan de una meiosis y sucesivas mitosis sin citocinesis, formando una clula multinucleada llamada gametofito femenino (el ncleo
masculino se fusiona con uno de estos ncleos, que
acta como vulo). En algunas conferas, el gametofito femenino puede ser bastante grande; este hecho
permite que pueda ser extrado y analizado electroforticamente. Un rbol de pino es heterocigota para
los alelos electroforticos "rpido" (r) y "lento" (l) de
las enzimas alcohol dehidrogenasa (AdhF/AdhS) y fosfoglucomutasa (PgmF/PgmS). Se estudi electroforticamente una muestra de 237 gametofitos femeninos y
se encontraron los siguientes fenotipos: 23 AdhF
PgmF, 24 AdhS PgmS, 93 AdhF PgmS y 97 AdhS PgmF.
a) Estn estos genes ligados?
b) Calcule la distancia entre los genes Adh y Pgm y en
qu fase estn. Otro gen que codifica para la enzima
esterasa (Est) tambin presenta dos alelos: EstF y EstS;
el mismo est ubicado entre los loci Adh y Pgm. De la
misma muestra antes estudiada se obtuvieron los siguientes resultados. Calcule la distancia:
AdhF EstF PgmF:
7
AdhS EstS PgmS:
10
AdhS EstF PgmS:
14
AdhF EstS PgmF:
16
1
AdhF EstS PgmS:
AdhS EstF PgmF:
1
F
F
S
Adh Est Pgm :
92
96
AdhS EstS PgmF:
Total
237
c) Coinciden las distancias calculadas para AdhPgm? Explique.
d) Cul es el coeficiente de coincidencia y la interferencia?
7) El padre del Sr. Spock, segundo oficial de la nave
Enterprise, proviene del planeta Vulcano y su madre
del planeta Tierra. Los vulcaneos tienen sus orejas
puntiagudas (P), ausencia de glndulas adrenales (A)
y el corazn del lado derecho (R). Todos estos alelos
son dominantes sobre los alelos terrqueos.
Estos genes son autosmicos y estn ligados, tal como
se muestra en el mapa de ligamiento:

P/p
A/a
R/r
_l___________l____________l__
l__15 um____l___20 um____l
Si el Sr. Spock se casa con una terrquea y no existe
interferencia (gnica), Qu proporcin de sus hijos
mostrarn:
a) Apariencia vulcanea para los tres caracteres?
b) Apariencia terrquea para los tres caracteres?
c) Orejas y corazn vulcaneos, pero adrenales terrqueas?
d) Orejas vulcaneas pero corazn y adrenales terrqueas?
9) Bridges y Morgan realizaron numerosos cruzamientos en Drosophila melanogaster. En cierto experimento cruzaron machos sin alas (apterous) con
hembras de cuerpo negro (black). En la F2 obtuvieron
186 individuos salvajes, 85 apterous, 99 black y ninguno con ambos caracteres. Qu se deduce de los
resultados obtenidos?. Razone la respuesta.
10) Un genetista quiere mapear los genes A, B, J, D y
E mediante dos cruzamientos de tres puntos. El primer cruzamiento lo realiza con lneas puras para los
cinco genes. Despus, el investigador cruza los individuos de la F1 con individuos homocigotas recesivos,
y el fenotipo de la descendencia es como sigue:
ABJDE
316
ABJdE
31
AbJdE
130
AbJDE
17
abJdE
314
abJDE
39
aBJDE
140
aBJdE
13
Las lneas puras utilizadas en el segundo cruzamiento
son las siguientes: AABBJJDDEE x aaBBjjDDee.
De nuevo, el investigador cruza los individuos de la
F1 con homocigotas recesivos, obteniendo los siguientes fenotipos: ABJDE 243; ABJDe 155; aBjDe
237; aBjDE 165; ABjDe 62; aBJDe 46; aBJDE 58;
ABjDE 34.
Por trabajos previos el investigador sabe que los genes
D y E tienen segregacin independiente entre s.
a) Elaborar el mapa correspondiente a estos 5 genes y
determinar, si es posible, la distancia entre ellos.
b) Existe interferencia?
Mapeo II
11) El gen de resistencia al virus del mosaico del tabaco se ha tratado de mapear en tomate respecto a
marcadores moleculares que detectan RFLP. Se supone que existe un alelo que confiere resistencia, dando
un fenotipo totalmente resistente en homocigosis, y un
fenotipo parcialmente resistente en heterocigosis.
Existe una variedad de Lycopersicum peruvianum (especie emparentada al tomate) totalmente resistente al
virus pero con otras caractersticas agronmicas indeseables; y otra que es totalmente susceptible al virus
pero potencialmente atractiva agronmicamente. Al
cruzar individuos de ambas variedades se obtuvieron
plantas hbridas F1, parcialmente resistentes. Se presentan los resultados de RFLP, para tres marcadores
moleculares diferentes, de los individuos parentales y
de 20 individuos originados por autofecundacin de la
F1 (F2), acompaados de los resultados fenotpicos

14

observados en los ensayos biolgicos con el virus: R

(totalmente resistente), P (parcialmente resistente) y S.
Fenotipo Padres 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Sonda R S P P R R P R R P R
--- --- --- --- --- --- --- --PTG9 ----- --- ----- ----- --- ------PCD3
----- --- --- --- --- --- --- --- ----------- --PXY ----- --- ----- --- ----Fenotipo 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Sonda R P P R S R S R S P R
--- --- --- --PTG9 --- --- --- --- --- --------- --- --- ----- --------- --PCD3
--- --- --- --------- ------- --- --- --- --- --PXY --- ----- ----- ----- ----a) Calcular el porcentaje de cosegregacin del gen de
resistencia junto a cada gen marcador e indicar cul de
estas 3 sondas (pTG9, pCD3, pXY) utilizara Ud. como marcador de RFLP para seguir la herencia del gen
de resistencia al virus en un proceso de mejoramiento
a travs de cruzamientos controlados.
b) Qu ventajas tendra usar el marcador elegido para
testar resistencia al virus, en lugar de hacer el ensayo
biolgico correspondiente?
c) Cuntas generaciones de retrocruza (contra la variedad susceptible) llevara, en promedio, tener una
variedad resistente al virus pero con un 99% del genoma de la variedad agronmicamente interesante?
d) Qu individuos F2 elegira para la primera retrocruza, para tratar de acortar el n de generaciones calculado en c)?
12) Para ciertas enfermedades no se cuenta an con
una sonda del gen implicado, sin embargo es posible
hacer el diagnstico por un mtodo indirecto. Siendo
requisito contar con marcadores polimrficos ligados
a la enfermedad.Indique el riesgo gentico (probabilidad de estar afectado) para los individuos en gestacin
(diagnstico prenatal) en el siguiente pedigr, en el
que se indican los fenotipos para el Sndrome de Marfan (enfermedad autosmica dominante) y un marcador situado a 10 cM del locus de la enfermedad (fenotipos A1; A1A2; A2).
A1A1

A1A2

A1A2

A2A2

A1A2 ?
A2A2
13) Antes que aparecieran los microsatlites, los
RFLP se utilizaron, en el pasado, como marcadores
genticos para la identificacin de parentesco. En ciertos casos, p.ej. verificacin del vnculo abuelo-nieto
en ausencia de los padres, este tipo de pruebas constituyen la nica evidencia vlida de que se dispone. El
siguiente problema representa una simplificacin de

su aplicacin a este tipo de cuestiones, que tomaron

importancia en la restitucin de hijos de personas desaparecidas por la ltima dictadura (1976-1983) a sus
legtimas familias. Existen seis nios de los cuales se
sabe con seguridad que slo tres pertenecen a dos familias que no guardan ninguna relacin entre s (son
de distintas ciudades). De ambas familias slo viven
los abuelos probables. Utilizando una sonda para un
gen con un alto polimorfismo para una enzima de restriccin (existen 4 alelos en la poblacin) se revelan
los Southern blots de ADN genmico de los seis nios
y de los posibles abuelos, que se muestran en el grfico:

a) Definir los haplotipos para cada individuo analizado. Cules nios pertenecen, con alta probabilidad, a
cada familia? Para cules esta experiencia no es suficiente para decidir a qu familia pertenecen? Cules,
con seguridad, no pertenecen a ninguna de las dos?
b) Cree Ud. que el hecho de no considerar la existencia de eventos de recombinacin (entre cromosomas
homlogos) dentro del gen marcador en las meiosis de
los abuelos y padres puede llevar a conclusiones errneas?
14) Una pareja afligida llega a Ud. para que le de asesoramiento gentico. Su segundo hijo falleci poco
despus de nacer debido a una enfermedad gentica y
la madre esta nuevamente embarazada. El hijo fallecido ha sido el segundo en la familia afectado por la
enfermedad (el primer afectado ha sido un hermano de
su abuela paterna). Ud. dispone, a travs de estrategias
de clonado, de una sonda de la regin cromosomal
donde se ubica el gen involucrado en esta enfermedad
autosmica recesiva. Usando esa sonda, pudo construir un mapa de restriccin de dicha regin, y
adems, obtuvo datos que muestran que, en la poblacin, existe polimorfismo para sitios reconocidos por

15

una enzima de restriccin E (indicado como +/- en la

figura).
Mapa de restriccion del gen que hibrida con la sonda:

Ud. aisl DNA de linfocitos de los abuelos y de los

miembros vivos de la familia y ha obtenido los correspondientes fragmentos de restriccin visualizados
en el esquema del Southern. Ud. est ahora en condiciones de hacer un diagnstico pre-natal a partir de
clulas fetales. Qu patrn de restriccin indicara
que el feto hered la enfermedad (dibjelo)?

15) Se lleva a cabo el anlisis de ADN en una familia

numerosa en la que algunos miembros estn afectados
por una enfermedad rara autosmica dominante de
manifestacin tarda (hacia los 40 aos). Se extrae el
ADN genmico de todos los miembros de la familia,
se digiere con HaeIII y los fragmentos obtenidos se
separan por tamao en un gel de agarosa. Mediante la
tcnica de Southern se transfieren dichos fragmentos a
una menbrana de nylon y se hibrida con una sonda
radiactiva procedente de un fragmento de ADN
humano de secuencia nica clonado de un vector bacteriano y se obtienen los resultados indicados en la
autorradiografa (ver debajo del pedigr).

Autoradiografa correspondiente
I1 I2 II1 II2 II3 II4 II5 II6 II7 II8 II9 II10 II11

4 kpb
3 kpb
1 kpb
Explique la variacin obtenida con la sonda dibujando
la regin cromosmica correspondiente.
a) Cmo se explica el tercer hijo?
b) Con qu probabilidad aparecer un individuo enfermo con el patrn de restriccin de la madre sana?
Tendran alguna utilidad estos resultados para aconsejar a las personas de esta familia?

16) El mosquito transmisor del dengue (Aedes aegypti) es una plaga endmica de climas tropicales, pero
que desde hace pocos aos est extendiendo su distribucin hacia Buenos Aires. Se encontr una variante
de mosquito que no transmite el temible virus. El
carcter se comport como dominante mostrando un
patrn de herencia mendeliana simple. Con el objeto
de introducir este carcter en la poblacin, comenzaron a realizarse cruzamientos. Como el carcter es
muy difcil de evaluar porque se requiere (para su anlisis) que el mosquito hembra pique huspedes infectados con el virus, se analizaron en cada generacin
los patrones de 50 microsatlites con el fin de determinar ligamiento entre alguno de ellos y el carcter de
resistencia. Slo uno de los marcadores (m25) mostr
ligamiento a este carcter y a una distancia de 5 cM.
Los patrones microsatlites observados cuando se utiliz este marcador en los genotipos homocigotas notransmisor y en el transmisor, respectivamente, fueron
como se ve en la figura. Si se cruzan las dos variantes
de mosquitos (no-transmiso-res x transmisores: generacin F0) se obtienen individuos heterocigotas con
fenotipo no transmisor (F1).
a) Qu patrones de micro- Tam. Trans NO
satlites y fenotipos de mole- misor trans
misor
transmisin
y
no- cular
transmisin presentarn los
descendientes de una F1 258 pb
cruzada por la lnea parental
transmisora? y
236 pb
b) en qu proporciones?
c) Como se explic ms arriba, para la determinacin
de los fenotipos slo se pueden utilizar las hembras.
Cmo hara si quiere evaluar a los machos de la retrocruza? Qu cruzamientos hara y qu resultados
esperara?.
17) Se desea hallar un marcador molecular asociado al
locus que determina resistencia al barrenador del tallo
(Diatraea saccharalis) en maz para utilizarlo en seleccin indirecta. Por esta razn se analiz el patrn
de bandas generado por 5 RAPD utilizando una poblacin de 23 lneas recombinantes endocriados provenientes de un cruzamiento entre un padre resistente
por otro sensible al ataque del insecto.
RESISTENTES
SENSIBLES
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 23

A
B
C=
= = = = == ==
===
D

E
a) Qu marcadores son polimrficos?
b) Qu marcadores estn ligados al locus?
c) Calcule la distancia gentica.
d) Indique qu marcadores NO estn ligados al locus.
e) Indique el/los marcadores para los que, con estos
datos, no puede afirmar que estn ligados (o no).
18) Se realiz el anlisis de ADN de una familia numerosa en la cual ocurrieron casos de una enfermedad

16

autosmica dominante letal de manifestacin tarda

(alrededor de los 40 aos). El mtodo aplicado fue el
del anlisis de segregacin de RFLP utilizando la sonda denominada T4. A continuacin se muestra un esquema del autorradiograma de los individuos analizados alineado con la genealoga correspondiente. Los
individuos afectados se representan con smbolo lleno.

a. Proponga los genotipos ms probables para el

sndrome y el marcador molecular para cada individuo
de la genealoga
b. De acuerdo con estos resultados, se podra suponer
ligamiento entre el marcador molecular y la enfermedad? Justifique su respuesta.
c. Si un investigador demuestra que el lod score entre estos dos caracteres (bandas y enfermedad) es mayor que 3, cmo explicara la ocurrencia de un enfermo que presentara slo la banda de 5kb?
d. Si otro integrante de la familia de 20 aos de edad
quisiera saber el riesgo de tener la enfermedad qu
estudio le hara y cmo interpretara los resultados?
e. Cuando se analizaron lneas celulares hbridas hombre-ratn se obtuvieron los siguientes resultados para
la sonda T4 y tres productos metablicos A, B y C.
Indique en los casos en que sea posible la ubicacin
cromosmica de la secuencia homloga a la sonda T4
y los productos A, B y C.
Ln Crom. human. present.
A T4 B C
cel 2 3 4 5 6 7 8 9
23 + + + + - - - ? - + - +
34 + + - - + + - ? + - +
41 + - + - + - + ? + + - +

4. ALTERACIONES CROMOSMICAS
Bibliografa recomendada
Griffiths y col. Captulos:
17- Chromosome mutation I: Changes in chromosome
structure; 18- Chromosome mutation II: Changes in
chromosome number
Lacadena, J.R. Gentica General. Conceptos fundamentales. (1999) Editorial Sntesis S.A., Madrid.
13- Variaciones cromosmicas estructurales
14- Variaciones cromosmicas numricas
Gua de estudio
1) Porqu las hemoglobinas humanas constituyen un
ejemplo acerca del papel evolutivo de las duplicaciones?
2) Cundo se dice que las inversiones son supresoras
o reductoras de la recombinacin. Nos referimos:
a) Al mecanismo citolgico o a su consecuencia
gentica?
b) A homocigotas o a heterocigotas estructurales?

c) A la zona invertida o al cromosoma completo?

d) A las inversiones paracntricas o a las pericntricas?
3) Enumere las dos caractersticas que considere ms
importantes en las inversiones paracntricas y en las
translocaciones recprocas.
4) En un heterocigoto estructural para translocacin
recproca, podra originarse algn gameto viable a
partir de los productos meiticos originados en una
meiosis con orientacin adyacente?
5) Los grupos de ligamiento se mantienen constantes
en cada especie?
6) El nmero diploide de un organismo es 2n= 12.
Cuntos cromosomas tendr: a) un monosmico. b)
un dismico.c) un tetrasmico d) un doble trismico.
e) un nulismico.f) un haploide. g) un triploide.h) un
autotetraploide.
7) Cul es la diferencia fundamental entre la aneuploida y la euploida?
8) Indique las diferencias entre auto y alopoliploides.
9) Debido al pequeo tamao del cromosoma IV de
Drosophila melanogaster, las moscas pueden ser monosmicas o trismicas para este cromosoma y continuar siendo viables.
a) Si una mosca dismica para el cromosoma 4 y
homocigota para el gen recesivo eyeless de dicho
cromosoma se aparea con una mosca monosmica
para este cromosoma pero normal, cul ser el aspecto de la F1?
b) Cules seran las proporciones fenotpicas que se
obtendran al cruzar los distintos fenotipos de la F1?
Problemas
1) En una seccin de cromosomas salivales de Drosophila las bandas tienen una secuencia 123.45678. El
homlogo con el que este cromosoma debe aparearse
tiene una secuencia:
a)123.45876; b)123.445678; c)123.478; d)14.325678;
e) 1234.45678; f) 124.35678.
Qu clase de cambios cromosmicos han ocurrido en
cada caso?
2) En el cromosoma X de D. melanogaster se observa
la regin 7B constituda por 12 bandas. El carcter
quetas chamuscadas se debe a la mutacin recesiva
sn situada en el cromosoma X, efectiva en hemicigosis. Cruzando machos de quetas chamuscadas con
hembras de fenotipo normal, pero heterocigticas,
para diferentes deleciones que abarcan varios segmentos de la zona 7B del cromosoma X, se obtuvieron los
resultados que figuran en la tabla:
Hembra Delecin
Fenotipo de las hembras de la
descendencia
1
7B1-7B8
50% con quetas chamus cadas
y 50% normales
2
7B2-7B5
Todas con quetas norma les
3
7B7-7B12
Todas con quetas norma les
4
7B5-7B10
50% con quetas chamus cadas
y 50% normales

17

Teniendo en cuenta que todas las deleciones estudiadas son letales en homocigosis y hemicigosis, y que
las hembras utilizadas en los cruzamientos eran hijas
de machos de fenotipo normal, deduzca cul es la posicin del locus sn en el mapa de cromosomas politnicos.
3) En la descendencia de un cruzamiento entre una
hembra normal de Drosophila y un macho, white (w)Bar (B), Bridges observ que una hembra no haba
heredado el carcter Bar del padre, pero era heterocigota para el carcter white. A esta hembra se la retrocruz con un macho w B, y las proporciones que se
obtuvieron en la descendencia fueron dos hembras a
un macho.
a) Cul es la explicacin ms simple de estas proporciones anormales?
b) Cul es el fenotipo de la descendencia?
Se cruzaron las hembras heterocigotas estructurales de
la descendencia con distintos machos que eran hemicigotas para los mutantes rudimentary (r), forked (f) o
fused (fu), que estn cercanos a Bar ( como lo muestra
el siguiente mapa):
1.1
55.1 56.5
57
59.5
__l_____________l______l______l______l___
w
r
f
B
fu
En los cruzamientos con machos forked se observaron
en F1 hembras forked; sin embargo, de los cruzamientos con machos r o fu no se obtuvieron hembras r ni
fu, respectivamente.
c) Cmo explicara estos resultados?
4) En un cromosoma de Drosophila persimilis se han
reconocido citolgicamente 8 regiones denominadas
a,b,c,d,e,f,g,h. Dentro de estas especies 4 razas diferentes tienen el siguiente orden cromosmico:
a) a h b d c f e g. b) a e d c f b h g. c) a h b d g e f c
d) a e f c d b h g.
Suponiendo que cada raza evolucion por una inversin paracntrica simple a partir de otra raza, muestre
cmo pudo haberse originado cada una.
5) En un heterocigota estructural para una inversin
paracntrica, un cromosoma tiene una ordenacin
12.3456789 y su homlogo 12.3765489.
a) En un meiocito se produce un entrecruzamiento en
la regin 4-5, durante paquitene qu se observara en
anafase I?
b) Cmo se observara la anafase I de otro meiocito
en el que se produce un entrecruzamiento en la regin
6-7?
c) En cul de los dos meiocitos ser mayor el tamao
del fragmento formado en Anafase I?
6) En cierta especie de Drosophila, que tiene los
cromosomas telocntricos, se conocen los loci A,a,
que est muy prximo al centrmero, B,b situado a 30
cM del anterior y C,c a 15 cM de B,b y a 45 cM de
Aa. Un macho de fenotipo normal capturado en el
campo se cruz con una hembra, perteneciente a una
poblacin de laboratorio, que es normal en todos los

aspectos, salvo recesiva para los tres caracteres antedichos. Toda la descendencia del cruzamiento fue de
fenotipo dominante. Cuando las hembras de este cruzamiento se sometieron a un cruzamiento de prueba
con machos de la poblacin de laboratorio se obtuvo
la siguiente descendencia:
Fenotipo
Nmero de individuos
ABC
4250
Abc
490
aBC
510
abc
4480
a) Explique por qu aparecen slo cuatro fenotipos.
b) De los datos de la tabla se deduce que la fraccin
de recombinacin entre A,a y B,b es 0,1. Cmo se
puede explicar esta discrepancia con los datos del
enunciado?
7) En hembras de D. melanogaster heterocigotas para
las siguientes 3 mutaciones: Bristle (Bl), mutacin
dominante ubicada en el cromosoma 2; Dichaete (D),
mutacin dominante ubicada en el cromosoma 3, y
eyeless (ey), mutacin recesiva ubicada en el cromosoma 4, fueron cruzados individualmente con machos
homocigotas para ey. La mayora de los cruzamientos
producen las 8 clases fenotpicas esperadas:
Bl D ey+; Bl D ey; Bl D+ ey+; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+
D+ ey+; Bl+ D+ ey; Bl+ D ey
Seis hembras produjeron un nmero limitado de fenotipos que es el siguiente:
a) Bl D ey+; Bl D ey; Bl+ D+ ey+; Bl+ D+ ey.
b) Bl D ey; Bl D+ ey+; Bl+ D ey; Bl+ D+ ey+
c) Bl D ey; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D+ ey+.
d) Bl D+ ey+; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D ey.
e) Bl D ey+; Bl D+ ey; Bl+ D ey+; Bl+ D+ ey.
f) Bl D ey+; Bl D+ ey+; Bl+ D ey; Bl+ D+ ey.
Para cada una de estas hembras d la explicacin ms
simple de la causa que pudo restringir el nmero de
fenotipos de la descendencia (considere que los
quiasmas son terminales).
8) En el cultivar de centeno Ails (2n=14), que presenta polimorfismo para translocaciones recprocas, se
cruz una planta heterocigota para una translocacin,
que a su vez era heterocigota para 4 loci distintos
(AaBbCcDd), por una planta homocigota estructural
para la ordenacin normal, que tambin era homocigota recesiva para los 4 loci.
Los resultados obtenidos en este cruzamiento se indican en la tabla:
Configuracin meitica en metafase I
de los descendientes
Loci
5 II + 1 IV
7 II
.
A,a
Aa:50 aa: 9
Aa: 7 aa:57
B,b
Bb:33 bb:26
Bb:31 bb:33
C,c
Cc:59 cc: 0
Cc: 0 cc:64
D,d
Dd:30 dd:29
Dd:32 dd:32
a) Indique si alguno de los loci se comporta como ligado a la translocacin.
b) Cmo explica la ausencia de individuos cc con 5
II y 1 IV, y la de individuos Cc con 7 II?

18

9) Suponga que est esttudiando la citogentica

c
d cinde
co especies ntimamentte relacionaddas de Drosoophila.
La figura de
d abajo mueestra el ordenn de los gennes (las
letras indican genes quue son idntticos en las cinco
especies) y los grupos de
d cromosom
mas que se enncuentran en cadaa especie.

1+
+

a) Expliquee de qu moddo, probablem

mente, estas espee
cies evoluciionaron una a partir de ottra, esquemaatizando los cambbios ocurridoos en cada paaso. (Nota: assegrese de que comparar el orden de loss genes con cuidac
do).
b) Esquemaatice una celuula en paquittene y otra anafase
a
I de una hembra hbrida obtennida a parttir del
cruzamientoo de un maacho de la especie
e
a poor una
hembra de la especie c.. (Considere solamente los dos
pares mayoores, y la form
macin de un
u solo quiassma en
cada bivalennte).
10) Tratanddo de localiizar (mapearr) en una especie
e
autgama (22n= 7x) el loocus correspondiente a una
u pareja allica A,a, se cruuza un indivviduo de geenotipo
recesivo poor los 7 trism
micos de unna variedad de genotipo dom
minante, obteenindose una
u
F1 com
mpuesta
por individuuos de 14 y 15 cromosom
mas. Al autoofecundar estos lltimos (los de
d 15 cromossomas) se obbtuvieron los ressultados quee figuran en la tabla. E
En qu
cromosomaa est el loccus consideraado? Justifiqque su
respuesta
Trismicoos
cromosomaa 1
cromosomaa 2
cromosomaa 3
cromosomaa 4
cromosomaa 5
cromosomaa 6
cromosomaa 7

2n
n=26. Los hbbridos entre estas especies muestran los
sig
guientes arregglos cromosmicos duran
nte la meiosiis:
HIIBRIDO
C
Configuraciin meittica
een metafasee I
G. hirsutum x G. thurberi 13 II pequeoss + 13 I grandees
G.h
hirsutum x G.herbaceum 13 II grandes + 13 I pequeoos
G.tthurberi x G.hherbaceum 13 I grandes + 13 I pequeos

Nota: II bivalentees, I univalenntes

a) Cmo podrra interpretaar estos resultados desdee un
pu
unto de vista filogentico??
b) Cmo poddra probar qque su interp
pretacin es correecta?.
13) Existen seiis especies pprincipales del gnero Brrassicca al que perrtenece la collza (y la can
nola): B. cariinata, B. campestrris, B. nigraa, B. oleracea
a, B. juncea,, B.
nap
pus. Las relaaciones entree las especiees pueden deeducirrse a partir dee la tabla:
a) Deduzca el nmero de ccromosomass de B. camppestriss, B. nigra y B. oleracea.
Especie
E
o hbrrido F1 Crom
mosomasBivalentesUnivalenntes
B. carinata
34
17
7
0
B. napus
38
19
9
0
B. juncea
j
36
18
8
0
B. juncea
j
x B. niigra
26
8
10
B.n
napus xB.camppestris
29
10
0
9
B.ccarinataxB.oleeracea
26
9
8
B. juncea
j
x B.oleeracea
27
0
27
BcarinataxB.cam
mpestris
27
0
27
B. napus x B. niggra
27
0
27

b) Algunas dee las especiess mencionadas son poliplo

oides ? Cules?
c) En caso afirrmativo seaale las especiies progenitooras
de cada una dee las especiess poliploides..
d) Explique meediante cruzaamientos com
mo se originaaron
n las especies poliploidess.

5. GENM
MICA Y P
POSTGEN
NMICA
A

Fenotipoo de la descenndencia obteniida por

autofecuundacin de loos trismicos de
d la F1
A
a
140
45
73
24
115
40
405
130
700
20
95
34
208
70

11) La zarrzamora eurropea (Rubuss idaeus) tieene 14

cromosomaas. Otro tipoo de mora (R
Rubus caesiius) es
tetraploide con 28. Loss hbridos enntre estas esspecies
son individduos F1 estrriles. Algunaas gametas que
q no
han reduciddo sus cromoosomas en la F1 son funciionales
en las cruzzas retrgraddas. Determ
mine el nmeero de
cromosomaas y el nivel de
d ploida paara cada uno de los
siguientes casos:
c
a) F1; b) Retrocruuza con ambbos padres.
12) Las esppecies de alggodn del Nuevo
N
Mundoo Gossypium hirssutum tienen 2n=52. Las especies dell Viejo
Mundo: G. thurberi y G.herbaceuum tiene cadda una

Gu
ua de estud
dio
1) Para qu siirven los marrcadores gen
nticos (moleecularres y no moleeculares)?
R: Para mapeaar. Existen distintos mto
odos de mappeo:
fsico y gentiico. Los mappas fsicos se
s construyeen a
parrtir de la seecuenciacin del ADN y otras tcniicas

19

moleculares, como el mapeo con enzimas de restriccin (como se vio en la gua 1 Biologa Molecular-)
usando o no Southern blot, la hibridacin in situ, la
alineacin de insertos genmicos clonados en BAC y
YAC, caminatas cromosmicas, comparacin sintnica de genomas filogenticamente relacionados, etc.
Los mapas genticos se construyen a partir de anlisis
de ligamiento en poblaciones segregantes posteriores
a la recombinacin y sumando distancias entre loci
sucesivos lo ms prximos posibles (ver gua 7 de
mapeo). Ambos mapas no coinciden en cuanto a las
unidades utilizadas (nmero de nucletidos o pares de
bases versus unidades de recombinacin) ni en las
distancias relativas (las frecuencias de recombinacin
no son parejas a lo largo de todo el cromosoma), pero
s en el orden de los marcadores.
2) Compare el uso de marcadores genticos moleculares, bioqumicos y morfolgicos.
R: Su uso para mapeo gentico es similar, salvo cuando los marcadores morfolgicos estn determinados
por ms de un locus (epstasis) o son de distribucin
continua (cuantitativos). Pero an en estos casos
existen formas de utilizarlos que se vern en otras guas. Los marcadores morfolgicos pueden verse influidos por el ambiente, el momento de desarrollo, el
rgano y otros factores. A menos que se conozca su
base molecular (secuencia nucleotdica) no pueden ser
usados para mapeo fsico (salvo que sean marcadores
citogenticos = morfologa cromosmica). Los marcadores bioqumicos (fundamentalmente patrones de
electroforesis de protenas e isozimas), tienen particularidades intermedias.
3) En qu medida los marcadores moleculares permiten relacionar los mapas genticos con los mapas fsicos?
R: Porque se puede relacionar su localizacin gentica con su hibridacin y mapeo fsico en clones genmicos alineados de BACs y YACs. Una serie de clones solapados se denomina contig. Para formar el contig, se emplean secuencias cortas y nicas presentes
en los insertos clonados como si fueran marcas distintivas (por ejemplo, un sitio de restriccin en el contexto de la secuencia nucleotdica de un gen que se puede
revelar mediante un RFLP). Esas marcas especficas
se denominan STS (sequence-tagged sites). Es decir
que un RFLP determinado puede ser un STS. Debido
a lo tedioso y poco automatizable de la tcnica de
RFLP; como usualmente se conoce la secuencia nucleotdica, se la convierte en una tcnica basada en
PCR llamada CAPS. Como estos mismos RFLP
(CAPS) pueden mapearse poblaciones segregantes,
esto permite superponer el mapa gentico con el mapa
fsico.
4) Cmo clasificara de acuerdo a la metodologa a
las distintas tcnicas conducentes a obtener marcadores genticos moleculares (RFLP, AFLP, RAPD, SSR,
SNP). Haga una comparacin entre ellas.
R: Los RFLP fueron los primeros marcadores de ADN
en ser utilizados. Surgen de comparar los patrones de

restriccin de Southern blot entre distintos individuos,

especies, etc. observando diferencias (polimorfismos)
en sitios de corte. Debido a que se basan en la hibridacin molecular lo que permite el reconocimiento entre
secuencias que no son totalmente homlogas, se los
considera marcadores relativamente conservados que
permiten comparaciones evolutivas entre especies,
gneros y familias relacionados (dependiendo de la
secuencia, se puede progresar en la escala taxonmica
hasta ms arriba). Se continan usando en estudios de
sintenia (mapeo comparativo). Como contrapartida,
resulta ms complicado encontrar variabilidad (polimorfismos informativos) intraespecficos para hacer,
por ejemplo, genotipificacin (identificacin a nivel
de individuo o fingerprinting).
Hoy en da, los RFLPs han sido desplazados en gran
medida por los SNPs (polimorfismo de nucletido
simple nico-, se pronuncia SNiP). Los SNP no tienen una nica metodologa como los RFLP sino varias, aunque todas ellas requieren de PCR en alguno
de sus pasos. Cualquier tcnica que permite visualizar
un cambio en un nucletido se clasifica como SNP.
Como ejemplo ya se mencion a los CAPs que implican la amplificacin y posterior digestin del producto
de PCR con una enzima de restriccin (aquel que fuera responsable del polimorfismo en el RFLP). Hoy en
da, los polimorfismos a detectar son identificados a
partir de estudios previos de secuenciaciones genmicas ms que de RFLP. No todos los SNPs requieren
restriccin. Otra tcnica bastante clsica clasificada
como SNP es la SSCP que consiste en desnaturalizar
el ADN y diferenciar electroforticamente las diferencias de migracin de los plegamientos secundarios
intracatenarios derivados del cambio nucleotdico.
Estos marcadores ofrecen varias ventajas respecto de
los RFLP: a) existe mayor nmero de alelos en la poblacin (en humanos se stima que hay un SNP cada
1000 pb) y b) el grado de heterocigosis es alto, con lo
que resultan ser ms informativos. Comparten con los
RFLP la ventaja de no ser annimos (se conoce su
identidad secuencia, pertenencia a un gen, por ej.-) y
su codominancia (posibilidad de diferenciar heterocigotas de homocigotas).
Los otros marcadores de mayor utilizacin (junto con
los SNPs) son los microsatlites o SSR (single sequence repeats) estn constituidos por un motivo (secuencia corta de ADN) de repeticin en tndem de di-,
tri y tetranucletidos. La repeticin ms comn es la
del dinucletido CA en animales y TA en vegetales.
Aqu lo que vara no es un nico nucletido, sino el
nmero de veces en que se repite el motivo de repeticin, lo que es detectado como productos de amplificacin que poseen tamaos que varan segn la cantidad de repeticiones. Son los marcadores ms utilizados para genotipificacin (tambin llamado genotipado o fingerprinting).
Los RAPDs (randomly amplified polymorphic DNA,
se pronuncia RAPiD) son marcadores moleculares que
surgen luego de utilizar un nico oligonucletido ini-

20

ciador (primer) en la reaccin de PCR. Son polimorfismos para fragmentos de ADN amplificados al azar
del genoma, obtenindose una serie de bandas de distintos tamaos segn donde se haya pegado ese primer. Este conjunto de bandas sirve como una huella
de ADN que puede emplearse para caracterizar a un
individuo. Se dice que es al azar pues se utilizan primers que no se sabe en qu lugar del genoma hibridan. Por eso se dice que son annimos porque se desconoce la secuencia y (salvo mapeo especfico) su
localizacin cromosmica. Como son oligonucletidos de 10 bases, en general pegan en varias regiones
del genoma, por lo que al correr el producto de la PCR
en geles de agarosa, generalmente se observan varios
fragmentos, que miden hasta 2 kpb. Otra desventaja es
que son marcadores dominantes (no se puede diferenciar al heterocigota del homocigota) y problemas de
reproducibilidad. Su mayores ventajas son los costos y
la posibilidad de usarlos con cualquier genoma de
cualquier especie aunque se desconozca absolutamente todo de su secuencia genmica. Al igual que los
RFLPs, se los puede mejorar secuenciando y convirtiendo en marcadores de PCR especfica (en este caso
se llaman SCARs). Los AFLP representan una sofisticacin ms reproducible que combina restriccin con
endonucleasas y amplificacin selectiva por PCR. Si
bien comparte desventajas y ventajas con los RAPD
(son dominantes y annimos, no requieren de informacin genmica previa), son ms costosos pero su
mayor costo se ve compensado por la generacin de
muchas ms bandas polimrficas por corrida (data
points) y mayor reproducibilidad.
RFLP
AFLP
RAPD
SSR
SNP

restriccin PCR hibridacindominantes codominan.

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+
+

4) Cul es el origen de la variacin genmica (mutaciones) detectada por cada una de ellas y cul es su
magnitud?
RFLP
AFLP
RAPD
SSR
SNP

sustitucin INDELHiper AltaConservado

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-

Aclaraciones: sustituciones: cambio de nucletidos,

INDELs: Inserciones o DELeciones, Hiper: hipervariables (altsima tasa de mutacin/evolucin, mximo
polimorfismo), Alta: variacin, Conservado (particularmente cuando afecta secuencias funcionales codificantes)
5) Suponiendo que en un genoma dado las 4 bases
posibles se encuentran representadas en forma similar
y totalmente al azar (contenido de GC = 50% uniformemente distribuido a lo largo del genoma):
a) Cul es la distancia promedio esperable entre sitios de restriccin para enzimas que reconocen especi-

ficidades de secuencia de 6 pares de bases, como

EcoRI? y para una de 4 o de 8 pb?
b) Cuntos sitios de restriccin y, por lo tanto, bandas de DNA en un gel, se generaran en un genoma
humano (109 pb), bacteriano (106 pb), o mitocondrial
humano (104 pb) se generaran con EcoRI?
c) Cuntas bandas generaran los RAPD que usualmente se hacen con decmeros y se detectan por
PCR?
R: a) Un sitio de restriccin de 6 bases aparecer, como promedio, una vez cada 46 bases, es decir 4.096
pb. Una de 4 ser cada 44 pb = 256 pb, uno de 8 pb
ser de una cada 65.536 pb.
b) 109 dividido por 4x103 = 250.000 bandas o sitios
para el genoma humano; 250 para una bacteria y entre
2 y 3 para el genoma mitocondrial.
c) Por un lado debemos considerar que los sitios complementarios a los primers tienen que ser perfectos
(los 10 nucletidos tienen que ser perfectamente complementarios, lo que no es necesariamente cierto). Por
lo tanto la distancia se podra calcular como para los
sitios de restriccin 410 = 1.048.576. En un genoma
humano habra 1000 sitios, en uno bacteriano, uno
slo. De todos modos, para que haya bandas se requieren 2 condiciones adicionales: que las orientaciones estn invertidas y apuntando hacia adentro entre
primers vecinos (se reduce a un cuarto = 250 y la distancia media aumenta a 4 millones) y que la distancia
sea menor a los 4000 pb porque la Taq polimerasa
deja de funcionar eficientemente ms all de este tamao. La probabilidad de que 2 sitios distintos estn
en una posicin arbitraria es de uno en 410 x 410 = 42x10
= 1.099.511.627.776 ~ 1012. Sabiendo que las distancias para una amplificacin detectable varan entre un
poco menos de 100 y aproximadamente 2500-2600
pb, la probabilidad de encontrar 2 secuencias en alguno de esos nucletidos es 44-2x10 x 2500 = 10-12 x
2,5.103 = 2,5 x 10-9, lo que significa que espero encontrar entre 2 y 3 bandas por genoma de organismo superior por primer, es decir que de las 250 bandas potenciales, slo el 1% est a la distancia necesaria para
dar bandas amplificables. Sin embargo, el nmero de
bandas observadas es mayor, debido a que no es requerida una complementaridad de bases perfecta en
las condiciones de anillado de los primers.
6) Qu ventajas tendra el usar enzimas que son sensibles (no cortan) a la metilacin de citosinas en el
sitio de restriccin (como es el caso de PstI) y que
ocurren con enorme frecuencia en el DNA heterocromatinizado de organismos eucariticos?
R: Si lo que se busca es clonar genes transcripcionalmente activos este comportamiento es una ventaja
porque slo se clonara aquello que es digerido por la
enzima. El DNA metilado dara fragmentos demasiado grandes para ser detectado o clonado (el DNA de
muy alto peso molecular se transfiere pobremente a
filtros en los Southerns y por su tamao no puede ser
clonado eficientemente en los vectores ms comunes,
entre otras razones). Tambin serviran para diferen-

21

ciar alelos epigenticos (como los que estn en el

cromosoma X en mujeres) o diferencias de estados del
gen entre tejidos expresantes (hipometilados) versus
silenciados (hipermetilados).
7) En qu consiste el clonado posicional y el "caminado cromosmico"? Para qu se utiliza?
Clonado posicional: El clonado posicional se utiliza
cuando no se dispone de otra informacin del gen que
se desea clonar ms que su posicin cromosmica relativa respecto a un marcador molecular. La idea es
poder disponer en el mismo inserto clonado en un
vector, tanto el gen deseado como la secuencia del
marcador molecular o en algn otro vector de secuencia vecina contigua (contig). Este tipo de clonados
fueron posibles a partir de la aparicin de vectores que
permiten clonar segmentos de ADN grandes (200.000
bases hasta 1.000.000 de bases) como los BAC y
YAC.
Caminado cromosmico: Los extremos de un fragmento clonado se usan como sondas para seleccionar
otros clones de la genoteca. Estas sondas detectan
clones de regiones del ADN que se superponen con el
clon inicial Se aisla un pequeo segmento de ADN de
un extremo del material, se inserta en el primer clon y
se lo usa como sonda para volver a rastrear la genoteca en busca de un clon que contenga ese segmento y
la secuencia contigua del genoma. Con el segundo
clon se puede obtener un tercero, y as sucesivamente,
hasta tener un conjunto de segmentos clonados que se
solapan. Permite el clonado posicional. Es decir, conociendo la localizacin del gen y disponiendo de uno
vecino clonado, se puede aprovechar esta vecindad
para as clonarlo.
8) Cmo se encara un proyecto genmico? Por
dnde se empieza? Qu tipo de vectores de clonado
son los ms habitualmente usados?
R: Como no se puede secuenciar sobre los cromosomas (la longitud de ADN es muy larga y el ADN est
mezclado) lo primero que debo hacer es segmentarlo en fragmentos manejables por las actuales tcnicas
moleculares. Esto se hace en 2 etapas: primero se clona en vectores que permiten insertos grandes (BAC y
YAC) y a stos ltimos se los subclona en vectores
con insertos ms pequeos (fagos y plsmidos). Ahora
bien, al segmentar un genoma pierdo el ordenamiento
lineal que tena el ADN en el cromosoma por lo que
tengo que organizar los clones en grupos de contigs y
as rearmar el ordenamiento perdido. Esto se logra
mediante mapeo fsico y gentico por lo que, en realidad, todo proyecto genmico comienza siendo un
proyecto de mapeo.
9) Qu es el transcriptoma y los EST? Cmo se
construyen y para qu sirven?
R: Como el procedimiento arriba descripto es largo,
laborioso y a veces econmicamente inviable, se procede paralelamente (o exclusivamente) por otra va
que aporta, adems herramientas que son necesarias
para el mapeo. En este procedimiento se privilegia la
secuenciacin de lo que ms interesa y que son los

genes. Como los genes (a diferencia de las secuencias

intergnicas no codificantes) se transcriben, una forma
es armar clonotecas de ADNc de distintos tejidos y en
distintas situaciones ambientales y fisiolgicas y secuenciarlas en forma grosera y masiva. De esta manera se obtiene una coleccin de secuencias representativas del transcriptoma denominadas EST (expressed
sequence tags o secuencias expresadas) de las cuales
se desconoce mayormente su funcin. En muchos casos, esta funcin puede deducirse en base a la homologa de las secuencias con las de genes caracterizados
en otras especies mediante bsqueda y comparacin
con las bases de datos de los bancos de genes. Estos
ESTs pueden usarse para el diseo de micromatrices
(chips de ADN) y para mapeo por RFLP/SNP y servir
como marcas ancladas (STS).
10) A qu se llama genmica funcional y anlisis de
proteoma? En este contexto para qu se usa el etiquetado mediante transposones o transposon-tagging?
Qu son las micromatrices o microarrays y chips de
DNA? Para qu se usan? Qu tcnicas para la caracterizacin de interacciones protena-protena conoce?
R: La genmica funcional es la rama de la genmica
que estudia la funcin molecular asociada a las secuencias expresadas descriptas por los proyectos
genmicos. Estos estudios comprenden tanto estudios
predictivos in silico por comparacin de una secuencia incgnita con secuencias depositas en bases
de datos como la corroboracin de su funcin molecular a travs de distintas estrategias. Estas estrategias
incluyen estudios de complementacin gnica por sobre expresin o silenciamiento de secuencias incognitas, la asociacin de determinado fenotipo con mutantes inducidas tanto por mutagenesis qumica como por
transposon tagging. Esta ltima estrategia permite
utilizar secuencias conocidas correspondientes a
transposones que interrumpen genes de inters como
etiquetas para asilar estos genes. En la ltima dcada
la genmica funcional ha contado con el desarrollo de
micromatrics de ADN o chips que son soportes slidos que incluyen un elevado numero de secuencias
correspondientes a un organismo, pudiendo estar representado el transcriptoma completo de una especie
para estudios de expresin concertada en disitntas estadios de desarrollo, distintas condiciones de crecimiento, respuestas a estreses biticos u abiticos, etc.
La protemica estudia el conjunto de proteinas presentes en determinadas condiciones de desarrollo y/o
crecimiento en los sitemas biolgicos de interes, permitiendo la determinacin de las secuencias primarias
as como de su possible estructura e interaccin con
otras protenas a travs de sistemas de estudios de interaccin protena-protena como el sitema doble
hibrido en levaduras.
Problemas:
1) El famoso detective Sherlock Molecularis se encuentra investigando un asesinato. La pista determinante del caso es una mancha de semen encontrada en
la ropa de la vctima, de la que pudo extraerse DNA,

22

el cual se someti
s
a coorte por una enzima de restricr
cin apropiiada y posterior electrofforesis, cuyoo Southern blot see analiz porr hibridacinn con el fagoo M13
(sonda de Jeffreys,
J
Natuure 314 [19885]: 67-72). En un
carril paraleelo se corri, en idnticaas condicionees, una
muestra de DNA de liinfocitos dell sospechosoo Jack
Destripadorrius. En la figgura se muesstra el resultaado de
la corresponndiente autorrradiografa:
I.- Si Ud. fuera
f
Watsoon (no James), cul de las siguientes afiirmaciones creera
c
correccta para asessorar a
Sherlock?:
a) Jack es presumiblem
mente culpabble porque laa sonda
hibrida tantto con el DN
NA de la maancha como con el
de Jack. La diferencia enn el patrn de
d bandas se debe a
que el sem
men contienee gametas y estas refleejan la
constitucinn haploide. Para
P
confirm
mar la culpabbilidad
habra que repetir el annlisis con una
u muestra de semen de Jackk.
b) Jack noo es culpablee porque los patrones sonn diferentes a peesar de que ambos DNA
As hibridan con la
sonda y com
mparten buenna parte del patrn
p
de banndas.
c) El presuunto culpable pas a ser el hermano prfugo de Jackk (con anteccedentes polliciales) porqque el
patrn de bandas de Jacck no coincidde, pero las bandas
b
comunes (aaproximadam
mente la mitad
m
de toddas las
bandas) haccen sospechaar de l. Se requiere, siin embargo, un annlisis del DNA
D
del joveen escurridizzo para
confirmar esta hiptesiss.
II.- Dado que
q estas secuencias son tan hipervarriables
(muy polim
mrficas), se supone
s
que la
l tasa de muutacin
(creacin de
d nuevos alelos por el mecanismo de recombinacin desiguaal o porr deslizam
mientoresbalamiennto de la DN
NA polimeraasa) en gameetas es
considerable (se calculaa un = 0,0001). Cree Ud.
U que
se puede ussar este tipo de anlisis para
p
tests de paternidad?
III.- Qu % de bandass coincidentees se esperarra encontrar, com
mparando loss patrones dee bandas de perso:
nas relacionnadas por loss siguientes parentezcos?
p
- madre e hijo
- abuelo y nieto
- to y sobbrino
2) Mediantee hibridacinn in situ, se pudieron localizar
5 YACs dee DNA humaano (YAC-A
A a YAC-E) en
e una
regin crom
mosmica detterminada deel genoma huumano
y se desea hacer un mapa
m
fsico de
d alineamiennto de
dichos clonnes (mapa dee contigs). Los 5 clones fueron
evaluados mediante
m
hibridacin conn 3 STS (sequuencetagged sitees o sitios de secuenncia indicaddora
marcadora-)).
Para obteneer los STS, se
s digiri DN
NA con una enzima
e
de restriccin y se connstruy una genoteca enn fago
lambda conn los fragmenntos resultanntes. Se anallizaron
varios de loos clones de esta genoteca mediantee hibridacin conn DNA genmico
YAC
humano, descartando
d
todos STS
S A B C D E
aquellos cloones que hibrida- 1
+ + + - ban con DN
NA repetitivvo. De 2
- + + + aquellos quue hibridaban con
3
+ + - - +

seccuencias niicas, se selecccio

onaron 3, loos cuales sse
hib
bridaron conn los YAC
Cs
obtenindose los
l siguientees
ressultados:
a) Por qu no se trat dde
hacer Southerrns con loos
YA
AC y realizaar un mapeo
por restriccinn de esta maanerra? Porqu no hibridaar
dirrectamente loos YAC entrre
s, evitando reecurrir a unna
sub
bgenoteca enn fago lambbda de los mism
mos? Por qqu se descaartaron aquelllos
clo
ones de la geenoteca en faago lambda que no hibriidaban
n con secuenncias nicas??
b) Dibuje un mapa
m
fsico con la alineeacin de loos 3
ST
TS y ordene (en paralelo) el mapa dee contigs de los
YA
ACs.
3) La levaduraa fue la prim
mera de las esspecies eucarriticas que fue totalmente
t
seecuenciada y constituye un
sisstema modello de investtigacin deb
bido al tamaao
rellativamente chico de su genoma y el
e nmero taambin relativam
mente chico dde genes. See sabe que hay
h
~6
6000 genes codificantes ppara protenaas, de los cuaales
hay
y 2400 para los que no sse tiene ni id
dea de qu funf
ci
n cumplen. Uno de los temas que siempre
s
conccit
intters es el prroceso de essporulacin (que
(
en levaadurass est asociaado a la meeiosis). La misma
m
se puede
con
ntrolar y sinccronizar conn relativa sen
ncillez ya quee se
inccuban levaduuras diploiddes en un medio
m
con deficieencia de niitrgeno, lo que dispara la meiosisesp
porulacin. La
L misma oocurre en 3 fases
f
bien diferen
nciadas. La I o tempranaa, en la que se abandonaa el
esttado vegetattivo para paasar al esporrulado. La II
I o
meedia, coincidde con la meiiosis I. La IIII o media-tarrda
coincide con laa meiosis II. Previamentte a la apariccin
de los arregloos de DNA (DNA array
ys) o chips de
DN
NA, se habaan identificaado, mediantte los cada vez
v
ms obsoletos Northern bllots unos 250
0 mRNAs. Con
C
la llegada de los chips, eel nmero caambi drstiicac 1998, Sccience 282:6
699). Se preppar
meente (Chu y col.
mR
RNA total dee cada una de las fases y se hibrid conc
traa las secuenccias de los 6000 genes. Se
S identificaaron
256 genes quee se activan especficam
mente durantee la
fasse I. En la grran mayora de ellos se identific
i
la secuencia: 5GG
GCGCC3 a 6600 pb del nucletido
n
1 del
gen
n, en direccin 5.
a) Qu le sugiere este ressultado?
Se identificaroon 158 geness adicionaless especficoss de
la fase II, de loos cuales, ell 70% tienen
n otra secuenncia
con
nsenso denoominada M
MSE. Adems, aparecieeron
otrros 61 geness especficoss de la fase III.
I Finalmennte,
un
na observacin curiosa fuue que 600 genes
g
que se encon
ntraron activvos en la fasee vegetativa no pudieron ser
dettectados duraante todo el pproceso de esporulacin.
e
.
b) Tendr algn inters eeste ltimo dato?
d

23

c) Podr hacer
h
una esttimacin de qu proporccin de
los genees est impliicado, directta o indirectaamente
con el proceso
p
de essporulacin?
d) A qu se dedica el resto de los 6000 genes??
4) Pas sin llamar muchho la atencin una pelcuula estrenada hacce unos
llamada
aos
GATTACA
A (que
no debe su nombre
a una gatta muy
agresiva sinno a una
secuencia nucleotdica y a la vez
nombre de un centro de viajees al espacio del futuro
cercano). Se
S trata
de un tpicoo thriller
con ambieente de
ciencia-ficccin que
se plantea un
u escenario futurro muy
inquietante (ms
detalles
en:http://ww
ww.spe.sony.com/Picturees/SonyMviees/mov
ies/Gattaca//home.html).. Gracias a la tecnologga del
genoma hum
mano, se poddr predecir con
c bastantee precisin las proobabilidades de morir, por
p ejemplo, de un
ataque carddaco antes de los 30 aoos. Hasta aquu nada
nuevo que no hayan deestacado toddos los diariios comentando las posibilidaades de la ciiencia real a partir
de la secuenciacin dell genoma huumano. La pelcula
avan-za en otro aspecto que es la poosibilidad de planificar la com
mposicin genntica (a-leloos) de los hi--jos de
una pareja. No lo hacee en un senttido tan decllaradad ojos
mente fasciista (que todos sean arios, rubios y de
azules estiloo Los nios de Brasil)), sino tratanndo de
evitar los alelos
a
de la llamada
l
cargga gentica (alelos
que predispponen a enfe
fermedades coronarias,
c
c
cncer,
neurolgicaas, etc.). No se
s trata de cclonar un Hitler
H
o
un premio Nbel,
N
sino de
d elegir entrre los futuros hijos
posibles dissponibles, los mejores alelos
a
del padre
p
y
la madre deel futuro hijjo/a, sin desspreciar los clsicos color de
d ojos, coefi
ficiente inteleectual o alturra.
a) Le pareece que esto sea factible en la cienciaa real?
Si Ud. fueraa un cientficco convenciddo de las bonndades
de liberar a la especie humana de su carga genntica,
basndose en
e las tcniccas que apreendi sobre clonacin e ingenniera gentica en animaales (que no es
e este
caso) Cm
mo diseara un sistema de anlisis de
d este
tipo?
b) Si bien en
e una parte de la pelcuula, en menoos de 5
minutos puueden generaar un largo diploma
d
con la secuencia nuccleotdica de una muestraa sacada de un pelo, an en el mejor esscenario futuuro (en el sentido
s
cientfico), no se podrn secuenciarr los 30.000 genes
humanos paara una apliccacin masiva como la menciom
nada Qu tipo de maarcadores moleculares
m
t
tendra

qu
ue utilizar parra esta detecccin? Podr detectar toodas
lass mutacioness posibles? D
Discuta este punto.
p
c) Despus de resolver el ltimo probllema de la gua
g
de mutaciones le parece qque librar a laa humanidadd de
tod
dos los aleloos deletreoss es un objeetivo alcanzaable
po
or mejoramiiento?
Para
P
premiaar la planifficacin gen
ntica familiaar,
la sociedad dee GATTACA
A se divide en
e 2 clases bien
b
diferenciadas. Aquellos que fueron planificaddos
tieenen acceso a los mejoores empleoss, mientras que
q
aq
quellos que son hijos ddel azar so
on considerados
in
nvlidos o de-gen-eraados y slo pueden ser barreenderos o tenner profesionnes mal pagaas. En la pelcula, una familiaa tiene 2 heermanos (uno
o de cada cclasee). El hermaano no planifficado genticamente innferio
or logra enngaar al sisstema y acceeder a un buuen
em
mpleo aproveechando la ccomplicidad de una persoona
g
genticamentte calificada que le da muestras
m
de tejit
do
o (de su DNA
A, bah). Toddo va bien haasta que se prop
du
uce un asesinnato y.... no le vamos a contar la paarte
su
ustanciosa dee la pelculaa. El tema es
e que hay una
u
cchica linda (ni
( ms ni m
menos que Um
mma Thurm
man)
qu
ue se enamorra del muchaacho que, si bien ser geenticamente infeerior, es tam
mbin tan bueno
b
y linndo!
Bu
ueno, la chicca lleva peloos a una em
mpresa que, por
pocos dlares, le analiza ((por computaadora) la hueella
dig
gital gentica de identiddad del muchachito (obvviameente tiene suus dudas y nno es cuesti
n de juntar sus
aleelos con un desconocido)
d
).
d) Es esto poosible? Qu tcnicas utilizara para poderr hacer una cosa as? (noo estamos haablando de prep
dissposicin a enfermedades
e
s, sino de ideentidad).
5) Mgy y coolaboradoress (Genome Biology,
B
20002)
pu
ublicaron un trabajo de iidentificacin
n de ESTs (se(
cuencias transccriptas) espeecficamentee expresadas en
el corazn. Enntre los ESTss identificados encontrarron:
NA
ADH dehidrogenasa, ubiiquinona, miosinas, troopomiiosina y actinna (involucraados en la co
ontraccin musm
cular), coliginaa (interactaa con el colgeno cardacco),
13 no mostraroon poseer fuunciones relaacionadas (haasta
estte trabajo) con
c el corazn y 11 no tenan funccin
alg
guna conocidda. Adems, 5 de ellos (TG114,
(
TG
G13,
TG
G131, TG1332_7, TG78)) fueron rellacionados prep
viaamente con problemas
p
caardacos. Es decir, la enffermeedad se relacciona con la malfuncin de los mism
mos.
Laa figura muesstra la topolooga de la reg
gin regulatooria
en el extremo 5
5 de 17 prom
motores de genes
g
cardaccos.
Fig
gura CAAT
T, GC, TAT
TA y CAP son secuenccias
con
nsenso relacionadas a la unin de la RNA polimeerasa II. Otros mootivos llamaados TRANS
SFAC y MEM
ME
se representan como puntaas de flecha. Los cuadrados
osccuros (GKLF
F) representaan sitios de unin
u
de un facf
torr de transcripcin pareciido al Krpp
pel de Drossophilla. Similarm
mente, (Tcf111 _Rora, TC
Cf11_API_C)) se
rep
presentan otrros motivos nnucleotdicoss identificadoos.
a) Qu son y qu funcinn cumplen estas
e
secuenccias
en la regin 5 no codificannte de estos genes?
g

24

b) Porqu algunas secuencias estn en la mayora de

los genes y otros no? Es esta una muestra representativa?
c) Dado que a esta altura est totalmente secuenciado
el genoma humano porqu estos investigadores utilizaron esta metodologa ms antigua para poder
identificar genes cardacos? Es decir, porqu no les
alcanz esa informacin previa? Se podran haber
utilizado chips (microarreglos de DNA)?
d) Encuentra alguna relacin entre unin de factores
de transcripcin y patologas cardacas? Cul? Podra proponer a uno (o varios) gen/es sospechoso/s a la
lista?
e) Con estos datos limitados podra proponer una
hiptesis de explicacin molecular de las patologas
cardacas?
f) Cmo confirmara sus hiptesis de la relacin establecida en el punto d y e a nivel funcional? Recuerde que, por razones de tica (hacia nuestra especie)
todos los experimentos se hacen con ratones
6) P36 es una protena de 36 kDa de Mycobacterium
tuberculosis cuya funcin fue asociada a los mecanismos de virulencia del bacilo. La ahora Licenciada
Laura Klepp estudi durante su trabajo de tesis de Licenciatura, la interaccin de dicha protena con el proteoma micobacteriano empleando un sistema de doble
hbrido en bacterias basado en la induccin, mediada
por cAMP del opern lactosa via protena CAP. El
sistema se basa en la expresin, por un lado, del dominio T25 de la adenilato ciclasa y por otro lado, del
dominio T18. Cuando estos dominios estn separados,
no se detecta actividad de adenilato ciclasa. En cambio cuando se produce una interaccin protenaprotena que las acerca fsicamente, se recompone dicha actividad. Se clon el gen P36 en el plsmido

pKT25 (anzuelo codifica el dominio T25) y tambin

se construy una genoteca de M. tuberculosis en el
plsmido pUT18C (codifica el dominio T18 en fusin
con el gen de la protena a pescar). Para ello, lo
primero que se llev a cabo fue la amplificacin del
gen P36 por PCR.
a) El oligonucletido 5 fue diseado de manera que
se respete el marco de lectura del fragmento codificante para T25 presente en el sitio de clonado Por
qu?
b) Luego de llevada a cabo la ligacin y la transformacin, los clones positivos se identificaron en la placa por presentar color blanco en presencia de IPTG
(anlogo de la lactosa) y X-Gal (sustrato incoloro de
la -galactosidasa y que se convierte en un producto
azul). Qu hubiera significado que fueran colonias
azules?
c) Ya obtenido y caracterizado el anzuelo, vino la
parte de la protena a pescar: se subclonaron fragmentos producidos al azar del genoma de M. tuberculosis
en pUT18C. Los plsmidos recombinantes se introdujeron, junto con los que contienen secuencias del gen
para P36, en clulas competentes de E. coli por cotransfeccin y se obtuvieron clones positivos. Cmo
identificaron aquellos clones en los que las protenas
derivadas de P36 se reconocieron y unieron con otras
expresadas en el vector pUT18C?
d) Las secuencias con capacidad de unin pudieron
ser asignadas a 2 genes ya secuenciados (Rv1417 y
Rv2617) de funcin desconocida, pero que posiblemente sean protenas de membrana y transmembrana.
Cmo se hizo para asignar las secuencias a estos 2
genes? Cmo hara para investigar la funcin de estas secuencias nuevas?
e) El plmido pKT25 (donde se clon el anzuelo
tiene un gen de resistencia a neomicina, mientras que
el pUT18C (donde van insertos los potenciales pescados) tiene un gen de resistencia a ampicilina. Por
qu esta diferencia?
f) Cmo es el genotipo de las E. coli que se utilizan
para este tipo de experimentos en cuanto al gen de la
adenilato ciclasa? Ac+ o Ac-? Por qu? Qu hubiera pasado si E. coli expresaba algn gen propio muy
similar a Rv1417, Rv2617 o P36?
g) Cmo fue la composicin del medio de seleccin?
mnimo o rico (conteniendo glucosa)?

6. REGULACION DE LA EXPRESION GENETICA

Bibliografa: Repaso de IBMyC, Biol. Molec. Clula, Watson y col. (2a Ed.) y Genes VIII, B. Lewin
cmo el DNA poda codificar una protena y desde el
Gua terica:
1) Cul es el concepto moderno o molecular de gen? descubrimiento de los intrones y el splicing (particuHacer un esquema de un gen eucaritico tpico, sea- larmente el transplicing y el splicing alternativo) y la
lar qu parte se transcribe como mRNA y qu parte se edicin de RNA rompieron la idea de la unidad y conexpresa como protena. Comparar con un gen proca- tinuidad transcripcional.
Definicin funcionalista de gen:
ritico.
R: La respuesta tpica sera que es una secuencia de Unidades hereditarias que se transmiten de una geneDNA codificante para una protena. Sin embargo, racin a otra en forma uniforme y predecible conteesta definicin estructuralista se acota a un perodo de niendo informacin decodificable sobre estructuras y
tiempo determinado entre mediados de los 50 y los funciones.
80. Entre Mendel y Watson y Crick no se conoca

25

Definicin detallada de gen (combinacin de estructura y funcin)

Unidad de informacin (fsicamente constituida por
un cido nucleico, DNA o RNA, que puede estar particionado, superpuesto con otros genes o no) codificante para una unidad de funcin (polipptido o
RNA, por ej. ribosomal). Propiedades: tienen capacidad de variar (mutar, recombinar, es decir evolucionar) y de tener una dinmica poblacional (comportamiento frente a la seleccin natural o artificial) dentro
del contexto de especies biolgicas. Tienen capacidad
de almacenamiento y reproduccin fidedigna de la
informacin, as como su decodificacin.
Los esquemas de los genes en los libros suelen tener
varios errores conceptuales. Por ejemplo: en el esquema que sigue, no se explicita que, as como hay un
promotor, existe tambin un terminador. Faltara incorporar los enhancers (que s aparecen en otros libros).
Estructura de un gen eucariota:

le esquematizar (en el opern lac) un segundo operador que es el sitio de unin (reconocimiento) de la
protena CAP, que servira para que el opern lac
constituyera un ejemplo de regulacin negativa (represor) y positiva (activador CAP). No se suele esquematizar tampoco el promotor del gen I, ni los terminadores de transcripcin correspondientes y otras
secuencias no codificantes importantes del futuro
mensajero (por ej. la secuencia de unin a ribosomas
llamada Shine Dalgarno), los codones de iniciacin
(que muchos estudiantes suelen confundir con el nucletido +1) y los codones de terminacin de lectura.

2)
Qu mecanismos moleculares co y posttranscripcionales conoce que sean capaces de producir
una sustancial modificacin en la secuencia de un
transcripto primario? Describa los 4 tipos de procesamiento (splicing). Describa la edicin del RNA.
R: El procesamiento del ARN genera un ARNm maduro (para genes que codifican para protenas) o
ARNr a partir del transcripto primario. El capping
(agregado de una metilguanosina en el extremo 5), la
poliadenilacin (agregado de una cola de poli A en el
extremo 3), el splicing (remocin de intrones) son
ejemplos de modificacin co-transcripcional, mientras
que el editing (cambio de bases) y el NMD (nonsense
mediated decay) son ejemplos de mecanismos de modificacin post-transcripcional. Mediante sileciamiento post-transcripcional (o interferencia o quelling)
tambin se produce degradacin o inactivacin especfica de ARNs. Otro mecanismo muy utilizado en
bacterias es la utilizacin de aptmeros (secuencias
complementarias
de ARN ubicadas en la regin 5no
En el caso de genes procariotas, la situacin es ms
codificante
del
ARNm)
que, segn el tipo de plegacompleja dado que los genes individuales pueden
miento
secundario,
pueden
inducir terminacin temcompartir sus secuencias regulatorias con otros genes
prana
de
la
transcripcin
(atenuacin)
o el autoclivaje
formando operones (no siempre, el gen I del represor
del
ARN
mediante
ribozimas
autocatalticas.
del opern lactosa no conforma un opern sino que se
parece, en este sentido a los genes eucariticos). De- Muchos transcriptos sufren splicing alternativo, remobido a esto, en los libros se suele encontrar esquemas cin de intrones y unin de los exones de un gen.
de operones y no de genes individuales (ej. opern lac Como consecuencia de esta modificacin cotranscripcional se producen diferentes secuencias de
formado por los genes Z,Y,A, ver abajo).
ARNm que codifican distintas formas de protenas los
P
I
O
Z
Y
A
P
cuales sern tejido especficas.
Otro mecanismo de procesamiento es el ARN editing.
En este proceso la informacin contenida en una
molcula de ARN se ve alterada. Se trata de mecanismos que incluyen deaminaciones de C a U y de A a
I, y tambin inserciones y deleciones. Afecta ARNt,
Transcripcin
ARNr y ARNm. En este ltimo caso, se ve afectada la
En estos esquemas se suele incluir, adems de los 3 secuencia aminoacdica de la protena, de manera que
genes que conforman el opern, el gen del factor de la misma difiere de lo que se puede predecir a partir
transcripcin (I = represor) que est fsicamente liga- de la secuencia de nucletidos en la molcula de
do a 5 del opern, pero no a otros genes reguladores ADN. Se da mayormente en eucariotas y se relaciona
igualmente importantes (como el que codifica a la con la presencia de variantes de protenas segn el
protena CAPCRP- en el caso operon lac). No se sue- tejido.

26

La degradacin mediada por mutaciones terminadoras

o nonsense mediated decay (NMD), es un proceso de
eliminacin de ARNm portadores de una mutacin
terminadora o de una mutacin del marco de lectura
que derivan en la creacin de codones de finalizacin
precoz de la sntesis de una protena. De no eliminarse
estos ARNm se produciran polipptidos defectuosos
o incompletos al ser traducidos. Estos poliptidos
pueden retener parte de su funcin (por ejemplo actividad enzimtica o capacidad de unirse a otra protena) pero no toda (por ejemplo se puede perder la regulacin de la actividad enzimtica o la capacidad de
unirse a otra protena). Por lo tanto si se produjeran
estos poliptidos, estas mutaciones podran resultar
dominantes. Al eliminarse estos transcriptos por NMD
muchas de estas mutaciones sern recesivas.
3) A travs de qu mecanismos un mismo gen puede
producir varias protenas distintas?
R: Por un lado se pueden producir distintos mRNAs
por los siguientes mecanismos:
-Splicing alternativo
-Poliadenilacin alternativa: un mismo gen puede tener ms de un sitio de poliadenilacin y dependiendo
de las situaciones fisiolgicas, tejidos, etc. se puede
utilizar uno u otro sito. De esta forma se puede producir, a partir de un mismo gen, protenas con distintos
extremos C-terminales. Esto sucede en el caso de los
genes de las inmunoglobulinas y de esta forma se regula si las mismas sern secretadas o formarn un receptor de membrana.
-Promotores alternativos: Puede haber ms de un sitio
de inicio de la transcripcin y cada promotor dar un
exn 1 diferente. De esta forma se pueden producir
protenas con distinto extremo N-terminal. Adems
cada promotor puede tener una regulacin diferente.
Por otro lado, a partir de una protena traducida se
pueden producir distintas variantes por modificacin
post-traduccional: fosforilacin, glicosidacin, clivaje
especfico, acilacin, etc.
4) A travs de qu mecanismos se pueden regular los
niveles de una determinada protena?
R: -Estado de condensacin de la cromatina
-Regulacin de la transcripcin
-Transporte del mRNA al citoplasma
-NMD (en caso de haber un STOP prematuro)
-Estabilidad del mensajero: Es tan importante encender rpido un gen cuando se necesita su producto como apagarlo cuando ya no se lo necesita. Existen protenas que se unen generalmente a la regin 3 no codificante del mRNA que regulan positiva o negativamente la vida media del mensajero. Tambin se puede
regular por microRNAs.
-Traducibilidad del mensajero: en algunas situaciones
fisiolgicas o ante infecciones virales se favorece o
desfavorece la traduccin de algunos mensajeros.
-Estabilidad de la protena: Algunas protenas son
rpidamente degradadas luego de ser producidas. Este
mecanismo tambin puede ser regulado.

5) Cul es la diferencia entre un opern, que codifica

para un mensajero policistrnico, y un gen que codifica para una poliprotena? En qu tipo de organismos
se presenta cada uno de estos mecanismos?
R: Un opern es una unidad transcripcional compuesta por una zona regulatoria de la transcripcin y una
serie de genes ubicados hacia 3 de dicha zona promotora-reguladora. Este segmento de ADN u opern se
transcribe como un todo y a partir del mensajero policistrnico, se producen varias protenas, cada una a
partir de su propio codn de iniciacin, como el caso
del opern lactosa en bacterias. Un gen que codifica
para una poliprotena es un gen cuyo producto se clivar post traduccionalmente para producir mltiples
pptidos. Los primeros son tpicos de los procariotas y
los segundos de los eucariotas (virus eucariotas, precursores de neuropptidos, etc.).
6) Qu es un nucleosoma? Qu protenas participan?
R: Un nucleosoma es la unidad fundamental de empaquetamiento del ADN. Consiste en un core central
de ocho protenas bsicas llamadas histonas que se
ubican alrededor de un segmento de ADN superenrrollado de 146 pb.
7) Cmo influyen los distintos rdenes de empaquetamiento del ADN en la expresin gentica? Cmo
vara el grado de empaquetamiento durante el ciclo
celular? Cmo resulta la susceptibilidad de corte por
DNAasa I en cromatina transcripcionalmente activa
con respecto a la inactiva?
R: Durante la mitosis, los cromosomas se condensan
y son transcripcionalmente inactivos. Sin embargo,
durante la interfase, la mayora de las fibras de cromatina se descondensan. Este material se denomina eucromatina, la cual contiene zonas transcripcionalmente activas con regiones de ADN no transcribibles. Es
decir que la condensacin de la cromatina se asocia a
la prdida de la expresin gnica. La DNAsa I corta
secuencias de ADN doble cadena. Si a las mismas se
le unen factores de transcripcin, existe una proteccin a la digestin con la enzima ya que estas protenas ocultan el sitio de corte de la DNAsa I.
8) Cmo influye la metilacin de las citosinas sobre
la expresin gentica en eucariotas? Comparar el grado de metilacin de la heterocromatina en relacin
con el resto del genoma.
R: La metilacin del ADN se relaciona con una represin de la transcripcin. La heterocromatina es cromatina altamente condensada a lo largo de todo el ciclo
celular, a diferencia de la eucromatina que se condensa en metafase. Existen dos clases de heterocromatina,
la facultativa, que puede ser genticamente activa o
inactiva, y la constitutiva que permanece siempre en
estado inactivo.
9) Qu es un gen reportero? Para qu se utilizan?
Mencione algunos ejemplos.
R: Los genes reporteros son secuencias que codifican
para protenas de simple deteccin. Adems deben
estar ausentes en la especie que se estudia para descar-

27

tar una posible actividad endgena. Se utilizan para

reemplazar productos gnicos difciles de medir y poder, entonces, determinar la actividad promotora.
Algunos ejemplos son:
-Luciferasa: Oxida a la luciferina emitiendo fotones
los cuales son cuantificados en un luminmetro
-GFP: Protena verde fluorescente de medusa
-CAT: Cloranfenicol acetil-transferasa
--galactosidasa: hidroliza un sustrato incoloro
(ONPG) para dar un producto amarillo
-SEAP: fosfatasa alcalina
10) Indique las caractersticas moleculares distintivas
de los diferentes tipos de factores de transcripcin
eucariotas.
R: Los factores de transcripcin reconocen y unen
una secuencia de nucletidos corta, como resultado de
una complementariedad entre la superficie de la protena y la regin de la doble hlice en la zona del binding. En eucariotas, estos factores presentan un dominio de unin al ADN y otro de activacin. El de binding presenta un motivo estructural de -hlices y as
se une al ADN. Los ms comunes son: cierres de leucina, hlice- vuelta- hlice y dedos de zinc.
11) a.- Describir el efecto de la regulacin de la transcripcin en procariotas en los siguientes casos:
I- Opern lactosa por el represor.
II- Opern lactosa por CRP (o CAP)-AMPc.
III- Opern triptofano por el represor.
b. Qu utilidad tiene para la bacteria que la lactosa
sea un inductor de su opern y en cambio el triptofano
sea un co-represor del suyo?
c. Qu diferencias funcionales existen entre los represores bacterianos y los factores de transcripcin
eucariticos? y entre un operador y un enhansn (secuencia de unin de un factor de transcripcin localizado en un enhancer o en un promotor)?
R: a) I- El represor del opern lac reprime la expresin del opern ya que se pega a la zona operadora
impidiendo que la ARNpol inicie la transcripcin.
Slo cuando en el medio haya ligando, en este caso,
lactosa, habr transcripcin del opern por remocin
del represor. Se trata de un mecanismo de regulacin
negativa.
II- En el caso del opern lactosa, la protena CAP
(tambin llamada CRP) coopera en la expresin del
opern. Normalmente, la ARNpol se pega muy
dbilmente a la zona promotora. Pero si adems se
une la protena CAP en posicin 5 del promotor, se
ve un aumento de los niveles de transcripcin. Se trata
de un mecanismo de regulacin positiva. La protena
CAP se une al ADN si en el medio existe AMPc. Los
niveles de AMPc se elevan cuando no existe en el
medio otra fuente de carbono como la glucosa que
ejerce lo que se conoce como represin catablica,
inhibiendo (indirectamente) la transcripcin del
opern lac.
III- En el caso del opern triptofano, un set de cinco
genes adyacentes codifican las enzimas necesarias
para la sntesis del aminocido. Existe un represor que

se pega al ADN junto con el triptofano. Se trata de un

mecanismo de regulacin negativa, ya que al igual
que el opern lac, el binding de la protena regulatoria
suprime la transcripcin.
b) Que no se sintetice triptofano cuando haya trp en el
medio, y que se induzca la sntesis de -galactosidasa cuando hay lactosa en el medio para
aprovecharla como fuente de carbono y energa.
c) Ninguna y ninguna. Distintos nombres para igual
funcin.
12) Qu son los elementos genticos reguladores (de
la transcripcin) en cis y en trans? Describirlos para:
a) el opern lactosa.
b) un gen eucaritico como el que codifica actina.
c) el gen de una protena eucaritica inducida por una
hormona esteroidea.
R: Existen elementos genticos que modulan la transcripcin desde una dada posicin en el genoma (en
cis), mientras que otros producen elementos difusibles
como protenas que se unen a otras zonas del ADN
(actan en trans).
a) cis: operador, sitio de unin (binding de CAP) y
promotor. trans: represor y CAP.
b) Cis: enhancers y promotor, trans: factores de transcripcin que actuan sobre el promotor del gen.
c) Cis y trans: idem actina y la hormona que se une a
una zona determinada del ADN despus de unirse a
un receptor soluble intracelular (que es, a su vez, factor de transcripcin).
13) Cmo explica que las mutaciones que generan
codones STOP prematuros sean dominantes si ocurren
en el ltimo exn de un gen de globina, mientras que
son recesivas si ocurren en los primeros exones?
R: Los mRNAs con codones de terminacin prematuros que ocurren en los primeros exones son eliminados por nonsense-mediated decay. Si los individuos
son heterocigotas para dicha mutacin y la dosis gnica del alelo salvaje es suficiente para mantener la funcin biolgica, entonces los individuos sern sanos y
por ende la mutacin recesiva. En cambio mutaciones
en el ltimo exn no son eliminadas por NMD y el
producto de dicho alelo puede tener un efecto dominante negativo interfiriendo con la funcin del alelo
salvaje, resultando en una enfermedad dominante.
14) Qu son las ribozimas, los ribointerruptores y los
aptmeros?
R: Las ribozimas son enzimas cuya composicin
qumica es ARN (en vez de protena). Tambin existen desoribosimas (de ADN). En forma natural se las
descubri en el proceso de splicing autocataltico de
intrones de mitocondrias del protozoo Tetrahymena.
En este caso se trata de una ribonucleasa especfica de
secuencia pero existen otras actividades naturales y
sintticas. Los ribointerruptores (riboswitches) son
secuencias de ARN que determinan la finalizacin de
una transcripcin de un ARNm o un splicing a travs
de secuencias que son parte del ARN llamadas aptmeros (que tienen la posibilidad de formar estructuras
internas de doble cadena por su complementaridad de

28

secuencia). Estas estructuras secundarias se ven afectadas porque la propiedad de inters de estos aptmeros es que tienen una afinidad muy fuerte de unin a
un metabolito regulador (parecido al de una enzima
por su sustrato), cuya presencia modifica el patrn de
plegamiento del ARN desencadenando su degradacin
por una ribozima o por terminacin temprana de
transcripcin porque esta estructura secundaria acta
como terminador informando a la transcriptasa que
debe detener la transcripcin.
15) Qu relacin existe entre los cromosomas politnicos de Drosophila con la resistencia a metotrexato en fibroblastos?
R: En ambos casos se produce gran amplificacin de
ADN, programada a nivel de desarrollo y afectando
cientos de genes en el primer caso y como respuesta al
antibitico localizada en el gen de la dihidro folato
reductasa (DHFR) en el segundo.
16) El mapa del opern lac es: I P-O Z Y A
El promotor (P) es el sitio donde se une la RNA polimerasa antes de comenzar la sntesis de mRNA. El
operador (O) es donde se une el represor (en ausencia
de inductor) codificado por el gen I. Dados los genotipos de los siguientes diploides parciales, completar la
siguiente tabla con "+" si espera actividad de la protena codificada por "Z" (-galactosidasa) y de la codificada por "Y" (permeasa) o con "-" si no espera
actividad. Considere que las mutaciones indicadas por
"-" impiden:
que las correspondientes regiones no codificantes
del opern se unan al ligando especfico.
que las correspondientes regiones codificantes del
opern puedan originar por traduccin una protena
biolgicamente activa.
Is: gen del represor con una mutacin que origina una
protena incapaz de unirse al inductor (pero su capacidad de unirse al operador est intacta).
Genotipo
I+ P+ O+ Z+ Y+/I+ P+ O+ Z+ Y+
I- P+ O- Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+
I+ P- O- Z- Y+/I- P+ O- Z+ YIs P+ O+ Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+
Is P+ O+ Z+ Y+/I- P+ O+ Z+ Y+
I- P+ O- Z+ Y-/I- P+ O+ Z- Y+
I- P- O+ Z+ Y+/I- P+ O- Z+ YI+ P+ O+ Z- Y+/I- P+ O+ Z+ Y-

galac- Permeasa
tosidasa
+lac -lac -lac +lac

R:
galac- Permeasa
tosidasa
Genotipo
+lac -lac -lac +lac
I+ P+ O+ Z+ Y+/I+ P+ O+ Z+ Y+ +
+
I- P+ O- Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+
+
+
+
I+ P- O- Z- Y+/I- P+ O- Z+ Y+
+
Is P+ O+ Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+
Is P+ O+ Z+ Y+/I- P+ O+ Z+ Y+
I- P+ O- Z+ Y-/I- P+ O+ Z- Y+
+
+
+
+
I- P- O+ Z+ Y+/I- P+ O- Z+ Y+
+
I+ P+ O+ Z- Y+/I- P+ O+ Z+ Y+
+

Problemas:
1) La figura muestra la estructura de un plsmido. El
gen R del fago lambda codifica un represor que reprime la transcripcin de ciertos genes del fago controlados por el promotor/operador PL; pero en este
caso, R tiene una mutacin tal que la protena codificada resulta termosensible: reprime a 30C, pero no
reprime a 42C porque su estructura 3-D se altera dramticamente. El gen R lleva su
R
PL
propio promotor PRM que, a
los efectos de este problema,
PRT Zrev
consideraremos constitutivo.
El gen Zrev contiene la secuencia codificante de la gal de E.coli en orientacin antisentido con respecto a
su promotor: PL. Con este plsmido se transforman
mutantes de E.coli con distintas caractersticas genotpicas, las cuales se detallan en la tabla. Completar con
+ o con "-", segn si espera o no actividad enzimtica.
pls
Actividad -gal
mi30 C
42 C
do s/IPTG c/IPTG s/IPTG c/IPTG
I-P+O+Z+
S
I+P-O+Z+
No
I-P+O-Z+
S
I+P+O-ZS
IsP+O+ZNo
I-P+O+Z+/ I+P+O+Z- S
Para aquellos casos en los que indic que no hay actividad de -gal, indique adems, para cada uno, si se
debe a:
I- inhibicin de la transcripcin
II- inhibicin de la traduccin
III- Produccin de una -gal inactiva
genotipo

genotipo

pls
mido

I-P+O+Z+
I+P-O+Z+
I-P+O-Z+
I+P+O-ZIsP+O+ZI-P+O+Z+/ I+P+O+Z-

Si
No
Si
Si
No
Si

Actividad -gal
30 C
42 C
s/IP c/IP s/IP c/IP
TG TG TG TG
+
+
II
I
+
+
II
- 30CIII/42CII
42C I
+
- 30CI/42CII*

* A 42C: sin IPTG no hay transcripcin pues el represor

se une al operador; con IPTG hay transcripcin pero no hay
traduccin pues se transcribe Zrev.

2) La ribulosa bisfosfato carboxilasa (abreviada "rubisco") es una enzima localizada en el interior de los
cloroplastos. Permite fijar CO2 en la sntesis de triosas
en el estroma cloroplstico. Rubisco est formada por
dos tipos de subunidades, la subunidad grande (LSU),
codificada en el genoma del cloroplasto, y la subunidad chica (SSU), codificada en el genoma nuclear e
importada desde el citoplasma. Ambas son ensambladas entre s dentro del cloroplasto con ayuda de una
chaperona. El estudio de la regulacin de la expresin
de los genes LSU y SSU despert el inters de mu-

29

chos investigadores. Con el objeto de encarar, en un

futuro, la produccin de plantas transgnicas con genes de resistencia a virosis reguladas por luz, se realiz el siguiente experimento: se tom un fragmento
de ADN ubicado entre -973 y -4 bp del gen de la SSU
de papa (por convencin, se denomina +1 al sitio de
iniciacin de la transcripcin) y se lig ro arriba de la
secuencia codificante del gen de origen bacteriano de
la cloranfenicol acetil-transferasa (CAT). Con esta
construccin se transformaron protoplastos (clulas
desprovistas de pared) de hojas de tabaco y se las someti a condiciones de luz u oscuridad. Luego de varias horas, se aisl ARN para analizar la expresin de
CAT dentro de esos protoplastos, mediante northern
blot usando como sonda el cDNA de CAT. Los resultados fueron:
Luz
Oscuridad
Posteriormente se eliminaron los siguientes fragmentos del gen, y con cada una de las nuevas construcciones se transformaron protoplastos, se sometieron a las
mismas condiciones y se aisl el ARN para hacer
nuevos Northerns:
Sin eliminar

Luz
Osc.

(-90/-4)
eliminado

Luz
Osc.

Luz
Osc.

(-973/-90)
eliminado

1)

luz
oscuridad
luz

2)
oscuridad
d) De acuerdo a los resultados obtenidos, Qu tipo de
elemento regulatorio est contenido en la secuencia 973/-772 aislada del gen SSU?
3) Imagine que las sin-herculitis son una serie de enfermedades genticas en humanos producidas por defectos recesivos en la expresin del gen de la herculina, una protena asociada al desarrollo y tono muscular. La enfermedad no es mortal pero se caracteriza
por una tendencia a la flaccidez y la pereza.
Para analizar los distintos tipos de la enfermedad, se
dispone de biopsias musculares de individuos sanos
homocigotas, es decir no portadores (S) y de enfermos
(homocigotas) (X1, X2 , ...), adems de un mapa de
restriccin del gen de la herculina, un clon de cDNA
de longitud completa y anticuerpos anti-herculina.
Para comenzar se realiza una serie de experiencias de
Southern (DNA genmico cortado con la enzima
BamHI), northern y western blots que se muestran en
la figura.
Gen sano
E1

E2

500 pb

200 pb

BamHI

Luz
Osc.

(-972/-722)
eliminado

una de las 2 construcciones se hizo un Northern, todo

bajo las mismas condiciones que antes:

a) Qu conclusiones se pueden sacar con respecto al

papel de las secuencias de SSU manipuladas?
b) Qu conclusin se puede sacar del hecho de que
los protoplastos fueran de tabaco y no de papa?
5 kpb
c) Podran haberse usado protoplastos preparados a 4 kpb
partir de races de tabaco?

E3
800 pb
BamHI

BamHI

1000 pb

4000 pb

S X1 X2 X3 X4 X5

S X1 X2 X3 X4 X5

1,5 kpb

1 kpb

1)

-973

SSU

-772

P nos

cat
Southern

2)

-772

SSU

-973

Pnos

cat

Finalmente, se realiz la siguiente construccin: el

fragmento de -973/-722 de SSU se fusion en los sentidos posibles ro arriba del promotor (P) del gen nopalina sintetasa (nos), gen que se expresa en vegetales
y que no est regulado por luz. Esta construccin se
fusion ro arriba de la regin codificante del gen
CAT. Luego de transformar los protoplastos con cada

Northern
S X1 X2 X3 X4 X5

50 kDa

Western

a) Interpretar los resultados caracterizando cada alelo

mutante X1, X2, X3, X4 y X5.

30

Dado que los pacientes X4 y X5 presentaban el mismo patrn de bandas en el Southern, en el northern y
en el western, y con el fin de determinar si ambos pacientes presentaban la misma alteracin, se realiz
otro experimento que consisti en la construccin de
plsmidos mediante fusin de: la zona 5' de un clon
genmico de la herculina de individuos enfermos con
un patrn tipo X4 y X5 (homocigotas) o de un individuo sano (S) + la parte codificante del gen de la gal. Luego se realizaron los siguientes experimentos
de transfeccin:
Lnea celular
Plsmido
Activ. -gal
Fibroblastos 3T3
p5S / CAT
--Fibroblastos 3T3
p5X4 / CAT --Fibroblastos 3T3
p5X5 / CAT --Mioblastos L6
p5S/CAT
+++
Mioblastos L6
p5X4 / CAT +++
Mioblastos L6
p5X5 / CAT --b) Cmo explica los resultados del experimento de
transfeccin?
c) Qu fenotipos tendrn individuos heterocigotas
con genotipos S/X1, S/X4, S/X5 y X4/X5?
d) Dibujar el resultado de Southerns (con enzima
BamHI) de individuos que sean portadores sanos de
los alelos recesivos X1, X2, X3 y X4.
e) En qu casos el polimorfismo de sitios de restriccin con la enzima BamHI ser til para el diagnstico prenatal de la enfermedad?
f) Si se crea un ratn transgnico con una copia del
gen humano sano completo y sabiendo que el gen sano de la herculina de ratn tiene el siguiente mapa de
restriccin para la enzima BamHI, dibujar los resultados de los Southern de ratones sanos (homocigotas)
transgnicos y no transgnicos hibridizados con una
sonda de herculina humana, a alta y baja sal.

BamHI

Fragmento
-1263 a 877
Extracto -

Fragmento
525 a 226

10C 28C Extracto -

10C 28C

BamHI

BamHI

1800 pb

a) Qu conclusiones obtiene de los resultados de medicin de actividad de luciferasa en las plantas transgnicas?
b) Qu controles agregara al experimento con plantas transgnicas?
El resultado sorprende al estudiante por lo que se decide a realizar experimentos para determinar qu secuencias en cis regulan la transcripcin del gen. Para
ello asla los fragmentos 1263 a 877 y 525 a 226
y los marca en uno de los extremos 5, los incuba con
preparaciones de protenas nucleares de plantas de
tabaco cultivadas a distintas temperaturas, los trata
con DNasa I y separa los fragmentos por electroforesis en gel de poliacrilamida. De este experimento de
footprinting obtiene el siguiente autorradiograma:

5000 pb

4) Un estudiante de doctorado est decidido a encontrar los factores que regulan la transcripcin del gen
OMEGA8 en plantas. Se sabe que los niveles de
mRNA de OMEGA8 aumentan cuando se exponen las
plantas de tabaco a baja temperatura, aunque la funcin real de OMEGA8 es desconocida. Para lograr su
objetivo, el estudiante realiza una serie de construcciones gnicas donde fusiona fragmentos de la regin
5 upstream del gen OMEGA8 a la regin codificante del gen de la luciferasa. Acto seguido introduce dichas construcciones por transformacin en plantas de
tabaco. Cuando obtiene las lneas transgnicas, analiza
la respuesta del transgn a la temperatura y obtiene los
siguientes resultados:
Nota: bloque blanco = regin 5 upstream del gen
OMEGA8, +1= sitio de iniciacin de la transcripcin,
bloque negro = regin que codifica para luciferasa.

Nota: la primera calle de cada gel corresponde a la

incubacin del fragmento de DNA correspondiente
con la DNasa I, en ausencia de extracto nuclear.
c) Qu le sugiere el footprinting?
d) En base a sus respuestas a) y c), haga un esquema
de la regin -1588/-1 indicando el rol de cada regin
e) Qu otro experimento de footprinting hara para
confirmar este modelo?
f) Por qu el estudiante hizo fusiones a la regin codificante del gen de la luciferasa y no de la propia secuencia codificante del gen OMEGA8?
5) Un investigador est estudiando la expresin de una
enzima heptica X la cual tambin se expresa en
pncreas slo en condiciones de stress oxidativo. Am-

31

bas enzimas son estructural y bioqumicamente idnticas. El gen en cuestin tiene la siguiente estructura:
E1

E2

E3

Las flechas indican sitios de clivaje y poliadenilacin.

La regin en gris es la regin codificante.
En primer lugar, realiz un nort- Hgado Pncreas
hern blot con RNA extraido a
CT S
CT S
partir de hgado y de pncreas
de ratones control y ratones
sometidos a stress:
a) Esquematizar los mRNAs
maduros que se expresan en
hgado y en pncreas.
b) Cmo hara para confirmar
su hiptesis? Qu experimento realizara para descartar que
la diferencia de tamao de los mensajeros se deba a
splicing alternativo del transcripto primario?
Interesado por la regulacin de la expresin de esta
protena en pncreas el investigador clon el promotor
de la enzima X ro arriba del gen de la luciferasa y
transform, con esta construccin, clulas de pncreas. Para su sorpresa, tanto las clulas sometidas a
stress como las clulas control expresaron niveles similares y elevados del gen reportero.
c) Qu puede decir, hasta el momento, sobre la regulacin de la expresin de la enzima X en pncreas?
Sospechando que la secuencia perteneciente a la regin 3 UTR presente en el mensajero en pncreas,
pero ausente en el hgado, podra estar relacionada
con estos resultados, el investigador dise las siguientes construcciones: (P: promotor constitutivo)
1

Luc

Luc

3UTR

Con estas construcciones transfect clulas pancreticas y las someti a condiciones de stress o control durante 8 horas. Finalmente midi la actividad de luciferasa:
Construccin 1 Construccin 2
Control
3000
400
Stress
3000
2000
d) Qu puede decir del papel de la regin 3UTR en
la regulacin de la expresin de la enzima X?
7) Se desea desarrollar un mecanismo para expresar
genes en el cerebro de ratn en un determinado momento de su vida. Para ello Chen y col. disearon una
estrategia utilizando el sistema Tet off. El sistema
funciona de la siguiente manera: el gen de inters se
clona ro abajo de un promotor (pTetOp) inducible
por el factor de transcripcin tTA. A su vez el gen
tTA se clona ro abajo de un promotor tejido especfico. El mecanismo es el siguiente:

Cuando se expresa tTA se induce la transcripcin del

gen de inters dado que se une a las zonas regulatorias de pTetOp. El sistema tiene un paso ms de regulacin: En presencia de tetraciclina, tTA no se puede
unir a pTetOp debido a un cambio en su conformacin. Esta inhibicin es reversible. Una vez removida
la tetraciclina, tTA se puede unir a pTetOp.
Se disearon ratones transgnicos con las siguientes
construcciones:
PromTetOp Gen de inters PromTej. esp. tTA

Lnea 1 (pTetOp-luciferasa): Lnea transgnica con

una construccin que lleva el gen de la luciferasa ro
abajo de TetOp.
Lnea 2 (pEnolasa-tTA): Lnea transgnica que lleva
una construccin con el gen tTA ro abajo de las zonas regulatorias del gen de la Enolasa (pEnolasa).
Lnea 3 (pNestina-tTa): Lnea transgnica con una
construccin que lleva el gen tTA ro abajo de las
zonas regulatorias del gen de la Nestina (pNestina).
Lnea 4 (pActina-tTA): Lnea transgnica con una
construccin que lleva el gen tTA ro abajo de las
zonas regulatorias del gen de la Actina (pActina).
Se cruzaron los ratones pTetOp-luciferasa por cada
una de las lneas fundadoras 2, 3 y 4. La F1 transgnica para ambas construcciones (corroborada mediante Southern blot) se utiliz para los ensayos de
actividad de luciferasa en diferentes tejidos en ratones
de 2 semanas de edad:
ACTIVIDAD LUCIFERASA 2 semanas.
Lnea 1
F1
F1
F1
sola
(1x2) (1x3) (1x4)
Corteza
4
400
500 2300
Cerebro
Estriado
3
90
1400 2000
Hgado
2
6
7
1900
corazn
3
7
6
2150
Nota: los nmeros representan medidas arbitrarias
relativas de actividad de luciferasa.
a) Teniendo en cuenta los resultados de la tabla, en
qu se diferencia la regulacin de los promotores analizados (pNestina, pEnolasa, pActina y pTetOp)?
b) Para qu sirve medir la actividad de luciferasa?
c) Esquematizar los northern blots esperados para
Nestina y Enolasa en estriado y en corteza de ratas
salvajes de dos semanas de edad. (tamao del mensajero de Nestina:1800 bases, tamao del mensajero de
Enolasa: 3200 bases).
Se quiere utilizar este sistema de expresin (TetOptTA) para el desarrollo de una terapia contra una enfermedad neurodegenerativa. El objetivo es expresar
una protena neuroprotectora en el estriado de ratas
sanas y enfermas en determinado momento de sus vidas y no en otro (NOTA: A las ratas se les puede dar
de tomar agua con tetraciclina el tiempo que sea necesario y sta llegar a todos los tejidos).

32

d) Bajo qu zonas regulatorias pondras a la protena

neuroprotectora? Qu lnea transgnica utilizaras
para hacer el experimento? Cmo haras el experimento?

7. GENTICA DE POBLACIONES

Gua de Estudio:
1) a) En una poblacin en equilibrio:
Cul es la frecuencia de heterocigotas que puede
haber?Cul es la de homocigotas dominantes?Cul
es la de homocigotas recesivas?
b) La invariabilidad de las frecuencias gnicas de una
generacin a otra, implica que est en equilibrio (de
Hardy Weinberg) la poblacin parental?
c) La estructura gentica de una poblacin, viene
dada por sus frecuencias gnicas o por las genotpicas?
d) El conocimiento de las frecuencias gnicas de una
poblacin, implica conocimiento de su estructura genotpica? Y si la poblacin est en equilibrio H-W?
R:a) Frecuencias heterocigotas H=2.p.q < 0.50 (si hay
dos alelos), H = 1 - pi (si hay ms de dos alelos)
Frecuencia homocigotas dominantes
D=p2
Frecuencia de homocigotas recesivos
R=q2
b) La invariabilidad de las frecuencias gnicas de una
generacin a otra no implica que la poblacin parental
est en equilibrio. La generacin parental puede tener
D, H, R p 2, 2pq, q 2, pero llega al equilibrio en una
generacin de panmixia. Para que hablemos de equilibrio deben mantenerse constantes las frecuencias
gnicas y genotpicas.
c) La estructura gentica de una poblacin viene dada
por sus frecuencias gnicas y genotpicas. Si (D, H, R)
(p 2, 2pq, q 2 ) puede deberse a que no hay panmixia,
o que hay seleccin, deriva, mutacin, etc., que afectan la estructura gentica.
d) El conocimiento de las frecuencias gnicas de una
poblacin no implica el conocimiento de su estructura
genotpica, a menos que la poblacin est en equilibrio de Hardy-Weinberg.
2) En el caso de loci ligados a cromosomas sexuales,
cundo se considera que una poblacin se encuentra
en equilibrio?
R:En estos casos, el sexo heterogamtico presenta
solo dos genotipos, y el homogamtico tres. Por lo
tanto podemos describir sus frecuencias genotpicas
poblacionales de la siguiente manera:

AA
Aa
aa
A
a
P
H
Q
R
S
pBfB = frec. del alelo A en la poblacin femenina
qBfB = frec. del alelo a en la poblacin femenina
pBmB = frec. del alelo A en la poblacin masculina
qBmB = frec. del alelo a en la poblacin masculina
En este caso, 2/3 de los alelos totales de la poblacin
son transportados por el sexo homogamtico y 1/3 por
el sexo heterogamtico. Las frecuencias gnicas en
cada uno de los sexos sern diferentes si la poblacin
no est en equilibrio.
Siguiendo la nomenclatura asignada para cada uno de
los genotipos, la frecuencia del alelo A en las hembras
ser igual a:
pf = P + H
y en los machos
pm = R
En la poblacin total ser igual a: p = 2/3 pf + 1/3 pm
Si las frecuencias en ambos sexos no son iguales en
un comienzo, y se produce apareamiento aleatorio, las
frecuencias irn oscilando en los dos sexos hasta alcanzar el equilibrio cuando: pf = pm = p
Los machos obtienen sus genes ligados al sexo de la
madre, por lo tanto:
pm = pf de la generacin anterior (identificada con el
apstrofe).
Las hembras obtienen sus genes en igual proporcin
de los progenitores, por lo tanto,
pf = (pm + pf ) de la generacin anterior
En cada generacin se reduce a la mitad la diferencia
de las frecuencias gnicas entre los dos sexos, lo que
se desprende de la siguiente ecuacin:
pf - pm=pm+pf - pf=pm - pf= - (pm+pf)
Por lo tanto, el equilibrio no se alcanza en una sola
generacin de apareamiento aleatorio, sino en varias.
Las frecuencias se van acercando asintticamente al
valor medio poblacional, momento en el cual se alcanza el equilibrio.
3) Por qu, en teora, la consanguinidad no favorece
un incremento en la frecuencia de alelos recesivos en
una poblacin sino que solamente afectara la distribucin de alelos entre genotipos?
R:La falta de panmixia no modifica las frecuencias
gnicas sino las genotpicas. Entonces, por la consanguinidad p y q no cambian. El apareamiento entre parientes no afecta las frecuencias gnicas conjuntas,
sino que aumenta la frecuencia de homocigotas. La
consanguinidad har que los genes recesivos raros se
presenten en homocigosis con una mayor frecuencia
que si existiese apareamiento aleatorio en poblaciones
de tamao grande.
Problemas:
1) Una condicin anmica en el hombre llamada talasemia es determinada por un par de alelos codominantes. El genotipo homocigtico dominante TmTm produce una anemia grave (talasemia mayor) y el genotipo heterocigtico TmTn produce una anemia benigna
(talasemia menor). Los individuos normales son homocigticos TnTn. Se encontr que la distribucin de
esta enfermedad en una muestra de una poblacin italiana era de 4 con talasemia mayor, 400 con talasemia

33

menor y 9596 normales. Indique si esta muestra est

de acuerdo con los valores indicados segn el equilibrio de Hardy-Weinberg dentro de lmites estadsticos
aceptables.
2) Cierta planta presenta flores azules, celestes y blancas y se sabe que esos tres colores estn determinados
por un locus biallico de dominancia incompleta. Un
eclogo vegetal encuentra una poblacin de esta planta y considera que pueden reconocerse dos subpoblaciones. Desea entonces averiguar si cada una de ellas
se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg y qu
sucede con la poblacin total. Si parti de los siguientes datos A qu conclusin lleg?
Azul Celeste Blanco
Total
Subpoblacin I
164
32
4
200
Subpoblacin II
20
80
100
200
Total
184
112
104
400
3) Los grupos sanguneos humanos (AB0) estn determinados por un sistema de alelos mltiples en el
que existen relaciones de codominancia y dominancia
(segn la interaccin). La jerarqua de dominancia de
estos tres alelos es: IA = IB > i.
En una muestra de una poblacin humana se encontraron 23 individuos del grupo AB, 441 del grupo 0,
371 del grupo B y 65 del grupo A.
a) Calcule las frecuencias allicas de IA, IB e i.
b) Calcule el porcentaje de la poblacin que se espera
que sea de los grupos A, B, AB y 0 si las frecuencias
gnicas fueran: IA = 0,36, IB = 0,20 e i= 0,44.
4) Al analizar, en una poblacin de mamferos, un
carcter monognico con ligamiento total al cromosoma X, se encontr que la frecuencia del gen dominante en las hembras es 0,8, mientras que el 30 % de
los machos son recesivos. Qu frecuencias gnicas
aparecern en cada sexo en la 3ra generacin a partir
de la citada? Hacia qu valor tienden dichas frecuencias al cabo de un gran nmero de generaciones?
5) La enzima 6-glicerol fosfato deshidrogenasa presenta, en algunos lepidpetros, distintas formas, diferenciables en una corrida electrofortica., donde cada
banda depende de la presencia de un alelo diferente
para el locus autosmico 6-Gpd. Los alelos ms comunes son el F y el S. Se inician 4 poblaciones experimentales. En la tabla se muestra el nmero de individuos de cada genotipo para cada sexo y en cada poblacin.
Machos
Hembras
FF FS SS
FF FS SS
POBLACION 1
48 84 18
18 84 98
POBLACION 2
24 24 72
24 24 72
POBLACION 3
9 42 49
9 42 49
POBLACION 4
20 20 60
9 42 49
Suponiendo que a partir de estas poblaciones se dan
las condiciones de equilibrio de Hardy-Weinberg:
a) Cules se inician con frecuencias de equilibrio?
b) Cules sern las frecuencias gnicas y genotpicas
de equilibrio en las poblaciones que no ofrecen diferenciacin sexual en las frecuencias gnicas?
c) Cuntas generaciones tardarn en alcanzarlo?

6) En un acuario se mantienen numerosos ejemplares

de Rana pipiens. Se estudiaron los individuos para el
locus isoenzimtico diallico esterasa, encontrndose
el nmero de individuos de cada genotipo en estado
de renacuajo y adulto que se indican en la figura.
a) Calcule las frecuencias allicas de este locus en la
poblacin y diga si est en equilibrio tanto en el estado de renacuajo como en el de adulto.
b) Compare la supervivencia larva adulto de los tres
genotipos.
RENACUAJOS

EST
Nde indiv.
observados

1272

652

76

ADULTOS

Nde indiv.
observados

1032

508

60

El becario que cuida las ranas para su tesis descubre

un nuevo producto para mantener el pH del acuario, a
mitad de precio del que vena utilizando habitualmente. Despus de cierto tiempo de utilizar este producto
se da cuenta
que aparcen
en el acuario
varios individuos muertos
y hace de
nue-vo el estudio anterior,
1440
520
40
encontrndoRENACUAJOS
se los siguientes
datos:

EST

Nde indiv.
observados

1008

364

ADULTOS

c) Calcule
las
frecuencias allicas de este locus en esta poblacin y
diga si estn en equilibrio tanto en estado larvario
como adulto.
d) Compare la supervivencia larva-adulto de los tres
genotipos.
e) El producto nuevo utilizado afecta diferencialmente
algn genotipo? Por qu?.

34

7) Un seor muy enfermo que estaba redactando su

testamento, deseaba saber si l era verdaderamente el
padre biolgico del segundo hijo de su anterior esposa, que, a pesar de su duda, llevaba su apellido. Sus
abogados le recomendaron que realizara las pruebas
genticas de filiacin. En un prestigioso laboratorio se
tomaron entonces las muestras de sangre del hijo y de
ambos padres. Se extrajo ADN genmico. Mediante
PCR y a partir de primers adecuados se amplificaron
8 regiones de microsatlites altamente variables del
ADN (loci), con el fin de determinar el ndice de paternidad. A continuacin se muestran los esquemas de
los patrones electroforticos de bandas obtenidos al
correr en geles de poliacrilamida los productos de amplificacin obtenidos para cada locus. P= padre, H=
hijo y M= madre. A los costados se indican los alelos
que difieren en el tamao del fragmento. En la tabla se
indican las frecuencias poblacionales de estos alelos.

P H

M
P H M
P H M
__ 117 __ __
157
__ __ 195
__ 155 __
193
__ __
113 __
153
__ __ 111

__ __ 149 __ __ __ 179

Locus 2
Locus 3
Locus 4
P H M
P H M
P H M
__ 166 __
205 __ __
104
__ __ 199
__ __ __ 156
__ 195
__ __ 88
__ __
185
Locus 5

Locus 6

P H M
__ __
115
__ __ __ 109
Locus 8

Locus 7
P H M
__
__ __
__ __
__

232
214
184
182

Locus 9

Frecuencias allicas:
Locus 2: 117= 0.18; 113= 0.16; 111= 0.1
Locus 3: 149= 0.01; 153= 0.32; 155= 0.1; 157=0.16
Locus 4: 179= 0.16; 193= 0.09; 195= 0.01
Locus 5: 156= 0.65; 166= 0.05.Locus 6: 185= 0.025;
195= 0.05; 199= 0.25; 205=0.13.
Locus 7: 88= 0.58; 104= 0.28
Locus 8: 109= 0.3; 115= 0.16
Locus 9: 182= 0.13; 184= 0.29; 214= 0.01; 232= 0.01.
A partir de estos datos calcule el ndice de paternidad
para cada locus (razn de verosimilitud hijo/ no hijo).
y el valor acumulado para
todos los loci.

8.- MUTACIONES
Guia de estudio
1) Explique los conceptos
siguientes:

- mutacin inducida
- mutacin espontnea
- clastgeno
- mutacin somtica
- mutacin germinal
- mutacin letal
- mutacin condicional
- mutacin polar
- reversin
R: clastgenos son mutgenos que producen ruptura
cromosmica. Son en general fsicos (Radiacin X,
por ejemplo) y no son detectables por el test de Ames.
Se requiere de ensayos cromosmicos (como el intercambio de cromtides hermanas) para ser detectados.
2) Indique las formas ms habituales de expresar la
probabilidad de que ocurra una mutacin.
3) Describa un proceso selectivo para aislar microorganismos revertantes de auxtrofos. Cmo se puede
demostrar que esas mutaciones revertantes son previas
al momento del contacto con el agente selectivo?
4) Defina los siguientes conceptos y d ejemplos:
- transicin (los 4 casos posibles)
- transversin (los 8 casos posibles)
- mutacin silenciosa
- mutacin neutra
- mutacin por corrimiento del marco del lectura (o
"frame-shift")
- mutacin por sustitucin "missense"
- mutacin por sustitucin "nonsense"
- mutacin supresora intragnica
- mutacin supresora extragnica
5) Diferencie los siguientes mecanismos de mutacin
espontnea:
- errores en la replicacin del ADN.
- lesiones espontneas
6) Con relacin a los errores en la replicacin del
ADN, con qu base se aparean por puentes de hidrgeno los siguientes nucletidos:
- la forma imino de C?
- la forma enol de T?
- la forma imino de A?
- la forma enol de G?
7) Indique dos tipos de lesiones espontneas que, de
no ser reparadas, pueden generar mutaciones.
8) Explique la causa por la cual las posiciones de 5metilcitosina constituyen "hotspots" para transiciones
C T G A.
Cul es la funcin de la uracil-DNA glicosidasa?
Cun especfica es la uracil-DNA glicosidasa?
Por qu no sera ventajoso para una clula tener uracilo como constituyente normal en su DNA? Qu
significado evolutivo tiene el hecho de que en eucariotas las zonas no codificantes tienen una mayor cantidad de A-T que las codificantes?
9) Describa un proceso selectivo para aislar microorganismos revertantes de auxtrofos. Cmo se puede
demostrar que esas mutaciones revertantes son previas
al momento del contacto con el agente selectivo?

35

10) Hermenigildito, el hijo de Eulalia y Casimiro,

herva de fiebre y diarrea. El doctor, al observar al
infante y sabiendo que muchos tratamientos haban
sido ineficaces para controlar esta salmonelosis en
otros pacientes, recet un cctel con un antibitico
tradicional derivado de la penicilina: ampicilina y otro
antibitico sinttico de ltima generacin llamado
bacterminator III del prestigioso laboratorio BioTruch
S.R.L. (Sociedad de Responsabilidad muy Limitada).
Despus de una breve mejora, el prvulo volvi a
recaer y el prestigioso mdico dictamin: las bacterias
se volvieron resistentes al nuevo antibitico, no es la
primera vez que veo que ciertos antibiticos inducen
resistencia. Gumersindo, despierto hermano de la
vctima, contest prontamente:
- pero Doctor a m me ensearon en Gentica I que
todas las mutaciones son preadaptativas.
Los dems pusieron cara de no entender (o mejor dicho, no entendieron un pepino).
- los agentes selectivos como los antibiticos no inducen la resistencia, la seleccionan, algunas de las bacterias ya eran resistentes antes de que Ud. administrara
los antibiticos.
Ante la cara de incredulidad de todos los presentes,
Gumersindo tuvo que aclarar.
a) Qu pudo haber dicho el enigmtico Gmer?
Despus de la explicacin, el mdico no qued muy
convencido y le dijo: Cmo puede haber resistencias
preexistentes a antibiticos con los que estas bacterias
jams tuvieron contacto previo? Demustremelo.
Gmer llev, entonces, al doctor a la FCEyN y prepar unos menjunjes para cultivar bacterias y le pidi
al matasanos aislamientos de bacterias de distintos
intestinillos tratados y no tratadas con el nuevo antibitico.
b) Qu experimento reprodujo Gmer para convencer al terco galeno? Obviamente, Gmer utiliz para
su demostracin bacterias de pacientes que no fueron
tratados previamente con el antibitico por qu?
c) Gmer aprovech los distintos aislamientos para
estudiar la razn por la que estas bacterias eran resistentes a tantos frmacos distintos. l vio que la frecuencia de aparicin de colonias resistentes a bacterminator era de 10-2 y mientras que para la ampicilina
(y otros antibiticos), los valores eran de 10-9. Qu
concluy Gmer de estos resultados?
Cuando busc evaluar colonias simultneamente resistentes a bacterminator y ampicilina, se gast todas
las cajas de Petri de la facultad para encontrar apenas
una colonia. Con cifras tan bajas era muy difcil explicar lo que le haba pasado a su hermanito. Sin embargo, hasta ese momento, slo haba estudiado la gua
de problemas de Mutaciones. Cuando lleg a la de
gentica bacteriana se le prendi la lamparita. Se puso
a hacer experimentos con el aislamiento de su hermanito (a esa altura, Gmer sufra de una terrible fiebre,
haca frecuentes visitas al bao y enflaqueca aceleradamente, vaya a saber porqu motivos). Cuando puso
en contacto clulas del aislamiento con una cepa de E.

coli Amp- Bac-, en cuestin de minutos fue capaz de

aislar colonias de E. coli resistentes a ambos antibiticos con altsimas frecuencias. Sin embargo, Escherichia y Salmonella claramente pertenecen a especies (y
gneros) distintos. Gmer no lo pudo explicar porque
est en cama y estudiando Gentica para el parcial.
d) Podr Ud.?
R: a) No existen mecanismos por los cuales los antibiticos puedan modificar el ADN y los genes, slo lo
pueden hacer los mutgenos pero de una manera inespecfica (no dirigida a un gen en particular) y no es el
caso de los antibiticos. Lo que ocurre es que las poblaciones bacterianas se cuentan por miles de millones, lo que hace que un evento improbable (una mutacin al azar en algn lugar muy preciso de algn gen)
se vea representada en una o en unas pocas clulas.
Como todas se mueren salvo esos raros mutantes, se
tarda un tiempo hasta que estas pocas clulas alcanzan
un nmero importante (breve mejora hasta la recada).
b) Hizo rplicas de placas de Petri sembradas con una
suspensin conteniendo numerosas bacterias y que
contenan el antibitico y le mostr al mdico que el
nmero y la distribucin de las colonias resistentes fue
idntica en todas las rplicas, lo que slo es posible si
las clulas que originaron dichas colonias ya eran resistentes ANTES de la colocacin del antibitico. Si
hubiesen sido inducidas por el antibitico, no existira
ninguna razn para que seleccionara el mismo nmero
y en la misma ubicacin en repetidas ocasiones.
c) Que el antibitico puede ser neutralizado por varios
mecanismos de accin diferentes: por una mutacin
en un hot spot (nucletido con una frecuencia de
mutacin muy superior al resto), por un aumento en el
nivel de expresin del promotor que controla la cantidad de la protena afectada, diluyendo el efecto del
antibitico; por transposicin del gen que codifica
para la protena blanco a un plsmido de alto nmero
de copias, aumentando su expresin, modificacin de
enzimas con leves cambios (varios cambios diferentes
alcanzan para la resistencia), por efecto de varias mutaciones distintas independientes entre s (lo que es lo
mismo), etc.
d) La conjugacin no suele reconocer barreras de especies. Adems, como lo que se suelen transferir son
plsmidos (donde suelen ubicarse los genes de resistencia a antibiticos), ni siquiera se requiere de que
los genomas de las bacterias conjugantes tengan
homologa muy grande entre s ya que los mismos no
se transfieren. La transferencia horizontal de plsmidos que combinan varios genes de resistencia a antibiticos es un conocido mecanismo de apilamiento y
dispersin de dichos genes en varias especies de bacterias patognicas.
11) Adems de permitir el estudio del proceso mismo
de mutacin, las mutaciones pueden ser tiles en algunos casos. D ejemplos de esos casos.
12) Por qu hay que preocuparse por el agujero de
ozono? Explique.

36

13) Qu procedimiento y sistema selectivo se le ocurren a Ud. para obtener plantas resistentes a una sustancia txica?
R: Desde los aos 70 se sabe que las plantas que regeneran in vitro en ciertas condiciones son propensas
a sufrir mutaciones aunque algunos autores opinan
que las mutaciones pueden producirse previamente, en
las clulas somticas que originan el explante (tejido
vegetal del cual se parte para iniciar el cultivo de tejidos). Este fenmeno de mutagnesis por cultivo de
tejidos es conocido en la literatura como variacin
somaclonal (variacin por mutacin y somaclonal
porque las plantas se derivan clonalmente de clulas
somticas por regeneracin in vitro). El cultivo de
tejidos in vitro ofrece varias de las ventajas que tiene
el manejo de microorganismos, fundamentalmente, la
posibilidad de seleccionar en frascos aplicando un
agente selectivo al medio de cultivo, por ejemplo, un
antibitico (que es una sustancia txica). La frecuencia de variacin somaclonal puede ser incrementada
por el agregado de mutgenos al medio.
14) Explique el modo de accin de los siguientes
mutgenos y el tipo de mutacin (a nivel molecular)
que producen:
- los anlogos de bases (ej., el 5-bromouracilo)
- los modificadores de bases, como los agentes alquilantes (ej., etilmetanosulfato y nitrosoguanidina)
- aflatoxina B1
- los agentes intercalantes (ej., proflavina, naranja de
acridina, bromuro de etidio)
R: el 5-bromouracilo es un anlogo de T pero forma,
con mucha mayor frecuencia que sta un tautmero,
que en su forma enlica adquiere propiedades de apareamiento como las de C.
- etilmetanosulfato y nitrosoguanidina son capaces de
conferir alquilos a nucletidos, preferencialmente G,
confirindole propiedades de apareamiento iguales a
las de A.
- la Aflatoxina B1 producida por el hongo Fusarium,
est muy frecuentemente presente en alimentos (cereales, manes,etc.) y es un modificador de bases muy
especial, que forma un derivado de G, el cual es eliminado enzimticamente, generando un sitio apurnico. (Los sitios apurnicos pueden inducir un mecanismo de reparacin imperfecto, introduciendo una A
enfrente de esos sitios.)
- Los agentes intercalantes se ubican entre bases obligando a la polimerasa a producir inserciones o deleciones.
15) Mencione los mecanismos biolgicos de naturaleza enzimtica ms importantes en la reparacin del
ADN daado.
16) Explique en qu consiste el test de Ames. Por
qu se usan varias cepas mutantes de Salmonella?
17) Cules son las diferencias entre mutaciones
somticas y germinales? y entre mutgenos y oncgenos o cancergenos?
R: mutaciones somticas son aquellas que se producen en clulas pertenecientes a tejidos no reproducti-

vos y NO son heredables por lnea germinal. Pueden,

o no, conducir a un cncer (lo ms frecuente es que la
mutacin sea neutra o silenciosa y, en caso de afectar
algn gen, disminuya la funcionalidad celular o lleve
a la muerte de la clula). Mutaciones germinales son
aquellas que afectan las clulas de la lnea germinal y
que darn origen a las gametas. Como no hay cncer
de gametas (aunque s lo puede haber del tejido somtico que las alberga ovarios, testculos-), no se puede
afirmar que sean cancergenas aunque afecten especficamente a un protooncogn. Mutgeno es cualquier
agente qumico o fsico que induzca o aumente la frecuencia de mutaciones en el ADN o el ARN. Oncgeno es aquel que lo hace en determinadas clulas somticas afectando a oncogenes y que pueden derivar en
el desarrollo de un proceso tumoral (el cual suele requerir de ms de un oncogn para producirse, adems
de fallas en los sistemas de defensa). No todos los
mutgenos son oncgenos ni todos los oncgenos son
mutgenos porque hay compuestos que se metabolizan formando otros compuestos que s son mutagnicos en determinadas condiciones especficas que slo
se producen en determinados tejidos u rganos.
18) Qu es un oncogn y un protooncogn? Recuerda el c-myc en el linfoma de Burkitt?
R: Protooncogn es todo gen que, por mutacin del
gen o de ADN circundante, es capaz de convertirse en
un oncogn. Pueden ser genes codificantes para hormonas de crecimiento o divisin celular, factores de
transcripcin, telomerasas, etc. El c-myc es el oncogn
que se induce extemporariamente en linfocitos por
efecto de posicin del enhancer de un gen de inmunoglobulinas que se localiza cercanamente debido a una
traslocacin recproca. Es un caso en que no necesariamente muta el oncogn, sino que lo hace el ADN
circundante (efecto de posicin).
19) Cul es la base molecular de la teora mutacional
del cncer?Existen otras teoras?Se contagia el
cncer?Se hereda?
R: Ver punto anterior. La teora viral, particularmente
la retroviral, que tuvo su auge en los 70-80, se basa
en la transduccin por parte de un virus de un oncogn
celular (por ej. el c-myc pasa al virus de la leucemia
aviar, pasando a llamarse v-myc) transmitiendo infecciosamente. Este mecanismo demostr ser de escasa o
nula importancia en humanos. Por lo tanto, no se contagia en humanos (aunque s entre algunos animales).
Un cncer es un fenmeno muy complejo que involucra usualmente la interaccin de varios genes. Se puede heredar la predisposicin heredando alguna mutacin en algn protooncogn en la lnea germinal, pero
definitivamente no se puede heredar una mutacin
somtica. Es decir, una persona que tuvo o tiene un
cncer particular no transmite, a priori, la enfermedad
a sus hijos porque las mutaciones determinantes son
mutaciones somticas.
20) Qu mtodos se utilizan para evaluar oncogenicidad especfica de rgano?Por qu no es suficiente
con mtodos como el test de Ames?

37

R: A veces, el agente inductor no es de por s mutagnico sino que es metabolizado por alguna enzima celular especfica en condiciones especficas de pH, por
ejemplo, para producir un mutgeno/oncgeno. Para
investigar el potencial mutagnico de este tipo de
compuestos en los que el agente es un subproducto
metablico, el test de Ames puede ser adecuado convenientemente mediante el agregado de extractos celulares de los tejidos/rganos que se desea detectar, se
trata de un sistema bactetiano que guarda diferencias
con el de los humanos. Debido a esto, se desarrollaron
en los ltimos aos varios modelos murinos transgnicos. Por ej. el MutaMouse es un sistema que se
basa en un ratn transgnico que contiene unas 40
copias repetidas en tndem del genoma completo de
un vector comn en ingeniera gentica (el gt10) el
cual, a su vez, tiene una copia funcional del gen de la
-galactosidasa del opern lac. Al extraer DNA total
del ratn y mezclarlo con un extracto de empaquetamiento, estas copias del genoma de se encapsidan y
pueden infectar clulas de E. coli (lac-) y expresarse
generando placas azules en presencia de IPTG y Xgal. Si se recuperan placas translcidas, se atribuye a
mutacin y puede ser verificada por secuenciacin del
clon. La relacin entre placas blancas y las totales genera un coeficiente que se denomina frecuencia de
mutacin.

posible mutgeno o
carcingeno
extraccin
de DNA
de rganos
Problemas:
1) Se est estudiando un gen de E. coli que especifica
cierta protena. Una parte de la secuencia de la misma
es ala-pro-trp-ser-glu-lys-cys-his. Se obtuvo una serie
de mutantes de este gen que no mostraban actividad
enzimtica. Aislando los productos enzimticos mutantes se encontraron las siguientes secuencias:
Mutante 1: ala-pro-trp-arg-glu-lys-cys-his
Mutante 2: ala-pro
Mutante 3: ala-pro-gly-val-lys-asn-cys-his
a) Cul es la base molecular ms probable de cada
mutacin?
b) Cul es la secuencia de ADN ms probable que
especifica esta parte de la protena? Utilice el cdigo
gentico.
2) Un hombre (H.S.), empleado durante varios aos
en la planta nuclear de Springfield, se convierte en
padre de un varn hemoflico (B.S.), el primer caso en
el rbol genealgico tanto suyo como de su esposa
(M.S.). Otro trabajador de la misma planta durante
varios aos tiene un hijo enano acondroplsico, tambin el primer caso en su familia y en la de su esposa.
Los dos compaeros de trabajo demandan a su empleador (Mr. M.B.). Como genetista, lo llaman a Ud.

a declarar en el juicio. Qu dira Ud. en relacin a

cada situacin?
Aclaraciones:
- la hemofilia es recesiva ligada al cromosoma X.
- la acondroplasia es autosmica dominante.
3) El mutgeno etilmetano sulfonato (EMS), que se
utiliza mucho en mejoramiento vegetal, induce transiciones G-C A-T. La aflatoxina B1, micotoxina que
frecuentemente contamina alimentos, induce transversiones G-C T-A. Diga si cada mutgeno es capaz
de revertir codones mbar (UAG) y ocre (UAA) tipo
salvaje.
4) Una mutante de E. coli defectuosa en el sistema
de reparacin SOS es resistente a la mutagnesis por
luz UV. Por otro lado, clulas de piel de un paciente
que padece xeroderma pigmentosum (deficiencia de
una de las enzimas reparadoras por escisin) son extremadamente propensas a morir (y desarrollar tumores) por exposicin al sol. Intente explicar la aparente
contradiccin.
5) Ud. fue nombrado Jefe del Laboratorio de Bromatologa (Ministerio de Salud y Accin Social), encargado de otorgar permisos para la venta de nuevos productos alimenticios que se desean lanzar al mercado,
luego de constatar su inocuidad. Ud. recibe, de manos
de una empresa productora de alimentos, una muestra
de un nuevo edulcorante artificial para analizar, junto
con
un
placas totales vs placas blancas
proyecto
de
una
impresionante
campaa
publicitaria
planeada, y adems un inesperado cheque. Para realizar
los anlisis, Ud. dispone de un cepario de Salmonella
con 5 auxtrofos que no pueden sintetizar histidina,
que se comportan frente a 3 mutgenos as:
frecuencia de reversin his- his+
mutantes
his-

espontnea

5-Br-U

aflatoxi- Bromuro de
na
etidio

1
0
0
0
0
2
10-8
10-5
10-8
10-8
-8
-8
-5
3
10
10
10
10-8
-8
-8
-8
4
10
10
10
10-5
-5
-5
-5
5
10
10
10
10-5
a) Qu mutantes eligira para usar en el test de Ames
con el objeto de evaluar la potencial mutagenicidad
del nuevo edulcorante?
b) Si la mezcla de las mutantes elegidas + muestra a
analizar + extracto heptico produce crecimiento bacteriano en ausencia de histidina exgena (1 colonia de
cada 10.000 bacterias plaqueadas), otorgara Ud. el
permiso para la venta libre del edulcorante?
6) La 2-amino-3-metilimidazo[4,5-f]quinolina (IQ) es
una amina heterocclica aromtica que se podra formar durante la coccin de ciertas comidas. Como algunos compuestos de esta familia son genotxicos, se

38

decidi invvestigarla. Primero

P
se utiliz el teest de
Ames, con resultados negativos.
n
Siin embargo se demostr in vitro
v
que, en presencia dee citocromo P450
se produce una N-oxiidacin a 2-(hidroxiamiino)-3metilimidazzo [4,5-f] quuinolina, la cual
c
reaccionna con
el DNA forrmando N-(ddeoxiguanosiin-8-il)-2-am
mino-3metil-imidaazo[4,5-f]quinnolina (dG-C
C8-IQ). La reversin de muutaciones porr test de Am
mes de este ltimo
compuesto (a diferenciaa del precurrsor) mostr mutaciones de cambio de lectura de unaa o dos pares G:C.
Cuando se ensay
se obe
con el
e sistema Muramouse
M
tuvieron loss siguientes valores
v
(* = diferencia. signifis
cativa respeecto al controol):
rganoTrattamiento total placas Muutantes FMx105
Hgado Conntrol
1 7001 030
47
2.81.1
1x200 mg/kg 1 4115 460
72
5.12.3*
5x200 mg/kg 2 7110 226
349 12.9
6.2*
Colon Conntrol
1 2999 750
35
2.71.2
1x200 mg/kg 1 2223 900
68
5.63.5*
5x200 mg/kg 1 3116 970
97
7.41.4*
Rin Conntrol
1 5440 100
51
3.31.3
1x200 mg/kg 1 5223 600
71
4.72.1
5x200 mg/kg 1 6111 830
95
5.90.8*
a) Por qu el control (aal que se le innyect agua)) da
valores posiitivos en los 3 rganos annalizados?
b) Hipoteticce por qu loos resultados son diferentes en
diferentes rganos

c) A la luz de
d estos resuultados Conssidera Ud quue la
IQ produce una respuestta mutagnicca generalizaada o
especfica de
d tejido?
Para estudiaar si el mecannismo de acccin tiene alggo que
ver con el hipotetizado,
h
se secuenciaaron todas las placas blancas derivadas dee DNA de hgado y se tabbularon los porccentajes relattivos de tipo de mutacinn en
los controlees y en las traatadas con IQ
Q (recordar que
q se
trata de porccentajes relaativos y que si
s IQ producee, en
algn caso algn
a
porcenntaje menor al
a control, esso no
significa quue haya generrado un nm
mero absolutoo menor de placaas blancas quue el control))
Control IQ
Tipo mutaciin
Transicin
G
GC
AT
38% 15%
1
A
AT
GC
9%
1%
Transversin
G
GC
TA
25% 52%
5
G
GC
CG
16%
7%
A
AT
TA
3%
4%
Cambio de marco
+
+1
6%
1%
Cambio de marco

1
3%
1
19%
Delecin 2 pb
0%
1%
d) Detecta Ud algn tippo de mecannismo prefereencial?
Cul?
e) Todo lo anterior result importaante para la deteccin de muutaciones som
mticas (com
mo las oncoggnicas
o carcinognicas) Le parece que los ratones transgnicos tam
mbin podrann servir paraa estudiar muutaciones germinaales? Qu tejido
t
se le ocurre
o
que sera
s
el
ms apropiaado para estuudiar este asppecto?

10.- TRAN
NSPOSONE
ES
1) Expliquee la siguiente terminologa

- secuencias de insercinn
- transposonnes
- repeticionees invertidas
Secuencias dee insercin: traduccin
n de inserttion
seq
quences o IS,
I que fuerron descubiertas como taales
en genomas baacterianos, dee all su nom
mbre. Son traansposones simplees, autnomoos, ya que co
odifican paraa las
enzzimas que permiten
p
su ttransposicin
n (una transsposassa). En sus extremos coontienen secu
uencias inveertipor
das repetidas (casi idnticaas), que son reconocidas
r
la transposasa. Cuando se iinsertan en el
e genoma huusped, se produccen pequeaas repeticionees (direct reepeatss) a cada ladoo del transpoosn.
Trransposones: son fragmeentos discreto
os de ADN que
q
tienen la capaccidad de mooverse a otro
os sitios del genoma. Contrarriamente a loo que ocurree con plsmidos
y fagos,
f
su moovimiento see restringe all genoma huusped.
Reepeticiones invertidas:
i
inverted reepeats, los extreemos de los transposonees se caracteerizan por teener
seccuencias sim
milares (de all repeticion
nes) en orienntaci
n invertida la
l de un extrremo respecto
o de la del ottro.
2) Explique, a nivel moleccular, la form
ma de chupeetn
observada al microscopioo electrnico
o adoptada por
cad
denas simplees de DNA qque contieneen transposonnes,
lueego de desnaaturalizacin y lenta renatturalizacin.
R: Cuando seccuencias connteniendo traansposones son
desnaturalizadaas y renaturaalizadas, los extremos reepetid
dos invertidoos pueden reaaccionar en forma intram
moleccular, formanndo una estruuctura doblee cadena. Coomo
la transposasa no tiene regiiones repetid
das, se mantiene
com
mo ADN dee simple caddena. Los ex
xtremos inveertidos forman la base
b
de la esstructura de chupetn,
c
miientraas que la trannsposasa form
ma el cuerpo de la mismaa.
3) Cmo se cree
c
que hann evolucionad
do las bacterrias
ue hoy son reesistentes a vvarios antibi
ticos al missmo
qu
tiempo?
R: Existen traansposones ccompuestos, que llevan secuencias del husped.
h
Un ejemplo so
on aquellos forf
maados por dos IS. Dos IS ccercanos pueeden comporttarse como un nnico transpossn y llevar consigo las sel separan. En algunos de estos cassos,
cuencias que los
alg
gunas de las IS perdi la capacidad de
d transposiccin
y todo
t
se transspone como uuna unidad. En otros cassos,
am
mbas IS son funcionaless, pero con una frecuenncia
bajja suelen traansponer en conjunto, lleevando conssigo
lass secuencias que los sepparan. Si bien
n estos evenntos
son
n de baja freecuencia, cuuando las seccuencias quee se
traansponen lleevan resisteencia a antiibiticos, esstos
eventos son seeleccionadoss y aparecen
n con ms fref
cuencia. Los trransposones no se transfi
fieren entre bacb
terrias, pero s lo hacen loss plsmidos en
e los que puep
den
n insertarse los transposoones; de ah que la mayoora
de las bacteriaas con multiresistencias lleven las mism
maas en plsmiddos.
no
4) Marque lass diferenciass entre los mecanismos
m
rep
plicativo y replicativo dee transposiciin. Qu ennzimaas participan?

39

R: En el mecanismo no replicativo, el transposn se

mueve de un lugar a otro del genoma, sin dejar una
copia en el sitio dador. En el mecanismo replicativo,
se genera una nueva copia en el sitio de transposicin.
En ambos casos acta una transposasa, que unida a los
extremos del transposn, es la encargada de clivar una
cadena del sitio dador y una del aceptor y ligarlas en
forma cruzada, por un mecanismo que tiene similitudes con las topoisomerasas. Las estructuras que se
forman tienen similitud con las orquillas de replicacin. Si dichas horquillas son sustrato para la maquinaria de sntesis de ADN, entonces habr una duplicacin del transposn, se formar un cointegrado y est
ser resuelto por una recombinacin homloga, catalizada por una resolvasa, tambin codificada por el
transposn. Si las horquillas no son sustrato para la
sntesis de ADN, entonces se produce un segundo corte y ligacin en el sitio aceptor, pero el sitio dador no
se reconstituye, por lo que el salto del transposn
produce una rotura del ADN en dicho sitio.
5) Qu evidencias experimentales demuestran que en
algunos casos la transposicin ocurre a travs de un
RNA intermediario?
R: En muchos transposones se encuentran huellas
del procesamiento del mRNA, como ser uniones
exn-exn precisas, colas de poli A y extremos 5 que
coinciden con el inicio de la transcripcin
6) Qu analoga tienen los retrovirus con los transposones?
R: Los retrovirus tambin tienen extremos repetidos y
se insertan en el genoma del husped.
7) Qu son y cmo funcionan los elementos controladores en maz?
R: Los elementos controladores de maz tambin son
transposones. Se los denomin originalmente controlling elements. Existen varias familias en el genoma
del maz. Dentro de cada familia se los puede clasificar en autnomos y no autnomos. Los primeros pueden transponer por s mismos, mientras que los segundos perdieron la actividad transposasa, por mutacin o delecin, y son estables a menos que acte en
trans una transposasa de un elemento autnomo de
la misma familia.
8) Qu son los elementos P de Drosophila?
R: Los elementos P de Drosophila tambin son transposones, que se encuentran en las cepas P. Estos
transposones se activan cuando se cruzan machos P
por hembras M. La activacin del transposn produce
lo que conocemos como disgnesis del hbrido, ya que
la transposicin continuada en la lnea germinal produce esterilidad en los hbridos de dicha cruza. El cruzamiento opuesto no produce disgnesis y eso ocurre
por un efecto materno en las lneas P, que reprime la
transposicin. La transposicin slo ocurre en la lnea
germinal. La explicacin molecular de dichos eventos
radica en que el transposn codifica para dos productos de splicing alternativo que difieren en la inclusin o no del intrn 3. Cuando el intrn se incluye, el producto de 66 kDa es un represor de la trans-

posicin, mientras que cuando el intrn no se incluye,

el producto es la transposasa de 87 kDa. En la lnea
germinal se produce el evento de splicing que elimina el intrn 3 y se produce la transposasa activa. El
efecto materno se explica por la presencia del represor
en la lnea germinal.
9) Cmo se supone que surgieron los pseudogenes?
R: En algunos casos, los pseudogenes procesados se
originaron de secuencias de ARN que fueron retrotranscriptas. Si bien no contienen informacin necesaria para su transposicin, pueden haber sido sustrato
para un sistema de retrotransposones. En general este
tipo de pseudogenes se encuentra en porciones del
genoma no relacionadas con la del locus que les dio
origen. En otros casos, los pseudogenes aparecieron
por duplicacin de los genes originales, seguida de
una prdida de la capacidad de expresarse de una de
las copias. En este ltimo caso no hay ARN intermediario, la estructura del pseudogen no revela huellas
de procesamiento de ARN.

Problemas
1) En 1938, Marcus Rhoades analiz genticamente el
maz negro (pigmentado) mexicano. De la autopolinizacin de una variedad totalmente pigmentada, surgi
una progenie con los siguientes fenotipos:
12/16: granos totalmente pigmentados
3/16: granos blancos con manchas pigmentadas
1/16: granos blancos
Estos resultados fueron confirmados por su contempornea Barbara McClintock quien, profundizando
sobre el tema, logr interpretar agudamente sus observaciones citogenticas, lanzando, en los '50s, una teora muy resistida en su momento sobre genes "mviles". Tres dcadas ms tarde, la Gentica Molecular
permiti la interpretacin de esos datos, al identificar
un gen dominante P que determina la pigmentacin y
otro gen dominante (situado en otro cromosoma) que
controla la reversin a un alelo Pm mutado por insercin de un elemento mvil.
a) Cules son los genotipos de la planta parental y de
la progenie?
b) Qu tendr el gen controlador que le falta al transposn que se meti en el gen de la pigmentacin?Qu deben tener en comn los dos?
c) En qu tipo de clulas (somticas o germinales) y
en qu momento del desarrollo ocurri la reversin en
los granos mosaico?
d) Cul sera el resultado de un Southern de las partes blancas y pigmentadas de los granos mosaico,
usando el gen P como sonda?
2) Una estrategia alternativa a los marcadores moleculares para el clonado de genes es el "transposon tagging", es decir etiquetado de genes mediante transposones. Se realiz la transformacin -va Agrobacterium- de Arabidopsis thaliana resistente al hongo
Cladosporium fulvum, con el elemento Ds a unas
plantas, y con un elemento Ac defectivo a otras plantas. Como resultado, se obtuvieron algunas transgni-

40

cas visiblemente mutadas (plantas enanas, albinas, sin

flores, etc.), pero ninguna presentando fenotipos mosaico. Sin embargo, al cruzar ambos tipos de transgnicas entre s (con Ds x con Ac), la progenie resultante inclua varios individuos con fenotipos mosaico
debido a mutaciones somticas. Uno de los fenotipos
analizados fue el aspecto de las hojas luego de inocular con Cladosporium fulvum, llamando la atencin
una planta que tena una hoja saludable excepto en
una zona necrtica-daada por el hongo- bien delimitada. Al hacer un Southern sembrando DNA -cortado
por Hind III- aislado de dos zonas de la hoja mosaico
(resistente (R) y susceptible (S) al hongo), el resultado
fue:

kpb

kpb

15-13--

insercin, no se expresa y los ojos resultan blancos.

Por sucesivas cruzas, se obtuvo una poblacin de
machos y hembras con todos sus cromosomas X
conteniendo el gen white interrumpido por peach.
Por otro lado, se logr una construccin denominada
hsp, en la que el elemento mariner salvaje se puso
bajo la regulacin del promotor del gen de la protena
hsp70 (heat shock protein), que es inducible por calor.
Esta segunda construccin se introdujo en uno de los
cromosomas del par 2 de moscas transgnicas que ya
eran peach, obtenindose moscas hsp/+.
Se realizaron cruzas entre moscas transgnicas peach,
en las que uno de los parentales tena 1 dosis de hsp
(hsp/+) y el otro parental, ninguna (+/+). Se cont el
porcentaje de la progenie, criada a 25C (actividad
basal de hsp) o a 37C (actividad inducida de hsp),
que exhiba ojos rojos.

Genotipo del cromosoma 2 de los padres

hsp/+ ; +/+

7-6--

hsp/+ ; hsp/+

3-Sonda: Ds

Sonda: Ac

Nota: Hind III no corta a Ds ni a Ac

a) Haga un esquema que muestre qu zona del
plsmido Ti (o derivado de Ti) usara para colocar a
los transposones con el fin de transgenizar a las plantas? Cmo hara para lograr una seleccin de las
plantas verdaderamente transformadas?
b) Por qu aparecieron mutantes somticas (fenotipos
mosaico) en la F1 y no en las parentales?
c) En qu se basa el "tagging" del gen a clonar, en
este caso? En base al Southern, por cul mecanismo
(replicativo o no replicativo) transpone Ds?
d) Si usted desea clonar el gen de resistencia a partir
de una biblioteca genmica indique:
I. la fuente de DNA para hacer la "library" (qu parte de la planta?)
II. el tipo de "library" (genmica o de cDNA?)
III. si usara alguna enzima de restriccin. Cul?
IV. el tipo de vector para construir la "library" (indique, adems, si debe permitir o no expresin de
insertos y por qu)
V. la sonda que usara y el fundamento del "screening"
VI. en qu consistira el anlisis del clon aislado
3) Recientemente, un grupo de
investigadores
estudiaron los mecanismos de regulacin del elemento
transponible mariner, que est presente en genomas
de invertebrados, hongos y humanos. Obtuvieron un
macho transgnico que tena reemplazado un
fragmento del gen white, localizado en el cromosoma
X, por otro homlogo, pero interrumpido por un
mariner cuya transposasa no era funcional. Esta
variante de transposn con transposasa no funcional
se denomin peach. El gen white codifica para un
pigmento rojo del ojo y cuando est mutado por

+/+ ; +/+

Temp. % progenie
(c/ ojos rojos)
25
8
37
17
25
18
37
48
25
1
37
2

a) Interprete los resultados numricos

b) En qu etapa del desarrollo ocurren los eventos
que dan a origen a la progenie con ojos rojos ?
c) En este tipo de cruza tambin aparecen individuos
con ojos blancos con manchas rojas (fenotipo mosaico). Cmo justifica estos resultados? En qu etapa
del desarrollo ocurrieron los procesos que originaron
los ojos mosaico?
d) Las hembras mosaico presentan un mayor nmero
de manchas rojas que los machos mosaico. Cual es la
causa?
3) Un ejemplo muy llamativo de transposon tagging es el del trabajo publicado por Ling y col. en
Science 282:943 (1998) en el que clonaron el gen Matusalem (Methuselah) que prolonga la vida de las
moscas (y de gusanos). Recientemente (febrero del
2002) se public en varios diarios la identificacin del
gen homlogo en humanos. Los investigadores introdujeron, de manera controlada como para evitar la
disgnesis del hbrido, elementos P en una cepa de
Drosophila que no los tena (cepa M).
a) Cmo supone que lo hicieron?
b) Le parece que aparecieron mosaicos? Por qu?
Si bien identificaron varios mutantes en la M1 (primera generacin de mutantes equivalente a lo que
comnmente se llama F1 pero que en este caso no
proviene de un cruzamiento sino de un tratamiento
mutagnico), encontraron muchas ms en la M2 (o en
generaciones posteriores de endocra entre hermanas,
equivalente a la F2, segunda generacin despus de la
mutacin).
c) Por qu es esto?

41

Entre los nuevos mutantes haba uno que les llam

mucho la atencin: era capaz de vivir un promedio de
77 das en vez de los 57 que vivan, como promedio,
las moscas normales, por lo que bautizaron Matusalem al gen en cuestin.
d) Quin fue Matusalem? Quiere decir que este gen
en forma normal alarga la vida?
Adems estas mutantes eran ms resistentes al ayuno
y a condiciones de estrs oxidativo. Por todas estas
razones, inmediatamente clonaron y secuenciaron el
gen en cuestin.
e) Por qu esto les result, relativamente, fcil de
hacer? Porqu no les habra sido tan fcil mutagenizando con un producto qumico como el EMS?
El gen result ser un receptor de superficie celular de
514 aminocidos del tipo de los receptores G, pero de
funcin desconocida. Con este gen se pudo clonar
rpidamente un gen muy similar en Caenorhabditis
elegans (un nemtodo muy estudiado como modelo en
anlisis genmico y del cual ya se conoca buena parte
de la secuencia genmica). Su mutacin tena efectos
fenotpicos muy similares a lo observado en moscas.
f) Qu le indican estos resultados respecto a la evolucin del gen?
g) Cmo se pudo aislar tan rpidamente este nuevo
gen de nemtodos y modificar el mismo para hacer
estas observaciones sin repetir el transposon tagging
de las moscas?

11.- INGENIERA GENTICA

Bibliografa: Recombinant DNA, Watson y col.

Gua de estudio:
1) Qu significa "clonar" un gen? Defina la expresin "ADN recombinante", "vector" e "inserto" Mencione un mtodo que sirva para reconocer fcilmente
colonias de bacterias que llevan plsmidos que contienen insertos.

R: Clonar un gen (o una secuencia de ADN) significa

sinifica aislarlo de su contexto original y colocarlo en
otro contexto donde pueda ser amplificado. Es decir,
aislarlo del genoma (por ej. con enzimas de restriccin) para insertarla en un vector (por ej. un plsmido
bacteriano) para que, despus de introducida la construccin recombinante en una bacteria como E. coli,
se pueda multiplicar esta secuencia para su anlisis
molecular (por ej. secuenciacin nucleotdica). El
concepto difiere de la clonacin biolgica en el sentido de que ac estamos hablando de un segmento de
ADN y no de un organismo completo. Para reconocer
bacterias que llevan plsmidos con inserto se hace
visualizacin de color (o falta de color) de colonias
(ver uso de -gal, ms adelante).
2) Defina la expresin "ADN recombinante"
R: ADN recombinante es un trmino que se origin
cuando se desarrollaron las primeras tcnicas de Ingeniera Gentica y se refiere a un fragmento de ADN
que se origina por la unin in vitro de dos fragmentos distintos, que pueden provenir, inclusive, de especies no relacionadas. Quimera (sinnimo) Nota: La
expresin recombinante (aqu) no es sinnimo de recombinacin homloga porque no hay un intercambio
de segmentos homlogos. En todo caso, se parece a la
llamada recombinacin ilegtima (como por ejemplo
la integracin de fago lambda para hacerse lisognico,
ver gua de gentica bacteriana).
3) Qu tipos de vectores de clonado conoce que funcionen en clulas procariotas? y en eucariotas?
R: Vector se refiere a un fragmento de ADN que tiene
la capacidad de replicarse en un determinado husped
y , como el tmino lo indica, puede servir de vehculo
para multiplicar otro fragmento de ADN que haya sido fusionado al mismo. Elementos bsicos de un vector: ser transferible por algn mtodo, ser seleccionable, ser propagable, aceptar la insercin de DNA exgeno.
Inserto se refiere a un fragmento de ADN que se fusiona al vector; en general representa el ADN de inters, que fusionado al vector puede replicarse en el
husped adecuado.
En clulas procariotas hay plsmidos y fagos. Los
primeros con circulares y tienen un origen de replicacin que permite que se repliquen y se mantengan en
la clula. Los hay de alto y bajo nmero de copia. Los
fagos pueden ser utilizados como vectores, donde el
ADN se inters debe ser insertado en el genoma del
fago. En ambos casos se puede tambin diferenciar a
los vectores de expresin, ya sean fagos o plsmidos,
que tienen promotores y terminadores que flanquean
al inserto, de forma de producir un mRNA y la protena correspondiente.
En clulas eucariotas tambin hay vectores virales y
plsmdicos. Estos ltimos slo se se parecen a los
bacterianos naturalmente en levaduras. En clulas de
mamferos se los ha fabricado articialmente utilizando
orgenes de replicacin y replicasas de origen viral
(como los plsmidos derivados de SV40 en clulas

42

Cos). Muchos de ellos fueron modificados para incorporar orgenes de eplicacin de E. coli para as poder
replicar tambin en bacterias, especialmente cmodo
para producirlos en buena cantidad. Por eso se los denomina: de combinacin (shuttle). En levaduras tambin se desarrollaron cromosomas artificiales (YACs),
que fueron los primeros en utilizarse para clonar grandes fragmentos que fueron secuenciados en los albores de la genmica estructural. Posteriormente fueron
sustitudos por otro tipo de vectores com los BACs
(Bacterial Artificial Chromosomes).
4) Qu es una genoteca (o library genmica) y cmo
se construye? Qu diferencia tiene con una clonoteca
(habitualmente
llamada
library)
de
ADNc
(cDNA)?Cmo se realiza una bsqueda, prospeccin,
relevamiento (habitualmente llamado screening)?
Cmo se puede marcar una sonda? Cmo se procede para identificar bacterias que llevan una construccin de inters, luego de haber sido transformadas con
una mezcla de ligacin?
R: Genoteca o genomoteca es una biblioteca de
ADN donde, en vez de colecciones de biblios. (que
significa libros) dispongo de colecciones de segmentos de genomas. En general son especficas de un organismo determinado. Se utiliza ADN genmico que
se corta ya sea con enzimas de restriccin o por mtodos fsicos y se liga a un vector, que puede ser un
plsmido, un fago o un BAC. Este material se utiliza
para transformar bacterias competentes (preparadas
fisiolgicamente para permitir la entrada de ADN extracelular) o para infectarlas, si se utiliza un fago. La
poblacin de bacterias obtenidas representa a todos
los posibles fragmentos del ADN genmico original.
En el caso de la clonoteca o library de cDNA se
utiliza ADNc en lugar de ADN genmico, pero el
proceso es similar, salvo que no es necesario cortar el
ADNc.
Hay varias formas de marcar sondas, las que numeramos a seguir.
Random priming: se incuba el fragmento con una
poblacin de oligonucletidos (hexmeros y/o octmeros) en presencia de fragmento Klenow (fragmento
de la ADN polimerasa de E. coli), dNTPs, alguno de
los cuales est marcado en Alpha (primer fosfato) y
Mg2+. Despus de un proceso de desnaturalizacin y
renaturalizacin se agrega la enzima, los oligonucletidos se unen al ADN y son utilizados como sustrato
por la enzima. Actualmente el ms usado.
Nick translation: si una de las cadenas de un
plsmido se corta exponindo un extremo 3OH, la
ADN polimerasa I utiliza ese extremo como sustrato e
inicia la sntesis de ADN, desplazando a la cadena
existente, y corriendo el nick. Aqu tambin se lleva a cabo la reaccin con dNTPs, alguno de los cuales
est marcado y Mg++, adems de la ADN Polimerasa
I de E. coli.
Marcacin terminal: se puede marcar el extremo de
un fragmento utilizando una quinasa especfica y ATP
marcado en gama.

PCR: la reaccin de PCR puede utilizarse introduciendo un dNTP marcado en la reaccin o utilizando
un primer previamente marcado en su extremo 5
con una quinasa. Lo mismo puede hacerse con hexmeros de secuencia al azar.
Ribroprobes: con el plsmido adecuado , en presencia de una ARN polimerasa como la T7 y de ribonucletidos, se puede transcribir un gen in vitro y
marcarlo pasa ser utilizado como sonda.
En el caso de las genotecas, se llama screening a la
bsqueda del clon que contiene el fragmento de nuestro inters. Existen esencialmente dos formas. La primera es utilizar un fragmento y oligonucletido de
nuestro gen marcado. Este fragmento se hibrida con
una membrana obtenida de una placa de petri conteniendo mltiples colonias o playas de lsis, dependiendo del vector utilizado. El ensayo es anlogo al
Southern blot. La marca (sea radiactiva o no radiactiva) indicar las colonias o placas positivas, las cuales se pueden recuperar de la placa madre. La segunda
forma es utilizar una forma de detectar la protena expresada, en caso de los vectores de expresin. En general puede hacerse utilizando anticuerpos que detectan la protena producida y nos darn la posicin de la
colonia o playa de lisis positiva, en un ensayo que es
anlogo al de un western blot.
Para identificar bacterias que llevan una construccin
de inters, luego de haber sido transformadas con una
mezcla de ligacin y seleccionadas para la presencia
de plsmidos: Se preparan plsmidos a partir de un
cierto nmero de clones positivos y se los chequea
por restriccin, es decir se los digiere para comprobar el mapa de la construccin realizada. A veces se
hace PCR con primers especficos directamente de las
colonias positivas (la Taq pol es mucho ms barata
que las enzimas de restriccin y permite analizar muchos clones a la vez).
5) Cul es la diferencia entre una transformacin y
una transfeccin?
R: En animales, transformacin se refiere a la conversin de una clula o tejido en neoplsico, por lo que
no es correcto sinonimizarlo con transfeccin. En bacterias, tambin es preferible decir transfeccin porque
la transformacin natural que vimos en gentica
bacteriana tiene diferencias con la artificial que se usa
en ingeniera gentica. En plantas son sinnimos.
6) En qu situaciones usara Ud. las siguientes enzimas?:
retrotranscriptasa
ligasa
Taq polimerasa
DNAasa I
RNAsa H
R: RT: Es una ADN polimerasa dependiente de ARN
por lo que se la usa para fabricar ADN a partir de
ARN por ejemplo en el proceso de clonado molecular
de ARNm. Nota: raramente se la puede usar como
ADN polimerasa dependiente de ADN cuando hay
dificultades en la secuenciacin manual de regiones

43

con estructuras secundarias que dificultan la accin de

las ADN polimerasas tradicionales.
L: Para ligar fragmentos. Para unir un inserto a un
vector. Requiere ATP y Mg.
Taq pol: en PCRs.
DNAasa I: para cortar ADN en forma inespecfica,
por ejemplo para introducir los nicks en la marcacin por nick translation.
RNAsa H: para eliminar la hebra de ARN despus de
la accin de la tanscriptasa reversa.
7) Se quiere clonar el gen de una protena que se expresa en cerebro de ratn. Ud. no tiene, ni puede llegar a saber, la secuencia de aminocidos de la protena y depende exclusivamente de anticuerpos. Qu
tipo de genoteca usara para comenzar?:
a) una genmica hecha con ADN obtenido de cerebro de ratn?
b) una genmica obtenida de hgado de ratn?
c) una de ADNc hecha con ARNm de corazn en
pBR322?
d) una de ADNc hecha con de ARNm de cerebro en
pBR322?
e) una genmica de expresin hecha en el fago
gt11 hecha a partir de ADN de ganglios linfticos de
ratn?
f) una genmica de expresin hecha a partir de ADN
genmico obtenido de cerebro de ratn?
g) una de ADNc de expresin hecha en fago gt11 a
partir de ARN de cerebro de ratn?
R: La opcin g) porque es en el tejido en el que el
ARNm es ms abundante.
8) Qu es la mutagnesis dirigida in vitro? Mencione
algn procedimiento para lograrla, uno usando clulas
y el otro sin usarlas.
R: Suponiendo que la secuencia que quiero mutar se
encuentra entre 2 sitios de restriccin de tipo cohesivo
dentro de un plsmido, puedo digerir con la enzima y
religar para obtener una delecin. Otra: teniendo la
secuencia clonada en un plsmido, se la desnaturaliza
con calor (para obtener ADN de cadena simple) e
hibrida (anilla) con un oligonucletido sinttizado artificialmente de forma de tener una secuencia complementaria, salvo por un nucletido (que es el que
interesa modificar) y que est ubicado en el centro del
oligo. El ADN heterodplex (tiene una base mal apareada o missmatch) se incuba con una ADN polimerasa que usa el oligo como iniciador (primer) para completar la cadena complementaria. Transformo bacterias con el plsmido heterodplex y su replicacin
dentro de la clula originar 2 molculas hijas: una
normal y la otra mutante.
Un ejemplo de mutagnesis usando clulas es el reemplazo allico que se produce en un experimento de
knock out de un gen.
9) Dada una secuencia de inters: mediante qu estrategias se pueden generar mutaciones in vitro? D
ejemplos de generacin de mutantes in vivo.
A) Partiendo de la secuencia de inters clonada en un
plsmido, se pueden hacer deleciones, inserciones o

reemplazos puntuales 1) mediante el uso de primers

especficamente diseados que amplifiquen la secuencia con la modificacin deseada. Se trabaja con DNA
simple cadena (por desnaturalizacin del plsmido,
por obtencin de molculas de simple cadena si el
plsmido es derivado de un fago), primers y DNA polimerasa. (Hacer esquemas ilustrativos). Las bacterias
son transformadas con el plsmido heterodplex y su
replicacin dentro de la clula originar 2 molculas
hijas: una normal y la otra mutada. 2) Se pueden hacer
deleciones por digestin y religado de la secuencia de
inters. Se necesita disponer de sitios adecuados de
enzimas de restriccin.
B) Por amplificacin de la secuencia de inters por
PCR en condiciones de alto error (concentraciones
bajas de alguno de los ddnucletidos, reemplazo de
Mg por Mn). Los fragmentos son clonados y se obtiene una library de mutaciones.
Una secuencia de inters puede ser mutagenizada in
vivo mediante la introduccin en clulas de construcciones adecuadas (algunas se describieron arriba).
Una posibilidad es el reemplazo allico que resulta en
una modificacin funcional (Ej. generacin de mutantes termosensibles) o en la anulacin de la funcin
(Ej.: en un experimento de knock out de un gen).
10) Cul es la diferencia entre una transfeccin transitoria y una estable? En qu casos se utiliza la primera?
R: En la transitoria (no se dice transiente) el ADN ingresa al ncleo y se expresa, pero no se integra al genoma. Despus de un tiempo se degrada o se pierde
por dilucin a medida que no puede acompaar la replicacin del ADN cromosmico. Se usa para determinar ms rpidamente la especificidad y nivel relativo de expresin de un promotor, as como en muchos
otros casos (reporteros en clulas animales, expresin
de protenas de fusin por ej.). Obtener clones estables en cultivos celulares animales o vegetales es un
proceso lento y engorroso.
11) Cules son los mtodos ms comunes para transfectar clulas animales? En qu casos o aplicaciones
se utilizan la transfeccin de clulas animales cultivadas in vitro versus la de animales transgnicos?
R: Coprecipitacin con fosfato de Ca (el ms antiguo,
en desuso), microinyeccin (dem), electroporacin,
liposomas usando lpidos catinicos e infeccin con
vectores virales.
Aplicaciones: industriales-farmacolgicas (algunas
comunes otras distintas en ambos casos) = molecular
farming. Mejoramiento (aunque no hay casos de esto
ltimo a nivel comercial).
12) A qu se llama organismo "transgnico" u OGM
u OVM? D ejemplos.
Las definiciones son necesariamente artificiosas y arbitrarias porque no basta con decir que se trata de un
organismo que contiene ADN procedente de otra especie o forneo. Todos los cultivos modernos tienen
esta caracterstica debido a que fueron mejorados mediante cruzamientos interespecficos y hasta inter-

44

genricos (el trigo, por ejemplo, fue cruzado con el

centeno para incorporarle genes de resistencia a enfermedades fngicas) por lo que seran transgnicos.
Por lo tanto, se denomina as a los organismos obtenidos por biotecnologa moderna, entendiendo por biotecnologa moderna a la ingeniera gentica y a la fusin celular entre clulas de especies que no se pueden
cruzar entre s. OGM (organismos genticamente modificados) es nomenclatura del Codex-FAO, OVM
(organismos vivos modificados) del Protocolo de Bioseguridad del Tratado de Cartagenadependiente del
Convenio de Biodiversidad de PNUMA (Prog. Nac.
Unidas Medio Ambiente).
13) Qu utilidad tiene el plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens?
R: El plsmido Ti contiene lo que se conoce como
regin T, que es la regin que la bacteria transfiere a
la planta en el proceso de infeccin, y otra que contiene los genes vir que se requieren en trans para que
la regin T pueda ser transferida. En los primeros ensayos de obtencin de plantas transgnicas, la regin
T se modific, agregando los genes de inters y manteniendo los bordes derecho e izquierdo que son importantes para la transferencia. De esta forma se logr
transferir un ADN de inters a plantas. En este momento se utilizan plsmidos Ti desarmados, es decir,
que no contienen la regin T, en conjunto con plsmidos pequeos que contienen los bordes de la regin T,
flanqueando los genes de inters. Este tipo de plsmidos se denomina binarios y permiten que la manipulacin sea mucho ms simple que con el plsmido Ti
completo ya que este ltimo tiene aproximadamente
250 kpb contra las 10 kpb de los plsmidos binarios.
14) Qu tipo de plantas se suelen transformar con el
plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens y cuales
por mtodos biolsticos y por qu?
R: Si bien es posible utlizar ambos mtodos con todo
tipo de plantas, las dicotiledneas suelen ser transformadas con Ti mientras que las monocotiledneas lo
son por el mtodo biolstico debido a que existen
grandes diferencias en su eficiencia relativa. Esto es
as porque estas ltimas no son huspedes naturales de
Agrobacterium.
15) A qu se llama "vacuna recombinante"? Hay
alguna en el mercado?
R: Vacuna recombinante es aquella producida por
mtodos de ADN recombinante. En general consiste
en la produccin del gen codificante para un antgeno
(protena recombinante) en un sistema viral heterlogo. El antgeno funciona como vacuna cuando logra
despertar en el organismo una respuesta inmune que
lo protege del ataque del patgeno que lleva ese antgeno. Un ejemplo muy utilizado es la vacuna contra la
Hepatitis B,Vaccinia- rabia. Retrovirus felino para
perros....
16) Qu significa "terapia gnica"?
R: Es una terapia que implica el uso de vectores para
lograr introducir ADN conteniendo un gen funcional
en clulas de un paciente con el propsito de revertir

los sntomas de una enfermedad, generalmente producida por un gen defectuoso.

17) Cules son los riesgos para el ambiente y para la
salud humana que pueden traer estas tecnologas?
R: Las inquietudes, algunas genuinas, otras no tanto,
pueden agruparse en 3 categoras:
a) Potenciales efectos sobre la salud humana y animal
(toxicidad, alergenicidad, transferencia horizontal de
resistencia a antibiticos, ingestin de ADN forneo
que modificara nuestra constitucin gentica, utilizacin de secuencias de ADN de origen viral)
b) Potenciales consecuencias ambientales (dao a
especies ajenas al proceso, como la mariposa Monarca; la aparicin de insectos resistentes; que el cultivo
se convierta en una supermaleza; que haya flujo de
genes desde cultivos a malezas; que las protenas
transgnicas se difundan en el ambiente; que disminuya la biodiversidad y otros semejantes).
c) Preocupaciones de tipo poltico, econmico o social: concentracin de beneficios monoplicos en empresas, particularmente multinacionales; limitacin de
acceso a la biodiversidad gentica por un patentamiento concebido como apropiacin comercial no tica; avasallamiento del derecho de agricultores; acrecentamiento de brechas sociales y productivas entre
productores pequeos y grandes; crecimiento de una
agricultura industrial poco sustentable, en detrimento
de prcticas que lo sean; dificultades de la coexistencia con la agricultura orgnica.
Un riesgo que se debe considerar como de ocurrencia
probable, es que el uso generalizado de plantas resistentes a plagas y herbicidas seleccione la aparicin de
insectos y malezas capaces de superar dicha resistencia (ver problema de gentica de poblaciones en el
anexo). La experiencia acumulada en 20 aos de comercializacin masiva del primer producto derivado
de un OGM, la insulina humana, y en 10 aos de cultivos, no parece indicar que la mayora de estas inquietudes se puedan fundar genricamente en la tecnologa. Es decir, un OGM no conlleva riesgo por ser
tal, si bien podra tenerlo por el transgn especfico
que lleve incorporado. Debido a ello, los organismos
nacionales e internacionales de anlisis y regulacin
estudian caso por caso el producto final. Por ejemplo,
los riesgos de soja con resistencia a herbicidas son
distintos que los de maz con el mismo gen incorporado por ingeniera gentica (o transgn), o a los de soja
con otro transgn. Es ms, los sistemas regulatorios
suponen razonablemente que una soja resistente a un
herbicida como resultado de acciones de ingeniera
gentica tiene idnticos riesgos ambientales que una
obtenida por mtodos convencionales. Los riesgos
alimentarios se evalan de acuerdo con procedimientos bien establecidos y aceptados internacionalmente.
Adems de analizar su toxicidad y su degradacin en
jugos gstricos sintticos, se realizan pruebas de equivalencia entre alimentos derivados del cultivo convencional y otros preparados con el OGM.

45

Si bien el riesgo de que los transgenes se incorporen

por cruzamiento a otras plantas de la misma especie o
de especies relacionadas demostr ser real, los perjuicios, segn se encontr, fueron ms comerciales que
ambientales. En todo caso, la incidencia real de estos
riesgos est muy lejos de obligar a la consideracin de
un abandono de los cultivos OGMs. Por otro lado, se
comprob que, a pesar de la demora en la liberacin
de desarrollos realizados por instituciones pblicas de
OGMs con caracteres que favorecen a los productores
ms pequeos, stos tambin se beneficiaron notblemente al cultivar los OGMs de primera generacin.
18) Qu pas en Asilomar en la dcada del 70?
Qu conoce del tema de la bioseguridad del manejo
de OGMs en Argentina y en el mundo?
Lo de Asilomar est en el Recombinant DNA de Watson: Poco despus de que se descubrieran las enzimas
de restriccin y se produjeran las primeras molculas
recombinantes, cuando an no exista Greenpeace, los
propios cientficos plantearon inquietudes de bioseguridad del tipo: qu pasara si una E. coli (habitante
habitual del intestino humano) recombinante con un
oncogn se escapa al ambiente e infecta la humanidad? A partir de ese momento se disearon laboratorios con distintos niveles de seguridad: desde P1 (muy
bajo) para trabajar con plantas (no se las consideraba
peligrosas) hasta P4 (parecido a la pelcula epidemia, igual nivel de seguridad que para trabajar con
bola). Posteriormente se demostr que la excesiva
cautela no fue justificada y los niveles de seguridad se
restringieron al nivel del problema estudiado, ms que
a la metodologa. Es ms, hoy se considera ms seguro trabajar con secuencias clonadas de patgenos
(como el HIV) que trabajar con el patgeno mismo.
La Secretara de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos public en su sitio de internet un documento
donde responde a las preguntas que frecuentemente se
hace la gente sobre los transgnicos: http://www.
sagpya.mecon.gov.ar/ ir a Biotecnologa donde se
puede obtener ms informacin sobre el sistema regulatorio en Argentina.

Problemas:

-galactosidasa que da un producto azul). Como la

relacin entre colonias blancas y azules result apropiada, se decidi continuar haciendo rplicas de las
colonias en filtros de nitrocelulosa. Finalmente, los
filtros se revelaron con un anticuerpo antientomotoxina, mediante el mtodo del segundo anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina. Diga si es verdadero o falso y fundamente el razonamiento:
a) Los extremos generados por BamHI no pueden ligarse a extremos generados por MboI.
b) Se utiliz BamHI porque la enzima universalmente
reconoce los codones de iniciacin de todos los genes
permitiendo su correcta insercin en el vector utilizado con respecto a su posicin respecto del promotor
lac.
b) La ampicilina sirvi para seleccionar bacterias
transformadas.
c) La ampicilina sirvi para seleccionar bacterias
transformadas con algn plsmido recombinante (es
decir plsmido con inserto).
d) Las colonias que llevaban algn plsmido recombinante (es decir con inserto) son azules.
e) Dado que la maquinaria transcripcional de E. coli
es similar a la de B.t. fue posible encontrar algunos
clones positivos que contenan el gen de la entomotoxina completo (incluyendo su promotor) orientado
en cualquiera de las dos sentidos respecto al vector.
2) Utilizando como sonda un cDNA de la subunidad
mayor del receptor de GABA (un neurotrans-misor) y
empleando condiciones de baja rigurosidad, se aisl a
partir de una genoteca de E. coli un fragmento de
DNA (llamado ORF ms adelante) conteniendo un
marco de lectura abierto con cierta similitud de secuencia con la sonda usada. Con el objeto de identificar la funcin de este gen (la cual seguramente no es
recibir neurotransmisores) se utiliz la siguiente estrategia: El plsmido pAMPR (ver Fig.) fue digerido
con la enzima de restriccin Cla I y el fragmento de
1,6 kpb conteniendo el gen de la -lactamasa (enzima
que hidroliza a la ampicilina y confiere resistencia a
este antibitico) fue purificado e introducido en el sitio Cla I de pTETORF (ver Figura) Este plsmido
contiene el fragmento clonado (ORF) y un gen (tet r)
que confiere resistencia al antibitico tetraciclina. La
replicacin de pTETORF es termosensible, funciona a
30C y se inhibe a 42C.

1) Se desea clonar el gen que codifica a una entomotoxina proteica con propiedades insecticidas que se
encuentra en Bacillus thuringiensis (bacteria del suelo originalmente aislada de insectos muertos), pensando en producir soja transgnica resistente a lepidpte- Cla I
pTEros. Para cumplir con la primera etapa del objetivo
ORF
ampR
TORF
Cla I
planeado, se cort el DNA total de B.t. con MboI en
Cla I
cantidad limitante (tubo 1). Por otra parte, el plsmido
R
pAMP
6 kpb
Bluescript (parecido al pUC19) fue incubado con
5
kpb
BamHI (tubo 2, ver tabla de sitios de reconocimiento
en la gua 1 y comparar BamHI y MboI). Despus se
mezclaron los contenidos de los tubos 1 y 2 en pre- El plsmido recombinante pTETORFAMP se obtuvo
sencia de ligasa, incubndose durante la noche a 16 C por transformacin en una cepa de E. coli recA (in(tubo 3). Luego se transformaron clulas competentes capaz de hacer recombinacin homloga). Las bacte(permeabilizadas con CaCl2) de una cepa de E. coli rias transformadas con la ligacin se crecieron a
que era RecA-, AmpS, lac- en presencia de ampicilina, 30C. Posteriormente, el plsmido obtenido fue introIPTG y X-gal (X-gal es un sustrato cromognico de la ducido por transformacin en una cepa de E. coli sal-

vaje (recA+). Las bacterias fueron cultivadas a 42C

durante 15 horas en presencia de ampicilina y luego
una alcuota fue sembrada en gar conteniendo medio
rico y ampicilina. Se hizo un plaqueo en rplica hacia
una placa conteniendo el mismo medio ms tetraciclina. Las colonias resistentes a ampicilina y sensibles a
tetraciclina fueron utilizadas en los ensayos siguientes.
A-Cul es el objetivo del protocolo? Por qu fueron
elegidas las bacterias ampR tetS? Hubiera bastado con
determinar la resistencia a ampicilina?Por qu?
B-Qu hubiera pasado si las bacterias hubieran sido
cultivadas a 30C?
C-Qu ensayos hara para confirmar que las mutantes
aisladas tienen el genotipo esperado?
Una vez confirmada la mutacin, obtenemos como
primera conclusin que sta no parece afectar la capacidad de la bacteria para crecer en medio rico. (D-
De dnde saca esa conclusin?). El experimento siguiente fue plaquear las bacterias mutantes en medio
mnimo. No se encontraron diferencias respecto de
las salvajes en nmero ni en morfologa de colonias.
Luego de tanto tiempo de trabajo infructuoso y, con
tal de tener un resultado, los investigadores decidieron
mapear por conjugacin el locus ORF aprovechando
las caractersticas de la mutacin introducida.
E-Que caracterstica de las mutantes facilita el mapeo del locus ORF? Podra hacerlo si no la tuvieran?
Muchos aos despus, un joven e inquieto estudiante
de biologa, buscando tema para su tesis de Licenciatura, rescat de una congeladora esta vieja mutante y
se propuso caracterizarla. Su razonamiento fue: si este
gen no es esencial en condiciones de crecimiento
normales, quizs sea necesario en condiciones de
estrs (calor, fro, hiperosmoticidad, hipoosmoticidad). Haciendo curvas de crecimiento en medio lquido en estas condiciones, encontr que la cepa mutante
mostraba una marcada deficiencia (comparando con la
salvaje) para crecer a temperaturas mayores a 45C.
Al mostrarle este resultado a su ya decrpito director
ste lo desanim dicindole que seguramente tanto
tiempo en la heladera haba introducido nuevas mutaciones en la cepa. Aunque extraado el estudiante enseguida pens y realiz un experimento que despej
toda duda sobre la causa gentica de la deficiencia de
la cepa congelada.
F- Cul fue el experimento realizado?
3) Disee una estrategia detallada para expresar anticuerpos monoclonales contra el virus de la diarrea
infantil (un rotavirus) en leche vacuna, usando las
tcnicas de uso comn en ratones transgnicos. Para
ello dispone de la lnea celular necesaria (hibridoma)
produciendo dichos anticuerpos, todo tipo de variantes
de bacterias y vectores utilizados en ingeniera gentica.
4) El tema de las patentes de secuencias nucleotdicas
es polmico, particularmente en el caso de las secuencias humanas. Para analizar el tema se analiza el caso
de la patente No. 4943674 de Calgene en Estados

46

Unidos que protege a secuencias nucleotdicas de

unin de factores transcripcionales especficos de fruto. La patente protege todo uso de estas secuencias en
cuanto a su uso en la obtencin de plantas transgnicas que provoquen CUALQUIER tipo de cambio fenotpico en el fruto de CUALQUIER planta (desde
vid, sanda, citrus, peras, cerezas, ciruelas, etc. hasta
tomate, pepinos y zapallos). Para sustentar el reclamo,
la empresa provee una serie de datos experimentales.
A partir de una clonoteca (coleccin de clones) de
cDNA diferencial se clon y caracteriz la secuencia
codificante para la poligalactouronasa (PGU). Esta
enzima se sintetiza en los tomates maduros y ataca la
pared celular produciendo el ablandamiento del fruto,
proceso no deseado comercialmente. La concentracin
del mRNA para PGU aumenta ms de 2000 veces
cuando se compara la concentracin en tomates rojos
(maduros) con la de tomates verdes (inmaduros) por
lo que hipotetizan que la regulacin del gen es fundamentalmente a nivel transcripcional. Posteriormente,
clonaron y secuenciaron el gen completo de la PGU
(incluyendo su promotor) e hicieron una construccin
en la cual invirtieron la orientacin de la secuencia
codificante la cual introdujeron en plantas de tomate
(transgnicas para la misma). Como consecuencia, se
transcribe un RNA complementario al mRNA para
PGU que al formar una doble cadena con el mRNA
bloquea su traduccin (esta forma de inactivacin de
la expresin de genes se denomina estrategia RNA
antisentido). De esta forma se obtuvo el tomate
FlavSav (con mucho aroma y sabor) que constituy la primera planta transgnica liberada, comercializada y consumida a nivel mundial (1988).
I) Describa cmo obtuvieron la clonoteca diferencial.
II) Describa cmo clonaron el gen PGU completo.
III) Describa cmo hara para demostrar en forma ms
precisa, usando secuencias indicadoras (reporteras), el
control transcripcional ejercida por este promotor. No
olvide detallar construcciones, vectores, mtodos de
transformacin, evaluacin de la expresin, etc.
IV) La descripcin de la patente viene acompaada
por la secuencia nucleotdica completa del promotor
del gen de la PGU. Sin embargo la empresa se preocupa particularmente en proteger no slo la secuencia completa sino tambin cualquier fragmento parcial
de la misma por qu?
V) La secuenciacin del gen incluy al terminador del
gen. Sin embargo, a diferencia del promotor, la empresa no solicita su proteccin mediante esta patente
por qu?
VI) Si Ud. fuera funcionario de la oficina de patentes
y le toca evaluar esta presentacin particularmente en
cuanto a la amplitud de la proteccin solicitada (derechos extensivos a todas las plantas, por ej.) qu experimentos adicionales solicitara para sustentarla?
5) En la pelcula de los expedientes secretos X, se
plantean una serie de situaciones cuya verosimilitud
sera interesante constatar. Al principio de la pelcula
(30.000 aos AC) un virus extraterrestre infecta a un

47

humano primitivo. Posteriormente, ya en el presente,

los "malos" de la pelcula tratan de multiplicar este
virus para su transmisin de varias formas (en una
escena la agente Scollie se infecta al ser picada por
una abeja transmisora del virus). En otra parte de la
pelcula se comenta que el virus est siendo producido
(biotecnolgicamente) en unos maces "transgenticos". Imagine que resulta contratado por una activa
organizacin ecologista tratando de demostrar el peligroso uso de estas plantas transgenticas como arma biolgica de produccin de virus activos, cmo
hara para demostrar que tales plantas pueden realmente ser producidas? Dispone para ello de viriones
aislados de un picornavirus (virus de RNA+ a los que
pertenecen, por ej. el virus de la poliomelitis, el de la
fiebre aftosa. y que se caracterizan porque a partir de
su genoma se traduce una nica protena autoclivable
postraduccionalmente -poliprotena-) y todos los recursos posibles a su alcance.
I) Detalle cada uno de los pasos del clonado de secuencias necesarias y de las construcciones genticas
que realizara para su posterior introduccin en maz
por ingeniera gentica.
II) Indique por qu va introducira esta construccin
en maz y justifique brevemente.
III) Cmo seleccionaria las plantas transformadas?
IV) Qu herramientas moleculares y biolgicas utilizara para confirmar que el virus se produce en esas
plantas?
6) La hormona del crecimiento (HC) es una protena
que se sintetiza y se secreta en la glndula pituitaria.
La expresin de este gen depende de un factor de
transcripcin especfico llamado Pit-1, el cual reconoce la secuencia de ADN (T/A)NCTNCAT. Adems de
Pit-1, existen otros elementos regulatorios que juegan
un papel importante en la expresin de este gen como
CRE, GRE y TRE, cuyas secuencias de reconocimiento son conocidas. La zona promotora del gen HC de
pollos (HCp), no ha sido tan bien estudiada como la
de mamferos. Se describieron slo 500 pb de la regin promotora del gen HCp, lo cual no permita realizar un anlisis profundo de la regulacin de la transcripcin en esta especie. Ip, S et al. (Exp.Biol.Med
229: 640-649, 2004) decidieron entonces estudiar ms
extensamente esta zona regulatoria, y lograron identificar un fragmento de 1,8 kbp de la regin promotora
de HCp.
a) Describa cmo le parece que hicieron los autores
para clonar el gen completo de HCp (zona reguladora
de 1,8 kpb + region codificante). Qu sonda/s habrn
utilizado?
b) Cmo se le ocurre que los autores determinaron
los posibles sitios de unin de Pit-1 y de otros elementos regulatorios?
Los resultados revelaron dos sitios de reconocimiento
de Pit-1 en el fragmento de 1,8 kpb. : uno proximal
113/-104 pb y el otro distal 541/-533 pb, y un posible
motivo TRE (CAATGAGGTA) a 137/128. Para ca-

racterizar funcionalmente la zona 5 del gen HCp, se

realizaron ensayos de transfeccin in vitro usando
como gen reportero al gen de la luciferasa.
c) Qu consideraciones cree Ud. que se deberan
tener para elegir un gen reportero?
d) Que construcciones genticas los autores podran
haber utilizado para el ensayo de transfeccin?
e) Qu clulas pudieron haber utilizado para el ensayo de actividad promotora por transfeccin? Qu control/es considera Ud. que los autores deberan haber
realizado?
Con los ensayos de luciferasa concluyeron que la zona
entre 187/+48 pb es la secuencia mnima para tener
la mayor actividad promotora. Luego, para determinar
si los sitios proximales y distales de unin de Pit-1
eran ambos funcionales, midieron actividad de luciferasa en el fragmento de 1,8 kbp al cual le haban introducido, previamente, mutaciones en la zona distal,
proximal o ambas. Los resultados se muestran en la
siguiente figura.
-1727pb -541pb -113pb

+ 48pb
LUCIF.

% Act. Prom
relativa a 1
100

Pit-1
LUCIF.

80

LUCIF.

LUCIF.

100
80

motivo ADN salvaje

motivo de ADN mutado
Secuencia codificante del gen de la
enzima luciferasa.
f) Cmo interpreta Ud. estos resultados?
Finalmente compararon las zonas regulatorias del gen
HC de pavo (HCv) con las de HCp. Encontraron que
dichas zonas en ambas aves tienen un 90% de identidad de secuencia. Sin embargo, informaron que existe
poca similitud entre estas zonas del gen HCp y las
zonas regulatorias de HCm (mamferos como rata y
humanos).
g) Qu le sugieren estos resultados?
LUCIF.

48

12.- GENTICA CUANTITATIVA

Gua de estudio:
1) Qu caractersticas particulares permiten diferenciar los caracteres de herencia cuantitativa y aquellos
de herencia cualitativa?

Caracteres Cuantitativos Caracteres Cualitativos

U

Diferencias de grado

Diferencias de clase

Variacin continua:
Variacin discontinua:
Clases fenotpicas que forman Clases fenotpicas discretas
un espectro mtrico continuo
Muchos genes involucrados Pocos genes
en determinacin del carcter
Efectos individuales de los Efectos individuales de los
genes no discernibles, por ser genes discernibles
pequeos y afectados por el
ambiente
El anlisis gentico se realiza El anlisis gentico se realiza
mediante estimaciones es- por conteo y proporciones
tadsticas de los parmetros de
la poblacin, como media y
varianza

2) Qu es la heredabilidad de un carcter?
Se refiere a la proporcin de la variabilidad fenotpica
total de un carcter que es genticamente heredable
en una poblacin (h2 = VA/VP, VA = varianza gentica aditiva, Vp = varianza fenotpica; en otras palabras
h2 es la proporcin de la varianza fenotpica que se
debe a la varianza gentica aditiva).
3) Una heredabilidad de 0,4, significa que para un determinado carcter, un individuo presenta el 40% de
su fenotipo determinado genticamente, y un 60%
determinado por el medio ambiente?
R: No!!!!, es un parmetro poblacional, por lo tanto
significa que en una poblacin, slo el 40% de la variabilidad fenotpica total observada para ese carcter
est determinada genticamente.
4) Por qu es importante conocer el valor de este parmetro en el marco de programas de mejoramiento?
R: Porque permite que el mejorador tenga un indicio
de cual es la respuesta potencial a la seleccin que se
est aplicando sobre el carcter. De esta manera se
disean los cruzamientos adecuados para obtener la
mejor respuesta (mejora del carcter) evitando la depresin endogmica y la disminucin drstica del tamao poblacional.

5) a) Por qu el mejoramiento de los toros es ms

rpido que el de las vacas? Por qu es ms fcil mejorar cerdos que ovinos o bovinos?Por qu en teora
la consanguinidad no favorece un incremento en la
frecuencia de alelos recesivos en una poblacin sino
que solamente afectara la distribucin de alelos entre
genotipos?, b) Cul es la razn por la que no se obtienen lneas puras en animales?Qu son las "razas"
en trminos de mejoramiento animal?, c) Por qu la
seleccin individual se llama fenotpica y la familiar
genotpica?
R: El mejoramiento en toros es conveniente pues producen mayor descendencia que las vacas.
Los machos son siempre ms convenientes pues se
pueden evaluar ms descendientes sin alargar el intervalo generacional (edad media de los padres cuando
nacen los hijos). Adems se pueden seleccionar pocos
animales con el caracter deseado sin afectar el tamao
poblacional del rodeo.
- Es ms fcil mejorar cerdos, por ser multparos.
- Consanguinidad: p y q no se modifican. El apareamiento entre parientes no afecta las frecuencias gnicas conjuntas, sino que aumenta la frecuencia de
homocigotas. La consanguinidad har que alelos recesivos raros se presenten en homocigosis con una mayor frecuencia que si existiese apareamiento aleatorio.
- Lneas puras en animales no existen pues no hay autofecunfacin. Las razas en trminos de mejoramiento
son poblaciones altamente endocriadas.
- En la seleccin individual se elige al individuo progenitor para realizar mejoramiento por su FENOTIPO. La seleccin familiar es GENOTPICA pues se
elige por el pedigree del individuo, por ejemplo, el
carcter produccin de leche en toros se elige por su
ta, madre o abuela.
5) A qu se denominan QTL? R: El trmino se aplica
a los loci que afectan caracteres cuantitativos. Es
decir que se refiere a la ubicacin de genes que afectan caracteres que pueden ser medidos en una escala
lineal o cuantitativa. El mapeo de QTL es una tcnica
de mapeo por recombinacin y requiere de: 1) uso de
grupos de individuos que difieran marcadamente en el
carcter que se quiere mapear; 2) identificacin de
aquellos marcadores moleculares polimrficos que
difieran entre ambas lneas; 3) anlisis de la F2 segregante entre ambos grupos (o de la retrocruza o de
RIL!!!!), tanto en cuanto a los marcadores moleculares como en cuanto a los valores para el carcter cuantitativo en estudio, 4) anlisis estadstico de los datos
(ANOVA simple o de regresin como primer paso
crudo - el anlisis real requiere mapeo del intervalo
compuesto con estadstica de mxima probabilidad
para estimar valores LOD a lo largo del cromosoma).
6) Qu son las lneas recombinantes endocriadas o
RILs (recombinant imbred lines)?y las lneas haploides duplicadas? R: Las RIL son lneas endocriadas
con 9 o ms generaciones (14 en Drosophila) de autofecundacin o endocra (cruzamiento entre hermanos)
y son, por lo tanto, prcticamente homocigotas. Sue-

49

len ser derivadas de un cruzamiento entre dos parentales altamente divergentes (contrastantes) para uno o
ms rasgos cualitativos o cuantitativos representando
diferentes combinaciones aleatorias de alelos que estaban fijados en las lneas parentales. Se parte de una
F2 (o retrocruza de F1 por un parental). Es una alternativa al cruzamiento prueba dado que todos los segregantes sern homocigotas dominantes o recesivos.
Otra ventaja es que la autofecundacin (o endocra) de
las lneas mantiene el genotipo (no hay segregaciones), lo que permite su mantenimiento (inmortalizacin) y distribucin entre distintos grupos que compatibilizan mapas genticos. Los haploides duplicados
tienen las mismas caractersticas, pero se obtienen por
un mecanismo distinto. En muchas plantas es posible
cultivar anteras (gametas) in vitro de forma de generar
plantas haploides. Partiendo de una F1 se obtienen,
entonces, gametas haploides que generan plantas que
combinan genes de distintos loci de las dos lneas paternas. Cuando se las trata con colchicina, se pueden
duplicar los cromosomas dando individuos diploides
que son homocigotas porque los cromosomas homlogos representan copias idnticas del mismo cromosoma del haploide original.

Problemas:
1) Suponga que dos pares de genes con dos alelos cada uno Aa y Bb, determinan en una poblacin la altura de las plantas en forma aditiva. El homocigota
aabb tiene una altura de 30 cm y el AABB, 50 cm.
a) Cul es la altura de la F1 de un cruzamiento entre
estas dos cepas homocigotas?
b) Despus de un cruzamiento F1xF1, qu genotipos
de la F2 presentarn una altura de 40 cm?
c) Cul ser la frecuencia de estas plantas en la F2?
d) Si se seleccionaran los individuos de 45 cm o ms
de altura para obtener la siguiente generacin, cul
sera la altura media de sta?
2) Se cruzaron dos razas diferentes de maz, cada una
con una altura media de 1,72 m y se obtuvo una F1
con una altura media tambin de 1,72 m. En la F2 haba una considerable variacin que iba de 0,91 m a 2,5
m. De las 1942 plantas consideradas, 8 alcanzaban
una altura de 2,5 m y 7 una de 0,91 m. La altura del
maz, sera para Ud. un carcter cualitativo o cuantitativo? Por qu? Cuntas parejas de genes estn implicadas en la determinacin del carcter segregaron
en la F2? Explique estos resultados en trminos gnicos asumiendo que el ambiente fue mantenido constante en todos los casos.
3) Johannsen midi el peso de las semillas de porotos
de la variedad Princesa. Los porotos son autgamos
(autofertilizados) y por lo tanto esta variedad es una
lnea pura. Los pesos en centigramos de una muestra
pequea pero representativa se enumeran a continuacin:
19 31 18 24 27 28 25 30 29
22 29 26 23 20 24 21 25 29
a) Calcule el peso promedio y la desviacin estndar
de las alubias en esta muestra.
b) Calcule la varianza ambiental.

c) Calcule la heredabilidad del peso de las alubias en

esta variedad.
d) Si el peso promedio de las alubias seleccionadas
para ser progenitores es 30 cg, prediga el peso promedio de las alubias de la siguiente generacin.
4) Al medir el contenido en protenas por mg de materia seca de las plantas de una poblacin se obtuvieron
los siguientes resultados:
Protenas (unidades arbitrarias):
3 4 5 6 7 8 9 10 11
N de individuos 1 3 6 10 18 13 6 2 1
Al seleccionar como progenitores para formar la generacin siguiente los individuos con contenido proteico
superior a 7 unidades se obtuvieron los siguientes resultados:
Protenas (unidades arbitrarias):
3 4 5 6 7 8 9 10 11
N de individuos 0 3 4 10 18 9 6 2 0
A la vista de estos resultados, se desea saber:
a) El valor de la heredabilidad del carcter "contenido
de protena"
b) De acuerdo con dicho valor de la heredabilidad,
qu consecuencia se puede sacar respecto al componente gentico del carcter analizado?
c) Podra darse esta interaccin en una algama?
5) Si 3 genes que segregan independientemente, con
dos alelos cada uno, determinan la altura de una determinada planta, por ej.: Aa, Bb y Cc, de modo que
la presencia del alelo representado por la mayscula
aada 2 cm a la altura base (que es de 2 cm).
a) Indique la altura que esperara en la F 1 de un cruzamiento entre las cepas homocigotas AABBCC (14
cm) X aabbcc (2 cm).
b) Indique la distribucin de las alturas (fenotipos y
frecuencias) que se espera en un cruzamiento F1 X F1.
c) Qu proporcin de esta F2 tendra la misma altura
que las cepas paternas?
d) Si los alelos representados por maysculas actuasen
como dominantes, por ej.:
A_B_C = 8 cm, cules seran las respuestas a los
epgrafes a), b) y c)?
e) Si los alelos representados por maysculas actuasen
multiplicando la altura existente, por ej.: Aabbcc= 4
cm, AAbbcc= 8 cm, AABbcc= 16 cm, etc., cules
seran las respuestas a los puntos a), b) y c)?
6) Tiempo atrs sali en los diarios el descubrimiento del gen del temor (o cobarda) en ratas de laboratorio basado en diferencias observadas en el patrn
de comportamiento de ratas frente a la aplicacin de
shocks elctricos poco despus de hacer sonar un sonido peculiar en un lugar de sus laberintos. Las ratas
temerosas desarrollaron un reflejo condicionado de
cobarda por el que huan rpidamente al escuchar el
sonido o cuando eran colocadas en ese lugar del laberinto, sin necesidad de aplicar el shock elctrico.
El grado de cobarda se estableci cronometrando el
tiempo que tardaban las ratas en huir despus de emitirse el sonido caracterstico y al ser colocadas en el
lugar prefijado. Se analiz la influencia del cromoso-

50

ma 1 en este comportamiento mediante cruzamientos

controlados. Se estudiaron distintas RILs para dicho
cromosoma obtenidas a partir de un cruzamiento entre
lneas temerosas y valientes.
a) Haga un esquema de los cruzamientos con los que
se obtuvieron las RILs ejemplificando con el caso de
este problema.
Valor proEsquema 1
Sondas RFLP Xabg XKna XCent Xpsr medio y
601
1
1
121 desvo

Padre valiente
10 2,8
Padre temeroso
0,9 0,3
Clase 1
1 0,5
Clase 2
9 2,5
Clase 3
10 2,6
Clase 4
9,5 2,4
Clase 5
0,8 0,4
Clase 6
1 0,6
Clase 7
8,5 2,3
Clase 8
0,9 0,6
Clase 9
1,3 0,7

En el esquema 1 se representa una regin del cromosoma 1 en las distintas familias recombinantes (negro
perteneciente al padre temeroso, blanco perteneciente
al padre valiente). De cada clase recombinante esquematizada se obtuvieron al menos 50 ratas que fueron ensayadas biolgicamente mediante un diseo
estadstico apropiado. Para cada clase recombinante se
obtuvo un promedio y un desvo estndar. Indique
cmo se hizo para ordenar los distintos marcadores en
el cromosoma 1
b) Porqu se utilizaron 50 ratas de cada una de las
lneas recombinantes y no solamente una?
c) Qu conclusiones puede sacar acerca de la localizacin gentica del temor? Est este QTL ubicado en
el cromosoma 1? Podra Ud localizar ms de un
QTLs en el esquema 1? Supone que puede estar ubicada en otras partes del genoma? Por qu?
d) Podra haber utilizado otro mtodo alternativo pa-

ra llegar a las mismas conclusiones?

e) Reflejan los datos la ocurrencia de segregacin
transgresiva? Por qu?
f) En el esquema siguiente se representa uno de los
RFLPs obtenidos para los padres temeroso y valiente,
respectivamente, utilizando la sonda Xabg601 y la
enzima Eco RI. Complete el patrn obtenido para cada
una de las clases recombinantes endocriadas.
Padres
T V 1 2

Clases Recombinantes
3 4 5 6 7 8

6) El enanismo es un carcter muy buscado en trigo

porque est asociado a una menor susceptibilidad al
vuelco y a un mayor rendimiento. Para estudiar este
carcter se construyeron lneas de sustitucin cromosmica entre las variedades Mara y CappelleDesprez. Es decir, se obtuvieron distintas lneas de la
variedad Cappelle-Desprez las cuales tienen alguno de
sus cromosomas reemplazados por los de la variedad
Mara. Mara es como 12 cm ms baja que C-D (cuyo
promedio de altura es de 103 cm de alto, ver ordenadas del grfico). Observando el grfico adjunto:
a) Qu clase de carcter es la altura?
b) Qu podra decir acerca de la cantidad y de la localizacin de los genes de altura de Mara?
c) Puede existir algn otro gen relacionado con altura
que no est siendo detectado por este anlisis?
d) Podra sospechar algn efecto episttico para el
carcter altura a partir de este anlisis?
e) Considera que a partir del cruzamiento se podran
obtener lneas ms bajas (o ms altas) que estas variedades parentales (por segregacin transgresiva)?
f) Servira este mtodo de utilizacin de lneas de
sustitucin para asignar una localizacin cromosmica
a marcadores moleculares?

51

13. GENTICA BACTERIANA

Bibliografia Microbial Genetics, D. Freifelder, Jones
and Bartlett Publishers, Inc. Modern Microbial Genetics. Streps UN y Yasbin RE (1991) J Wiley Sons.

Gua de Estudio:
1) Cmo es la estructura de una clula bacteriana?
Como est organizado su genoma?
R: La clula bacteriana (gram-) contiene dos membranas externas que encierran el espacio periplsmico y
una pared celular, generalmente de pptidoglucano,
que le otorga rigidez y protege de los shocks osmticos. La membrana interna encierra al citoplama, separndolo del periplasma. En el citoplasma encontramos toda la maquinaria necesaria para la sntesis de
cidos nucleicos y protenas. La membrana interna es
compuesta por una bicapa lipdica mayormente de
fosfolpidos, mientras que la externa contiene una
hemimembrana interna similar y una capa externa de
lipopolisacrico. Las bacterias gram+ no tienen membrana externa y la pared de peptidoglicano es ms
gruesa que la de las gram-.
Si bien no existe un ncleo, como en las clulas eucariotas, el ADN se encuentra organizado en el nucleoide, que es una masa de ADN y protenas (80% ADN),
que puede ser observado por microscopa. El nucleoide contiene dominios cuyo grado de superenrrollamiento no es afectado por los dominios vecinos. Este
grado de independencia sugiere que los dominos estn
asociados a una matriz que impide que se transfieran
las tensiones entre ellos. El cromosoma bacteriano no
est tan empaquetado como el de los eucariotas, pero
se encuentra asociado a una serie de protenas que
cumplen funciones anlogas a las de las histonas, como ser HU, HN-S, Fis e IHF.
En la mayora de los casos conocidos, las bacterias
poseen un nico cromosoma circular que se replica en
forma bidireccional. Pueden contener plsmidos grandes (el factor F o el plsmido Ti, por ejemplo, pueden
llegar a tener 200 kpb y pueden servir como vectores
para ingeniera gentica: BAC).
2) Cmo se multiplican las bacterias?
R: Se reproducen asexualmente por divisin binaria
(aunque no es la nica forma). Es asexual y en los libros viejos se la llama fisin). Incluso las bacterias
que esporulan (Bacillus y Clostridium) lo hacen
asexualmente y son un ejemplo del fenmeno de diferenciacin celular.
3) Qu es un cultivo lquido? Y uno slido? Para
qu se utiliza cada uno?
R: Medio de cultivo lquido: es un medio que no tiene
soporte slido, donde los microorganismos crecen en
suspensin y los nutrientes difunden libremente, por
lo que existe competencia por ellos entre los microorganismos. El medio lquido se puede realizar en tubos
de ensayo (pocos ml), Erlenmeyers (decenas o cientos
de ml) o en fermentadores de varias escalas.
Medio de cultivo slido: difiere del lquido en el agregado de una matriz inerte que sirve de sostn para el
crecimiento bacteriano. Esta matriz es por lo gene-

ral de gar, un polmero extrado de algas, de consistencia similar a una gelatina. El crecimiento bacteriano ocurre sobre la superficie del gar, de forma que
los microorganismos no pueden moverse libremente y
forman colonias aisladas. Los componentes solubles
del medio difunden lentamente, por lo que disminuye
considerablemente la competencia entre los microorganismos que comparten el medio de cultivo. El medio slido se suele realizar en cajas de Petri (de varios
tamaos y formas), o en frascos chatos (de Roux, utilizados para clulas tipo fibroblastos). Cada microorganismo origina una colonia, que en muchos casos,
por sus caractersticas, permite la identificacin del
microorganismo que la gener.
Los medios de enriquecimiento permiten aumentar la
proporcin de un microorganismo determinado en una
poblacin heterognea. Para ello debe haber competencia entre las distintas cepas microbianas, de forma
tal que aumente la proporcin de aquellas para las
cuales el medio de cultivo es adecuado. Es por ello
que los medios de enriquecimiento son lquidos, de
forma de facilitar la difusin de nutrientes y/o de inhibidores que se utilicen.
El medio slido sirve para aislar colonias (clones) individuales (purificar). El medio lquido sirve para obtener masa (gran cantidad) de clulas, por ejemplo,
para obtener plsmidos en forma preparativa.
4) Qu diferencia un medio selectivo de medio diferencial. R: Un medio selectivo es aqul donde slo
crecern determinadas cepas o especies. Es un caso
extremo de medio de enriquecimiento, pero dado que
la competencia entre microorganismos no es necesaria, se utilizan medios slidos. Un ejemplo de medio
selectivo es el que utiliza un antibitico que slo permite el crecimiento de las cepas resistentes.
Un medio diferencial es aquel que permite diferenciar
al menos una de las distintas cepas/especies de una
muestra. Los medios diferenciales son slidos, para
permitir el crecimiento aislado de las distintas colonias, de forma tal que puedan distinguirse. El medio
diferencial no impide el crecimiento, simplemente
permite diferenciar. (ej. bacterias lac+ vs lac- en presencia de X-gal).
5) Diferencie entre un medio completo y uno definido
Para qu los utilizara? R: Medio completo es el que
contiene todos los nutrientes incluyendo fuentes de
carbono y nitrgeno necesarias para el crecimiento
pero no estn bien definidos en su composicin que
puede variar levemente de partida a partida. Por ej. la
triptona del medio LB es un hidrolizado de casena
con tripsina, el extracto de levadura es un extracto
soluble de levaduras hidrolizadas. El medio definido,
en cambio, contiene componentes y concentraciones
de aminocidos individuales y vitaminas (por ejemplo
biotina para E. coli) perfectamente establecidos y
constantes.
6) Qu es la tcnica de plaqueo en rplica (replica
plating)? Para qu sirve?

52

R: Cuando obtenemos sobre la superficie del agar de

una caja de petri un nmero de colonias, cada una de
las cuales proviene de un solo microorganismo y debemos analizar su comportamiento en distintos medios de cultivo, existe la posibilidad de replicar dicha placa de petri. Esto implica obtener otra placa con
la misma distribucin de colonias, cada una de las
cuales debe ser genticamente idntica a la de la placa
madre. Para ello se usa un trozo de terciopelo estril,
que cubre un lado de un cilindro del dimetro de la
caja de petri. El cilindro se coloca suavemente sobre
la caja de petri a replicar, contactando el terciopelo
con las colonias. Algunos microorganismos de cada
colonia quedarn adheridos al terciopelo, y este se usa
a la manera de un sello en una caja de petri vaca.
En esta ltima, crecern colonias idnticas a las originales, en la misma posicin. Podramos evaluar, por
ejemplo cuales son resistentes a un antibitico determinado, con lo que bastara con preparar una placa
con dicho antibitico y hacer la rplica a dos placas,
una con y otra sin antibitico.
6) Qu es una placa (playa o calva) de lisis?
R: La difusin limitada que se observa en los medios
slidos tambin puede ser utilizada para estudiar fagos
(virus) bacterianos. Si distribuimos sobre una placa de
petri un cultivo denso de bacterias, ellas crecern cubriendo toda la superficie, lo que llamamos csped.
Si antes de sembrar la placa, mezclamos las bacterias
con una suspensin diluda de fagos, stos infectarn
y lisarn las bacterias y en la superficie del gar se
observar un halo translcido por cada fago infectivo
como consecuencia de la lisis localizada de bacterias.
Es decir, las bacterias son el medio de cultivo de los
fagos. Esto no slo permite titular (contar) suspensiones de fagos, tambin permite trabajar con ellos en
forma anloga a lo que hacemos con otros microorganismos. Existe un mtodo anlogo para estudiar virus
animales, aunque eso se hace sobre monocapas de
clulas en cultivo.
Para obtener un nmero bajo y cuantificable de placas
se requiere mezclar un exceso de bacterias con una
cantidad mucho menor de viriones (a esto se le llama
baja multiplicidad) de manera que la probabilidad de
que 2 partculas virales distintas penetren en la misma
clula sea insignificante. Despus se plaquean las
clulas sobre la caja de Petri.
7) Qu se entiende por "sexo" en organismos procariticos (NO en eucariticos!)?
R: A los bizarras formas de transferencia parcial de
ADN entre bacterias de la misma o de distinta especie: transformacin, a travs: bacterias muertas que
actan como machos (donantes); transduccin, a
travs de sus virus; conjugacin: a travs de plsmidos
y estructuras de secrecin que conforman puentes celulares.
8) Describa brevemente el mecanismo de conjugacin.
Siempre se observa transferencia de informacin
gentica cromosmica?

R: Se produce entre una bacteria conteniendo un

plsmido conjugativo (histricamente denominado
Factor F o episoma) llamada F+ y una que no lo contiene. La conjugacin es el mecanismo por el cual una
bacteria transfiere a otra una hebra simple de ADN. El
mecanismo es similar al de replicacin por crculo
rodante (rolling circle). Primero se genera un corte
(nick) en una de las cadenas, ms precisamente en la
regin conocida como oriT, por origen de transferencia. En el sitio de corte, una helicasa comienza a separar ambas cadenas, a partir de ese punto comienza la
transferencia de una de ellas. La transferencia termina
cuando se transfiere la secuencia completa (plsmido,
por ejemplo) o cuando se interrumpe el contacto entre
la bacteria aceptora y la dadora (transferencia cromosmica). En el caso de los plsmidos, cuando finaliza la transferencia se recircularizan utilizando el oriT
y la cadena complementaria se sintetiza de novo tanto
en la bacteria dadora como en la aceptora.
Adems del oriT, los plsmidos transmisibles contienen una serie de genes que son necesarios para la
transferencia, los genes tra. Estos genes codifican para
el pilus que es una estructura que protruye de la
bacteria dadora y hace contacto con la bacteria receptora y facilita la formacin de complejos de secrecin
tipo III. Adems del pilus, otros genes tra codifican
para protenas que no tienen un rol estructural, como
ser la endonucleasa que realiza el corte inicial y la
helicasa .Otro tipo de plsmidos que no son transmisibles, pero si son movilizables se encuentran en la naturaleza. Dichos plsmidos no contienen el juego
completo de genes tra, pero s contienen la regin
mob, que permite que los genes tra de un plsmido
transmisible puedan actuar en trans para transferir a
los plsmidos movilizables. La regin mob contiene
un origen de transferencia y algunas de las enzimas
necesarias para la transferencia, como ser la endonucleasa y la helicasa.
En el caso ms comn, slo se transfiere una copia (en
general completa) del plsmido (ej. factor F) por lo
que la clula receptor (F-) se convierte en F+. NO hay
tranferencia de genes cromosmicos ni, por lo tanto,
aparicin de recombinantes para genes crosomales; a
menos que estos se encuentren transpuestos en el Factor F (sexduccin), lo que no es muy comn. Esta
forma de apareamiento permite transferir horizontalmente (es decir, incluso entre especies distintas como E. coli y Salmonella typhimurium) genes nuevos
importantes como pueden ser los genes de resistencia
a antibiticos que pueden ubicarse en plsmidos por la
susodicha transposicin. Se observa transferencia de
ADN cromosmico en donantes Hfr (factor F cointegrado al genoma cromosomal) o en sexduccin (factor
F recombinado = F conteniendo algn gen cromosomal).
9) Cul es la diferencia entre una cepa Hfr y una F+?
R: Hfr proviene de High frequency recombination.
El plsmido F tiene aproximadamente unas 100 kpb y
codifica para los genes tra que lo hacen transmisible,

53

manteniendo en general una copia por clula. Las cepas F+, son las que contienen el plsmido F como episoma. Como el plsmido F tiene algunas secuencias
homlogas a secuencias cromosmicas (transposones
llamados elementos IS), en algunos casos ocurren
eventos de recombinacin, donde el plsmido F se
integra al cromosoma. En estos casos, el oriT y los
genes tra siguen siendo funcionales, y promueven la
transferencia del cromosoma, que puede llegar incluso
a ser completa. La transferencia cromosmica es la
causa de la alta frecuencia de recombinacin de estas
cepas y de all su nombre Hfr.
La cointegracin del plsmido (la cual se produce,
usualmente, por entrecruzamiento via recombinasa
(rec A combinada con recBCD) entre el cromosoma y
el factor F en regiones con secuencias homlogas,
usualmente transposones duplicados en ambos ADNs
o, ms raramente, como producto de una transposicin
sin resolucin). Resolucin quiere decir: separacin
de los 2 crculos cointegrados despus de que se produjo la copia o transferencia del transposn entre el
crculo de ADN dador al receptor).
10) Qu es un F' y cmo se origina?
R: Un F es un plsmido derivado del F que contiene
fragmentos de ADN cromosmico. Cuando un
plsmido F se escinde de una cepa Hfr (resolucin),
en general ocurre por recombinacin entre los sitios IS
flanqueantes (los mismos que permitieron la integracin). Hay casos en que los eventos de recombinacin
ocurren entre secuencias ms lejanas (otros elementos
IS o secuencias homlogas) y el plsmido que se escinde es mayor que el original y contiene el fragmento
cromosmico que estaba contenido entre las secuencias que recombinaron. Estos plsmidos F se denominan F. Tambin se pueden generar plsmidos F por
otros mecanismos como ser la transposicin.Un F es
una forma natural (in vivo) de clonado molecular en
un vector plasmdico, sin uso de enzimas de restriccin, muy usada por los genetistas bacterianos. Los
genetistas bacterianos suelen utilizar, para ello, un
virus-que es, al mismo tiempo, un transposn llamado
fago .
11) Cmo determinara orden y distancia entre genes
utilizando la tcnica de "apareamiento interrumpido"?
R: Cuando una cepa Hfr conjuga con una cepa F-, el
ADN se transfiere desde el oriT. Puede llevar ms de
una hora y media la transferencia completa, lo que
generalmente no ocurre. El ADN transferido puede
recombinar con el cromosoma de la cepa aceptora.
Dado que en la suspensin, la interrupcin de la conjugacin ocurre durante todo el proceso, la frecuencia
de recombinantes cae exponencialmente con la distancia al oriT. La frecuencia de recombinacin para un
marcador es entonces una medida de la distancia al
oriT. Para determinar el orden entre dos marcadores
se analizan la cantidad de recombinantes dobles.
Cuanto mayor es la frecuencia de aparicin de los dobles recombinantes, menor es la distancia entre ellos
(menor es la frecuencia de recombinantes entre ellos).

Por lo tanto, se hace cronometrando la aparicin de

recombinantes en una conjugacin entre una Hfr y una
F-que se interrumpe artificialmente con una licuadora
a distintos intervalos y que implique la transferencia
de alelos diferenciables de los genes a estudiar.
12) Algunos bacterifagos tienen la capacidad de llevar a cabo dos tipos de ciclos dentro de su hospedador. Explquelos y ejemplifique. Qu es un profago o
un provirus?
R: Existen fagos en los cuales el proceso de infeccin
puede tomar por dos vas antagnicas, lisis o lisogenia. En el ciclo ltico, la funciones tempranas y tardas
codificadas por el fago son activadas en forma programada originando un gran nmero de partculas virales y provocando finalmente la lisis. En el ciclo lisognico, la mayor parte de los genes virales son reprimidos, el ADN viral se cointegra al genoma bacteriano formando un provirus (llamado profago en bacterias) y se multiplica silenciosamente en la bacteria.
Hay procesos externos, como el dao al ADN que
producen la activacin del ciclo ltico.
Esta cointegracin puede ser mediada por enzimas de
recombinacin codificadas por los virus como es el
caso de la integrasa del fago que, a diferencia de la
recombinasa del husped, produce recombinacin especfica de sitio (una secuencia de ADN llamada attB,
presente entre los operones gal y bio de E. coli. Como
esto es muy distinto a la recombinacin homloga
tradicional, se lo denomina recombinacin ilegtima.
El virus HIV (y otros retrovirus eucariticos) tambin
tienen una fase proviral. Si bien el mecanismo es ms
complejo, los retrovirus son capaces de transducir genes cromosomales (por ejemplo se ha estudiado mucho la transduccin de oncogenes entre clulas eucariticas, al igual que lo hacen los fagos en bacterias).
13) Compare transduccin generalizada y especializada. R: En la transduccin, un bacterifago (virus)
transfiere DNA desde la bacteria en la cual se reprodujo a la bacteria que infecta. El virus debe tener la
caracterstica de no producir la lisis del hospedero al
cual transfiere el material gentico, es decir la partcula viral debe ser defectiva. Existen diferentes tipos de
transduccin, ellas son:
Los fagos que las realizan tienen estrategias diferentes
de encapsidacin. Los fagos que permiten la transduccin generalizada (por ej. P1) no son capaces de
reconocer especficamente el ADN que encapsidan
por lo que son capaces de transducir cualquier segmento de ADN cromosmico, sin importar su secuencia. Es decir que, potencialmente, pueden transferir
cualquier segmento cromosmico del tamao apropiado. Es decir, que es aquella en que cualquier porcin del genoma del hospedante del virus puede
hacerse parte de la partcula viral madura reemplazando al ADN viral.
Transduccin Especializada o Restringida. Se define a
sta cuando el virus slo puede transferir determinados genes bacterianos cercanos a su sitio de integracin genmica.

54

Los fagos que permiten t.e. son aquellos que pueden

pasar por una fase lisognica (por ej. el fago ) integrndose en un sitio preciso del genoma (entre los
operones gal y bio en el caso de ) y tienen mecanismos de reconocimiento de ADN al encapsidar (tipo
secuencia cos del fago ) por lo que slo son capaces
de transportar genes vecinos al sitio de integracin
que accidentalmente permanecen unidos al genoma
viral en el entrecruzamiento que se produce al resolver
el cointegrado (como primer paso hacia la activacin
de la fase ltica). Adems, en la t.g. el segmento de
ADN donante se incorpora por recombinacin homloga reemplazando al alelo nativo (la clula sigue
siendo monoploide). En la t.e. el ADN donante se integra como si fuera un profago y se produce un diploide parcial. Nota: todo esto se puede resumir en un
cuadro.
14) Cmo sera afectada en su capacidad de dar colonias transducidas una cepa bacteriana rec-(deficiente
en los sistemas de recombinacin celulares) al infectarla con un lisado transductor de el bacterifago ? y
por el fago P1?
R: La induccin del fago requiere de la protena RecA. RecA se activa por dao cromosmico (por formacin de ssDNA que es sustrato de RecA) y, a su
vez, esta interacta con el represor del ciclo ltico.
Esto produce la derrepresin de las funciones lticas y
el ciclo ltico comienza.
El fago se integra como profago al genoma bacteriano en sitios especficos, attB. Requiere adems funciones celulares como IHF y la integrasa que es una
recombinasa especfica de secuencia (la secuencia
attB) de , pero NO requiere RecA. Esto implica que
no se vera afectada la capacidad de transducir si la
cepa aceptora es RecA-.
En el caso del fago P1, la capacidad de transduccin
se vera afectada, ya que el fago P1 transduce fragmentos de ADN cromosmico de la cepa dadora que
tienen que recombinar con las porciones homlogas
de la cepa aceptora.
15) Pueden recombinar los virus entre s? Qu mecanismos estn involucrados?
R: S. En los casos de virus con genoma de ADN de
doble cadena: recombinacin homloga usando las
enzimas de la clula husped. En los virus a ADN de
simple cadena, la recombinacin puede realizarse entre las formas replicativas (que son de doble cadena).
Hay mecanismos de (pseudo)recombinacin en virus a
ARN cuya explicacin excede lo que se pretende ensear en la materia.
16) Describa algunas aplicaciones de la utilizacin de
fagos para la ingeniera gentica.
R: El fago es un vector ampliamente utilizado en
ingeniera gentica en el que el ADN conteniendo los
genes codificantes para lisogenia fueron artificialmente reemplazados por ADN (por ej. humano) que es
transducido sin posterior lisogenizacin a bacterias
(que no tienen otra opcin que ser lisadas) para su
clonado molecular, conservacin y multiplicacin.

Genes de salvaje
En recombinante
lisis lisogenia lisis lisis inserto lisis
17) Qu es la transformacin bacteriana? Se logra
nicamente en forma artificial o tambin ocurre en
poblaciones naturales?
R: La transformacin bacteriana es un proceso por el
cual las bacterias incorporan ADN del medio. Se logra
en condiciones de competencia, es decir, cuando las
bacterias son competentes para la transformacin. La
competencia puede ser natural, lo que se observa en
algunas especies o puede ser inducida en laboratorio.
La transformacin natural implica, entre otras cosas,
el ingreso de ADN de simple cadena en la clula receptora despus de un reconocimiento por receptores ubicados en la periferia celular, un reemplazo allico en las colonias recombinantes. En la transformacin artificial (tambin llamada transfeccin), las
clulas son forzadas a permeabilizar el ingreso de
ADN (que suele ser de doble hebra como por ejemplo
un plsmido) mediante mecanismos artificiales. E.
coli, por ejemplo, no es una bacteria que intercambia
ADN por transformacin en la naturaleza y es la bacteria que ms se transforma (= transfecta) en el laboratorio. Se puede esquematizar en un cuadro.
18) Se pueden mapear genes por transformacin?
R: S; en forma similar a la transduccin, la eficiencia
de cotransformacin es una medida de la cercana de
dos loci determinados. Contrariamente a los mapeos
utilizando cepas Hfr, pero en forma similar a la transduccin, la transformacin es til para los mapeos
finos. Al igual que en la transduccin generalizada, el
% de cotransformacin de 2 genes es inversamente
proporcional a su distancia. Estos mtodos de mapeo
gentico en bacterias han sido totalmente reemplazados, en la actualidad, por mtodos de mapeo fsico por
lo que se les prestar menor importancia a la que se le
da en los libros de texto.
19) El grfico muestra el resultado de un experimento
de apareamiento interrumpido entre las siguientes cepas de E. coli:
Hfr: a+ b+ c+ d+ strps X F-: a- b- c- d- strpr

c + strpr
a + strpr

50

d + strpr
b + strpr
5

10

15

20 Min.

a) Defina en forma precisa a las variables del eje X y

del eje Y.
b) Por qu algunos marcadores alcanzan valores de
frecuencias ms altos que otros?
c) Deduzca el orden y la distancia gentica en minutos. Qu puntos de la curva utiliz?
d) Cul es la utilidad de la resistencia a antibitico
que posee la cepa receptora?

55

R: a) eje x: nmero de recombinantes / 100 bacterias

Hfr; eje y: tiempo en minutos, posterior a la mezcla de
los parentales.
b) Frecuencia mayor: ms prximos al origen de
transferencia. Los marcadores que entran antes estn
representados en una proporcin mayor de recombinantes ya que tuvieron ms tiempo para integrarse.
c) orden c a d b
tiempo 3 4 9 14punto donde cruza eje x (y=0)
3 es el tiempo al cual se transfiere el primer marcador
d) distinguir recombinantes a+ b+ c+d+ str R de los
parentales Hfr a+ b+ c+ str s. Elimina a cepa dadora.
20) En la hmeda profundidad de la Baticueva, el
Hombre Murcilago intenta olvidar su desengao
amoroso con una famosa reportera de Ciudad Gtica
mapeando una cepa bacteriana hilarante desarrollada
en los laboratorios secretos del Guasn. Mientras Alfred le acerca un sabroso vaso de leche cultivada con
una bacteria probitica genticamente modificada, el
encapotado contempla los datos proporcionados por la
BatiPC:
Resultados de la transferencia por conjugacin de material
gentico en secuencias diferentes. Se indica tiempo de entrada en un receptor F- (dador Hfr):

cepa
1

genes
ja
je
ji
jo
tiempo 15 21 32 48
genes
ju
ji
jua jo
jue
57
2
tiempo 10 17 22 33
genes
jui juo juu ay
jo
jua
11 33 48
49 60
3
tiempo 6
genes
juo jui ja
ju
4
tiempo 18 23 35 45
Podr Bruno Daz construir un mapa gentico que
incluya todos estos hilarantes marcadores y sealar la
distancia de tiempo entre genes adyacentes? No se
pierda la continuacin de este batiapasionante captulo, a la misma batihora, por el mismo baticanal y en la
misma batimateria.
R: JA JE JU JI JUA JO AY JUU JUE JUO JUI y,
dando la vuelta, de nuevo JA. De una forma similar a
esta se demostr por primera vez la circularidad del
genoma de E. coli. Era la nica forma de justificar
resultados como stos.
Nota sobre el enunciado: las bacterias probiticas
(tipo la Lactobacillus casei del Actimel) suelen producir una modificacin favorable o reconstitucin de
la flora bacteriana intestinal (por ejemplo por cambio
del pH intestinal). No hay evidencia cientfica clara de
que produzcan ninguno de los efectos que muestra la
publicidad. Es ms, este tipo de publicidad est prohibida en la mayora de los pases del primer mundo.
Algunas bacterias del yogur (como el famoso Lactobacillus G de origen francs que comercializa La Serensima) estn genticamente modificadas e incluso
contienen genes de resistencia a antibiticos, aunque
fueron obtenidos por mecanismos de gentica bacteriana (como en los ejercicios de esta gua ingeniera
gentica in vivo) por lo que las legislaciones no los
consideran OGMs y los fabricantes (y los ecologistas)

niegan su transgenicidad (fueron obtenidos por mejoramiento convencional y no por ingeniera gentica).

Problemas:
1) Bitcora de vuelo: fecha espacial 1654.9. Habla e1
capitn Kirk. Toda la tripulacin del Enterprise sufre
una diarrea infernal. E1 seor Spock afirma que se
trata de una extraa bacteria intestinal proveniente de
la tercera luna del cuarto planeta de la segunda estrella
del sistema Papanpulos XXXIII. Sospecho que la
bacteria fue introducida involuntariamente por el seor Cheko despus de la ltima visita a su novia en
Nueva Creta. En el tiempo que le queda libre despus
de repartir pastillas de carbn, el doctor McCoy logr
identificar cuatro genes implicados en la regulacin de
un sistema enzimtico. Tambin aisl una mutante: Fa-,b-,c- y d- StrR, la cual normalmente da revertantes
a+, b+, c+ o d+ a una frecuencia aproximada de 1
colonia revertante por cada 107 clulas sembradas en
el medio selectivo correspondiente. Con esta cepa
aisl un clon con las mismas auxotrofas (a-b-c-d-) y
con la misma tasa de reversin hacia a+ y d+ pero
con una frecuencia de aparicin de revertantes c+ y
b+ reducida a niveles no detectables. Se utiliz esta
cepa como receptora en un experimento de apareamiento con la Hfr a+ b+ c+ d+ StrS. La figura muestra los resultados obtenidos usando medios selectivos
que carecen de a, b, c o d.
c + strpr
N recomb.

b+
c+ d+
10
20
30
40 min.
Luego se tomaron 100 colonias d+, 100 b+ y 100 c+
de las placas de 30 minutos y se ensay su genotipo
para los otros dos marcadores. Los resultados se resumen en la tabla. Explique los resultados.
2) Cuando Sledge
d+
b+
c+
Hammer le dijo al
93
93
capitn
Tronk: d+ ----95
----100
-Confe en mi, s b+
exactamente lo que c+
92
100 ---hago-, a la teniente
Dureau se le erizaron los pelitos de la nuca. Entonces
Sledge se encerr durante siete das en el laboratorio
del cuartel (despus de desalojar a punta de revlver
al mdico forense). Cuando sali, Sledge anunci que
haba resuelto el misterioso caso de los coliformes
mutantes. Ms tarde, en una ronda de prensa sensacionalista, Sledge declar: - Bueno, se trataba de un
aislamiento de la cepa bacteriana Mgnum 44 la cual
es Hfr y StrS y, lo que es ms grave, completamente
salvaje. De este condenado germen, aislamos un engendro mutante (F-StrR arg-lac-). La cuestin es que
conjugu ambos demonios pero interrumpiendo su
disgustante orga a distintos tiempos con lo que logr

56

hacerles confesar lo ms ntimo de sus genes sometindolas a un medio con estreptomicina y suplementados como se indica en la tabla, con el sencillo trmite de contar el nmero de colonias al da siguiente.
Con esto queda demostrado, una vez ms, que el crimen es la
N de colonias observadas en
profesin
menos
t (min) lac glu arg+lac arg+glu
paga des1
0 0
0
500
pus de la
5
0 128 0
491
de Estu
10
40 201 58
509
diante de 15
80 199 127
498
Biologa.
20
82 203 139
504
a) A qu
distancia del opern lac mapea el origen de transferencia en la cepa Hfr usada?
b) Cules son los genotipos de las bacterias que crecen en los distintos medios?
c) Porqu los valores de la primer columna son menores que los de la tercer columna?
d) Qu estrategia se podra seguir para clonar el gen
(salvaje) involucrado en la sntesis de arginina cuya
versin defectuosa est en la cepa F-?
3) Se realiz una coinfeccin en medio lquido (a alta
multiplicidad densidad- de fagos y sobre una cepa
sensible), con dos fagos T4 mutantes: T4m- (playas
pequeas) y T4tu (playas turbias). Una alcuota del
lisado resultante fue usada para infectar (a baja multiplicidad de infeccin) nuevas bacterias de la misma
cepa y se obtuvo un 7% de playas grandes y claras
(salvajes). Qu porcentaje de playas pequeas y turbias se habr obtenido?
4) Teodorico Snopolsky se aboc a una tarea que le
haba quitado el sueo durante la mayor parte de su
vida: obtener bacterias que sintetizaran whisky y gi-

nebra. A continuacin se reproduce una pgina del

cuaderno de Snopolsky, encontrado por unos expedicionarios groenlandeses:
Anotacin N 12.506: Para transformar una cepa bacteriana
incapaz sintetizar whisky (whi-) y ginebra (gin-) us, por una
parte, una mezcla de ADN de dos cepas. Una whi+ gin- y la
otra whi- gin+ y, por otra lado, e1 ADN de una cepa whi+
gin+. Obtuve clases transformadas en las siguientes proporciones:
ADN donante
whi+ gin-

cepa
receptora
whi- gin-

whi- gin+
whi+ gin+

whi- gin-

clases
transformadas
whi- gin+
whi+ ginwhi+ gin+
whi- gin+
whi+ ginwhi+ gin+

N
colonias
248
175
3
315
201
382

A qu se debe la aparicin de un mayor nmero

de colonias transformadas whi+ gin+ en el segundo caso?
5) Uno de los objetivos de la microbiologa es construir microorganismos recombinantes para que acten como remediadores del medio ambiente dentro
de un ecosistema contaminado, y que al terminar su
funcin se autodestruyan.
Existe un compuesto txico, 3-metil-benzoato (3MB)
que es catabolizado por la bacteria Pseudomonas putida. Los genes responsables del catabolismo del 3MB
estn organizados en un opern dentro de un plsmido
denominado TOL. Los genes de este opern estn regulados positivamente en presencia de 3MB.
Construya, mediante conjugacin, una cepa de Pseudomonas putida capaz de destruir al 3MB presente en
un lago contaminado, y que esta cepa se autodestruya
luego de eliminar el contaminante. Se dispone de los
siguientes elementos:

(1) a (4) cepas de P. putida:

TOL

TOL

TOL

p3MB -gal

opern Trp

(1) lac; leu / pTOL /

pOpern Trp

(2) leu- / pTOL

(I) y (II) cepas de E. coli

(3) leu / pTOL /

p[p3MB--gal]; kmR
(I) leu; ala-; mob+;
tra+ (en el cromosoma)

(A) a (C): Plsmidos que poseen origen de replicacin de amplio rango de husped (funciona en
Pseudomonas y Escherichia), contienen un gen
de resistencia a ampicilina y las siguientes caractersticas:

TOL
p3MB lacI

(4) lac; leu / pTOL

/ p[p3MB-lacI]; kmR
(II) leu; ala-/
pRK2013 (mob+;
tra+; bom+; kmR)

II
pRK2013

leu+
A

leu+
bom

plac gef
- p3MB-gal: promotor del opern que cataboliza el
3MB a 5del gen de la enzima -galacosidasa.
- p3MB-lacI: promotor del opern que cataboliza
3MB a 5del gen del represor del opern lactosa.
- lac y leu: La (delta) significa que lo que sigue
est delecionado (opern lac o leu, en este caso la
delecin involucra tambin al gen del represor I).
- tra: genes de transferencia del plsmido F
- mob: endonucleasa que corta en la regin bom
- bom: origen de transferencia del plsmido F
- ptrp : promotor opern triptofano (otro distinto)
- plac: promotor del opern lactosa
- gef: es un gen suicida, es decir que codifica para
una protena que produce la muerte de la bacteria
cuando se expresa.

14. GENTICA DEL SEXO

Gua terica
1. Qu se entiende por determinacin sexual y diferenciacin sexual?
R: Determinacin sexual: sistemas biolgicos que determinan el desarrollo de las caractersticas sexuales
de un organismo (determinacin cromosmica, gnica, por nivel de ploida o ambiental)
Diferenciacin sexual: procesos necesarios para alcanzar las caractersticas sexuales previamente determinadas
2. Qu son los cromosomas sexuales y en qu grupos
taxonmicos se los encuentra?
R: Son los cromosomas que determinan genticamente el sexo. Se encuentran muy distribuidos en insectos,
mamferos, aves y plantas dioicas.
3. Qu se entiende por regin pseudoautosmica
(PAR)?
Solucin: regin de homologa y apareamiento entre
los cromosomas sexuales
4. Los genes relacionados con la diferenciacin sexual
estn ubicados exclusivamente en los cromosomas
sexuales? Explique
R: Nooo!! Slo es necesario que se localicen all los
genes regulatorios codificantes para los factores de
transcripcin maestros que disparan el proceso que se
describe en los libros. Existen muchos genes importantes para el sexo (incluso los que codifican para cosas tan importantes como son las hormonas sexuales)
que se localizan en los autosomas y pueden verse influidos por los cromosomas sexuales.
5. A la inversa, pueden existir genes que no tienen
nada que ver con el sexo localizados en los cromosomas sexuales? Explique.
R: S, el gen que determina la presencia de pelos en el
borde de la oreja, se encuentra en la regin diferencial
del cromosoma Y.

ptrp gef

leu
bom

57

plac gef

a) Disee una estrategia para construir (mediante conjugacin) la cepa de Pseudomonas putida que sea capaz de metabolizar el contaminante 3MB y que luego
se autodestruya, indicando cules cepas y plsmidos
elige y cmo se selecciona la bacteria de inters.
b) Justifique las/los que descarta.
c) Esquematice mediante un grfico la curva de crecimiento (nmero de bacterias en funcin del tiempo)
y el nmero de bacterias en funcin de la concentracin de 3MB.
Considere t=0 al lago conntaminado en el momento
del agregado de las bacterias limpiadoras.
d) Por qu se debe evitarel escape de la bacteria limpiadora al medio ambiente?
6. Cmo se comportan, en relacin con las leyes de
Mendel, los genes que se encuentran en los cromosomas sexuales?
R: Su herencia difiere de la de los genes ubicados en
los autosomas, ya que los alelos se heredan asociados
con el sexo de la descendencia. La misma est influida, a su vez por hemicigosis (genes del cromosoma
Y), heterocromatinizacin (genes del cromosoma X),
etc.
7. Qu diferencia existe entre genes LIGADOS, caracteres LIMITADOS a un sexo e INFLUIDOS por el
sexo?
R: Los genes ligados al sexo, son aquellos que se encuentran en la regin diferencial de los cromosomas
sexuales (ligados al X o Y). Los caracteres limitados
a un sexo, son aquellos que se expresan solamente en
un sexo aunque los genes que los determinan estn
presentes en ambos (ej. distribucin facial del vello en
hombres). Los caracteres influidos por el sexo, se expresan en ambos sexos pero con diferente relacin de
dominancia (ej. el alelo que determina la calvicie
humana, es dominante en hombres y recesivo en mujeres)
8. En qu consiste la determinacin del sexo por
equilibrio gnico?
R: En Drosophila melanogaster, el sexo est determinado por la relacin: cromosoma X/conjunto de autosomas. Siendo 1 la relacin que determina hembras y
0,5 la que determina machos.
9. Cul es el mecanismo de determinacin sexual en
humanos?
R: En humanos el sexo se determina cromosmicamente, siendo el cromosoma Y el determinante masculino (portador del gen SRY, factor determinante del
desarrollo de los testculos).
10. Qu es la compensacin de dosis gnica en
mamferos?. Qu establece la hiptesis de Lyon? D

58

una evidencia citolgica y una gentica de la compensacin de la dosis.

R: La compensacin de la dosis es el mecanismo mediante el cual se iguala, en ambos sexos, la actividad
de los genes que se encuentran en el cromosoma X.
Hiptesis de Lyon: en mamferos, la compensacin de
la dosis ocurre por inactivacin, al azar, de uno de los
cromosomas X de las hembras (heterocromatinizacin). El corpsculo de Barr es la evidencia citolgica
de esta inactivacin. Una evidencia gentica puede
obtenerse analizando la expresin de Glu6Pdeshidrogenasa en hembras heterocigotas.
11. Cul es el mecanismo de compensacin de dosis
gnica en Drosophila?
R: La compensacin de la dosis ocurre por hiperactivacin del cromosoma X de los machos.
12. En qu consiste el mecanismo de determinacin
del sexo por haplodiploida? En qu grupos taxonmicos se encuentra?
R: En este sistema, la determinacin del sexo depende
de la dotacin cromosmica de los individuos, siendo
las hembras diploides y los machos haploides. Se encuentra en los himenpteros (abejas, hormigas, termitas)
13. Qu mecanismos de reproduccin permiten perpetuar un genotipo mas all de la existencia del individuo? Conoce alguno que implique la produccin de
semillas?
R: Apomixis
Problemas:
1) En los embriones de los mamferos, la presencia del
cromosoma Y determina el desarrollo de testculos y
genitales externos masculinos. En 1990 se clon un
fragmento de 14 kpb del cromosoma Y que contiene
todo el gen determinante del sexo, al cual se lo llam
Sry (Sex Reversal Y, es decir, revierte el sexo). Como
era previsible para un gen regulatorio, Sry codifica
para una protena (SRY) que contiene un dominio de
unin al ADN, la misma acta en el conducto genital
precursor de los testculos y el comienzo de la expresin es alrededor de 10 a 12 das post-coito o postreimplantacin.
Con la intencin de obtener ratones transgnicos, se
inyectaron vulos fecundados con una solucin acuosa conteniendo el gen Sry clonado. Las cigotas fueron
reimplantadas en madres adoptivas seudo-preadas.
Se obtuvo una camada de 93 cras nacidas (machos y
hembras). Para determinar rpidamente qu ratones de
la camada eran transgnicos, se obtuvo ADN genmico de trozos de cola de toda la camada, y se realiz un
Southern-blot con 2 sondas radioactivas. Sonda A =
fragmento del gen Sry clonado, revela una sola banda
de 3,5 kpb. Sonda B = fragmento del gen Zfy, revela
dos bandas de 11 kpb y 5 kpb. El gen Zfy es un gen
del cromosoma Y, localizado lejos de Sry y por fuera
del fragmento de 14 kpb.
a) Dibujar las bandas que se observaran en un Southern hecho con ADN genmico de las cras e hibrida-

do simultneamente con las sondas A y B. Considere

todos los resultados posibles.
b) Gracias a estudios previos con cepas de ratones
con anomalas cromosmicas, se sabe que la presencia
de ms de un cromosoma X en el ratn macho, siempre da por resultado esterilidad. Cules de las cras
obtenidas seran frtiles y cules estriles?
c) Proponga otras metodologas para la deteccin de
los ratones transgnicos.
2) En un laboratorio de gentica de Drosophila melanogaster, se obtuvo por irradiacin una poblacin A
con alteraciones en la gametognesis tanto de hembras
como de machos, la misma consista en fallas meiticas durante anafase II. Como resultado de estas anormalidades se observ, por un lado, no disyuncin de
todo el complemento cromosmico, con la consecuente produccin de gametas completamente no reducidas
y, por el otro, no reduccin de cromosomas sexuales,
producindose gametas parcialmente no reducidas.
Este tipo de gametas se encontraba en una frecuencia
elevada, pero tambin aparecieron gametas normales.
Con el objetivo de estudiar la viabilidad y capacidad
de fecundacin de estas gametas, se realizaron cruzamientos entre hembras y machos de la poblacin A, y
se analizaron todos los descendientes obtenidos.
Considerando que las gametas pueden fecundarse totalmente al azar, prediga el complemento cromosmico de toda la descendencia posible y su fenotipo
sexual.
3) En humanos, el gen Sry (localizado en el segmento
diferencial del cromosoma Y) determina masculinidad. Qu fenotipo sexual, y cuntos corpsculos de
Barr presentarn los siguientes individuos: a) 46, XY;
b) 47, XXY; c) 45, X
4) Supongamos que una determinada enzima dimrica
A, cuyo locus se encuentra en el segmento diferencial
del cromosoma X, interviene tanto en el metabolismo
de Drosophila como en el del ratn, y que en ambos
casos dos variantes moleculares de dicha enzima estn
codificadas por los alelos A1 y A2. El genotipo de los
individuos es distinguible por electroforesis segn el
siguiente esquema:

A1A1

A2A2

+
Se hace el siguiente experimento, tanto en Drosophila
como en ratn. A partir de un tejido adecuado de una
hembra heterocigota A1A2 se obtiene un cultivo celular primario y de este 10 subcultivos unicelulares.
Qu patrones electroforticos se obtendrn en los
siguientes casos?
a) Cultivo primario de Drosophila.
b) Subcultivos de Drosophila.
c) Cultivo primario de ratona.
d) Subcultivos de ratona.
5) En el ratn existen dos sistemas enzimticos cuyos
productos son detectables en los glbulos rojos. Los
mismos estn determinados por las parejas allicas
A,a y B,b, cuyos loci respectivos estn situados en el

59

segmento diferencial del cromosoma X. Unas hembras diheterocigotas (hijas de machos que presentaban
las enzimas A y b) se cruzaron con machos AB, obtenindose la siguiente descendencia masculina: AB:34;
ab:26; Ab:67; aB:73.
Teniendo en cuenta la hiptesis de Lyon, de los ocho
tipos de hembras que se sealan en la tabla, Cules
sern las hermanas de los machos antes indicados?
Con qu frecuencia aparecer cada una?
Porcentaje de gbulos rojos con
Tipo de
las enzimas que se indican
Hembra
AyB
Ayb ayB ayb
100
1
2

25

25

25

100

3
4

50

50

50

25

50
50
50
50

50

50
50
8
6) Ni el Zar Nicolas II ni su esposa la Emperatriz Alexandra tenan la enfermedad conocida como hemofilia, caracterizada por estar ligada al sexo. Su hija, la
princesa Anastasia, tampoco la tena, pero el Zarevich
Alexius, su hermano, s. Podria Anastasia haber sido
portadora de la hemofilia? Si se hubiese casado con su
primo Henry, que era hemoflico, alguno de sus hijos
o hija habran sido hemoflicos?
7) Es de conocimiento popular que todo gato de 3 colores es gata (hembra). A este tipo de gatos se los llama calico. Se sabe que el pelaje blanco presente en
sectores o mosaicos proviene de un gen independiente
del que produce pelaje naranja o negro.
Se realizaron dos cruzamientos: 1) Macho blanco y
negro x Hembra blanca y
naranja
50%
machos
blancos y naranjas
50% hembras
tricolores
2) Macho blanco y naranja x Hembra blanca y negra
50% machos blancos y negros
50% hembras tricolores
a) Cul es el indicador ms evidente de la ausencia
de herencia mendeliana?
b) Por qu gatos machos no tienen nunca 3 colores?
c) Explique la base gentica de este comportamiento.
d) Cmo sera el resultado de cruzar una hembra tricolor por un macho blanco y negro?
8) Es posible que, en los humanos, un gen mutante
recesivo est localizado en el cromosoma X, si una

mujer que presenta el rasgo recesivo y un hombre

normal tienen un hijo varn normal? Explique.
9) En la especie humana la presencia de cierto
mechn de pelo blanco es un caracter influido por el
sexo, dominante en el hombre y recesivo en la mujer.
La protanopia (tipo especial de ceguera al color rojo)
est determinada por el alelo recesivo de un gen situado en el segmento diferencial del cromosoma X. Un
hombre con mechn blanco y visin normal, cuyo
padre careca de dicho mechn, tiene descendencia
con una mujer sin mechn y con visin normal, cuyo
padre careca del mechn y tena protanopia, y cuya
madre tena el mechn.
a) Qu proporcin de los descendientes sern hembras
con mechn blanco y visin normal?
b) Qu proporcin de la descendencia sern machos
con mechn blanco y protanopia?
10) En la mariposa trbol todos los machos son amarillos, en cambio las hembras pueden ser amarillas si
tienen el genotipo homocigota AA, o blancas si poseen el alelo (A'_). Sin tomar en consideracin el sexo,
qu proporciones fenotpicas pueden esperarse en F1
de la cruza AA' x AA'?

15.- HERENCIA DE ORGANELAS

Gua terica:
1) Qu es la HERENCIA materna (tambin llamada
uniparental, citoplasmtica o extranuclear) y cmo se
diferencia de la INFLUENCIA materna? Cul es su
base genmica? Mediante qu mecanismos se multiplican las organelas?
R: Herencia materna: genes presentes en organelas
con un modo especial de herencia, la progenie hereda
los genes de las organelas de uno de los progenitores
(herencia uniparental), en la mayora de los casos de
la madre. Debido a que las organelas se encuentran en
el citoplasma y que en la formacin del cigoto el principal aporte citoplasmtico proviene del huevo u vulo es que las organelas se transmiten por va materna,
tambin se utiliza el trmino herencia citoplasmtica. Adems debido a que el ADN de las organelas se
encuentra fuera del ncleo tambin se lo denomina
herencia extranuclear. Influencia materna: Diferencias en el fenotipo causadas por componentes citoplasmticos presentes en las gametas. Nuevamente
debido a que el principal aporte citoplasmtico proviene de la madre es que se lo denomina influencia
materna. Los componentes citoplasmticos pueden
ser protenas u otros factores que influyen en el fenotipo del cigoto pero no en su genotipo. Pueden perderse los efectos de la influencia materna luego de una
generacin si el genotipo del cigoto no posee los genes que codifican para dichos componentes.
2) Explique la organizacin genmica de mitocondrias
y cloroplastos, tomando como base mitocondrias de
humanos, levaduras y cloroplastos de plantas superiores. Dira Ud. que su evolucin fue lenta o rpida
comparada al genoma nuclear? Si dependiera del caso,
ejemplifique.

60

R: La organizacin genmica de mitocondrias y cloroplastos es significativamente diferente del ADN nuclear. Ambas organelas se originaron por transferencia
horizontal que involucr eventos de endosimbiosis
donde clulas eucariotas adquirieron el genoma bacteriano intacto (ver siguiente pregunta).
Cloroplastos: Genoma circular que no posee histonas
ni otras protenas cromosomales presentes en el ADN
nuclear. Muchas de las protenas utilizadas en la fotosntesis estn codificadas en el ADN de los cloroplastos. Comparado con el ADN nuclear vegetal la
tasa de evolucin es ms rpida (menor velocidad
de cambios que las mitocondrias).
Mitocondrias: genoma circular que no posee protenas
cromosomales. Las mitocondrias de plantas, hongos y
animales difieren en estructura, composicin, tasa de
evolucin y modo de herencia (ver tabla).
Tabla. Caractersticas del ADN mitocondrial
Plantas
Tamao del Extremadagenoma
mente variable
(300kb a
2400kb en una
misma familia)
Estructura Variable, circular o lineal
Informacin rRNA, tRNA,
protenas
ribosomales,
protenas
involucradas
en respiracin
Presencia de
No, pero
intrones
abundantes
regiones no
codificantes
Modo de Variable, prinherencia
cipalmente
materna
Tasa de dilenta
vergencia de
secuencia
comparada
con el correspondiente
ADN nuclear

Hongos
Animales
Muy variable Pequeas y
(26,7kb a
poco varia115kb en as- bles 16kb
comycertes
filamentosos)
circular
circular
rRNA, tRNA
,protenas
ribosomales,
protenas
involucradas
en respiracin
Si

Cualquiera de
los dos parentales
media

rRNA,
tRNA, protenas involucradas en
respiracin
No, pocas
regiones no
codificantes
materna
rpida

3) Qu origen evolutivo tienen estas organelas? Es

el mismo monofiltico o polifiltico? Explique la teora de Margulis.
R: Una de las principales hiptesis es el origen endosimbitico (Margulis 1970; 1993). La idea es que las
organelas se originaron a partir de bacterias que vivieron como simbiontes internos de las clulas eucariotas
primitivas. La secuencia de los genes de las organelas
apoyan esta hiptesis siendo similares en secuencia a
los genes bacterianos. Los genes mitocondriales son
similares a los genes presentes en proteobacterias y
los genes de cloroplastos similares a los presentes en
cianobaterias. En el caso de los cloroplastos el origen
es polifiltico ya que cloroplastos de algas tienen un
origen diferente que los cloroplastos de plantas supe-

riores, en el caso de las mitocondrias se encuentra en

discusin.
4) Hace unos 10 aos una noticia sacudi los titularesEva (s, la de Adn y Eva) fue negra y vivi hace
200.000 aos. En qu se bas el periodista?Por qu
ignor olmpicamente al pobre Adn?Era feminista?
R:La noticia se basaba en la reconstruccin filogenetica de la evolucion humana mediante la secuenciacion de regiones nocodificantes de ADN mitocondrial.
Los rboles obtenidos sugieren un orgen africano de la
especie humana. Se calcula que el ancestro comn a
todos los ADN mitocondriales presentes vivi hace
166000 y 249000 aos. Los criterio empleados fueron:
1) asumir que las mutaciones en el genoma mitocondrial se acumlan a tasa constante; 2) utilizar secuencias de chimpanc de manera comparativa; 3) usar
estimadores de tiempo de divergencia entre humanos
y chimpanc basados en la teora del reloj molecular
(tasa mutacional constante a lo largo del tiempo, se
explicar ms adelante)
Debido a que las mitocondrias se heredan por la va
materna es que se lo llam Eva mitocondrial. Todos los humanos heredamos nuestras mitocondrias de
Eva. Estas comparaciones determinan otros hechos
que echan por tierra teoras racistas. Muchas variantes
de negros son ms distintas entre s que los blancos de
algunos negros (con los que estn muy emparentados).
Toda la clasificacin de razas humanas tiene mucho
ms que ver con la evolucin de unos poqusimos genes determinantes de caracteres fenotpicos como el
color de la piel y poco tiene que ver con la evolucin
global del resto del genoma y mucho menos con caracteres como la inteligencia.
5) Cmo se puede hacer mapas genticos de genomas de organelas?Cmo se hace para mapear usando
levaduras ptites y bromuro de etidio?
R: Hay muchos mtodos, slo veremos el mapeo de
ptites que consiste en tratar levaduras con bromuro
de etidio (un mutgeno que produce deleciones de
segmentos del DNA mitocondrial). Al perder genes
mitocondriales, se puede estudiar con qu frecuencia
se pierden juntos 2 genes, lo que es proporcional a la
distancia en el mapa. Como en general se pierden funciones mitocondriales importantes, la levadura pierde
la capacidad de respirar, por lo que crece menos que
las normales o grandes (en francs) en medio aerbico. Por eso, se llaman petites a estas mutantes.
Problemas
1) Una enfermedad humana que produce cardiomiopatas muestra el siguiente pedigr:

61

a) Cmo exxplica el pattrn de herenncia de esta enfermedad?

b) Si el inddividuo 5 tieene hijos conn una madree sana,
como esperra que sean sus
s hijos varrones? Y sus hijas
mujeres?
c) Puede el individuo 10 tener una hija sana?? Y un
hijo? Justifiique
d) La pareja formada poor los individduos 3 y 4 tuuvo un
cuarto hijo sano, como lo explicaraa? Puede dedducir si
ese hijo es varn
v
o mujeer? Justifiquee.
2) La polillla de la harina Ephestiaa kuehniella posee
ojos negross y cuerpo piigmentado debido a un precurp
sor del pigm
mento (proteena kynurennina) cuyo control
c
de expresin est dado por
p el gen doominante A. Cuando el genottipo de la poolilla es aa el
e fenotipo es
e ojos
rojos y cueerpo sin pigm
mentar. Si se realiza el cruzamiento de un
u macho heeterocigota por
p una hembbra recesiva el reesultado es de polillass pigmentadas con
ojos negros y 1/2 de poolillas no piggmentadas coon ojos
rojos. Si se realiza el crruzamiento recproco
r
toddas las
larvas nacenn pigmentaddas pero los adultos
a
resulltan en
con ojos negros y con
c ojos rojoos.
a) Expliquee los fenotippos observaddos en amboos cruzamientos. De
D que tipo de herencia se
s trata?
b) Qu explicacin molecular
m
tieene este tippo de
herencia?
c) Que expperimento reaalizara para probar la reespuesta dada en 2).
2 Considerre que cuentaa con herram
mientas
para anular genes de la polilla en estados especcficos
de su ciclo de
d vida.
3) Una estrategia comerrcial en la prroduccin dee maz
es la generaacin de hbrridos con estterilidad del polen.
De esta maanera el productor debe comprar seemillas
todo el tiem
mpo adems de que evita la autofeccundacin y la coonsecuente prdida
p
de vaalor comerciaal (por
disminucinn del vigorr hbrido). Los
L determiinantes
genticos dee esterilidad del polen esstn localizados en
las mitoconndrias (en maaz se conoceen por lo mennos 20
determinanttes distintos)). Para evitaar la expresiin de
estos determ
minantes en las plantas que actan como
parentales en
e los cruzam
mientos paraa generar loss hbridos, se utiliza un gen nuclear
n
dom
minante restaaurador
de la fertiliidad (Rf) quee permite quue la planta pueda
dar polen auunque sea geenotpicamennte androestril. Si
usted tiene una semilla de maz cuualquiera de origen
desconocidoo cmo harra para sabber su genotipo en
cuanto a estte carcter?
4) El anlisis de la correspondenciaa entre la secuencia
nucleotdicaa del DNA genmico
g
mittocondrial dee plantas superiorres y la secuuencia de am
minocidos de las
protenas coodificadas inndic que ell codn CGG
G, que
"universalm
mente" determ
mina Arg, loo hace para Trp
T en
las mitoconndrias de planntas (el cdiggo "universall" para
Trp es UGG
G), sugirienddo que, al iguual que en mamfem
ros y honggos, las mitoocondrias veegetales tiennen un
cdigo gentico propio.. Sin embarggo, un investtigador
argentino en
e Francia reevis esa poostura y deteermin
que las mitoocondrias veegetales se rigen por el cdigo
c
universal. Cmo explicca esta contrradiccin apaarente?

C
Cul mecanissmo de los ssiguientes pu
uede estar innvoluccrado?:
a-- Mutacin puntual somttica
b-- Reordenam
miento cromosmico
c-- Transposiciin gentica
d-- tRNAs suprresores
e-- Splicing dell RNA
f- Correccin (edicin) dell RNA ("editting")
5) Cmo se explica
e
que llas secuenciaas de aminocidos de la subuunidad III de la citocromo
o oxidasa aisslada de:
- mitocondrias
m
s de mamferros
- mitocondrias
m
s de plantas
- kinetoplastos
k
s de tripanosomtidos
esttn muy consservadas evoolutivamente, mientras quue
loss genes respeectivos guarddan muy poca homologaa
enttre s?
6) La idea del origen procaaritico de laas mitocondrrias
se ve avalada/ss por las siguuientes evideencias que inndican
n similitudess con las baccterias actuales y diferenccias
con
n el equivaleente nuclear:
a) Grado relatiivo de homoologa de seccuencias de nucleetdos de los genes ribossomales mito
ocondriales.
b) La estructurra policistrnnica del RNA
A inmaduro mitoccondrial.
c) El cdigo geentico mitoccondrial.
d) El sistema de
d replicacinn del DNA mitocondrial.
m
.
e) La secuenciia de aminocidos de las isozimas mitocon
ndriales,
f) El fenmenno de "transsplicing" y/o
o "editing" del
RN
NA mitoconddrial
g) La herencia materna de llos genes miitocondrialess.
h) E1 fenmenno de conjugaacin mitoco
ondrial.
Ind
dique las oppciones correectas y falsas y justifique..
7) Los prionees son agenttes
inffecciosos innvolucrados en
enfermedades neurodegennerattivas en los mamferos ccomo
o la conociida encefaliitis
esp
pongiforme bovina o eenferrmedad de laa vaca loca y
el scrapie enn ovejas. Enn los humano
os se incluyee la
enfermedad dee Creutzfeld--Jakob, el inssomio fatal y el
ku
uru. El aspectto ms peculliar del proceeso de infecccin
por priones es que no tiennen cidos nu
ucleicos asocciados, en personnas sanas y eenfermas se encuentran los
miismos alelos de los geness que codificcan para la prop
tena prinica. La naturalezza infecciosaa de los prioones
derriva de que la
l protena pprinica pued
de existir en dos
esttados conforrmacionales: el normal o no infeccioso
(40
0% de hlicees y casi nada de plegaamientos ) y el
anormal o infeeccioso (muyy rico en estrructuras de tipo
t
).. Cuando la protena se encuentra en
n conformaccin
inffecciosa tienne propiedadees del tipo chaperona,

, en
el sentido de que
q es capaz de convertirr protenas norn
maales en infeccciosas (mediante una reaaccin en caadena)) producienddo los agreggados neuron
nales caracteersticos de la ennfermedad. E
En enfermedades comoo el
ku
uru o de la vaca loca la conformaacin infecciiosa

62

aparece en el husped como consecuencia de la ingestin de tejido nervioso enfermo. En cambio, en enfermedades hereditarias como la de Kreutzfeld-Jakob
ciertas mutaciones en el gen prinico aumentan la
chance de aparicin espontnea de la conformacin
infecciosa sin necesidad de ingestin del agente infeccioso. A este ltimo tipo de transmisin se lo considera herencia infecciosa (un tipo especial de herencia
extranuclear). Hasta hace poco se pensaba que slo
existan priones en mamferos, pero actualmente se
tiene certeza de que tambin estn presentes en levaduras. Uno de estos priones fngicos (el PSI) tiene
una funcin biolgica conocida (es un factor de terminacin de la traduccin citoplasmtico). Esta protena
puede existir en 2 variantes: PSI+ y PSI-. La herencia
sigue un patrn de herencia infecciosa como el mencionado anteriormente.
a) Esquematice un cruzamiento entre levaduras Psi+ y
psi- y su segregacin en F1 y F2. No omita las convenciones correspondientes para la ploida, tipos de
apareamiento y proporciones genotpicas y fenotpicas
en cada una de las generaciones. Lea atentamente,
para ello, el ciclo de vida de las levaduras en su libro
de texto.
b) Dnde tendra que estar localizado el gen Psi? en
un autosoma, en un cromosoma sexual, en un plsmido o en genoma mitocondrial? por qu? Justifique.

La herencia de esta protena fue siempre intrigante

porque en ninguna de las decenas de mutantes petite
se afecta la herencia de la protena. En cambio el fenotipo prinico PSI+ poda ser revertido a PSI- con
altsima frecuencia al someter a las levaduras a agentes desnaturalizantes de protenas como el hidrocloruro de guanidina, no sucediendo as con tratamientos
mutagnicos. Los tratamientos mutagnicos s pueden
producir que levaduras PSI- se transformen en PSI+.
Las mutaciones responsables son puntuales y el gen
determinante (Psi) pudo ser ubicado en un cromosoma
nuclear. Todo esto llev a cuestionar la herencia infecciosa-materna del gen y llev a la hiptesis de que
el fenotipo PSI+ depende de la conformacin de la
protena como en el mal de la vaca loca.
c) Teniendo en cuenta lo anterior y disponiendo de:
una sonda del gen Psi (sabiendo que la mutacin
puntual que condujo a transformar una levadura PSIen PSI+ coincide con el sitio de restriccin EcoRI).
anticuerpos monoclonales que reconocen diferencias conformacionales entre PSI+ y PSI-.
Esquematice un experimento para estudiar la herencia
del gen Psi en sus dos variantes allicas. Cmo seran las proporciones genotpicas y fenotpicas en una
progenie resultante del cruzamiento de Psi+ y psi- (recordando que la protena codificada por Psi+ tambin
tiene propiedades de chaperona infecciosa)?

16. GENTICA DEL DESARROLLO y EPIGENTICA

Gua terica:
1) Qu similitudes y diferencias tiene el desarrollo
embrionario en vertebrados y en moscas? Qu importancia relativa tienen las gametas masculina y femenina (los vulos o futuros huevos)?
2) Qu diferencias y similitudes existen entre determinacin (o compromiso) y diferenciacin?
3) Describa la determinacin autnoma versus la determinacin en comit o grupal.
4) Qu es una cascada regulatoria y los efectos de
posicin? Sirven para explicar porqu el producto de
un mismo gen tiene efectos opuestos en distintos tejidos?
5) Qu caractersticas tienen los genes que condicionan y participan en el desarrollo? Son todos genes
para factores de transcripcin?
6) Son los genes hometicos un subgrupo de los
mismos?
7) Existen efectos maternos (como los que Ud. vio
para el caracol del gnero Limnaea) para alguno de
estos genes?
8) Si la mayora de estas mutaciones (como la del
problema 2) son letales. Cmo hacen para mantenerlas (y visualizar su efecto sobre los embriones)?
9) Existen similitudes entre los genes de artrpodos
y vertebrados? Implica esto una evolucin convergente de estos genes?
Problemas
1) Clulas de fibroblasto cultivadas "in vitro" fueron
transfectadas ("transformadas gentica-mente") con
un gen quimrico conteniendo la secuencia estructural

del gen myoDI (gen que codifica para un factor de

transcripcin de activa expresin en mioblastos:
clulas musculares) y un promotor constitutivo del
virus SV40 (virus animal cuyo promotor funciona en
un amplio rango de clulas de mamferos). Como
resultado, se observ la brusca formacin de un
mioblasto incluyendo la formacin de un sincisio a
partir de clulas uninucledas.

Gen quimrico
Gen virus SV40
Gen myoDI
prom Sec. cpside viral
prom Sec. estructural
promotor

Sec. estructural

a) Explique cmo tan abrupta "transdetermina-cin

pudo ser causada por un solo gen.
b) Por qu no se utiliz el gen myoDl con su propio
promotor para realizar el experimento y se lo cambi
por uno constitutivo?
c) Podra ocurrir lo mismo con cualquier clula de
cualquier otro tejido, como ser una clula neuronal?
Por qu?
2) Para estudiar la regulacin del gen hometico "hairy" de Drosophila, se clon la regin promotora del
mismo, reemplazando la secuencia estructural por la
del gen indicador lac Z (-galactosidasa de E. coli).
Posteriormente, se transformaron embriones sinciciales de Drosophila y se les suministr X-gal en el momento en que normalmente se expresa el gen "hairy",
observndose la aparicin de 7 anillos (segmentos)

63

coloreados de azul. A continuacin se hicieron deleciones en la regin 5' de la regin promotora para analizar la contribucin de cada parte de esta regin promotora. Como resultado, se identificaron secuencias
* Regin promotora gen hairy
Regin 5'

CAT y TATA boxes

regulatorias especficas que resultaron ser responsables, individualmente, de la formacin de cada uno de
los anillos.
Embrin transfectado

Sec. estruct. lac Z

transcripcin

1234567
1
2
6

Para estudiar la accin de estas secuencias, se tom la construccin responsable de la formacin del anillo 6, y
con ella se transformaron embriones de moscas mutantes hometicas deficientes para el gen "knirps" y para el
gen "Krppel", y otra que expresa el gen "Krppel" en forma constitutiva, con los siguientes resultados:
Salvaje
- knirps
- Krppel
expresin constitutiva Krppel
Con anticuerpos especficos e hibridaccin "in situ" del mRNA, se ensay la concentracin relativa de los productos de los genes knirps y Krppel en el embrin de las moscas salvajes, observndose la siguiente distribucin:
protena Krppel
protena knirps

prot. knirps + prot. Krppel

Anillo 6

a) Por qu se utiliz una secuencia estructural de -galactosidasa en lugar de la secuencia estructural del mismo
gen, pudiendo disponer de anticuerpos para detectar la expresin de la protena "hairy"?
b) Por qu no se elimin la regin promotora conteniendo las CAT y TATA boxes en los experimentos de delecin?
c) Cmo explica la disminucin en nmero, de 7 a 1, de los segmentos "teidos" con X-gal en las deleciones?
d) En base a los experimentos con mutantes y de deteccin de productos de los genes knirps y Krppel qu
funcin cumplen estos productos? En su contestacin considere la posibilidad de que sean receptores de membrana, hormonas, factores de transcripcin, reguladores positivos, negativos, segundos mensajeros y/o protenas
especficas de tejidos diferenciados como podra ser la hemoglobina de los glbulos rojos de vertebrados.
e) Proponga un modelo de regulacin (un esquema al estilo del opern lactosa) para explicar la funcin de la
secuencia regulatoria estudiada en la expresin del gen hairy

INTERFERENCIA/SILENCIAMIENTO E IMPRONTA
3) La impronta genmica ("genomic imprinting") es
una rara propiedad que presentan algunos genes de
transcribir y expresar slo el alelo derivado del progenitor de un determinado sexo, es decir o del padre exclusivamente, o de la madre exclusivamente y no del
otro; mientras que el alelo proveniente del progenitor
del otro sexo no se expresa. El alelo que no se expresa
es el que se dice que est imprinteado. Cada gen
tiene su patrn de imprinting especfico. Se cree que
este fenmeno est relacionado con los casos epigenticos de silenciamiento pretranscripcional descriptos
en plantas dado que la metilacin representara una

impronta o marca a nivel molecular para distinguir el

alelo paterno del materno (para una revisin del tema:
Cell 77, 473-476 [1994]).
El gen del factor de crecimiento "insuline-like growth
factor" tipo 2 (IGF2) humano, que se expresa en las
etapas embrionaria y fetal, est sujeto a "imprinting".
El "imprinting" est asociado a un grado de metilacin
diferencial en cada uno de los alelos, que se establece
en las gametas, no siendo claro an cmo es que un
patrn de metilacin se mantiene en el DNA de las
clulas somticas de la descendencia, y cmo es capaz

64

de borrarse en la lnea germinal de la descendencia del

sexo opuesto.
Para estudiar este fenmeno en el gen del IGF2, se
aprovech uno de sus polimorfismos -que cae en una
regin del exn 9 que corresponde a la regin 3' no
codificante-, que da dos alelos posibles: uno que presenta el sitio para la enzima Apa I, y otro que carece
de l (Nature Genetics 4, 98-101 [1993]). Usando dos
oligonucletidos especficos del exn 9, los autores
del trabajo amplificaron una regin de 236 pb que
abarca a dicho sitio. La enzima Apa I corta al fragmento amplificado a partir del primer alelo mencionado, en dos fragmentos: uno de 173 pb y otro de 63 pb,
como muestra la figura:
Ud. es un bilogo muy riguroso y crtico (eso est
bien) y duda de mucho de lo que le dicen sus docentes
(eso no est tan bien) con respecto a la existencia del
"imprinting", queriendo revisar Ud. mismo lo hecho
por los autores del trabajo. Disee un protocolo experimental para determinar si el gen IGF2 est sujeto a
"imprinting" y si ste es de tipo materno o paterno,
indicando:
a) Qu individuos analizara?
b) Qu genotipo (homocigota o heterocigota con respecto al sitio Apa I) eligira en los individuos a analizar? Cmo determinara esos genotipos?
c) Qu tcnicas usara? Qu tipo de muestra usara
de cada individuo (DNA o RNA?).
4) Las plantas poseen diversas estrategias de defensa
para contrarrestar el ataque de patgenos. En Arabidopsis, por ejemplo, la presencia de un pptido correspondiente a los ltimos 22 residuos de la flagelina
de bacterias (flag22) sirve de seal para desencadenar
grandes cambios en los niveles de transcriptos de ciertos genes. Navarro et al. (2006) hallaron que la respuesta a flag22 involucraba principalmente cuatros
genes, cuyos patrones de abundancia de transcriptos
se muestran a continuacin:
Sin flag22
Con

1.25
Cantidad
1
Relativa
0.7
de
mRNA 0.50
0.25

TIR1

ABF

ABF

miR39

TIR1, ABF2, ABF3: receptores de auxinas

miR393: microRNA 393
*Todas las diferencias son significativas
a) Cmo se modificaron los niveles de mRNA en
cada caso?
Con el objeto de estudiar la regulacin de estos genes
en presencia de patgenos se obtuvieron plantas
transgnicas que contenan la regin promotora de
cada uno de ellos ro arriba de la regin codificante de
GFP (Green Fluorescent Protein). Al someter las plantas transgnicas a tratamiento con flag22 durante 30

minutos y medir los niveles de mensajero de GFP se

observaron los siguientes resultados:
2
Sin flag22
Con flag22

1
Cantidad
relativa
de mRNA
GFP

TIR1 ABF

ABF

miR39

b) Cmo interpreta los resultados del experimento 2

teniendo en cuenta lo observado en el experimento 1?
Qu tipo de regulacin estara siendo ejercida en cada caso?
El anlisis de secuencia de la regin codificante de
TIR1, ABF2 y ABF3 revel que los tres genes poseen
una regin conservada de 25 pb que puede ser reconocida por microRNAs.
c) Proponga un mecanismo para explicar los cambios
observados en los niveles de transcriptos de los cuatro
genes en respuesta a flag22.
5) La ingeniera gentica de plantas para conferir resistencia a enfermedades virales tiene larga data. Las
primeras transgnicas resistentes a virosis, lo fueron
por expresin de funciones (protenas) virales (como
la cpside) las cuales interfirieren la estrategia de multiplicacin de los virus. Tambin se intent bloquear
la traducibilidad de los mensajeros virales expresando
secuencias de ARN complementario (llamadas de
orientacin antisentido). En los ltimos tiempos se
enfoc en el aprovechamiento del mecanismo de defensa llamado silenciamiento post-transcripcional mediante la expresin de secuencias nucleotdicas virales. En un trabajo reciente, Vazquez Rovere y col.
(Arch. Virology 146:1337, 2001), obtuvieron papas
transgnicas que expresaban las siguientes 3 construcciones genticas conteniendo el gen de la replicasa del
virus PLRV (ORF2b):
Aclaraciones:
ATG-rep: Construccin que contiene el gen de la replicasa con el codn de iniciacin (ATG AUG);
No codific-rep: Idem sin ATG;
Anti-rep: construccin antisentido (la secuencia se
encuentra invertida);
RB y LB: bordes derecho e izquierdo del segmento T
de Agrobacterium tumefaciens;
35S, mas5: promotores constitutivos fuertes;
t-nos, mas3 terminadores de transcripcin;
ORF2b: gen de la replicasa;
nptII: gen de resistencia a kanamicina;
Flechas: indican la orientacin 5 3de la secuencia.

65

a) Para qu se us la resistencia a kanamicina?

Las plantas transgnicas fueron desafiadas con el virus y se encontraron plantas con resistencia (y tambin
con susceptibilidad) con cualquiera de las 3 construcciones. Para caracterizar el mecanismo que media esta
resistencia, se bombardearon hojas de las papas transgnicas utilizando un can gnico y una construccin
que codifica para una protena de fusin
GUS::replicasa (Fig. 2, la GUS -glucouronidasa es
detectable en forma similar a la -lac). La fusin, sin
embargo, afecta parcialmente la actividad enzimtica.
Es decir, la enzima funciona un poco peor, pero fun-

ciona. De esta forma se consigue la expresin (transitoria) de las construcciones genticas bombardeadas
en las clulas impactadas y su fcil visualizacin en
forma de puntos azules (fig.2).
Nota: No se grafican las transgnicas con la construccin ATG-rep porque dan casi igual que las no codific-rep.
b) Para qu se hicieron los experimentos de la Fig.
2? Interprete los resultados:
i) Cmo me doy cuenta de cunto afecta a la actividad GUS la fusin con la replicasa? Qu resultados
comparo para evaluarlo?
ii) Para qu sirven, adems, los experimentos realizados con la construccin 2 (GUS slo)?
iii) A qu atribuye las diferencias entre A1 y A2
y entre S1 y S2? Qu relacin tiene con la resistencia?
iv) Cul mecanismo (mediado por protena, mediado
por bloqueo de la traduccin antisentido-, mediado
por silenciamiento posttranscripcional) media la resistencia?
Aclaraciones: GUS-rep: construccin gentica capaz
de expresar una protena (y su mRNA) de fusin
GUS+replicasa, GUS: Idem slo
GUS. uid-A: gen codificante para GUS;
A1 y A2 son 2 plantas transgnicas representativas
para la construccin antisentido (Anti-rep);
S1 y S2 plantas con la construccin sentido (no codific-rep).
(S) y (R) representan plantas susceptibles y resistentes.
Ken (NT) es un control de la misma variedad de papa
que el resto (Kennebec) pero no transformada.

66

16. EVOLUCIN, BIODIVERSIDAD Y MEJORAMIENTO

1) La epidemia global del SIDA es provocada por el

HIV, un retrovirus que infecta linfocitos. Se conocen
al menos 2 variantes llamadas HIV-1 y HIV-2, siendo
el HIV-1 el causante principal de la epidemia) Se especul mucho sobre su origen y ha habido muchas
versiones como que el virus fue diseado en un laboratorio de ingeniera gentica hasta otras en las que
mdicos a la antigua se inyectaron suero de monos
para probar proteccin (vacunas) contra determinadas
enfermedades y permitieron as el ingreso del HIV al
husped humano ayudando a cruzar barreras interespecficas.

Mono verde africano

Mono sootey
mangadey
Mono sykes
HIV-2
Mandril

chimpanc
ZR59

HIV-1
Independientemente de esta ltima hiptesis, siempre
se especul acerca de la relacin evolutiva con la familia de SIVs (virus de inmunodeficiencia de simios)
que presentan chimpancs, mandriles y otros simios,
los cuales no son patognicos en sus huspedes pero
que, al transferirse a los humanos, pudieron haber adquirido propiedades patognicas hacia el mismo.
Debido a su particular sistema de replicacin, las enzimas que intervienen no tienen mecanismos de correccin eficientes para los posibles errores de copia
de cidos nucleicos. Por lo tanto, el reloj molecular es
mucho ms rpido que para los genes nucleares o mi-

tocondriales de sus hospedantes. De esta manera se

puede tener una relativa precisin para evoluciones
que, se supone, tienen menos de 100 aos de antigedad. A partir de un estudio utilizando RT-PCR de secuencias nucleotdicas virales de distintos aislamientos de HIV y sus variantes en humanos, as como los
virus del tipo SIV en monos, se identific una regin
que muestra un gran polimorfismo, la cual se quiere
usar para hacer un anlisis filogentico y un estudio
poblacional de cuantificacin de la variabilidad gentica.
a) Por qu se utiliz RT-PCR y no clonado molecular de cDNA (y posterior secuenciacin de los clones)? Cmo se relaciona esto con el concepto de las
cuasiespecies en virologa?
b) Se muestran las secuencias de cuatro aislamientos:

1.
2.
3.
4.

AGGCC AAGCC ATAGC TGTCC

AGGCA AAGAC ATACC TGACC
AGGCC AAGAC ATAGC TGTCC
AGGCA AAGAC ATACC TGTCC

Construya una matriz de distancia gentica simple

expresada como el nmero de diferencias nucleotdicas por sitio polimrfico para cada par de secuencias
comparadas (por ejemplo, las secuencias 1 y 2 tienen
20 nucletidos y tienen 4 diferencias 4/20 = 0,2).
c) Qu secuencias se encuentran ms relacionadas
entre s?
d) Construya un fenograma con estos datos
e) Podra proponer una posible secuencia evolutiva
de cambios? Qu tiene que ver esto con el principio
de parsimonia?
f) Podra asignar a una de las secuencias el papel de
primitiva y otras de evolucionadas? Qu
necesitara para poder hacerlo?
En un trabajo publicado por Wain-Hobson (Nature
391:531, 1998) se propone un rbol filogentico como
el que se muestra a continuacin.
g)
Opina
que
la
1
2
3
4
clasificacin en HIV-1 y
1
0,2
HIV-2
refleja
2
correctamente
la
3
taxonoma de este virus?
4
El origen del HIV, es
monofiltico o polifiltico? Discuta.
h) En 1998 caus mucho asombro el anlisis de una
muestra de sangre conservada desde 1959
perteneciente a un individuo africano de sexo
masculino (ZR59). Si bien no se pudo secuenciar
completamente, fue suficiente para ubicar su relacin
evolutiva en el centro de HIV-1.
Como Ud. sabe, el SIDA se hizo conocido (por afectar
a actores como Rod Hudson) a fines de los 80 y
principios de los 90 (en ese momento se lo llam
peste rosa) Qu conclusiones puede sacar sobre la
antigedad de la enfermedad y su evolucin?

67

Paciente C
Paciente A
Paciente G
Paciente B
Paciente E
Dentista
CL 1
CL 2
Paciente F
CL 3
CL 4
Paciente D

i) Cun altas le parece que pueden ser las

probabilidades de contagiarse de SIDA de un
chimpanc infectado con SIV? Porqu?
La rapidsima velocidad de evolucin se puso de
manifiesto en un sonado estudio a nivel de
epidemiologa molecular con pacientes de un dentista
en Florida, Estados Unidos, en la dcada del 90 (ver
figura, CL son controles locales de pacientes de las
inmediaciones, con SIDA, pero que no tuvieron
ningn contacto o relacin con el dentista y sus
pacientes).
j) Podra Ud. confirmar con estos datos que las
prcticas dentales hechas sin las debidas precauciones
deben ser consideradas como un factor de riesgo?
Considera que todos los pacientes se enfermaron por
esta causa? Para qu se utilizaron controles? Porqu
fueron locales y no externos? Le permite esto inferir
que todos los casos analizados provienen de un origen
comn (monofiltico)?
2) En un trabajo de un grupo de investigacin interesado en filogenia de hominoides, publicado en Mol.
Biol. Evol. 7, 203 (1990), se muestran las secuencias
alineadas de una regin transcripta (3500 pb) del gen
rRNA 28S de varios primates. En la tabla se presentan
los valores tabulados como diferencias encontradas
entre los diferentes pares.La parte del gen elegida es
lo suficientemente conservada para no dar variaciones
intra-especie (entre individuos) y relativamente variable para dar pequeas diferencias (puntuales) comparando con otras especies o gneros.
Hum. Chimp gorila
humano
chimpanc
gorila
orangutn
ratn

19
31
53
242

29
57
245

a) Para qu se incluye al ratn?

59
239

Orang ratn

250

b) Sobre la base de los datos, los autores concluyen

que el chimpanc es el primate ms cercano al humano. Est Ud. de acuerdo?
c) Los autores no incluyeron "gaps" (huecos que aparecen en alguna de las secuencias al alinear todas) en
el anlisis porque dicen que uno no est seguro de que
los "gaps" fueron consecuencia de eventos simples
nicos de mutacin? Ud. esta de acuerdo con esa decisin de los autores?
d) Conoce algn otro mtodo molecular que pudiera
aportar ms datos para confirmar la teora concluida
en b?
3) Otro caso evolutivo de inters epidemiolgico es el
de la BSE (encefalopata espongiforme bovina o mal
de la vaca loca causada por priones) y que ya se coment en un problema de la gua de herencia no mendeliana. Se sabe que la protena normal debe estar involucrada en la sealizacin nerviosa dado que se encontraron alteraciones en los niveles de GABA en ratones knock-out para el gen correspondiente. Una
de las particularidades epidemiolgicas de esta enfermedad es que la misma es transmisible desde ovejas
enfermas de scrappie a bovinos que se alimentan de
tejidos ovinos infectados. Los humanos desarrollan la
enfermedad de Creutzfeld-Jacobs (o kuru) si consumen tejidos bovinos infectados, pero nunca pudo demostrarse la infeccin por consumo de carne ovina.
Los genes para priones de 33 especies distintas han
sido secuenciados y permitieron construir un fenograma como el de la figura.

a) La topologa del rbol es bastante inusual en

algunos aspectos de relaciones entre primates
Orangutn
Humano
Gorila
Chimpanc
Gibn
Cabra
Oveja
Vaca
(comparar con el obtenido en el problema 2)
Cules aspectos?
b) Independientemente de ello, la posicin de los rumiantes (respecto de los primates) es coherente.
Permite este rbol inferir la cadena epidemiolgica
oveja vaca humano? Por qu?
c) Una peculiaridad llam mucho la atencin. Los
OTUs marcados en negritas subrayadas tienen una
serina en la posicin 143 y una histidina en la 155,
mientras que la mayora de los otros priones tienen
asparragina y tirosina en dichas posiciones. Cmo se
puede explicar este resultado? Le parece que, para el

68

caso de este gen, vacas y humanos tienen un origen

filogentico comn? Surge de estos resultados alguna
nueva interpretacin epidemiolgica?
d) Opine si el resultado experimental observado: que
ratones y ovejas pueden ser infectados con BSE (aunque carecen de las 2 modificaciones mencionadas)
contradice las conclusiones de c).
4) Se postula que los cromosomas sexuales de los
humanos evolucionaron a partir de autosomas. Se cree
que los actuales (y escasos) pares de genes que an
recombinan entre su posicin en el cromosoma X e Y
son fsiles moleculares de una homologa mucho ms
extensiva del pasado evolutivo. En un trabajo de Lahn
y Page (aparecido en Science 286:964, 1999) se estudi la evolucin comparando secuencias genes autosmicos ancestrales (llamados ancestrales porque su
homologa con genes autosmicos actuales es muy
baja) que persisten en los cromosomas X e Y. Se tomaron en cuenta 2 variables:
1) la posicin de los genes en el mapa y
2) la divergencia de la secuencia nucleotdica.
a) El mapeo se realiz mediante la utilizacin de
hbridos somticos irradiados. El mapa se ilustra en la
figura de la izquierda. En el cromosoma X estos genes
se concentran en la regin distal del brazo corto. En
cambio, aparecen mucho ms dispersos en el cromosoma Y.
b) La comparacin de secuencias se hizo analizando
las mutaciones silenciosas (tambin llamadas sustituciones sinonmicas) que no cambian la secuencia de
aminocidos de la protena. A partir de este anlisis se
hizo una cuantificacin mediante el parmetro Ks
(promedio de sustituciones sinonmicas por sitio, estadstico que sirve para estimar el tiempo evolutivo
transcurrido desde que las secuencias que se comparan empezaron a divergir por ausencia de recombinacin homloga; en este caso, entre cromosomas X e
Y).
i) Por qu se considera que las sustituciones sinonmicas o silenciosas son prcticamente neutras respecto
a la seleccin?
ii) Porqu se eligieron estas mutaciones en particular
(y no otras) para este clculo de "edad" de genes?
Sorprendentemente, encontraron 4 grupos bien diferenciados de genes: 1) con valores de Ks de 0,94-1,25;
2) 0,52-0,58; 3) 0,23-0,36 y 4) 0,05-0,12. Las diferencias son estadsticamente significativas. Ms sorprendentemente, los genes pertenecientes a cada uno de
los 4 grupos mapean juntos en el cromosoma X y se
ordenan en el mismo por edad. Es decir, el grupo 1
se ubica en el brazo largo, el 2 en el brazo corto (cerca
del centrmero), el 3 en el medio del brazo corto y el
4 en el extremo del brazo corto (ver de nuevo la figura
de arriba). En cambio, en el cromosoma Y no se observa este ordenamiento. Ud. sabe (de cuando vio alteraciones estructurales) que las inversiones cromosmicas constituyen un mecanismo que impide la re-

combinacin homloga,
porque los alelos de los
a
genes homlogos dejan
b
de aparearse en la meio- 4
sis.
c
iii) le ayudan estos co- 3
nocimientos a entender
las diferencias de edades de los genes contenidos estos 4 segmentos 2
cromosmicos?
Por lo tanto, se postula
a
que estos resultados reflec
jan 4 eventos evolutivos
puntuados de inversin
cromosmica (y eventual
b
prdida de DNA de los
segmentos) del cromosoma Y, que llevaron a la 1
prdida de ordenamiento
por grupo de edades de
estos genes en el cromosoma Y (ver segunda figura). Esto sugiere que la
inversin ms reciente
(grupo 4) ocurri hace
30-50 millones de aos
(en la lnea de los primates), la del grupo 3 hace
80-130 Ma, etc. Desde el punto de vista de la evolucin de los grandes grupos, esto significa que el sistema de determinacin del sexo basado en cromosomas X e Y apareci muy tempranamente en la lnea
evolutiva de los mamferos.
iv) Indique si estos datos corroboran (o no) que el sistema de determinacin Z-W de las aves es independiente (o no) del de los mamferos. Qu podra decir
del sistema de determinacin del sexo de los reptiles
de los que se originaron mamferos y aves?
Otro resultado de inters es que los genes SOX3 y SRY
(genes que primariamente determinan el sexo) tienen
valores de Ks que los ubican entre los genes ms antiguos (es decir, genes originalmente homlogos y que
divergieron en el transcurso de la evolucin).
v) Por qu estos genes son importantes?
Finalmente, otro resultado de inters es el del gen
XIST, involucrado en la heterocromatinizacin de uno
de los cromosomas X en las mujeres. Este gen se ubica en el grupo de genes ms reciente, contrariando
hiptesis preexistentes que indicaban que surgi contemporneamente con la determinacin del sexo basada en el sistema X-Y.
vi) Qu funcin cumple la heterocromatinizacin del
cromosoma X y cmo supone que era la situacin antes de que sta apareciera? Podra postular si esta
heterocromatinizacin es evolutivamente tarda o
temprana?

Autosomas
Autosomas reptiles

X Y
XY monotremas

Y
XY marsupiales

4
3

Cuarta inversin del Y (30-50 Ma)

Tercera inversin del Y (80-130 Ma)

Expansin de la zona pseudoautosmica

(120-130 Ma)

Segunda inversin del Y (130-170 Ma)

Emergencia de los cromosomas sexuales

despus del primer evento inversin cromosmica del cromosoma Y (320-240
Ma)

69

X Y
X Y
XY en mamferos placen- XY humanos
tarios no simios

MEJORAMIENTO
5) La (kappa) -casena es una protena presente en la
leche bovina y juega un papel importante en el proceso de elaboracin de quesos. Un alelo del gen de la casena, llamado A, produce un tipo de casena que
da un queso de calidad superior a la que da otro alelo,
gtgctggag(t/c)aggtatcctag

llamado a. La nica diferencia entre ellos radica en

una base que abarca el sitio de restriccin para la endonucleasa Hind III, lo cual hace que el sitio est presente en A y ausente en a:

sitio Hind III +/ regin 3 no codificante

regin codificante

DNA amplificado (874 pb)

Al hacer PCR con iniciadores ("primers") especficos
(indicados en la fig.) sobre muestras de sangre de cinco toros y posterior tratamiento con Hind III, se obtuvieron los siguientes resultados (Animal Genetics 22,
11 [1991]):

pb
874
521
353

a) Qu clase de marcador estamos analizando: dominante o codominante?

b) Cul es el genotipo de los toros testados?
c) Si Ud. fuera un rico y poderoso productor agropecuario que abastece leche a una importante fbrica de
muzzarella,
- cules bovinos elegira para realizar apareamientos
dirigidos?
- seleccionara adems basndose en otras caractersticas fenotpicas?
- financiara un proyecto de investigacin a realizar
por un Licenciado en Biologa para optimizar (por
ejemplo automatizar) la tipificacin genotpica?

ggtcacaacaa cgtg agatg

d) Qu ventajas tiene este mtodo sobre el clsico de

RFLP?
e) De qu otros tejidos se podra extraer DNA de los
toros?
f) Se podra determinar el genotipo de vacas, haciendo PAGE no desnaturalizante de protenas en muestras de leche?
6) Varios trigos argentinos portan la translocacin
1BL/1RS trigo-centeno (es decir son transgnicos
con muchos genes de centeno). El segmento de centeno translocado lleva genes de resistencia a roya de la
hoja, del tallo y a oidio. Adems, algunos autores encontraron una asociacin positiva entre dicha translocacin y el rendimiento. Por otro lado, evidencias ms
recientes muestran un efecto detrimental sobre la calidad panadera debido a la presencia de un gen en el
1RS que codifica para una secalina (protena de reserva de centeno) que afecta a la interaccin de las gluteninas (protenas de reserva de trigo) que constituyen el
gluten. Por eso muchos programas de mejoramiento
estn tratando de eliminar esta translocacin de las
variedades comerciales ms modernas sin desaprovechar el resto de los alelos fijados en las variedades que
estn bien adaptadas.
a.- Conociendo el mtodo de retrocruza. Cmo hara
para obtenerlo?
b.- Evale las siguientes tcnicas para hacer la seleccin pertinente en cada generacin de retrocruza en
cuanto a:

70

i) descripcin de cmo sera el modus operandi de la

tcnica involucrada
ii) complejidad del equipamiento y del personal involucrado (es decir, qu instrumentos y nivel de capacitacin se requiere?)
iii) posibilidad de masificar el anlisis (relacin tiempo empleado por muestra)
Citolgicas: recuento cromosmico, anlisis cariotpico, bandeo C
Bioqumicas: electroforesis de protenas de reserva (secalinas vs. gluteninas-gliadinas), isoenzimas,
ELISA de secalinas.
Moleculares: Microsatlites, hibridacin in situ
Inoculacin con roya
c.- Cul recomendara? Por qu?
Nota: el satlite del brazo corto 1RS del cromosoma
de centeno no se expresa en el fondo gentico del trigo. El cultivar de trigo que lleve centeno tendr una
constitucin 42-2 (cromosomas-satlites) en lugar de
42-4 de un cultivar sin genoma de centeno.
7) El vigor hbrido o heterosis es una interaccin que
se produce en genotipos heterocigotas muy buscada
en mejoramiento animal y vegetal por su asociacin
con caracteres productivos como el rendimiento.
Adems, en muchos casos se producen relaciones
epistticas positivas importantes cuya base bioqumica
o molecular est lejos de ser entendida. Las especies
autotetraploides como la papa ofrecen la posibilidad
de obtener tetrahbridos (heterocigosis con hasta 4
alelos diferentes).

BIODIVERSIDAD

8) Ud. es un bilogo muy preocupado por la conservacin de la biodiversidad y le han encargado tratar de
armar una coleccin de germoplasma de una especie
vegetal o seleccionar un grupo de animales en peligro
de extincin para su conservacin en un rea protegida. Como est interesado en mantener la mayor cantidad de diversidad gentica pero el nmero de individuos que puede seleccionar es pequeo, est tratando
de establecer parmetros objetivos para su seleccin.
Decidi probar con los marcadores RAPD y debe evaluar qu primers y bandas son los ms informativos.Con el primer primer que prueba obtiene el siguiente patrn de bandas:

a) Cuntas bandas diferentes pudo detectar (aydese

de una regla)? Numrelas y arme una tabla con ellas,
en la que pondr este nmero en la primera columna y
los nombres de los individuos (A, B, C, etc.) en la
primera fila. Rellene el cuadro con 0 y 1, segn pre-

A la papa comn (Solanum tuberosum spp tuberosum)

se le pueden aplicar muchas tcnicas biotecnolgicas
como son:
i) cultivo de anteras (es decir, polen) para reduccin
del nmero cromosmico
ii) fusin de clulas somticas (de protoplastos)
iii) cruzamientos amplios (cruzamientos interespecficos con otras especies de nmero cromosmico compatible)
Adems, tiene especies silvestres relacionadas con
genes interesantes para el mejoramiento pero que, en
general, son diploides y autgamas (por lo tanto con
un alto grado de homocigosis), pero que tambin admiten la realizacin de cruzamientos interespecficos
mediante castracin e inoculacin de polen.
Ud. dispone genotipos caracterizados de 4 especies
(Solanum tuberosum tuberosum -4n-, Solanum tuberosum andigena -2n-, Solanum chacoense -2n- y Solanum phureja -2n-, todas cultivadas en distintos pases) con varios genes agronmicos de inters y quiere
combinarlos de alguna manera.
a) Disee un mtodo para la obtencin de tetrahbridos de estas 4 especies.
b) Sabiendo que existe un mapa gentico de RFLPs
muy bien caracterizado (con sondas que detectan bandas en todos los cromosomas) en Solanum tuberosum
tuberosum y que hay mucho polimorfismo para este
tipo de marcadores, indique una forma sencilla de
evaluar el grado de xito que obtuvo con la estrategia
diseada en a).

sencia o ausencia de banda. Felicitaciones! Acaba de

construir una MBD (matriz bsica de datos).
b) Calcule la frecuencia de presencia de cada banda
(alelo).
c) Calcule el contenido de informacin polimrfica
(PIC) de cada una mediante la frmula de Anderson
(1993):
n

PICi = 1 j =1 pij2
donde p es la frecuencia del alelo j para el marcador i.
d) Como Ud. est bastante ansioso, y considera que la
muestra de individuos aqu analizados es representativo, como as tambin confa en el patrn de bandas
obtenidas, quiere avanzar y tener una medida de la
diversidad gentica, se decide a estimarla. Para ello
utiliza la frmula de Weir (1996). sta est formada
por la suma de cuadrados de las frecuencias de los
alelos

D = 1

1
i
L l

en promedio para L loci, donde p es la frecuencia del

alelo i en el locus.

71

Anexo: Compendio de preguntas de parciales anteriores (cursos 2000-2006 de verano):

Nota: la inclusin de las siguientes preguntas y, particularmente, las respuestas esperadas que sirvieron de gua
para la correccin de los parciales por parte de los docentes, no tienen otro propsito didctico que el de orientar
a los estudiantes acerca de cmo son los parciales de la materia y de cmo se corrigen. Aquellas preguntas de
parciales que los docentes consideramos que aportaban a la mejor comprensin de algn captulo de la materia,
fueron incluidas en la gua de problemas y no se repiten aqu. Algunas de las preguntas de parciales integran
ms de un captulo de las clases de problemas. Las preguntas de los parciales de la presente cursada tendrn el
mismo espritu pero sern diferentes en sus enunciados. El orden de los temas no es el mismo que en la gua.
Regulacin e Ingeniera Gentica
1) Los operones mce de Mycobacte-gal
rium tuberculosis (bacteria que produce la tuberculosis) codifica para
500
pP3Rv 200
100
protenas potencialmente involucraRv
das en la virulencia de este patgePromotor mce
no. En el genoma de M. tuberculosis
hay 4 operones mce similares en
pP3
-gal
secuencia y organizacin, que codifican para protenas secretadas o de
membrana y una protena de tipo
-gal
pJEM15
invasina. Estos genes son exclusivos
de las micobacterias y no se encuentran en otras bacterias mejor caracA
terizadas como Escherichia coli.
Santngelo y col (del INTA CasteB
lar) publicaron en Microbiology
(2002, 148:29973006) un trabajo
C
en el que estudian la regulacin de
este opern en base a la informacin genmica dispo- a) Qu tipo de efecto tiene la presencia del gen Rv
nible. Por un lado conocan las secuencias estructura- sobre la regulacin del gen quimrico?
les de los genes mce pero no tenan bien caracterizado b) Si la construccin que interesa analizar es pP3Rv
su promotor. Por otro lado, les llam la atencin un para qu se hicieron los experimentos con pP3 y con
gen (llamado Rv) ubicado hacia 5 de uno de los ope- pJEM15?
rones dado que codificaba para una protena cuya es- c) Por qu se reemplaz la secuencia codificante de
tructura predicha por los modelos bioinformticos era mce por la de la -gal?
similar a la de algunos factores de transcripcin. Para Para investigar la localizacin del sitio de unin de la
estudiar la funcin de este gen realizaron las siguien- protena codificada por Rv hicieron gel-shifting en los
que se diferencian electroforticamente los DNAs
tes construcciones quimricas:
pP3Rv contiene el gen Rv completo (incluyendo el sueltos de los que tienen pegados una protena
porque sta les repromotor de Rv), la regin intergnica completa hasta A
B
C
el codn de iniciacin del primer gen mce (es decir, 1 2 3 1 2 3 1 2 3 - trasa su migracin
en el gel. Los
donde debera ubicarse el promotor de mce). La seDNAs se detectan
cuencia codificante para mce fue reemplazada por el
por hibridacin con
gen lac
una sonda del
pP3 es igual, pero sin Rv
segmento
interpJEM15 es el vector vaco (salvo por el gen lac)
gnico.
Se
incubaA, B y C representan segmentos de la regin interron los siguientes
gnica (1-100, 1-200 y 200-500 pb hacia 5 del ATG,
productos de PCR:
respectivamente)
A) nucletidos 1Lo primero que hicieron fue estudiar el efecto de in+ 100 B) 1-200,
troducir las construcciones quimricas en E. coli obteC) 200-500 con 1)
niendo los siguientes resultados:
bfer 2) ex tractos de bacterias transformadas de
Efecto del gen Rv sobre el promotor mce:
E.coli conteniendo la construccin pP3Rv; 3) extracMicobacterias transformadas con
tos de bacterias de E. coli conteniendo la construcpJEM15 (vector sin insertos) [barras blancas]
cin pP3
pP3 (construccin sin Rv) [barras grises]
d) Dnde se localiza el sitio de unin de la protena?
pP3Rv (construccin con Rv) [barras negras]

72

e) Por quu se utilizzaron extracctos de E. coli

(transformaadas con las construcciiones) y noo de
micobacteriias?

7 kb

E1
pb

prom
motor 21
de actina
a
de tomate
t

12 kb

3 kb

E2
370 pb

E3
pb
80

E4
4
130
0 pb

vector

Respuestaas esperadaas a) Activaddor

b) La com
mparacin entre
e
la acctividad de p3 y
p3Rv es loo que permiite determinnar que Rv es un
elemento activador
a
(oo represor sii lo hubiese sido).
pJEM15 ess un control negativo.

c
en un Southerrn de DNAss genmicoss digeridos con
n
b) Aloe
A
HindIII provennientes de: a) tomate normal,
verra, c) tomatee transgnicoo; hibridando
o con una sonnda
de cDNA de loongitud comppleta.
2) Por qu habr
h
elegidoo tomate y no tabaco, por
ejeemplo?
3) Analizando la expresinn de los mRN
NAs de aloeeverin
na en distintoos tejidos deel tomate tran
nsgnico porr la
tccnica de Norrthern, usanddo como son
nda al cDNA
A de
alo
oeverina de longitud coompleta, se observ lo siRNA de

RNA d
de tomate transgnico

c) Porque es
e fcil de deetectar enzim
mticamente y los Aloe vera:
v
hoja raaz hoja rraz
fruto flor
resultados no
n son afecttados por la expresin de
d los
_
genes mce endgenos (cromosmic
(
cos) de las micom
mRNA
AI
bacterias traanformadas.
d) 100-200
mRNA
A II
e) Porque necesito
n
extraaer de una clula que expprese
la protena Rv, porque si no, nuncaa podra estuudiar
su efecto.
+
2) El Dr. Cuureta, en su eterna
e
bsquueda de la pcima
gu
uiente:
de la juventtud eterna, esstudi la estrructura y exppresin
a) Cules son los tamaoss del mRNA I y mRNA III?
del gen de la aloeverinaa que producce una proteena de
b) En el primeer esquema uubique (con flechas) la prop
maravillosaas propiedadees curativas y rejuvenecedoras
bab
ble ubicacin del codnn de iniciaciin y la del de
en Aloe verra (planta noo comestible). Este gen da
d oriterrminacin.
gen a dos protenas difeerentes en lass hojas y las races
c) Por qu el Dr. Cureta rreemplaz en
n su experim
mende la plantaa por splicinng alternativoo. Sin embarrgo, la
to el promotorr de la aloevverina por el de la actinaa de
nica que tiiene propiedaades especiaales es la de la
l hoja
tom
mate? Le parece
p
que eligi el prom
motor ms adea
que se prodduce en cantidades muy pequeas.
p
Addems,
cuado para sus propsitos? Por qu?
su purificaccin es ineficciente, con el
e agravante de
d que
d) Qu concllusiones sacaa a partir dee los resultados
sus propiedades se ven afectadas
a
poor las fenoloxxidasas
del Northern en
e cuanto a la especificidad tisular del
que se liberran de los lisoosomas cuanndo estas orgganelas
spllicing del RN
NA del gen dde la aloeveriina?
se rompen en el processo de homoggenizacin. Esta
E es
e) Qu sugerrencias expeerimentales le hara al Dr.
la estructuraa del gen de la aloeverinaa:
Cureta parra mejorar laa performancce de sus exxpe3 kb
12 kb
7 kb
rimentos y as obtener los resultado
os deseados?
Respuestaas 1) tomate, no da nadaa. Aloe veraa: 3
bandas de 7, 3 y 12 kpb. Tomaate transgniico:
E2
E3
E4
E1
1
promotor
dem. 2) Porque el tabaco tampoco
0
pb
130
pb
o es comestibble.
210 pb
70
p
b
8
3
s.
Respues
El
tomate,
sta
alternativ
va:
Si la ideaa es
Las flechas indican sitioos para la ennzima HindIIII. Los
de
mejorar
la
productiv
vidad,
el
taba
aco
(por su alta
a
la
dos mRNAss difieren poorque en unoo est presentte y en
oduccin
de
biomasa)
po
odra
haber
si
ido
una
alter
rnapro
el otro est ausente el exxn E3 de 800 pb. El Dr. Cureta
va interesantee. 3) a) 790 y 710, b) ATG: Una flecha
decidi obttener tomatees transgniicos transfecctando tiv
un
n
poco a la deerecha del exxtremo del exn
e
1 (no enn el
con un plssmido recom
mbinante con el gen clonaado de
ext
tremo
porqu
ue
siempre
ha
ay
un
extrem
mo
5
de mRN
NA
la aloeverinna en el que haba
h
reempllazado al proomotor
no
codificante
)
o
al
princ
ipio
del
ex
n
2.
Stop:
u
una
nativo de laa aloeverina por el de laa actina de toomate,
echa
un
poco
o
a
la
izquier
rda
del
extre
mo
derecho
fle
del
con el fin de analizar la expresin de
d mRNAs dee aloeex
n
4
(siempr
re
hay
un
se
egmento
3
no
n
codificant
te
a
verina en loos distintos teejidos:
1) Sabiendoo que los toomates no tienen
t
ningn gen 3 del codn dee terminacin), c) El promotor nativoo es
u
constituttivo
endgeno homlogo
h
a de la aloeverina, dibbuje el poco eficientee y lo reempplaza por uno
al
fue
erte,
pero
po
odra
haber
elegido
mejo
or
el
promottor:
patrn de bandas de hibbridacin quee esperara obtener
o
por ej. uno esspecfico de fruto de tom
mate, que ess el

73

tejido de inters para alimentacin. d) Aparentemente,

el sistema que permite reconocer al exn 3 como tal,
es especfico de hoja y de especie y, tal vez, de gen
(pero eso no lo podemos determinar con estos datos).
e) Usar una construccin SIN intrones para evitar el
procesamiento incorrecto.
3) Para el opern lactosa de Escherichia coli, indique
el genotipo de al menos uno de los diploides parciales
posibles capaces de producir beta-galactosidasa (codificada por el gen Z) constitutivamente y permeasa
(codificada por el gen Y) en forma normal (es decir
inducible con anlogos de la lactosa) usando la nomenclatura practicada en las clases de problemas.
Respuesta: lacI+ lacOc lacZ+ lacY- / lacI+ lacO+
lacZ- lacY+ (en alguno de los 2 genotipos lacI puede
ser lacI-)
3) En la pelcula Blade II, el hroe (Blade) es un semivampiro que lucha a favor de la humanidad con
los vampiros malos que quieren dominar el mundo.
En una escena trascendental de la pelcula, Blade es
capturado para poder extraer su sangre (y su ADN)
porque los vampiros estaban diseando nuevas variantes transgnicas clonadas con mejor adaptacin. Si
bien ya haban logrado obtener vampiros resistentes a
la plata modificando el gen de la metalotionina, queran extraer de Blade un gen de resistencia a la luz solar. Ud. ha sido contratado por los vampiros para
hacer este trabajo (le han prometido vida eterna como
forma de pago) y dispone de un laboratorio de ingeniera gentica excelentemente equipado que le permite, entre otras cosas, cultivar in vitro vampiroblastos
(clulas equivalentes a los fibroblastos humanos). Los
vampiroblastos extrados de vampiros comunes se
lisan en presencia de luz solar, mientras que las clulas extradas del cuerpo de Blade son luminoresistentes. No se dispone de informacin alguna sobre la secuencia del gen a clonar, ni anticuerpos, ni secuencias
parciales de aminocidos de la protena. Tampoco se
pueden planear cruzamientos genticos de Blade con
vampiresas para estudiar su progenie porque llevara
mucho tiempo. Inspirndose en el ejemplo histrico
del clonado molecular de los primeros oncogenes
qu estrategia de clonado y caracterizacin funcional
del gen de resistencia a luz solar propondra?
Respuesta: En caso de seguir los pasos histricos
descriptos en el Recombinant DNA de Watson y col.:
se extrae ADN total de Blade (slo o con una etiqueta tag- de secuencia nucleotdica conocida ligada) y
se lo usa para transfectar vampiroplastos por la tcnica
de coprecipitacin con fosfato de calcio. Despus se
exponen los vampiroblastos a la luz y se extrae ADN
total de las clulas transgnicas resistentes y se fabrica
una genoteca en fago lambda. Se releva (screenea)
la genoteca con ADN repetitivo de Blade (el equivalente a secuencias Alu) o con la sonda para el tag para
identificar el ADN procedente de Blade. Se confirma
la identidad del clon de lambda por transfeccin de
vampiroblastos que se convierten en luminoresistentes.

Con tcnicas ms modernas se aislara el ADN de

Blade y se lo clonara en BACs (se puede aceptar que
sea en otros vectores como csmidos o en fagos
lambda). Con mezclas (pooles) de clones recombinantes se transfectan vampiroblastos para identificar
clulas luminoresistentes (por electroporacin o usando liposomas). A las mezclas que producen clones
positivos se las separa en clones individuales hasta
identificar el clon conteniendo el gen de inters. Una
vez identificado el clon se subclona y secuencia el
inserto para ver si hay ORFs candidatos, los cuales
son testados funcionalmente de la misma manera.
4) La Dra. Romntica est intentando encontrar genes
que aceleren la floracin. Con este objetivo en mente
procede a transformar plantas de Arabidopsis thaliana
mediante la utilizacin de Agrobacterium, con la siguiente construccin:

LB y RB: bordes izquierdo y derecho del T-DNA,

35S: enhancer fuerte y constitutivo, nptII: gen de resistencia a kanamicina Pnos: promotor constitutivo, tnos: terminador
Entre las miles de plantas generadas encuentra una
mutante
(M) que florece en la mitad de tiempo que las plantas
salvajes (wild type = wt). A partir de una hoja de esta
planta extrae DNA, lo digiere con BamHI, lo corre en
un gel de agarosa, transfiere a una membrana y lo revela con una sonda radiactiva correspondiente al TDNA completo. Cuando cruz esta planta con una
planta salvaje, dentro de la descendencia, algunas
plantas presentaron floracin temprana y otras no. Al
repetir el Southern blot con 10 plantas de la F1 se obtuvieron los siguientes resultados:

a) Para qu se incluy el gen quimrico npt II en la

construccin?
b) Cul fue el objetivo de introducir un enhancer
suelto no acompaado de un promotor o de una secuencia estructural?
c) Cree que el hecho de que se observen dos bandas
en el mutante parental se deba a que BamHI corte dentro del TDNA o a qu se insertaron dos T-DNAs (en
lugar de uno) en ms de un lugar en el genoma? Analice teniendo en cuenta los resultados obtenidos con la
F1.
d)Qu plantas de la F1 seguira analizando? Justifique. El hecho de conocer la secuencia de la construccin utilizada le permiti a la Dra. Romntica median-

74

te PCR, secuenciacin y finalmente comparacin con

la base de datos del genoma de Arabidopsis, identificar el sitio exacto de insercin del T-DNA. Este sitio
de insercin se encuentra 1 kpb ro arriba (5) de un
marco de lectura abierto an no estudiado (ORF4329).
e) Qu efecto cree que tiene la insercin del T-DNA
sobre el ORF4329? Qu experimento hara para
comprobarlo? Muestre mediante un diagrama los resultados esperados.
f) Cree que el ORF4329 es un gen inductor o represor de la floracin? Disee un experimento complementario al realizado por la Dra. Romntica que, mediante ingeniera gentica, le permita comprobar su
hiptesis, indicando los resultados esperados. Recuerde que en la transformacin mediante Agrobacterium
el T-DNA no se integra mediante recombinacin
homloga (en biobalstica tampoco).
g) Como Arabidopsis es un yuyo y sus flores son bastante feas, un estudiante de doctorado de la Dra.
Romntica est interesado en ver si los rosales tambin tienen un gen homlogo al ORF4329. Cmo lo
hara experimentalmente sabiendo que el genoma del
rosal no est secuenciado? En caso de que haya un
gen homologo al ORF4329 presente, cmo clonara
el gen homlogo completo?
Respuestas esperadas
a) Como gen marcador selectivo que permite seleccionar las plantas transgnicas de las no transgnicas
durante la regeneracin de plantas en un medio conteniendo el antibitico kanamicina
b) Porque el objeto del experimento es que este enhancer estimule constitutiva y fuertemente los promotores cercanos al sitio de insercin del segmento T con
la esperanza de que alguno de ellos estimule la floracin temprana.
c) No puede haber ocurrido que haya slo un sitio de
insercin y que BamHI corte dentro del DNA-T pues
en la F1 las dos bandas segregan independientemente.
Seguramente el DNA-T se insert en 2 sitios distintos.
d) Seguira analizando alguna de las siguientes plantas: 1, 6 o 9 ya que presentan floracin temprana, pero
no heredaron el inserto del T-DNA no relacionado con
la induccin temprana de la floracin. El descartar las
plantas 4, 7 y 10 facilita los pasos siguientes de identificacin del sitio de insercin.
e) Dado que el T-DNA no interrumpe un gen ni el
promotor mnimo, pero s se ubica cercano al promotor, la insercin del DNA-T estara aumentando la
transcripcin del ORF4329 mediante los enhancers
35S. Para comprobar esta hiptesis habra que realizar
un Northern partiendo de mensajeros de plantas normales y mutantes (sera interesante comparar tambin
tejidos florales y no florales ya que el enhancer 35S es
constitutivo) utilizando una sonda complementaria al
ORF4329.
f) Es un inductor de la floracin pues al aumentar su
expresin se adelanta la floracin. Para comprobarlo
se podra hacer un antisense del ORF4329 y espero

ver un retraso o ausencia de floracin. Si repito el

Northern vera menos mensajero que en el normal.
g) Otra respuesta alternativa que pueden pensar los
alumnos sera realizar un knock out de ese ORF. En
realidad tericamente no sera correcto pues en plantas no suelen realizarse knock outs, pero ellos probablemente no lo sepan (conceptualmente no importa,
tcnicamente, lo knock outs en la actualidad, salvo en
bacterias, se hacen por interferencia transformando
transitoriamente con RNAi o establemente con construcciones que expresen iRNA). Adems est la aclaracin de que la integracin del T-DNA no es por recombinacin homloga y s saben que para hacer un
knock out dirigido se requiere recombinacin homloga.
h) Hara un Southern usando como sonda al
ORF4329 y condiciones de baja rigurosidad en la
hibridacin. Para clonarlo hara una genoteca y localizara el gen homlogo mediante hibridacin con la
sonda de Arabidopsis.
5) Los ritmos circadianos que corresponden a ciclos
de aproximadamente 24 horas permiten a los organismos regular su actividad con la alternancia danoche. Aunque estos ritmos son autnomos, algunos
estmulos externos, tales como la luz, pueden poner
en hora este reloj interno. En mamferos, existe un
marcapasos central, ubicado en el ncleo supraquiasmtico (NSQ) del hipotlamo anterior. Varios
genes estn involucrados en el mecanismo molecular
del reloj interno, existiendo entre ellos lazos de retroalimentacin positiva y negativa a nivel de la expresin
y de la actividad de las protenas que codifican. Se
sabe que la fase de este marcapasos central se puede
adelantar con un estmulo lumnico durante la noche
relativa que es captado en la retina y llevado al NSQ a
travs del tracto retino-hipotalmico (que libera el
neurotransmisor glutamato) y que este cambio de fase
est asociado a un aumento rpido de la expresin del
gen Per1. Ro arriba (hacia 5) de este gen se encuentra una secuencia cre (elemento de respuesta a
cAMP), a la cual se puede unir en ciertas condiciones
el factor de transcripcin CREB. Se realiza el siguiente experimento: a un cultivo sincronizado de clulas
del NSQ de ratn se lo estimula durante la noche relativa con concentraciones adecuadas de glutamato
(provoca el mismo efecto que la luz provoca in vivo) o
db-cAMP (dibutiril cAMP: anlogo del cAMP que
puede atravesar la membrana celular) o con solucin
salina (control). Despus de 30 minutos se extraen
RNA y protenas. Northern Blot con sonda para Per1:
Control Glut db-cAMP

Relacin entre CREB fosforilado (P) y no fosforilado

Relacin
CREB-P/CREB

Control Glut. db-cAMP

0,3

4,2

2,2

75

Esta relacin se determin realizando Western Blot

con anticuerpos anti-CREB y anti-CREB-P.
Para poder confirmar el rol de CREB se construy el
siguiente sistema indicador (reportero) y se transfect
en clulas del NSQ en cultivo.
Prom: promotor del gen Per1.
cre

Prom

Sec estr.gen luc

La luciferasa (codificada por la secuencia estructural

del luc) es una enzima que reacciona con el agregado
de luciferina produciendo luminiscencia. Se ensaya la
actividad de estas clulas en las siguientes condiciones:
+ inhibidor de AC - (baja expresin)
- glutamato

- sin inhibidor

- (baja expr.)

+ inhibidor de AC + (expr. media)

+ glutamato - sin inhibidor

+++ (alta expr.)

AC (adenilato ciclasa): enzima que sintetiza cAMP a

partir de ATP, responsable del aumento de cAMP durante la transduccin de seales de diversos estmulos.
Interpretar estos resultados.
Se sospecha que el glutamato ejerce su accin va
cAMP pero que esta podra no ser la nica va en que
lo hace. Qu opina acerca del rol de CREB en los dos
tipos de estmulo? Justificar.
Respuestas a) Esta respuesta implica un mnimo de
detalle de descripcin de para qu se hicieron los 3
experimentos y qu datos aporta cada uno. Conclusiones: tanto glutamato como cAMP inducen la expresin de Per1. La induccin por glutamato es ms fuerte que por cAMP. Adems, el glutamato es capaz de
activar el promotor de CREB an en presencia de inhibidores de la AC.
b) La contestacin a esta pregunta puede tener algunas
variantes de respuesta y se evaluar en funcin de la
coherencia del razonamiento que se emplee. La respuesta esperada es que puede deberse a que el glutamato activa la misma va de seal del cAMP y adems
otra (u otras) o a que activan vas totalmente separadas que terminan en el mismo efecto (siendo la de glutamato una va ms fuerte). En cuanto a CREB, se ve
que la fosforilacin de CREB se corresponde con una
alta expresin, por lo que podra pensarse que CREB
est implicado en la activacin de Per1. El menor
efecto de cAMP tambin se ve en este caso, lo que
lleva a pensar en principio que la menor expresin
vista con cAMP se debera a una menor activacin de
CREB y no a que falte activarse otro factor de transcripcin adems de CREB que s se active con glutamato.

Mendel y extensiones
1) En los cobayos, el color de pelo (negro vs blanco)
es determinado por el gen B. Los smbolos negros re-

presentan a los cobayos negros y los blancos a los cobayos de fenotipo blanco. Se dispone del siguiente
rbol genealgico, en el cual los individuos II1 y II4
pertenecen a lneas altamente endocriadas (asumir que
pertenecen a lneas puras).
a) Represente
I
2
1
el
genotipo
probable de
cada indiviII
1
2
3
4
duo (en los
casos de que
III
1
2
?
pueda ser ms
de uno, represente con un guin bajo, i.e. B_)
b) Calcule la probabilidad de que un descendiente del
cruzamiento entre III1 y III2 sea blanco. Para contestar es suficiente que escriba los genotipos al lado de
los smbolos en el esquema y las probabilidades (slo
de las que se usarn para hacer los clculos) sobre el
esquema (puede dibujarlo o escribir sobre este enunciado). De lo contrario, explique su razonamiento
Respuestas esperadas:

Bb 1

Bb

2/3 BB
---Bb
1
2 bb
3
4
b
BB
b
Bb 1
2 Bb
?

BB
II
III

En caso de respuesta con explicacin:

I1 y I2 tienen que ser heterocigotas (Bb) porque si no,
no podran tener un hijo blanco
II1 y II4 son BB por definicin de lneas puras, II2 bb
porque su fenotipo refleja su genotipo
II3 es B_ porque no podemos saber qu segundo alelo
recibi. Tiene 1/3 de posibilidades de ser BB y 2/3 de
ser Bb (son tercios y no cuartos porque se descarta
que pueda ser bb dado que su pelaje es negro).
III1 es Bb porque deriva de un BB y un bb
III2 es B_ dado que, como se explica arriba, existe
una probabilidad de 2/3 que su padre II3 sea Bb
Si II3 era BB, III2 es BB. Si II3 era Bb, existe de
probabilidad de que III2 sea BB o Bb.
Slo si III2 resulta Bb, podr tener de posibilidad
de tener un hijo blanco con III1
Por lo tanto, la probabilidad de que se produzca un
cobayo blanco es (2/3)(1/2)(1/4) = 2/24 = 1/12
2) La anemia de clulas falciformes (ACF) es un proceso hereditario humano causado por un alelo autosmico recesivo de muy baja incidencia en las poblaciones occidentales. Un matrimonio quiere conocer
la probabilidad de tener un hijo afectado. Con sus conocimientos sobre herencia mendeliana qu podra
decirles si:
a) ambos miembros de la pareja son normales, pero
cada uno de ellos tiene un padre afectado y el otro
progenitor no tiene historia familiar de ACF?

76

b) el marido est afectado por la enfermedad pero la

mujer no tiene antecedentes familiares de ACF?
I) Para cada caso construya las genealogas posibles
para esta familia indicando los genotipos y fenotipos
de todos los individuos involucrados.
II) Sobre qu fundamento(s) incluido(s) en la/s
ley(es) de Mendel) se apoyan sus predicciones en los
casos anteriores?
Nomenclatura: S alelo determinante de hemoglobina
falsiforme, N de Hb normal, _ puede ser cualquiera de
los 2 alelos (N o S)
Respuesta: a) b) 0
I) a) abuelos SS (enfermo) x NN (sano) padres SN
(sanos en ambos casos) hijos posibles NN, SN o SS
b) abuelos en un caso: S_ x S_ (ambos sanos o enfermos) padre SS (enfermo), abuelos en otro caso
NN x NN padre NN (sanos todos)
II) En el concepto de segregacin de los alelos al formar las gametas que darn origen a la progenie explicitada en la primera ley de Mendel.
3) La corea de Huntington es una enfermedad rara,
mortal, que aparece normalmente a mediana edad. Se
debe a un alelo dominante. Un hombre fenotpicamente normal, de poco ms de 20 aos, advierte que su
padre ha desarrollado la corea de Huntington.
a) Cul es la probabilidad de que ms tarde l mismo
desarrolle la enfermedad?
b) Cul es la probabilidad de que la desarrolle su hijo
al cabo del tiempo? (Nota: Para sus clculos asuma
que la frecuencia del alelo que produce la enfermedad
en la poblacin humana es insignificante).
Respuesta Suponiendo que el padre que desarrolla la
enfermedad fuese heterozigota para el alelo mutante
(dado que la probabilidad de que tambin lo tenga la
madre es insignificante): a) b) .
Si suponen que el padre tambin poda ser homocigota
(adems de heterocigota) y se hacen los clculos correctos [a) 1 b) ] para esta segunda posibilidad el
problema se considerar bien contestado. Si ponen
homocigota como nica posibilidad an cuando se
hagan los clculos correctos, el problema est mal
contestado.
4) Dos plantas enanas de maz (E1 y E2) tenan origen
distinto, pero eran fenotpicamente idnticas. Se cruzaron cada una de estas plantas enanas con una lnea
altamente endocriada de plantas altas que, se saba,
son homozigticas para todos los genes que determinan el tamao. Ambos cruces dieron lugar a una F1
constituida nicamente por plantas altas. Al autofecundar cualquier planta de la F1, la proporcin de la
F2 fue de 3 altas: 1 enana. Los cruzamientos entre las
dos lneas enanas paternas E1 x E2, solo dieron lugar
a plantas altas en la F1. A pesar de este resultado, en
la F2 reaparecieron las variantes enanas. La proporcin de plantas enanas en la F2 fue de 7/16.
a) Explicar los resultados obtenidos, indicando todos
los genotipos implicados.

b) Qu proporciones genotpicas y fenotpicas esperara si se realizase el cruzamiento prueba de la F1 del

cruzamiento E1 x E2 con el progenitor E1?
Respuesta a) Dos genes afectan al tamao
A (normal)> a (enanismo 1)
B (normal)> b (enanismo 2)
[Es un caso de epstasis complementaria]
P E1=AAbb x E2=aaBB
F1 AaBb (altas)
F2 9 A_B_ (altas) vs 7 aa__ o __bb (enanas)
b) AaBb x AAbb AABb , AaBb , AAbb ,
Aabb .
Proporciones fenotpicas: A- B- 1/2 altas; A- bb 1/2
enanas
4) Un joven de
35 aos se acerca
a un consultorio
mdico con el fin
de
investigar
cules son las
chances de desarrollar la enfermedad que aquePedigr de la familia. El individuo 4
ja
generacin
es el que se acerc al consultorio.
tras generacin a
su familia. Su abuelo materno y su madre murieron de
una rara enfermedad neurodegenerativa que los sorprendi a la edad de 45-50 aos, y que ahora tambin
aqueja a su hermana mayor, pero no as a sus otros
dos hermanos, ambos ya en sus 50s. Lo primero que
hace el mdico es analizar el rbol genealgico de la
familia:
a) Qu tipo de herencia tiene esta enfermedad?
b) Determine los posibles genotipos de todos los individuos esquematizados en el pedigr (con excepcin
del 4).

A partir de la descripcin de la enfermedad y del rbol

genealgico el mdico sugiere que el paciente se haga
un anlisis de DNA para tratar de detectar la posible
existencia de una enfermedad de esas caractersticas,
para la cual, afortunadamente, se tienen marcadores
moleculares que se sabe que cosegregan perfectamente con el gen mutado.
c) Qu caractersticas esenciales debe tener un marcador molecular para que sirva en el anlisis de cosegregacin? Qu tiene que permitir distinguir?
De esta forma el mdico analiza resultados de los
exmenes del individuo en cuestin y de todos sus
hermanos, obtenidos con el marcador PV123:

77

d) Qu sonda se utiliz para revelar el Southern? Esquematizar la regin cromosmica correspondiente y

marcar dnde hbrida la sonda.
e) A la luz de estos resultados, qu le dira al muchacho? Justifique su respuesta analizando los resultados
del Southern.
Respuesta: a) Debida a un alelo dominante
b) Aa x aa

Aa x aa

(1) Aa , (2) aa, (3) aa, (4) ? (por lo que se ve ms abajo es Aa)
c) Estar localizado (mapear) lo ms cerca posible (estrechamente ligado) al locus a diagnosticar. Me tiene
que permitir distinguir no solamente al enfermo (o que
potencialmente se va a enfermar) del no enfermo (fenotipo) sino tambin homocigotas de hetrocigotas
(sobre todo en enfermedades recesivas, que no es este
caso).
d) El marcador PV123 tiene 2 alelos: uno que se visualiza como una banda de 5 kb (alelo sano) y otro
como 2 bandas de 3 y 2 kb (alelo enfermo), respectivamente. [El polimorfismo probablemente se deba a
la aparicin de un nuevo sitio de restriccin en el segundo caso]
e) Que comience un tratamiento para amortiguar la
aparicin de la enfermedad dado que es portador del
alelo que predispone a la enfermedad.
5) Se present ante los tribunales de justicia el siguiente caso: la familia Prez reclama que cierto beb
(Juan), que les dieron en la maternidad, no les pertenece y que, en cambio, el beb Felipe, que tiene la
familia Garca, es el suyo y se lo cambiaron. La familia Garca niega este hecho, y el tribunal ordena el
examen de los grupos sanguneos de los bebes y de los
padres, con los siguientes resultados:
Ma- PaBeb
dre
dre
Familia Prez AB
O
A
(Juan)
Flia. Garca
A
O
O (Felipe)
Qu familia tiene razn y por qu?
Respuesta: la Garca. Si escribimos los genotipos
completos de los padres resulta claro que el primer
podra ser resultado de cualquiera de las 2 parejas,
pero el segundo beb slo de la segunda
Ma- Pa- Beb
dre
dre
Familia Prez
AB
OO AO
Flia Garca
AO
OO OO

Mapeo
1) En una determinada especie animal los loci A,a; B,
b y C,c se localizan en el mismo autosoma. El locus
B,b es el central. La distancia entre A,a y B,b es de 20
unidades de mapa, la distancia entre B, b y C, c es de
10 unidades de mapa y el coeficiente de coincidencia
es 0,6. Indicar la proporcin esperada de individuos
obtenidos con el fenotipo Abc.

Respuesta: Cc = Frecuencia de dobles observadas

(FO) / Frecuencia de dobles esperados (FE) = 0.6
FO= 0.6 x FE= 0.6 x 0.2 x 0.1=0.012
N de dobles observados = 0.012 x 100 = 1,2% individuos dobles recombinantes: AbC y aBc
distancia. A-B = N de Individuos recombinantes entre estos marcadores + N de dobles recombinates x
100 / n total de individuos = 20 n ind. rec. entre
estos marcadores + 1,2 = 18,8
Es decir, 18,8 % son recom. Abc y aBC por lo tanto
aproximadamente tendremos la mitad de individuos
de cada tipo: 9,4 %
2) Se est estudiando una nueva especie de plantas
descubierta recientemente. Se sabe que el alelo Q codifica para hojas verdes, y el q para hojas moteadas (Q
domina sobre q); por su parte el alelo R codifica para
hojas redondas, y el r para puntiagudas (R domina
sobre r). Todava no se sabe la funcin del gen E/e. A
estos investigadores les result raro que, a pesar de
haber muestreado una gran regin en la que este tipo
de planta habita, no se encontr ninguna planta con
hojas verdes y puntiagudas simultclases
Nro
neamente. Para dilucidar esta cuesEqR
280
tin, se realiz un cruzamiento
eqr
203
prueba, y los resultados fueron los
EQR
199
siguientes:
eqR
7
a) Qu genes estn ligados?
67
b) Hay interferencia? Contestar si Eqr
279
o no, no hace falta calcularla eQr
numricamente (lo mismo en a)
eQR
73
c) Por qu piensa que no se observan individuos de uno de los genotipos posibles?
e) Analizando los resultados, discuta qu supuestos
de los que se utilizan para este tipo de estudio para
calcular las distancias gnicas en base a las frecuencias observadas pueden no estar cumplindose.
Rta: a) Q/q y E/e estn ligados, E/e y R/r estn ligados, q/Q y R/r no pareceran estar ligados porque el
porcentaje de recombinacin es del 50%. Sin embargo, se encuentran en el mismo cromosoma (estn ligados a 50 um o ms)
Para hacer los clculos (no pedidos para responder la
pregunta), primero tienen que sacar el locus central
que es el E/e. Despus:
dist Q/q E/e = 36,9 um
dist E/e R/r = 13,27 um
dist q/q R/r = 50,07 um (no estn ligados)
Lo correcto para calcular la distancia entre los genes
de los extremos es sumar las distancias internas (da
50,07 um), en vez de realizar una prueba de dos puntos (da 48,92 um), pues de lo contrario no se estaran
considerando los dobles recombinantes.
b) Si. Para hacer los clculos (no pedidos para responder la pregunta)
Cc = 7 / 54,25 = 0,12
Por lo tanto I = 1- 0,12 = 0,88
Siendo 7 el nro de dobles rec observados

78

Siendo 54,25 el nro de dobles rec esperados (0,369 *

0,1327 * 1108)
Siendo 1108 el total de individuos
c) Una posibilidad es que, como sugera el enunciado,
la combinacin de alelos Q/q r/r sea letal, siempre y
cuando a su vez el genotipo sea E/e. En el campo
abierto podra presentarse el mismo fenotipo generado por el genotipo anterior por ejemplo por la combinacin de QQ Ee rr, Qq EE rr Qq eE rr (pues se
pueden dar todas las combinaciones posibles, al no
tratarse de cruzamientos prueba). Dado que en el
enunciado se menciona que a campo abierto no se observa ese fenotipo (hojas verdes y puntiagudas) se
puede pensar que tanto Q/Q r/r como Q/q r/r son combinaciones letales en presencia de por lo menos un
alelo E. (y no en presencia de ee, ya que se observan
parentales del cruzamiento prueba que son Qq ee rr)
d) Hay que recordar que para calcular distancias en
base a frecuencias fenotpicas, se supone que todas las
gametas son igualmente viables. En este caso vemos
que no es as.
Respuestas esperadas a) Las gametas de los caballos
tendrn 32 cromosomas (la mitad de 64) y las de los
burros 31 32 +31 = 63 (el 2n de la mula es impar!).
b) A los problemas de apareamiento y segregacin
meitica derivados de cromosomas tan dismiles y de
nmero impar.

Gentica Bacteriana
1) Cmo esperara que fuera la transferencia heredable del gen lac+ en cruzamientos entre cepas donoras
de E. coli lac+ a) Hfr, b) F+ y c) F'lac con cepas receptoras F- lac- incapaces de recombinar (rec-)? Justifique su respuesta
Respuesta: El nico cruzamiento capaz de transferir
el gen lac+ en forma heredable es aquel en el que interviene la donora c) F'lac debido a que el gen lac+
forma parte del plsmido transferido que no requiere
de recombinacin (entrecruzamiento) para mantenerse
establemente en la clula receptora..
La cepa b) es capaz de transferir lac+ pero la cepa receptora requiere de las funciones de recombinacin
homloga para que se produzca el reemplazo allico
(entrecruzamiento) para integrar establemente el gen
recibido. Como el segmento transferido es inestable
(es lineal, no puede replicarse correctamente y es susceptible a degradacin por nucleasasas) termina perdindose.
La cepa a) F+ slo puede transferir lac+ con muy baja
frecuencia si en alguna de sus clulas el factor F se
integra previamente al cromosoma principal (esas po-

cas clulas se convertiran en Hfr). Sin embargo,

tendr el mismo problema que la cepa b).

2) Se realizaron experimentos de conjugacin interrumpida entre cepas Hfr AmpS leu+mal+trp+ y

F- AmpR leu-mal-trp-. Los resultados se exponen
en la siguiente figura: (mal: capacidad de metabolizar la maltosa)

1) Por qu los recombinantes para leu y

mal aparecen con mayor nmero de recombinantes?
2) Explique en qu medios se hicieron crecer las
bacterias para analizar su genotipo, y qu tipo de
bacterias (qu genotipo) crece en cada uno.
3) A qu distancia del ori de transferencia mapea
el gen que codifica para trp? Y los que codifican
para leu y mal?
4) Qu experimento hara para determinar el orden
entre leu y mal?
5) Dibuje, indicando Origen de transferencia y terminacin, el modo en que el plsmido F se integr al
cromosoma bacteriano y dio origen a esta HFR.
6) Qu tipo de recombinacin ocurre para que las
bacterias leu- pasen a ser leu+? Qu tipo de recombinacin ocurre cuando el plsmido F se integra en el cromosoma bacteriano? (15 ptos)
Rta: 1) Porque al estar ms cerca del origen de transferencia pasan antes y le dan menos tiempo a las bacterias conjugantes a que se separen espontneamente e
interrumpan la transferencia.
2) MM + ampicilina + los 2 aac que no se analizan en
cada caso F- AmpR aac+ donde aac+ es leu+, mal+ (que
en realidad no es un aminocido) o trp+, respectivamente. Para los otros 2 genes cuyos aac estn presentes en el medio, los genotipos pueden ser + o -. Por ej,
en el primer caso el genotipo es F- AmpR leu+ mal+/trp+/-

B1

79

3) 10, 5
S19
bp26
bmp18
/
1
4) una prueba de recombinacin equiva990 bp
696 bp
p26f
p26r
p18f
p18r
lente a una prueba de 3 puntos con los 3
B + B
marcadores de este experimento. 5) Diluc
Primer evento
bujito
R
pKS26L
Kn
de entrecruza3) Un tema de inters para la medicina
sac
humana y veterinaria es el desarrollo de
Integracin del plsmido suicida
vacunas ms confiables. En el caso de la
R
2
Kn
brucelosis (que es una zoonosis, es deluc
bp26
bp26
bmp18
/
sacB
cir, enferma a animales y a humanos) se
a
b
desarrollaron vacunas para el ganado
Segundo evento
Seleccin con sacarosa
vacuno que consisten en bacterias vivas
de entrecruzaatenuadas por diferentes procedimientos
N
B
de cultivo. En este contexto, en la Arluc
bmp18
3
/
1837 bp
990 bp
gentina se utiliza la cepa S19 que tiene
p26f
p26r
p18f
p18r
algunos problemas porque no est sufi+
bmp18
cientemente atenuada. Con el adveniR
Primer
evento
pSD18
miento de la ingeniera gentica se puAp
de
entrecruzadieron caracterizar genes como el bp26
sacB
y el bmp18 que, al ser mutados, prctiIntegracin del plsmido suicida
camente eliminan la virulencia, tal como
4
lo publican Campos y col (Veterinary
R
sacB
Ap
bmp18
bmp18
luc
Microbiology, 2002). En un trabajo pre/
a
vio, lo demostraron mediante el desarrob
Segundo
evento
llo de mutantes knock-out para ambos
Seleccin con sacarosa
de entrecruzagenes.
a) Indique una estrategia de cmo
5
bmp18
hubiese obtenido Ud. esta mutante INTA2
luc
/
694 bp
1837 bp
knock-out. Utilice exclusivamente esp26f
p26r
p18f
p18r
quemas para su respuesta
distinguir
animales
vacunados
de
infectados en forma
Debido a que no resulta deseable la liberacin de organismos modificados genticamente conteniendo sencilla, barata y masiva. Tradicionalmente, el diagenes de resistencia a antibiticos (y menos si stos gnstico se realiza mediante la deteccin de anticuerson patognicos), para la construccin de la cepa mu- pos anti-Brucella en sangre porque la bacteria es muy
tante vacunal bp26::luc bmp18 ( simboliza dele- difcil de detectar y no resulta sencillo diferenciar encin y :: simboliza insercin y que bautizaron IN- tre los animales que tienen estos anticuerpos debido a
TA2) usaron una tcnica de contraseleccin (ver Figu- que estuvieron infectados o porque fueron vacunados.
Qu solucin le parece que proponen los diseadores
ra).
de esta vacuna?
Aclaraciones: El gen sacB (de Bacillus subtilis) codiRespuestas esperadas: a) Se podra usar el mismo
fica para una levansacarasa que metaboliza la sacarosa
esquema del enunciado (parte izquierda) reemplazanen un levano que es txico para Brucella. Es decir que
do el gen luc por un gen de resistencia a antibitico
las bacterias que contienen este gen se mueren cuando
(por ej. a Tetraciclina) y manteniendo el gen de resisse agrega sacarosa al medio de cultivo. a y b sealan
tencia a kanamicina (o el SacB) para seleccionar el
secuencias homlogas (probables sitios de entrecrudoble recombinante.
zamiento). El gen luc codifica para la luciferasa de
b) i) Suponiendo que se quiera ir paso a paso (como
lucirnaga, los genes ApR y KnR para resistencia a
sugiere el flujo de esquemas) y seleccionar primero el
ampicilina y kanamicina, respectivamente. En varios
cointegrado (construccin 2) y recin despus el doble
de los genes se especifican, con flechas, oligonuclerecombinante (construccin 3): KnR servira para setidos diseados para PCR y el tamao del fragmento
leccionar en un medio conteniendo kanamicina (en
de amplificacin esperado.
ausencia de sacarosa). En un segundo paso, se pasarb) Qu funcin especfica cumplen los siguientes an las bacterias a un medio conteniendo sacarosa, en
genes marcadores en el esquema de obtencin de la ausencia de kanamicina. [De hecho, esto fue lo que
cepa vacunal?
hicieron los autores del trabajo]. Lo mismo con ApR
i) ApR y KnR (2 ptos); ii) luc (2 ptos); iii) sacB
para el gen bmp18.
c) Porqu se usaron plsmidos suicidas?
Otra respuesta correcta: Suponiendo que se quisiera
d) Disee un sistema molecular de deteccin para dis- seleccionar directamente la construccin 3, sin pasar
tinguir los 5 genotipos posibles entre s. Explquelo.
por la construccin 2 (doble recombinante directo),
e) Un punto importante en cualquier campaa de erra- KnR no tiene funcin alguna en el experimento del
dicacin de enfermedades como la brucelosis es poder

80

problema. Al utilizarse el sistema de contraseleccin PCR. En la realidad, esta ltima variante no es practibasado en SacB podra no estar presente, sin afectar cable, porque la cepa vacunal sobrevive muy poco a
con su ausencia el resultado. En este caso, su nica las defensas del animal y resulta muy lento, peligroso
funcin es ser un marcador selectivo en E. coli (otorga y poco prctico el aislamiento de bacterias patognial plsmido una ventaja selectiva que ayuda a mante- cas.
nerlo, evitando su prdida, durante su multiplicacin 4) Bacterias de una cepa de E. coli Hfr rec+ bio+ his+
en E. coli). En el caso del segundo plsmido conte- StrS son mezcladas junto a bacterias de otra cepa de E.
niendo ApR, esta aproximacin es mucho ms difcil coli F- rec+ bio- his- StrR. A diferentes tiempos, se
(aunque no imposible) porque no tengo un gen indica- inter-rumpieron las conjugaciones, se plaque en los
dor y slo puedo distinguir dobles recombinantes siguientes medios selectivos (todos conteniendo Str)
(construccin 5) de salvajes (construccin 3) mediante y al da siguiente se cont el N de colonias. (MM =
PCR de las colonias, por ej.
medio mnimo)
Tiemp N de colonias en
ii) Este gen sirve para distinguir las mutantes knock
(min)
M
MM+b MM+h MM+bio+
out para el gen bp2 que quiero seleccionar (consM
io
is
his
truccin 3) de las revertantes salvajes (construccin
5
0
0
0
503
1), dado que ambas sobreviven en el medio conte10
0
0
34
487
niendo sacarosa.
15
0
0
44
499
iii) Como dice el enunciado, este gen sirve para con20
0
0
50
503
traseleccionar (seleccionar en forma negativa) las
25
0
0
59
498
construcciones 2 y 4 en presencia de sacarosa.
30
20 30
80
501
c) Bsicamente, el que el plsmido sea suicida me
a) El experimento anterior se aprovech para mapear
permite seleccionar ms eficientemente al recombilos genes involucrados en la sntesis de biotina.
nante. Suponiendo que la seleccin de las construcUbique en el mapa gentico el gen bio. Se aclara la
ciones se hizo paso a paso [como se explica en b)
posicin donde est integrada la secuencia del
i)], si el plsmido replicara en Brucella, la seleccin
plsmido F en esta cepa Hfr, y adems la del gen his,
en presencia de kanamicina solo me dara muchsimas
previamente mapeado.
bacterias con el plsmido sin integrar y me sera exb) Un amigo suyo, estudiante de Biologa, le cuenta
tremadamente dificultoso aislar el recombinante
que hizo un experimento de conjugacin -mientras
(construccin 2) por su baja probabilidad de ocurrenmiraba videoclips de Britney Spears- con una cepa
cia.
Hfr diferente a la anterior, la cual, al conjugar con la
Ahora, suponiendo la alternativa de seleccin directa
misma F- que en el experimento
del doble recombinante [como se explica en otra resanterior, le transfiere el gen his a
puesta correcta en b) i)], el primer plsmido podra
los 20 min y el gen bio a los
no ser suicida, porque sera seleccionado en forma
F
40 min. Le creera a su
negativa en presencia de sacarosa.
amigo o pensara que se
d) Por PCR usando los primers flanqueantes de los
distrajo mientras haca los
his
genes. Las construcciones 1, 3 y 5 daran una sola
experimentos?
banda por primer (total 2 bandas), a saber 696 + 990
c) Un fago que hace
en 1, 1837 + 990 en 3 y 1837 + 694 en 5. Los cointetransduccin
generalizada
grados daran 2 bandas, para el par de primers p26 en
puede encapsidar fragmentos de
2 o para el par de primers p18 en 4. En total 3 bandas.
DNA genmico de una cepa bacteriana infectada y
Tambin se considerarn correctas respuestas con
lisada que tengan un tamao de hasta 30.000 pb. Si
otras variantes (deteccin de fluorescencia en lugar de
ese fago es usado para infectar una cepa de E. coli
la banda de 1837 combinada con PCR de los otros
salvaje, y el lisado resultante es usado, a baja
genes; RFLPs usando bp26 y bmp18 como sondas,
multiplicidad de infeccin, para infectar a la Fdeteccin de las protenas codificadas mediante Wesmencionada antes. Esperara observar colonias en
tern, etc.), siempre y cuando la respuesta permita difeMM? Justifique (1 min equivale a 20 kpb aprox)
renciar claramente los 5 genotipos.
e) Usara Ud. la cepa F- en MM para testear la mutae) La presencia de anticuerpos anti-luciferasa diferengenicidad de una sustancia en un test de Ames?
cian animales vacunados con esta cepa respecto de los
que se infectaron con una cepa salvaje no recombinan- Respuestas esperadas a) El gen bio entra a los 10
te. La ausencia (versus presencia) de anticuerpos con- y el his a los 30, por lo tanto el gen bio se encuentra a
1/3 de la distancia entre F e his.b) Le creo, seguratra bp26 y bmp18, es otra variante de la respuesta.
Tambin se considerar correcta (con la mitad de la mente tiene un Hfr distinto con el F integrado apunnota = 2,5 ptos) la respuesta que proponga el aisla- tando al revs y en otra posicin. Ntese que la dismiento de bacterias del animal, las cuales deberan no tancia entre his y bio es de 20 (igual que en este exser fluorescentes en presencia de luciferina en el caso perimento). c) No, estn demasiado lejos para ser code la cepa de campo y ser fluorescentes en el caso de transducidos. d) No, porque es una doble auxtrofa y
la cepa vacunal. Idem si la tcnica seleccionada es una por lo tanto requiero de la mutacin (reversin) si-

81

multnea de al menos 2 bases distintas y cuya reversin no necesariamente requieren del mismo mecanismo de mutacin Respuesta alternativa que, en caso
de aparecer, debe ser considerada correcta: S, si utilizo MM+ bio (o MM+ arg)
4) Un investigador est interesado en mapear y estudiar 3 genes bacterianos a, b y c involucrados en la
biosntesis de aminocidos. Se sabe que los productos
de los genes a, b y c catalizan las siguientes reacciones:
C
Leu
X
B
Val

N recombinantes

donde X es un compuesto que puede ser sintetizado

por ambas cepas de bacteria creciendo en un medio
mnimo (MM). Para realizar el estudio dispone de 2
cepas de bacterias: Hfr a+b+c+ StrS y otra F- a- b- c- StrR
con las cuales realiz un experimento de conjugacin
interrumpida obteniendo los siguientes resultados:

c+ StrR

a+ StrR
b+ StrR

12

16

20

24

t (min)

a) En qu medios se seleccionaron cada uno de los

genotipos de bacterias del grfico anterior?
b) A qu distancia del origen de transferencia de la
cepa Hfr utilizada mapean los genes a, b y c?
c) Grafique y explique los resultados que hubiera tenido en el experimento de conjugacin interrumpida si
el genotipo de la cepa dadora hubiese sido:
i) Hfr a+b+c+ StrR
ii) F+ a+b+c+ StrS
iii) Si el origen de transferencia de la cepa Hfr
se encontrara entre el gen b y el c.
El hecho de que a y b mapearan juntos y formaran
parte de una misma va metablica le sugirieron al
investigador que a y b pertenecen a un mismo opern.
Con el objeto de estudiar esta posibilidad realiz el
siguiente experimento:
A) Se digiri ADN genmico de una cepa salvaje con
la ER Alu I (de corte frecuente) en cantidades limitantes. Luego los fragmentos se ligaron en uno de los

que

se

Alu I

muestran.

Alu I
P

AmpR

AmpR

Vector 1

P = promotor del opern

Vector 2
lac

Ile

vectores

B) Luego se transformaron bacterias a- b- c+ AmpS con

uno de los vectores y se plaquearon las bacterias
transformantes en gar + MM + ampicilina + un aminocido. Cada una de las colonias que crecieron en
estas placas fueron luego cultivadas en gar + MM +
ampicilina obtenindose los siguientes resultados:
Vector 1: Todas las bacterias que crecieron en
MM+Amp+Leu crecieron tambin en MM+Amp.
-De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Val el
60% crecieron en MM+Amp.
Vector 2: De las bacterias que crecieron en
MM+Amp+Leu+Lac, el 55% crecieron en MM+Amp
+Lac.
-De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Val+
Lac, el 50% crecieron en MM+Amp+Lac.
d) Cules son los genotipos de las bacterias que crecen en cada uno de los 3 medios?
e) Cmo interpreta los resultados de este experimento? Demuestre que estos resultados son compatibles
con la hiptesis de que a y b estn en el mismo
opern.
f) Cul de los genes est ms cerca del promotor: a o
b? Justifique.
g) Cmo hara, utilizando la tcnica de PCR, para
demostrar que a y b pertenecen al mismo opern? Indique los resultados esperados tanto si a y b forman
parte de un opern como si se transcriben independientemente.
Respuesta a) a+ StrR = MM + Str + Val + Ile
b+ StrR = MM + Str + Leu + Ile
c+ StrR = MM + Str + Leu + Val
b) a y b mapean a 12 min del OriT y C mapea a 6 min.
c) i) Se hubieran seleccionado a las bacterias dadoras
por lo que no hubiera habido diferencias entre los distintos medios ni tampoco entre los distintos tiempos.
ii) Se hubieran obtenido muy pocas recombinantes
(aquellas en las que el plsmido F+ se hubiera incorporado en la cepa dadora y luego los marcadores a, b
o c se hubieran transferido a la cepa aceptora).
iii) Dependiendo de la orientacin del OriT hay dos
posibilidades: -que a y b salgan primero y bastante
tiempo despus salga c -que c salga primero y bastante tiempo despus salgan a y b.
En el grfico tienen que quedar claro esto, y adems
que la frecuencia de recombinantes para los genes que

82

salen primero debe ser bastante mayor que la de los

genes que salen al final.
d) MM+Amp+Leu = a- b+ AmpR y a+ b+ AmpR. Es
decir, b+ AmpR
MM+Amp+Val = a+ b- AmpR y a+ b+ AmpR. Es
decir, a+ AmpR
MM+Amp = a+ b+ AmpR
La lactosa no importa, slo se usa para inducir la expresin mediada por el promotor lac.
e) De las bacterias transformadas con el vector 1 todas
las bacterias b+ tambin eran a+, pero slo el 60% de
las a+ eran b+.
En cuanto a las bacterias transformadas con el vector
2 el 55% de las bacterias b+ tambin eran a+, y el
50% de las a+ eran tambin b+.
La diferencia en los resultados obtenidos con ambos
vectores radica en que el vector 1 no contiene un promotor por lo que la expresin de los transgenes se
dar solo si vienen acompaados de su promotor. El
hecho de que todas las bacterias b+ sean tambin a+
nos indica que b se transcribe utilizando el promotor
de a sugiriendo que a y b forman parte de un opern.
En el caso del vector 2 dado que aporta un promotor
(y ste est encendido debido a la lactosa) s se obtienen bacterias a-b+.
f) Dado que, cuando se transform con el vector 1, no
se obtienen bacterias a-b+ pero s a+b- esto nos sugiere que no se necesita que se transcriba b para que se
transcriba a (pero s al revs). Esto indicara que a se
encuentra ms prximo al promotor que b.
g) RT-PCR usando primers de la regin 5 del gen a y
de la regin 3 del gen b. Si amplifico es porque hay
transcriptos que contienen al gen a y al b. Hay otras
posibilidades que se evaluarn caso por caso
5) Se realiza un experimento de transformacin con
una cepa bacteriana donante resistente a cuatro antibiticos: A, B, C y D. La cepa receptora es sensible a
las cuatro drogas. La poblacin de clulas receptoras
tratada se divide y se
Antibiticos N colonias
siembra en placas de meA
1.156
dios suplementados con
B
1.148
varias combinaciones de
C
1.161
las drogas. Los resultados
D
1.139
fueron:
AB
46
AC
640
a) Uno de los genes est
AD
942
claramente alejado de los
BC
51
otros tres, los cuales pareBD
40
cen estar estrechamente
CD
786
ligados. Cul es el gen
ABC
30
distante?
ABD
42
b) Cul es el orden de los
ACD
630
tres marcadores que estn
BCD
36
ligados?
ABCD
30
Rta: a) B es el gen distanTotal
7.877
te; b) A D C.

Mutagnesis y Transposicin
1) En levaduras, el tratamiento con mutgenos permiti seleccionar, en forma independiente, varios tipos

de mutantes auxtrofas incapaces de utilizar galactosa

como nutriente. El mapeo de las mutaciones responsables de esta caracterstica permiti clasificarlas en 2
grupos de ligamiento distintos (mendelianamente independientes).
a) Significa este resultado que los genes involucrados
se encuentran en 2 cromosomas distintos? Por qu?
b) Cul ser el fenotipo resultante del diploide resultado del cruzamiento entre mutantes (haploides) pertenecientes a distintos grupos de ligamiento? Por
qu?
c) Cmo sern las proporciones fenotpicas de las
levaduras (haploides) derivadas de las ascosporas una
vez producida la meiosis?
d) Qu clase de mutagnesis es la ms apropiada para este tipo de experimentos? la producida por radiacin (gamma) o por algn compuesto qumico como
el EMS o la nitrosoguanidina? Justifique muy brevemente.
Respuesta: a) En principio s, los grupos de ligamiento pueden comprender y extenderse ms all de 50 u
de recombinacin y pertenecer al mismo cromosoma
[es decir, si bien 2 genes o marcadores pueden comportarse mendelianamente como independientes por
estar a ms de 50 unidades de mapa, a travs de otros
marcadores o genes intermedios puedo incluirlos a
ambos en el mismo grupo de ligamiento = cromosoma. Sin embargo pueden existir 2 grupos de ligamiento pertenecientes al mismo cromosoma si no tengo la
suerte de encontrar marcadores o genes intermedios].
b) Prottrofa. Por complementacin. [Si a es el alelo
mutante de A y b de B: Ab x aB AaBb fenotipo
salvaje]
c) 3 a 1, auxtrofas a prottrofas [ ab, Ab, aB
vs AB]
d) Usualmente se utiliza algn mutgeno qumico
(como EMS o nitrosoguanidina) que producen mutaciones puntuales y se pueden dosificar ms fcilmente. La radiacin produce rupturas, deleciones y rearreglos cromosmicos groseros, por lo que sera menos conveniente.
2) Se estudia el efecto de 2 conocidos mutgenos en
levaduras: el etil metanosulfonato (EMS) y el bromuro de etidio (EtBr) observando la frecuencia de aparicin de petites (levaduras que forman colonias de crecimiento mucho ms lento que las normales o grandes, debido a un malfuncionamiento del sistema de
fosforilacin oxidativa). A primera vista, los resultados parecen similares ya que ambos mutgenos inducen una abundante aparicin de mutantes. Sin embargo, ms del 99% de las mutantes obtenidas con EMS,
segregaban en una proporcin mendeliana de 50%
grandes a 50% petites, al ser cruzadas con levaduras
salvajes (grandes). Nota: recordar que las levaduras
son usualmente haploides y que los fenotipos descriptos se refieren a lo observado con ese nivel de ploida.
En cambio, ms del 90% de las mutantes obtenidas
con EtBr segregaban 100% de petites o 100% de
grandes. Es decir, a pesar de tener un parental petite y

83

un parental grande, la progenie era toda petite o toda

grande. Cmo se explican estos resultados?
Solucin: el EMS afecta, fundamentalmente a genes
nucleares (que pueden afectar a las funciones mitocondriales para resultar en un fenotipo petite -no realizan fosforilacin oxidativa- porque stas importan
ciertas protenas codificadas en el ncleo) y el EtBr
tiene mayor especificidad por los genes mitocondriales que se heredan uniparentalmente.
3) En un estudio sobre mutaciones inestables de maz,
un investigador propuso los siguientes genotipos para
dos plantas distintas de esta especie:
I) C/cd ; Ac+/AcII) C/ca ; Ac- /AcC: alelo silvestre que permite la expresin del color
del grano; cd: es un alelo inestable producto de la insercin de un elemento mvil no autnomo Ds que
inactiva la expresin del gen. ca: es un alelo inestable
producto de la insercin de un elemento mvil Ac
autnomo que inactiva la expresin del gen. Ac+ presencia/ Ac- ausencia del elemento mvil (atencin que
esta nomenclatura es distinta a la empleada en algunos
libros de texto).
Se realizaron los siguientes cruzamientos:
a) plantas con genotipos I y II se cruzaron con plantas
c/c; Ac- /Ac-, en donde el alelo c representa una forma
mutante incolora, producto de una sustitucin de bases.
b) planta con genotipo I) se cruz con planta con genotipo II).
Qu fenotipos y en qu proporciones aparecern en
la descendencia de los cruzamientos a) y b)? NOTA:
Asumir que Ac y C no estn ligados, y que la frecuencia de rupturas cromosmicas es despreciable.

Respuesta: a) I) prpuras, blancas, mosaico II) prpuras, mosaico; b) prpuras,

mosaicos [Todos los genotipos C_, homo- o heterocigotas, son prpuras; la probabilidad de que un
transposn (por ej. del locus Ac) justo vaya a insertarse en un locus especfico del genoma es extremadamente baja. Todos los genotipos dobles recesivos
(conteniendo c, cd o ca) son mosaicos si est ca_ o
cd_, Ac+_]
4) Se desea estudiar el mecanismo de transposicin
gentica de los elementos Ty ("transposons of yeast")
caracterizando la funcin de una secuencia abierta de
lectura (ORF, open reading frame) con homologas
con el gen de la replicasa de retrovirus. Para ello se
introduce en una levadura un plsmido conteniendo el
transposn. El transposn fue modificado mediante
insercin (cortando con enzimas de restriccin y ligando) de un promotor gen inducible por galactosa en
el LTR izquierdo desplazando el promotor nativo del
transposn. Curiosamente, como no se encontraron
intrones en el gen de la replicasa, se introdujo uno
procedente de otro gen de levaduras resultando la siguiente construccin:
Plsmido Ty modificado

LTR

Promotor

Sec abierta lectura

Intrn

LTR

Mediante sondas especficas para el intrn y para la

secuencia abierta de lectura de Ty, es posible seguir,
mediante Southern blots, la transposicin de Ty en el
genoma de levaduras. Cuando las levaduras se cultivaron usando glucosa (es decir en ausencia de galactosa)
no se evidenciaron cambios importantes (es decir no
hubo -o hubo muy poca- aparicin de nuevas copias
de Ty). En presencia de galactosa (inductor), en cambio, la sonda de Ty permiti detectar la aparicin de
numerosas bandas (copias) nuevas en las clulas. Sin
embargo, la sonda para el intrn gal fall en revelar la
aparicin de bandas nuevas. Los Northern blots del
mRNA confirmaron estos resultados (deteccin de
una banda por parte de la sonda Ty y falta de deteccin de la misma banda por parte de la sonda para el
intrn).
a) Cmo explica estos resultados?
b) Porqu y para qu se reemplaz el promotor presente en el LTR por el promotor inducible por galactosa?
c) Porqu y para qu se introdujo un intrn?
d) Hubiera sido lo mismo (para lo que se quiere demostrar en este experimento) reemplazar el promotor
de levaduras inducible por galactosa por el promotor
del opern lactosa de E. coli e inducir con lactosa o
IPTG? Por qu?
e) Y reemplazar la secuencia abierta de lectura por
el gen de la -galactosidasa, sabiendo que es muy

sencillo detectar de esta manera la transcripcin

colorimtricamente usando X-gal?
Posteriormente, se realiz un experimento similar en
moscas M (carentes de elementos P en su genoma).
En este caso se dispone del cDNA del gen que se desea estudiar, el cual se fusion con un promotor de un
gen de moscas inducible por calor (heat shock protein). Igual que para las levaduras, se introdujo un
intrn de otro gen de dpteros y se dispone de una
sonda para su deteccin, as como de otra pra el
cDNA incgnita.
Plsmido con elemento P modificado

IR

Prom HSP

Sec abier lect

Intrn

IR

Cuando se tranfectaron embriones y se cultivaron a

20C no se evidenciaron cambios importantes (es decir hubo muy poca aparicin de nuevas copias de P).
A 37C, en cambio, la sonda del cDNA permiti detectar la aparicin de numerosas bandas (copias) nuevas en las clulas. Sin embargo, contrastando lo ocurrido en levaduras, la sonda para el intrn revel las
mismas bandas nuevas que el cDNA. Sin embargo, el
Northern blot del mRNA dio como en levaduras. Es

84

decir, se detecta una banda con la sonda para P y no se

detecta nada con la sonda para el intrn.
f) Cmo explica Ud. este resultado?
Respuestas: a) Hubo transcripcin inducible por
galactosa del ORF, splicing con prdida de intrn, lo
cual
permiti
la
retrotransposicin
(RNAcDNAintegracin cromosmica) del Ty
mediada por la RT endgena o codificada por el mismo gen.
b) Para poder convertir el sistema de expresin de la
RT en inducible y poder atribuir diferencias de comportamiento de la transposicin a la transcripcin inducible del gen.
c) Porque si se quiere demostrar que la transposicin
es mediada por el RNA transcripto, el intrn debe
procesarse y desaparecer. Si lo que se transcribe es un
gen de una transposasa la cual despus mueve el
transposn a nivel de DNA, el intrn debera aparecer
en las copias.
d) No, por 2 razones: 1) los promotores bacterianos
muy raramente funcionan en eucariontes como las
levaduras y 2) porque la construccin introducida en
levaduras no incluye el gen del represor del opern
lactosa ni el de la protena CAP que deberan estar
presentes (convenientemente modificados genticamente para su funcionamiento en levaduras) para que
el sistema regulatorio del opern lac est completo.
e) No, porque la beta-galactosidasa no es capaz de
reemplazar la funcin del gen incgnita 8la transposicin). Los genes indicadores (reporteros) sirven para estudiar la funcin de los promotores. Aqu no estoy estudiando el funcionamiento de un promotor, sino de una secuencia estructural.
f) El cDNA codifica para una transposasa que reconoce los IR y transpone el elemento P tal cual est en la
construccin (incluyendo el intrn). Si bien el mRNA
de la transposasa probablemente est procesado, por
los datos del Northern, la transposicin en s misma
del DNA no produce procesamiento (splicing) de
intrones. Una cosa es la expresin del gen de la enzima y otra muy distinta es la accin de esta enzima en
la transposicin.
5) Se confeccionaron varios mutantes del Tn5 mediante ingeniera gentica. El mapa y el fenotipo se
muestra ms abajo:
grafica una delecin del
DNA entre los extremos de la llave.
grafica
un fragmento de 800 pb de DNA forneo que se insert en la posicin O. Las capacidades del mutante de
transponerse y de resistir a neomicina (NeoR) se indican a la derecha de cada mutante. WT significa wild
type (normal o salvaje).
y
indican
las regiones repetidas invertidas (IR) del Tn5. NOTA:
Para su respuesta suponga que entre los valores de la
tabla 90 y 100 o entre 0 y 0,5 no existen diferencias
estadsticamente significativas.

cepa

Qu conclusiones puede sacar acerca de:

a) la(s) region(es) requerida(s) para la transposicin y
region(es) no requeridas?
b) Por qu estos resultados son inesperados y se contradicen con lo que Ud. aprendi en la materia?
c) la(s) regio(es) requeridas para NeoR?

Solucin: a) Para la transposicin:

completo,

slo el extremo izquierdo (aquella parte

afectada en la mutante 135). b) Porque hubiera esperado que TODO el
hubiera sido imprescindible para la transposicin. c) El gen NeoR (completo o
su extremo 5) est ubicado en algn lugar entre el
extremo derecho de
y su regin derecha adyacente (es decir, parte o todo el fragmento afectado
por la delecin en la mutante 138). [Con los datos suministrados no puedo afirmar que TODO el gen NeoR
est en ese segmento. Tampoco puede concluirse, con
estos datos, que haya una superposicin entre parte
del gen y el IR izquierdo, pero resulta altamente sospechoso. Para confirmarlo, deberan hacerse mutaciones dirigidas usando deleciones ms pequeas o sustituciones nucleotdicas puntuales].
6) En un trabajo reciente (Mol Gen Genomics, 2006,
275: 231-241) un grupo japons estudia la coloracin
de las flores en Gentiana scabra, una planta ornamental muy difundida en Japn. Para ello analizan tres
cultivares de G. scabra: cv. Momokorin (flores rosadas), la lnea mejorada 13-98 (flores rosadas) y el cv.
Alta (flores azules); y G. triflora cv. Macyri (flores
azules). Primero, miden la acumulacin de antocianinas mediante HPLC de extractos obtenidos de los
ptalos de las flores. Los perfiles de HPLC obtenidos
fueron los siguientes:
a y d) cv. Alta: dos picos, uno mayor correspondiente
a delfinidina y otro menor a cianidina.
b,c y e,f) Lnea 13-98 y cv. Momokorin: un nico pico
correspondiente a cianidina.

85

i) Qu le indican
i
estoss resultados en cuanto a la determinacinn bioqumicca del coloor de las flores?
f

La enzima clave en la biosntesis

b
d delfinidinaa es la
de
flavonoidil 35-hidroxiilasa (F35H
H) que cataaliza la
hidroxilacin en 5 dell anillo B del
d esqueletoo de la
antocianina. La expresiin gnica de
d esta enziima se
muestra en la siguiente figura:
f
a) Anlisiss de Northern blott usando
RNA total de ptalos
de los tres cultivares
de G. sccabra. La
membrana fue hibridada con caada una de
las sondas correspondientes a los genes
F35H y F3H
F
(codifica para una enzima que cataliza
c
la
hidroxilacin en 3
del anillo B de flavonoides). rR
RNA: control de caantidad de
RNA ribosoomal teido con brromuro de
etidio.
b) Anlisiss de RTPCR para amplificar
el ORF de
d F35H
usando RN
NA total
extrado de ptalos. Loss nmeros a la derecha inndican
los tamaoss de los fragm
mentos ampliificados.
Nota: por 3RACE
3
ampplifican transscriptos mennores a
1,4 kb en laa lnea 13-98
c) Anlisiss de PCR para amplifficar la secuencia
genmica de
d F35H con
c los iniciiadores emppleados
para la RT--PCR. Los nmeros a la derecha indiican lo
mismo que en b.

ii) Cul fue el

e objetivo dde los experim
mentos mosttrados en a y b?
iii)) Para qu se
s realiz la hhibridacin con
c F3H?
iv)) Qu explicacin moleecular podraa dar a los caambio
os en el perfiil de los transscriptos?
A continuacin, a partir de ADN geenmico de las
plaantas ampliffican fragmeentos conten
niendo el ORF
O
F35H (ver paarte c de la figura anteriorr):
v) Cul fue ell objetivo de este experim
mento?
vi)) Qu evidencian estos rresultados?
Lo
os fragmentoos de 4 kb y 3,3 kb fueeron clonadoos y
seccuenciados.
El fragmento de
d 4 kb de laa lnea 13-98
8 presentabaa en
el exn 1 una insercin (a la que llamaaron dTgs1) cuya secuencia contena
c
un sitio blanco de duplicaccin
(TSD) de 8 pb
p y repeticiiones termin
nales invertiidas
(TIIR) de 14 pbb. La secuenncia TIR preesentaba una regi
n palndrom
mica imperfeecta y exhiba similitud parp
ciaal con un eleemento dTphh de petunia (el cual se sabe
qu
ue es reconoccido por la traansposasa Acc).
El fragmento de
d 3,3 kb deel cv. Momo
okorin conteena
un
na insercin en el exn 1, a la qu
ue denominaaron
diGssTRIM. Estaa secuencia ppresentaba repeticiones
r
recctas terminales (TDR). Esta insercin no conteena
seccuencias quee codificarann para algunaa protena. AsiA
miismo, presenntaba similituud con secueencias de Lootus
japonicus,, designadas LjTRIM.
vii) Qu le permitenn confirmar estos datos de
secuencia?? Cul es eentonces la explicacin
e
p
para
los diferenntes fenotipoos observados?
Como los elementos T
TRIM fueron
n identificadoos a
partir de anlisis
a
de baases de dato
os de secuenccias
nucleotdiicas y mostraaron la peculliaridad de esstar
conservaddos en distinttas especies de plantas, rear
lizaron unn anlisis ffilogentico empleando las
secuenciass TDR y usaando los pro
ogramas CLU
USTAL W y TREEVIE
EW. El rbol obtenido se
muestra a continuacinn:

viii) Qu puedde concluir ddel agrupam

miento mostraado
en el rbol?
viiii) Sugiera un
u experimennto simple para
p
analizarr la
existencia de los elementoos dTgs1 y GsTRIM enn el
noma de otraas especies dde Gentiana.
gen
Rtta: Aclaracin: Las genttianas rosadaas vienen sienndo
obtenidas por mejoramiennto a partir de mutacioones
esp
pontneas a partir de geentianas azu
ules, pero el//los

86

mecanismo/s involucrado/s eran desconocido/s hasta

el momento.
i) Estos resultados indican que hay diferencias en la
acumulacin de las distintas antocianinas en ambas
plantas (azules y rosadas), en particular, las plantas
rosadas carecen de delfinidinas. Pero la acumulacin
de cianidinas es similar para ambas.
ii) Como los autores saben que la F35H es la enzima
clave en la sntesis de delfinidina y viendo los resultados anteriores, analizan si hay diferencias en cuanto a
la expresin del gen para esta enzima entre los dos
tipos de plantas y analizan si esto podra explicar los
fenotipos observados.
iii) La hibridacin con F3H es usada como control.
Tanto en plantas azules como rosas se obtiene el mismo patrn de expresin. Es otra enzima involucrada
en la sntesis de pigmentos pero que produce otro
compuesto (que no tiene nada que ver con las delfinidinas, si bien pertenece a la misma ruta biosinttica).
Tambin prueban con otros genes relacionados con la
sntesis de flavonoides y ven que exhiben los mismos
patrones que la F3H pero esto tampoco lo muestran
en el trabajo original.
iv) Los resultados evidencian que:
No se observa transcripto de F35H para la planta
rosada, lnea 13-98 tanto por Northern blot como por
RT-PCR (Aclaracin: los primers para esta RT levantan el ORF por completo, full length). Adems se
aclara que por 3RACE obtienen fragmentos menores
a 1,4 kb.
Para la planta rosada cv. Momokorin, el transcripto de
F35H es de tamao mayor que el observado para la
planta azul cv. Alta (Northern). Por RT-PCR este cultivar muestra dos fragmentos de 1,3 y 2,1kb que difieren del de 1,6kb observado para la planta azul.
En conclusin: ninguna de las plantas rosadas acumulan el transcripto de tamao normal esperado (1,6kb)
v) El objetivo de este experimento fue examinar la
estructura del gen para F35H en estas plantas a partir
de amplificacin sobre el ADN genmico de las mismas, para ver si existen diferencias que puedan explicar los resultados a nivel de transcriptos.
vi) Se obtienen fragmentos de amplificacin de distinto tamao para las distintas plantas. Estos resultados
muestran que el cv. Alta (azul) muestra un fragmento
de 2,8kb mientras que para la lnea 13-98 y el cv.
Momokorin (rosadas) las bandas son 1,2 y 0,5kb mas
grandes, respectivamente (sus tamaos eran 4 y 3,3
kb, respectivamente). Es probable que en el gen de las
plantas rosadas haya alguna insercin.
vii) Estos resultados, dadas las similitudes de las secuencias con elementos transponibles, evidencian que
las inserciones observadas corresponderan a transposones (dTgs1 y GsTRIM1). La explicacin para los
diferentes fenotipos observados es que estos transposones interrumpen la secuencia del gen, resultando en
transcriptos anormales (o ausencia de transcripto) que
no permiten la sntesis de la enzima F35H y por lo

tanto no se sintetizan el pigmento que produce la coloracin azul (delfinidina).

vii) Los resultados claramente muestran que GsTRIM1
y LjTRIM se agrupan juntos y apartados del resto de
los TRIMs reportados previamente, indicando que
estos dos transposones son evolutivamente diferentes
de los otros elementos TRIM de plantas.
vii) Al inicio del problema, en el enunciado, se indica
que tambin disponen de G. triflora cv. Macyri. Por lo
tanto, el experimento sera hacer Southern blot de sta
conjuntamente con las 3 plantas analizadas de G. scabra e hibridar con dTgs1 y GsTRIM1 (Southerns separados, obviamente) y observar la aparicin de muchas bandas (esto mostrara que, como la mayora de
este tipo de transposones, son miembros de una familia de alto nmero de copias, y que estn distribuidos
por todo el genoma de Gentiana).

Alteraciones cromosmicas y cromosomas

1) El caballo (Equus caballus) tiene un complemento
diploide de 64 cromosomas, de los cuales 36 que son
acrocntricos. El burro o asno (Equus asinus) tiene 62,
de los cuales 22 son acrocntricos.
a) Indique el nmero (diploide) de cromosomas que
tendr el hbrido interespecfico (la mula)
b) A qu atribuye la usual esterilidad (incapacidad
de producir gametas viables) de la mula?
R: a) Las gametas de los caballos tendrn 32 cromosomas (la mitad de 64) y las de los burros 31 32
+31 = 63 (el 2n de la mula es impar!).
b) A los problemas de apareamiento y segregacin
meitica derivados de cromosomas tan dismiles y de
nmero impar
2) Describa un ejemplo de alteracin cromosmica
estructural que afecte la fertilidad en individuos heterocigotas para la alteracin. Justifique brevemente su
respuesta.
Respuesta: Cualquiera de los ejemplos de alteraciones estructurales que dio Liliana o figuran en los libros (translocaciones recprocas, por ejemplo) que
impliquen la formacin de configuraciones meiticas
como trivalentes, tetravalentes, etc. y que afecten la
correcta migracin de los cromosomas en la anafase
meitica. La inclusin de algn esquema reemplaza
buena parte de la explicacin.
3) Se desea localizar en qu cromosoma se localiza el
locus para un marcador molecular de tipo codominante (microsatlite) ligado a un carcter de inters
agronmico (QTL). La especie vegetal tiene un nmero diploide de 2n=10 cromosomas y se dispone de la
serie monosmica completa. Se cruza una planta
dismica homocigtica (muestra una banda de 200
pb) por cada uno de los diferentes monosmicos todos
los cuales muestran una banda de 180 pb. Algunos de
los descendientes muestran ambas bandas (200/180
pb) y otros slo una (la de 200 pb). Las descendencias
obtenidas se desglosan en la tabla clasificadas de
acuerdo a su constitucin cromosmica, es decir si
poseen 9 cromosomas (es decir, monosmicas) o 10

87

cromosomas (dismicas, ver columna 1) y a su patrn

de bandas (columnas 2 a 5):
Descendencia de los 5 cruCromosoma en
zamientos analizados
condicin moDismicos Monosmicos
nosmica
200/180 200 200/180 200
1
140
0
139
0
2
97
0
93
0
3
193
0
0
196
4
58
0
57
0

158

145

Explique los resultados obtenidos e indique en qu

cromosoma se localiza el marcador molecular.
Solucin: Si el locus no est en un cromosoma cualquiera de los que se encuentran en 2 copias (es decir
no est en el monosmico) tendr una segregacin 1:1
mendeliana normal y todos sus descendientes sern
heterocigotas 200/180. Si el locus est en el cromosoma crtico lo que realmente estamos cruzando es
200/200 x 180, y de esta descendencia, los individuos
con 9 cromosomas sern 200 y los de 10 cromosomas
sern 200/180. Si observamos la tabla vemos que este
razonamiento se compatibiliza con los resultados del
cromosoma 3.
Por ej. para el cromosoma 1: 200/200 x 180/180
todos 200/180 (sean mono- o dismicos)
Para el cromosoma 3: 200/200 x ---/180 50%
200/180 (dismicos) y 50% ---/200 (monosmicos)
4) En una enfermedad gentica humana se observa la
siguiente conformacin cariotpica de los pares de
cromosomas 7 y 21 (notar las similitudes de bandeo
mostradas por las llaves).
a) Cual fue el origen de esta anomala y qu nombre
recibe?
b) En caso de examinar la gametognesis de este individuo
esperara
observar
alguna
peculiaridad durante la meiosis?
Cul?
c) Podra implicar
una reduccin en la
fertilidad de las
gametas?
Por
qu?
Respuesta: a) Translocacin recproca desigual 7:21
b) S. Multivalentes formados entre el 7, el 21 , el 21
translocado, que se denomina 217, y el 721, que es el
otro producto recproco de la translocacin desigual.
c) S, como consecuencia de lo descripto en b) se
afectara la migracin a los polos provocando aneuploidas capaces de inviabilizar las gametas
5) Un investigador trat con colchicina las famosas
arvejas de Mendel y obtuvo los tetraploides correspondientes. Por otro lado, tambin introdujo un
transgn proveniente del trigo que estabiliza una forma de herencia diploide evitando la formacin de
multivalentes (por ej. tetravalentes) que puedan oca-

sionar gametas desbalanceadas. Luego repiti los cruzamientos arvejas de flores blancas por arvejas de flores rojas. Qu proporciones de plantas con flores
blancas y rojas obtuvo en la F2? Describa los genotipos simplificados de dicha F2, de la F1 que le dio origen y de los parentales poliploides (usar guiones bajos
para ejemplificar casos en que ambas variantes genotpicas resultan en fenotipos equivalentes)
Respuesta correcta:

Como los bivalentes se forman al azar, ya que son

producto de autoploliploida por tratamiento con
colchicina, la frecuencia de individuos
aaaa en la F2 es 1/ 36 (1:35). Todos los cromosomas
son homlogos, si no estuviera el transgn se
formaran todos cuadrivalentes.
6) En un reciente trabajo de Learmonth y colaboradores se estudiaron los efectos a largo plazo de las artroplastas (injerto o reemplazo de partes seas por prtesis metlicas) que generan debris (restos) en linfocitos
de sangre perifrica. Estos restos metlicos se suelen
alojar en las adyacencias de la prtesis, ganglios linfticos, hgado y pncreas. Para ello realizaron hibridacin in situ (FISH: preparados cromosmicos a los
cuales hibridaron) con sondas especficas del cromosoma 1 marcadas con un fluorforo (rodamina) que lo
tie especficamente de rojo, contrastando con el color
azul del resto de los cromosomas (teidos con DAPI).
Observaron que cuando se utilizan prtesis con cromo-cobalto se observa un aumento de 3,5 veces de
conformaciones cromosmicas del tipo de la figura 1
y 2,5 veces de las de la fig. 2 respecto a la utilizacin
de prtesis de acero inoxidable.
a) Defina el tipo de mutaciones cromosmicas estructurales y numricas detectadas en las figs. 1 y 2.
b) En el trabajo se hizo un especial esfuerzo para que
el muestreo realizado se independizara de factores
como el hbito de fumar, el nmero de radiografas,
etc. Por qu?

Fig. 2

Fig. 1

c) De acuerdo a lo que muestra este trabajo. En principio, las prtesis de cromo-cobalto inducen mutaciones somticas o germinales? Es decir, podran aumentar la probabilidad de que se produzcan malformaciones genticas en la descendencia de estos pacientes?

88

d) En este trabajo solo se examinaron mutaciones de

tipo estructural y no aquellas de tipo puntual? Se le
ocurre algn modelo experimental (no humano) para
estudiar este aspecto. Le servira este modelo para
contestar con ms certeza la pregunta c)?
Rta a) traslocacin y aneuploida (triploida) del cromosoma 1
b) Porque son otros factores mutagnicos comprobados que tambin aumentan la tasa de mutaciones y
podran interactuar sinrgicamente (o no) con el factor
que estoy estudiando.
c) Somticas. En principio, no. (los debris no se acumulan en tejidos reproductivos)
d) Los sistemas basados en ratones transgnicos vistos
en clase de problemas injertados con prtesis o inyectados con debris metlicos en sangre, analizando distintos tejidos incluyendo el reproductivo. Pueden contestar otros sistemas como pueden ser los de intercambio de cromtides hermanas (por ej) pero este sistema no detecta tan bien mutaciones puntuales sino las
cromosmicas o el test de Ames pero no podran
examinar tejido reproductivo.

Gentica cuantitativa
1) La longitud media internodal en espigas de cebada
de la variedad gran cervecera es de 4,24 mm (con
baja variancia). En la variedad imperial la media internodal es de 6,34 mm (con baja variancia). La media
de la F1 de un cruce entre las dos variedades tiene,
aproximadamente, 5,4 mm (con baja variancia). La F2
da tambin 5,4 mm pero con un rango de variacin
continuo desde un extremo parental al otro (alta variancia). El anlisis de la progenie de la autofecundacin de cada uno de los individuos de la F2 mostr 3
distribuciones entre sus descendientes: i) tipo gran
cervecera con media de 4,24 mm y baja variancia, ii)
tipo imperial de 6,34 mm y baja variancia y iii) igual a
la F2. La longitud internodal en espigas de cebada, es
un carcter discontinuo o cuantitativo?Cuntos loci
estn involucrados en la segregacin del carcter?Por
qu?
Respuesta: La respuesta puede ser de distintas maneras (ver ms abajo) pero se debe concluir que la
herencia involucra un nico locus y es tpicamente
mendeliana (en este caso semidominante ) y no de
tipo cuantitativa. Si gran cervecera es AA e imperial aa, la F1 es Aa (semidominante) y los individuos
de la F2 son AA, aa o Aa, como lo demuestra el comportamiento de las respectivas pruebas de progenie. Se
puede contestar que es un carcter discontinuo (medido cuantitativamente) o que es cuantitativo (por su
forma de medicin) pero formado por un nico locus
(QTL).
2) Una poblacin vegetal silvestre es sometida durante
muchas generaciones sucesivas a un proceso de seleccin artificial basado en sembrar cada ao nicamente
las semillas procedentes de plantas incluidas en el
20% de mayor produccin. Como consecuencia de la
seleccin practicada, la produccin media aumenta
gradualmente. Los valores de heredabilidad del carc-

ter produccin en dicha poblacin a lo largo del proceso selectivo sern a) creciente, b) decreciente, c)
primero creciente y luego decreciente d) constante.
Justifique su respuesta.
Respuesta: Decreciente. La heredabilidad est en
funcin directa con la variabilidad gentica (varianza
genotpica), la cual disminuye con el proceso de seleccin.[Respuesta alternativa: debera ser decreciente
y despus constante, una vez agotada la variabilidad
genotpica].
3) Dados los excepcionales conocimientos de Gentica que adquiri en tiempo rcord en este curso de verano y gracias a la devaluacin y sus bajas pretensiones salariales, una exitosa empresa textil exportadora
de productos regionales decide contratarlo para mejorar la productividad y la calidad de la lana de sus rebaos de llamas. El establecimiento del NOA dispone
de una poblacin de animales cuya produccin de lana
y calidad de la fibra siguen una distribucin de tipo
normal y que se muestran en A y B, respectivamente.
Tal como aprendi en Gentica I, lo primero que hace
es estudiar la heredabilidad del carcter y para ello
dividi la poblacin en 3 subgrupos cada una (denominados 1, 2 y 3 en la figura) de acuerdo a los valores
promedio de produccin o calidad X1, X2 y X3, respectivamente). Seguidamente dej que los individuos
de cada una de las subpoblaciones creadas se aparearan entre s y analiz la distribucin de valores de la
siguiente generacin. Como se ve en la figura, los valores promedio de la nueva generacin coincidieron
con los valores promedio de cada una de las subpoblaciones paternas en A (productividad). En cambio
en B (calidad) coincidieron con el promedio de la poblacin original sin seleccionar.

a) Cmo fue la heredabilidad de los 2 caracteres?

Debido a que es un profesional muy serio, antes de
hacer un diagnstico prefiri esperar un par de aos
ms y ver que ocurre en una segunda generacin antes
de emitir un diagnstico y una estrategia de mejoramiento. Para ello, sin aplicar nueva seleccin, dej
cruzar entre s a los nuevos individuos pertenecientes
a las subpoblaciones.
b) Cmo seran las distribuciones en esta segunda
generacin?
c) Cul fue su diagnstico y qu plan de mejoramiento present a la empresa?
Aprovechando su estancia en el NOA decidi hacerse
un viajecito a Bolivia y, en el lago Titicaca observ
unas llamas con una fibra de excepcional calidad
(muy superior a cualquiera de las del establecimiento

89

argentino) aunque de productividad de lana muy inferior. Indeciso, compra esas llamas y vuelve al establecimiento a realizar nuevos cruzamientos entre ellas y
las argentinas. Para su sorpresa, entre los descendientes no slo obtiene individuos con un aumento de la
calidad de la fibra, sino que algunos (muy pocos)
animales tienen una productividad superior a la observada en la subpoblacin seleccionada de A. Desconfiado, supone que los valores de estos pocos individuos podran estar influidos por el ambiente, por lo
que los pone aparte, deja que se crucen entre s y analiza sus hijos. Resultado: la alta productividad se mantiene y obtuvo las mejores llamas de la historia.
d) Cmo explica su buena suerte? Es decir, a qu
fenmeno gentico atribuye este resultado?
A todo esto, ya pasaron varios aos y decide ir con sus
resultados a pedir un considerable aumento de sueldo.
Sin embargo, a esta altura del partido, vuelve Cavallo
al ministerio de Economa, reimplanta la convertibilidad y la empresa entra en crisis, entre otras cosas porque, durante los aos en Ud. haca estudios genticos,
la productividad no aument y decidieron prescindir
de sus servicios por ineficiente (no vale la pena
hacer investigacin y desarrollo en la Argentina, le
argumentaron) y le vendieron las llamas a Telecom
para su famosa propaganda (porque observaron que
llamaban por telfono muy seguido a sus familiares
bolivianos).
Mientras tanto, su hermanito ms chico decide seguir
sus pasos y en la facultad aprende que un grupo en
Australia, public un trabajo en el que encuentra una
asociacin entre un RFLP correspondiente a un gen
que interviene en la sntesis de la queratina en la lana
en ovejas y que explica el 90% de la variabilidad (varianza gentica) del carcter calidad de la fibra.
e) En base a toda esta experiencia y en no ms de 10
renglones qu hubiera hecho distinto (adems de votar con conciencia) para evitar este final? Nota: se castigar con -1 punto si la respuesta excede los 10 renglones.
Respuesta: a) 1 (100%) y 0, respectivamente, b)
igual, c) Que, dada la alta heredabilidad de A, puedo
tratar de seguir seleccionando individuos en base a
produccin y que, dada la nula heredabilidad de B, no
hay variabilidad gentica y no tiene sentido seleccionar para este carcter. Deberan buscarse otras fuentes
de variabilidad. d) Segregacin transgresiva. e) Hubiera tratado de hacer mis primeras evaluaciones utilizando la mayor diversidad gentica disponible (y no
limitarme a los animales del establecimiento) y, en
paralelo, hubiera buscado la literatura cientfica relacionada para evaluar la factibilidad de encontrar marcadores moleculares para el carcter estudiado que me
sirvan para seleccionar con ms eficiencia. Por ejemplo, intentara usar el gen de oveja como sonda que, si
hibrida con el gen homlogo de la llama, podra servir
para observar si encuentro un polimorfismo til en
llama para RFLP (u otra tcnica como STS, SSCP,
etc.), es decir, ver si hay cosegregacin de un marca-

dor con mi caracterstica de inters para as usarla en

seleccin asistida por marcadores. Respuesta alternativa: llamas transgnicas con el gen de la oveja.
4) En el mejoramiento bovino se busca un aumento
ms rpido del peso de los animales en determinados
ecosistemas de pasturas semitropicales. Se trata de un
carcter cuantitativo y aditivo. Para ello se cruzaron
vacas con cebes (de aumento ms rpido, pero cuya
calidad de carne es menor) obtenindose una F1 con
valores intermedios (la media se ubic equidistante
entre la media de las vacas y la media de los cebes).
La varianza fue muy similar tanto a la de vacas como
de cebes (que a su vez se parecan entre s). Los integrantes de la F1 se cruzaron entre s para obtener una
poblacin segregante.
a) Cmo supone que fue la media de esta poblacin
segregante? mayor, menor o similar a la de la F1?
b) La varianza fue mayor, menor o igual a la de la
F1?
Entre los individuos de esta poblacin se encontraron
algunos que superaron en aumento de peso a los mejores cebes.
c) Conoce alguna explicacin gentica a este fenmeno?
Respuestas esperadas: a) Similar, b) mayor, c) segregacin transgresiva
5) Un conocido protagonista de Los Simpsons que
habitualmente se disfraza de Vaquita de San Antonio
se dedic a la lucrativa venta de dichos colepteros
pero, para hacerlos ms atractivos, necesitaba aumentar su tamao dado que naturalmente tienen una media
de tan solo 5 mm. Seleccion los machos y hembras
ms grandes que encontr (promedio de 8 mm) pero
como eran muy pocos decidi reproducirlos para as
disponer de volumen para la venta. Para su sorpresa,
la descendencia no mantuvo la esperada longitud media de 8 mm sino que baj a 6,5 mm. Muy enojado
por la baja performance de los bichos, los tir y se fue
a recoger colepteros nuevos y repiti el procedimiento de seleccin (con idnticos resultados).
a) Por qu baj la longitud promedio de la descendencia?
b) Puede calcular la heredabilidad de este carcter?
Despus de admirar el tamao de las cucarachas del
bar de Moe, abandon la idea de seleccionar y se le
ocurri criarlas con una dieta que le recomend
Homero. De esta manera logr aumentar el promedio
de longitud de 5 a 6,5 mm (lo mismo que arriba!)
c) Es casualidad que ambas medias hayan coincidido?
Finalmente decidi contratarlo como consultor
d) Qu hubiera hecho Ud en caso de querer convertirse en vendedor de vaquitas de San Antonio super
size, disponiendo nicamente de una regla milimetrada y sabiendo que en Springfield NO existen laboratorios de marcadores moleculares o ingeniera gentica?
Respuestas esperadas
1) a) Porque el tamao observado es la combinacin
de una estructura gentica poblacional particular (va-

90

riancia gentica) que puede segregar y de la influencia

ambiental (no heredable) o variancia ambiental.
b) La seleccin diferencial fue de 8 5 = 3 mm y la
respuesta selectiva 6,5 5 = 1,5 mm. Por lo tanto, la
heredabilidad fue de h2 = 1,5/3 = 0,5 (50%)
c) S (o no, en el sentido de que se reduce a un mnimo la variancia ambiental permitiendo expresar el
mximo potencial gentico; de todos modos sigue
siendo casualidad que coincida una media general
nicamente debida a factores genticos de una poblacin sin seleccionar con los de una poblacin seleccionada en la que no se afect la influencia ambiental)
d) Volver a seleccionar en la descendencia y en las
siguientes generaciones hasta que la heredabilidad se
acerque a 0 (adems de darles la dieta de Homero).
6) La resistencia al patgeno Sclerotinia sclerotiorum
en girasol es un carcter complejo que involucra distintos loci y se evala cuantativamente mediante un
ndice de dao en el captulo floral. Para evaluar la
heredabilidad del carcter se sembraron 100 plantas
de una lnea moderadamente resistente (no existen
variedades totalmente resistentes al patgeno) en Balcarce, obtenindose una media de ndice de dao de
0,20. De esta poblacin, se seleccion un grupo de
individuos de mayor resistencia, con una media para
el ndice de dao de 0,10, como padres para la siguiente generacin, siendo la media de esta ltima
generacin de 0,13 para la variable evaluada
a) Cul es la heredabilidad del carcter resistencia?
Cuando el mismo experimento, utilizando el mismo
material y presin de seleccin se realiza en otra localidad, la heredabilidad obtenida fue de 0,50
b) A qu se debe la diferencia en la heredabilidad
obtenida en ambos casos?
Sobre una poblacin segregante F2 proveniente del
cruzamiento de la lnea resistente estudiada arriba y
una lnea susceptible al patgeno, se realiz un estudio con marcadores moleculares codominantes, detectndose 2 marcadores estrechamente ligados a 2
QTLs, uno en el grupo de ligamiento 8 (GL8) y el
segundo en el grupo de ligamiento 6, que explican el
50 y 35 % de la varianza gentica del carcter resistencia respectivamente. En base a estas conclusiones,
c) Descartara la presencia de otros QTLs para este
carcter en la poblacin en estudio?
El siguiente esquema representa el patrn para el marcador asociado al QTL del GL8 en el padre moderadamente resistente (MR), en el sensible (S) y en 10
individuos F2, evaluados como moderadamente resistentes o sensibles (ver fila superior)
Padres
Resistentes
Susceptibles
MR S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
------- ---------------- ---- ---- ---- ---- ---Cmo explica el patrn encontrado para el marcador
en estudio en los individuos 3 y 5 cuya evaluacin
fenotpica es moderadamente resistente?
Rta:
a) h2 = Xf Xo = 0,7

Xs - Xo
b) a la varianza ambiental e interaccin genotipoambiente (carcter cuantitativo, con alta componente ambiental).
c) Dado que entre los dos QTLs explican el 85 % de
la varianza gentica, es muy probable que haya
otro/s QTLs de efecto menor en otros grupos de
ligamento no detectados
d) Se esta evaluando con un marcador ligado a un
solo QTL y la resistencia moderada observada
puede deberse a la presencia de otro/s QTL/s en
esos individuos. Tambin pueden decir que hubo
recombinacin entre el marcador y el QTL, pero
dado que se dijo que estaban estrechamente ligado
se espera que deduzcan la primera respuesta

Gentica de poblaciones
1) La apolipoprotena E (apoE) fue implicada como
un factor de riesgo en las enfermedades cardiovasculares y en el Alzheimer. Se describieron 3 alelos comunes: apoE2, apoE3 y apoE4. La tabla muestra la
distribucin poblacional de los distintos genotipos:
Cul es la frecuencia del alelo apoE2?
a) 0,002 b) 0,040 c) 0,076 d) 0,175
Respuesta:b) [f(E2)= (2x2)+(64)+(7)/(937x2)=0,040]
GenotipoE2E2E2E3 E2E4 E3E3E3E4E4E4Total
N indiv 2
64 7
684 169 11 937
2) Uno de los riesgos cientficamente aceptados en el
uso de las plantas transgnicas Bt (es decir, conteniendo un transgn que codifica para la entomotoxina
de una cepa de Bacillus thuringiensis) con resistencia
a los insectos, es el que se refiere a la predecible seleccin de mutantes de insectos resistentes. Varios
factores contribuyen a predecir este desarrollo de resistencia: la historia previa de uso de insecticidas
qumicos y, ya ms especficamente, la seleccin de
insectos resistentes en cultivos orgnicos que utilizan
este insecticida como mtodo de control biolgico, el
uso generalizado de plantas resistentes que reemplazaran a las sensibles (alta presin de seleccin), la
presencia de un nico transgn codificante para una
nica protena (en lugar de varias) lo que implica que
con una nica mutacin de un gen contra esa protena
se obtendran mutantes especficamente resistentes
para esa protena, y datos de seleccin en condiciones
de laboratorio. Por ejemplo, el grupo de Gould (PNAS
89:7986, 1992) seleccion la cepa mutante YIID2
mediante alimentacin artificial en medios conteniendo dosis subptimas de la toxina por nueve generaciones. El anlisis gentico de la mutante utilizando marcadores moleculares indic la presencia de un gen de
resistencia mayor de expresin recesiva. El modo de
accin del gen es disminuir la capacidad de unin de
la toxina a las protenas intestinales. Que son blanco
de la toxina. Tambin se demostr que esta mutante es
capaz de atacar exitosamente al algodn transgnico
comercial en condiciones de invernculo. Si bien ninguno de los datos anteriores demuestra que vaya a
haber resistencia funcional en condiciones de campo,

91

los mismos contribuyen a la construccin de posibles

modelos tericos que pueden ayudar a manejar el desarrollo de estas resistencias y, por lo tanto, el impacto
ambiental sobre la estructura gentica poblacional de
la plaga. El escenario que se predice en los modelos es
la presencia de frecuencias poblacionales muy pequeas de genes de resistencia (r), recesivos o semirecesivos, que requieren estar en homocigosis para conferir una resistencia eficiente (rr).
En otro trabajo publicado por el mismo grupo (PNAS
94:3549, 1997), se trat de estimar la frecuencia de
alelos de resistencia en poblaciones no expuestas a la
entomotoxina de B. thuringiensis mediante el siguiente procedimiento:
i) colocaron trampas en regiones geogrficas diversas
conteniendo feromonas femeninas para atrapar insectos machos,
ii) cruzaron estos insectos con la cepa de hembras mutantes de laboratorio YIID2 descripta arriba,
iii) de esta manera analizaron 1028 familias derivadas
de los cruzamientos, de las cuales 4 mostraron segregar cerca de un 50% de resistentes.
a) Cul son las frecuencias gnicas suponiendo equilibrio de Hardy-Weinberg? Es decir, calcule p y q.
b) Qu frecuencia de individuos resistentes (rr) esperara encontrar?
c) En base a su respuesta anterior, por qu le parece
que utilizaron un procedimiento tan complicado como
es hacer estos cruzamientos (y evaluar su genotipo
mediante pruebas de progenie) en lugar de tomar directamente insectos a campo y probar (tambin directamente) su resistencia?
d) Por qu era tan importante hacer el experimento
con poblaciones naturales no expuestas previamente a
la toxina?
e) Todo esto es previo a la introduccin de las transgnicas Bt, las cuales actuaran seleccionando qu
genotipos? i) los rr, ii) los rs, iii) los ss, iv) los rr
y los rs. Explique.
f) Dentro del esquema de utilizacin de refugios para
el control de resistencia qu proporcin de plantas no
transgnicas debo mantener para que haya suficientes
insectos sensibles (ss + sr) para garantizar que sobrevivan para mantener algo parecido a un equilibrio de
Hardy-Weinberg si se quiere mantener una frecuencia
de alelos r menor al 10% (frecuencia de r = 0,1)?
Se presupone que las polillas se aparean y distribuyen
al azar sin distinguir si los huevos que depositan estn
sobre plantas transgnicas o no transgnicas, por lo
que la proporcin de plantas es sinnimo de proporcin de insectos que deben quedar vivos. Para hacer el
clculo suponga, adems, que no hay un efecto de seleccin importante a lo largo de las generaciones que
cambie las proporciones previamente calculadas, como ser que todas las resistentes sobrevivan independientemente de que les haya tocado en suerte crecer y
alimentarse en una planta transgnica como no transgnica.

Solucin: Datos: 1024 de los 1028 insectos machos

colectados fueron SS (porque mediante el cruzamiento
pruba con las hembrasdoble recesivas rr, el 100% de
la descendencia dio susceptible, es decir Sr). Por lo
tanto p2= 1024/1028 = 0,996 (observado). Los heterocigotas fueron 4 (Sr x rr 50% rr + 50% Sr). Por lo
tanto H = 2pq = 4/1028 = 0,004. No se observaron
homocigotas recesivos (rr) por lo que el q2 observado
(no el esperado) fue 0. a) p = raz cuadrada de 0,996 =
0,998, 2pq = 0,004 q = 0,004/ 0,998 x = 0,002
b) R = q2 = 0,000004 es decir, el valor esperado es de
4 resistentes (homocigotas rr) cada 100.000 insectos.
c) Sin contar los errores de muestreo, habra que haber
muestreado un mnimo de 25.000 insectos para pescar
(con suerte) uno resistente. Si adems se quiere calcular un error estadsticamente confiable, la muestra
tendra que haber sido an mucho mayor. El mtodo
empleado es ms engorroso, pero con un poco ms de
1000 insectos recolectados se pudieron obtener datos
relativamente fiables.
Respuesta esperada: porque al detectar heterocigotas
(en vez de los homocigotas recesivos) se necesita analizar una muestra menor.
d) Porque la seleccin distorsiona el equilibrio de
Hardy-Weinberg.
e) Los rr. Los rs son, selectivamente iguales a los ss.
Si bien van a aumentar, lo hacen porque al aumentar
rr aumentan automticamente los rs.
f) q = 0,1 R = q2 = 0,12 = 0,01. Es decir, que tengo
que garantizar un nivel de resistentes menor a 0,01
cuando tengo una proporcin real (sin usar plantas Bt)
de 0,0004%. Quiere decir que dejando muchsimo
menos que un 1% de plantas no transgnicas me garantizara dichas proporciones (para ese gen en particular).
3) Hagamos un poco de ciencia-ficcin. Supongamos
que la ciencia mdica avanzase hasta el punto de que,
con un tratamiento aplicado a lo largo de toda la vida,
la especie humana dejase de sufrir nuevas mutaciones.
Admitamos tambin que tal tratamiento se aplica a
toda la humanidad en el intervalo de una sola generacin, y se mantiene as en lo sucesivo. Qu ocurrira
con la variabilidad gentica en las sucesivas generaciones? Aumentara? Desaparecera? Se mantendra? Explquese tanto como pueda.
Respuesta: Suponiendo panmixia, ausencia de seleccin y el alto nmero poblacional de la especie, la variabilidad debera mantenerse constante (en equilibrio
de HW). Por lo tanto, se mantendra. Lo que se impedira es el surgimiento de potenciales nuevos alelos
inexistentes en la poblacin actual.
4) Segn algunos las rubias (no teidas) estn condenadas a la extincin cuando la poblacin humana
mundial llegue a total panmixis. El alelo determinante
del color rubio del principal gen involucrado en el
color del cabello es de expresin recesiva.
Si mediante un clculo arbitrario estimamos que la
cantidad de rubias/os es de 22 millones sobre una po-

92

blacin munndial de 6.6000 millones y hay 50 milllones

de heterociggotas.
a) Cul serr la proporccin de rubios cuando la poblap
cin llegue a equilibrio de Hardy-W
Weimberg?
b) Qu prooporcin de rubios
r
de la poblacin
p
tenndrn
los dos padrres no rubioss?
Rta: p=R+11/2H= 22/6600 +50/66000*1/2= 0,00771
q=1-p=
=0,9929
En equilibrio H-W la poblacinn de rubioss ser
p2=5*10-5
b) NO era necesario
n
conntestar. La reespuesta era q2
2pq=0,014. La proporccin de matrrimonios (0,0014)2=
2*10-4
-4
Hijos * 2*10
2
= 5.10-5

En
n B se sombrrean: II 2, 3,, 5; III 1, 3, 4, 8,10,11; IV
tod
dos
2) El siguientee rbol muesstra una fam
milia que hereda
un
na forma seveera de hidroccefalia causaada por una mum
taccin en el gen L1CAM (llocalizado en
n el cromosooma
X)) y que pressenta una heerencia recessiva. Utilizanndo
un
n marcador inntragnico quue tiene tress alelos (12, 8 y
7) se hace el diagnstico
d
del propsitto (nombre que
q
recciben los ppacientes ppor parte dee los genetisstas
mdicos y que se inndica con una flechha).

Genticas no Mendellianas
1) La neuroopata pticaa hereditaria de Leber (N
NOHL)
es una enferrmedad rara en la especie humana quue produce una rpida atrofia del nervio ptico

y que genera
g
ceguera en adultos jveenes. Esta ennfermedad esst caracterizada por una prddida bilateraal de la visin central mientraas que se maantiene la visin perifriica. La
genealoga de la izquierrda muestra la herencia de
d esta
enfermedadd en una famiilia bastante amplia:

Cul es el tipo de heerencia mss probable para

p
la
NOHL en la especie humana?
h
Exxplique su raazonamiento.
Segn su hiiptesis com
mplete la geneealoga de laa derecha indicando los indiviiduos afectaddos.
Respuesta: Observamoos que todos los descenddientes

independienntemente de su sexo, muuestran el feenotipo

de la madree. [Esto no podemos
p
expplicarlo si el carcter estuvierra en los croomosomas seexuales, ya que el
fenotipo de la descendenncia no depeende de si el carcter es dominnante o recesivo, o de laa direccin del cruzamiento, sino
s
slo dell fenotipo dee la madre]. Por lo
tanto podraamos aseguraar que este carcter
c
es un
u caso
de herencia materna.

C
Cul fue el resultado del ddiagnstico?
a) La propsitoo es portadorra del alelo mutante
m
b) La propsitoo es heterociigota no portadora
c) La propsitoo es homociggota para el alelo
a
normal
d) El resultadoo no permitee dar un diag
gnstico precciso
sob
bre el genotipo.
Reespuesta: b)
3) En el antigguo testamento, Dios dispuso
d
que los
hijos de Isaac y su mujer cconstituiran la nacin judda.
Sin
n embargo, la
l esposa de Isaac era baastante mayoor y
sup
puestamente infecunda. Segn las co
ostumbres loocaless de la pocaa, ella eligi uuna mujer allternativa conn la
qu
ue Isaac tuvo un hijo: Esaa. Un da, laa anciana muujer
le coment a Isaac
I
que esttaba encinta y tuvo un hijo:
h
con 5 herm
maJaccobo. Posterriormente, Jaacobo se cas
nas (de otra familia)
fa
y tuuvo 13 hijos y varias hijjas.
uponiendo quue pudiera accceder a mu
uestras de tejjido
Su
de Isaac, Esa, Jacobo y de los hijos de Jacoboo y,
adems, pudieese extraer D
DNA y analizarlo:
a) Cuntos haaplotipos o ssecuencias nucleotdicas
din
ferrentes en la regin del ccromosoma Y en la reggin
del gen Sry obttendra? Justifique.
b) Cuntos tippos de secueencias nucleo
otdicas diferrentess del D-loop de DNA miitocondrial obtendra?
o
Juustifiq
que.
So
olucin: a) Uno slo: el que prov
viene de Issaac
(heerencia ligadda al sexo, etcc.)
b) 4: el de Isaaac (donado poor su madre)), el que provviene de la madree de Esa, eel que provieene de la maadre
de Jacobo y el que provienne de la mad
dre de las 5 herh
maanas (herenciia materna...)
4) Aproximadaamente el 0,,3% de la hu
umanidad tiene
na enfermedaad gentica lleve llamadaa LHON prooduun
cid
da por una mutacin
m
que substituye una
u Asn por una
u
Assp en el compplejo NADH
H mitocondriaal.

93

a) Cules son las freccuencias gennotpicas parra este

carcter? S
Seran distinntas a las freecuencias allicas?
por qu?
b) Si aparecciese una corrriente eugennsica que prreconice mejorarr la raza huumana que proponga
p
eliminar
las enfermedades genticas por mtodos
m
drsticos
deberan prohibir
p
teneer hijos a toddos los indivviduos
con sntomas de LHON
N?por qu?? Atencin: ignore
los datos quue se enumerran a continuuacin para contesc
tar esta preggunta.
Gracias a loos conocimieentos adquiridos en genttica I y
para buscarr argumentos cientficoss para enfrenntar al
movimientoo eugensico a Ud se le ocurre
o
hacer 2
o y ii)
estudios: i) diagnstico molecular confirmatori
c
cuantificaciin de la freecuencia de aparicin esspontnea de esta mutacin. En
E el primer caso encontrr que,
adems de los enfermos, existen individuos con
c
la
mutacin pero
p
asintom
mticos (debiidos a heterroplasmia: presenncia de mitoccondrias con genotipo normal y
mutante en una nica clula)
c
y en el segundo que la
misma es siignificativa.
c) Argumennte por qu estos estudioos demostrarran la
inutilidad prctica
p
de encarar la seleccin
s
neegativa
propuesta por los eugennsicos.
por lo
Respuestass: a) Este es un
u carcter mitocondrial
m
que, salvo algn
a
caso raro
r
de heterroplasmia, el alelo
est presennte o ausentee (como si fuera una especie
e
monoploidee)]. Por lo tanto,
t
las frrecuencias allicas
a
son iguales a las geenotpicas f(LHON)
f(
= 0,3%
F(normal) = 0,97%
b) A las muujeres (y no a los varonees) porque se
s trata
de una herencia maternaa, no hay neccesidad de evvitar la
reproduccin de los varoones dado quue no transm
miten la
enfermedadd
c) Despus de la seleeccin negatiiva la segreggacin
somtica dee los heteroplsticos y la aparicin coonstante de nuevaas mutacionees similares llevaran la enfermedad gentica a las
mismas ciffras actuales (despus de algunas pocas generaciones)
5) El seor sealado
con un crcuulo rojo
tiene una raara enfermedad gentica y le
pregunta: -V
Vos que
hiciste un cuurso rpido de genttica me
podrs averriguar qu
probabilidadd tengo de
transmitirle esta enfermedad a mis futuros hijos? Mi
M seora
no posee estta enfermedad peroo con la
gentica nunnca se
sabe!. Me tendr que
hacer un anlisis yo o mi
m seora?

L
Le podr conttestar sin neccesidad de peedirle un anlisiss gentico detallado (pediigr) a la seora? Justifique
breevemente.

Rtta: La probaabilidad es nnula porque se trata de un

claaro ejemplo de herenciaa materna. No
N requiere de
ms anlisis.
Reespuestas altternativas vlidas a estaa pregunta (no
pedidas):
a) Imprinting materno
m
b) podra ser unn gen autonmico recesiv
vo
En
n el caso b), S debera hhacer anlisiss genticos.

Evolucin
n, Mejoram
miento, Biod
diversidad
1) La papa-ocaa es un cultiivo andino de
d origen preecolom
mbino (fue, para los inccas, tan impo
ortante comoo la
pap
pa comn) que
q se cultivva en el NOA y es de gran
g
intters evolutivo, antropollgico y eco
onmico. Perrtenece a la esppecie octoploide Oxaliss tuberosa. El
n
mero bsicoo de cromosoomas permitti agrupar esta
e
esp
pecie con otrras, dentro ddel gnero y postular su orio
gen
n evolutivo por alopolipploida o auttopoliploidaa de
esp
pecies del gnero. Para ccorroborar esste agrupamiiento mediante esttudios de evvolucin molecular y cuantificcar la similituud gentica ccon otras esp
pecies del gnero,, Tosto y cool. (Plant Syystem Evol 2000)
2
utilizaaron

AF
FLP para obbtener patronnes de bandaas polimrfiicas
parra as generaar un dendroggrama.

94

a) En la comparacin se incluy a O. articulata, la

cual no pertenece al agrupamiento. Por qu?
b) En la comparacin se incluyeron varias accesiones
(individuos) de cada especie Por qu?
c) Observando el dendrograma y comparando distintas
especies podra intuir si la variabilidad gentica de la
especie cultivada es relativamente muy baja debido a
la poliploidizacin, mejoramiento y seleccin? Por
qu?
Respuestas esperadas: a) Es un control externo (outgroup) y sirve para relativizar las distancias genticas
o los ndices de similitud que se obtienen dentro del
agrupamiento en estudio.
b) Para tener una idea del grado de variabilidad intraespecfica y compararlo con la interespecfica.
c) Salvo por 2 individuos que parecen idnticos, el
resto parece ser muy variable. A juzgar por el largo de
las ramas, la variabilidad intraespecfica de O. tuberosa es no es menor a la variabilidad intraespecfica de
las otras especies no cultivadas analizadas.
2) Existen teoras en conflicto acerca del origen del
hombre. Existe consenso en que una especie anterior,
llamada Homo erectus, se origin en frica y se movi hacia otros continentes hace ms de un milln de
aos. Posteriormente a este suceso empieza la controversia. La evidencia paleontolgica parece apoyar la
llamada teora de evolucin multiregional que postula
que el Homo sapiens evolucion local y paralelamente
en Europa, Asia y frica a partir del Homo erectus.
Cuando se realizaron estudios moleculares con DNA
mitocondrial surgi otra hiptesis (llamada out of
Africa igual que la famosa pelcula) que postula un
origen nico africano del Homo sapiens hace apenas
200.000 aos. El hombre moderno se habra movido
(igual que el Homo erectus) fuera de frica, desplazando (y posiblemente extinguiendo) a otros homnidos. Los fsiles de los hombres de Neandertal ofrecen
una oportunidad para confrontar ambas hiptesis. Los
neandertales son homnidos descendientes del Homo
erectus que vivieron en Europa entre 300.000 y
30.000 aos atrs que, de acuerdo con la teora africana, fueron desplazados por el hombre moderno (hombre de Cromagnon) procedente de frica (o Asia central) hace unos 50.000 aos atrs, mientras que la teora multitregional apoyara una relacin evolutiva entre
neandertales y los pueblos europeos ms antiguos
(como por ejemplo, los celtas). A partir de huesos
fsiles se aisl DNA cuyas secuencias mitocondriales
mostraron que sobre 994 nucletidos analizados, un
promedio de 27 posiciones mostraban diferencias entre humanos y el neandertal, mientras que los DNAs
humanos de muestras de los ms diversas procedentes
de todos los rincones del mundo tienen diferencias en
8 posiciones. El fenograma obtenido se muestra a continuacin.
a) A cul de las 2 hiptesis apoyan estos resultados?
Explique
b) Podra afirmar, con estos datos, que los neandertales (hasta ahora llamados Homo sapiens sbp neander-

talensis) pertenecieron a una especie distinta al Homo

sapiens sbp sapiens? Por qu?

Neandertal
Humanos
modernos
(incluyen
blancos, negros,
australianos,
amerindios, etc)
c) Por qu se utilizaron secuencias mitocondriales y
no secuencias nucleares?
Respuestas: a) A out of Africa porque muestra que
neandertales y cromagnones forman clusters (agrupamientos) muy separados entre s. Si fuera cierta la
hiptesis multiregional se esperaran mayores similitudes. De todos modos, hubiese sido interesado usar
un outgroup (control externo) para relativizar estos
valores.
b) S, por lo explicado en a) aunque para estar seguro
necesitara comparar con, por ejemplo, el chimpanc.
c) Porque las secuencias nucleotdicas mitocondriales
tienen una tasa de mutacin (velocidad de evolucin)
mucho mayor y permiten ajustar con mejor precisin
el reloj molecular en estas distancias evolutivas. [Sin
embargo, tambin se usa una secuencia nuclear ubicada en el cromosoma Y].

Genmica
1) Mediante el uso de marcadores moleculares se
construy un mapa de ligamiento del ratn, usando
como genotipos parentales de la poblacin de mapeo a
dos lneas endocriadas que presentan una marcada
diferencia respecto a su predisposicin a contraer
Alzheimer experimental (enfermedad caracterizada
por una acelerada desmielinizacin a nivel cerebral).
Se localiz en dicho mapa de ligamiento, adems, un
locus (gen de expresin recesiva) involucrado en dicha predisposicin. El mencionado gen (al que se denomin alz) mapea en el cromosoma 3, flanqueado a
10 cM y 13 cM por dos marcadores RFLP humanos
denominados hs3 y hs1, respectivamente (Fig. 1) (Nota: fue posible usar sondas humanas ya que muchas
sondas de esta especie hibridan con DNA de ratn
debido a su alto grado de parentesco). Recientemente,
un grupo de investigacin, clon molecularmente en
humanos, un gen (gdm) involucrado en la regulacin
de la produccin de mielina a nivel cerebral y lo mape en el cromosoma 8, flanqueado a 12cM y 15cM,
por los mismos marcadores hs3 y hs1. En la publicacin de dicho trabajo, los autores reportaron la localizacin cromosmica del gen y su secuencia completa.
Al leer este trabajo, se sospech (y con fundamento)
que el gen de ratn podra ser un homlogo del gen

95

humano. Laamentablemeente ambos grupos

g
nuncaa colaboraron parra que esto see pudiera dem
mostrar.
a) Cules fueron los fuundamentos de la sospechha?
b) Qu esttrategia utilizara usted para
p
clonar, al menos parcialm
mente, al gen supuestam
mente homloogo de
ratn (recueerde que el gen
g de ratn est mapeaddo pero
no est secuuenciado y no
n se sabe si la similitud de secuencia es alta,
a
ni tampooco si hibridan entre s)?
c) Cmo verificara, funcionalmeente, si el gen
g de
humanos cuumple la missma funcinn que su hom
mlogo
en ratones?? Disee un experimentto recordanddo que
los genes y las protenaas humanas son
s funcionaales en
ratones y viiceversa.
F 1
Fig.
cM

10
13

hs3
gdm
hs1

Hum
mano

c
cM

12
1
15

hs3
alz
hs1

Ratn

Respuesta: a) La sinttenia evoluttiva (conservvacin

filogenticaa de mapas genticos
g
enttre especies emparentadas) y,, tal vez, las caractersticas de loss genes en cuuanto a su
rol fisiolgiico.
b) Clonado posicional (cualquiera
(
de sus vaariantes es correcta).
Otras alternnativas de clonado ingeniosas puueden llegar a aceptarse.
c) Hacer esstudios de coomplementacin en ratones traansgnicos
(alz/alz, es decir homoccigotas recesivos) ussando el genn humano
como transggn. Espero que a ninguno se le ocurra hacerr humanos
transgnicos para Alzheeimer..
2) El clonaddo molecularr de genes
de resistenccia (R) a enfeermedades
en plantas es
e un viejo obbjetivo de
los fitopatllogos que traabajan en
interaccin husped-pattgeno. A
fines de los 90 se clonaaron los
primeros geenes R por esstrategias
de clonado posicional
p
(vver figura)
y en la actualidad ya hayy decenas
de estos gennes en el GenneBank y
otras bases de datos. Udd se involucra en un proyecto de este tipo

mero de cuessparra su tesis y tiene que ressolver un nm

tio
ones:
En
n el paso n se
s identificarron marcadorres moleculares
lig
gados al locus a distancias genticas del
d orden de los
10 cM. En el paso
p
o se obttuvieron marrcadores mss
cerrcanos de forrma tal de diisminuir las distancias
d
fssicass para que enn el paso p ppoder trabajaar con un
n
mero no muyy grande de clones.
a) Con qu tippo de colecciiones (librarries) de clonees
se trabaja para hacer esto?
i) genmicos
g
ii) o de cDNA
y por

qu?
b) Qu tipo dee vectores see utilizan (plsmidos, fagos,
csmidos, BAC
C o YAC) y porqu?
c) Suponiendo que los marcadores moleeculares em-pleeados (M1, M2,
M M3 y M44) son RFLP
Ps Cmo se
hace (metodolgicamente) para identifiicar los clonees
1, 2, 3 y 4 de laa figura y su ordenamien
nto posicional
(m
mapa fisico)?
d) Cul es el tamao
t
fsicoo aproximad
do (en kiloparres de bases)) de 1 unidadd de mapa geentico (1 cM
M)
en el ejemplo de
d la figura?
Por qu esta diferencia
d
de unidades? Cmo

se mide
cad
da una de elllas?
Un
na vez identificados los cclones corresp
pondientes a
estta regin cromosmica, ssus insertos se
s subdividenn
en tamaos ms chicos (paso q) para su
s subclonado y
traansferencia a plantas (passo r) para ev
valuar a estas
lttimas fenotppicamente coomo R (resisttentes) o S
(seensibles) a laa enfermedadd.

96

e) Para introducir los segmentos de ADN en plantas

se requiere de algn paso de subclonado en vectores
especiales? Se requiere, dentro de lo anterior, modificar el promotor y el terminador? Por qu? Se debe
tener alguna consideracin acerca del genotipo que se
va a transformar? Es decir se puede usar un clon de
la misma planta que se us para clonar el gen de resistencia?
En el ltimo paso (el s) se secuencian los insertos, se
identifican las ORF (secuencias abiertas de lectura)
presentes, las que se constituyen en candidatos a genes R.
f) Cmo se identifica una secuencia ORF en un inserto?
g) y si hay ms de una, cmo me doy cuenta de la
correcta?
h) Bioinformticamente de qu manera puedo asignarle una posible funcin al gen?
Rta: a) Genmicos porque tengo representada una
copia exacta del segmento cromosmico que estoy
identificando, incluyendo regiones no codificantes que
me van a servir para empalmar (identificar solapamientos entre clones) las secuencias con las que se
arma el mapa fsico de la regin. Si usara clones de
cDNA, no podra empalmar un clon con otro porque
no habra secuencias comunes entre ellos.
b) BACs o YACs porque son los que me permiten
contener insertos ms grandes y as poder tener reprensada la regin cromosmica en el menor nmero
de clones posible.
c) Las sondas utilizadas para RFLP pueden utilizarse
como sondas para inspeccionar (screenear) la genoteca y as identificar los clones que se corresponden al
segmento cromosmico en estudio. El ordenamiento
de los insertos lo puedo deducir de estas hibridaciones. S que el orden deducido del mapa gentico es
M1-M3-M4-M2. El mapa fsico, en cambio, slo me
permite ubicar M3 y M4 porque no tengo clones que
abarquen a M1 y M2 (+ el gen que quiero clonar) y
sean contiguos a M3 y M4. Por lo tanto, el inserto del
clon 1 (que slo hibrida con M3) tiene que estar ubicado en un extremo y as sucesivamente. La ocurrencia de insertos que hibridan un marcador y al gen
(clones 3 y 4) facilitan este ordenamiento.
d) 600-700 kpb / 0,2 cM = 2000 3500 kpb
Porque uma proviene del mapeo gentico que se realiza mediante cruzamiento y recuento de recombinantes
(unidades de recombinacin o cM) y la otra por mapeo de restriccin donde se comparan los tamaos de
los insertos com estndares de tamao molecular en
kilo pare de bases.
e) Si se decide utilizar transformacin mediada por
Agrobacterium tumefaciens, se requiere subclonarlo
en un vector Ti. En el caso de usar biolstica (can
gnico), no hara falta subclonar en ningn vector es-

pecial. No se requiere cambiar secuencias regulatorias

porque estamos trabajando con genes y secuencias
nativas y el experimento no requiere cambiar la regulacin de su expresin. No se puede elegir un clon de
la planta de la cual se clon el gen porque sera resistente independientemente del inserto que se le introduzca. Debera elegirse un genotipo susceptible a la
enfermedad.
f, g y h) Identificando codones de iniciacin (ATG) y
terminacin (alguno de los 3 codones STOP) con programas informticos. Esto se podra complementar
mediante la identificacin de secuencias consenso de
promotores, terminadores, splicing, etc.Mediante el
uso de BLAST y comparacin con otras secuencias ya
publicadas.

Desarrollo, epigentica, etc.

1) Durante el desarrollo de la mosca Drosophila melanogaster participan varias molculas conocidas como morfgenos, siendo en las primeras etapas, de
origen materno ( los mRNAs que codifican para dichos morfgenos se traducen en el huevo, pero provienen de las clulas nutricias maternas). Ejemplo de
esto y responsables del establecimiento del eje anteroposterior son:
-en la parte anterior del embrin, BICOID (bcd) y
ms tardamente HUNCHBACK (hb), productos de
los respectivos mRNA maternos.
-en la parte posterior del embrin, NANOS (nos) y
ms tardamente CAUDAL (cd), productos de los respectivosmRNA maternos. Se demostr tambin que:
-la protena bcd reconoce el 3UTR del mRNA de
cd y enla regin promotora del gen hb
-la protena nos reconoce el 3UTR del mRNA de
hb. I) Qu tipo de accin presentan bcd y nos segn
lo comentado anteriormente? Para contestar complete
el siguiente esquema con flechas de unin: (convenciones: activacin, ---| inhibicin).

II) Con toda la informacin que tiene acerca de

bcd, complete los fenotipos que espera observar
en los experimentos de la Fig asignando en cada
caso, alguna de las 4 opciones que se muestran
debajo de la figura, en donde se ha ensayado el
agregado de mRNA bcd en embriones con diferentes fondos genticos En la Figura siguiente,
complete (con flechas) el esquema de los resultados de inyeccin de mRNA de bcd.

97

Rta I)
bcd

gen
HB

nos

mRNA

hb

mRNA cd

cd

hb

Explicacin: bcd y nos son los morfgenos de la parte anterior y posterior: bcd actua como factor de transcripcin para hb regulando positivamente su transcripcin, pero tambin es un inhibidor de la traduccin del
morfgeno cd, que es ms tardo. Anlogamente, nos es un inhibidor del morfgeno ms tardio de la parte anterior, hb.
II) Explicacin: bcd es el morfgeno principal anterior, ya que donde se coloca, se generan zonas que darn
lugar a estructuras anteriores (cabeza y torax). El esquema del primer experimento sera anlogo a una complementacin (mutante bcd-, con fenotipo WT por el agregado del morfgeno anterior en la zona correspondiente).
Desarrollo normal

Desarrollo en mutante bcd-

inyectado adelante

inyectado al medio

Las 4 opciones para los 3

casos incgnita
2) Muchos tipos de cncer humano tienen su causa en
la hipometilacin del ADN. Para estudiar este fenmeno se generaron ratones transgnicos conteniendo
alguna de estas construcciones:
i) Vector conteniendo un promotor de SV40 (constitutivo, proveniente de un adenovirus) controlando la
expresin de la secuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en orientacin antisentido
ii) Vector conteniendo un promotor de SV40 (constitutivo, proveniente e un adenovirus) controlando la

iny. atrs en salvaje

expresin de la secuencia de la metiltransferasa 1

(Dnmt1) en orientacin sentido
iii) Vector conteniendo el promotor constitutivo proveniente del fago controlando la expresin de la secuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en
orientacin sentido
iv) Vector conteniendo el promotor constitutivo proveniente del fago controlando la expresin de la secuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en
orientacin antisentido

98

Se sabe que la enzima Dnmt1 controla la metilacin

del ADN en ratones y que su sobre-expresin permite
metilar exhaustivamente todo potencial ADN metilable y que su disminucin causa una sustancial hipometilacin del ADN en todos los tejidos.
a) Cul de los 4 vectores usara? Por qu?
b) En base al vector elegido, cmo espera que sea el
grado de metilacin general del ratn transgnico?
Explique el mecanismo
c) Con cul de las siguientes tcnicas corroborara
que el ADN est hipometilado? Justifique:
i) digestin con sendas ER que reconocen sitios metilados y no metilados, respectivamente, seguido de
Southern Blot con la sonda Dnmt1
ii) ensayo de proteccin a la digestin por ADNasaI
iii) preparacin de ARN de ratn salvaje y ratn
transgnico, seguida de Northern Blot con la sonda
Dnmt1
iv) digestin con ER que reconocen sitios metilados,
seguido de Southern Blot con la sonda de igf2 (insulin-like growth factor-2, conocido gen que sufre impronta gnica)
v) secuenciacin bisulftica genmica directa de
Dnmt1y/o igf2
vi) secuenciacin bisulftica del cDNA de Dnmt1y/o
igf2
Para la/s tcnica/s elegida/s indique los controles que
hara.
El ratn transgnico desarroll tumores en varios tejidos. Se determin que el gen Tm, candidato a causar
tumores en hgado, se encontraba hipometilado en
estos ratones. Ud. sabe que Tm presenta dos alelos,
Tm1: sin sitio para EcoRI y Tm2 con sitio para EcoRI.
d) Cmo hara para probar que Tm sufre impronta
(imprinting) en ratones salvajes? Ud cuenta tanto con
ratones homocigotas como con heterocigotas.
e) Suponiendo que realmente existe impronta de Tm
en el macho cmo sera la proporcin de Tm1 y Tm2
metilados y no metilados en la F2, es decir los nietos
de un cruzamiento entre ratones homocigotas para
Tm1 y Tm2?
Respuesta a) El i) porque es el nico que tiene un
promotor que se expresa en clulas eucariticas y tiene potencialidad de reducir la actividad de mutilacin
bloqueando la traduccin del gen que codifica la enzima Dmnt 1. Contestacin no necesaria: Podra venir
bien usar al vector ii) pero slo como CONTROL

contrastante del experimento. Las construcciones de

los vectores iii) y iv) no se expresaran en clulas eucariticas porque slo funciona en bacterias.
b) Altamente reducida. El RNA antisentido (complementario) de Dmnt 1 formar una doble cadena de
RNA con el mensajero nativo dificultando su traducibilidad. Al reducirse la cantidad de enzima, se reduce
tambin el efecto de la misma.
c) La v) dado que este tipo de secuenciacin permite
detectar nucletidos metilados. Se debe secuenciar un
gen ya caracterizado como metilado. No sabemos si
ste es el caso del gen Dmnt1 y lo ms probable es
que no lo sea. En todo caso, Dmnt1 puede servir como
control (no metilado). En realidad, el control ms importante es comparar con la secuenciacin comn
(que es insensible a la metilacin) y (como se indica
despus) ratones transgnicos vs no transgnicos. La
iv) sirve si se compara el patrn de restriccin de
ratn transgnico vs no transgnico. Tambin podra
ser aceptada como vlida si se explica que se usa ER
que NO reconocen sitios metilados, adems de los
metilados para as comparar ambos patrones, dado que
usar slo una enzima que s reconoce sitios metilados,
no es capaz de diferenciarlos de los no metilados.
Una complicacin (que no es necesario explicitar en la
respuesta correcta) es que los genes metilados por imprinting tienen una copia (epialelo) metilado y otro no
metilado.
d) Cruzara 2 homocigotas: por ej. homocigotas
para Tm1 y Tm2. Despus, analizara en la F1 la
correspondencia entre metilacin (por ej. por secuenciacin bisulftica que, adems, me revelar la presencia/ausencia del sitio EcoRI en el epialelo metilado).
(La otra alternativa es una doble digestin con ER
sensible/insensibles a metilacin + EcoRI seguido de
Southern). En base a cual alelo aparezca metilado determinar si el imprinting es paterno o materno. La
confirmacin del imprinting se puede hacer realizando
un cruzamiento prueba con el parental que no metila
sus gametas. Debera ver un 50% de la progenie con
metilacin para cada alelo.
e) 25% de individuos Tm1 homocigotas con una copia
de las 2 metiladas (Tm1m/Tm1), 25% Tm2 homocigotas dem (Tm2m/Tm2), 25% de heterocigotas con metilacin en Tm1 (Tm1m/Tm2) y 25% de heterocigotas
con metilacin en Tm2 (Tm2m/Tm1).