Curso de Anlisis Instrumental

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA

EFICACIA (HPLC)

Instituto de Ingeniera Qumica

Facultad de Ingeniera - 2007

Ampliamente utilizada

Gran sensibilidad

Determinaciones cuantitativas exactas

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
DE ALTA EFICACIA (HPLC)

Determinacin de compuestos no voltiles (alto Peso Molecular,

iones metlicos) o termolbiles.

Aplicabilidad a sustancias de inters general (industria, salud,
medioambiente).

Aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos,
carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos,
esteroides, etc.

Juan Bussi

Solventes como Fase Mvil

Interacciones qumicas entre la muestra, la fase mvil y el relleno
de la columna, determina el grado de migracin y separacin de
componentes contenidos en la muestra.

Compuestos con interacciones ms fuertes con la fase mvil que
con la fase estacionaria eluirn ms rpidamente de la columna
(tiempos de retencin menores).

La fase mvil puede ser alterada en el transcurso del anlisis para
manipular las interacciones de los componentes de la muestra con
la fase estacionaria.
Elucin Isocrtica: composicin constante de la fase mvil
Elucin por gradiente: los distintos analitos son eludos
con incremento de la composicin de la fase mvil en la fase
orgnica.
Elucin politptica: se combinan varios tipos de tcnicas.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS

Definiciones

Polaridad creciente
Insoluble en agua

Soluble en agua
Inico

No Polar
No Inico Polar

PesoMolecular

102

10

Reparto

Adsorcin
(Reparto
en fase
inversa)

(Reparto
en fase
normal)

Intercambio
inico

Velocidad lineal media v = u x ft

Velocidad de migracin u
1

v=ux

104

105

Coeficiente de distribucin K = cS/cM

Tiempo de retencin: tM

1 + KVS/VM

Exclusin por
tamao
(Penetrabilidad
sobre gel)

(Filtracin
sobre gel)

106

Distintos mtodos son complementarios.

Factor de capacidad de una especie A:

kA = KA VS/VM
tR tM
kA =
tM

Eficacia de columnas para HPLC

Factor de selectividad para dos especies A y B

(tR)B tM
= KB/KA = kB/kA =
(tR)A tM
Altura de plato terico H = 2/L
N de platos tericos N = L/H

Conceptos de Altura de Plato Terico y factores que lo afectan

como en otras cromatografias.
H = A + B/u + (CS + CM) u
(ecuacin de Van Deemter)

Velocidades lineales menores
que en CG

Altura de plato menor que en
GC (1 orden de magnitud).

Longitud de columnas menor
(25 a 50 cm).


Efecto del tamao de partcula del relleno

CS y CM dP2
Aumento de eficiencia con disminucin del tamao de partcula
(tamao usuales entre 2 y 10 m

Ensanchamiento extracolumna
Debido a diferencias de velocidad entre distintas capas del
lquido que se desplaza en tubos de inyeccin, de conexin y
detectores.
Gradientes no se compensa por difusin.
Hex =

r 2u
24DM

Reduccin del dimetro de

tubos a menos de 2.5 mm.

Efecto del tamao de muestra

Ms notorio en Adsorcin y Reparto

Instrumentacin
Elevadas presiones para alcanzar caudales necesarios.
Equipamiento sofisticado y caro.

Recipientes para una o ms fases mviles

De vidrio o acero de 0.2 a 1 L

Sistemas de pretratamiento de fases mviles

Cmara de mezcla para disolventes

Ventajas de la elucin con gradiente (relacin variable de
volmenes de dos o ms disolventes)
Mejora de resolucin en tiempos de anlisis ms cortos.

Para eliminacin de gases disueltos y slidos en suspensin

desgasificacin por vaco

calentamiento

agitacin

inyeccin de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio).

Filtros para polvo y partculas slidas en suspensin.
Mtodo comn: filtracin a vaco a travs de filtro millipore de
tamao de poro muy pequeo (eliminacin de gases disueltos y
slidos en suspensin).

Sistemas de bombeo

Generacin de presiones superiores a 6000 psi.

Cada de presin en una
columna:

Lu
P =

dP2

: viscosidad
: parmetro adimensional (valor cercano a 500 para
columnas bien empacadas)
dP: dimetro de partcula del relleno


Flujo libre de pulsaciones (minimizacin de errores de medicin)

Variaciones menores a 1% son normales

Intervalo de caudales entre 0,1 y 10 mL/min

Control y reproducibilidad de caudal mejor al 0,5%.

Cambio de volumen de lquidos y sellos al cambiar la
contrapresin:
1 dV
=
V dP T

Caudal = Dimetro Pistn*desplazamiento - *P*V-P*compr.sellos y
burbujas.

En sistemas de bombeo por jeringa (250 mL) la compresin del

solvente (a 400 atm) puede requerir varios mL de desplazamiento
del pistn.

Coeficientes de compresibilidad isotermos de algunos solventes

usados en HPLC.

Solvente

(10-11Pa-1)

Metanol

120

Agua

45

n-hexano

150

n-octano

100

Isopropanol

100

cloroformo

105

Dietil ter

185

vara para mezclas de solventes en anlisis con elucin por

gradiente

Programacin por microprocesadores que corrige desvos

Bombas recprocas

Componentes resistentes a corrosin (juntas de acero inox o
tefln).

Las ms utilizadas

Altas presiones no suponen riesgo de explosin (s riesgo de

incendio).

Movimiento cclico de uno o

ms pistones con vlvulas de
entrada y salida.

Elementos compresibles en el
circuito atenan variaciones.

2 Pistones es la opcin ms adecuada

Ventajas: pequeo volumen interno (35 a 400 L), altas
presiones (>10000 psi), fcil adaptacin a sistemas por gradiente
y caudales constantes e independientes de la contrpresin de la
columna y viscosidad del disolvente.

Desventajas: flujo con pulsaciones.

Prdidas en vlvulas
Funcionamiento normal:

prdidas pequeas y constantes

Mayor incidencia a bajos caudales (L/min).

Fabricantes suministran diagnsticos para
deteccin de prdidas

Test para prdidas

Bombas de desplazamiento

Cmara con un mbolo impulsado por un motor

Ventajas: flujo libre de pulsos, independiente de viscosidad y
contrapresin

Desventajas: capacidad de bombeo limitada (0.25 L), poco
prctica para reposicin y cambio de disolvente.

Reemplazo de columna por una vaca de

V=1.5 mL

Llenado con disolvente y tapado.

Prender la bomba hasta que la presin
alcanza 300 atm.

Apagar la bomba y registrar cada de
presin en funcin del tiempo (normal < 2
atm/min)

Bombas neumticas

Sistema de inyeccin de muestra

Ventajas: baratas

Exentas de impulsos
Desventajas:

Capacidad limitada y de presin de salida.

Volmenes pequeos para evitar ensanchamiento de picos

(dcimas de L a 500 L).

Inyeccin manual.

Sencilla

Caudal dependiente de la viscosidad del disolvente y de la

contrapresin.

Evitar despresurizacin (microjeringas capaces de resistir 1500 psi).

No sirven para elucin con gradiente.

Inyecciones a flujo detenido

Presiones menores a 2000 psi.

Reproducibilidad: dispersin 2%-3% o mayor

Control de caudal

Inyeccin con bucles

Medicin de caudal mediante cada de presin a travs de un

tubo en la salida de la bomba.

Programa de Ordenador

Ventajas

Inyeccin a presiones de hasta 7000psi

Precisin de dcimas por ciento.

Volmenes de bucles entre 0,5 y 500 L.

Columnas

Tubos rectos de acero inoxidable

Tubos de vidrio hasta presiones de 600 psi

Longitud entre 10 y 30 cm

Acoplables

Dimetro interno entre 4 y 10 mm

Tamaos de partculas entre 5 y 10 m

Columnas comunes: longitud 25 cm, dimetro interno 4.6 mm,
relleno de partculas de 5 m: 40000 a 60000 platos/metro

Columnas de alta eficacia de menores dimensiones con hasta
100000 platos/metro.

Precolumnas

Eliminacin de materia en suspensin y componentes que se
unen irreversiblemente al relleno.

Saturacin del solvente con la fase estacionaria (minimiza
prdidas de relleno.

Tamao de partcula mayor al de la columna

Columna termostatizada

Entre temp. ambiente y 100-150C.

Rellenos
Pelicular:

Bolas de vidrio o polmero, no porosas y esfricas con dimetros
entre 30 y 40 m.

Recubrimiento con una capa delgada y porosa de distintos
compuestos y recubrimiento adicional de fase estacionaria lquida
y retenida por adsorcin.

Tratamientos qumicos para mejorar fijacin.

Ampliamente utilizados en precolumnas

Partculas porosas.

Micropartculas porosas con dimetro entre 3 y 10 m.

Preparadas por aglomeracin a partir de partculas pequeas.

Recubrimiento con pelculas orgnicas unidas qumicamente o
fsicamente.

Materiales ms utilizados como soportes

Detectores

slice, almina, resinas de poliestireno. divinilbenceno o

carbohidratos.

Propiedades de la fase mvil (Indice de Refraccin, constante

dielctrica, densidad)

Parmetros fsicos: porosidad, tamao de poro, tamao y rigidez

de partcula, tamao.

Propiedades del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente lmite).

Parmetros qumicos. Polaridad, acidez-basicidad, estabilidad

frente a solventes y pH, reactividad superficial.

Detectores de absorbancia (71%)

Volumen de 1 a 10 L, longitud de 2 a 10 mm

Presiones < 600 psi (necesitan reductores de presin)

Dispositivos de doble haz (los ms comunes)

Seal proporcional al Log I/Io

Filtros (longitudes de onda determinados)

Monocromadores (redes de difraccin)(UV y Visible)

Cromatogramas a una fija o variable segn el analito.

Barrido de para un analito con detencin de flujo

Detectores de diodos permiten recoger el espectro completo
en 1 segundo (cromatografa tridimensional.

Detectores de absorbancia en el infrarrojo

Barrido de entre 2.5 y 15 m

Cubetas con ventanas de NaCl o CaF2, long. 0,2 y 1,0 mm,
volumen 1,5 a 10 L.

Limitacin: baja transparencia de los disolventes (agua,
alcoholes)

Detectores de fluorescencia

Detector colocado perpendicularmente al haz de excitacin

Fuente de excitacion
de Hg y filtros
Xenn y monocromador de red
lser sintonizables en desarrollo

Tratamiento previo para dar derivados fluorescentes.

Alta sensibilidad (materiales de inters farmacutico, clnico,
productos naturales y del petrleo).

Detectores de ndice de refraccin

Detector universal

No dependen del caudal

Robustos

Sensible a cambios de temperatura

Menor sensibilidad que otros detectores.

Detectores electroqumicos

Elevada sensibilidad, sencillez, extensa aplicabilidad

Electrodo indicador de platino, oro, carbn vtreo o pasta de
carbono, electrodo de referencia y contraelectrodo se colocan ms
adelante en el canal de flujo.

10

Detectores por espectrometra de masas

Sistemas para introduccin de la fase mvil en cmara de vaco

Introduccin directa de una pequea cantidad de lquido

Vaporizacin previa de solvente y posterior desorcin-ionizacin
de solutos.

Termovaporizador-ionizador

Aplicable a compuestos termoestables y no voltiles (pptidos,
nucletidos.

Espectros de impacto electrnico

Rellenos tipo siloxano para fase inversa:

Grupo R: C8 (n-octilo), C18 (n-octadecilo)
Mecanismos de retencin de solutos (por disolucin,
equivalente a una fase lquida no polar, por adsorcin fsica

Cromatografa de Reparto

La ms utilizada

Para compuestos polares, no inicos, de baja a moderada masa
molecular (<3000)

Ms recientemente para compuestos inicos derivatizados
(formacin de pares inicos).
Lquido-lquido: fase estacionaria unida por adsorcion fsica

Efecto de la longitud de cadena en eficacia de columnas de

siloxano en fase inversa (Figura 28.15 Skoog).
pH<7,5 para evitar hidrlisis del siloxano.

Desventaja: prdida de fase estacionaria por disolucin en la fase

mvil
Fase unida qumicamente: soporte ms comn es la slice. dimetro
entre 3, 5 o 10 m); porosidad (hasta 0.80)
Hi

Ln km = ao,i - a1,i 2 + (a2,i 22)

2: fraccin en volumen del componente orgnico

OH
Si

Grupo silanol
aislado

Hi

Hi

OH

OH

Si

Si

Grupos silanoles
vecinos

Hi
OH
Hi

Hi
OH

OH

Si

Si

Agua unida a
grupos silanoles

11

Cromatografa de fase normal

Slice hidrolizada con HCl 0.1 M en caliente durante uno o dos das
mol/m2 de grupos OH
Inmovilizacin qumica (90% de rendimiento)
Si

OH + X

slice

Si

(CH2)n

organoclorosilano

Si

Relleno polar (agua o trietilenglicol soportado sobre slice o

almina y fase mvil apolar.

Competencia del disolvente y del analito por el relleno es
determinante de los factores de retencin.

Si

(CH2)n

Solventes no polares (etilter, cloroformo y n-hexano).

siloxano

Ecuacin de Soczewinski: ln ki = ln ki(2) Si lnx2

n = 8 o 18
L: metil, amino, carboxil, ciano, diol
Recubrimiento mximo 4 mol/m2 de grupos.
Silanos residuales se desactivan con clorotrimetilsilano

Cromatografa de fase inversa

Fase estacionaria no polar (hidrocarburo) y fase mvil polar (agua,
metanol, acetonitrilo).

Cambios de solvatacin del analito en el disolvente es determinante
de cambios de factores de retencin.

X2: fraccin molar del componente de ms polaridad

Rellenos tipo siloxano para fase normal:

amino (C3H6NH2) (los ms polares)

diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH) (polaridad intermedia)

dimetilaminopropil (C3H6N(CH3)2) (polaridad intermedia)

ciano (C2H4CN) (los menos polares)

Criterios de seleccin

Polaridad de la fase estacionaria similar a la de los analitos.
(Evitar tiempos de retencin muy altos).

Fase mvil con polaridad distinta a la fase estacionaria
Polaridad creciente:
Hidrocarburos < teres < steres < cetonas < aldehdos <
amidas < aminas < alcoholes < agua
k (factor de retencin) entre 2 y 5

Indice de polaridad P de Synder (J. Chromatog. Sci 1978, 16, 223)

Para una mezcla de solventes A y B: P = APA + BPB
A B: fracciones en volumen
PA, PB: ndices de polaridad

Cambio de 2 unidades en P cambio de k en un factor de 10
k2
k1

= 10

(P1 P2)/2

12

Selectividad
En fase inversa se ajusta con 3 disolventes: metanol, acetonitrilo
y tetrahidrofurano. Agua para ajustar k.
En fase normal se ajusta con etilter, cloruro de metileno y
cloroformo, nhexano para ajustar k.
Formacin de derivados
1) Reduccin de polaridad que haga posible el uso de
cromatografa de reparto
2) aumento de respuesta del detector
3) aumento de selectividad de la respuesta
Cromatografa de pares inicos
Fase mvil: agua + disolvente orgnico (metano o acetonitrilo +
compuesto inico con contrain de carga opuesta a la del analito.
Contrain forma un par inico con el analito: especie neutra
retenida por el relleno de fase inversa.

Cromatografa con fases estacionarias quirales

Ms apropiada en HPLC que en CG

Aplicaciones de la Cromatografa de Reparto

Campo

Mezclas tpicas

Frmacos

Antibiticos, sedantes esteroides,

analgsicos

Bioqumica

Aminocidos, protenas,
carbohidratos, lpidos

Productos de alimentacin

Edulcorantes artificiales,
antioxidantes, aflatoxinas, aditivos

Productos de la industria qumica

Aromticos condensados,
tensioactivos, propulsores,
colorantes

Contaminantes

Pesticidas, herbicidas, fenoles, PCB

Qumica forense

Drogas, venenos, alcohol en sangre,

narcticos

Medicina clnica

cidos biliares, metabolitos de

drogas, extractos de orina,
estrgenos.

Relleno recubierto con un ismero pticamente activo.

13

Cromatografa de Adsorcin (Lquido-slido)

Fases estacionarias: slice y almina
Seleccin del disolvente
Fuerza del disolvente 0 (energa de adsorcin por unidad de
superficie).
0 vara no linealmente con la relacin de volmenes de dos
disolventes.
Eleccin de disolventes
Un aumento de 0.05 unidades de 0 disminuye k en un factor de 3-4.
Cambios de se logran por ensayos previos con distintos
disolventes.
Ensayos por cromatografa de capa fina
Aplicaciones de la cromatografa de adsorcin
Para compuestos no polares con masa molecular < 5000
Compuestos con solubilidad limitada en disolventes acuosos
Complementario con Reparto
Separa ismeros

[RSO3-B+]s
[B+]ac

= KII

[RSO3-H+]s
[H+]

ac

[H+]ac y [RSO3-H+]s >> [B+]

[RSO3-B+]s
[B+]ac
Kex alta

= KII =

CS
CM

tiempo de retencin elevado

Tl+ >Ag+>Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+

Cromatografa inica
Equilibrio de intercambio entre iones de la fase mvil y iones del
mismo signo en la superficie de la fase estacionaria (resinas de
intercambio).
xRSO3-H+
slido

Mx+

disolucin

xRN(CH3)3 OH- + Axslido

(RSO3-)x +
slido

disolucin

xH+

disolucin

[RH(CH3)3+]xAx- + xOHslido

disolucin

Primera etapa: adsorcin de iones en la cabeza de la columna

Segunda etapa: elucin de iones adsorbidos con una disolucin
diluida de cido clorhdrico.
KII =

[RSO3-B+]s[H+]ac
[RSO3-H+]s[B+]ac

Rellenos
Partculas esfricas porosas copolmeros de estireno y
divinilbenceno (8%) emulsionados (estables entre pH 0 y 14).
Activacin por grupos cidos (sulfnico) o bsicos (aminas
cuaternarias).
Nuevos desarrollos: partculas esfricas (30 a 40 m), no porosa,
de vidrio o polmero, recubierta con resina de intercambio inico
(menor difusin)
Fase mvil
Disoluciones acuosas con metanol u otros disolventes orgnicos
y especies inicas para formar un buffer.

Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Cp2+>Zn2+>Mg2+>UO22+

Cromatografa inica con columnas supresoras

SO42->C2O42->I->NO3->Br->Cl->HCO2->CH3CO2->OH->F-

Electrolito eluyente enmascara la respuesta del Detector de

conductividad a los iones del analito.

14

NaBr, NaCl, NaF, NaOH (diluyente)

Columna supresora convierte iones de la fase mvil en especies

poco ionizadas

Bomba
Inyector

Ejemplo:
H+(ac) + Cl-(ac) + Resina+OH-(s)

Resina+Cl-(s) + H2O
Resina-Na+(s) + H2CO3 (ac)

NaBr
NaOH
NaCl
NaF

Sistema para
separacin de
analitos aninicos
usando columna
supresora

Columna separadora
+
Resina OH (s)

HBr
H2O
HCl
HF

Columna supresora
- +
Resina H (s)

Conductancia

Na+(ac) + HCO3-(ac) + Resina-H+(s)

Eluyente
NaOH

Detector
Tiempo

Residuos

Aplicaciones orgnicas y bioquimicas

Aminocidos, vitaminas, azcares y preparaciones
farmacuticas, alimentos. (figura 28-25)
Cromatografa de exclusin de iones (para cidos dbiles)
Fase mvil: solucin acuosa de HCl diluido

Regeneracin (cada 8 10 horas)

Desarrollo reciente de supresores de membranas supresoras de
intercambio inico con regeneracin continua: alta velocidad de
intercambio.
Cromatografa inica con una sola columna: deteccin debida a
pequeas diferencias de conductividad entre iones del analito y del
eluyente.

Fase estacionaria: resina de intercambio catinico en su forma

cida
Columna supresora de resina catinica con Ag para supresin de
contribucin inica del eluyente.
Para cidos y bases dbiles (y sus sales): coeficientes de
distribucin se relacionan inversamente con las constantes de
disociacin.
Aplicaciones a especies cidas en leche, caf, vino, etc.

Mtodo fotomtrico para deteccin de iones no absorbentes (figura

28-24

15

Cromatografa de exclusin por tamao

Propiedades de los rellenos comerciales tpicos para la cromatografa

de exclusin por tamao

Para masas moleculares elevadas

Relleno: partculas polimricas con una red de poros uniforme (10
m) en los que pueden difundir molculas del soluto y del
disolvente.
Tiempo de residencia depende del tamao efectivo de las
molculas.

Tamao de
partcula
m

Tamao
promedio de
poro, A

Lmite de exclusin
en peso molecular

Poliestirenodivinilbenceno

10

102
103
104
105
106

700
(0.1 a 20) x 104
(1 a 20) x 104
(0.1 a 20) x 105
(5 a >10) x 106

Slice

10

125
300
500
1000

(0.2 a 5) x 104
(0.03 a 1) x 105
(0.05 a 5) x 105
(5 a 20) x 105

Tipo

Molculas ms grandes no se retenidas y eluyen primero.

Separacin por tamao, no implica interacciones qumica o fsica
con el relleno.
Rellenos de slice: retienen por adsorcin y catalizan
descomposiciones. Se modifican por sustituyentes orgnicos
(sililacin).
Rellenos de copolmeros estireno-divinilbenceno: hidrofbicos.

Teora

Aplicaciones

Vt = Vg + V i + Vo

Filtracin sobre gel

Vt: volumen total de la columna

Disolventes acuosos y relleno hidroflicos

Vg: volumen ocupado por matriz slida del gel

Vi: volumen del disolvente retenido

Penetrabilidad sobre gel: disolventes orgnicos no polares y

rellenos hidrofbicos.

Vo: volumen libre exterior

Separacin de productos naturales de alto peso molecular.

Separacin de homlogos y oligmeros

Volumen de elucin = Vo: analitos no retenidos

Volumen de elucin = Vo + K Vi analitos de tamao intermedio (K
entre 0 y 1).

Determinacin de la distribucin de pesos moleculares en

polmeros o productos naturales (comparacin con patrones).
Ventajas

Lmite de exclusin: peso molecular por encima del que no existe

retencin.

Tiempo de separacin cortos y bien definidos (entre Vo y Vo+Vi)

Lmite de penetracin: peso molecular por debajo del cual las

molculas pueden penetrar completamente en los poros.

No hay prdida de muestra

Bandas estrechas

No hay desactivacin de la columna

16

Desventajas
Nmero limitado de bandas
No diferencia compuestos de tamao semejante (ismeros)

Cromatografa de Capa Fina (cromatografa

bidimensional)
Capa delgada de un Soporte inmovilizado sobre una superficie
plana de vidrio, plstico o metal.
Fase mvil se mueve por capilaridad, por gravedad o por un
potencial elctrico.
Otras modalidades menos usadas (en papel, electrocromatografa)
Caractersticas: Rapidez y Bajo costo.
Aplicaciones:
Ensayos previos a los de columna
Control de pureza en la industria.

17