FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR

Alumno: ____________________________________________ Cdigo: ___________
Alumno: _____________________________________________ Cdigo: ___________

Prctica 6: Fraccionamiento subcelular e identificacin de organelos a partir de

Elodea

OBJETIVOS:

Familiarizarse con la teora de la centrifugacin diferencial

Determinar las condiciones requeridas para separar diferentes organelos de las
clulas.
Emplear tcnicas citoqumicas para diferenciar los organelos presentes en cada una
de las 4 fracciones subcelulares obtenidas a partir de clulas de Elodea.

1. INTRODUCCIN
Para comprender el funcionamiento celular como un todo, es
importante conocer cada componente de la clula y sus
funciones. Ahora, damos por hecho que el ncleo es el lugar en la
clula donde se almacena el material gentico y que las
mitocondrias son las plantas energticas de las clulas; pero,
Cmo se lleg a estas conclusiones?

Nuestro entendimiento de las funciones que llevan a cabo las clulas y los organelos presentes en su
interior, ha sido posible por una combinacin de tcnicas bioqumicas y de microscopa.
La microscopa ha permitido observar las diferentes estructuras subcelulares, entender cmo estn
organizadas, y conocer las diferencias en arquitectura que existen entre los distintos tipos celulares,
adems de comprender, los cambios que pueden ocurrir bajo diferentes condiciones, como las de
crecimiento. Esta herramienta nos ha dado algunas pistas sobre las funciones de los componentes
intracelulares; pero es el uso de la microscopa, en conjunto con las tcnicas de separacin bioqumica y
los mtodos citoqumicos, lo que ha permitido la localizacin de molculas especficas y reacciones
metablicas, que ocurren en cada uno de los organelos.

Elaborado por: Rengifo | Profesor: Juliana Rengifo | Correo: jrengifo@icesi.edu.co

Editado por: Eliana Torres Bedoya

En esta prctica de laboratorio, utilizaremos la tcnica de centrifugacin diferencial para separar un

homogeneizado celular en varios componentes o fracciones. Inicialmente el homogeneizado contiene una
mezcla de tejidos, organelos celulares y molculas solubles, que mediante centrifugaciones secuenciales
a velocidades cada vez mayores, se irn separando segn sus caractersticas fsicas (forma, masa,
densidad, etc.). Los organelos con una mayor velocidad de sedimentacin (mayor densidad), se recogern
en el fondo del tubo (pellet) cuando se somete a centrifugacin a bajas velocidades. A medida que se
incrementa la fuerza gravitacional (fuerzas g) y el tiempo de centrifugacin, se recogern en los pellets,
organelos de menor tamao.

Elaborado por: Eliana Torres Bedoya

Una vez que el homogeneizado celular ha sido separado en varias fracciones, se pueden emplear una
serie de tcnicas para identificar los componentes celulares presentes en cada fraccin; dentro de estas
tcnicas se encuentran las tinciones especficas, que se utilizan para identificar las distintas clases de
macromolculas, por ejemplo, sustancias que se unen especficamente a los cidos nucleicos, pueden
emplearse para identificar la fraccin nuclear. Esto es lo que se conoce con el nombre de citoqumica.
Otro mtodo de identificacin es el uso de ensayos bioqumicos, en donde se recurre a demostrar las
reacciones qumicas que ocurren en determinados organelos para establecer la presencia o ausencia de
los mismos; por ejemplo, las enzimas implicadas en la fotosntesis, se espera que estn localizadas en los
cloroplastos, las relacionadas con el ciclo de Krebs deberan estar restringidas a la mitocondria y estar
ausentes en otros organelos, entonces se proporcionan los sustratos de la enzima para que ocurra la
reaccin cataltica, si esta se da, se demuestra la presencia de la enzima y por consiguiente, la del
organelo donde se encuentra.

Elaborado por: Rengifo | Profesor: Juliana Rengifo | Correo: jrengifo@icesi.edu.co

Editado por: Eliana Torres Bedoya

2. SEGURIDAD DURANTE LA PRCTICA

2.1 Normas de seguridad:

El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.
2.2 Equipos de proteccin personal:
Usar durante todo el desarrollo de la prctica los siguientes elementos de seguridad:

Bata de laboratorio.
Guantes de nitrilo.
Gafas de seguridad.

Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Est prohibido su
intercambio con los dems compaeros de laboratorio.
2.3 Manejo de residuos qumicos:
Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prcticas del laboratorio de qumica en forma adecuada. Por ello el
estudiante debe:
a. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los
cuales estn debidamente identificados segn el tipo de sustancia a desechar.
b. Verter nicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no
controladas y potencialmente peligrosas.
No arrojar por el desage los desechos o residuos qumicos obtenidos durante el desarrollo de la
prctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comunquela al responsable del laboratorio, quien le
indicar la forma correcta de hacerlo.
2.4 Disposicin y Descarte de Materiales
a. Cada estudiante es responsable de su rea de trabajo.
b. Depositar el material de vidrio roto en el tarro de basura blanco.
c. En caso de haber utilizado objetos corto-punzantes (lancetas, bisturs, agujas, etc.)
descartarlos en el Guardin.
d. Las lminas y laminillas contaminadas con muestras biolgicas, deben ser depositadas
en el Recipiente que contiene hipoclorito al 2%.
e. Los medios de cultivo, una vez utilizados, deben ser depositados en la bolsa roja
especial para autoclavar.
f. Los implementos que contengan fluidos o muestras biolgicas (guantes, toallas de papel,
algodn, etc.) deben ser descartados en bolsa roja.

Elaborado por: Rengifo | Profesor: Juliana Rengifo | Correo: jrengifo@icesi.edu.co

Editado por: Eliana Torres Bedoya

3. PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIALES
Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja:
ITEM

DESCRIPCION DEL ITEM

Portaobjetos
Cubreobjetos
Pipeta Pasteur
Mortero
Elodea
Beaker de 100 ml plsticos
Tubos vaccuntainer tapa roja
Gradilla para tubo vaccuntainer
Recipiente para descartar material
contaminado

CANTIDAD
8
16

U.M.
Un
Un

OBSERVACIONES

1
1
1
9
5
4

Un
Un
Kl
Un
Un
Un

Para la semana
Por clase

Un

Por clase

Por clase

3.2 REACTIVOS
Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja:
ITEM

DESCRIPCION DEL ITEM

CANTIDAD

U.M.

Lugol

300

ml

Azul de metileno

300

ml

OBSERVACIONES
Por clase divididos en 3 frascos
con gotero
Por clase divididos en 3 frascos
con gotero

3.3 EQUIPOS
Tabla 3. Listado de equipos necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja:
ITEM

DESCRIPCION DEL ITEM

Microscopio
Centrifuga (Rotofix 32 A)
Balanza 100 g
Vortex

CANTIDAD
1

U.M.
Un

1
3
3

Un
Un
Un

OBSERVACIONES
Por clase
Por clase
Por clase

3.4 SOLUCIONES
Tabla 4. Listado de soluciones que requieren estar listas para el da de la prctica:
ITEM

DESCRIPCION DEL ITEM

Cloruro de sodio al 0.9%

CANTIDAD
1

U.M.
L

OBSERVACIONES
Para la semana

Elaborado por: Rengifo | Profesor: Juliana Rengifo | Correo: jrengifo@icesi.edu.co

Editado por: Eliana Torres Bedoya

TENGA EN CUENTA QUE

Al utilizar la CENTRFUGA

Siempre se debe ubicar en mesones planos y resistentes.

Al cambiar de rotor es necesario verificar que sea el adecuado para el tipo de tubo que

va a utilizar y que este asegurado.

Para centrifugar una muestra DEBE preparar un tubo adicional y verificar que PESE LO
MISMO que el tubo con su muestra para que haga contrapeso (puede utilizar agua o un
tubo con otra muestra para equilibrar el peso).
Al ubicar tubos en la centrfuga tenga en cuenta que el tubo que hace contrapeso debe
estar EXACTAMENTE en la POSICIN OPUESTA al tubo con su muestra.
Si trata de centrifugar tubos que no estn correctamente
balanceados stos se quebrarn y tendr que repetir su
trabajo.
PELIGRO!!! El mal balance de los tubos en la centrfuga
podra daarla o hacer que se desplace lentamente por el
mesn y caer al piso.
En caso de que los tubos hayan quedado mal balanceados
APAGUE INMEDIATAMENTE la centrfuga y calibre
los pesos nuevamente.
Para operar, la tapa de la centrfuga siempre debe estar cerrada.
Una vez en operacin, nunca mueva ni se apoye contra la centrfuga.

3.5 CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL Y VISUALIZACIN DEL MACERADO DE ELODEA

La Elodea es una planta acutica que se encuentra en forma abundante en nuestros ecosistemas; es
fotosintticamente muy activa por lo que contiene grandes cantidades de cloroplastos. El objetivo de esta
actividad es realizar un homogenizado de Elodea y posteriormente fraccionarlo mediante centrifugacin
para observar las estructuras bsicas de estas clulas (ncleos y cloroplastos).

a.
b.
c.
d.
e.

Marque 4 tubos de ensayo con los rtulos E1-E4

Colecte varias hojas de Elodea y dispngalas en un mortero.
Adicione 3 ml de Solucin Salina al 0.9%.
Macere fuertemente las hojas de Elodea.
Transfiera el macerado en el tubo con el rtulo E1.

Elaborado por: Rengifo | Profesor: Juliana Rengifo | Correo: jrengifo@icesi.edu.co

Editado por: Eliana Torres Bedoya

f.

Utilizando una balanza, equilibre el tubo E1 (use dos cifras decimales) con otro que contenga
agua. Ubquelos SIMTRICAMENTE en las canastillas de la centrfuga.
g. Centrifugue durante 10 segundos a 500 rpm
h. Transfiera el sobrenadante del tubo E1 a otro tubo rotulado como E2.
i. Resuspenda el pellet del tubo E1, en 3 ml de solucin salina (0.9%).
j. Utilizando una balanza, equilibre el tubo E2 (use dos cifras decimales) con otro que contenga
agua. Ubquelos SIMTRICAMENTE en las canastillas de la centrfuga.
k. Centrifugue durante 30 segundos a 2.000 rpm.
l. Transfiera el sobrenadante del tubo E2 a otro rotulado como E3
m. Resuspenda el pellet del tubo E2, en 1 ml de solucin salina (0.9%).
n. Utilizando una balanza, equilibre el tubo E3 (use dos cifras decimales) con otro que contenga
agua. Ubquelos SIMTRICAMENTE en las canastillas de la centrfuga.
o. Centrifugue durante 4 minutos a 4.000 rpm
p. Transfiera el sobrenadante del tubo E3 a otro rotulado como E4
q. Resuspenda el pellet del tubo E3, en 1 ml de solucin salina (0.9%).
A continuacin se presenta el esquema del procedimiento que debe realizar, observe con atencin:

Elaborado por: Eliana Torres Bedoya

r.

Rotule 4 portaobjetos desde E1 hasta E4. Divida cada portaobjetos a la mitad utilizando un
marcador.
s. Disponga dos gotas de cada fraccin en el portaobjetos rotulado para cada caso (Tubo E1/
Portaobjetos E1). Coloque una gota en cada extremo.
t. Cubra UNA de las gotas con una laminilla, sta ser la gota control
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Editado por: Eliana Torres Bedoya

u. Adicione a la otra, una gota de azul de metileno. Cubra con una laminilla.
v. Visualice cada preparacin al microscopio para observar los diferentes componentes subcelulares.
Realice dibujos de lo que observa (40x) en cada una de las laminillas indicando el tipo de
muestra, de tincin utilizada y el nombre de cada organelo

E1 + ________ (40x)

E1 Control (40x)

E2 + ________ (40x)

E2 Control (40x)

E3 + ________ (40x)

E3 Control (40x)

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E4 + ________ (40x)

E4 Control (40x)

w. Tome nota de las fracciones en las que aparecen cada uno de los organelos y complete la Tabla 2.
Indique la cantidad relativa de cada uno de los organelos en cada una de las fracciones (mucho,
algo, poco y nada)

Tabla 1. Datos de las observaciones de microscopa de los organelos de las clulas de Elodea.
Fraccin de clulas de
Elodea

Azul de metileno
(ncleos)

Control sin teir

(cloroplastos)

Pellet 1 (E1)
Pellet 2 (E2)
Pellet 3 (E3)
Sobrenadante 4 (E4)

x. Basado en su conocimiento y en la lectura de la gua, qu organelos esperara observar mas

abundantemente en:
la fraccin #1?

la fraccin #2?

la fraccin #3?

la fraccin #4?
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Editado por: Eliana Torres Bedoya

y. En qu casos sus predicciones concuerdan con las observaciones experimentales? Discuta

porqu si o porqu no.

ELODEA
Fraccin #1:

Fraccin #2:

Fraccin #3:

Fraccin #4:

z.

Teniendo en cuenta que Ud. conoce los tamaos relativos de los diferentes componentes
subcelulares, qu fraccin esperara que contuviera la mayor cantidad de protena? Por qu?

aa. El aislamiento de los cloroplastos, es exclusivo de una de las fracciones? Si la respuesta en NO,
cul podra ser la razn de la presencia de un organelo en varias fracciones?

REFERENCIAS
Imgenes:
http://www .microscopico.wordpress.com
http://www.tuelsalvador.com

Fecha: Julio de 2011

Elaborado por: Rengifo | Profesor: Juliana Rengifo | Correo: jrengifo@icesi.edu.co

Editado por: Eliana Torres Bedoya