Universidad de Oriente.

Ncleo de Sucre.
Escuela de Ciencias.
Laboratorio de Bioqumica I.
Cuman, Edo - Sucre.

Extraccin, cuantificacin y determinacin

de ARN en el hgado de Gallus gallus
domesticus

Profa.

Realizado por:

Patricia Velsquez

Maiz Maestre, Diosmary.

C.I: 25.528.378
Garca Khan, Gnesis.
C.I: 25.889.155
Seccin 01.

Diciembre de 2014

INTRODUCCIN

OBJETIVOS
Objetivo general:

Extraer y cuantificar la concentracin de ARN en una muestra a partir del

mtodo convencional del orcinol.

Objetivos Especificos:

Determinar colorimtricamente la concentracin de ARN a travs de la

reaccin de orcinol.
Comparar la muestra con un modelo de referencia de cuantificacin de ARN

en el mismo tejido u otro.

Sealar la importancia de la macromolcula en el tejido.

METODOLOGA

Para la curva patrn de ARN:

Se busc 5 tubos de ensayo.

TABLA N1. CANTIDADES AADIDAS PARA LA CURVA PATRN.

TUBOS
1
2
3
4
5

Estndar de ADN (0,2mg/ml)

0
0,25
0,5
1
2

Agua (ml)
2ml
1,75ml
1,5ml
1ml
0

Orcinol(ml)
3ml
3ml
3ml
3ml
3ml

Se le aadi a cada uno de los 5 tubos de ensayo, las anteriores

cantidades especficas de Estndar de ADN, agua y orcinol.

Para agregar el orcinol se llev los tubos de ensayo a la campana ya que

se necesit sumo cuidado.

Luego de haber sido aadidas estas cantidades, se coloc todos los tubos
de ensayo en un beacker considerablemente grande, que se puso en la
campana, a calentar previamente con bao de Mara en la plancha de

calentamiento por dos minutos.

Pasados los minutos anteriormente dichos, se dej en reposo a los tubos

patrones durante 5 min.

Finalmente, se ley sus transmitancias en el espectrofotmetro a 650 nm.
En cuanto a datos, las transmitancias obtenidas posteriormente son
transformadas a absorbancias, valores indispensables que conforman el eje
Y de la curva de calibracin, adems, a partir del estndar de ADN se
procesan y calculan datos para la obtencin de los mg de ARN, valores del
eje X de la misma.

Para la extraccin de ARN:

Se pes 1,03g de hgado de Gallus gallus domesticus.

Se le agreg 9ml de solucin salina (NaCl)

 Se homogeniz.
Se verti la solucin ya homogenizada en dos tubos de eppendorf.
Se llev los tubos de eppendorf a la centrifuga a 3000rpm durante 10

minutos.
Posterior a esto, se busc un tubo de ensayo donde se agreg el

sobrenadante.
En un tubo de ensayo se aadi 0,4ml de sobrenadante + 1,6ml H 2O + 3ml

Orcinol.
Se puso el tubo de ensayo en la plancha de calentamiento en bao de
Maria por dos minutos aproximadamente.
Finalmente en el espectrofotmetro se ley su transmitancia.

Para efecto de datos, el valor de la transmitancia que se transforma, sirve

para cuantificar la concentracin de ARN en la muestra. La cantidad pesada
en gramos del tejido y los 9ml de solucin salina, son la base para
determinar los gramos de peso hmedo, los cuales se le dividirn a los mg
ARN.

RESULTADOS

TABLA N2. TRANSMITANCIAS Y ABSORBANCIAS DE LOS

TUBOS PATRONES (2-5)

Tubos
2
3
4
5

Transmitancias
72
34
30
6

Absorbancias
0,142
0,468
0,522
1,221

Las transmitancias fueron leidas en el espectrofotmetro. En esta tabla se observa

la rotulacin de los tubos, las transmitancias y absorbancias. Para transformar las
transmitancias ledas a absorbancias se utiliz:

2log T .

Para los mg de ARN, se toma en cuenta que el estndar de ADN tena una
concentracin de 0,2mg/ml. De lo que surge la siguiente regla de tres, lo cual
permite determinar los mg de ARN que representarn el eje X de la curva de
calibracin:

0,2 mg 1ml
X

0,25ml

X1= 0,05 mg

0,2 mg 1ml
X

0,5ml

X2=0,1 mg

GRFICO N1.

0,2 mg 1ml
X

1ml

X3= 0,2 mg

0,2 mg 1ml
X

2 ml

X4= 0,4 mg

Curva de calibracin de los tubos patrones en la determinacin de ARN

1.4

1.2

f(x) = 3.04x

0.8

Abs

0.6

0.4

0.2

0
0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

mg ARN
En el eje X los mg.ARN y en el eje Y la absorbancia. La lnea de
tendencia parte desde el cero. Solo coinciden dos puntos. La
pendiente obtenida= 3,043.

TABLA N3. TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA DE LA MUESTRA

Muestra
de
Gallus

Higado

gallus

Transmitancia
51

Absorbancia
0,292

domesticus

Los mg de ARN son determinados por la siguiente frmula:

Y =mx +b

b tiende a 0, por tanto m es la pendiente y x los mg de ARN. De all surge

que:
||m(mg.

ARN )

Despejando lo anterior se obtiene:

||

m
mg . ARN =

Sustituyendo el valor de la pendiente obtenido en la curva de calibracin y el

valor de absorbancia de la muestra de rgano (hgado) en Gallus gallus
domesticus:
Higado de Gallus gallus domesticus:
||

m
mg . ARN =

0,292
mg . ARN = 3,043 =0,0959 mg ARN .

Se deben calcular los gramos de peso hmedo para la muestra. A partir de la

siguiente regla de tres tomando en cuenta los gramos de tejido pesado y la
solucin salina:

1,03g tejido 9ml sol sal

X

0,4ml sbn

X=0,045 g ph.

Finalmente,

se divide el valor de mg.ARN/g.ph obtenidos anteriormente para

obtener los mg de ARN totales:

mg . ARN totales=

mg . ARN
g . ph

0,0959mg . ARN
=2,131 mg. ARN / g . ph
0,045 g . ph

DISCUSIN

CONCLUSIONES

Se comprob que la transmitancia y la absorbancia son inversas.

Se obtuvo 0,993mgARN/gph totales en el hgado de Gallus gallus

domesticus.

BIBLI OGRAFA