Mdulo 1.

Muestreo y examen microscpico de los alimentos

Cuando se elaboran alimentos o cuando se tiene que controlar su calidad y/o
seguridad, los anlisis microbiolgicos proporcionan informacin muy valiosa,
respecto a: la calidad de las materias primas, las condiciones sanitarias en que se
proces el alimento, y sobre la efectividad del proceso, especficamente de los
mtodos de conservacin.
Como qumicos sabemos que antes de proceder a un anlisis es indispensable:
tener claro el objetivo de un anlisis,
identificar los analitos adecuados y las tcnicas para determinarlos, y
planear correctamente el tipo y la forma de muestreo y de manejo de
las muestras.

Parte A.
PLANES DE MUESTREO Y CRITERIO MICROBIOLGICO
ICMSF es la Comisin Internacional para la Especificacin Microbiolgica de los
Alimentos (en ingls, International Comssion on Microbiological Specification for
Food) y forma parte de la Organizacin Mundial para la Salud (OMS). Est
constituida por representantes de la mayora de los pases en el mundo. ICMSF
surgi por la necesidad de regular el comercio internacional de alimentos
estableciendo lmites microbiolgicos, mtodos de anlisis y de muestreo.
Existen diversos mtodos de muestreo, pero el de ICMSF est siendo adoptado
rpidamente por la industria de alimentos relacionada con el comercio internacional.
La calidad de los alimentos
Segn Adams y Moss (2000), la calidad de los alimentos depende de 3 factores:
Seguridad. Un alimento no debe contener ciertos niveles de microorganismos
patgenos o de sus toxinas que causen enfermedades cuando ste se consuma.
Aceptabilidad. Un alimento no debe contener niveles de microorganismos tales
que lo conviertan en organolpticamente inaceptable en poco tiempo.
Consistencia. La calidad de los alimentos debe ser consistente, es decir, no
mostrar variaciones de lote a lote, tanto desde el punto de vista de seguridad
como de aceptabilidad.
Para determinar la calidad de un alimento se debe tomar una muestra y suponer que
la calidad de esa muestra refleja la del lote del que fue tomado. La validez de esta
extrapolacin depender de la representatividad de las muestras y de la exactitud y
precisin del anlisis. De ah la importancia de establecer un plan de muestreo
adecuado.
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Es necesario entonces contar con un criterio microbiolgico para determinar si un

alimento es de buena o de mala calidad, evaluando la seguridad del alimento, el
seguimiento de buenas prcticas de manufactura, la vida de anaquel y la utilidad o
adecuabilidad de un alimento o ingrediente para cierto propsito (Smoot y Pierson,
1997).
Segn la Comisin Internacional para la Especificacin Microbiolgica de Alimentos
(ICMSF, 2002), deben incluirse los siguientes factores en un criterio
microbiolgico:
Una descripcin del alimento al que aplica el criterio, ya que al diferir en origen,
composicin y procesamiento, cada alimento representa diferentes problemas de
descomposicin y de seguridad.
Una descripcin de los microorganismos o toxinas capaces de causar problemas.
Detalles de los mtodos analticos para detectar o cuantificar esos
microorganismos o toxinas.
El nmero y tamao de muestra que debe ser tomado de un lote de alimento.
Los lmites microbiolgicos apropiados, de acuerdo con el alimento y el
microorganismo a analizar.

PLANES DE MUESTREO (ICMSF, 2002)

Un plan de muestreo debe incluir un procedimiento de muestreo y un criterio de
decisin.
Una muestra es un grupo de unidades que se sustraen para estimar el carcter de
una poblacin.
La unidad de muestra es cada uno de los elementos que constituyen la muestra.
Un plan de muestreo est descrito por 2 valores: n, que es el nmero de unidades a
analizar y c, que es el nmero mximo de unidades defectuosas aceptables.
Mediante el uso de una curva de operacin caracterstica (para un par
determinado de valores n y c) se puede determinar qu tan discriminante es un plan
de muestreo. En esta curva se grafica la probabilidad de aceptacin de un lote
contra la calidad real del lote (porcentaje de unidades defectuosas). Un plan de
muestreo es ms estricto mientras mayor sea el nmero de unidades analizadas (n)
y menor el nmero mximo de unidades defectuosas a aceptar (c).
El riesgo del productor describe la probabilidad de que un lote aceptable sea
falsamente rechazado (1 - Pa); mientras que el riesgo del consumidor describe la
probabilidad de que un lote malo sea aceptado falsamente (Pa).

Un lote rechazado deber regresarse al productor, ser reprocesado, destruido o

prohibido para el consumo humano.
Para asegurar que la condicin de la muestra tomada sea lo ms similar a la del lote
del que se sustrajo, sta deber ser representativa. Para lograr lo anterior se
sugiere realizar un muestreo al azar o un muestreo estratificado, en el caso que
se esperen diferencias en la calidad del lote.
Se consideran los siguientes principios fundamentales:
n se refiere al nmero de unidades que se sustraen de manera separada e
independiente.
La sustraccin de un nmero grande de unidades pequeas provee mayor
proteccin que la del mismo peso total de muestra en menos unidades.
La muestra real consiste de aqullas unidades que se examinan.
Lo relevante no es la sustraccin de una fraccin del lote, sino el tamao de la
muestra tomada al azar y los criterios de aceptacin y de rechazo.
Cuando no es posible tomar una muestra al azar de todo un cargamento, sino slo
de una seccin accesible, se le llama a esta seccin el marco y los resultados y
conclusiones aplicarn solamente a ste.
Al aumentar el riesgo debe aumentar el nmero y el tamao de las unidades, para
minimizar la probabilidad de aceptar un lote que debera ser rechazado.
A menor uniformidad, ser necesario sustraer un mayor nmero de muestras.
Los anlisis microbiolgicos son laboriosos y lentos y los alimentos son
perecederos. Por estas razones existen presiones polticas o administrativas para
reducir el muestreo. Esto traer como consecuencia el aumento en la probabilidad
de error.
El tamao de la muestra es crtico en situaciones de anlisis de presencia o
ausencia.
MTODOS DE MUESTREO
Existen diferentes tipos de datos:
En el caso de los de atributos, las decisiones se basan en la presencia o ausencia
de algn microorganismo o en el resultado positivo o negativo de una prueba. En los
de medida la variable es continua, como una concentracin o un nmero. Los de
medida pueden ser convertidos en los del tipo atributo estableciendo un valor lmite.
Planes de 2 clases (Figura 1).
Son aqullos en los que la muestra se divide en dos clases, despus de analizar las
unidades:
Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m se consideran
aceptables.
Las unidades con las que se obtengan valores mayores de m se consideran
defectuosas.

Se pudo haber realizado una prueba para determinar la presencia o ausencia de un

microorganismo o una para determinar una cuenta microbiana o la concentracin de
una toxina. m es un valor crtico arriba del cual la unidad analizada se considera
defectuosa.
Planes de 3 clases (Figura 2).
Son aqullos en los que la muestra se divide en tres clases, despus
unidades:
Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m
aceptables.
Las unidades con las que se obtengan valores entre m y M
marginalmente aceptables.
Las unidades con las que se obtengan valores mayores de M
defectuosas.

de analizar las
se consideran
se consideran
se consideran

En ambos casos la probabilidad de aceptacin depender de los valores n y c

seleccionados.
Las ventajas del uso de los planes de tres clases son:
De acuerdo con la experiencia prctica, an observando buenas prcticas de
manufactura, algunas unidades pueden resultar en el rango marginalmente
aceptable, sin causar problemas, y se pueden aceptar.
Se afectan menos por cambios en la distribucin de microorganismos dentro de un
lote, debidos a causas desconocidas.
Permiten advertir aumentos en los riesgos, si existe una tendencia de aumento en
el nmero de unidades marginalmente aceptables.

PLAN DE MUESTREO DE DOS CLASES

n = nmero de unidades a analizar
c = nmero mximo de unidades defectuosas que se pueden aceptar
m = Cantidad que distingue aceptables de defectuosas

Aceptables

Defectuosas

Figura 1 Planes de muestreo de dos clases.

PLANES DE 3 CLASES
Resultados cuantitativos
Concentraciones

Aceptables

Marginalmente

Defectuosas

aceptables

Figura 2 Planes de muestreo de 3 clases.

En la Figura 3 se presenta un diagrama de flujo sugerido por el ICMSF (2002) para la
seleccin del tipo de plan de muestreo.

Medicin del microorganismo por:

Pruebas de presencia o ausencia
concentracin

Plan de dos clases

Es posible aceptar la presencia de

este microorganismo en el alimento?

NO
SI
c=0
c0

Seleccionar
Seleccionar
n
nyc

Pruebas

de

Plan de tres clases

Seleccionar n y c

Figura 3 Seleccin del tipo de plan de muestreo.

Curvas de operacin
Una curva de operacin (Figura 4) es la que se obtiene al graficar la probabilidad de
aceptacin, con valores entre 0 y 1 y el porcentaje real de unidades defectuosas del
lote (considerando que se hubieran analizado cada una de las unidades del lote). Se
presenta en la Figura 4 la curva de operacin para el plan de muestreo n = 5 c = 0;
o sea que para considerar que la calidad del lote es buena analizarse 5 unidades del
lote y no se acepta ninguna unidad defectuosa. Entonces cuando el lote no contiene
ninguna unidad defectuosa la probabilidad de aceptacin es de 95% y cuando
contiene 45% de unidades defectuosas, con el plan establecido, la probabilidad de
rechazo sera de 95%.
El efecto de n y c en la rigurosidad del plan de muestreo
En la Figura 5 se presentan las curvas de operacin para diversos valores de n y c.
Se presentan 4 figuras con curvas para diferentes valores de n (5, 10,15 y 20) y en
cada figura se presentan curvas de operacin para diferentes valores de c. Como se
puede observar, la Pa disminuye cuando n aumenta y cuando el valor c disminuye.

Es posible entonces, modificando los valores de n y c, disear planes de muestreo

tan estrictos como se requiera.

Figura 4 Curva de operacin caracterstica para el plan de muestreo n=5, c=0.

(ICMSF, 2002).

Figura 5 Efecto de los valores n y c en la rigurosidad del plan de muestreo (ICMSF,

2002).
SELECCIN DEL PLAN DE MUESTREO
Para seleccionar un plan de muestreo adecuado es necesario considerar:
1. La seriedad del tipo de riesgo segn el microorganismo a analizar.
2. Las condiciones a las que se expondr el lote del alimento.
Tipo de riesgo.
El plan de muestreo deber ser ms estricto mientras mayor sea el riesgo que
implique el tipo de microorganismo a analizar. Los factores a considerar en el tipo de
riesgo son:
Mdicos y epidemiolgicos, que incluyen la severidad clnica de la enfermedad
producida, su frecuencia, duracin, la infectividad del microorganismo, la
posibilidad de ocurrencia del estado portador y la extensin potencial.
Etiolgicos, como la asociacin inherente con riesgos severos, como ocurre en el
caso de Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, Entamoeba
histolytica, Taenia solium y Taenia saginata, que sobreviven y se multiplican en el
hombre, daan su salud, amenazan su vida y presentan dosis infectivas
pequeas, o como Clostridium botulinum, que produce una toxina fatal.
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 Factores clnicos. Se debern tomar en cuenta las altas tasas de mortalidad

ocasionadas por enfermedades como la disentera y el botulismo, las secuelas
severas de la accin de Streptococcus beta-hemoltico, la convalescencia larga de
enfermedades como la fiebre tifoidea, la paratifoidea, la brucelosis y la
vulnerabilidad de nios, ancianos y enfermos.
Factores epidemiolgicos. La propensidad de ciertos tipos de microorganismos
patgenos de encontrarse distribuidos ampliamente en el reino animal, las
costumbres locales, los estndares de higiene, la asociacin entre ciertos tipos de
patgenos con ciertos alimentos, las costumbres dietticas y de la preparacin de
los alimentos.
Se clasifica entonces a los microorganismos o grupos de microorganismos de
acuerdo al tipo de riesgo que representan en:
Sin riesgo a la salud. Se incluye aqu a los grupos microbianos responsables de la
descomposicin de alimentos, que disminuyen su aceptabilidad, su vida de anaquel,
pero que como grupo de microorganismos no se considera que causen dao a la
salud.
Riesgo indirecto. Se considera a los microorganismos indicadores, como los
microorganismos mesfilos aerobios, los coliformes totales y fecales, los enterococos
y Staphylococcus aureus, que indican (de manera indirecta) la posible presencia de
microorganismos patgenos.
Riesgo moderado de extensin moderada. Son microorganismos ubicuos en la
naturaleza y la enfermedad que producen est relacionada con nmeros grandes del
patgeno.
Riesgo moderado de extensin amplia. Incluye microorganismos que presentan
riesgos epidemiolgicos severos. Son diseminados por alimentos especficos, pero
pueden introducirse al alimento por contaminacin ambiental o cruzada. La
enfermedad resulta de inculos relativamente pequeos.
Riesgo severo. Los microorganismos incluidos en este grupo presentan riesgos
severos a la salud.
En la Tabla 1 se presenta una clasificacin de microorganismos y parsitos de
acuerdo con los criterios anteriores. Se debe mencionar que sta no es una
clasificacin rgida, ya que se debe tomar en cuenta que lo que para un adulto
normal representa un riesgo moderado, para un adulto, un beb o un enfermo puede
ser un riesgo severo.
Efecto de las condiciones a las que se expondr el alimento.
Dependiendo de la naturaleza del microorganismo y de la del alimento, existen
condiciones que pueden provocar:

 Aumento del riesgo. ste puede ocurrir por recontaminacin despus del
procesamiento, uso de tal manera que permita la multiplicacin de
microorganismos, cuando la coccin no ocurre inmediatamente antes del
consumo.
El riesgo no se modifica.
Disminucin del riesgo. Por ejemplo, cuando se sabe que se aplicar al alimento
un procesamiento trmico.
Combinando estos dos aspectos, el ICMSF propone que se consideren 15 casos,
as como un plan de muestreo para cada uno (Tabla 2).
Determinacin de los valores m y M.
El valor m se define como el nivel de microorganismos aceptable y obtenible con
buenas prcticas de manufactura. Puede tener un valor de cero o de ausencia de
cierto microorganismo, o el nivel de detectabilidad de una prueba, o un valor
numrico.
El valor M es un nivel de contaminacin riesgoso, provocado por malas prcticas
higinicas.
Microorganismos de descomposicin: sern los niveles de microorganismos que
producen una descomposicin detectable (olor o sabor) o una vida de anaquel
inaceptablemente corta.
Indicadores de sanidad: niveles que indican una condicin de sanidad inaceptable.
Microorganismos que presentan un riesgo a la salud: los niveles de
microorganismos (o concentracin de toxinas) que producen enfermedades.
Tabla 1 Agrupacin de microorganismos y de parsitos de acuerdo al tipo de
severidad del riesgo (Smoot y Pierson, 1997).
Tipo de riesgo
Riesgo severo

Organismo
Clostridium botulinum tipos A, B, E y F
Shigella dysenteriae
Salmonella typhi serotipos paratyphi A y
B
Escherichia coli enterohemorrgica
virus de la hepatitis A y E
Brucella abortus, Brucella suis
Vibrio cholerae 01
Vibrio vulnificus
Taenia solium

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Riesgo
moderado
de
potencialmente amplia

extensin Listeria monocytogenes

Salmonella spp.
Shigella spp.
otras cepas enterovirulentas de E. coli
Streptococcus pyogenes
Rotavirus
Virus del grupo Norwalk
Entamoeba histolytica
Diphyllobotrium latum
Ascaris lumbricoides
Criptosporidium parvum
Riesgo moderado de extensin limitada Bacillus cereus
Campylobacter jejuni
Clostridium perfringens
Staphylococcus aureus
Vibrio cholerae no 01
Vibrio parahaemolyticus
Yersinia enterocolitica
Giardia lamblia
Taenia saginata

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Tabla 2 Planes de muestreo sugeridos por el ICMSF (2002) para las diferentes
combinaciones de riesgo a la salud y condiciones de uso.

Grado de riesgo
Sin riesgo directo,
vida de anaquel,
descomposicin
Riesgo a la salud
Bajo,
indirecto
(indicadores)
Moderado, directo,
extensin limitada
Moderado, directo,
extensin amplia
Severo, directo

Condiciones en las que se espera que el alimento sea

manejado y consumido despus del muestreo
Condiciones
que Condiciones
que Condiciones
que
reducen el riesgo
no modifican el incrementan
el
riesgo
riesgo
Vida de anaquel Sin cambio
Vida de anaquel
aumenta
disminuye
Caso 1
Caso 2
Caso 3
3 clases
3 clases
3 clases
n = 5, c = 3
n = 5, c = 2
n = 5, c = 1
Riesgo disminuye Riesgo no cambia Riesgo aumenta
Caso 4
Caso 5
Caso 6
3 clases
3 clases
3 clases
n = 5, c = 3
n = 5, c = 2
n = 5, c = 1
Caso 7
Caso 8
Caso 9
3 clases
3 clases
3 clases
n = 5, c = 2
n = 5, c = 1
n = 10, c = 1
Caso 10
Caso 11
Caso 12
2 clases
2 clases
2 clases
n = 5, c = 0
n = 10, c = 0
n = 20, c = 0
Caso 13
Caso 14
Caso 15
2 clases
2 clases
2 clases
n = 15, c = 0
n = 30, c = 0
n = 60, c = 0

Referencias
Adams M.R., Moss, M.O. (2000). Food Microbiology. The Royal Society of Chemistry,
Gran Bretaa.
Doyle M.P., Beuchat L.R., Montville T.J. (2001). Food Microbiology. Fundamentals
and Frontiers. ASM Press, Washington, D.C.
ICMSF (2002) Microorganisms in Foods 7. Microbiological Testing in Food Safety
Kluwer Academic/Plenum Publishers. E.U.

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Smoot L.M., Pierson M.D. (1997) Indicator microorganisms and microbiological

criteria. En: Doyle M.P., Beuchat L.R., Montville T.J. (Eds) Food Microbiology,
Fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington, D.C. 66-80.

Parte B.

EXAMEN MICROSCPICO DEL ALIMENTO

Cuando se tiene un alimento alterado por microorganismos en descomposicin y

cuando se sospecha que un alimento est involucrado en una ETA, es importante
hacer un examen microscpico directo del alimento o de una de las primeras
diluciones; la microbiota que se encuentra en una tincin de Gram de dicha
preparacin puede orientar al analista sobre el problema, an cuando los
microorganismos pueden no estar viables. Por ejemplo la presencia de gran
cantidad de cocos Grampositivos puede implicar la presencia de toxina
estafilocccica, an si los cultivos resultan negativos, ya que el calentamiento puede
destruir a la bacteria pero no a la toxina.
Si se encuentran cantidades importantes de bacilos Grampositivos esporulados,
conviene considerar el manejo que ha tenido el alimento (refrigeracin, tratamiento
trmico, condiciones aerbicas o anaerbicas) y relacionarlas con los posibles
contaminantes.
La presencia de bacilos Gramnegativos se debe relacionar con los sntomas y
periodos de incubacin, para buscar alguno de los gneros posiblemente implicados:
Salmonella, Shigella, Escherichia, Yersinia, Vibrio, Campylobacter.
A continuacin se describe el mtodo para el examen microscpico de alimentos en
general:
Equipo
Microscopio ptico

Material y muestras
Alimento homogenizado o dilucin 10-1.
Portaobjetos previamente marcados
Asa microbiolgica

Reactivos
Colorantes de Gram
Metanol
Xilol (xileno dimetil-bencenos)
PRECAUCIN: Flamable, evitar exposicin en embarazo

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Procedimiento
0. En esta prctica NO SE UTILIZA MECHERO por el xilol, que es muy voltil y
flamable. Aplique las muestras con pipeta Pasteur.
1. Hacer preparaciones fijas, secar al aire y fijar con metanol durante 1 a 2 minutos,
escurrir, enjuagar y secar al aire.
2. Desengrasar las muestras de alimentos (que lo requieran), sumergiendo en xilol
por 2 minutos; escurrir, lavar en metanol para eliminar el exceso de xilol, ya que
es insoluble en agua, escurrir y secar.
PRECAUCIN: El xileno es muy flamable y es txico. NO USAR MECHEROS
CUANDO SE USA XILOL. EVITAR LA INHALACIN. EMPLEAR LENTES DE
PROTECCIN. EVITAR LA EXPOSICIN EN EL EMBARAZO.
3. Teir las preparaciones con el mtodo de Gram
4. Examinar al microscopio, con 1000x y aceite de inmersin. Se deben examinar al
menos 10 campos de cada preparacin, buscando los tipos predominantes de
microorganismos, en particular costridia, cocos Grampositivos y bacilos
Gramnegativos.
Para el examen microscpico de huevo congelado y en polvo, as como de leche
bronca, el mtodo se aplica de manera cuantitativa, aplicando una cantidad
conocida de muestra en una superficie definida.

Referencias
CFSAN. 2006. Bacteriological Analytical Manual (online). USFDA. Disponible a
travs de Internet en: http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-2.html
International Labour Organisation. (ILO). 2002. International Chemical Safety Cards
(ICSC). P-xylene. International Occupational Safety and Health Information Centre.
Disponible a travs de Internet en:
http://www.ilo.org/public/english/protection/safework/cis/products/icsc/dtasht/_icsc00/i
csc0086.htm

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