La Ciencia Del Diagnostico Del Laboratorio

La ciencia
del diagnstico
de laboratorio
Segunda edicin
La ciencia
del diagnstico
de laboratorio
Segunda edicin
John Crocker
Department of Cellular Pathology,
Birmingham Heartlands Hospital,
Bordesley Green East, Birmingham, UK
David Burnett
Micropathology, LTD
University of Warwick Science Park
Sir William Lyons Road
Coventry CV4 7EZ, UK
Traduccin:
QFB Carina Amador Vzquez
Revisin tcnica:
Dr. Cs. Ismael Vsquez Moctezuma
MXICO BOGOT BUENOS AIRES CARACAS GUATEMALA LISBOA

MADRID NUEVA YORK SAN JUAN SANTIAGO SAO PAULO
AUCKLAND LONDRES MILN MONTREAL NUEVA DELHI
SAN FRANCISCO SINGAPUR ST. LOUIS SYDNEY TORONTO
Director Editorial: Marco Antonio Tovar Sosa

Editor Sponsor: Fausto Acosta Garca
Editor de desarrollo: Camilo Heras Martnez
Supervisor de produccin: Olga Snchez Navarrete
Diseo de portada: Utopa visual
NOTA
La medicina es una ciencia en constante desarrollo. Conforme surjan nuevos conocimientos, se
requerirn cambios de la teraputica. El(los) autor(es) y los editores se han esforzado para que
los cuadros de dosificacin medicamentosa sean precisos y acordes con lo establecido en la
fecha de publicacin. Sin embargo, ante los posibles errores humanos y cambios en la medicina,
ni los editores ni cualquier otra persona que haya participado en la preparacin de la obra garantizan que la informacin contenida en ella sea precisa o completa, tampoco son responsables
de errores u omisiones, ni de los resultados que con dicha informacin se obtengan. Convendra
recurrir a otras fuentes de datos, por ejemplo, y de manera particular, habr que consultar la hoja
informativa que se adjunta con cada medicamento, para tener certeza de que la informacin de
esta obra es precisa y no se han introducido cambios en la dosis recomendada o en las contraindicaciones para su administracin. Esto es de particular importancia con respecto a frmacos
nuevos o de uso no frecuente. Tambin deber consultarse a los laboratorios para recabar informacin sobre los valores normales.
LA CIENCIA DEL DIAGNSTICO DE LABORATORIO

Prohibida la reproduccin total o parcial de esta obra,
por cualquier medio, sin la autorizacin escrita del editor.
DERECHOS RESERVADOS 2007 respecto a la primera edicin en espaol por

McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES. S.A.DE C.V.
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Piso 17, Colonia Desarrollo Santa Fe,
Delegacin lvaro Obregn
C.P. 01376, Mxico, D.F.
Miembro de la Cmara Nacional de la Industria Editorial Mexicana, Reg. Nm. 736
ISBN-13: 978-970-10-6200-5
ISBN-10: 970-10-6200-0
Translated from the Second English edition of
The science of laboratory diagnosis
By: John Crocker and David Burnett
Copyright 2005 by: John Wiley & Sons, Ltd.
The Atrium, Southern Gate, Chichester,
West Sussex PO 19 8SQ England
All rights reserved
ISBN (original): 0-470-85912-1
1234567890
Impreso en Mxico
09865432107
Printed in Mexico
A nuestras familias con amor
Faith is a fine invention

When Gentlemen can see
But microscopes are prudent
In an Emergency
Emily Dickinson
Contenido
Prefacio a la primera edicin
xv
Prefacio a la segunda edicin
xvii
Lista de colaboradores
SECCIN 1
HISTOPATOLOGA
Editor de seccin
xix
John Crocker
Manipulacin y preparacin de la muestra

para el diagnstico histopatolgico
de rutina
Mtodos indirectos
Mtodos de mltiples etapas
Aplicaciones de la inmunohistoqumica
Control de calidad
Automatizacin
Proyeccin de imagen
Lecturas adicionales
Tinciones generales
Introduccin
Principios de la tcnica y de la organizacin de la ME
Aplicaciones de la microscopia electrnica
de transmisin
Tcnicas y procedimientos especializados
Resumen
Reconocimientos
Bibliografa
3
3
4
4
5
7
11
13
15
15
Introduccin
Diseo bsico del microscopio
Tipos de microscopia
Micrografa
17
Histoqumica de la enzima
17
17
20
25
25
25
Inmunohistoqumica
27
27
28
29
35
Jane Starczynski y John Crocker

Introduccin
Mtodos directos
35
35
Mtodos cuantitativos en la patologa

tisular
Introduccin
Mtodos
Aplicaciones de la medicin en la patologa
diagnstica
Automatizacin en histologa
Conclusin
27
31
34
34
48
54
59
59
60
60
61
61
61
63
66
67
69
Peter W Hamilton y Derek C Allen
Trevor Gray y Neil Hand

Introduccin
Estructura y clasificacin
Conservacin y preparacin
Tcnicas histoqumicas
Aplicaciones diagnsticas de la histoqumica
enzimtica
Conclusin
Referencias
Microscopia de luz
44
Brian Boullier
Barrie Sims
Por qu la tincin?
Mecanismos bsicos de tincin
Mtodos comunes de tincin
Conclusiones
Agradecimientos
43
Brian Eyden
P.J. Smith y J.L. Warfield

Introduccin
Sistemas para manipular la muestra
Recepcin y manipulacin de la muestra
Fijacin y descalcificacin
Preparacin e inclusin del tejido
Microtoma
Tcnicas especiales
Lectura adicional
Reconocimientos
Microscopia electrnica en patologa
35
35
41
41
41
41
42
Marcadores de la proliferacin
en histopatologa
69
69
75
79
81
81
83
Cheryl E Gillett y Diana M Barnes

Introduccin
Marcadores de proliferacin
Uso prctico de marcadores
Mtodo de evaluacin
Conclusin
83
83
88
89
92
92
viii
CONTENIDO
SECCIN 2
CITOLOGA
93
12
Citopatologa
95
Adrian T Warfield
Introduccin
Tipos de muestra citolgica
Tcnicas para la preparacin de frotis
Fijacin de la muestra
Tcnicas de concentracin celular
Mtodos de tincin
Citodiagnstico
Citomorfologa
Exactitud y limitaciones de la citologa
Citopatologa ginecolgica y exploracin cervical
Aseguramiento de la calidad en la citologa
diagnstica
SECCIN 3
MICROBIOLOGA - BACTERIOLOGA
Editor de seccin
10
95
95
99
99
99
103
104
105
112
113
13
119
119
121
14
123
123
123
124
Pruebas automatizadas en bacteriologa
145
145
145
146
148
149
150
150
Tcnicas de bacteriologa molecular:

preparacin y aplicacin de la muestra 151
Necesidad de mtodos moleculares
Preparacin de la muestra
Amplificacin
Control de calidad
Prctica actual
Epidemiologa y tipificacin
Problemas con los mtodos moleculares
Aplicacin futura
151
151
152
153
153
156
156
157
157
Otras pruebas en bacteriologa
159
124
125
125
128
15
Darrel Ho-Yen
Introduccin
Pruebas para el anticuerpo
Pruebas para el antgeno
Prueba del complejo inmunitario especfico
del antgeno
Otras pruebas
Desarrollos futuros
129
Eric Y Bridson
Medios de cultivo en microbiologa
Formulacin de los medios de cultivo
Enriquecimiento y seleccin en medios fluidos
Medios de cultivo qumicamente definidos
medios complejos indefinidos
Factores ambientales de crecimiento
Actividad del agua (aw)
Almacenaje de los medios de cultivo
Pruebas de calidad
El futuro de los medios de cultivo
Microbiologa cuntica
135
135
136
140
144
Richard E Holliman y Julie D Johnson
Microscopia en bacteriologa:
aplicacin y preparacin de la muestra 123
Medios de cultivo en bacteriologa
Introduccin
Identificacin directa
Identificacin despus del cultivo
Identificacin de bacterias de importancia mdica
Introduccin
Sistemas de cultivo sanguneo
Comprobacin de la sensibilidad antimicrobiana
y sistemas de identificacin
Sistemas de examen de la orina
Sistemas de identificacin y
sensibilidad antimicrobiana para micobacterias
Comentario
Dugald R Baird
11
135
Paul C Boreland
Darrel Ho-Yen
Introduccin
Microscopia de luz
Microscopia de fluorescencia
Muestras para microscopia
Examen de muestras sin teir por
transmisin de luz
Examen de muestras sin teir mediante
iluminacin de fondo oscuro
Tincin de las muestras
Identificacin de bacterias
Andrew J Hay
Editor de seccin Adrian T Warfield
129
130
131
131
132
132
132
133
134
134
134
16
Control de la quimioterapia
antimicrobiana
159
159
162
162
163
164
164
165
Ian M Gould
Introduccin
Principios generales del control del laboratorio
de la quimioterapia
Comprobacin de la sensibilidad
165
167
168
ix
CONTENIDO
Automatizacin
Control del hospital y enlace clnico
Conclusin
169
170
171
171
21
Introduccin
Automatizacin en el laboratorio
de diagnstico
Debe automatizarse el Laboratorio?
Otros desarrollos en la automatizacin
Conclusiones
SECCIN 4 MICROBIOLOGA, VIROLOGA,

MICOLOGA Y PARASITOLOGA
173
Editor de seccin
17
Darle Ho-yen
Microscopia en virologa: aplicacin

y preparacin de la muestra
175
22
18
175
176
177
178
180
180
180
Microscopia electrnica en virologa
181
19
Cultivo tisular
181
181
182
187
187
188
188
189
23
20
Pruebas serolgicas en virologa
197
Goura Kudesia
Introduccin
Principios
Tcnicas
Interpretacin y uso de las pruebas serolgicas
Futuro de la serologa
197
197
198
203
204
205
Virologa: otras pruebas

Deteccin de la enfermedad por prion
Diagnstico
Pruebas de susceptibilidad antivrica
Inmunidad mediada por clulas
24
209
210
212
212
212
213
213
213
220
222
222
225
Micologa
225
227
228
231
232
233
David W Warnock
Introduccin
Examen microscpico
Cultivo
Identificacin
Pruebas serolgicas
Nuevas direcciones en el diagnstico
191
191
191
192
193
193
196
196
207
Alex WL Joss
William L Irving y Alan Pawley

Introduccin
Seleccin de los cultivos celulares
Preparacin de cultivos celulares
Especmenes clnicos para el aislamiento de virus
Identificacin del crecimiento vrico
Conclusiones
Tcnicas moleculares en virologa

Introduccin
Tcnicas de amplificacin del cido nucleico
Anlisis de la secuencia
Resumen
175
Hazel Appleton
Introduccin
Mtodos
Usos de la microscopia electrnica
Laboratorio de virologa
Reaccin rpida de urgencia
Virus de nueva aparacin
Conclusiones
207
Paul E Klapper
Marie M Ogilvie
Introduccin
Histopatologa: cuerpos de inclusin y clulas
multinucleadas gigantes
Virologa
Inmunofluorescencia
Examen microscpico de los cultivos celulares
Desarrollos
Reconocimientos
Pruebas automatizadas en virologa

Roger P Eglin
25
Parasitologa
233
234
235
236
237
238
238
239
Robert WA Girdwood
Introduccin
Microscopia
Montajes hmedos
Extendidos y frotis
Histopatologa
Fluorescencia
Microscopia electrnica
Cultivo
Infeccin animal
Xenodiagnstico
Serologa
Mtodos moleculares
239
239
240
240
241
241
241
242
242
242
243
243
244
CONTENIDO
SECCIN 5
HEMATOLOGA
Editor de seccin
26
Adherencia plaquetaria
Investigaciones de la agregacin plaquetaria
Analizador PFA-100 para la funcin plaquetaria
Investigaciones sobre la liberacin plaquetaria
Citometra de flujo
Tromboelastograma
245
Peter E Rose
Morfologa de las clulas sanguneas

y de la mdula sea
247
Supratik Basu
Morfologa de la sangre perifrica
Examen y morfologa de la mdula sea
Clulas no hematopoyticas y parsitos en sangre
y mdula sea
27
Principios de los contadores

automatizados de clulas sanguneas
247
249
31
263
263
Identificacin del grupo sanguneo

Mtodos para identificar el grupo sanguneo
Tamizaje de anticuerpos
Compatibilidad cruzada
Prctica de la transfusin
265
28
Mtodos para la identificacin

de hemoglobinopatas
265
265
265
267
268
269
271
295
Steven Walton y Peter E Rose
Graham Martin
Introduccin
Medicin de la Hb
Mediciones de los eritrocitos
Medicin de los reticulocitos y RBC nucleados
Eritrocitos nucleados
Mediciones de los leucocitos
Servicio transfunsional del hospital
291
291
292
292
292
293
293
32
295
296
297
300
301
301
Citometra de flujo y biologa molecular

en la hematologa
303
Ian Chant
Introduccin
Citometra de flujo e inmunofenotipificacin
Valoracin de la funcin plaquetaria por citometra
de flujo
Biologa molecular en la hematologa
Resumen
273
303
304
307
307
310
311
Nick Jackson y Anne Sermon

Introduccin
Tcnicas de tamizaje
Diagnstico de laboratorio de hemoglobinopatas
y de talasemias
Deteccin, identificacin y cuantificacin
de hemoglobinopatas
Agradecimientos
29
Investigaciones especiales del factor

von Willebrand
273
273
33
Cobalamina (vitamina B12) y folato

Hierro
Resumen
34
281
Introduccin
Caractersticas clnicas
Desrdenes hemolticos
Segmento final
281
282
285
287
35
30
Anlisis de plaquetas
289

Introduccin
Estructura y funcin
Conteo plaquetario
Anticuerpos plaquetarios
Tiempo de sangrado
Investigacin del laboratorio

de la hemlisis
313
317
322
322
323
Paul Revell
Mohammad S. Enayat
Introduccin
Pruebas fenotpicas
Pruebas genotpicas para identificar la mutacin
313
Frank Wells
274
274
279
279
Investigaciones hemticas
Investigaciones de laboratorio
de la hemostasis
323
323
326
332
332
333
Peter E Rose y Catherine Caveen

289
289
290
291
291
Introduccin
Tiempo de protrombina
Tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT)
Tiempo de trombina
Tiempo de reptilasa
333
333
335
337
338
xi
CONTENIDO
Fibringeno
Ensayos del D-dmero y de los FDP
Ensayos del factor
Marcadores de la coagulacin activada
Evaluacin automatizada de la coagulacin
Lectura adicional
SECCIN 6
CITOGENTICA
Editor de seccin
36
343
Brian Boullier
Bandeo y anlisis cromosmico
345
Mervyn Humphreys
Introduccin
Bandeo cromosmico
Anlisis cromosmico
37
Marcadores
Ensayos homogneos
Mtodos de separacin
Automatizacin
Miniaturizacin
Clculo de los resultados
Exactitud y precisin
Control de calidad
Especificidad, reactividad cruzada e interferencia
Efecto de gancho por dosis alta
338
339
339
340
341
341
Hibridizacin in situ
fluorescente
40
SECCIN 7
QUMICA CLNICA
345
345
352
355
Introduccin
Teora
Especificidad: cmo los electrodos se hacen
selectivos
Reacciones electroqumicas
Electrodos de glucosa
Detectores electroqumicos
Electrodos complejos
Otros electrodos complejos mediados
por las enzimas
Comprobacin en los puntos de cuidado (POCT)
Respaldo
Reconocimientos
357
357
357
358
358
358
360
361
362
41
Adquisicin, aplicaciones
e interpretacin de los datos
bioqumicos clnicos
363
39
Inmunoensayo en bioqumica
clnica
Introduccin
Tcnicas de absorcin de la luz
Turbidimetra y nefelometra
Luminescencia
42
391
392
393
394
394
395
395
395
397
399
403
Espectrometra atmica analtica
405
Andrew Taylor
365
366
367
371
371
371
Introduccin
Principios
Instrumentacin
Aplicaciones
Aseguramiento de la calidad
Conclusiones
Referencias
405
405
407
413
414
414
415
373
43
Joan Butler y Susan M Chambers

Introduccin
Diseo del ensayo
Condiciones del ensayo y calibradores
384
386
389
390
390
365
William J Marshall
Introduccin
Recoleccin y anlisis de la muestra
Interpretacin de los datos de laboratorio
Bioqumica clnica basada en evidencia
Conclusin
Absorcin de la luz, dispersin

y tcnicas de luminiscencia
en bioqumica clnica rutinaria
381
381
Bernard F Rocks
Editor de seccin William J Marshall
38
381
Alan D Hirst
Ivor Hickey
Eleccin de la sonda
Marcacin de las sondas
Hibridacin
Deteccin de la sonda hibridada
Aplicaciones en la investigacin bsica
Aplicaciones en la gentica mdica
Aplicaciones en el diagnstico e investigacin
del cncer
Electrodos ion-selectivos
375
376
376
377
377
377
378
378
379
380
380
373
373
374
Tcnicas qumicas del reactivo seco
417
JA Schroeder, JC Osypiw y GS Challand

Introduccin
Principios de la metodologa
417
418
xii
CONTENIDO
Ejemplos especficos
Control de calidad de la qumica del reactivo seco
Resumen
44
Tcnicas de separacin
419
423
427
427
49
Introduction
Estructura y funcin de HLA
Gentica del complejo principal de
histocompatibilidad (MHC)
La mecnica de tipificacin HLA
Tipificacin molecular
Resumen
429
SECCIN 8
INMUNOLOGA
Editor de Seccin
45
429
429
429
431
433
434
436
SECCIN 9
50
437
46
Ensayos del complemento
51
47
Inmunologa celular
447
447
449
453
455
Aarnoud Huissoon
Introduccin
Pruebas cuantitativas y cualitativas
Estudios funcionales
El futuro de la inmunologa celular
455
455
459
463
463
487
Microdiseccin por lser y captura

de tejido
489
489
492
493
493
Anlisis del gen por reaccin en cadena

de la polimerasa (PCR) en tiempo real 495
Cara M Martin, Orla Sheils y John O Leary
J North y K Whaley
Introduccin
Ensayos de los niveles sricos del complemento
482
482
483
486
John OLeary
LCM-PixCell y AutoPix de Arcturus

Microdiseccin con microrrayo lser
Leica AS LMD
439
439
439
440
443
446
446
446
481
481
Orla Sheils, Paul Smyth, Esther ORegan,

Stephen Finn, Richard Flavin y John OLeary
David Burnett
Introduccin
Una breve perspectiva histrica
Tcnicas cualitativas
Mtodos cuantitativos
Conclusin
Reconocimientos
PATOLOGA MOLECULAR
Editor de seccin
David Burnett
Ensayos proteicos
481
Mark Hathaway
Roy Sherwood
Por qu separar?
Cromatografa
Cromatografa de capa fina (TLC)
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
Cromatografa de gases (GC)
Electroforesis
Tipificacin de HLA
52
Introduccin
Qumica de la reaccin en cadena de la
polimerasa en tiempo real
Qumica de la TaqMan de PCR (ensayo de la
5nucleasa)
Sondas TaqMan de unin al surco menor del DNA
Iniciador TaqMan y diseo de la sonda
Deteccin del amplicn
Deteccin por TaqMan en tiempo real
Cuantificacin absoluta
Cuantificacin relativa
Genes housekeeping
Aplicaciones de TaqMan PCR en patologa
Referencias
495
496
498
498
499
500
500
500
500
501
504
Reaccin en cadena de la polimerasa

en la clula
505
495
John OLeary, Cara M Martin y Orla Sheils
48
Enfermedades del complejo

inmunitario y crioglobulinas
465
Siraj A Misbah
Introduccin
Ensayos para los complejos inmunitarios circulantes
Enfermedad srica
Lupus eritematoso sistmico
Crioglobulinemia
Lecturas complementarias
465
466
467
468
477
480
Introduccin
Visin general de la metodologa
Tecnologas de PCR celular: definiciones
Amplificacin del DNA en la clula
Deteccin de los amplicones
Reaccin de amplificacin, controles y deteccin
en el tejido para uso en ensayos de PCR DNA
en la clula
Amplificacin del RNA en la clula
Problemas de la amplificacin por PCR en la clula
505
505
506
508
510
510
511
511
xiii
CONTENIDO
Trabajo futuro con los ensayos basados en la PCR

en la clula
Referencias
53
Anlisis de SNP de alta densidad

y de arreglos de cDNA
515
Orla Sheils, Cara M Martin, Paul Smyth,

Jon Sherlock, Stephen Finn, Esther ORegan,
Steve Picton y John OLeary
Introduccin
Tecnologa Affymetrix GeneChip
Perfil de SNP y matrices de DNA
Sistema de expresin con microarreglo de Applied
Biosystems
Ilumina, microarreglo de ordenamientos
Manejo de datos y anlisis secundario
Referencias
54
Anlisis por microarreglo de la

hibridacin genmica comparativa
de los tejidos humanos
55
515
515
517
517
519
521
521
523
Esther ORegan, Paul Smyth, Stephen Finn,

Cara M Martin, Orla Sheils y John OLeary
Antecedentes de hibridacin genmica comparativa
(CGH) y de su microarreglo
Apreciacin global de hibridacin genmica

comparativa
Aplicaciones clnicas
Microarreglos
Conclusin
Referencias
513
513
Secuenciacin de cidos
desoxirribonucleicos
531
Cara M Martin, Steven J Picton,

Orla Sheils y John OLeary
Introduccin
Historia de la secuenciacin del cido
desoxirribonucleico
Secuenciacin qumica del cido
desoxirribonucleico
El mtodo dideoxi de secuenciacin del DNA
Secuenciacin automatizada
Proyecto del Genoma Humano
reas que avanzan en la secuenciacin
de los cidos nucleicos
Referencias
ndice alfabtico
523
524
525
525
528
528
531
531
532
532
534
536
537
538
538
539
Prefacio a la primera edicin

Tanto nosotros como nuestros colegas hemos encontrado
en nuestra experiencia de muchos aos que las personas de
todos los niveles que trabajan en nuestros laboratorios no
tienen experiencia en algunos aspectos. Nos hemos dado
cuenta que existe la necesidad de un libro que una todas
las disciplinas de la patologa, el cual pueda explicar los
porqu y para qu de la medicina de laboratorio. Debemos
enfatizar que este material no intenta ser un libro de recetas; nuestro objetivo es mucho mayor que explicar los
principios bsicos de las tcnicas de laboratorio y la interpretacin de los resultados que se obtienen de ellos. Hemos
tratado de asegurar que este libro lo puedan utilizar varios
tipos de lectores. Estos podran incluir estudiantes, patlogos, cirujanos y mdicos, as como tcnicos de laboratorio.
Los contenidos son multidisciplinarios y existe coincidencia entre algunos captulos y secciones. Esto es intencionado y refleja el estado verdadero de la patologa moderna.
Sentimos que es importante que los patlogos de cada subespecialidad muestren ms inters por la actividad de sus
colegas de laboratorio. Este libro tiene la intencin de presentar los mtodos ms comunes y sus avances ms recientes. Otra vez se enfatiza que la unin entre la patologa y la
medicina de laboratorio es forzada aunque con frecuencia
conveniente. Sin embargo, esperamos que los profesionales de una especialidad lean otras secciones. Por ejemplo,
para trabajar el campo de los linfomas, los histopatlogos
necesitan entender bien la hematologa y la microbiologa.
Lo anterior, por supuesto, interviene en el tratamiento del
linfoma en los pacientes, como la microbiologa cuando se
presentan infecciones oportunistas despus de la quimioterapia. Adems, los qumicos necesitan relacionar sus descubrimientos a los procesos hematolgicos.
Otra caracterstica de este libro es que en algunas partes,

existen coincidencias entre captulos y secciones; esto es
completamente intencional y refleja una vez ms el estado actual del laboratorio clnico. As, la aplicacin, contextos e interpretacin de varios mtodos inevitablemente
sern diferentes dependiendo de la disciplina. El lector ser
avisado de esta particularidad en las secciones cubriendo
temas como la microscopia de electrones y tcnicas moleculares, que son metodologas que forman parte de manera extensa de diferentes disciplinas. Es ms, los problemas
de comunicacin producen un efecto de deterioro evitable
en los avances de metodologas de uso comn y de investigacin. En nuestro conocimiento este libro es nico
y esperamos que d los elementos a mucha gente capacitada o en capacitacin en medicina de laboratorio no slo
en su propio campo sino tambin en otros. La mayora de
los captulos incluye una lista de las principales referencias
aunque en algunos casos lo hemos credo innnecesario;
adems, algunos captulos tienen una lista de referencias
grande que puede reflejar su complejidad o su contenido
de gran alcance. Por supuesto, deseamos expresar nuestra
garatitud a todos nuestros editores de seccin y los autores
de los captulos. Naturalmente, tambin estamos en deuda
con nuestro editor John Harrison y su equipo. Extendemos nuestro agradecimiento a Ruth Fry, Vivien Garland y
Valerie Griffiths por su ayuda en la asistencia y respuesta a
las interminables llamadas telefnicas.
John Crocker
David Burnett
John Crocker (1952-2004)

John Crocker demostr en su relativa corta vida un conocimiento agudo y un profundo inters en la ciencia de muchas formas. Fue premiado en el Kings College, Cambridge, a
la edad de 16 aos. Despus, estudi medicina. Su primer libro, de cerca de 250 pginas,
lo realiz en su tercer ao en Cambridge, los resultados de su tesis de patologa. Ah fue en
donde John conoci a su pareja de toda la vida y esposa, Kate. Despus de su examen, John
decidi estudiar patologa. Su primer puesto fue en el East Birmingham Hospital (ahora el
Birmingham Heartlands Hospital), del cual regres como colaborador despus de siete aos
en el Departamento de Patologa en la University of Birmingham, durante los cuales obtuvo
su M.D. Fue ah donde desarroll su inters por la investigacin de linfomas.
John disfrutaba su trabajo en el Departamento de Histopatologa en el Heartlands Hospital,
especialmente gracias a su buena relacin con sus colaboradores. A pesar de haber contribuido al diagnstico usual, servicios de enseanza y administrativos del departamento, John
trat de mantener una carrera activa de investigador, colaborando con otros patlogos y cientficos, especialmente de las universidades de Warwick, Birmingham y Wolverhampton; sus
dos ltimas ctedras. Con Jane Starczynski y sus colaboradores, desarroll tcnicas nicas
en la disciplina. Sus aportaciones a la patologa fueron reconocidas en un evento de admisin
poco usual, en 1995, como miembro honorario del Royal College of Physicians. Con gran
inters que inclua astronoma, msica, literatura contempornea, biologa marina, computacin, arte, fotografa, qumica y geologa, es claro que John fue polifactico. Su naturaleza
eclctica fue parte de su trabajo y sus creencias que los patlogos de todas las disciplinas
tienen mucho que aprender del otro, y efectivamente, de otras disciplinas cientficas, fue el
filsofo detrs del libro que tiene en sus manos. Por desgracia, John muri antes de que su
segunda edicin se publicara. Todos sus familiares, amigos y colegas lo recordaremos no
slo como un cientfico extremadamente inteligente y entusiasta, sino tambin como un hombre jovial y bondadoso con un profundo sentido de compasin. Deseo dedicar este segunda
edicin a su memoria.
David Burnett, marzo 2005
Prefacio a la segunda edicin

Han pasado seis aos desde la primera edicin de este libro
y actualmente tenemos un nuevo editor, John Wiley & Sons,
que convino que era oportuno poner al da este volumen.
Los autores siempre estn entusiasmados de tener la
oportunidad de mejorar lo que escribieron y esto se refleja
aqu. Tambin es la oportunidad de actualizar ciertas reas
debido al rpido desarrollo en esos campos, aunque, inevitablemente, hay algunos captulos a los que se les ha cambiado el ttulo. Algunos captulos ahora tienen nuevo autor
o incluyen otros. Las razones son varias. En algunos casos,
los autores han recibido apoyo de nuevos colaboradores y

otros se han retirado desde la publicacin de la primera edicin. De forma trgica, un autor, Graeme Bird, muri. No
obstante, la esencia del libro contina, aunque el estilo ha
cambiado inevitablemente a consideracin de los editores
actuales, quienes quieren agradecer todo su apoyo, especialmente al Dr. Joan Marsh. Tambin queremos agradecer
a Ruth Fry por su asistencia.
John Crocker
David Burnett
Lista de colaboradores
Derek C Allen Histopathology Laboratory, Belfast City
Hospital, Belfast BT9 7AD, UK
Hazel Appleton Health Protection Agency, Specialist
and Reference Microbiology Division, 61 Colindale Avenue, London NW9 5TH, UK
Dugald R Baird Formerly Department of Microbiology, Lanarkshire Acute Hospitals NHS Trust, Hairmyres
Hospital, Eaglesham Road, East Kilbride G75 8RG,
UK
Diana M Barnes Hedley Atkins/Cancer Research UK
Breast Pathology Laboratory Guys Hospital, St. Thomas
Street, London SE1 9RT, UK
Supratik Basu Pathology Laboratory, Warwick Hospital, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK
Paul C Boreland Microbiology Department, Ulster Hospital, Dundonald, Beifast BT16 1RH
Brian Boullier Illuminate Communications, The Beacons, Leeds Road, Lightcliffe, Halifax HX3 8NU, UK
Eric Y Bridson Formerly Oxoid Ltd, 3 Bellever Hill,
Camberley, Surrey BU15 2HB, UK
David Burnett Micropathology Ltd. University of
Warwick Science Park, Sir William Lyons Road, Coventry
CV4 7EZ, UK
Joan Butler Honorary Lecturer, Guys, Kings and St.
Thomass School of Medicine, London
Catherine Caveen Department of Haematology, Warwick
Hospital, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK
G S Challand Department of Clinical Biochemistry,
Royal Berkshire Hospital, Reading, Berkshire RG1 5AN,
UK
Susan M Chambers Department of Clinical Biochemistry, Kings College Hospital, Denmark Hill, London SE5
9RS, UK
Ian Chant Department of Heamatology, Warwick Hospital, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK
John Crocker Department of Cellular Pathology, Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East,
Birmingham B9 5SS, UK
Roger P Eglin National Transfusion Microbiology Laboratories National Blood Service, Colindale Ave Colindale, London NW95BG
Mohammad S Enayat Molecular Heamostasis Laboratory, Birmingham Childrens Hospital NHS Trust,
Ladywood, Birmingham B16 8ET, UK
Brian Eyden Department of Histopathology, Christie
Hospital NHS Trust, Manchester M20 4BX, UK
Stephen Finn Department of Histopathology, Trinity
College, Dublin, Dublin, Ireland
Richard Flavin Department of Histopathology, Trinity
College, Dublin, Dublin, Ireland
Cheryl E Gillett Hedley Atkins/Cancer Research UK
Breast Pathology Laboratory, Guys Hospital, St. Thomas
Street, London SE1 9RT, UK
Robert WA Girdwood formerly Scottish Parasite Diagnostic Laboratory, Stobhill Hospital, Balornack Road,
Glasgow, G21 3UW
Ian M Gould Department of Medical Microbiology,
Medical School, Foresterhill, Aberdeen AB9 2ZB, UK
Trevor Gray Histopathology Department, Queens Medical Centre, University Hospital NHS Trust, Nottingham
NG7 2UH, UK
Peter W Hamilton Department of Pathology, The
Queens University of Belfast, Grosvenor Road, Belfast
BT12 6BL, UK
Neil Hand Histopathology Department, Queens Medical Centre, University Hospital NHS Trust, Nottingham
NG7 2UH, UK
Mark Hathaway National Blood Service, Vincent Drive,
Selly Oak, Birmingham B15 2SG, UK
Andrew J Hay Department of Microbiology, Raigmore
Hospital, Old Perth Road, Inverness IV2 6DJ, UK
xx
LISTA DE COLABORADORES
Ivor Hickey School of Biology and Biochemistry, Medical Biology Centre, Queens University Belfast, 97 Lisburn
Road, Belfast BT9 7BL, UK
Alan D Hirst Department of Biochemistry, Bradford
Royal Infirmary, Duckworth Lane, Bradford BD9 6RJ,
UK
Richard E Holliman Department of Medical Microbiology, St. Georges Hospital and Medical School,
Blackshaw Road, London SW17 0QT, UK
Darrel
Ho-Yen Department
of
Microbiology,
Raigmore Hospital, Old Perth Road, Inverness IV2
6DJ, UK
AP Huissoon Regional Immunology Department, Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East,
Mervyn Humphries Northern Ireland Regional Genetics Centre, Leukaemia Cytogenetics Laboratory, Floor A,
Belfast City Hospital, Tower Block, Lisburn Road, Belfast
BT9 7AB, UK
Siraj A Misbah Department of Immunology, Churchill

Hospital, Old Road, Headington, Oxford OX3 7LJ, UK
Jonathan North Department of Immunology, City Hospital, Dudley Road, Birmingham B18 7QH, UK
Marie M Ogilvie Division of Medical Microbiology,
College of Medicine and Veterinary Medicine, University
of Edinburgh, Edinburgh, UK
John OLeary Department of Pathology, The
Coombre Womens Hospital Dublin, Ireland; and Department of Histopathology, Trinity College Dublin, Dublin,
Ireland
Esther ORegan Department of Histopathology, Trinity
College Dublin, Dublin, Ireland
Jacqueline C Osipiw Department of Clinical Biochemistry, Royal Berkshire Hospital, Reading, Berkshire RG1
5AN, UK
Alan Pawley Virology Laboratory, Queens Medical
Centre Trust, Nottingham, UK
William L Irving Department of Virology, University of

Nottingham, Nottingham, UK
Steven J Picton Affymetrix UK Ltd, Wooburn Green,

Hight Wycombe HP10 0HH, UK
Nick Jackson Department of Heamotology, University

Hospital Coventry and Warwickshire NHS Trust, Clifford
Bridge Road, Coventry, UK
Paul Revell Department of Haematology, Staffordshire General Hospital, Weston Road, Stafford ST16
3SA, UK
Julie D Johnson Department of Medical Microbiology, St. Georges Hospital and Medical School, Blackshaw
Road, London SW17 0QT, UK
Bernard F Rocks Department of Clinical Pathology,

Royal Sussex County Hospital, Brighton, Sussex BN2
5BE, UK
Alex WL Joss Microbiology Department Raigmore

Hospital NHS Trust, Perth Road, Inverness IV2 3UJ,
UK
Peter E Rose Department of Haematology, Pathology

Laboratory, Warwick Hospital, Lakin Road, Warwick CV34
5BJ, UK
Paul E Klapper Department of Virology, Health Protection Agency, Leeds Laboratory, Bridle Path, York Road,
Leeds LS15 7TR, UK
Jessica Schroeder Department of Clinical Biochemistry, Royal Berkshire Hospital, Reading, RG1 5AN
Goura Kudesia Department of Virology, Northern

General Hospital NHS Trust, Herries Road, Sheffield S5
7BQ, UK
William J Marshall Consultant Clinical Biochemist,
The London clinic, 20 Devonshire Place, London W79
6BW
Anne Sermon Department of Haematology, Nottingham City Hospital, Hucknall Road, Nottingham NG5
1PB, UK
Orla Sheils Department of Histopathology, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
Jon Sherlock
Applied Biosystems, Applera, UK
Cara M Martin Department of Histopathology, Trinity

College Dublin, Dublin, Ireland
Roy A Sherwood Department of Clinical Biochemistry, Kings College School of Medicine and Dentistry,
Bessemer Road, London SE5 9PJ, UK
Graham Martin Heamotology Department, Gloucester Hospitals NHS Trust, Great Westerm Road, Gloucester
GL1 3NN
Barrie Sims Department of Histopathology, Staffordshire General Hospital, Weston Road, Stafford ST16
3SA, UK
LISTA DE COLABORADORES
xxi
Paul J Smith Department of Cellular Pathology, Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East,
Adrian T Warfield Department of Histopathology,

Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green
East, Birmingham B9 5SS, UK
Paul Smyth Department of Histopathology, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
Janine L Warfield Birmingham Heartlands Hospital,

Bordesley Green East, Birmingham B9 5SS, UK
Jane Starczynski Department of Cellular Pathology,

Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green
East, Birmingham B9 5SS, UK
David W Warnock Division of Bacterial and Mycotic

Diseases, National Center for Infectious Diseases, Center
for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333,
USA
Andrew Taylor Trace Element Laboratory, School of

Biological Sciences, University of Surrey, Guildford, Surrey GU2 5XH, and Clinical Laboratory, Royal Surrey
County Hospital, Guildford Surrey GU2 5XX, UK
Steven Walton Department of Haematology, Warwick
Hospital, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK
Frank Wells Biochemistry Department Warwick Hospital, Lakin Road, Warwick, CV34 5BJ
Keith Whaley Department of Immunology, Leicester
Royal Infirmary, Leicester LE1 5WW, UK
SECCIN 1
HISTOPATOLOGA
1
Manipulacin y preparacin de la muestra
para el diagnstico histopatolgico de rutina
PJ Smith y JL Warfield
Introduccin
La histopatologa diagnstica es una especialidad que, incluso hoy en da, no ha dejado de ser una labor en particular intensa, sobre todo si se considera que en esta rea el
desarrollo de la tecnologa automatizada ha sido discreto
y an toman tiempo sus procedimientos. Las mquinas que
procesan y tien cortes, como parte integral de cualquier
laboratorio de histologa comn, son cada vez ms complejas en trminos de su aplicacin y contribucin a un ambiente de salud y seguridad. El registro manual de casetes
para procesar tejidos y el portaobjetos del microscopio se
ha vuelto en poco tiempo obsoleto desde la introduccin
de sistemas de transcripcin independientes conectados a
una computadora. Los sellos hermticos y automatizados
tambin son comunes en muchos laboratorios y hacen posible minimizar la exposicin del personal a los solventes
orgnicos; en consecuencia, los laboratoristas pueden concentrarse en las tareas manuales del departamento y no en
las labores de montaje.
El moderno laboratorio de histopatologa, aunque se ha
beneficiado en cierto grado con la automatizacin y el continuo desarrollo de mejoras del equipo estndar, es todava
un rea sensible a las cargas de trabajo. La posibilidad de
renovacin se relaciona de manera directa, primero, con
la capacidad de procesamiento y, segundo, con el personal
disponible para realizar las tareas requeridas para obtener
los cortes histopatolgicos teidos necesarios para el examen microscpico subsiguiente y el diagnstico patol-
gico. Muchos laboratorios modernos han experimentado

aumentos notables de la carga de trabajo en los ltimos
aos, como resultado de nuevos lineamientos y fusiones,
sin un aumento correspondiente de la contratacin de personal. De manera inevitable, estos laboratorios han mejorado sus metodologas y tcnicas para no sucumbir a las
exigencias del alto rendimiento y proporcionar un servicio
de calidad eficiente.
La intencin de este captulo es proporcionar una sinopsis de la preparacin de tejidos en el moderno laboratorio de histopatologa, con nfasis en la eficiencia y calidad
del servicio. Rebasa los lmites de este estudio explicar, en
cualquier grado, la qumica o los pormenores de la preparacin del tejido. La descripcin debe ser suficiente para
conocer de forma general las tcnicas y estandarizar la
histopatologa de rutina en el diagnstico de laboratorio.
La preparacin de las muestras de tejido para el diagnstico se analiza bajo los siguientes ttulos:
1. Sistemas de control de la muestra.
2. Recepcin y manipulacin de la muestra.
3. Fijacin y descalcificacin.
4. Procesamiento e impregnado.
5. Microtoma.
6. Tcnicas especiales.
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker,
2005 John Wiley & Sons, Ltd.
CAP. 1
MANIPULACIN Y PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNSTICO HISTOPATOLGICO DE RUTINA
Sistemas para manipular la muestra

La mayor parte de los laboratorios modernos de histopatologa tiene su propia tecnologa de informacin departamental para almacenar y obtener los datos demogrficos
y muestrales del paciente. El sistema de registro manual o
computarizado del enfermo se debe situar dentro del rea de
reserva del laboratorio. Esta ubicacin debe separarse del
cuarto de corte y, en condiciones ideales, localizarse en
un ambiente de oficina, integrada al rea administrativa del
laboratorio.
Sistemas de informacin computarizados
Una de las funciones esenciales de un sistema de control
computarizado de la muestra consiste en facilitar la asignacin de los identificadores especficos del hospital y de
la muestra: nmero de registro hospitalario y nmero del
laboratorio de referencia. El primero debe tener el formato
de solicitud histolgica y colocarse en la muestra de acompaamiento. El segundo lo asigna de manera automtica
el sistema, pero tambin es posible el procedimiento manual. El nmero del laboratorio permanece con la muestra
en todo el proceso histolgico y se transfiere a la forma
de solicitud, el (los) contenedor(es) de la muestra, el (los)
casete(s) del tejido, el portaobjeto(s) del microscopio y
el informe final del diagnstico.
Los patlogos, el responsable del laboratorio, las secretarias y las reas del laboratorio requieren terminales para
facilitar el ingreso y la codificacin de los informes diagnsticos, datos muestrales, generacin de la lista de trabajo, procedimientos tcnicos adicionales, seguimiento de la
muestra (fases del procedimiento), relacin especfica de
tejido, y trastornos y recoleccin de datos para determinar
la carga de trabajo, las condiciones laborales y los costos.
Ingreso manual de datos
El ingreso manual de datos, mediante un libro diario quirrgico, y el etiquetado de los casetes del tejido y los portaobjetos del microscopio tienen ms desventajas que un
sistema de laboratorio computarizado. Los sistemas manuales confan en la letra legible y clara, y la asignacin
exacta de los nmeros progresivos del laboratorio para una
persona. Los errores de transcripcin pueden ocurrir durante la transferencia del nmero de laboratorio a los casetes del tejido y portaobjetos del microscopio si la letra
asentada en el libro diario, o en la solicitud, es confusa.
El marcado impreciso o ilegible de los casetes del tejido
puede ocasionar que los bloques del tejido se vinculen mal
con las formas de solicitud y portaobjetos, y por lo tanto, es
posible, en el mejor de los casos, establecer un diagnstico

equvoco si dos tejidos son similares o perder un tiempo
valioso en el laboratorio mientras se resuelve la situacin.
Es esencial en todos los laboratorios, tanto si se utiliza un
sistema manual o uno computarizado, que medidas de control rigurosas garanticen la integridad del informe diagnstico final.
Los sistemas manuales requieren la disposicin de un
archivo de referencia cruzada, un registro diagnstico y
amplias instalaciones para almacenar los informes y las
formas de solicitud.
La calidad de la informacin que procesa el departamento de servicio depende de la solicitud o los informes
que proporcione la administracin hospitalaria (o los sistemas de comunicacin si es que se dispone de una red por
computadora).
Al realizar el ingreso de datos, manual o computarizado, las formas de solicitudes se anexan a su respectivo
contenedor(es) de la muestra y los recipientes se marcan
de modo indeleble con el nmero de laboratorio. Algunos
centros asignan el nmero de laboratorio, antes de asentarlo en el registro, mediante rollos preimpresos de nmeros
secuenciales autoadhesivos.
Marcadores de casete y portaobjetos automticos
Los marcadores de casete y portaobjetos estn disponibles
en el comercio y pueden utilizarlos todos los laboratorios.
Las instituciones que efectan el ingreso manual de los datos confan tambin en el ingreso manual de estas mquinas,
del mismo modo que los laboratorios que tienen sistemas
informticos genricos menos comunes. Los laboratorios
con sistemas ms complejos pueden interconectarse con
estas mquinas, de tal modo que el marcado del casete y el
portaobjetos se convierte en un procedimiento automtico
ligado, por ejemplo, al registro de datos y la generacin
de la lista de trabajo, respectivamente. El advenimiento de
estas mquinas ha permitido el etiquetado preciso de casetes y portaobjetos y reducido el error de transcripcin a
mrgenes mnimos (fig. 1-1).
Recepcin y manipulacin de la muestra

Cuarto de corte
La estancia diseada para la prctica de los cortes debe estar disponible para la recepcin y manipulacin de todas las
muestras tisulares que requieren un diagnstico histopatolgico. Esta sala debe estar por completo separada de otras
adaptaciones del laboratorio, contar con buena iluminacin
y ventilacin y proporcionar las reas para el desempaque,
FIJACIN Y DESCALCIFICACIN
acero, un cuchillo cerebral, tijera, tijeras intestinales, sondas, una fuente de luz amplificadora, pinzas atraumticas
intestinales y pinza de diseccin para la manipulacin de
biopsias y cortes de tejido. El equipo de proteccin personal debe incluir batas u overoles, mandiles, guantes quirrgicos y resistentes al corte, gafas, viseras, cubrebocas y
respiradores (usados en la etapa de desechar la muestra).
La sala de corte puede, donde hay espacio disponible,
alojar las mquinas que procesan tejidos. Los procesadores
pueden ser por completo cerrados, aprobados por Health
and Safety, o abiertos, y deben incluirse en un gabinete
ventilado para contener los vapores del solvente.
Fijacin y descalcificacin
Figura 1-1 Marcadores Leica IP C e IP S para casete y portaobjetos.
correlacin y diseccin de la muestra. El almacenamiento

de los tejidos fijados con formalina (mojados), despus de
la diseccin, puede tambin ser una funcin del cuarto
de cortes. Los almacenadores para muestras construidos
a la medida y ventilados estn disponibles en el mercado y
se pueden incorporar a las salas de corte ms grandes o
alojarse de modo conveniente en un rea separada, usada
de forma especfica para guardar las muestras.
Las precauciones con el formaldehdo son la primera
preocupacin en esta rea y se legislan de manera conjunta en las secciones Health and Safety Act (1974) y Containment of Substances Hazardous to Health (COSHH)
Regulations. El formaldehdo es el fijador ms usado en
el laboratorio moderno de histologa y se discute ms adelante. Hasta la fecha, el rea de corte de la muestra debe
contar con un equipo de extraccin que incluya un banco
de diseccin adaptado a un sistema de extraccin que haga
circular los humos lejos del usuario. El banco debe incluir
un lavabo integral, con agua corriente caliente y fra, para
lavar las muestras y limpiar el rea despus de la desinfeccin con el agente qumico apropiado. El rea de diseccin
del banco debe inclinarse hacia el lavabo para facilitar el
drenaje de la formalina lejos de las muestras fijadas e incluir un tablero de diseccin de polipropileno, o resistente
al corte, para el examen y corte de las biopsias fijadas y de
rganos enteros.
Un equipo estndar de corte debe incluir una regla de
acero inoxidable, un bistur y un mango con hojas de corte intercambiables y lminas PM40, cuchillos de mano de
Cuando se retiran los tejidos del cuerpo experimentan diversos cambios degenerativos, como la autlisis y la putrefaccin. La primera es la descomposicin de las clulas y
los componentes del tejido por accin de enzimas propias
del cuerpo; la segunda es el cambio degenerativo del tejido
como consecuencia de la accin bacteriana.
Objetivos de la fijacin
La fijacin debe detener la autlisis y la putrefaccin y preservar las clulas y los componentes tisulares en un estado
tan natural como sea posible. El fijador no debe propiciar
la contraccin, inflamacin o endurecimiento del tejido y
debe estabilizarlo pese al rigor del proceso. Por ltimo, el
fijador debe complementar y mejorar los subsecuentes procedimientos histolgicos de tincin, inmunohistoqumicos
y de biologa molecular. En trminos amplios, stas son las
exigencias de un fijador ideal. Sin embargo, la fijacin
depende en realidad de la conjuncin de estos requisitos.
Fijadores
Los fijadores simples son soluciones de un solo qumico,
por ejemplo metanol, etanol, cido actico glacial y formaldehdo; stos, que carecen de aditivos, pueden inducir algunos de los artefactos ya mencionados si se usan
solos. Los fijadores compuestos son mezclas de fijadores
simples que se han formulado para compensar y reducir
al mnimo los artefactos de la fijacin, como el lquido
de Carnoy (etanol-cloroformo-cido actico), que se recomienda para la fijacin de cidos nucleicos.
Ambos tipos de fijadores reaccionan con las protenas
de dos maneras. Los coagulantes, como lo sugiere su nombre, coagulan la protena del tejido, por ejemplo el etanol.
Los fijadores no coagulantes, como el formaldehdo, for-
CAP. 1
man enlaces cruzados (reticulaciones) con la protena del

tejido.
Duracin de la fijacin
La fijacin adecuada es esencial para todas las tcnicas
histolgicas posteriores. Una demora en la colocacin de
un tejido en el fijador o la infiltracin inapropiada del fijador antes del proceso pueden afectar la interpretacin morfolgica y el anlisis histoqumico o inmunohistoqumico.
La extensin de la fijacin depende de la densidad del tejido y la velocidad de penetracin del fijador. Tejidos ms
blandos y menos densos se penetran en menos tiempo que
los tejidos fibrosos y seos. El grado de penetracin de los
fijadores vara entre uno y otro; por ejemplo, el glutaraldehdo y el lquido de Carnoy son ms rpidos en su accin
que el formaldehdo. Para facilitar la fijacin minuciosa, en
los laboratorios de histologa es comn describir primero y
seccionar despus muestras densas grandes. De modo alternativo, el fijador se puede inyectar en un rgano entero y
se calienta en un horno de microondas o una incubadora.
Formaldehdo como fijador de rutina
El fijador utilizado de forma ms extensa en los departamentos de histopatologa es la formalina al 10% (formaldehdo al 4%) y sus derivados. El formaldehdo es soluble
en agua a un mximo de 40% por peso (formalina al 100%)
y est disponible en el comercio como solucin al 40%, con
la adicin de 10 a 14% de metanol como estabilizador. En
condiciones normales se diluyen 10 partes de formalina al
100% con 90 partes de agua, amortiguador salino fisiolgico o de fosfato para obtener la solucin de trabajo al 10%.
La formalina no amortiguada puede adquirir acidez permanente debido a la formacin de cido frmico. ste reacciona con la sangre en tejidos muy vascularizados, como el
bazo, para producir un pigmento negro llamado hematina
formalina cida. Esto ocurre casi siempre despus de una
fijacin prolongada; las soluciones amortiguadas de formalina resuelven este artefacto de la fijacin.
La formalina tiene un olor acre y es un intenso irritante
de los ojos, la piel y las membranas mucosas; en algunos
trabajadores puede causar dermatitis por contacto. El personal que manipula esta sustancia debe someterse a una
valoracin respiratoria anual de sensibilizacin. Los lmites mximos de exposicin recomendados son una parte
por milln y los grados de exposicin deben supervisarse
con regularidad. Las soluciones de formalina deben manipularse de forma cuidadosa en cuartos bien ventilados
que dispongan de extractores para vapores; asimismo, debe
usarse ropa protectora, como guantes, capas de laboratorio,
gafas y respiradores.
La formalina reacciona para formar enlaces cruzados (reticulaciones) entre las protenas. Las protenas solubles se fijan a las estructurales y ello suministra fuerza al tejido y hace
posible el proceso siguiente. La formalina no fija los carbohidratos sino el glucgeno cuando se adhiere a una protena
fijada. Es un buen fijador para los lpidos complejos.
El calor y la agitacin aceleran el proceso de fijacin. El
tiempo recomendado para la fijacin de tejidos en formalina es de 24 a 48 horas; el tiempo ptimo es de siete a 10
das. Las mquinas modernas cerradas que procesan tejido
pueden calentar los reactivos (40 a 45C) durante el procedimiento y, por lo tanto, el proceso de fijacin puede acelerarse. Los tejidos recibidos en el laboratorio se deben sumergir
por completo en el fijador cinco a 10 veces su volumen.
No existe un fijador ideal, pero la formalina al 10%
tiene la ventaja de preservar una amplia variedad de tejidos. La formalina es tolerable y permite llevar a cabo
con posterioridad una histoqumica adecuada. El tejido
se puede almacenar por largos periodos sin sufrir efectos
dainos en el ncleo, el citoplasma o la morfologa total
de la muestra. No es el fijador de eleccin para la inmunohistoqumica o biologa molecular, pero muchos de los
problemas derivados de su uso pueden superarse con
los pretratamientos apropiados del tejido.
Otros fijadores de uso general
El glutaraldehdo es a menudo el fijador de eleccin

para el tejido que requiere la microscopia electrnica, ya
que proporciona una buena preservacin de la ultraestructura celular. Es un sensibilizador respiratorio y tiene
un vnculo evidente con la denominada asma industrial.
Deben observarse las medidas de seguridad adecuadas
al usar glutaraldehdo. Su uso como desinfectante en las
caeras se ha proscrito en muchos hospitales.
El tetraxido de osmio se emplea como fijador secundario en microscopia electrnica, por lo regular despus de la fijacin primaria en glutaraldehdo. Fija los
lpidos y tambin preserva la estructura fina de la clula.
El tetraxido de osmio es txico y exige tambin la institucin de medidas de seguridad adecuadas.
El dicromato de potasio se puede utilizar para identificar tumores medulares suprarrenales, macroscpicos
y microscpicos. Reacciona con las catecolaminas medulares suprarrenales y produce un precipitado negro
o marrn que es insoluble en agua. No conviene como
fijador general cuando penetra el tejido lentamente y
causa contraccin.
El alcohol penetra el tejido con rapidez y se puede usar

junto con otros fijadores para aumentar la velocidad de
PREPARACIN E INCLUSIN DEL TEJIDO
la fijacin. El etanol absoluto preserva al glucgeno,

pero distorsiona el contorno nuclear y altera la contraccin del citoplasma. El fijador de Carnoy es un buen
fijador para los cidos nucleicos, si bien propicia la contraccin del tejido y la lisis de los eritrocitos; consiste en
etanol absoluto, cloroformo y cido actico glacial.
Pueden emplearse diversos aditivos en los fijadores. Por

ejemplo, las soluciones de cido tnico, fenol o metales
pesados se pueden adicionar a la formalina para incrementar el grado de penetracin y de esa manera mejorar
la preservacin o favorecer los procedimientos subsecuentes de teido.
La fijacin por vapor mediante fijadores voltiles permite la retencin de sustancias solubles in situ y las
convierte en productos insolubles antes de que entren
en contacto con los solventes. Este mtodo es de uso
frecuente junto con la liofilizacin. Los fijadores convenientes para esta tcnica incluyen al formaldehdo, el
tetraxido de osmio y el alcohol.
Los hornos de microondas son recursos en la fijacin

para conservar el tejido mediante la accin del propio
calor o acelerar el proceso de fijacin, como se describi con anterioridad.
Descalcificacin
El hueso o los tejidos que contienen material calcificado
requieren la descalcificacin antes del proceso para permitir la microtoma estndar (es posible realizar el corte
en huesos an calcificados cuando es necesario cuantificar
este elemento). Se pueden emplear varios lquidos descalcificantes, incluidos cidos como el ntrico, agentes quelantes como el cido diaminotetraactico de etileno (EDTA),
una combinacin de ambos, o soluciones disponibles en el
comercio. El calor aplicado a las soluciones descalcificantes, mediante un horno de microondas o la incubadora, se
puede aplicar para acelerar el proceso de la descalcificacin. El tiempo prolongado en un lquido descalcificante,
en especial en las soluciones cidas, puede daar la morfologa del tejido y afectar de manera adversa la calidad de
las tcnicas subsecuentes. El lmite de la descalcificacin
puede determinarse con la prueba qumica de la solucin,
los rayos X o, con ms frecuencia, la evaluacin manual.
Preparacin e inclusin del tejido

El tejido fijado y estabilizado se somete a continuacin a la
microtoma, que implica la preparacin de cortes gruesos
de 1 a 6 m del tejido para el examen microscpico. Para
facilitar este proceso, el tejido debe apoyarse de modo interno y externo. Aunque los protocolos congelantes estn
disponibles para las muestras fijadas y sin fijar de tejido, estos mtodos se emplean casi siempre para la demostracin
de componentes de fijacin lbil o las tcnicas de diagnstico rpidas. Para el diagnstico histopatolgico general,
los tejidos se someten a diversos reactivos, a su infiltracin
y por ltimo al recubrimiento con un medio de apoyo rgido. Casi todos los fijadores son variaciones de la formalina
acuosa al 10% y, en consecuencia, son el objetivo de la preparacin del tejido para sustituirlos, dentro de la muestra,
por la cera de parafina inmiscible en agua. Para lograr esto,
el espcimen se somete a las etapas siguientes:
1. Deshidratacin: el alcohol sustituye al fijador acuoso
dentro del tejido.
2. Clarificacin: un antimedio, como el xileno, reemplaza
al alcohol.
3. Infiltracin: la cera de parafina sustituye a la sustancia
clarificante y se infiltra en el tejido.
4. Inclusin: la cera de parafina encapsula al tejido infiltrado y le proporciona un soporte rgido para la microtoma.
Para asegurar una buena preparacin del tejido es esencial que los cortes no sean mayores de 2 a 3 mm de grosor para las programaciones rpidas o urgentes y de 3 a
5 mm para las programaciones comunes durante la noche
o el fin de semana. Es posible una preparacin deficiente si
el tejido se acumula en el casete del procedimiento, lo que
impide a los reactivos circular con propiedad. Las biopsias
minsculas se pueden colocar en bolsas o casetes de malla
para biopsia, disponibles en el mercado, que pueden dejarse dentro del casete (fig. 1-2a, b).
Factores que afectan el proceso tisular

Temperatura
Los reactivos para la preparacin a bajas temperaturas son
ms viscosos y por tanto su difusin tisular es ms lenta.
Una temperatura de proceso elevada aumenta la energa
cintica de las molculas del reactivo, disminuye la viscosidad del reactivo e incrementa la difusin del reactivo
en el tejido. La calefaccin ligera de los reactivos para la
deshidratacin y la clarificacin, en lmites de 37 a 45C,
acorta en proporcin sustancial los tiempos de preparacin,
pero puede aumentar la contraccin del tejido debido al
efecto del calor sobre la colgena.
CAP. 1
(b)
(a)
Figura 1-2 a) Casete y bolsa de biopsia para la preparacin tisular. b) Contenedor seguro de biopsia celular.
Las temperaturas elevadas en la etapa de la infiltracin pueden provocar la contraccin y el endurecimiento

indebidos del tejido. Esto puede prevenirse con el uso de
temperaturas de 2 a 3C sobre el punto de fusin de los medios de la infiltracin para reducir al mnimo estos efectos.
Sin embargo, la sangre y el msculo pueden an tornarse frgiles durante la infiltracin y, en consecuencia, debe
tambin considerarse el efecto combinado del tratamiento
de la fijacin, el deshidratante y el tipo de tejido.
Vaco y presin
Las mquinas modernas de preparacin tisular incorporan
un ciclo intercambiable de vaco y presin. En la prctica,
la aplicacin de presin durante la deshidratacin y la clarificacin ejerce poco efecto sobre la difusin de los reactivos, aunque puede tener un efecto creciente en la etapa de
la infiltracin. No obstante, la aplicacin de vaco mejora la
deshidratacin, la clarificacin y la infiltracin.
Agitacin
El rea superficial mxima del tejido debe estar disponible
para el intercambio y la circulacin de lquido y reactivo
durante el procedimiento. ste no es el caso cuando los
casetes tisulares permanecen en el fondo del recipiente, se
hallan estticos en el reactivo o se envasan de forma hermtica en la cesta de procesamiento. El rea superficial mxima para el intercambio de lquido se daa y es imposible la
circulacin del reactivo alrededor del tejido; el efecto es el
estancamiento, es decir, el reactivo que circunda al tejido
permanece a una concentracin ms baja y se requiere un
tiempo mucho mayor para la preparacin satisfactoria.
Para conseguir resultados constantes, los casetes tisulares se deben envasar, suspender y agitar en el reactivo para
prevenir la inmovilizacin y posibilitar la circulacin del

medio. La agitacin se puede facilitar con los agitadores y
rotores magnticos para el procesamiento manual, mientras
que las mquinas modernas aplican cualquier movimiento
rotatorio, de arriba abajo, de lado a lado o de marejada.
Deshidratacin, clarificacin,
infiltracin e inclusin
Deshidratacin
La mayor parte de los fijadores tisulares se elabora en solucin acuosa y la funcin del deshidratante es eliminar las
molculas de agua libres y unidas de la muestra. El deshidratante ms empleado para el procesamiento de rutina
en parafina es el etanol al 99.85% que, en virtud de su alto
costo, los laboratorios adquieren en la forma menos costosa de alcohol desnaturalizado industrial (IMS, por sus siglas en ingls) al 99%, que contiene metanol al 2%. Ciertos
lpidos y protenas solubles en agua se eliminan del tejido
durante esta etapa.
Los tejidos se procesan por medio de una concentracin creciente de etanol hasta 99% de IMS (etanol absoluto). El mtodo de fijacin empleado y el tipo de tejido
determinan la resistencia del primer bao con IMS. Las
programaciones comunes del proceso histolgico emplean
IMS al 70% como el primer paso en la deshidratacin
del tejido. Los tejidos delicados pueden necesitar IMS al
50% para un proceso lento, mientras que los tejidos fijados
en un reactivo alcohlico, como el fijador de Carnoy, se
pueden sumergir directamente en varios cambios de IMS
al 99%.
El tiempo de deshidratacin depende del tamao y el
tipo de muestra tisular. En general, los bloques de tejido de
1 mm de espesor requieren 30 minutos en cada gradua-
PREPARACIN E INCLUSIN DEL TEJIDO
cin de alcohol y los bloques de tejido de 5 mm hasta 90

minutos.
Clarificacin
El agente clarificador es un reactivo que puede mezclarse
con la cera de parafina y acta como un enlace entre el deshidratante (no miscible) y la cera de parafina. Los agentes
clarificadores ms empleados para las tcnicas habituales
son los hidrocarburos, como el xileno, el tolueno, el cloroformo y los solventes del petrleo. Estos reactivos, que
regula el COSHH, son sustancias inflamables, eliminan la
grasa de la piel y tienen grados variables de toxicidad. El
tolueno es un posible agente carcingeno, el cloroformo
tiene un efecto narctico y el xileno, aunque no est demostrado que sea un carcingeno, puede causar dolores de
cabeza como efecto secundario de la inhalacin del vapor,
cuando el laboratorio carece de las instalaciones adecuadas
de extraccin (sobre todo en reas desprotegidas y de tincin manual).
Por tales razones, el xileno es quiz el agente clarificador ms utilizado. Pueden usarlo todos los procesadores
tisulares importantes y es relativamente barato. El xileno
se debe adquirir como reactivo libre de benceno (carcingeno) y azufre. La exposicin prolongada al xileno puede
causar endurecimiento tisular excesivo y deben formularse las programaciones del procesamiento para reducir al
mnimo este efecto. Los tejidos de 1 a 2 mm de espesor
requieren dos o tres cambios de xileno en 30 a 60 minutos
y los bloques de 3 a 5 mm de espesor exigen tres cambios
en un lapso de dos a cuatro horas para el proceso normal.
Las funciones de calor y vaco en las mquinas modernas
reducen de forma sustancial estos tiempos.
Infiltracin
La cera de parafina es el medio de eleccin para la infiltracin e inclusin en la histopatologa comn. Es una
mezcla de hidrocarburos policristalinos de cadena lineal
producida a partir de la destilacin y separacin del aceite
mineral crudo. La cera de parafina se caracteriza por su
punto de fusin, que refleja la mezcla de pesos moleculares
de sus hidrocarburos constitutivos. Los puntos de fusin,
aunque no son exactos del todo, se hallan en los lmites
de 39 a 68C; como regla general, cuanto ms alto sea el
punto de fusin, ms dura es la cera. Los tejidos ms blandos se benefician con la infiltracin de ceras con puntos de
fusin ms bajos y los tejidos ms duros, con la infiltracin
de aqullos con un punto de fusin ms alto. Empero, el
procesamiento histopatolgico de rutina es en parte una dificultad debido a la variacin de tamao y la dureza de las
muestras tisulares y el agente clarificador elegido. Para este
fin se emplea la cera de parafina con un punto de fusin

de 56 a 58C. Los tiempos de la infiltracin se ilustran en
el cuadro 1-1. Estos tiempos se reducen de forma considerable si se utiliza vaco, el que resulta esencial para las
muestras del pulmn, en las cuales el vaco fuerza a las molculas de aire atrapadas a abandonar el tejido.
En algunas ceras de parafina se incluyen aditivos para
mejorar su consistencia cristalina, atenuar su dureza y fragilidad y, por lo tanto, mejorar las caractersticas de corte
(microtoma). Entre estas sustancias figuran, entre otras,
las resinas termoplsticas, los polmeros plsticos y el sulfxido de dimetilo, que ayuda a la infiltracin y permite un
corte fino.
Inclusin
La cera de parafina para la inclusin tisular debe estar limpia, filtrada y mantenida a 2 a 4C alrededor de su punto
de fusin. Al trmino de la tcnica, la cesta del tejido se
transfiere a un depsito calentado o un bao fijo libre de
cera. Los tejidos se remueven de sus casetes, uno a la vez,
con pinza calentada y la cara colocada abajo en un molde con cera de parafina fundida. El molde se aplica en una
superficie refrigerada o un recipiente congelado para facilitar la adhesin del tejido a su base. Est disponible una
gran variedad de moldes, entre ellos los moldes de acero
inoxidable de capacidades graduadas que reciben el casete
del procesamiento/inclusin que acta como la plataforma de soporte del tejido; las piezas L de Leuckhart; los recipientes congelados; los botes de metal, y los recipientes
de plsticos desmoldables. Los moldes se dejan en la placa
fra hasta que la cera se solidifica; si no se cuenta con una
forma de refrigeracin, se puede sumergir en agua fra
una vez formada una corteza bastante gruesa en la superficie de la cera. En la actualidad estn disponibles los centros de infusin comerciales, que combinan un almacn de
molde calentado, un depsito/dispensador de cera fundida
y una placa fra (fig. 1-3). Una vez que la cera se solidifica,
los bloques del tejido se pueden desprender con suavidad
de sus moldes y prepararse para la microtoma.
Para la orientacin apropiada de las muestras de tejido, una regla general seala que la superficie inferior del
tejido en el casete debe colocarse cara abajo en el molde.
La orientacin es en extremo importante para el diagnstico efectivo. Una biopsia de piel se debe impregnar en
sentido perpendicular a su superficie para suministrar un
plano correcto de corte. El tejido cilndrico/tubular, como
las trompas de Falopio o los vasos deferentes, se debe impregnar en su extremo, de modo que puedan practicarse
cortes transversales a sus paredes y luz. Es posible utilizar
tinturas especiales para marcar los planos de la reseccin y
observar la orientacin correcta del tejido.
10
CAP. 1
(a)
Figura 1-3 Centro de impregnacin tisular Shandon Histocentre 3 .
Procesadores tisulares automticos

Los procesadores tisulares tipo carrusel abiertos (fig. 1 -4a)
se han sustituido sobre todo con los cerrados (fig. 1-4b), esto
es, mquinas de procesamiento que satisfacen los lineamientos de Health and Safety y tienen capacidades mayores para casetes. Los procesadores abiertos liberan los
vapores del reactivo a la atmsfera cuando la cesta del tejido se mueve entre las fases y, por lo tanto, deben estar
instalados en un rea de extraccin bien ventilada. La agitacin se efecta por un movimiento rotatorio o de riego y
el vaco est disponible en la impregnacin final de la infiltracin de cera. Los tejidos se procesan mediante solventes a
temperatura ambiente.
Los procesadores cerrados son las unidades indepedientes (modulares) que retienen por completo los vapores del
reactivo durante el procedimiento del tejido por medio de
trampas de agua o vapor y filtros de adsorcin con carbn.
Los reactivos se bombean hacia dentro y fuera de un compartimiento/retorta del procesamiento. La agitacin se proporciona bajo la forma de flujo de marejada de los reactivos
dentro y fuera del recipiente o mediante un movimiento
rotatorio de lado a lado. El ingreso de los reactivos se puede mejorar si se alternan los ciclos programables de vaco
y presin, de los cuales el primero es el ms eficaz. Las etapas de deshidratacin y clarificacin se pueden reducir en
grado notorio por la capacidad para calentar los reactivos
(25 a 45C). La tecnologa de microprocesadores permite
que mltiples programaciones del procesamiento se almacenen y recuperen y, en algunas mquinas, hacen posible
el uso simultneo de unidades adicionadas para diversas
programaciones bajo el control de un mdulo regulador.
Programaciones de rutina durante la noche
y rpidas del procesamiento tisular
El cuadro 1-1 muestra una comparacin de las programaciones de rutina durante la noche y rpidas para los pro-
(b)
Figura 1-4 a) Procesador de tejido Leica TP1020. b) Procesador de tejido cerrado Shandon Excelsior.
cesamientos tisulares automticos abierto y encerrado. El

reabastecimiento de los reactivos y los medios de infiltracin de la tcnica son dependientes del volumen de reactivo usado por etapa y el nmero de casetes procesados.
11
MICROTOMA
Cuadro 1-1
Programaciones de rutina durante la noche y rpida para el procesamiento de tejidos

Procesador de tejido abierto
Reactivo
Procesador de tejido cerrado
Rutina durante
la noche (minutos)
Rpida
(minutos)
Vaco
Rutina durante
la noche (minutos)
Rpida
(minutos)
Vaco
60
60
60
60
60
60
60
30
60
60
60
60
90
30
0
0
15
15
30
30
15
15
30
30
30
30
No
No
No
No
No
No
No
No
No
No
No
S
S
30*
30*
30*
30*
30*
60*
60*
30*
30*
30*
30*
60*
60*
15
0
15
15
15
15
15
10
15
15
15
30
30
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Formol salino al10%

Alcohol al 70%
Alcohol al 95%
Alcohol al 100%
Alcohol al 100%
Alcohol al 100%
Alcohol al 100%
Xileno
Xileno
Xileno
Cera de parafina
Cera de parafina
Cera de parafina
* La temperatura del procesamiento es de 45C.
Deben considerarse medidas de seguridad apropiadas y es

esencial el uso del equipo de proteccin personal al decantar estas soluciones.
de consumir demasiado tiempo, algo inadecuado en una

era en la que las cargas de trabajo exigen la fluidez de los
servicios de histopatologa.
Procesamiento por microondas
Micrtomos
La utilizacin de la tecnologa de microondas para el procesamiento rpido de los tejidos se adopt hace ya tiempo.
Es en particular til en procedimientos simples, cuando se
requiere un resultado diagnstico expeditivo de la biopsia,
antes que el paciente egrese de la institucin. Las biopsias
urgentes y las del mismo da tambin se benefician de esta
tecnologa y, lo que es de gran importancia, sin perder la
calidad de la preparacin final.
El micrtomo rotatorio (fig. 1-5) es una mquina de uso

general para la produccin de cortes de tejido semifinos
Microtoma
La microtoma es la ejecucin de cortes finos, de uno a
cinco micrones (m) de grosor, a partir de bloques de tejido embebidos en cera de parafina. Este proceso emplea
un micrtomo y un cuchillo o una hoja de micrtomo desechable, adems del mango de la hoja. Los micrtomos
son de la variedad rotatoria o de base deslizable y estn disponibles en el comercio por innumerables proveedores de equipos de laboratorio. La hoja desechable del
micrtomo ha reemplazado al cuchillo del micrtomo en
las prcticas de los departamentos de histopatologa. Estos
instrumentos deben estar afilados, sea de modo manual (un
procedimiento calificado) o por mquina; esta ltima pue-
Figura 1-5 Microtmo rotatorio Shandon Finesse E.
12
CAP. 1
para microscopia ligera. La rotacin manual de la rueda

montada en un plano lateral hace que el mecanismo de
avance mueva al sostenedor del bloque hacia el cuchillo fijado rgidamente a un espesor preestablecido de corte (grosor). El bloque se mueve de arriba abajo contra el cuchillo
en un plano vertical con la ejecucin de cortes planos, casi
siempre de un espesor de 3 a 5 m para propsitos histolgicos de rutina. La velocidad del bloque contra el cuchillo
la controla el ritmo al que gira la manivela. Los micrtomos rotatorios y motorizados de uso industrial tambin estn disponibles para usarse en cortes semifinos (0.5 a 1 m)
impregnados en resina para la microscopia de luz; en estos
casos la velocidad constante del bloque contra el cuchillo
puede controlarse de forma automtica. Por lo general, los
lmites de grosor del corte de estos micrtomos fluctan
entre 0.5 y 60 m.
El micrtomo de deslizamiento, aunque es ms conveniente para el corte de tejidos duros y algunas resinas ms
blandas, es tambin til para el corte y formacin de tiras
de tejidos y biopsias blandas. La pesada estructura de estas mquinas impide la vibracin y el mango del cuchillo
puede angularse lejos de la direccin del corte, lo cual resulta de utilidad en caso de tejidos duros. El sostenedor
del bloque se monta sobre dos corredores paralelos y el
sostenedor del bloque discurre por el avance manual de la
muestra sobre la misma manivela o por una palanca ensamblada sobre el borde del transportador del bloque, que se
mueve contra un soporte esttico. El bloque se pasa hacia
delante y atrs contra el cuchillo, mediante movimientos
de empuje y traccin. Los cortes son de 3 a 5 m para la
histologa comn.
Cuchillos del micrtomo
En general, las hojas desechables para la prctica histopatolgica de rutina reemplazaron a los cuchillos convencionales de acero del micrtomo.
Los cuchillos de acero se fabrican a partir de un carbn de alto grado o acero de gran calidad y deben estar
libres de impurezas y ser inoxidables. Los cuchillos se templan (endurecimiento) de un extremo al otro y el grado de
dureza se mide mediante la escala de Vickers (casi siempre
400 a 900). Los grados de dureza pueden variar entre los
fabricantes y entre los propios cuchillos del mismo fabricante. Se recomienda una dureza de 700; la de 400 es muy
blanda y la de 900 demasiado quebradiza para el uso de
rutina. Los cuchillos de acero pueden dividirse en perfiles,
segn sea el uso para el que estn destinados (fig. 1-6):
El perfil A corresponde a dispositivos bicncavos y se

emplean para el corte de tejidos impregnados en celoidina. Rara vez se usan en histopatologa comn.
Figura 1-6 Perfiles de los cuchillos de micrtomo.
El perfil B incluye instrumentos planos y cncavos y

pueden utilizarse para seccionar tejidos blandos embebidos en cera y tejidos y muestras botnicos impregnados en celoidina. Este perfil y el anterior poseen los
bordes ms afilados.
El perfil C se refiere al dispositivo acuado y es el cuchillo de acero de empleo ms comn en histopatologa de rutina. Los cuchillos son ms rgidos respecto de
los perfiles A y B y se utilizan para el corte de cera
de parafina de todos los tejidos y en los cristatos para el
corte de material congelado (vase ms adelante). Los
instrumentos de esta categora no son tan afilados como
los de los perfiles A y B.
El perfil D corresponde a herramientas ms anchas y

planas y se usa para seccionar materiales duros, como
resinas, y bloques de tejidos en cera de parafina de extrema dureza. Este cuchillo produce el borde menos
agudo cuando se aplica.
Se sugiere la consulta de varios mtodos manuales y automatizados disponibles para el afinado y afilado de los cuchillos mencionados.
Las hojas desechables se modificaron y engrosaron a
partir de hojas de afeitar; se fabrican con acero inoxidable
de alta calidad y permiten hacer cortes reproducibles, sin
compresin y de buena calidad. La hoja fina se sujeta con
rigidez en su propio sostenedor especial para minimizar la
vibracin durante la microtoma. Las hojas pueden recubrirse con platino o cromo para otorgarles una vida ms
larga. Hoy en da, estas hojas son la primera opcin para la
histopatologa comn.
Otros cuchillos incluyen carburo de tungsteno para
trabajar la resina y cortar hueso sin descalcificarlo; los
cuchillos de vidrio, diamante y zafiro se usan con materiales tratados con araldita y resina epxica en microscopia
electrnica o para obtener bloques pequeos y estrechos de
tejidos impregnados en acrlico o resina de polister para
la microscopia de luz.
13
TCNICAS ESPECIALES
Corte de la cera de parafina
Corte de un macrobloque
Para la prctica de un corte se requiere un cuchillo recin

afilado del micrtomo o una hoja desechable nueva con
un borde agudo sin defectos. Todas las operaciones referentes a la colocacin o retiro del bloque dentro y fuera
del sostenedor del bloque se deben efectuar con firmeza
y seguridad. Las hojas son en extremo peligrosas y deben
tratarse con mesura. Debe sujetarse el mango de los micrtomos rotatorios; el transportador del bloque se coloca
en los micrtomos de deslizamiento y se sujeta de donde
se disponga en el extremo del micrtomo, lo ms alejado
de la lmina.
Algunos laboratorios emplean un micrtomo de corte
spero para recortar el bloque del tejido hasta obtener un
rea representativa seccionada de forma transversal. Las
muestras se remueven en intervalos de 10 a 15 m, hasta
que la faz del tejido est disponible; luego se practican varios cortes a 4 o 5 m para asegurar un bloque de superficie
lisa (que evita el artefacto del corte burdo). El sostenedor
del bloque del cortador burdo se coloca en el mismo plano
que el resto de los micrtomos del laboratorio. El corte burdo puede realizarse con el mismo micrtomo o incluso con
la misma lmina. El corte de la seccin se debe efectuar en
un rea separada de la hoja o el cuchillo utilizados para los
propsitos del corte general.
Los bloques extrados para el diagnstico se preenfran
en un recipiente congelado o una placa ms fra antes del
corte. El enfriamiento propicia la compresin del bloque y
opone una faz ms rgida del bloque al cuchillo para facilitar el corte. El grosor de la seccin es casi siempre de 3 a
5 m. Cuando el filo del cuchillo pasa a travs de la superficie del bloque, los cortes del tejido se desplazan hacia
arriba (micrtomo de deslizamiento) o abajo (micrtomo
rotatorio) de la cara del cuchillo. Cuando el bloque golpea
el filo del cuchillo, la friccin producida crea una superficie que se derrite en la cera y, en consecuencia, las secciones subsecuentes se adhieren una a otra y forman una cinta.
sta se sostiene, se retira del filo del cuchillo y se hace
flotar sobre un bao de agua a 48 a 50C con la pinza cortante. Las secciones se separan de sus puntos de adhesin y
se fijan a los portaobjetos de vidrio del microscopio por sumergimiento parcial del portaobjetos en el agua. El exceso
del agua se elimina del portaobjetos, que se deja secar sobre una placa caliente a 60C, no en contacto directo, hasta
que todos los restos de agua se eliminen. Slo entonces el
portaobjetos se pone en contacto con la placa caliente por
cinco a 10 minutos para facilitar la adherencia de la seccin
de cera de parafina al cristal. Los cortes quedan listos para
la tincin con hematoxilina y eosina o un sinfn de mtodos de tincin e inmunocitoqumica que el histlogo tiene
a su disposicin. El montaje, como se mencion con anterioridad, puede ser automatizado.
El informe del laboratorio y el suministro de un mnimo

de datos establecen la base del diagnstico histolgico. El
muestreo, procesamiento y cortes transversales enteros de
un tumor son ahora tcnicas histolgicas adoptadas y proporcionan informacin ms precisa sobre la naturaleza del
tumor y las distancias de los mrgenes de reseccin. El mtodo tiene una aplicacin extensa, pero es en particular til
en las afecciones de la mama, prstata e intestino.
El procesamiento de macrobloques requiere megacasetes, portaobjetos grandes e instalaciones especiales.
Los tiempos de la tcnica se incrementan y las muestras
se resecan con micrtomos rotatorios o de deslizamiento
modificados. La tincin se facilita sobre todo de manera
manual.
Tcnicas especiales
Corte por congelamiento de tejidos frescos
La mayor parte de los laboratorios histolgicos de rutina
incluye en su inventario un servicio de diagnstico que recurre al corte por congelamiento para pacientes con sospecha de tumor. El diagnstico puede notificarse al cirujano
por telfono 10 a 20 minutos despus de tratar la muestra
del tejido; por consiguiente, es de gran ayuda para la atencin clnica del paciente. Para este procedimiento se utiliza
el cristato (fig. 1-7), un micrtomo rotatorio u oscilatorio
Figura 1-7 Cristato Leica CM3050S.
14
CAP. 1
alojado dentro de una cmara refrigerada. La temperatura

de la muestra y el sostenedor del espcimen, el cuchillo y la
cmara pueden fijarse de modo independiente o bien puede
seleccionarse una sola temperatura para todo el conjunto.
El tejido fresco para diagnstico rpido se enva desde el
quirfano, congelado en el contenedor de la muestra con
dixido de carbono, nitrgeno lquido o un aerosol congelante, y se transfiere al cristato para cortarlo. Si las condiciones tisulares son ptimas, es posible obtener cortes tan
delgados como de 1 m. Los tejidos frescos se deben disecar y congelar en un gabinete de seguridad microbiolgica.
La mayora de los cristatos modernos incorpora un ciclo
de descontaminacin de cuatro horas con formalina para
la desinfeccin de la cmara despus de casos de cortes
infecciosos insospechados (algunas lesiones tuberculosas
pueden parecer a simple vista tumoraciones).
El micrtomo congelante (fig. 1-8) puede aplicarse para
cortes semifinos de tejidos frescos, cuando apremia demos-
superficie del tejido tanto como el sostenedor de la muestra avanza de acuerdo con un espesor preestablecido. El
tejido se congela in situ por medio de un cilindro adjunto
de dixido de carbono o un refrigerante que circula. Los
cortes delgados consistentes son difciles de obtener.
Cortes de hueso sin descalcificar
Este procedimiento exige la produccin de cortes de 4 a
5 m de hueso sin descalcificar embebidos en una resina
acrlica o de polister. Aunque un micrtomo de deslizamiento puede usarse para este propsito, es ms comn
emplear un micrtomo motorizado industrial (fig. 1-9).
Los cuchillos del perfil D (herramienta con filo), de tungsteno, vidrio o diamante, se emplean con frecuencia para los
cortes de ese tejido.
Figura 1-9 Micrtomo rotatorio motorizado de uso industrial

Leica RM2255.
Figura 1-8 Micrtomo congelante Leica 1325.
trar sustancias que de manera habitual se eliminan durante el procesamiento de rutina (p. ej., lpidos). Este tipo de
micrtomo tiene un recipiente esttico para la muestra y
el propio cuchillo discurre de forma manual a travs de la
La microscopia electrnica requiere practicar cortes ultrafinos impregnados de resina y usar un ultramicrtomo.
Las resinas epxica o de araldita se usan con regularidad
y el grosor de la seccin se mide en nanmetros (nm). El
corte se facilita con el uso de cuchillos de vidrio o diamante y el grosor de la seccin se vigila al observar el color
de la interferencia que produce la seccin en contacto con
el agua, es decir, oro (90 a 120 nm), plata (60 a 90 nm) y
gris (< 60 nm). Los cortes se recuperan y tien sobre rejillas especiales de cobre o rodio. Las tinturas emplean sales
RECONOCIMIENTOS
de metales pesados, como el citrato de plomo y el acetato de uranilo, que impregnan a ciertas estructuras tisulares.
Estos metales pesados desvan un haz de electrones que
emite el microscopio electrnico. Esto crea reas de tonos negros y grises dentro del corte tisular, donde los elementos ultraestructurales se impregnaron de metales pesados. El microscopio electrnico incorpora un sistema de
cmara que puede fotografiar reas de inters dentro de la
seccin; el resultado final es la micrografa electrnica.
sta es una revisin en extremo general de la microscopia
electrnica.
15
Lectura adicional
Bancroft JD, Gamble M. Theory and Practice of Histological
Techniques, 5th ed. Edinburgh: Churchill Livingstone 2002.
Reconocimientos
Fotografas por cortesa de Thermo Electron Anatomical
Pathology, Leica UK Ltd, y Dr AT Warfield, Histopathology, University Hospital Birmingham, UK.
2
Tinciones generales
Barrie Sims
Por qu la tincin?
Cuando se examinan al microscopio, los cortes finos de tejido muestran una diferenciacin muy sutil entre las estructuras compuestas. La tincin de los tejidos con colorantes
contrastantes permite que las estructuras se visualicen bajo
el microscopio de luz. Adems, la demostracin de varios
productos, inclusiones o microorganismos celulares exige
el uso de procedimientos de tincin especializados.
La mayor parte de la histopatologa diagnstica de rutina
se realiza sobre tejidos impregnados en cera de parafina.
Los cortes por congelamiento son una excepcin. Estos
procedimientos son necesarios para el diagnstico de urgencia o para demostrar sustancias perdidas, destruidas o
inhibidas en el proceso de fijacin e impregnacin.
Despus de la microtoma, el corte en parafina an est
infiltrado con cera. La cera presente en las secciones oscurece la estructura del tejido y es impermeable en grado
notable a los colorantes. Casi todos los mtodos de tincin
se basan en agua o alcohol y, por lo tanto, la remocin de
la cera es imprescindible. Una vez que los cortes se secan
sobre el portaobjetos, las secciones se tratan con xileno
para eliminar la cera. Clarificar las muestras en alcoholes
graduados elimina el xileno y hace posible la hidratacin
de los especmenes. Este proceso se conoce a menudo en la
metodologa con diversos trminos: cortes desencerados,
secciones al agua, hidratacin de muestras.
vital, es decir, cuando el colorante se aplica a tejidos vivos,

se utiliza slo de modo ocasional, si acaso).
Solubilidad electiva
ste es el mecanismo por el cual los colorantes disueltos en
un solvente son ms solubles en el componente del tejido
que en el solvente mismo. Este mecanismo se emplea sobre
todo en la demostracin de grasa en cortes congelados. Por
lo general, los tintes usados son del tipo Sudn (III, IV).
Impregnacin metlica
Es posible la aplicacin de plata metlica a los elementos
del tejido para demostrar una amplia variedad de estructuras y sustancias.
Las clulas que tienen la capacidad de reducir una solucin amoniacal de plata, sin la necesidad de un agente
de reduccin externo, se conocen como argentafines. La
melanina y las clulas de Kultschitzky del aparato digestivo son ejemplos tpicos.
Las clulas o las estructuras que requieren un agente de
reduccin externo se llaman argirfilas. Se recurre con
regularidad a la impregnacin metlica en la demostracin
de fibras reticulares, membranas basales, hongos, inclusiones celulares y clulas nerviosas y sus axones.
Mecanismos bsicos de tincin
Reacciones histoqumicas
En la histopatologa diagnstica, los mtodos de tincin se

pueden agrupar en cuatro procesos principales (la tincin
stos son los mtodos en los cuales existe una comprensin

clara de los mecanismos que intervienen. La reaccin final
18
CAP. 2
TINCIONES GENERALES
puede usar un colorante o inducir por s misma una reaccin

coloreada. Por ejemplo, el reactivo de Schiff, utilizado en
la demostracin de aldehdos, emplea la fucsina de tincin
bsica en la reaccin, que tie de magenta los sitios que
tienen aldehdo; por su parte, en la reaccin de Perl para
los depsitos de hierro frrico (fig. 2-1), la interaccin entre
el ferrocianuro de potasio (un componente de la solucin de
Perl) y el hierro frrico en los tejidos produce el pigmento
azul de Prusia en el sitio donde se halla el hierro frrico.
dos comprenden a la gran mayora de los colorantes usados

en las tcnicas histolgicas (p. ej., eosina, azul de metileno
y fucsina bsica). Los colorantes se pueden tambin agrupar como cidos, bsicos o neutros.
Colorantes cidos y bsicos
De forma sinptica, los colorantes cidos (aninicos) sufren atraccin de los elementos del tejido con propiedades bsicas, por ejemplo el citoplasma de las clulas. Los
colorantes bsicos (catinicos) experimentan atraccin de
las estructuras que poseen una naturaleza cida, como el
DNA del ncleo celular. Mediante una combinacin de colorantes cidos y bsicos de un color contrastante pueden
diferenciarse el ncleo y el citoplasma. sta es la base de la
tincin con hematoxilina y eosina (H-E), un mtodo de tincin usado en la mayor parte de los laboratorios de histopatologa diagnstica para demostrar la estructura general.
Colorantes neutros
Figura 2-1 Reaccin de Perl para el hierro frrico. Los depsitos

de hierro frrico estn teidos de azul.
Muchas enzimas se pueden demostrar por la incubacin

de los cortes (congelados o en cera) en los sustratos que contienen una sustancia con la cual reacciona la enzima, lo que
induce un producto de reaccin primaria. A continuacin, un
segundo reactivo interacta con el producto de reaccin primaria
para formar un depsito coloreado en el sitio de la actividad.
Las muestras de control que tienen o no la sustancia (positivas
o negativas) se usan para determinar la especificidad de la reaccin. Las sustancias que inhiben la reaccin tambin pueden emplearse para mejorar la especificidad de la reaccin.
Tincin con colorantes
Casi todos los procedimientos de tincin en patologa diagnstica pertenecen a este grupo. En muchos casos, la comprensin del mecanismo de tincin no es completa y los
resultados dependen con frecuencia de la capacidad y el
conocimiento del clnico.
Clasificacin
Los colorantes se pueden clasificar como naturales o sintticos. Los primeros incluyen a la hematoxilina; los segun-
Los colorantes neutros se elaboran al combinar soluciones

cidas y bsicas. El producto resultante de la combinacin
tie las estructuras cidas y bsicas con una solucin nica. Los colorantes de Romanowsky, aplicados por ejemplo
en la demostracin de clulas de la mdula sea, son una
combinacin de azul de metileno y eosina.
Metacromasia
Los colorantes que se combinan con ciertos elementos
tisulares y que producen un color que es diferente al del
colorante original se denominan metacromticos. Los
mtodos de tincin metacromtica se pueden emplear para
la demostracin de mucinas, grnulos de mastocitos, amiloides y cartlago del tejido conectivo. La metacromasia se
pierde casi siempre durante la deshidratacin de los especmenes antes del uso de los cubreobjetos. Por lo regular,
lo anterior puede prevenirse con la utilizacin de un medio
acuoso para el montaje. Existen algunas variaciones en los
mtodos metacromticos que conservan la metacromasia
durante la deshidratacin.
Fluorescencia
Casi todos los mtodos de tincin se observan con la luz
visible. Los colorantes que tienen la capacidad de absorber
la luz ultravioleta y luego transmitirla dentro del espectro
visible se conocen como fluorescentes. stos pueden
utilizarse para demostrar el amiloide de Mycobacterium
MECANISMOS BSICOS DE TINCIN
19
tuberculosis (y antgenos tisulares cuando se aplican en las

tcnicas inmunocitoqumicas). Para ver las preparaciones
se requieren microscopios fluorescentes y un cuarto oscuro
para conseguir una claridad ptima. La tincin fluorescente
es a menudo de breve duracin y en tal caso se recurre a la
fotografa para proporcionar un registro permanente.
celulares. Hay varias formulaciones disponibles, por ejemplo las de Harris, Ehrlich, Mayer, Delafield, Cole y Gill.
Las hematoxilinas de alumbre deben ser azuladas (vase
ms adelante) para que los ncleos se tian de azul.
Colorantes directos
Se obtienen tras agregar cloruro frrico o sulfato frrico y

amonio a la solucin de hematoxilina. La solucin resultante produce un colorante negro e intenso que se puede utilizar para demostrar ncleos celulares, elastina, estriaciones
musculares y mielina. El colorante es ms resistente a la
extraccin cida que las hematoxilinas de alumbre y est
indicado cuando se emplean las contratinciones cidas, por
ejemplo en el mtodo de Gieson para tejidos conectivos.
La estructura demostrada depende del reactivo usado para
diferenciar (eliminacin del exceso de colorante del fondo
de la muestra hasta que slo se delinea la estructura requerida). Los diferenciadores cidos eliminan el colorante necesario para perfilar los ncleos de la clula. Al reaplicar la
solucin mordiente a la seccin se observa una eliminacin
progresiva de hematoxilina de la muestra; esto permite que
puedan observarse la mielina, elastina y estriaciones musculares. Las hematoxilinas de alumbre se pueden convertir a
hematoxilinas de hierro mediante el tratamiento del corte
con una solucin de hierro antes de la hematoxilina. Un
ejemplo es la secuencia azul celeste-hemalum.
Los colorantes que tienen la propiedad de combinarse

con las estructuras tisulares a partir de soluciones acuosas
simples o alcohlicas se llaman colorantes directos. La
eosina y muchos otros colorantes anilnicos poseen esta
caracterstica.
Colorantes indirectos
Los colorantes que no poseen ninguna afinidad directa por
las estructuras tisulares y requieren una sustancia intermediaria para permitir la tincin se llaman colorantes indirectos. La sustancia intermediaria se conoce como mordiente
(similar a un catalizador). El colorante se combina con el
mordiente y a su turno con el elemento del tejido, lo que
produce un complejo colorante-mordiente-tejido. La hematoxilina, sin el uso del mordiente, es un colorante tisular
dbil. La adicin de metales a la solucin de hematoxilina,
como el sulfato de aluminio y potasio o el cloruro frrico,
puede crear colorantes potentes para usos diversos.
Hematoxilinas de hierro
Hematoxilina de plomo
Tincin con hematoxilina
Las soluciones de hematoxilina necesitan oxidarse (algunas veces se dice madurarse) antes de emplearlas para
teir tejidos. La oxidacin se puede realizar por medios
qumicos con la adicin de agentes oxidantes, como yodato de sodio o, desde luego, mediante la luz solar (lo que
puede tomar varios meses). El proceso de la oxidacin convierte a la hematoxilina en hematena. Por lo general, las
preparaciones de hematoxilina se oxidan slo en parte y
la oxidacin adicional prosigue con el tiempo. El uso de la
oxidacin incrementa la vida de la solucin.
Segn sea el mordiente utilizado, la hematoxilina puede
demostrar diversas estructuras.
Hematoxilinas de alumbre
stas se producen por la adicin de sulfato de aluminio y
potasio o amonio a la solucin de hematoxilina. Las hematoxilinas de alumbre se usan para teir de azul a los ncleos
Las soluciones de hematoxilina que contienen plomo revelan clulas endocrinas.

Hematoxilina de cido fosfotngstico
Esta tincin perfila estriaciones musculares, fibrina, ncleos,
mielina, cilios, clulas neurogliales y amebas. El cido fosfotngstico se utiliza tanto como el mordiente y la hematena o la hematoxilina como colorante. El uso de la hematena
elimina la necesidad de la oxidacin.
Preparaciones comerciales
Ahora estn disponibles muchas soluciones de hematoxilina en el comercio. Esto evita la necesidad de la preparacin,
que consume tiempo en el laboratorio y la manipulacin
de sustancias txicas. Las nuevas frmulas eliminan el uso de
sustancias dainas o txicas (p. ej., mercurio) de la preparacin y se elaboran soluciones menos perjudiciales.
20
CAP. 2
TINCIONES GENERALES
Tinciones regresivas y progresivas

Regresivas
Una tincin regresiva se aplica casi siempre al corte por un
periodo que tia de manera inicial todas las estructuras del
tejido. Al eliminar de modo selectivo el exceso de colorante se revelan los elementos de inters. El retiro del exceso
del colorante se llama diferenciacin. Esto puede conseguirse con el uso de solventes (alcohol), cido diluido y
soluciones cidas o alcohlicas o la solucin mordiente.
Progresivas
Una tincin progresiva tie de manera creciente elementos
del tejido, de acuerdo con el tiempo en la solucin de tincin. Las tinciones progresivas no tien los tejidos de modo
excesivo y el periodo de impregnacin se suspende despus de un lapso determinado. La hemalum de Mayer es
una tincin nuclear progresiva de uso frecuente como contratincin nuclear en otras tcnicas, por ejemplo el mtodo
del cido perydico de Schiff (PAS).
Mtodos comunes de tincin

Los mtodos de tincin habituales se pueden agrupar en
nueve categoras (vase el cuadro 2-1).
Cuadro 2-1 Categoras de los mtodos comunes de tincin

Estructura general
Fibras de tejido conectivo
Carbohidratos y mucosustancias
Pigmentos
Microorganismos
Sustancias extracelulares (fibrina, amiloide)
Lpidos
Grnulos citoplsmicos
Clulas neurolgicas
Figura 2-2 Corte de rin teido con hematoxilina y eosina

que muestra un glomrulo de situacin central. Los ncleos estn teidos de azul (las intensidades que difieren dependen de la
cantidad de cromatina nuclear presente) y la estructura general de
rosa. Los eritrocitos son de color rosa salmn.
Cuadro 2-2 Protocolo para la tincin de H-E

1. Desencerar los cortes con xileno, tratar con alcoholes graduados y lavar en agua
2. Teir los ncleos con una hematoxilina de alumbre (p. ej.,
Harris, Gill, etc.)
3. Clarificacin en agua para eliminar el exceso de colorante
4. Eliminar el exceso de colorante de los tejidos (diferenciar)
hasta que slo se delineen los ncleos (se utiliza con frecuencia una mezcla de cido clorhdrico al 0.5 a 1.0% en
alcohol al 70%)
5. Lavar las muestras hasta que los ncleos sean azules. El
trmino azulado se utiliza para describir el proceso por el
cual los ncleos celulares teidos con una hematoxilina de
alumbre se lavan en agua o un lcali dbil hasta que los
ncleos cambian del rojo al azul. La reaccin es anloga a
los cambios de color mostrados por el tornasol
6. Teir el citoplasma celular con la eosina (hay un buen nmero de formulaciones que se pueden utilizar para ajustar
las condiciones locales y el pH del agua)
7. Despus de una breve clarificacin en agua (o directamente
en alcohol) las muestras se devuelven al xileno y se aplica
un cubreobjetos
Estructura general
El mtodo con hematoxilina y eosina (designado a menudo
como H-E) es uno de los ms utilizados para la tincin de
estructuras generales en histopatologa diagnstica (vase
fig. 2-2). El procedimiento sigue el orden mostrado en el
cuadro 2-2. Los procesos de lavado y deshidratacin efec-
tuados luego de la tincin con eosina eliminan a sta de

la muestra. El control cuidadoso de este proceso permite
que varias estructuras (msculo, colgena y eritrocitos) se
muestren de forma selectiva en diversas intensidades, desde el rosa hasta el rojo.
MTODOS COMUNES DE TINCIN
Soluciones simples para tincin

Una solucin acuosa al 0.5 a 1% de azul de metileno, por
ejemplo, tie de azul todas las estructuras del tejido. La
eliminacin selectiva del colorante mediante clarificacin
y alcoholes revela los elementos tisulares en intensidades
que se diferencian del azul.
Colorante de Romanowsky
Se trata de un colorante neutro (vase antes) que puede inducir una reaccin de tincin similar a la de H-E cuando se
aplica a los cortes con cera de parafina.
Fibras y msculos del tejido conectivo
21
jacin basada en mercurio produce mejores resultados que

los del formaldehdo. La tincin requiere habilidad para su
prctica. Los principios tericos del tricromo son complejos y rebasan los alcances de este captulo.
Hematoxilina fosfotngstica cida (PTAH) De uso frecuente en la demostracin de tejidos musculares, la tincin
PTAH tie las estriaciones y las miofibrillas musculares de
azul. La colgena se delinea en rojo.
Fibras reticulares
Impregnacin con plata Las fibras reticulares se demuestran en particular con los mtodos de impregnacin
en plata (fig. 2-4). Existe una amplia variedad disponible
Colgena y msculo
van Gieson van Gieson y sus variantes son los colorantes
ms comunes para colgena y msculo. La solucin que
tie es una mezcla de cido pcrico y fucsina cida. Debido
a la naturaleza cida de la solucin de van Gieson, se utiliza una hematoxilina de hierro para la tincin nuclear. El
msculo y los eritrocitos se tien de amarillo, mientras que
la colgena lo hace de rojo; los ncleos son negros.
Tricromos Delinean la colgena y el msculo de manera
diferenciada (fig. 2-3). El msculo teido es rojo, en tanto
que la colgena puede adoptar un tono azul o verde, de
acuerdo con el orden de tincin usado. Por lo regular, la fiFigura 2-4 Impregnacin de plata de fibras reticulares en una
seccin del hgado. Una fina red negra de fibras envuelve a las
clulas. El teido ms burdo (derecha inferior) es colgena.
de estas tcnicas; empero, su metodologa es similar (vase

el cuadro 2-3). La contratincin de los ncleos es opcional. Se ennegrecen las fibras reticulares y otras estructuras
emiten sombras de tono marrn (a menos que de suyo sean
oscuras). Tambin pueden impregnarse los ncleos. La preparacin de la solucin de plata amoniacal debe estar fresca y requiere habilidad. La reaccin del cido perydico de
Schiff (PAS) tambin perfila fibras reticulares.
Figura 2-3 Para la demostracin de los tejidos conectivos se utiliza un mtodo de tricromo (o tricrmico). Las fibras del msculo
se tien de rojo, la colgena de azul, los ncleos de negro y las
clulas sanguneas rojas de rojo brillante.
Membranas basales Es necesaria la demostracin de

membranas basales glomerulares durante el diagnstico
de la enfermedad glomerular. Los cortes se oxidan con cido
perydico y se impregnan con una solucin de metenamina
de plata. La reaccin es progresiva y se detiene en el punto
22
CAP. 2
TINCIONES GENERALES
Cuadro 2-3 Protocolo para la tincin con impregnacin de plata
Glucgeno
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
La reaccin de PAS se usa con frecuencia para la demostracin del glucgeno. Para identificar los sitios de acumulacin
del glucgeno es necesario pretratar un corte duplicado con
diastasa. sta extrae el glucgeno y, cuando se tien ambas
muestras, la digerida seala una ausencia de PAS al teir los
sitios del glucgeno.
La metenamina de plata se puede utilizar de una manera
similar y reconoce al glucgeno como producto ennegrecido. El carmn de Best es otro mtodo difundido para el
glucgeno.
Desencerar los cortes y clarificar en agua destilada

Oxidar con permanganato de potasio
Blanquear con cido oxlico
Sensibilizar con el alumbre de hierro
Impregnar con una solucin de nitrato de plata amoniacal
Reducir con formaldehdo
Fijar con el tiosulfato de sodio
Tonificar (opcional) con cido clorourico (cloruro de oro)
Lavar, deshidratar con alcohol, tratar con xileno y montar
deseado de impregnacin. Se requiere el corte de las muestras en 1 a 2 m para que se visualicen las estructuras finas
de la membrana basal. La reaccin con PAS tambin puede
emplearse para delinear las membranas basales.
Elastina Varios colorantes se pueden usar para demostrar
tejido de elastina, entre ellos la hematoxilina (mtodo de
Verhoeff), fucsina de rescorcina (mtodo de Weigert o Miller) y aldehdo de fucsina y orcena. El mtodo de Verhoeff, aunque es comn, tiene dificultades para demostrar
fibras gruesas y finas en el mismo corte. La variante de
Miller de la tincin de Weigert para la elastina produce
resultados buenos y confiables de modo consistente. Las
calificaciones de este mtodo son superiores de manera
constante respecto de otros mtodos en estudios de calidad
(United Kingdom National Quality External Quality Assurance Service for Cellular Pathology Technique [UKNEQAS-CPT]; portal: www.ukneqas-cpt.co.uk). La orcena
tiene xito razonable para demostrar la elastina de la piel.
Se usa con frecuencia la tincin de van Gieson del tejido
conectivo para la contratincin de la elastina.
Mucosustancias
Por lo general, las mucosustancias se encuentran en la forma
de mezclas de tipos diversos e incluyen a las mucinas. stas
se localizan en muchos sitios tisulares (p. ej., tejidos glandular y conectivo). La demostracin de las diversas mucinas
depende de sus propiedades particulares. Las mucinas neutras se pueden teir por la reaccin de PAS (fig. 2-5), mientras que las mucinas cidas lo hacen con el azul alciano.
Carbohidratos y mucosustancias
Reaccin de cido perydico de Schiff (PAS)
La reaccin del PAS se emplea en patologa para demostrar
una amplia gama de sustancias. El cido perydico rompe
los enlaces de carbono de los grupos adyacentes de glicol
1:2 por oxidacin y forma aldehdos. stos inducen al reactivo incoloro de Schiff para recolorear y teir los sitios de
actividad de un tono magenta oscuro. Dado que muchas
sustancias contienen grupos glicol 1:2, la tincin no es muy
selectiva. Para mejorar la selectividad de la reaccin para
algunas sustancias es necesario extraer o bloquear esa sustancia en una muestra duplicada mediante enzimas o productos qumicos.
Figura 2-5 Demostracin de mucina que se tie mediante una

combinacin del mtodo de cido perydico de Schiff (PAS) y
azul alciano. Las mucinas neutras se tien de magenta, las mucinas cidas de azul y las mezclas, de azul prpura intenso.
El azul alciano, preparado a diferentes pH, diferencia

las mucinas cidas generales de las sulfatadas. Esta tincin
preparada con concentraciones que difieren del cloruro de
magnesio revela mucosustancias como el cido hialurnico, el sulfato de condroitina, el sulfato de queratina y la
heparina.
MTODOS COMUNES DE TINCIN
Las mucinas del tejido conectivo se pueden tambin reconocer con colorantes metacromticos como el azul de
toluidina, en tanto que la mucicarmina de Southgate perfila
las mucinas carboxiladas o dbilmente cidas.
Las tcnicas de bloqueo para prevenir la tincin de grupos qumicos particulares (p. ej., carboxilo) se aplican para
mejorar la especificidad por la ausencia de tincin en las
secciones tratadas.
Demostracin de pigmentos
Los pigmentos se pueden encontrar en material normal y
patolgico y se forman de modo natural o como artefactos
de la fijacin o la tincin del tejido.
Artefactos
Por lo regular, los artefactos ocurren durante la fijacin y
pueden deberse a las soluciones cidas del formaldehdo
que reaccionan con la sangre (pigmento de formalina).
Pueden evitarse con el uso de soluciones neutrales amortiguadas de formalina. Los fijadores basados en el mercurio (p. ej., Zenker) dejan un depsito de sales de mercurio
dentro de los tejidos. Ambos pigmentos se eliminan con
facilidad antes de aplicar la tincin. El cuadro 2-4 enlis-
23
ta algunos pigmentos comunes y los mtodos usados para

demostrarlos.
Microorganismos
Los microorganismos que pueden delinearse en el plano
histolgico incluyen bacterias, inclusiones vricas, hongos
y espiroquetas. Los colorantes simples como el azul de metileno proporcionan a menudo medios rpidos y fciles de
identificar la presencia de agentes patgenos dentro de una
muestra; sin embargo, el azul de metileno suministra informacin slo en relacin con la morfologa.
Bacterias
Las bacterias se dividen en grampositivas o gramnegativas,
segn sea su reaccin de tincin con el colorante cristal
violeta de Gram. Las bacterias grampositivas conservan la
tincin despus de la diferenciacin en acetona o alcohol,
mientras que las bacterias gramnegativas se decoloran.
Luego de aplicar el colorante cristal violeta, en el cual el
yodo se utiliza como mordiente o agente atrapador, que
precipita el colorante dentro del citoplasma de las bacterias
grampositivas, se emplea una contratincin roja para mostrar las bacterias gramnegativas. La tcnica requiere destreza,
dado que es posible una sobrediferenciacin del cristal violeta que produce bacterias grampositivas rojas.
Cuadro 2-4 Demostracin de algunos pigmentos comunes
Bacilos rpidos para el cido y el alcohol

Pigmento
Mtodo de demostracin
Hemosiderina
Pigmento de la bilis
Melanina
Lipofucsinas
Azul prusiano de Perl

Gmelina
Masson Fontana
Ferrocianuro frrico de Schmorl
PAS
Masson Fontana
Negro de Sudn
Ziehl-Neelsen largo
Hematoxilina de plomo
Masson Fontana
Diazo
Grimelius
Bodian
Digestin del precursor de

la amina y descarboxilacin
de grnulos celulares en
clulas neuroendocrinas
Clulas cromafines
Cobre
Asbesto
Reaccin cromafn
Giemsa
cido rubenico
Rodanina
Azul prusiano de Perl
Birrefringencia
Estos patgenos se demuestran casi siempre mediante el

mtodo de Ziehl-Neelsen (ZN). La fucsina bsica y el fenol se mezclan para producir carbol fucsina intensa. La
siguiente tincin (con o sin el uso de calor) de la muestra se
diferencia con una solucin de alcohol cido hasta decolorar el espcimen. Una contratincin (azul o verde) demuestra otros microorganismos y la estructura general.
Tambin es posible emplear un mtodo fluorescente
(auramina-rodamina). Visto bajo un microscopio fluorescente, el microorganismo emite luz fluorescente amarilla
o verde. Este mtodo es ms sensible que el ZN estndar
puesto que los agentes patgenos aislados se identifican
con mayor facilidad. Casi siempre es necesario desarrollar
el mtodo con un ZN estndar una vez que se identifica la
localizacin de los microorganismos.
Inclusiones vricas
No hay mtodos de tincin especficos para las inclusiones
vricas ya que muchas de las tcnicas tien a otras estructu-
24
CAP. 2
TINCIONES GENERALES
ras. Se ha usado la tartracina floxina para demostrar cuerpos

vricos en la inclusin y la orcena para la identificacin
de la hepatitis B. Los mtodos inmunocitoqumicos han
reemplazado en buena medida al reconocimiento de las inclusiones vricas.
Hongos
Los hongos pueden ser evidentes en muestras teidas con
H-E, pero pueden teirse de forma ms selectiva mediante
PAS, metenamina de plata de Grocott (fig. 2-6), mucicarmina de Southgate (para Cryptococcus), tincin de Gram,
Ziehl-Neelsen y Giemsa.
colorante a la hematoxilina fosfotngstica cida. Fibrinoide es un trmino aplicado a una sustancia hialina que
induce reacciones de tincin similares a las de la fibrina.
El mtodo azul de escarlata de Matius-Lendrum delinea
a los eritrocitos en tono amarillo, a la fibrina y fibrinoide
en rojo y a la colgena y fibrina menos reciente en azul. El
mtodo requiere una hbil diferenciacin. El mtodo original recomend la fijacin basada en el mercurio; empero,
pueden alcanzarse resultados aceptables con soluciones de
formaldehdo sin mercurio.
Amiloide
El amiloide se tie de rosa en cortes con H-E, es positivo
en moderada medida al PAS y se tie de amarillo o marrn
con la tincin de van Gieson. El amiloide se revela de rutina si se utiliza el rojo Congo. Un gran nmero de formulaciones tie al amiloide en tonos rosados a rojos. Bajo luz
polarizada, el amiloide teido con rojo Congo es dicroico y
emite birrefringencia amarilla o verde.
El violeta de metilo o el azul de toluidina tien al amiloide de manera metacromtica (rojo prpura a violeta).
La tioflavina T es un colorante fluorescente que posee
fluorescencia amarilla brillante. Este mtodo no es especfico pero s muy sensible.
Lpidos
Quiz las espiroquetas sean los microorganismos ms difciles de demostrar en cortes tisulares. El mtodo de Levaditi se realiz en bloques de tejido impregnados con plata.
La impregnacin y el corte subsiguientes revelaron que las
espiroquetas aparecan en tonalidad negra.
Se han descrito varios mtodos con plata para demostrar
espiroquetas en muestras tisulares. Todos requieren un grado sustancial de habilidad para obtener buenos resultados.
Algunos de ellos se han adaptado para revelar Helicobacter.
Los lpidos se pueden encontrar en tejidos normales y patolgicos.

En condiciones normales, los lpidos simples se pierden durante el procesamiento con cera de parafina y se
requieren cortes congelados para probar su presencia. Se
demuestran los lpidos simples mediante colorantes solubles en grasa (p. ej., colorantes de Sudn). El principio de
la tincin se basa en la presuncin de que el colorante es
ms soluble en la grasa que en el solvente del que est compuesto (solubilidad electiva).
Los lpidos compuestos, en los cuales estn presentes
otros productos (p. ej., fosfolpidos), pueden resistir el procesamiento y los revelan diversos mtodos en cortes de parafina. La mielina (fosfolpido) se puede perfilar con azul
Luxol rpido o colorantes basados en hematoxilina.
Sustancias extracelulares (fibrina y amiloide)
Grnulos citoplsmicos
Fibrina
Grnulos de mastocitos
La fibrina se tie de forma intensa con eosina y es positiva

al PAS en grado moderado. La fibrina fija con solidez el
Los grnulos de mastocitos son metacromticos y se pueden demostrar mediante azul de toluidina, tionina o azul ce-
Figura 2-6
de Grocott.
Impregnacin de plata de hifas micticas. Mtodo
Espiroquetas
25
AGRADECIMIENTOS
leste A. Los grnulos poseen metacromasia prpura o roja

con los ncleos y otras estructuras teidas de azul. Tambin
pueden reconocerse otros tejidos conectivos y algunas mucinas epiteliales. De igual modo, puede emplearse el azul
alciano para reconocer los grnulos. Bancroft recomend
la esterasa de cloracetato como el mtodo de eleccin.
Cuadro 2-5 Algunas tinciones neurolgicas comunes

Estructura
Mtodo
Neuronas y axones
Sustancia de Nissl
Mielina
Impregnacin en plata
Cristal violeta rpido
Azul Luxol rpido
Cianina solocrmica
PTAH
Hematoxilina de hierro
Grnulos celulares de Paneth

Los grnulos celulares de Paneth son acidfilos y se observan con facilidad y diferenciacin en muestras teidas con
H-E. El mtodo de tartracina floxina de Lendrum tie los
grnulos rojos contra un fondo amarillo.
Grnulos celulares pancreticos
Los ms especficos mtodos inmunocitoqumicos sustituyeron en gran medida a la tincin de las clulas insulares
del pncreas. Algunos mtodos tradicionales incluyen hematoxilina con alumbre-cromo y aldehdo de fucsina para
las clulas B, Grimelius para las clulas A y el mtodo de
Hellerstrm y Hellman para las clulas D.
Grnulos celulares pituitarios
De nueva cuenta, los mtodos inmunocitoqumicos reemplazaron en buena medida a los mtodos tradicionales de
tincin. El PAS-anaranjado G era un mtodo aceptado y se
realizaba lo mejor posible sobre fijadores basados en dicromato (lquido de Helly). El PAS tea a los basfilos
pituitarios de magenta, el anaranjado G a los acidfilos de
anaranjado y los cromfobos permanecan sin tonalidad.
Los tricromos tambin se han utilizado para reconocer los
tipos celulares.
Conclusiones
Los mtodos convencionales de tincin an tienen una
funcin relevante en el diagnstico de la patologa tisular.
En la actualidad, los laboratorios de diagnstico usan una
combinacin de tincin y tincin inmunocitoqumica para
proporcionar la informacin necesaria que permita establecer un diagnstico informado. El aspecto morfolgico
del tejido teido con H-E represent el precursor para las
investigaciones subsecuentes.
Aunque la inmunocitoqumica ha sustituido a un nmero notorio de mtodos de tincin histricos, existe todava
una gran cantidad de investigaciones que confan slo en la
tincin habitual con colorantes.
Este captulo slo proporciona una introduccin muy sinptica a
los aspectos relacionados con las tinciones. Para una informacin
ms profunda se recomiendan los siguientes libros:
Bancroft JD, Gamble M. Theory and Practice of Histological Techniques. 5th ed. Edinburgh: Churchill-Livingstone, 2002.
Culling CFA, Allison RT, Barr WT. Cellular Pathology Technique. 4th ed. London: Butterworths, 1885.
Eosinfilos
Lectura avanzada
Los eosinfilos son acidfilos y la tincin de H-E los delinea y diferencia con claridad. Tambin se han empleado las
tinciones Cromotrope y de Romanowsky.
Horobin RW, Kiernan JA (eds.), Conns Biological Stains. A Handbook of Dyes, Stains and Fluorochromes for use in Biology and
Medicine. 10th ed. Oxford, UK: Bios Scientific, 2002.
Tejidos neurolgicos
Agradecimientos
En la histopatologa diagnstica de rutina, la demostracin
de elementos neurolgicos por mtodos de tincin convencionales se reduce a las neuronas, axones y mielina. Los
mtodos inmunocitoqumicos reemplazaron en gran parte
a algunas de las tcnicas ms difciles de impregnacin en
plata (cuadro 2-5).
Quisiera expresar mi agradecimiento al Dr. Stephen Harris,

consultor histopatlogo del Staffordshire General Hospital,
por su ayuda durante la preparacin del manuscrito, y a
Jim Elsam de HTEQA Services por facilitar las imgenes
digitales.
3
Histoqumica de las enzimas
Trevor Gray y Neil Hand
Introduccin
Las enzimas son grandes protenas terciarias que actan como
catalizadores de la mayor parte de las reacciones biolgicas y
son vitales en el metabolismo celular, puesto que mantienen
la homeostasis en el hombre. Existen alrededor de 700 enzimas conocidas y cada una cataliza una reaccin particular al
actuar sobre molculas especficas (sustratos). El producto
de la reaccin puede actuar como un nuevo sustrato para una
enzima diferente, segn lo ilustra el ciclo de Krebs. Despus
de cada reaccin metablica, la enzima de cada caso permanece inalterada para intervenir en reacciones futuras.
Los bioqumicos estudian de rutina las concentraciones
enzimticas de las soluciones derivadas de lquidos corporales, cultivos tisulares y tejidos resecados con fines de diagnstico y durante las investigaciones. Esto suministra evidencia valiosa en la deteccin y vigilancia de los procesos de la
enfermedad y la evaluacin de los cambios fisiolgicos que
induce un medicamento. Sin embargo, los resultados obtenidos por anlisis bioqumicos se relacionan con una poblacin
heterognea de las clulas que se encuentran en los tejidos
y no proporcionan valores celulares especficos. Es posible
llevar a cabo una valoracin ms precisa de la localizacin
intracelular de la enzima y su actividad biolgica si se recurre
a la histoqumica de la enzima. sta se basa en la aplicacin
de un sistema de deteccin enzimtico en los cortes de tejido
o en un frotis. La tcnica ofrece el producto final de una reaccin coloreada que se localiza en las clulas con una intensidad proporcional a la actividad de la enzima. A diferencia de
los mtodos bioqumicos, esta intensidad es difcil de cuantificar, pero los aspectos microscpicos cualitativos como los
que observa un patlogo experimentado son ms relevantes
en la deteccin y determinacin histolgicas de los procesos
patolgicos.
El principal problema con la histoqumica enzimtica es

la retencin de la funcin de la enzima durante la preparacin del tejido y la tincin histoqumica. Se han desarrollado
numerosos mtodos histolgicos para enzimas especficas,
y si bien estos mtodos no son difciles, los procedimientos
no estandarizados de manipulacin de los tejidos requeridos
han obligado a realizar con regularidad estas tcnicas en laboratorios especializados.
Otros mtodos histoqumicos no enzimticos para la deteccin de la enzima en cortes estndar de parafina incluyen
la inmunohistoqumica y la hibridacin in situ del mRNA.
Estos mtodos pueden identificar la presencia o produccin
de enzimas celulares, pero ninguno puede mostrar la actividad biolgica de la enzima.
Estructura y clasificacin
Estructura
Las enzimas son protenas globulares de alto peso molecular
que pueden hallarse libres dentro del citoplasma (lisoenzimas) o fijarse en las membranas celulares (desmoenzimas).
Los componentes no protenicos (grupos prostticos) pueden unirse a la enzima, lo cual puede ayudar a formar una
estructura cuaternaria activa. La propiedad funcional de la
enzima depende de mantener la forma y carga de su sitio
activo en el punto de la interaccin enzima/sustrato.
Se necesitan varios cofactores para la mayor parte de las
reacciones. Activadores como los iones de calcio, magnesio, manganeso, sodio, potasio y otros ayudan a transferir
el electrn durante la reaccin enzimtica. Las coenzimas
son molculas que se combinan con una apoenzima inactiva y crean un sitio activo en trminos estricos por la
28
CAP. 3
HISTOQUMICA DE LAS ENZIMAS
alteracin de la estructura cuaternaria de la apoenzima. La

coenzima puede tambin combinarse con el sustrato y desempear una parte activa en la reaccin metablica. Casi
todas las vitaminas B son coenzimas.
Clasificacin
Se puede clasificar a las enzimas de varias maneras; la ms
precisa se basa en el cdigo de cada una, de acuerdo con el
nombre sistemtico de la enzima. ste contiene el nombre
del sustrato especfico sobre el que reacciona, seguido por
una palabra con el sufijo -asa, y se especifica el tipo de
reaccin participante. En el diagnstico histoqumico de la
enzima se utiliza un nombre ms corto debido al pequeo
nmero de enzimas investigado.
Los seis grupos mayores de enzimas se clasifican segn
sea su efecto sobre el sustrato: oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Probablemente, los grupos ms importantes para el diagnstico
histoqumico de la enzima son las oxidorreductasas (antes
conocidas como oxidasas y deshidrogenasas) e hidrolasas.
stas se llaman a menudo enzimas oxidativas e hidrolticas, respectivamente.
Conservacin y preparacin
Conservacin de la enzima
Los efectos acumulativos de las etapas del procesamiento requeridas en la produccin de un bloque de tejido
impregnado en parafina, como la fijacin, deshidratacin
e inclusin en cera de parafina, no son favorables para la
preservacin funcional de las enzimas. Por lo general, estos procedimientos dan lugar a la prdida completa de la
actividad enzimtica, aunque la esterasa de cloracetato y
la peroxidasa son resistentes en grado suficiente al dao
del procesamiento de la parafina. Por lo tanto, las demostraciones de la mayor parte de las enzimas se llevan a cabo
casi siempre en cortes congelados, pero tambin pueden
emplearse otras preparaciones como los frotis.
Es importante recordar que diversas enzimas reaccionan
de manera diferente a las influencias externas, pero la mayor parte de las enzimas se pierde con rapidez si el tejido
fresco se deja a temperatura ambiente. Muchas enzimas
oxidativas que poseen relevancia diagnstica para investigar una enfermedad del msculo se localizan en la mitocondria. Cuando se sustrae el oxgeno del tejido fresco,
las membranas mitocndricas se daan en poco tiempo y
se observa la reduccin de la actividad de la enzima. En
consecuencia, es importante congelar a la brevedad el tejido, que est fresco, ya que casi ninguna enzima oxidativa
puede soportar la fijacin convencional. Las enzimas hidrolticas estn contenidas en los lisosomas, pero se alteran por
el congelamiento y el subsiguiente descongelamiento de los
bloques o cortes con liberacin de enzimas. La difusin de
las enzimas hidrolticas puede minimizarse y la localizacin
mejorarse si el tejido se trata con un fijador antes de la criotoma, aunque es posible alguna prdida de la actividad enzimtica. En la prctica, la tincin histoqumica de la enzima se
efecta sobre las muestras desmontables del cristato, sobre
todo en circunstancias clnicas en las que un retraso diagnstico es indeseable o cuando se necesita reconocer diferentes
enzimas en la misma muestra. Empero, la localizacin de
algunas enzimas puede resultar un poco mejor si se fija el
espcimen de tejido despus de la criotoma.
Si se recurre a la fijacin, los fijadores deben estar a 4C y
utilizarse por el menor tiempo posible. Con frecuencia se recomienda el formol de calcio para los bloques de tejidos, ya
que ayuda a mantener la integridad de la membrana celular,
aunque la formalina amortiguada o la salina formal son satisfactorias en casi todos los casos. La criotoma y la actividad
de la enzima pueden mejorarse al lavar el tejido fijado en una
solucin amortiguadora de sucrosa antes del congelamiento.
Para resultados ptimos es importante mantener estas soluciones cercanas al pH fisiolgico del tejido. Se ha empleado
una variedad de fijadores, adems del formol de calcio, en
frotis y secciones de cristatos, entre ellos acetona, vapor
de formalina y mezclas de formalina-alcohol. La opcin del
fijador depende de la enzima particular investigada y de la
relacin entre la actividad enzimtica y el aspecto morfolgico. Aun despus de tiempos de fijacin cortos, la mayora
de las enzimas oxidativas se torna inactiva pero, segn se
mencion ya, la fijacin puede emplearse en la demostracin
de estas enzimas al ayudar a preservar la morfologa celular
y la localizacin del producto final de la reaccin.
Preparacin del tejido
Varios mtodos estn disponibles para el examen de las enzimas, pero en este captulo slo se consideran los cortes
congelados, frotis y secciones de parafina. Como se ha sealado, las enzimas que deben revelarse determinan el tipo
de preparacin empleada.
Cortes congelados
La preparacin ms comn de la muestra en la histoqumica
de la enzima es el uso de cortes congelados, casi siempre
practicados con un cristato. Es necesario que el tejido se
congele con rapidez, ya que el congelamiento lento induce
artefactos de cristal de hielo: el congelamiento ms rpido
forma cristales de hielo ms pequeos. Las biopsias muscu-
TCNICAS HISTOQUMICAS
lares se consideran para la mayora de las muestras histoqumicas de la enzima de diagnstico, aunque son muy
propensas a los artefactos de cristal de hielo. El mtodo
ptimo para el congelamiento del msculo incluye el uso
del isopentano congelado con nitrgeno lquido y el descongelamiento gradual. La fraccin slida acta como un
amortiguador trmico y mantiene la temperatura de la fraccin lquida estable (150C) durante el congelamiento del
tejido. El tejido (fijado o sin fijar) se orienta sobre un disco
de corcho en gel de OCT y se sumerge en el isopentano
descongelado hasta que el gel y la muestra se congelan. De
igual modo, el corcho se une al bloque sostenedor mediante el compuesto de OCT y entonces se coloca dentro del
cristato listo para la seccin a 23C. El nitrgeno lquido
solo no puede emplearse, ya que tiene un ndice bajo de
conductividad trmica y produce una barrera trmica gaseosa alrededor del tejido, lo cual provoca dao celular al
permitir la formacin de grandes cristales de hielo.
Frotis
Los frotis pueden prepararse por varios mtodos a partir de
suspensiones de sangre, mdula sea y clulas de tejido. Los
frotis impresos de tejido, por ejemplo los ganglios linfticos, son tambin tiles si el tejido fresco se corta y la nueva
superficie se coloca suavemente otra vez en un portaobjetos
limpio. La mayor parte de los frotis se seca al aire y se fija
(segn sean las enzimas requeridas) por pocos segundos,
casi siempre con acetona fra, antes de la tincin citoqumica
de las clulas.
Secciones de cera de parafina
Casi ninguna enzima resiste los efectos del procesamiento de cera de parafina estndar, por lo cual este modo de
preparacin no suele ser til. La peroxidasa y la esterasa
de cloracetato son lo suficiente fuertes para sobrevivir a
la inclusin en cera de parafina y pueden demostrarse con
facilidad. Algunas otras enzimas pueden preservarse de
modo parcial al usar medidas especiales con ceras de bajo
punto de fusin, pero esto slo es ocasional.
29
cin primario (PRP). Este PRP puede entonces reaccionar con

un qumico conocido como agente de captura para formar un
producto de reaccin final (PRF), que debe ser insoluble y
estar en el sitio de la enzima. Numerosos factores modifican
las reacciones y todos deben controlarse de manera cuidadosa. El pH de las soluciones de incubacin es crtico para la
mayora de las reacciones de la enzima y debe mantenerse
con los amortiguadores apropiados. Al cambiar la temperatura puede alterarse la tasa de reaccin de la enzima; algunos
mtodos requieren incubacin a 37C, mientras que otros se
realizan a temperatura ambiente. La temperatura ambiente
subptima permite ms tiempo para la terminacin de la formacin del PRF y el agente de captura, lo cual mejora la localizacin del PRF en el sitio de la enzima y reduce la tasa de
reaccin. Los sustratos y los agentes de captura deben elegirse para prevenir interacciones y ambos deben difundirse
con facilidad a travs de las membranas celulares. El sustrato
y el agente secuestrador deben usarse a una concentracin
que prevenga el agotamiento durante la rpida actividad de
la enzima, pero no a una concentracin que podra inhibir la
reaccin de la enzima. La seleccin de un agente de captura
depende del mtodo enzimtico utilizado y el tipo de tejido
en el cual se encuentra la enzima. Por ejemplo, cuando se usa
el mtodo de precipitacin de metal sobre el msculo, se
prefiere la sal de calcio a la sal de plomo, dado que la segunda puede ligarse de modo inespecfico al msculo. Adems,
muchas veces hay una eleccin de sustratos, aunque muchos
sustratos que ocurren de forma natural, si bien econmicos,
pueden ser inespecficos o producir PRP que no sean del
todo insolubles. Los sustratos especialmente sintetizados
casi siempre ofrecen resultados superiores.
Es importante incluir un control positivo del tejido durante la tincin histoqumica de modo que puedan examinarse la calidad de los reactivos y la exactitud del protocolo
empleado. La omisin del sustrato del medio de incubacin o la inclusin de inhibidores especficos actan como
un control negativo.
Mtodos de reaccin de la enzima
En histopatologa, la mayor parte de las enzimas se demuestra mediante: a) acoplamiento simultneo o b) acoplamiento posincubacin.
Tcnicas histoqumicas
Estos mtodos histolgicos son los nicos en los que las
enzimas nunca se tien; slo los productos de reaccin se
delinean. Para obtener resultados relevantes son esenciales
la cuidadosa optimizacin de la reaccin de la enzima y la
coloracin del producto de reaccin.
El proceso implica el desdoblamiento de un sustrato por
la enzima ligada al tejido para formar un producto de reac-
Acoplamiento simultneo
El acoplamiento simultneo slo requiere una solucin que
contenga el sustrato y un agente secuestrador con el cofactor requerido. La enzima ligada al tejido reacciona con el
sustrato en la solucin para producir un PRP. ste puede
ser insoluble o soluble, ya que el agente secuestrador (tam-
30
CAP. 3
bin en solucin) se liga con el PRP de forma instantnea

para formar un PRF. Este PRF insoluble se liga al sitio de la
enzima y puede colorearse o permanecer incoloro, aunque
lo ltimo podra requerir un paso de coloracin adicional
para la visualizacin.
Acoplamiento posincubacin
Algunas veces no es posible tener el sustrato y el agente secuestrador en una solucin, ya que las condiciones necesarias
para la produccin del PRP pueden ser diferentes respecto de
las requeridas para la elaboracin del PRF. En ocasiones, el
agente secuestrador puede adems interferir con la funcin
de la enzima o inhibirla. En los mtodos de acoplamiento
posincubacin, la solucin inicial slo contiene al sustrato
y algunos cofactores necesarios. El PRP debe ser insoluble
puesto que son posibles falsos negativos o la difusin densa del PRF. Una solucin secundaria que contiene al agente
secuestrador se aplica entonces para producir el PRF, como
se indic. En la prctica es difcil encontrar los sustratos convenientes para los mtodos de acoplamiento posincubacin,
con un resultado que se utiliza rara vez.
Mtodos de demostracin
En condiciones normales, los PRF coloreados se producen
por uno de los siguientes mtodos:
1. Precipitacin del metal.
2. Diazo.
3. Sal de tetrazolio.
4. Mtodo indigognico.
Otros mtodos incluyen:
5. La oxidacin de 3,3-diaminobencidina (DAB) por la
oxidasa de citocromo o las peroxidasas para formar un
pigmento marrn.
6. El metabolismo del glucgeno por la fosforilasa para
producir un polisacrido que se colorea de azul/negro
con yodo.
Mtodos de precipitacin de metal
Los mtodos de precipitacin de metal se usan de rutina para
identificar fosfatasas, por ejemplo fosfatasa cida, fosfatasa alcalina y trifosfatasa de adenosina (ATPasa; fig. 3-1).
Figura 3-1 Los cortes congelados muestran la tincin diferencial de fibras musculares para ATPasa tras la incubacin a pH 4.2
con una tcnica de precipitacin de metal.
stos dependen de la liberacin de iones de fosfato del

sustrato, que entonces reaccionan con el plomo o las sales
de calcio en la solucin (agente de captura) para formar el
PRF insoluble de plomo o fosfato de calcio.
El fosfato de plomo es incoloro pero se ennegrece con
solucin de sulfuro de amonio para formar sulfuro de plomo. El fosfato de calcio es insoluble a un pH alcalino y
debe convertirse en fosfato de cobalto con solucin de cloruro de cobalto, tratado antes con sulfuro de amonio para
formar sulfuro de cobalto negro. Con el tiempo, estos mtodos son propensos a desteirse, pero pueden recolorearse
con sulfuro de amonio.
El mtodo con la acetilcolinesterasa que usa el sustrato
acetilcolina puede considerarse un mtodo de precipitacin
metlica que produce un PRP de tiocolina, el cual reacciona con el sulfato de cobre y el ferrocianuro de potasio, respectivamente, para formar ferrocianuro de cobre marrn.
Mtodos diazo
Los mtodos diazo se utilizan para identificar las fosfatasas alcalinas y cidas, la esterasa inespecfica y la esterasa
de cloracetato. Los diferentes sustratos contienen un grupo
naftol que puede atacar a una de las enzimas anteriores.
Varias sales de diazonio o la pararrosanilina hexazotizada
se emplean para reaccionar con el grupo naftol y formar
un diazo insoluble coloreado. De manera caracterstica, las
sales de diazonio usadas incluyen rojo rpido TR, azul rpido RR, azul rpido B y Garnet rpido GBC, que deben
montarse en medio acuoso. El diazo, formado a partir de la
pararrosanilina hexazotizada, es el mtodo de opcin, ya
que puede practicarse en una resina sinttica, lo que mejora
la localizacin ptica en la microscopia de luz. Las sales
APLICACIONES DIAGNSTICAS DE LA HISTOQUMICA ENZIMTICA
31
de diazonio pueden usarse con mtodos simultneos o de

acoplamiento posincubacin.
Mtodos con sales de tetrazolio
Las sales de tetrazolio, que son incoloras y solubles en
agua, aceptan hidrgeno liberado de modo enzimtico del
sustrato para formar depsitos microcristalinos coloreados
insolubles en agua, los llamados formazanes. Muchas enzimas oxidativas, como la deshidrogenasa succnica, se identifican mediante sales de tetrazolio, como el metil-tiazolildifenil tetrazolio (MTT; fig. 3-2) y el tetrazolio nitroazul
(NBT). Como en el caso de las sales de diazonio, varios
Figura 3-3 Corte congelado de yeyuno que muestra la actividad

de la lactasa sobre la microvellosidad, teida de turquesa mediante el mtodo indigognico.
2. Sospecha de enfermedad de Hirschsprung en nervios y

ganglios.
3. Valoracin de la malabsorcin del tejido gastrointestinal.
4. Demostracin de clulas linfoides y mieloides.
5. Identificacin de degeneracin temprana del hgado.
Las dos primeras aplicaciones son las ms comunes, pero
se remiten inusualmente a los centros de diagnstico especializados.
Figura 3-2 Corte congelado de msculo teido para diaforasa de
NADH con la sal de tetrazolio MTT.
factores modifican su seleccin, pero el NBT se usa ms a

menudo que el MTT, de modo que puede montarse en una
resina sinttica.
Mtodo indigognico
Los sustratos contienen un grupo indoxilo, que se libera como un PRP; ste, a su vez, se oxida por accin del
agente de captura ferrocianuro de potasio para formar PRF
turquesa (fig. 3-3). La solucin de incubacin tambin incluye ferrocianuro de potasio, que previene la sobreoxidacin del PRF.
Aplicaciones diagnsticas
de la histoqumica enzimtica
La histoqumica de la enzima puede ser de utilidad en varias aplicaciones diagnsticas, entre ellas las siguientes:
1. Tipificacin de la fibra muscular esqueltica.
Msculo esqueltico
Se ha establecido con firmeza el uso de la histoqumica enzimtica en el diagnstico de las enfermedades neuromusculares y miopatas congnitas; en realidad, muchos aspectos
histopatolgicos slo se reconocieron y describieron despus
de la introduccin de la histoqumica de las enzimas.
La tincin tradicional del msculo estriado es suficiente
para mostrar las reacciones inflamatorias y la variacin del
tamao de la fibra, pero es incapaz de diferenciar entre los
diversos tipos de fibra muscular. Esto es importante porque
muchas enfermedades se limitan a tipos especficos de fibras musculares o muestran alteracin de stas. La anomala
puede asumir la forma de atrofia o hipertrofia y, en ciertas
afecciones, de alteracin de la estructura celular interna. La
aplicacin de los mtodos de histoqumica enzimtica al
msculo esqueltico cortado en sentido transversal facilita la
distincin de los tipos de fibras; esto, junto con el examen de
su distribucin y tamao, puede ser de utilidad diagnstica.
En general, las fibras del msculo estriado pueden dividirse
en los tipos 1 y 2, de acuerdo con el nivel de actividad de la
ATPasa mostrada a un pH de 9.4. Si la tincin de la ATPasa
se aplica despus de la preincubacin en un amortiguador a
32
CAP. 3
un pH de 4.2 o 4.6, es posible establecer una diferenciacin

adicional de las fibras de tipo 2 en los subtipos 2A, 2B y
2C (fig. 3-1). Otra enzima importante para demostrar es la
fosforilasa, que en la enfermedad de McArdle es deficiente en las clulas del msculo estriado, pero no desaparece
del msculo liso de los vasos sanguneos, y por tanto es
til como control. La diaforasa de NADH (dinucletido de
nicotinamida y adenina reducido) se utiliza para el estudio
de la estructura interna de las clulas musculares, dado que
delinea a la mitocondria y a la red del retculo sarcoplsmico (fig. 3-2). Cuando esto se compara con la distribu-
cin miofibrilar de la ATPasa pueden reconocerse varias

anomalas. Los patrones anormales de la distribucin de la
enzima se describen a menudo en trminos de sus aspectos,
que son especficos de una enfermedad particular, como
fibras objetivo, fibras anulares y ncleos centrales.
La oxidasa del citocromo, deshidrogenasa succnica y deshidrogenasa de lactato son ms especficas para la mitocondria y pueden proporcionar ayuda en la identificacin
de miopatas mitocndricas. En el cuadro 3-1 se muestra
un resumen de la tincin diferencial enzimtica del msculo esqueltico.
Cuadro 3-1 Histoqumica enzimtica diagnstica

Tejido
Msculo
estriado
Enzima
Mtodo
Sustrato
pH
Color
Identificacin
ATPasa
miofibrilar
Precipitacin metlica
(cloruro de calcio)
Trifosfato de adenosina
(ATP)
9.4
Negro/marrn
Fibras tipo 1: plidas

Fibras tipos 2a, 2b y 2c:
oscuras
Preincubacin de
precipitacin metlica
(cloruro de calcio)
@ pH 4.6
Fibra tipo 1: oscuras

Fibras tipos 2b y 2c: intermedias
Fibras tipo 2a: plidas
Preincubacin de
precipitacin metlica
(cloruro de calcio)
@ pH 4.2
Fibras tipo 1: oscuras

Fibras tipo 2c: intermedias
Fibras tipos 2a y 2b: plidas
NADH
diaforasa
Sal de tetrazolio (MTT)
NADH
7.0
Negro
Mitocondria (fibras tipo

1: ms oscuras)
Retculo sarcoplsmico
Deshidrogenasa
succnica
Sal de tetrazolio (MTT)
Succinato de sodio
7.0
Negro
Para mitocondria (fibras

tipo 1: ms oscuras)
Oxidasa de
citocromo
Oxidacin de DAB
Citocromo c
7.4
Marrn
Anormalidades mitocndricas
Miofosforilasa
Metabolismo de
glucgeno (yodo)
Glucosa-1 fosfato
5.9
Prpura/negro
Tincin negativa de las

fibras musculares en la
enfermedad de McArdle
Desaminasa de
mioadenilato
Sal de tetrazolio (NBT)
Adenosina 5monofosfato (AMP)
6.1
Azul
Ausente en algunos trastornos metablicos
Fructosa disdica
1,6 difosfato
8.6
Rojo/marrn
Fibras y clulas del nervio

En recto, colon (Hirschsprung) y enfermedades
musculares
Turquesa
Reducido o negativo con

malabsorcin
Aldolasa
Fosfofructocinasa
Fructosa 6-fosfato
Nervios
Acetilcolinesterasa
Ferricianuro de potasio
reaccin de sulfato de
cobre (precipitacin
metlica)
Yeyuno
Lactasa
Mtodo indigognico
(ferrocianuro de potasio)
Diazo (pararrosanilina)
Sucrasa
7.0
Yoduro de acetiltiocolina 6.0
d-Fucosida de 5-bromo- 6.0

4-cloro-3-indoxil-
d-Glucosida de 6-bromo- 6.0
2-naftil-
Rojo
APLICACIONES DIAGNSTICAS DE LA HISTOQUMICA ENZIMTICA
33
En fecha reciente, los mtodos inmunohistoqumicos se

han desarrollado para la tipificacin confiable de la fibra
muscular del tejido procesado con parafina. Si bien ste
puede tener un importante potencial diagnstico para tales
tejidos procesados, no permite la identificacin de las otras
enzimas relevantes desde el punto de vista diagnstico o la
capacidad para mostrar su actividad metablica.
Nervios y ganglios
En el colon y recto normales, las clulas ganglionares y
nervios relacionados se encargan de la motilidad del colon.
En la enfermedad de Hirschsprung infantil se reconoce
la ausencia ganglionar en la unin de las capas circular y
longitudinal del msculo liso (plexo mientrico) y en la
submucosa. Existe tambin un incremento marcado del
nmero y grosor de las fibras nerviosas no argirfilas en la
submucosa y la lmina propia. En la actualidad, las clulas
ganglionares pueden identificarse sobre un corte con H-E,
pero esto es mucho ms difcil con las fibras del nervio. Las
clulas ganglionares y las fibras del nervio contienen colinesterasa, la cual puede reconocerse con el mtodo rpido
de la acetilcolinesterasa. En condiciones normales se requiere la identificacin de la enfermedad de Hirschsprung
para confirmar el diagnstico inicial y ms tarde, durante
la operacin correctiva, cuando los lmites de la reseccin
deben precisarse antes de la eliminacin del intestino anormal. Como sta se lleva a cabo durante la intervencin mediante biopsias pequeas de aspiracin rectal, la rapidez
es esencial. Las muestras obtenidas con cristato y teidas
con H-E suelen ser suficientes para detectar la presencia
o ausencia de clulas ganglionares grandes; no obstante,
puede utilizarse cualquier biopsia superficial que no descarta el mtodo de la acetilcolinesterasa para mostrar las
fibras del nervio anormales en la lmina propia (fig. 3-4).
El mismo mtodo puede usarse para demostrar anormalidades motoras de la placa terminal en biopsias de msculo estriado.
Tejido gastrointestinal
Para determinar un diagnstico definitivo en las biopsias
gastrointestinales con sospecha de mala absorcin, la informacin morfolgica es insuficiente. Varias enzimas en
el contorno de la vellosidad son tiles, pero las disacaridasas, lactasa, trehalasa y sucrasa son en particular importantes. Estas enzimas reflejan cambios observados al daarse el enterocito; la lactasa (fig. 3-3) es la ms sensible,
mientras que la sucrasa es la ms resistente y por lo tanto
la tincin histoqumica para estas dos disacaridasas es de
utilidad. Estos mtodos pueden tambin emplearse para
Figura 3-4 Corte congelado de tejido rectal con enfermedad de

Hirschsprung teido para acetilcolinesterasa que demuestra las fibras engrosadas del nervio.
detectar deficiencias primarias de lactasa o sucrasa, aunque

en clnica la prueba bioqumica de estos disacridos es ms
importante que la identificacin histoqumica.
La fosfatasa cida encontrada en los lisosomas de los
enterocitos y en macrfagos de la lmina propia puede
tambin ser una enzima til para demostrar malabsorcin.
Para evaluar y vigilar de modo apropiado la malabsorcin se
requiere que el yeyuno se oriente de tal forma que las vellosidades se seccionen en sentido longitudinal.
Clulas linfoides y mieloides
Diversas enzimas, incluidas la esterasa inespecfica, la fosfatasa cida y la esterasa de cloracetato, se usan para la identificacin citoqumica y evaluacin de clulas en preparaciones para frotis, como se muestra en el cuadro 3-2. Adems
de la actividad enzimtica, las clulas especficas pueden
diferenciarse por su patrn de tincin, es decir, focal o difuso. La inmunohistoqumica es ahora el mtodo optativo para
34
CAP. 3
Cuadro 3-2 Tincin histoqumica enzimtica de los leucocitos

Enzima
Mtodo
Sustrato
pH
Color
Comentario
Esterasa de cloracetato
Cloracetato de
naftol AS-D
6.3
Rojo
Fosfatasa cida
Fosfato de naftol
AS-BI
5.0
Rojo
Fosfatasa alcalina
Diazo (rojo rpido TR)
8.0
Rojo
Primero se tien las clulas cebadas, luego los eosinfilos y neutrfilos

Las clulas T de los monocitos difusamente teidos tienen una sola
mancha pequea
Neutrfilos
Esterasa inespecfica
7.6
Rojo
Monocitos
Acetato de -naftilo
la identificacin de estas clulas en la histopatologa, pero

algunos departamentos de hematologa todava utilizan los
mtodos enzimticos histoqumicos. La esterasa de cloracetato, que resiste la inclusin en parafina, como se mencion con anterioridad, puede distinguir clulas linfoides y
mieloides. Los mastocitos se reconocen con facilidad por
su tincin intensa, morfologa y granularidad mediante este
mtodo histoqumico de la enzima (fig. 3-5).
Conclusin
La histoqumica de la enzima todava desempea un papel
vital en la histopatologa, sobre todo en la deteccin y diagnstico de la enfermedad muscular, incluso si estn ahora
disponibles nuevos mtodos inmunohistoqumicos. En la
inmunocitoqumica y la biologa molecular, las tcnicas histoqumicas de la enzima se utilizan de rutina en los sistemas
de deteccin. El mtodo del formazn para la deshidrogenasa succnica se ha usado de manera exitosa en macrocortes
frescos del corazn tras identificar post mortem el infarto
del tejido. El cientfico forense tambin ha usado los mtodos histoqumicos de la enzima para determinar la fecha y
el tiempo en que se cometi una herida. En la investigacin
se estudia un espectro mucho ms amplio de enzimas con
tcnicas diversas, entre ellas microscopia electrnica y citometra de flujo, adems de la microscopia de luz.
Referencias
Figura 3-5 La muestra en parafina de la piel muestra mastocitos
de la dermis teidos de rojo para esterasa de cloracetato con cloracetato de naftol AS-D y pararrosanilina de hexazonio.
Degeneracin heptica
La ausencia de actividad enzimtica en los cortes congelados de hgado puede ser til en la identificacin temprana
del dao al hepatocito y los cambios cirrticos. Donde existe
un cambio cirrtico notorio, es importante el control de la
muestra en ausencia de algunos hepatocitos normales presentes que acten como control interno. La redistribucin de
la actividad enzimtica, como la fosfatasa cida localizada
en los ncleos, es tambin una seal temprana de dao celular y necrosis eventual debido a la degeneracin lisosmica.
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4
Inmunohistoqumica
Jane Starczynsky y John Crocker
Introduccin
En trminos de la funcin normal y los estados de enfermedad, el estudio de la morfologa simple de cortes o clulas
casi siempre es suficiente para el anlisis. Segn se describe
en los captulos 3 y 5, las tcnicas auxiliares como la histoqumica, histoqumica enzimtica y microscopia electrnica
pueden ser las ms provechosas para entender mejor la naturaleza y el estado funcional de una clula o un tipo de tejido. Sin embargo, en el decenio de 1970 result evidente que
era necesaria y posible una valoracin ms detallada de los
productos de la funcin celular. En histopatologa, el advenimiento de la inmunohistoqumica (IHQ) fue emocionante
y abri grandes y nuevas perspectivas en la investigacin de
biopsias y las muestras quirrgicas de escisin. El principio
que subyace a la IHQ es la demostracin del antgeno por
medio de su enlace a un anticuerpo que, a su vez, se une
a una marca que puede visualizarse en forma histolgica
(fig. 4-1). En consecuencia, puede delinearse el sitio del antgeno en cuestin. Los mtodos de IHQ se pueden clasificar
en tres grupos principales, directos, indirectos y complejos,
desde aquellos que usan la fluorescencia ultravioleta activada hasta los cromgenos. Adems, el material particulado,
como el metal pesado, se puede utilizar en los microscopios
de luz y electrnico.
Mtodos directos
En los mtodos directos, el anticuerpo dirigido contra cierta
molcula o parte de ella (epitopo) se une a un espcimen. El
anticuerpo tiene un agente indicador unido a l y entonces
se visualiza de manera directa. El mtodo es relativamente
insensible en tanto que no haya ninguna amplificacin

de la seal antignica. La tcnica directa se ha abandonado
en gran parte en los procedimientos IHQ; empero, an es
el mtodo de eleccin para la citometra de flujo (vase
cap. 8).
Mtodos indirectos
Los mtodos indirectos implican el uso de capas del anticuerpo para demostrar el antgeno en cuestin. Esto lo
ilustra de forma tpica la acumulacin de estratos de anticuerpos dirigidos contra antgenos de especies que difieren
en especificidad, lo que crea un cono invertido de molculas, de tal modo que se amplifica en grado notable la
seal original. Por ejemplo, como primer paso se reactiva
mejor el antgeno de conejo antihumano con un anticuerpo
de cerdo anticonejo marcado. Esto proporciona mayor sensibilidad que los mtodos directos, pero los mtodos ms
complejos lo han reemplazado en gran proporcin.
Mtodos de mltiples etapas

Estos mtodos emplean capas de anticuerpos y marcas para
amplificar la seal en el sitio de enlace del anticuerpo. Son
ejemplos los mtodos del puente enzimtico, la peroxidasaantiperoxidasa (PAP) y las tcnicas de la fosfatasa alcalinaantifosfatasa alcalina (APAAP), adems de los basados en
avidina/estreptavidn-biotina. En todas estas reacciones la
sensibilidad de la seal es mucho mayor que en las tcnicas
directas e indirectas y el cono invertido de la amplificacin
es mucho ms grande con las capas mltiples de molculas.
36
CAP. 4
INMUNOHISTOQUMICA
Figura 4-1 Diagrama esquemtico para mostrar algunas de las secuencias ms comunes en IHQ. a) Mtodo directo: el anticuerpo primario
marcado reacciona con el antgeno del tejido. b) Mtodo indirecto de dos pasos: el anticuerpo secundario marcado en forma enzimtica
reacciona con el anticuerpo primario unido al antgeno del tejido. c) Mtodo indirecto de tres pasos: el anticuerpo terciario marcado de modo
enzimtico reacciona con el anticuerpo secundario marcado. d) El complejo APAAP reacciona con el anticuerpo secundario. El anticuerpo
primario y el anticuerpo del complejo inmunitario deben ser de la misma especie. e) En el mtodo CAB, el complejo avidina o estreptavidina-biotina-enzima reacciona con el anticuerpo secundario biotinilado. f) En la secuencia catalizada de la amplificacin de la seal (CSA),
el anticuerpo primario antecede a un anticuerpo secundario biotinilado, luego sigue el complejo (estrept)avidina, despus el reactivo de la
amplificacin y, por ltimo, el complejo (estrept)avidina-enzima. g) Tincin dual para dos epitopos mediante la metodologa CSA. Se aplica
el primer anticuerpo, le sigue la primera molcula de la espina y a continuacin un cromgeno apropiado. Despus se aplica un agente de
bloqueo. Se utiliza luego el segundo anticuerpo primario, con una segunda molcula espina y un segundo cromgeno. h) Simbologa para
a) a f). Reproducido con autorizacin de DAKO Cytomation Ltd.
MTODOS DE MLTIPLES ETAPAS
37
Molculas fluorescentes
Anticuerpo primario
Anticuerpo secundario
Anticuerpo secundario (anticonejo)
Anticuerpo secundario (antirratn)
Antgeno tisular primario
El indicador original fue la tincin fluorescente, que marcaba al anticuerpo apropiado. A continuacin se poda visualizar el antgeno por microscopia fluorescente (vase cap.
6). Una limitacin del uso de las molculas fluorescentes
indicadoras es su fotoinestabilidad, esto es, la seal se decolora de manera gradual al exponerse a la luz del da. Debe
advertirse que las propiedades antignicas, no tanto las fluorescentes, de la fluorescencia se utilizan ahora por el buen
efecto sobre los sistemas de deteccin que no se basan en la
biotina por IHQ. En la actualidad se dispone de fluorforos
mltiples con diversas frecuencias de excitacin y emisin
que puedan emplearse para permitir el marcado simultneo
de antgenos mltiples dentro del mismo tejido.
La inmunofluorescencia tiene un uso relativamente limitado en el laboratorio de diagnstico, pero todava se considera en la valoracin de las biopsias de rin (fig. 4-2) y
Antgeno tisular secundario

Enzina PR
Enzima FA
Bloqueo de tincin doble
Rojo sensible
Polmero (molcula espinal)
Figura 4-1 (Continuacin)
Molculas indicadoras y de acoplamiento

Para visualizar el antgeno, si bien de modo indirecto, es
necesario producir una seal visual para localizar el sitio
de unin en las clulas o los tejidos. Por consiguiente, se ha
desarrollado una gama de sistemas indicadores a travs
de los aos. stos se describen a continuacin en un orden
cronolgico aproximado.
Figura 4-2 Micrografa de un glomrulo de una biopsia renal.

El paciente padeca una glomerulopata IgA y la delicada inmunotincin se puede reconocer en este corte congelado, reactivado
con IgA (verde fluorescente). Reproducido por cortesa del Dr.
Aarnoud Huissoon.
piel, quiz porque el material favorece la demostracin del

antgeno lineal o membranoso. Todava se utiliza extensamente para la localizacin del antgeno en la investigacin;
adems, con la capacidad simultnea de localizar los antgenos mltiples dentro del mismo tejido o clula, proporciona la informacin til sobre las interacciones celulares
y protenicas.
Peroxidasa
La peroxidasa de rbano (PR) es una molcula que se adapta de modo extraordinario para la investigacin de la enfermedad humana. En primer lugar, no es de origen mamfero,
38
CAP. 4
INMUNOHISTOQUMICA
sino que se deriva, por supuesto, de una planta. Esto significa

que las oportunidades de una reaccin cruzada antignica se
reducen; no obstante, debe notarse que la actividad enzimtica de la PR es similar a la de los mamferos y esto puede
causar problemas cuando la enzima se demuestra en tejidos
o clulas (vase ms adelante). En segundo lugar, puede revelarse con facilidad a travs de su reaccin con diversos
sustratos y se forma un producto teido de la reaccin que
puede visualizarse al microscopio, por ejemplo la 3,3-diaminobencidina (DAB) en presencia de perxido de hidrgeno. Por ltimo, es una molcula que puede usarse en el plano
ultraestructural. El marcado de PR se ha utilizado en tcnicas directas, indirectas y de mltiples etapas. Por algunos
aos, la principal tcnica de los laboratorios de histopatologa fue el mtodo de la peroxidasa-antiperoxidasa (PAP).
Sin embargo, la tcnica de la avidina-biotina (CAB) ms
amplificadora ha desplazado en buena medida a aqulla.
Un problema con el uso de la PR es que arroja resultados
falsos en presencia de actividad peroxidsica endgena en
tejido humano u otros, lo que conduce a una reaccin positiva; por ejemplo, los neutrfilos polimorfonucleares tienen actividad peroxidsica endgena. Afortunadamente, esta
actividad se puede bloquear en gran parte mediante pretratamiento de la muestra con reactivos bloqueadores, sobre
todo perxido de hidrgeno o cido clorhdrico en metanol
y azida de sodio. Incluso con esta medida, ciertas clulas, en
particular neutrfilos polimorfonucleares y mastocitos, que
son muy ricos en peroxidasa, pueden expresar resultados positivos falsos.
nada con la plata a partir de compuestos argentosos, en virtud de la diferencia de electropositividad. Esto suministra
una secuencia muy sensible de la reaccin, que encontr un
uso extendido en la microscopia de luz hace unos 10 aos,
cuando se utiliz en estudios como mtodo de marcado para
los epitopos de baja expresin, como aquellos de superficies
celulares. Sin embargo, debe indicarse que el mtodo nunca
encontr una amplia aplicacin diagnstica y slo se limit
a su uso en investigacin. Adems, lo ha sustituido en buena medida la serie de mtodos del complejo avidina-biotina
(CAB). Pese a ello, un uso importante de la tcnica inmunourica se reconoce en el campo de la microscopia inmunoelectrnica, en la cual las partculas metlicas se pueden ver
al localizarse en sitios antignicos; en realidad, es posible
demostrar ms de un antgeno en la misma preparacin con
los anticuerpos ligados a las partculas de oro de tamaos
diversos.
Avidina-biotina
Los mtodos de avidina-biotina se basan en la unin de alta afinidad entre avidina (o estreptavidina) y biotina. Esta
afinidad en extremo elevada es esencial para su aplicacin
como una etapa intermedia de los mtodos de amplificacin
y extrema sensibilidad, como el CAB (fig. 4-3). Los anti-
Fosfatasa alcalina
La fosfatasa alcalina (FA) es otra enzima que ha encontrado
amplio uso en la IHQ, en especial en las preparaciones celulares. Esto ltimo se debe en gran medida a la gran sensibilidad de la interaccin fosfatasa alcalina-antifosfatasa alcalina
(APAAP) resultante. La FA puede proporcionar productos
de reaccin de color vivo con ciertos sustratos, pero en general stos manifiestan el problema de que, al contrario del
producto de reaccin de la DAB, son solubles. Esto significa que las muestras se deben montar en medios acuosos;
anteriormente, stos eran lquidos y creaban problemas con
el almacenamiento por largo tiempo, pero en la actualidad
se dispone de montajes permanentes. Una vez ms, puede
haber problemas con la fosfatasa alcalina endgena tisular,
pero esto puede bloquearse con agentes como el levamisol.
Oro-plata
Los anticuerpos se pueden unir a los agregados uniformes
y finos del oro elemental y ste reacciona de forma alter-
Figura 4-3 Micrografa de un linfoma folicular, inmunoteido

para la oncoprotena bcl-2, mediante la metodologa CAB.
cuerpos secundarios se biotinilan, con la capa terciaria de

avidina conjugada a una molcula indicadora, por ejemplo
PR o FA. El mtodo CAB ha encontrado un uso extenso en
laboratorios de diagnstico e investigacin y es tal vez el
estndar actual. Un problema potencial con los sistemas basados en CAB es que la avidina y la biotina se pueden en-
MTODOS DE MLTIPLES ETAPAS
contrar en tejidos normales. Es importante considerar esto

cuando se analizan estos especmenes y puede recurrirse
al uso de los bloques de avidina/biotina para contrarrestar
este problema.
Amplificacin de la seal de la tiramina
Este mtodo muy sensible amplifica en grado notable la
seal, hasta 103 veces ms respecto de otros mtodos. En
este sistema, la PR acta como catalizador en la sedimentacin de la tiramida, ligada a un fluorocromo o la biotina
en las reacciones directas e indirectas. Lo anterior es de
gran valor cuando el antgeno objetivo se expresa en grados
bajos y puede ser inferior al umbral para la deteccin con
mtodos estndar de IHQ.
39
tripsina. La base exacta de tales procesos es incierta, pero

se admite que ciertos grupos antignicos son desenmascarados en trminos bioqumicos por la eliminacin de las
cadenas laterales que oscurecen, lo cual hace posible el acceso del anticuerpo primario. Las enzimas son muy lticas
y la titulacin antes del uso regular es esencial para evitar
la alteracin del tejido.
Pretratamiento con microondas
Se ha observado ya que puede haber problemas con la actividad enzimtica endgena y molculas endgenas dentro del
tejido normal. Se han desarrollado mtodos ms recientes
mediante marcas que no se encuentran habitualmente en el
tejido normal. La fluorescena encontr aceptacin reciente
como reactivo acoplador, no en virtud de su fluorescencia
sino como antgeno: esta molcula presenta la ventaja obvia
de que carece de un anlogo humano.
Un acercamiento novedoso para la amplificacin de la seal ha sido la introduccin de sistemas basados en polmeros.
stos permiten que las marcas mltiples enzimticas (PR/FA)
se unan al anticuerpo secundario a travs de la columna vertebral del polmero. Este tipo de sistema es un procedimiento
de dos etapas y de ese modo ahorra tiempo en relacin con
los sistemas convencionales de avidina/biotina, mientras que
las marcas mltiples enzimticas mantienen la sensibilidad.
En el decenio de 1990 result evidente que ciertos epitopos

se podan desenmascarar con el uso de la radiacin de
microondas controlada de las secciones del tejido en medio
acuoso. Como en el caso del pretratamiento de la enzima,
el mecanismo que subyace a esto se encuentra lejos de ser
claro; no obstante, esta tcnica encontr una aplicacin
muy amplia en los ltimos aos. Como los mtodos enzimticos, el tratamiento con microondas no slo mejora la visualizacin en algunos casos de ciertos antgenos, sino que
tambin puede permitir la deteccin, cuando antes ninguna
era posible. Como en el tratamiento enzimtico, es necesaria la titulacin de la sincronizacin de la microonda.
Otro desarrollo reciente ha sido el uso del cocimiento
a presin de las secciones para mejorar la inmunotincin.
Esto es algo ms peligroso que el uso cuidadoso de los hornos de microondas. En algunos centros tambin se utilizan
el cocimiento a presin mediante hornos de microondas, la
esterilizacin, el cocimiento con vapor y ebullicin simple.
Con la metodologa de la recuperacin, es esencial utilizar portaobjetos microscpicos precubiertos para evitar
la prdida de tejido de la superficie del portaobjetos. Los
portaobjetos cargados de modo positivo estn disponibles
en el comercio; las alternativas incluyen recubrimiento de
los portaobjetos con poli-l-lisina, APES o Vectabond.
Enlace inespecfico del anticuerpo
Controles
Los lectores deben observar que los anticuerpos primarios pueden ligarse de forma inespecfica a muestras de tejido, en gran
parte por medio de sus fracciones Fc. Es mucho ms probable que el problema se suscite con policlonales y menos con
reactivos monoclonales. Esto puede superarse casi siempre por
medio del bloqueo con el suero no inmunitario apropiado.
Es muy importante instituir ciertos controles esenciales antes de probar cualquier anticuerpo nuevo y, en condiciones
ideales, por lo menos algunas de estas exigencias se deben
aplicar sobre una base de diagnstico diario. Los controles
positivos implican la inclusin de las muestras conocidas
para tener elementos reactivos con el anticuerpo en cuestin. ste es el control ms importante y usado con regularidad en el diagnstico diario IHQ. Es til algunas veces
preparar un bloque tisular compuesto incluido en cera de
parafina que contenga una combinacin de piezas pequeas de los controles positivos conocidos y montarlo en el
mismo portaobjetos como la muestra de prueba. Esto permite al patlogo ver ambas estructuras teidas, de forma
positiva o negativa, al mismo tiempo.
Sistemas sin biotina
Mtodos de recuperacin de antgeno

Pretratamiento de la enzima
A finales de la dcada de 1970 se reconoci que la inmunotincin se poda mejorar con el pretratamiento de las muestras con ciertas enzimas proteolticas, como la pronasa o la
40
CAP. 4
INMUNOHISTOQUMICA
Figura 4-4 Cortes teidos de forma doble para demostrar la reactividad citoplsmica en marrn (DAB, Menarini) para la cadena ligera
de Ig y la actividad citoplsmica (Vector SG) de gris acero para la cadena ligera . En a), las clulas plasmticas en una amgdala
reactiva muestran una mezcla de clulas, en la que algunas contienen una cadena y otras la restante. En b), todas las clulas plasmticas
(en una biopsia de piel) contienen la cadena y son, por lo tanto, clonales.
Cuando un anticuerpo nuevo se halla bajo evaluacin

antes de su uso diagnstico o de investigacin, se requiere
una gama de controles ms rigurosos, entre ellos los siguientes: bloqueo con el antgeno/epitopo puro (es decir, el anticuerpo preadsorbente con su antgeno objetivo);
la omisin del anticuerpo primario (o reemplazo con un
control igualado de modo isotpico) u otros anticuerpos en
la secuencia y aplicacin de la reaccin cromgena sola.
Tales controles comprueban la especificidad de la unin
primaria del anticuerpo y la necesidad de su presencia en el
resultado positivo de la reaccin.
Mtodos de marcacin dual
A menudo es importante poder demostrar ms de un antgeno o epitopo en una clula o tejido particular. Un ejemplo es la demostracin de las cadenas ligeras (kappa) y
(lambda) para determinar la clonalidad en una lesin linfocitoide (fig. 4-4). La pregunta es, por supuesto, se trata
de una muestra de tejido linfoide benigno o maligno? La
exposicin de monoclonalidad en las clulas o sobre ellas
de un corte debe indicar malignidad; la capacidad para demostrar esto debe modificar el control del paciente. Para
identificar ms de un antgeno/epitopo se utilizan los sustratos cromgenos de diversos colores y por consiguiente se determina la preparacin. La IHQ tambin se puede
combinar con otras tcnicas, como el mtodo de AgNOR
(vase cap. 8), histoqumica convencional e hibridacin

in situ.
Anticuerpos policlonales y monoclonales
El trabajo inicial sobre IHQ se llev a cabo mediante antisueros policlonales inoculados en mamferos contra preparaciones antignicas. Estos antisueros fueron politpicos
y por tanto tendieron a proporcionar patrones de tincin
que no estaban muchas veces claros en los cortes, con la
unin de diversos anticuerpos constitutivos a sitios microscpicos ms bien variables. El mtodo de purificacin de
afinidad, en el cual el anticuerpo policlonal se hizo pasar
a travs de una columna que contena el antgeno objetivo
unido a la matriz, mejor la especificidad de los reactivos.
Con el advenimiento de los anticuerpos monoclonales result posible la localizacin mucho ms clara y especfica de epitopos y por consiguiente una mejor delineacin de
las especies celulares y tisulares.
Pese a ello, un problema inicial de peso fue que, a diferencia de muchos anticuerpos policlonales, la mayor parte de
los anticuerpos monoclonales no poda aplicarse con xito
de forma regular a las muestras incluidas en cera de parafina
guardadas. Por consiguiente, la mayora de los estudios iniciales dependi de la disponibilidad de material congelado
de la seccin, con su preservacin morfolgica relativamente
pobre. Sin embargo, hoy, con la llegada de los anticuerpos
PROYECCIN DE IMAGEN
monoclonales de afinidad ms alta, muchos se pueden aplicar

a los cortes en parafina, sobre todo tras el uso de los mtodos de recuperacin del antgeno. No obstante, las secciones
congeladas pueden ofrecer una ventaja sobre las muestras en
cera de parafina dado que pueden suministrar una mejor visualizacin de los antgenos de superficie.
Aplicaciones de la inmunohistoqumica
Rebasa los lmites de este libro delinear una explicacin
comprensiva de los innumerables usos de la IHQ en el laboratorio de diagnstico. Basta con sealar que esta tecnologa se puede utilizar en el diagnstico y como indicador
del pronstico en patologa celular comn. La IHQ ha permitido distinguir entre los linfomas y carcinomas celulares
pequeos, melanomas y seminomas, mesoteliomas y adenocarcinomas, y linfomas de clulas B y T. Adems, es posible
identificar microorganismos muy diversos, desde Cytomegalovirus hasta Toxoplasma y, como se discute en el captulo
8, se puede determinar la proliferacin celular y el estado
apoptsico. Adems, pueden demostrarse las hormonas, los
receptores de la hormona, los factores del crecimiento, las
molculas de adhesin y los productos oncgenos, al igual
que los ligandos para ciertas molculas. No obstante, como
advertencia debe subrayarse que los epitopos compartidos
no indican en todos los casos orgenes comunes. Por ejemplo, las clulas de Reed-Sternberg de la enfermedad de
Hodgkin y las clulas del adenocarcinoma expresan CD15,
sin que ello indique que estos tipos de clula posean un linaje
comn. Un campo cada vez ms importante para el uso de la
IHQ se sita en la valoracin del pronstico, que puede ayudar al clnico a prescribir con mayor precisin el tratamiento
ms conveniente para una enfermedad maligna en particular.
Los ejemplos se hallan en la valoracin de la fraccin del
crecimiento por medio del anticuerpo Ki67. Asimismo, la
expresin de la oncoprotena bcl-2 confiere un pronstico
relativamente pobre en linfomas de alto grado. La investigacin del receptor de estrgeno y progesterona y el estado
HER2 son tambin de gran importancia en el tratamiento de
los carcinomas de mama.
Control de calidad
En el mundo actual que exige estndares de laboratorio
cada vez ms estrictos, son del todo recomendables el control externo de la calidad y la vigilancia interna de rutina.
Muchos pases cuentan con esquemas externos de aseguramiento de la calidad que, en general, dependen de la evaluacin de la tincin de los antgenos seleccionados por el
laboratorio objetivo. Las muestras son una combinacin
de casos directos indudables y cortes de ineludible dificul-
41
tad (p. ej., la tincin de las cadenas ligeras superficiales

de Ig sobre las clulas que presentan antgeno). Esto debe
permitir a los laboratorios mejorar y estandarizar su tcnica
a la luz de las revisiones.
Automatizacin
La inmunohistoqumica lleg al campo de la automatizacin relativamente tarde (fig. 4-5), quiz porque pocos
Figura 4-5 Aparato automtico de inmunotincin del fabricante

Dako Cytomation Ltd. Reproducido con autorizacin de DAKO
Cytomation Ltd.
anticuerpos que eran convenientes para su uso de rutina

estaban disponibles. No obstante, en poco tiempo cualquier
laboratorio dispondr de un panel grande de reactivos aplicados a numerosos cortes en cualquier procedimiento diagnstico; la automatizacin slo es cuestin de tiempo.
Los dispositivos anteriores eran semiautomatizados
y servan en gran parte para ahorrar tiempo y manipular
grandes volmenes de reactivos; esto atenuaba, por ejemplo, el tedio de los lavados mltiples con amortiguadores.
Ms adelante aparecieron en el mercado mquinas ms
automatizadas, por supuesto mucho ms costosas que sus
precursoras. Los aparatos recientes poseen microprocesadores, controlados y programables a las exigencias del
usuario, que permiten procesar de modo simultneo muestras que emplean distintos tipos de tincin.
Proyeccin de imagen
Hoy en da cada vez ms es posible cuantificar la tincin
IHQ. En el pasado, ello resultaba difcil debido al pobre
42
CAP. 4
INMUNOHISTOQUMICA
SL-50 (fig. 4-6), que permite la cuantificacin y anlisis

de portaobjetos IHQ con instrumentos de alta eficacia de
procesamiento y programas de anlisis de imagen. Esto
tambin permite crear una red virtual gracias a la cual
los patlogos pueden evaluar paneles de portaobjetos que
analizan el sistema y poner a disposicin los resultados de
manera directa en los sistemas del hospital.
Figura 4-6 Applied Imagings Ariol SL-50. Reproducido con

autorizacin de Applied Imaging.
entendimiento de la estequiometra de las reacciones IHQ,

en particular en la unin cromgena. Sin embargo, ahora
se cuenta con sistemas como el Applied Imagings Ariol
Leong AS-Y, Cooper K, Leong FJW-M. Manual of Diagnostic

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5
Microscopia electrnica en patologa
Brian Eyden
Introduccin
Los tejidos o lquidos humanos que contienen clulas se
muestrean sobre todo con propsitos diagnsticos, es decir, para la identificacin de las categoras patolgicas que
pueden reconocerse y tratarse. A menudo es necesario un
diagnstico microscpico para optimizar el control del paciente y, cuando menos en el campo del cncer, muchos
diagnsticos clnicos se modifican tras la investigacin microscpica histopatolgica.
El examen microscpico de luz de las muestras teidas
con hematoxilina y eosina (H-E) de tejidos embebidos en
cera de parafina es el procedimiento tcnico ms importante para el diagnstico slido de especmenes humanos. En
este punto, un patlogo determina aspectos de la clula y
la matriz, incluida la estructura, en el contexto de hallazgos generales y datos clnicos para precisar un diagnstico. Mientras que la microscopia de luz de los cortes con
H-E es an la base del diagnstico histolgico, tcnicas ms
nuevas, como la microscopia electrnica (ME), inmunohistoqumica, tincin AgNOR, citometra de flujo, adems de
las tcnicas citogenticas y moleculares (anlisis de reconfiguracin gnica, hibridacin de fluorescencia in situ
y la reaccin en cadena de la polimerasa [PCR]), pueden en
la actualidad proporcionar informacin adicional para depurar el conocimiento de la enfermedad y el diagnstico.
La microscopia electrnica de diagnstico ha resultado
importante desde finales de la dcada de 1960 y principios
del decenio de 1970. Sin embargo, a partir de los inicios de
los aos de 1980, la inmunohistoqumica en particular se
ha convertido en una tcnica imprescindible y ha propiciado cierta declinacin en la prctica de la ME. Dado que
la inmunohistoqumica se reconoce como la tcnica ms
conveniente y til, atrajo recursos que antes se destinaban

a la ME. Empero, la ME proporciona una informacin nica (sobre la morfologa subcelular) y puede proporcionar
por tanto nuevos datos sobre la enfermedad, parte de los
cuales tienen aplicaciones diagnsticas. Esto es as porque
en algunas afecciones bastan las caractersticas puramente
morfolgicas para establecer el diagnstico (cuadros 5-1 y
5-2), aunque tambin porque la inmunohistoqumica tiene limitaciones, si bien es una tcnica de particular importancia en el diagnstico oncolgico.
La bibliografa actual atestigua el valor de la continuacin de la ME en la investigacin y el diagnstico de
los casos de la enfermedad humana que son problemticos
para la microscopia de luz (Dar et al., 1992; Hashimoto,
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al., 2001). La carencia de informacin ultraestructural disminuye el rendimiento de un departamento de diagnstico,
puesto que la ME puede confirmar o descartar de modo
continuo las interpretaciones de los patlogos basadas en
la microscopia de luz; de esa manera aumenta la confianza
con la cual se sustenta un diagnstico. Se suele decir con
cierta razn que la ME hace mejores a los patlogos.
El grado al cual se emplea la ME en un departamento de diagnstico de rutina depende de la experiencia disponible (tcnica e interpretacin) y, en grado notorio, de
los lineamientos y antecedentes del jefe de servicio. Algunos utilizaron la ME en el pasado, pero ahora no confan ms en ella y prefieren la inmunohistoqumica y las
tcnicas moleculares nuevas para solucionar los problemas diagnsticos (pese a que la inmunohistoqumica contina su transformacin en trminos tecnolgicos y existen
dudas acerca de la especificidad de muchos de los anticuer-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
44
CAP. 5
Cuadro 5-1
MICROSCOPIA ELECTRNICA EN PATOLOGA
Marcadores ultraestructurales de diferenciacin celular usados en la identificacin de tumores
Tipo celular
Caractersticas ultraestructurales
Epitelio escamoso
Epitelio glandular
Neumocito tipo 2
Mesotelio
Clula neuroendocrina
Clula de Schwann
Adipocito
Clula del msculo estriado
Clula del msculo liso
Miofibroblasto
Fibroblasto
Endotelio
Neurona
Desmosomas, tonofibrillas, lmina basal

Complejo apical conjuntivo, microvellosidades, grnulos mucgenos
Cuerpos amortiguadores (mielinosomas)
Microvellosidades lisas, largas, sinuosas
Grnulos neuroendocrinos (ncleo denso)
Proyecciones finas cubiertas con lmina externa
Gotas de grasa, lmina
Sarcmeros consistentes en formaciones de actina y miosina y discos Z
Miofilamentos finos con densidades focales, lmina externa
Retculo endoplsmico rugoso, miofilamentos, articulaciones fibronexales
Retculo endoplsmico rugoso, grnulos con secreciones de colgena
Cuerpos de Weibel-Palade
Grnulos neuroendocrinos, retculo endoplsmico liso, microtbulos, conexiones
sinpticas
Melanosomas
Grnulos romboidales
Cristales, lpidos, retculo endoplsmico liso, crestas tubulares
Desmosomas
Grnulos de Birbeck
Aparato de Golgi, retculo endoplsmico rugoso
Lisosomas, proyecciones filopodiales
Clula indiferenciada (organelos indistinguibles)
Melanocito
Clula yuxtaglomerular
Clula de Leydig
Clula granulosa
Clula de Langerhans
Clula plasmtica
Macrfago
Linfocito
Adaptado segn Cameron and Toner (1998).
pos usados). Por el contrario, otros recurren a la ME en

mayor grado y ocupan casi siempre posiciones en las instituciones grandes o especializadas en las cuales la carga de
trabajo ingente o la referencia de muchas de las muestras
representan nmeros ms grandes de casos difciles.
La cuantificacin del valor de la ME es difcil. Se ha dicho que hasta 5% de todos los tumores, por ejemplo, puede
ser bastante problemtico para beneficiarse de la investigacin con ME, mientras que 25% de las muestras renales
no neoplsicas puede necesitar ME (Pearson et al., 1994).
Cualesquiera que sean los nmeros, la ME debe aplicarse
siempre que haya una dificultad en la interpretacin del corte
con H-E. La ME es siempre digna de practicarse en estas
circunstancias porque nunca es posible predecir en un caso
individual qu resultados pueden obtenerse y algunas veces
se experimenta el placer de reconocer hallazgos del todo inesperados y nuevos. Adems, la ME y la inmunohistoqumica (y todas las tcnicas ms recientes) se deben considerar
como complementarias; es una idea generalizada admitir
que la informacin proveniente de la inmunohistoqumica y la ME pueden delinear un cuadro ms completo de
una lesin que cualquier tcnica sola. El cuadro se complica
a veces por el uso de ambas tcnicas (pueden ser excluyentes), pero esto puede considerarse un estmulo para la investigacin suplementaria.
Principios de la tcnica
y la organizacin de la ME
Microscopia electrnica de transmisin:
energa de resolucin
Casi todo el trabajo de diagnstico ultraestructural utiliza la
microscopia electrnica de transmisin (MET) para demostrar las propiedades celulares especficas o las caractersticas de la matriz, que pueden contribuir a la comprensin y el
diagnstico de la enfermedad (cuadros 5-1 y 5-2). Adems
de la MET existen algunas aplicaciones, aunque no demasiadas, que pueden denominarse tcnicas especializadas,
por ejemplo la ME de barrido, que es otra clase morfolgica de ME, y otras tcnicas que suministran informacin sobre el contenido elemental (microanlisis de rayos
X) o la composicin biomolecular (inmunocitoqumica
e histoqumica ultraestructurales) (cuadro 5-3). Tambin se
han desarrollado las versiones ME de los procedimientos de la microscopia de luz, como la morfometra, para
proporcionar la informacin cuantitativa ultraestructural
(p. ej., la irregularidad nuclear en los linfomas).
Pese al desarrollo de las tcnicas funcionales ultraestructurales ms recientes, la ME es an un mtodo esencialmente morfolgico, como la histopatologa con H-E.
PRINCIPIOS DE LA TCNICA Y LA ORGANIZACIN DE LA ME
Cuadro 5-2
Enfermedad renal
Padecimientos neuromusculares
Trastornos cutneos
Enfermedades del tejido conectivo

Alteraciones hematopoyticas
Errores innatos del metabolismo
Biopsias peditricas hepticas
Biopsias endomiocrdicas
Enfermedades respiratorias
Trastornos del sistema nervioso
central y perifrico
Medicina reproductiva
Agentes infecciosos
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Aplicacin de la microscopia electrnica en trastornos no neoplsicos

Espesores de la membrana capilar basal (p. ej., enfermedad de la membrana basal delgada)
Presencia y localizacin de depsitos inmunitarios (p. ej., glomerulonefritis [GN]
membranosa)
Presencia de fibrillas extracelulares (p. ej., amiloide), inclusiones celulares (p. ej., figuras
de mielina en la enfermedad de Fabry), estadificacin de ciertas enfermedades (p. ej.,
GN membranosa), procesos de apoyo (la fusin extensa puede ser indicativa de GN
de cambio mnimo)
Mitocondrias, miopatas congnitas y metablicas
Afecciones de queratinizacin
Dermatosis mecanobulosa
Defectos del cabello y las uas
Trastornos estrmicos que incluyen alteraciones de la colgena, proteoglucanos y
amiloidosis de la elastina
Enfermedades plaquetarias
Anomalas granulocticas
Acumulacin de metabolitos
Potencial para la deteccin prenatal
Enfermedad metablica del hgado
Sndrome de Reye
Cardiomiopatas, amiloidosis
Anormalidades ciliares
Identificacin de partculas pulmonares
Demencias, neuropatas, CADISIL*
Anormalidades de los espermatozoides
Virus, bacterias, protozoarios, hongos
*Arteriopata cerebral autosmica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopata.

Adaptado segn Cameron y Toner (1998).
Cuadro 5-3
Tcnicas y procedimientos ultraestructurales

especializados
Microscopia electrnica de barrido

Microscopia inmunoelectrnica
Histoqumica ultraestructural
Microanlisis por rayos X y difraccin electrnica
Fractura y delineado por congelacin
Hibridacin in situ ultraestructural
Morfometra ultraestructural
Como la microscopia de luz, la ME utiliza muestras sometidas a una forma de radiacin para observarlas. La radiacin (haz electrnico) interacta con el material interno
del corte para emitir una imagen, que se puede interpretar
para obtener informacin sobre la naturaleza de la muestra.
La importancia de la ME radica en que utiliza un haz electrnico. Puesto que la energa de resolucin depende de la
longitud de onda de la radiacin, la energa de resolucin
de un microscopio electrnico es en la prctica cerca de
100 veces mayor respecto de un microscopio de luz. En
consecuencia, pueden proyectarse detalles estructurales de

la clula y la matriz tan pequeos como de tan slo algunos
nanmetros en tamao, lo cual rebasa de forma notable la
capacidad de la microscopia de luz. Por lo tanto, a travs
de los aos se han identificado las estructuras celulares
y de la matriz que son distintivas o especficas de una clula o enfermedad, y esta abundancia acumulada de informacin representa la base de la microscopia electrnica de
diagnstico en los tumores y la enfermedad no neoplsica
(cuadros 5-1 y 5-2).
Formacin de la imagen
En la MET, los electrones en el haz que ilumina (incidente) producen un nmero importante de interacciones
al entrar en contacto con la muestra. Muchos pasan simplemente a travs del espcimen casi sin cambio alguno. Otros
se desvan de su trayectoria (se dispersan) por reas o
puntos de mayor densidad electrnica en el corte y se filtran hacia afuera del haz incidente final por una abertura
(fig. 5-1a). Por consiguiente, el haz incidente final posee
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CAP. 5
Figura 5-1 Formacin de la imagen en el microscopio electrnico de transmisin. Los electrones en el haz incidente entran en contacto
con el corte ultradelgado (a). Algunos pasan sin desviarse a travs de su trayectoria incidente (a), mientras que los que se impactan sobre
un punto denso de la muestra (p. ej., un tomo de metal pesado) se desvan fuera de la trayectoria incidente (dispersados de forma elstica)
y no avanzan hacia la pantalla de visualizacin por una abertura del metal (a). Por lo tanto, el haz incidente final contiene la informacin
que resulta de la combinacin de electrones sin desviar y de otros que sufrieron dispersin elstica (b). Representacin de Paul Chantry.
reas que carecen de electrones en comparacin con el haz

incidente inicial (fig. 5-1b) y esta diferencia establece la
base de la imagen. La densidad dentro de una muestra puede ser natural, como en un concentrado de mineralizacin,
o el tratamiento qumico del tejido en el espcimen puede
introducirla. Por lo general, lo anterior se lleva a cabo con
la solucin de tetraxido de osmio (vase la tcnica ms
adelante), en la cual los tomos del osmio se unen de manera selectiva a los materiales biolgicos, como las membranas. En consecuencia, una fila de tomos de osmio unidos
a una membrana celular produce una imagen que refleja
esta lnea de electrones ausentes en el haz incidente final

(fig. 5-1b), que a su vez se convierte en una lnea sobre la
pantalla del microscopio electrnico cuando los electrones
chocan con el recubrimiento fluorescente de la pantalla que
se visualiza y se convierten en luz visible.
Tcnica
Las tcnicas empleadas para preparar el tejido para la MET
de corte fino se han estandarizado bastante en los ltimos
PRINCIPIOS DE LA TCNICA Y LA ORGANIZACIN DE LA ME
aos. Como en la microscopia de luz, el tejido necesita fijarse con rapidez para evitar la autlisis y primero se fija en
un aldehdo, es decir, un fijador con el que predominan las
uniones cruzadas con protenas. Se acepta que el glutaraldehdo, entre una variedad de aldehdos disponibles en el
comercio, ofrece el mejor desempeo para la conservacin
ultraestructural. No obstante, la fijacin de una biopsia o
una muestra de reseccin en glutaraldehdo requiere personal y tiempo para atender un problema quirrgico. Segn
sean las condiciones del laboratorio, puede ser necesario
recuperar tejido de la muestra principal en formalina histolgica. Resuelto lo anterior, se amortigua a un pH fisiolgico; la muestra es bastante pequea y no debe recogerse para la ME de la profundidad de un espcimen grande
(donde la autlisis puede alterar la estructura del tejido);
la conservacin puede ser muy buena. La opcin de muestreo del tejido en formalina histolgica imposibilita la inclusin de la muestra entera en cera y requiere una pieza
representativa pequea para retenerse, dado que es posible
la eventualidad de un problema diagnstico identificado
en la investigacin con H-E. Esto puede no ser factible en
una institucin con grandes cargas de trabajo.
La muestra fijada en glutaraldehdo o recuperada a partir de formalina necesita cortarse en piezas pequeas (milmetros cbicos), puesto que los reactivos del proceso
subsecuentes tienden a penetrar con lentitud. Las muestras
pequeas disponibles para el estudio constituyen una de las
limitaciones principales de la ME. Despus de la fijacin en
aldehdo, el contraste selectivo se incorpora mediante una
solucin de tetraxido de osmio y algunas veces tambin
con una solucin de acetato de uranilo. Estos tomos del
metal pesado se unen de modo selectivo a las estructuras de
la clula y proporcionan la energa de dispersin electrnica
y el contraste. Aunque las reacciones de estos reactivos con
los componentes biolgicos son complejas, el tetraxido de
osmio se conoce por ser un fijador de lpidos y una de sus
funciones principales es delinear las membranas al depositar los tomos de osmio en los intersticios bimoleculares.
El acetato de uranilo es un fijador de fosfolpidos y tambin
realza la delineacin de la membrana, aunque fija adems
los cidos nucleicos y de este modo proporciona densidad
a los ribosomas y a la desoxirribonucleoprotena (cromatina) nuclear.
Despus de la tincin y fijacin en bloque, el tejido se
deshidrata en etanol o acetona y se infiltra con una resina
epxica lquida, en ocasiones con un solvente transitorio
como el xido de propileno, tolueno o el limoneno, que es
el menos usado pero tambin el menos txico. El bloque
del tejido infiltrado en resina epxica entonces se polimeriza por medio de calor a un estado slido. Los pasos de la
infiltracin se pueden realizar de forma manual con el tejido
en frascos pequeos, encapsulados, de cristal, con reactivos
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recolocados con pipeta o mediante un procesador automatizado de tejido. Los instrumentos basados en microondas,
de reciente introduccin, pueden procesar el tejido hasta
un bloque polimerizado en cuestin de algunas horas, algo
comparable con los procedimientos tpicos de la inmunohistoqumica.
Los bloques de resina epxica tienen las propiedades
fsicas que permiten que las secciones se corten con un ultramicrtomo manual sobre el cristal disponible o con
cuchillas permanentes de diamante. Las secciones con un
espesor de alrededor de 80 nm son bastante delgadas para
el paso de los electrones requeridos para la formacin de la
imagen, y aun bastante fuertes para soportar el efecto trmico de la exposicin a electrones de alta energa. Las secciones se recolectan casi siempre en rejillas de malla de cobre
de 3 mm de dimetro, teidas para el contraste adicional en
soluciones de acetato de uranilo y citrato de plomo (Maunsbach y Afzelius, 1999) y entonces se encuentran listas para
el examen en el microscopio electrnico.
Manipulacin de los tejidos antes de la fijacin
Los procesos de muestreo y manipulacin del tejido previos a la fijacin pueden ser cruciales para obtener un tejido
bien seleccionado y preservado. Esto es de lo ms importante, puesto que la interpretacin se facilita en gran medida por la calidad de la conservacin estructural. A pesar de
los deseos de usar el glutaraldehdo o incluso la formalina
histolgica amortiguada, a veces es necesario recuperar el
tejido a partir de un bloque de cera. sta es la directriz
de rutina en algunas instituciones de diagnstico, es decir,
conformar todo en bloques en cera, lo cual se aplica en especial a las muestras pequeas, un tratamiento en particular
inapropiado para la muestra de ME con el fin de no poner
en peligro el examen con la microscopia de luz.
El tratamiento bastante radical con xileno y cera calientes daa de modo inevitable algunas ultraestructuras, pero
ciertos componentes de la clula pueden sobrevivir en la
cera: desmosomas, tonofibrillas, miofilamentos, filamentos
intermedios, luces, grnulos de Birbeck, grnulos neuroendocrinos y melanosomas. Ciertas estructuras exclusivamente membranosas, como el retculo endoplsmico liso y
la mitocondria, suelen preservarse mal, pero algunas membranas del plasma se pueden conservar o delinear bien y
as reconocerse. Una variacin en la recuperacin de cera
es el mtodo llamado pop-off, en el cual una seccin de
H-E se puede procesar para la microscopia electrnica, sometida al osmio, deshidratada e infiltrada con resina sobre
el portaobjetos de cristal. La muestra se puede entonces
tratar (popped-off) en un molde convencional con resina epxica para el corte ultrafino subsiguiente (vase la
seccin de Lecturas adicionales). Esta tcnica se puede
48
CAP. 5
tambin aplicar a los frotis, pero es exigente desde el punto

de vista tcnico.
El tejido secado o congelado sin agentes criopreservadores, o dejado durante la noche antes de la fijacin, puede ser intil para la ME (con la salvedad de que ciertos
microorganismos pueden sobrevivir; vase la fig. 5-7b).
Sin embargo, el tejido crioprotegido, que se congela y despus se descongela, puede suministrar buenos resultados
ultraestructurales. Muchas otras muestras pueden o necesitan fijarse en glutaraldehdo. Los especmenes de sangre
perifrica, semen, de cepillados nasales y bronquiales y los
fragmentos pequeos de tejido que pueden verse en una
muestra aspirada con aguja fina en una jeringa se fijan con
facilidad, desde el punto de vista del proceso, se trate de
glutaraldehdo o formalina. Algunas muestras no necesitan
fijarse. El sndrome de Hermansky-Pudlak, una afeccin
compleja que implica disfuncin plaquetaria, puede demostrarse tan slo al secar una preparacin de la plaqueta
en una rejilla revestida con pelcula y examinarla de forma
directa en el microscopio electrnico para reconocer los
grnulos distintivos y el nmero de grnulos anormales
(vase fig. 5-9d).
Preliminares para examinar cortes ultrafinos
En la histopatologa tisular, rara vez se realiza la ME sin tener en cuenta otras fuentes de informacin diagnstica. El
patlogo necesita disponer de toda la informacin clnica
apropiada, conocer los aspectos histolgicos detallados de
la lesin y, en el caso de tumores, contar con los hallazgos
inmunohistoqumicos a la mano cuando se efecta la ME.
La idea de ejecutar la ME antes de la inmunohistoqumica para eliminar inmunotinciones innecesarias puede ser
til y tal vez lgica, pero carece al parecer de aceptacin
general.
Es usual realizar la ultramicrotoma con cortes semifinos. Por lo general, stos son de 1 a 2 m de espesor, se
tien con azul de toluidina o una tincin similar y se examinan en el microscopio de luz. Las muestras confirman que
el tejido posee una morfologa comparable a la obtenida con
H-E o que las clulas son las esperadas a la luz del antecedente clnico cuando no hay muestras con H-E de una contraparte slida del tejido (p. ej., en un espcimen de lquido
corporal). Con este procedimiento pueden evitarse los focos
indeseados de colgena o necrosis hallados a menudo en los
tumores. Por ltimo, los cortes semifinos pueden suministrar
informacin sobre la calidad de la conservacin del tejido.
La tincin plida de clulas y ncleos indica casi siempre
una buena preservacin, mientras que los ncleos delineados de forma aguda con espacios interiores claros suelen sealar una pobre conservacin (Eyden, 2002). Por lo
tanto, en la investigacin de un tumor los cortes semifinos
de varios bloques deben dividirse y el ms apropiado se elige con base en el contenido celular del tumor y la calidad
de la preservacin. En lesiones complejas es deseable cortar
muestras ultrafinas a partir de los bloques que representen a
todas las reas histolgicamente diferentes.
Al asegurar la seleccin apropiada para ultramicrotoma, el patlogo o bien el cientfico examinan los cortes ultrafinos para las estructuras celulares o los componentes
de la matriz considerados como caractersticos o especficos de ciertos padecimientos. La identificacin de estas
estructuras depende de una interpretacin detallada de la
ultraestructura de la clula y el tejido, as como de un conocimiento de las caractersticas ultraestructurales de las enfermedades especficas: sta es una experiencia que tiende
a acumularse a travs de los aos. Cuando los cientficos
clnicos o los biomdicos examinan cortes ultrafinos bajo la
instruccin de patlogos, son esenciales el enlace y la comunicacin cercanos entre estas partes, como sucede en
el Reino Unido. En el trabajo arduo de un tumor complejo
las ideas diagnsticas pueden cambiar en el curso de pocos
das a medida que las inmunotinciones se hallan disponibles.
Aplicaciones de la microscopia
electrnica de transmisin
Tumores
En el diagnstico de una tumoracin, la caracterizacin
acertada de la neoplasia depende del hallazgo de las estructuras distintivas de la clula o la matriz. Debe determinarse si son iguales o no respecto de las encontradas en la
clula normal correspondiente. En tal caso, por ejemplo,
un carcinoide intestinal se puede diagnosticar por los grnulos neuroendocrinos hallados en las clulas enteroendocrinas normales (fig. 5-2); un carcinoma mamario por los
desmosomas, tonofibrillas, lmina basal, luces y grnulos de mucgeno (figs. 5-3a y 5-5), como en el epitelio normal de la mama, y un melanoma maligno por el hallazgo de
los melanosomas tpicos de los melanocitos normales (fig.
5-3b). Esto no significa que estos procesos malignos se originen a partir de esas clulas normales diferenciadas; ms
bien se piensa que proceden de las clulas embrionarias
diferenciadas de forma ms primitiva. Una amplia variedad
de tumores se puede identificar con base en su ultraestructura distintiva o especfica (cuadro 5-1). Los ejemplos de
los organelos especficos tiles en el diagnstico del tumor
se muestran en las figuras 5-2 a 5-5.
Hay obstculos en el diagnstico ultraestructural de los
tumores. Desde luego, muchos tumores pierden las propiedades esperadas y se vuelven menos diferenciables. En un
protocolo de revisin tpico se examina de forma cuidadosa
un bloque (una rejilla de cortes ultrafinos) por una hora. No
APLICACIONES DE LA MICROSCOPIA ELECTRNICA DE TRANSMISIN
49
Figura 5-2 a) Clula normal enteroendocrina del intestino delgado humano normal. Las inclusiones muy electrodensas cerca del polo
basal de la clula (*) son grnulos neuroendocrinos que contienen hormonas. Obsrvense los grnulos redondeados y en forma de barra
(8 700 ). b) Tumor carcinoide del intestino delgado (hace metstasis a un ganglio linftico mesentrico). Ntese la misma clase de
morfologa del grnulo neuroendocrino (60 700 ).
obstante, los tumores con grados decrecientes de diferenciacin pueden ameritar una valoracin ms extensa (varias horas y mltiples bloques, segn sean la percepcin del
patlogo, la necesidad clnica, el resultado del diagnstico,
etc.). Como complicacin adicional, los tumores pueden
tambin expresar caractersticas inesperadas y mostrar as
una diferenciacin divergente o anmala. Por lo tanto,
el clnico debe tener un conocimiento de estas propiedades
tumorales a partir de la experiencia personal y bibliogrfica. No obstante, la ME es de un valor mayor respecto de la
seccin H-E, en la cual los tumores aparecen apenas diferenciados y revelan casi siempre una inmunotincin tenue
o negativa para los marcadores previstos; en consecuencia,
la confirmacin inmunohistoqumica de un diagnstico con
H-E puede ser incompleta. La ME es tambin en extremo
importante cuando la inmunotincin no puede reconocer un
fenotipo definido con claridad, sea por la especificidad incierta del anticuerpo, la incertidumbre interna si la tincin
es levemente positiva o negativa o una tincin inesperada
(aberrante). Por ejemplo, las variantes del melanoma, el
linfoma y el sarcoma malignos son tales que se tien de
modo positivo el filamento epitelial intermedio y la citoqueratina y, en consecuencia, puede ser necesaria la investigacin ultraestructural para dilucidar la diferenciacin.
Es importante considerar la posibilidad de encontrar clulas no neoplsicas en el tejido tumoral. En la bibliografa
se notifican micrografas de clulas y pericitos endoteliales en paredes vasculares, malinterpretados como clulas
tumorales. Deben tambin distinguirse como no neoplsicas las clulas de los tejidos normales invadidos por
el tumor o las clulas normales del tejido que se regeneran
(p. ej., clulas estriadas del msculo), adems de las clulas inflamatorias o reactivas (p. ej., macrfagos, linfocitos,
clulas del plasma, miofibroblastos). Estas clulas tienden
a diferenciarse bien y se deben observar con sospecha, en
particular si se localizaron en un tumor de escasa diferenciacin.
Aunque cualquier tumor que demuestre cierta incertidumbre por microscopia de luz merece la valoracin por
ME, la tcnica ha demostrado utilidad particular en un
buen nmero de grupos tumorales (tumores anaplsicos
epitelioides de clulas redondas; tumores de clulas redondas pequeas; tumores de clulas falciformes, y la extensa
categora de lesiones mesenquimatosas o del tejido blando,
incluidos los sarcomas). Uno de estos ltimos lo representan las neoplasias fibroblsticas y puede esperarse que
muestren poca inmunopositividad, con excepcin de la vimentina, un marcador bastante inespecfico. La microscopia
electrnica puede tambin ayudar a sugerir el sitio primario de una masa metastsica, mientras que en los tumores
del sistema nervioso central la identificacin de las caractersticas de tumoraciones menngeas, schwannomas y
50
CAP. 5
Figura 5-3 Sistemas membranosos intracitoplsmicos 1. a) Grnulos de mucgeno en un carcinoma ductal de mama. Tienen un centro denso
proteinceo en un espacio claro. En concordancia con su naturaleza exocrina, se encuentran a menudo cerca de la luz, en la cual descargan
su contenido (24 000 ). b) Los melanosomas constituyen el sello ultraestructural para la diferenciacin melanoctica. Este melanosoma es
un melanoma maligno de clulas fusiformes sin pigmento y se encuentra libremente en la matriz citoplsmica (98 000 ). Los melanosomas
mltiples dentro de un lisosoma secundario (un melanosoma compuesto) son evidencia de la digestin de melanosomas sometidos a exocitosis y se encuentran a menudo dentro de macrfagos o fibroblastos. c) Los lisosomas son marcadores de macrfagos pero muchos tumores
(tumores de clulas granulares) pueden mostrar lisosomas secundarios abundantes. Esta figura delinea lisosomas secundarios en un tumor
estrmico gastrointestinal (36 000 ). d) Grnulo de Birbeck en una granulomatosis de las clulas de Langerhans (69 000 ).
51
Figura 5-4 Sistemas membranosos intracitoplsmicos 2. Adenoma negro de la corteza suprarrenal en un paciente con sndrome de Cushing.
El fenotipo esteroidognico consiste en lpido (a), retculo endoplsmico liso (* en b) y mitocondria con crestas tubulares (vase la mitocondria gigante en b), y se encuentra sobre todo en las clulas de Leydig, clulas hiliares y tumores adrenocorticales. La lipofuscina es tambin
comn en estos tumores y a ella se atribuye la pigmentacin en este tumor. Ntense tambin los apilados cortos del retculo endoplsmico
rugoso (a, 10 000 ; b, 30 000 ).
cnceres neuronales, gliales o ependimarios por ME es importante para el neuropatlogo, puesto que la inmunohistoqumica tiene un valor limitado para discriminar entre estos
tumores (Cameron y Toner, 1998; Al-Sarraj et al., 2001).
Por ltimo, no debe subestimarse el valor de la ME
en la confirmacin simple de un diagnstico sospechoso.
Diagnosticar una lesin no es una edicin en blanco y negro: los patlogos efectan diagnsticos con cierto grado
de seguridad y stos pueden incrementarse por hallazgos
ultraestructurales.
Enfermedad no neoplsica
En la actualidad, la ME aplicada a la enfermedad no neoplsica est quizs en una posicin ms segura que la ME aplicada a los tumores, ya que en la patologa oncolgica las
tcnicas inmunohistoqumicas y moleculares se apropiaron
del territorio ultraestructural. Mientras que en el diagnstico del tumor el objetivo primario es a menudo la determinacin de la diferenciacin celular de la masa, en la
enfermedad no neoplsica hay muchas aplicaciones en las
cuales se pueden identificar las mltiples formas del cambio estructural dentro de un solo organelo, clula o tejido
(cilio, epitelio glomerular, clula del msculo estriado, ner-
vio perifrico), que son indicativas de diversas afecciones.

Por lo tanto, en esta rea la ME puede tener un papel ms
crtico y quizs se dependa menos de la inmunohistoqumica y la biologa molecular. Las figuras 5-6 a 5-9 incluyen
ejemplos de la ME diagnstica aplicada a la enfermedad no
neoplsica. Puntos similares del procedimiento son vlidos
para examinar la enfermedad no neoplsica si el objetivo
es confirmar la presencia de clulas afectadas y su calidad
de conservacin a partir de cortes semifinos, como en los
tumores. No obstante, muchas enfermedades no neoplsicas se estudian a partir de lquidos y es preciso llevar a
cabo una valoracin de las clulas esperables en los cortes
semifinos con base en el antecedente clnico.
La ME tuvo por mucho tiempo un valor en la identificacin de microorganismos. Entre los ms significativos en
clnica respecto de la incidencia numrica estn los virus,
los cuales se identifican por tradicin mediante la tcnica
rpida y precisa de la tincin negativa (vase el cap. 18
para revisar ms detalles). La ME puede reconocer otros
agentes patgenos microscpicos o detalles de su estructura, entre ellos bacterias como las espiroquetas (fig. 5-7a),
protozoarios como Cryptosporidium, microsporidios y
Leishmania (en el sida) y hongos como Candida y Pneumocystis (fig. 5-7b).
52
CAP. 5
Figura 5-5 Caractersticas citoesquelticas y superficiales.

a) Las tonofibrillas son la contraparte ultraestructural de inmunotincin con citoqueratina
que pueden ayudar a reconocer
la diferenciacin epitelial en los
tumores. Las tonofibrillas se ponen a menudo en contacto con
los desmosomas y promueven
de tal modo la cohesin celular,
una caracterstica tpica de los
carcinomas. Carcinoma celular
escamoso seudoangiosarcomatoso (31 900 ). b) El desmosoma es la unin intercelular
ms importante para identificar
la diferenciacin epitelial. Tiene
placas submembranosas, una lnea intermedia en el espacio entre las membranas opuestas del plasma, y las tonofibrillas adhieren
las placas al citoesqueleto perinuclear. Mesotelioma epitelial (99 000 ). c) La lmina es una capa distintiva de clulas como el epitelio,
el endotelio, las clulas de Schwann y las perineuriales, los adipocitos y las clulas del msculo. Carece de fibroblastos, miofibroblastos,
condroblastos, osteoblastos y neuronas, y por tanto tiene importancia diagnstica. En este schwannoma benigno, las capas mltiples
de lmina rodean a los procesos de la clula (30 000 ). d) Los miofilamentos del msculo liso con sus densidades focales distintivas
son marcadores importantes de la diferenciacin celular del msculo liso. Tambin se reconocen en clulas mioepiteliales, pericitos,
miofibroblastos y clulas intersticiales de Cajal, y sus tumores. Obsrvense los miofilamentos ms finos (flecha) en contraste con los
filamentos ms gruesos de la citoqueratina que forman tonofibrillas en este carcinoma escamoso de clulas fusiformes (20 100 ).
53
Figura 5-6 Microscopia electrnica de una enfermedad no neoplsica: patologa tisular. a, b) Glomerulonefritis membranosa. a) Depsitos inmunitarios despus de la microscopia de luz e inmunofluorescencia mediante un anticuerpo anti-IgG marcado con fluorescena. b) Micrografa
electrnica de transmisin correspondiente a tejido fijado en glutaraldehdo que demuestra los depsitos inmunitarios subepiteliales (flechas)
de una organizacin discreta que refleja la microscopia de luz. Ntese el engrosamiento de la membrana basal y la prdida de las proyecciones de apoyo del podocito (25 000 ). Fotografas cortesa del Dr. Alan Curry. c) Miopata de bastones de nemalina en una mujer de 15 aos.
La presentacin clnica incluy retraso en la motricidad, deambulacin sobre los dedos del pie, cadas frecuentes y dolores de pierna despus
del ejercicio. El bastn de nemalina es denso, demuestra las estriaciones transversales y se considera una anormalidad del disco Z. Los discos Z
normales y los sarcmeros se muestran para fines de comparacin (60 000 ). Fotografa cortesa del Dr. Liz Curtis. d) Sndrome de discinesia
ciliar primaria. Obsrvese la ausencia de brazos de dinena de los dobletes perifricos (160 000 ). Fotografa cortesa de Ann Dewar.
54
CAP. 5
Figura 5-7 Microscopia electrnica de una enfermedad no neoplsica: microorganismos infecciosos. a) Espiroquetosis en una biopsia
de intestino grueso (8 800 ). b) Pneumocystis recuperado de la necropsia de tejido pulmonar. De forma inadvertida, este tejido se dej
toda la noche sin fijacin. Por lo tanto, aunque su mayor parte se preserv mal (segn se esperaba), los agentes patgenos an son
identificables por sus perfiles curvos distintivos. Aqu, el aspecto en un paciente inmunocomprometido con cncer sugiere una infeccin
oportunista (7 500 ).
La distincin entre el diagnstico, por un lado, y el desarrollo de la investigacin tecnolgica, por otro, es a veces
imprecisa y la ME posee una funcin en tal desarrollo. Tiene utilidad, por ejemplo, en la determinacin de la calidad
de la conservacin estructural de los ovocitos en la corteza del ovario extirpado y criopreservado in vitro en las
mujeres jvenes con cncer durante la quimioterapia. El
diagnstico prenatal se puede realizar a partir de las clulas
obtenidas del lquido amnitico (Cameron y Toner, 1998),
al tiempo que existe un inters cada vez mayor en la caracterizacin ultraestructural de las clulas embrionarias en el
campo emergente de la ingeniera tisular.
Tcnicas y procedimientos especializados

El cuadro 5-3 enumera las tcnicas sealadas como especializadas y que no se utilizan de modo tan amplio en
los laboratorios de diagnstico como la MET, por lo cual
tienen pocas aplicaciones diagnsticas reales. En muchos
casos, las imgenes de estas tcnicas confirman un diagnstico bastante seguro que se basa sobre todo en resultados
clnicos e histopatolgicos; empero, muchas veces ofrecen nuevos detalles que pueden mejorar la comprensin
de la enfermedad. Son sin duda de un valor potencial en la

investigacin y debe recordarse que los hallazgos de la investigacin son en ocasiones precursores de pruebas diagnsticas. Estas tcnicas suelen encontrarse en laboratorios
que efectan tambin trabajos de investigacin; en estos centros, la investigacin genera experiencia con la tcnica y se
dispone de personal con entrenamiento y experiencia en la
tcnica para aplicar el procedimiento a casos diagnsticos
raros (vase la seccin de Lecturas adicionales).
Microscopia electrnica de barrido (MEB)
La MEB suministra informacin tridimensional, en particular de las caractersticas superficiales y, en consecuencia,
las imgenes son a menudo ms fciles de interpretar (fig.
5-8a) en comparacin con las de la MET, en las cuales es
necesario extrapolar una interpretacin a partir de cortes finos y es posible una interpretacin difcil debido a la orientacin subptima. Por lo general, el tejido se fija como en
la MET, pero al final de la fase de deshidratacin el etanol
se sustituye por dixido de carbono lquido, casi siempre
bajo presin en un secador de punto crtico. En el punto
crtico, el lquido y el dixido de carbono gaseoso forman
TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS ESPECIALIZADOS
55
Figura 5-8 Tcnicas especiales 1. a) Microscopia electrnica de barrido. Eje del pelo humano. El paciente se valor por cabello retorcido, afeccin en la cual el eje del cabello se tuerce y es frgil, pero el anlisis de MEB indic tricorrexis nudosa, con supuesto dao secundario al traumatismo mecnico o qumico (830 ). b) Microscopia inmunoelectrnica. MET de doble tincin de la regin mesangial
de un glomrulo de un individuo con nefropata mesangial por IgA que demuestra doble inmunolocalizacin de colgena de tipo IV (10
nm de oro) dentro de la matriz e IgA mesangiales (20 nm de oro) dentro del depsito electrodenso (33 000 ). Micrografas cortesa del
Dr. Jill Moss y Ian Shore.
una serie continua, que permite el secado del espcimen

de una manera que evita las distorsiones de la clula y la
estructura del tejido que de otra manera se presentaran con
el secado convencional. El espcimen seco se cubre entonces con una capa delgada del metal evaporado (oro, paladio, platino o cromo), que ayuda a eliminar la acumulacin
de la carga durante la exposicin al haz electrnico. El tejido, fijado habitualmente a una base metlica (un trozo), se
encuentra entonces listo para colocarse en el microscopio
electrnico de barrido. En contraste con el haz incidente en
la MET, el haz electrnico en la MEB se aplica al espcimen como rastreador. Esto da lugar a la emisin de electrones secundarios, que recolecta un detector de electrones y
los convierte en una imagen observable en un tubo de rayos
catdicos. Adems del contorno y el detalle superficiales,
los microscopios electrnicos de barrido ofrecen la ventaja
de suministrar una ampliacin ms baja (10 o 100 veces)
comparada con las tcnicas tradicionales disponibles para
la MET y por tanto se pueden utilizar para los especmenes
patolgicos completos.
Las aplicaciones diagnsticas de la MEB son limitadas.

Incluyen la valoracin del cabello humano (fig. 5-8a) y la
identificacin de las partculas respiratorias, en especial las
fibras de asbesto, que se pueden tambin estudiar por microanlisis con rayos X para identificar la composicin qumica
o elemental. Los resultados pueden tener relevancia legal
respecto de la exposicin industrial (Ingram et al., 1989).
La capacidad exigida para distinguir las clulas B
y T y el mesotelioma y el adenocarcinoma a partir de
la morfologa diferenciada de la superficie celular no se
ha explotado de manera extensa en la prctica de rutina.
En el cuadro 5-4 se dan algunos de los mltiples ejemplos
de la MEB aplicada a las clulas y tejidos humanos que han
contribuido con datos para la comprensin de la enfermedad
sin conducir a la creacin de pruebas diagnsticas.
Microscopia inmunoelectrnica
La microscopia inmunoelectrnica (inmunomarcacin ultraestructural) proporciona de manera simultnea los datos
56
CAP. 5
Figura 5-9 Tcnicas especiales 2. Histoqumica ultraestructural. a) Procedimiento de uranafina para los grnulos neuroendocrinos en
un carcinoma mucoide de mama (25 700 ). b) La tincin de Grimelius para ME distingue los grnulos neuroendocrinos de los grnulos
de secrecin lctica en un carcinoma anficrino de mama (39 600 ). c) Tincin de Warthin-Starry modificada para que la ME demuestre
la melanina en un melanoma maligno (45 000 ). d) Plaquetas enteras, desmontadas y sin teir en una rejilla revestida con Formvar. El
paciente tena una anomala similar al sndrome de Hermansky-Pudlak secundario a una enfermedad mielodisplsica. Los grnulos (flechas) son ricos en calcio, que proporciona densidad electrnica inherente. La cuenta de los grnulos fue de 3.8 por plaqueta (valor normal, 5.3). Obsrvense los grnulos densos en una plaqueta y la ausencia en la plaqueta adyacente y un grnulo con colas (17 700 ).
Micrografas cortesa de Bart E. Wagner.
TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS ESPECIALIZADOS
Cuadro 5-4
Aplicaciones de la MEB en material

clnico humano
Fibras de asbesto y otras partculas respiratorias

Distingue las clulas B y T a travs de la morfologa
de la superficie celular
Microvellosidades mesoteliales y adenocarcinomatosas
Anormalidades de espermatozoides
Urotelio y carcinoma urotelial
Hiperplasia endometrial
Hiperplasia prosttica benigna y cristales intraluminales
en carcinoma prosttico
Papilas renales/conductos de Bellini
Superficies esofgicas e intestinales
Giardia lamblia en la superficie duodenal
Espiroquetosis
Cryptosporidium
Enfermedad de Crohn
Apendicitis aguda
Tejidos y clulas sinoviales en artritis reumatoide
y gota
Cristales de pirofosfato de calcio en cartlago y tejido
del menisco
Mitocondria en oncocitos
Superficies de la clula leucmica (clula del cabello)
Cuadro 5-5
57
morfolgicos de la MET convencional y la informacin

sobre la composicin biomolecular, como en la inmunohistoqumica microscpica de luz. Los datos de la microscopia
inmunoelectrnica, como los de la MEB, son casi siempre
confirmatorios o se suman a la comprensin cientfica de
un padecimiento clnico; empero, el potencial de la tcnica
para confirmar un diagnstico, al eliminar incertidumbre
de interpretacin y acentuar la probabilidad de un diagnstico, es muy grande. Pero, en la prctica, los requerimientos
de personal y financiamiento para la ME comprometen el
uso de la microscopia inmunoelectrnica diagnstica, que
tambin exige ms atencin para su prctica. La gama de
protenas identificables en material clnico con la microscopia inmunoelectrnica se resume en el cuadro 5-5.
Una de las formas ms simples de microscopia inmunoelectrnica se observa al desparafinar y procesar una muestra teida por medios de microscopia inmunohistoqumica
a partir de un portaobjetos de cristal. Esto representa un
desafo tcnico y tiende a ofrecer una preservacin estructural mala. Algunas veces tambin, al identificar la inmunotincin, que es densa en electrones como resultado de la
exposicin al tetraxido de osmio, puede ser menos que
clara. Las mejores tcnicas utilizan un anticuerpo especfico marcado con partculas de oro coloidal. Las partculas
Aplicaciones de la microscopia inmunoelectrnica en anormalidades

clnicas y patolgicas
Contenido hormonal en los grnulos neuroendocrinos en los tumores

Depsitos de inmunoglobulinas y complemento en las clulas plasmticas, linfoma, enfermedad renal y queratopata cristaloide;
amiloide en plasmacitoma
Protenas citoesquelticas (actina del msculo liso, actinina alfa, citoqueratina, vimentina, desmina y neurofilamento protenico)
en clulas no neoplsicas y tumorales
Fibronectina en la superficie de los miofibroblastos
Laminina y colgena tipo IV en membranas basales
Molculas de adhesin intercelular (p. ej., ICAM-1, CD44) en clulas reactivas y neoplsicas
Molculas de superficie celular (CD4, CD8, CD56) en enfermedad de injerto contra husped aguda
El vasopresor y la protena vasoconstrictora, endotelina 1, en glndula suprarrenal
La diferenciacin del antgeno, receptor de la urocinasa, en neutrfilos
La protena antiapoptsica, BCL2, en tumores tiroideos
Factor de von Willebrand en cuerpos de Weibel-Palade en el endotelio
Lisozimas y mucinas en lesiones epiteliales glandulares
Lactoferrina y lisozima en leucemia mielomonoctica
Mieloperoxidasa en leucemia mieloide
Protena cristalina de Charcot-Leyden (lisofosfolipasa) en basfilos
Catepsina D en lisosomas en las clulas vasculares del msculo liso en anastomosis arteriovenosas
Sintasa del xido ntrico en la vescula seminal humana
Rotavirus en extractos fecales humanos
58
CAP. 5
de oro son en su mayor parte de 5, 10 o 20 nm de dimetro

y, una vez localizadas en los cortes del tejido, se identifican
con facilidad en la pantalla del microscopio electrnico por
su contorno agudo, que tambin facilita el enfoque y la fotografa (fig. 5-8b).
Es preciso tener precaucin al aprovecharla para mejorar la conservacin del antgeno. Las protenas varan en
grado considerable en la conservacin de su inmunorreactividad y, por lo tanto, en el grado al cual pueden demostrarse por microscopia inmunoelectrnica. El tejido que
acaba de obtenerse ha de fijarse en una solucin de reciente
preparacin de paraformaldehdo. Aunque el tejido pueda
recuperarse del espcimen histolgico principal, muchos
antgenos sobreviven en la formalina histolgica. Los
fijadores de metal pesado no se usan para evitar la desnaturalizacin adicional de la protena, y a menudo la deshidratacin no se lleva a cabo con un etanol de ms de 70%
antes de la impregnacin en una resina hidrfila como LR
White. Luego, la muestra se somete a una polimerizacin
trmica mnima antes de la seccin de los cortes ultrafinos
y la aplicacin de los reactivos apropiados que soportan el
oro. Lowicryl es una resina hidrfila alternativa de cierta
demanda que proporciona conservacin ultraestructural
superior; este agente, dado que es una resina hidrfila a
baja temperatura, conserva mejor al antgeno. La forma
ms exigente de la microscopia inmunoelectrnica utiliza los cortes ultrafinos congelados (crioultramicrotoma).
La microscopia inmunoelectrnica se puede tambin realizar en cortes ultrafinos a partir de tejido impregnado en resina epxica procesado de modo convencional para MET,
a menudo con el uso de reactivos que develen la resina y
expongan sitios antignicos.
Histoqumica ultraestructural
La histoqumica ultraestructural (histoqumica electrnica)
es anloga a la histoqumica de la microscopia de luz tpica,
pero proporciona informacin sobre la naturaleza qumica o
bioqumica de clulas y tejidos en el plano ultraestructural.
Para ello, las tcnicas requieren un marcador electrodenso,
las ms de las veces un compuesto que contiene los tomos
del metal que dispersa a los electrones. Se ha identificado
una amplia gama de sustancias en las clulas y los tejidos,
incluidas las enzimas, mediante histoqumica ultraestructural (cuadro 5-6). Como en la microscopia inmunoelectrnica, los estudios publicados que identifican estas sustancias
se sitan en el campo de la investigacin, en vez de tener
un valor real en la histopatologa diagnstica. Sin embargo, como en el caso de la microscopia inmunoelectrnica,
los individuos o los laboratorios con intereses, experiencia
o lneas de investigacin tal vez encuentren aplicaciones
diagnsticas para estas tcnicas.
Cuadro 5-6 Histoqumica ultraestructural: aplicaciones

en material clnico
Reaccin de uranafina (acetato de uranilo) para grnulos
neuroendocrinos
Acetato de uranilo modificado-citrato de plomo para la
tincin selectiva de cidos nucleicos
Tincin de Grimelius (tincin con plata) para grnulos
neuroendocrinos
Tcnica de Warthin-Starry para la melanina
Reaccin L-DOPA modificada para ME y tirosinasa
y melanosomas
Peroxidasa plaquetaria en el diagnstico diferencial
de leucemias
cido fosfotngstico etanlico para sinapsis
Procedimiento de ferrocianuro de osmio-potasio para
glucgeno
Imidazol-tetraxido de osmio amortiguado para lpidos
Fosfatasa cida para lisosomas (p. ej., en linfocitos
granulares grandes)
Rojo de rutenio, azul cuprolnico, metenamina de plata,
diamina de hierro para porciones de polisacridos
La prctica de las tcnicas vara en grado considerable, segn sea la sustancia que se revela. Para las enzimas,
como la peroxidasa plaquetaria, pueden requerirse fijadores especializados (p. ej., uno que contenga cido tnico,
formaldehdo y una concentracin baja de glutaraldehdo). Para el glucgeno, el fijador tetraxido de osmio se
puede modificar con la adicin de ferrocianuro de potasio,
mientras que para los lpidos, que se pierden durante el
procesamiento de MET tpico, puede emplearse una solucin de imidazol-tetraxido de osmio amortiguada. Por
el contrario, en la reaccin de uranafina para los grnulos
neuroendocrinos (fig. 5-9a) es preferible el glutaraldehdo
a la formalina histolgica, puesto que las molculas pueden perderse del tejido recuperado a partir de la formalina,
lo que genera una reaccin dbil.
El procedimiento con uranafina es una tincin til de
la ME para los grnulos neuroendocrinos, dado que stos
muestran heterogeneidad ultraestructural y pueden algunas
veces ser difciles de distinguir de los lisosomas primarios,
grnulos pequeos de secrecin lctica y grnulos pequeos serosos. La tcnica se basa en la hiptesis segn la cual
el centro granular neuroendocrino consiste en un complejo
de hormonas, protenas y nucletidos (Payne, 1993). Las
cargas negativas de los ltimos se unen a los iones uranilo
de carga positiva para proporcionar electrodensidad. Todo
el fosfato libre debe eliminarse despus de la fijacin con
aldehdo, antes que el tejido pase a la solucin concentrada
de acetato de uranilo (hasta por dos das) y no debe usarse ninguna otra tincin que confiera electrodensidad. Los
RECONOCIMIENTOS
ribosomas y la cromatina nuclear, en virtud de su contenido de nucletidos, pueden actuar como controles internos
positivos. Las tcnicas de tincin con plata en el plano ultraestructural estn tambin disponibles para grnulos neuroendocrinos y melanina (fig. 5-9b, c).
59
En la tcnica de fractura y delineado por congelacin, el

tejido se congela con rapidez y despus se fractura por
impacto con un borde agudo dentro de un instrumento especficamente diseado y disponible en el comercio. La
fractura plana pasa a travs de sistemas membranosos y
proporciona una superficie para la observacin posterior del
sombreado metlico. El sombreado puede retardarse despus del delineado, para revelar reas ms grandes de
superficies reales de la membrana adems de superficies
membranosas hendidas. No existen aplicaciones diagnsticas reales, pero la tcnica se aplica a clulas y tejidos
humanos para suministrar nueva informacin sobre la organizacin de la membrana celular, por ejemplo exocitosis
de los grnulos neuroendocrinos de las clulas y espacios
alterados y uniones estrechas en los tumores oncocticos de
la tiroides humana (Cochand-Priollet et al., 1998).
tico de rutina en el campo de la patologa. Se han delineado

algunos principios de la teora cientfica de estas tcnicas
ultraestructurales prcticas para facilitar la interpretacin
de las imgenes microgrficas electrnicas. A pesar del desarrollo continuo de nuevas tcnicas, sobre todo en la inmunohistoqumica y la biologa molecular, el microscopio
electrnico an es valioso en el diagnstico de lesiones
problemticas en la investigacin clnica o la microscopia
de luz. Es una cuestin de experiencia directa de quienes
practican la microscopia electrnica que las lesiones se
encuentren todava donde los hallazgos clnicos e inmunohistoqumicos son contradictorios o intiles, al grado de
establecer un diagnstico impreciso: esto se puede, en algunas circunstancias, modificar por microscopia electrnica,
incluso a pesar de la propia limitacin del muestreo de la
tcnica. En el campo del diagnstico tumoral, algunas de
estas dificultades se deben a las limitaciones de la inmunohistoqumica, en la que hoy da confa el patlogo tumoral;
es una tcnica que, a diferencia de la microscopia electrnica, todava no alcanza la etapa de estabilidad tecnolgica.
En el campo ms grande de las anomalas no neoplsicas
enfermedad renal y neuromuscular, microorganismos
infecciosos, enfermedades ciliares, dermatopatologa, para
mencionar quizs las principales la microscopia electrnica ejerce una influencia ms notoria dado que es menos
dependiente de la inmunohistoqumica; en este caso, la microscopia electrnica puede identificar una multiplicidad de
cambios estructurales dentro de una clula o tejido que se
pueden relacionar con diversas enfermedades.
En gran medida, la mayora de las aplicaciones morfolgicas tiene lugar en la microscopia electrnica de transmisin. Sin embargo, aunque existen diversas tcnicas
especializadas que han contribuido a mejorar la comprensin
de la biologa estructural de la clula, tejidos y lesiones humanas, se conocen pocas aplicaciones reales al diagnstico.
Por ltimo, la microscopia electrnica es una tcnica
esencial para el anlisis diagnstico de las lesiones humanas.
En este contexto, es necesario enfatizar que mientras el anlisis de la expresin del gen es fundamental para comprender la enfermedad, dicha comprensin slo ser completa
si se acepta que las afecciones observadas en los cortes con
H-E o los ultrafinos resultan no slo de la expresin del gen,
sino tambin de actividades posgenmicas: estas actividades
pueden constatarse de modo ms efectivo con las tcnicas
fenotpicas, como la demostracin inmunohistoqumica de
protenas funcionales y su elaboracin dentro de las estructuras funcionales de la clula por microscopia electrnica.
Resumen
Reconocimientos
Este captulo tiene como objetivo transmitir una perspectiva

contempornea de la microscopia electrnica en el diagns-
En la preparacin de este captulo merecen un reconocimiento especial los colegas siguientes por su inestimable
Microanlisis con rayos X y difraccin electrnica

Una de las interacciones de los electrones con tomos de
un espcimen fsico conduce a una reconfiguracin de los
niveles energticos en las rbitas del electrn alrededor de
los tomos, con la consecuente emisin de rayos X. stos
son caractersticos del nmero atmico y por tanto establecen la naturaleza qumica elemental del material bajo
investigacin. Una variedad de elementos con importancia
clnica se puede identificar mediante esta tcnica; los ms
importantes son las partculas respiratorias, incluidas las
diversas formas de la fibra de asbesto (Ingram et al, 1989;
Cameron y Toner, 1998). Con frecuencia puede ser necesario digerir el tejido para liberar las fibras para el anlisis.
La tcnica de difraccin electrnica puede ser til para
demostrar una periodicidad y por consiguiente la naturaleza
cristalina dentro de un objeto expuesto a electrones, como
un resultado en el cual se observan los patrones de difraccin, que consisten en puntos de alta intensidad dispuestos
con precisin en el espacio. Esta informacin puede discriminar sustancias de composicin qumica diferente.
Fractura y delineado por congelacin
60
CAP. 5
colaboracin: Dr. Alan Curry (Manchester Royal Infirmary), Dr. Liz Curtis (Queen Elizabeth Hospital, Birmingham), Ann Dewar (Royal Brompton Hospital, Londres), Dr.
Jill Moss y Ian Shore (Charing Cross Hospital, Londres), y
Bart E. Wagner (Northern General Hospital, Sheffield), por
proporcionar los micrgrafos electrnicos; y Paul Chantry
y Elizabeth White (ambos del Christie Hospital) por trazar
la figura 5-1 y la recopilacin bibliogrfica de investigacin
y la impresin fotogrfica, respectivamente. Asimismo, estamos en deuda con el Dr. Jill Moss, Dr. Alan Curry y el
profesor Peter Toner por los comentarios valiosos sobre
el manuscrito y nuestro reconocimiento a la importancia
del captulo original del Dr. Stuart Cameron y el profesor
Peter Toner como el punto de partida para este trabajo.
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Society of Ultrastructural Pathology Handbook Committee. Handbook of Diagnostic Electron Microscopy for Pathologists-intraining. 1996: Igaku-Shoin Medical Publishers, New York
and Tokyo, in conjuction with the Society for Ultrastructural
Pathology.
Artculos especiales de revistas dedicados

a la microscopia electrnica
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microscopia electrnica de diagnstico.
Semin Diagn Pathol 2002; 20(1): se dedica a la microscopia
electrnica de tumores.
Hum Pathol 1998; 29(12): contiene un simposio de la microscopia electrnica sobre tumores.
Ultrastruct Pathol 1992; 16: contiene los artculos sobre tcnicas
de ME especializadas, incluidas la microscopia inmunoelectrnica, hibridacin in situ ultraestructural, tcnica pop-off y
morfometra ultraestructural.
Artculos sobre tcnicas ultraestructurales especializadas

Las tcnicas y los procedimientos como los enumerados en el
cuadro 5-3 se pueden encontrar en diarios especializados, como
Ultrastruct Pathol, J Submicrosc Cytol Pathol y Med Electron
Microsc.
6
Microscopia de luz
Brian Boullier
Introduccin
El microscopio de luz apareci hace mucho tiempo, cuando Hans y Zacharias Janssen crearon el primer microscopio
compuesto, en 1590. A diferencia de una simple lupa, el
instrumento consista en un tubo con una lente particular
en cada extremo. Los cientficos clnicos se beneficiaron de
forma subsecuente con las mejoras radicales en el diseo,
construccin y tcnica del microscopio, en particular durante los ltimos 100 aos.
El microscopio de luz compuesto es el caballo de batalla
de todo laboratorio clnico y con l se observa la mayor
parte de las muestras con la ayuda de la iluminacin de
campo brillante. Sin embargo, la disponibilidad cada vez
mayor de herramientas diagnsticas, como los anticuerpos
monoclonales marcados con fluorescencia, obliga al cientfico clnico a adquirir destreza con mltiples tcnicas microscpicas en los aos recientes.
Este captulo introduce los conceptos bsicos del diseo del microscopio, explica de forma sinptica los principios que subyacen a los procedimientos actuales ms
comunes del laboratorio clnico y discute varias reas de aplicacin. El lector puede consultar las referencias adicionales (Bradbury y Bracegirdle, 1998; Determan y Lerpusch,
1988; Lacey, 1999) para una descripcin ms extensa y una
explicacin ms completa de cada tcnica.
Diseo bsico del microscopio

El ms simple, el microscopio compuesto, se conforma
con dos sistemas de lentes, la lente objetivo, que forma una
imagen real de la muestra, y la ocular, la cual crea una ima-
gen al infinito que puede observar el operador. La ampliacin total es el producto de la magnificacin de estos dos
grupos de lentes. En la prctica, el microscopio tpico de
laboratorio contiene de forma adicional grupos de lentes,
prismas y divisores de la imagen, lo cual puede o no afectar la ampliacin total, pero en forma invariable mejora el
funcionamiento ptico del instrumento o la conveniencia
de operacin, por ejemplo, al inclinar los oculares hacia el
operador.
El funcionamiento del microscopio se describe de modo
ms correcto en trminos de poder de resolucin (la capacidad del microscopio para distinguir dos puntos separados
por una distancia diminuta). En el mejor de los casos, el ojo
humano puede resolver sin ayuda dos puntos tan prximos
como 150 m uno del otro. El lmite de la longitud de onda
de la luz visible y la abertura numrica de las lentes del microscopio se combinan para precisar la resolucin terica
mxima del microscopio de luz a 0.22 m, al margen de la
ampliacin mxima.
Casi todos los microscopios modernos son modulares
en su construccin. Esto ofrece varios beneficios para el
usuario, incluida la facilidad para ampliar las capacidades
del microscopio y satisfacer demandas futuras. Lo ms
importante es tal vez que el presupuesto inicial incline la
compra por la obtencin de la ms alta calidad ptica posible; despus de todo, un microscopio completo es tan bueno como la calidad de sus sistemas de lentes. Las mejoras
futuras pueden incluir fuentes alternativas de iluminacin
y sistemas pticos accesorios o quiz la adicin de una
computadora personal, programas y cmara digital fija o
de video (la integracin de computadoras personales con
los microscopios pticos facilita la optimizacin automatizada de los ajustes del microscopio y la obtencin de la
62
CAP. 6
MICROSCOPIA DE LUZ
Figura 6-1 Corte transversal de un microscopio tpico de laboratorio (cortesa de Leica UK Ltd).
imagen conveniente, adems del almacenamiento de datos

y el anlisis de imgenes de gran alcance).
La figura 6-1 ilustra las partes principales del microscopio tpico de laboratorio. Varias partes merecen explicacin: las lentes objetivo, los oculares, el condensador, el
diafragma de campo y la(s) fuente(s) de luz.
Las lentes objetivo son la parte ms importante del microscopio, dado que determinan las diversas ampliaciones
posibles y definen la calidad ptica alcanzable. De manera
caracterstica, las lentes objetivo de 10, 40 y 100 estn
sujetas a una torreta giratoria. Esto ofrece ampliaciones totales de 100, 400 y 1 000 , respectivamente, cuando se
usan oculares de 10 .
Las propiedades de cada lente objetivo estn casi siempre inscritas sobre el can de la lente. Las marcas incluyen lo siguiente:
p. ej., Ph 2, que especifica la abertura del condensador

de contraste de fase a usar).
Plan, que seala que la lente produce una imagen de

campo plano en la cual todo se enfoca a travs del
campo entero de visin.
Apo, es decir, que la lente es corregible para aberracin cromtica, lo que de otra manera produce franjas
de color visible alrededor de los puntos finos en la
imagen.
Ampliacin de la lente y abertura numrica (en esencia el poder de recoleccin de luz de la lente), como
40 /0.85.
Longitud del tubo (que es la distancia efectiva entre el

ocular y el objetivo, casi siempre de 160 mm) y grosor
requerido del cubreobjetos (en mm), como 160/0.17.
Floutar, Fluor, Neofluar o UV, lo cual significa

que la lente transmite luz ultravioleta y por lo tanto es
conveniente para la microscopia de fluorescencia.
Oel, Imm u Oil, esto es, que la lente est diseada

para el uso con aceite de inmersin entre el elemento
final de la lente y el cubreobjetos.
Phaco, Phase o Ph, que indica la presencia de un

anillo de fase y que la lente es conveniente para la microscopia de contraste de fase (un nmero lo acompaa,
CDI, que significa que la lente est diseada de manera especfica para contraste diferencial de interferencia de Nomarski.
Nombre del fabricante.
TIPOS DE MICROSCOPIA
Los oculares amplan adems la imagen producida

por las lentes objetivo, por lo regular por un factor de 10.
La imagen que producen se enfoca en el infinito, lo que
permite al operador verla como si estuviera en la distancia.
Los oculares son tiles para los usuarios de anteojos debido a que se disean para permitir que la imagen completa
se observe desde varios centmetros arriba del ocular.
El condensador es una parte importante del sistema de
iluminacin. Cuando se ajusta de forma correcta, enfoca
un cono uniforme de luz sobre la muestra (en ampliaciones
bajas, una lente desplazable situada por encima del condensador puede removerse respecto de la trayectoria de la
luz para asegurar que el campo de visin est iluminado).
El ajuste correcto del diafragma del condensador asegura
un equilibrio ptimo de la resolucin de la imagen, el contraste y la profundidad del campo.
El diafragma del campo se centra y su abertura se ajusta
para que slo la regin observada de la muestra se ilumine. Esto minimiza la dispersin de luz innecesaria, que se
produce dentro de las regiones exteriores inadvertidas de
la muestra.
La fuente de luz utilizada en los microscopios modernos
del laboratorio es un bulbo de tungsteno/halgeno de bajo
voltaje; ste proporciona iluminacin intensa y estable en
el espectro visible. El bulbo puede alojarse dentro del cuerpo del microscopio o en un bastidor externo. Por lo general,
la microscopia de fluorescencia explota las caractersticas
espectrales ms adecuadas de la lmpara de arco de mercurio de alta presin, que se emite con intensidad en la regin
ultravioleta (UV) del espectro. Los lseres proporcionan
una fuente de luz monocromtica de alta intensidad, que
en condiciones ideales satisface a la microscopia confocal,
as como tambin a varias tcnicas de investigacin como
el fotoblanqueamiento y la fluorescencia de reflexin interna total.
Tipos de microscopia
La iluminacin de campo brillante es an la forma ms empleada de la microscopia en el laboratorio clnico. Otros mtodos, incluidas las microscopias fluorescente y la de contraste
de fase y, cada vez ms, las microscopias de campo oscuro,
luz polarizada y de Nomarski, tienen diversas aplicaciones en
el diagnstico de laboratorio. Sin embargo, el costo y la relativa complejidad del microscopio confocal han restringido
mucho su uso para aplicaciones de investigacin. Cada uno
de estos tipos de microscopia se comenta a continuacin.
Como su nombre lo seala, la iluminacin de campo brillante presenta al observador una imagen del conjunto de
la muestra contra un fondo brillante. Para trabajar de manera eficiente, la muestra debe absorber suficiente luz para
producir un grado aceptable de contraste. Las tinciones se
63
emplean de manera habitual para incrementar el contraste

de la muestra y revelan adems detalles estructurales.
La iluminacin de Khler, que introdujo de forma inicial en el siglo pasado August Khler, se ha convertido
en la forma universal utilizada de iluminacin de campo brillante debido a la calidad de la imagen producida.
No obstante, la calidad de la imagen ptima requiere el
reajuste regular del microscopio. Infortunadamente, muchos instrumentos no se utilizan a su mxima capacidad
debido a que se soslaya la necesidad de reajustar el microscopio al cambiar las lentes objetivo y se desconoce en
general la tcnica requerida.
En la iluminacin de Khler, dos conjuntos de rayos
de luz contribuyen a la imagen final, uno de ellos llamado rayos iluminadores y el otro rayos formadores de
la imagen. Ambos se derivan del filamento de la lmpara
incandescente (en la prctica, un filtro de vidrio molido se
fija frente al filamento de la lmpara para proporcionar una
fuente ms uniforme de los rayos iluminadores).
La figura 6-2 ilustra las trayectorias separadas seguidas
por los rayos iluminadores y los rayos formadores de la
imagen en un microscopio dispuesto de modo correcto para
la iluminacin de Khler. Ms notable an es lo siguiente:
1. Los rayos que iluminan son paralelos al plano de la
muestra para proporcionar la amplia rea de iluminacin requerida.
2. Los rayos iluminadores se enfocan con precisin sobre
el cristalino antes de divergir para proporcionar una
gran rea de iluminacin sobre la retina.
3. Los rayos formadores de la imagen convergen sobre el
plano de la muestra y crean una imagen magnificada
pero invertida de la muestra en el plano de la imagen
primaria debajo del ocular.
4. Las lentes oculares invierten de nueva cuenta los rayos
formadores de la imagen de la muestra antes de que entren al ojo y se enfocan sobre la retina para producir una
imagen de la muestra.
De esta manera, la iluminacin de Khler proporciona un
gran campo de visin iluminado de modo uniforme sobre
la retina del observador, junto con una imagen enfocada y
ampliada de la muestra.
La microscopia de fluorescencia aprovecha la propiedad de las molculas llamadas fluorocromos para emitir luz
de una longitud de onda particular cuando se excitan por
luz incidental de longitud de onda ms corta. Estos fluorocromos pueden ser naturales de la muestra bajo estudio,
pero por lo regular la muestra se trata de manera directa
o indirecta con colorantes fluorescentes. Por ejemplo, el
46-diamidino-2-fenilindol especfico de DNA (DAPI)
64
CAP. 6
MICROSCOPIA DE LUZ
Figura 6-2 Montaje de los componentes del microscopio para la iluminacin de Khler: a) trayectorias de los rayos formadores de
imagen; b) trayectorias de los rayos de iluminacin.
puede usarse de forma directa para revelar la presencia

extracelular del micoplasma que contiene DNA, el que
contamina con frecuencia los cultivos celulares. Los componentes celulares, por ejemplo el citoesqueleto, pueden
teirse de manera indirecta mediante sondas muy especficas creadas por la conjugacin de fluorocromos, como el
isocianato de fluorescena con anticuerpos monoclonales.
La microscopia de fluorescencia requiere una modernizacin relativamente simple del microscopio de luz convencional. Las lmparas de arco de mercurio de alta presin
suelen utilizarse para proporcionar iluminacin intensa en
la regin ultravioleta (UV) del espectro, lo cual excita la
fluorescencia en muchos fluorocromos importantes. El
uso de UV tambin exige el empleo de lentes objetivo especiales capaces de transmitir la UV. Esto se debe a que
en la configuracin tpica del microscopio de fluorescencia, las lentes objetivo tambin sirven para enfocar los rayos de iluminacin sobre la muestra. Dado que los rayos de
iluminacin pasan a travs del objetivo e inciden sobre la
muestra (ms que transmitirse a travs de ste desde abajo), esta tcnica se conoce como epiiluminacin.
Debe utilizarse una combinacin apropiada del filtro de
excitacin, el divisor del haz cromtico y el filtro de barrera para cada uno de los fluorocromos en uso (fig. 6-3). El
filtro de excitacin est situado enfrente de la lmpara de
mercurio y se selecciona para permitir la transmisin de un
espectro estrecho de longitudes de onda de la luz, incluida
la longitud de onda necesaria para excitar la fluorescencia.
El divisor de haz monocromtico debe reflejar las longitudes de onda excitatorias de la luz sobre la muestra y detener la luz incidente reflejada que alcanzara los oculares.
Figura 6-3 Trayectoria de la luz en un microscopio epifluorescente.
Como su nombre lo sugiere, el filtro de barrera asegura que

slo la luz emitida por el fluorocromo alcance los oculares
(la luz UV puede daar los ojos y la piel desprotegida).
TIPOS DE MICROSCOPIA
La microscopia de contraste de fase permite el estudio

de muestras biolgicas sin teir con contraste inherente
pequeo (incluidas muestras vivas). La tcnica explota las
diferencias de fase que se presentan entre la luz que pasa
a travs de una muestra biolgica y la luz que pasa de forma ininterrumpida a travs del medio circundante (en los
materiales biolgicos esta diferencia es cercana a 1/4). El
microscopio de contraste de fase requiere un condensador
especial con una serie de aberturas anulares en su plano focal delantero y lentes objetivo alineadas con los anillos de
fase en su plano focal posterior (fig. 6-4). Estas disposiciones introducen otro desplazamiento relativo de fase de 1/4
a la luz ya difractada a travs de la muestra y el resultado
es un total de 1/2 de retraso de fase en relacin con la luz
de fondo. La interferencia destructiva producida da lugar
a que los detalles refractivos en la muestra aparezcan ms
oscuros que el fondo, un efecto conocido como contraste
de fase positivo. Por el contrario, el contraste de fase negativo, en el cual los detalles de la muestra aparecen ms
brillantes que el fondo, surge cuando se produce interferencia constructiva al retardarse la luz de fondo por 1/4.
Los microscopios de contraste de fase son excelentes
para observar muestras vivas con la mnima distorsin,
incluidas las clulas animales cultivadas en contenedores
estriles y cerrados y la motilidad del espermatozoide en
cajas de Petri.
La microscopia de campo oscuro revela detalles estructurales como objetos brillantes sobre un fondo oscuro. Se
usa un condensador especial para proporcionar iluminacin oblicua que, si la muestra no la altera, no puede entrar
a las lentes objetivo. Slo aquellas partes de la muestra que
desvan la luz hacia la lente objetivo presentan una imagen a los oculares. Dos tipos de condensador facilitan la
Figura 6-4 Trayectoria de la luz en la microscopia de contraste

de fases.
65
Figura 6-5 Trayectoria de la luz en la microscopia de campo

oscuro.
iluminacin de campo oscuro. Una simple pieza de detencin puede usarse para oscurecer la porcin central de la
iluminacin que proporciona un condensador convencional y que deja slo que los rayos oblicuos incidan sobre la
muestra (fig. 6-5). Los condensadores de espejo especiales proporcionan la mejor calidad de imagen, pero slo son
apropiados para la iluminacin de campo oscuro.
La microscopia de campo oscuro no proporciona una
imagen por completo representativa de la muestra (muchas
estructuras intracelulares pueden no ser evidentes). Sin embargo, el mtodo es til para revelar detalles adicionales de
estructuras de borde fino que son difciles de observar con la
iluminacin de campo brillante debido a su carencia de contraste. Adems, puesto que la tincin es innecesaria (como
con la microscopia de contraste de fase y de Nomarski), este
mtodo de iluminacin es til para observar muestras vivas,
los espermatozoides y protozoos flagelados ofrecen imgenes fascinantes cuando se observan de esta manera.
La microscopia de luz polarizada representa otra modificacin del microscopio de luz convencional. La luz que
emana desde una fuente de luz puede ser el reflejo de las
numerosas ondas sinusoides que oscilan en alguno de los
planos de nmero infinito alrededor de un eje central; en
otras palabras, no est polarizada. El microscopio de polarizacin incluye dos filtros polarizantes: primero, el polarizador, que por lo general puede rotarse, se localiza entre
la lmpara y el condensador y adems proporciona rayos de
iluminacin a la muestra que oscilan en un solo plano, y, segundo, el analizador, que suele estar fijo, y se halla entre la
lente objetivo y el ocular. Si se asume que la muestra no est
en la trayectoria de la luz, entonces hay una sola posicin
del polarizador donde coinciden los planos transmitidos y la
imagen aparece mucho ms brillante. En cambio, a 90 de
esta orientacin los dos planos transmitidos se cruzan y el
resultado es la extincin de la luz que alcanza los oculares.
El microscopio polarizante explota la caracterstica birefringente de las muestras para dividir la luz polarizada
66
CAP. 6
MICROSCOPIA DE LUZ
incidente en dos componentes, que oscilan en planos paralelos respecto de las dos direcciones del ndice refractivo.
Los dos componentes se retardan de forma distinta dentro de la muestra, lo que introduce una diferencia de fase.
Puesto que estos componentes no comparten el mismo
plano no conducen a la interferencia. Sin embargo, al alcanzar el analizador, slo los componentes paralelos al analizador se transmiten, y dado que comparten entonces el
mismo plano, pueden interferir. Rotar el portaobjetos de la
muestra permite que la cantidad de interferencia constructiva se modifique, con el cambio consiguiente de la luminosidad de las estructuras birrefringentes bajo observacin.
Los objetos de birrefringencia conocidos, llamados
compensadores, incluidos el cuarzo y el filtro placa roja
de primer orden, se pueden insertar en la trayectoria de la
luz y usarse para calcular las caractersticas birrefringentes
de estructuras desconocidas, lo que contribuye a su identificacin. El microscopio de polarizacin se beneficia tambin del uso de las lentes objetivo especializadas libres
de tensin, que minimizan la cantidad de birrefringencia
introducida por el propio sistema ptico. La microscopia
polarizante ha encontrado aplicacin, por ejemplo, en la
diferenciacin entre el urato cido de sodio y el de pirofosfato de calcio deshidratado del lquido sinovial; empero, casi
siempre las aplicaciones de la microscopia polarizante en el
diagnstico de laboratorio son limitadas e infrecuentes.
La microscopia de contraste diferencial de interferencia (CDI) de Nomarski representa una combinacin de la
microscopia de polarizacin y la de contraste de fases y
es ms adecuada para las muestras finas transparentes sin
teir. La aplicacin acertada requiere un instrumento diseado especialmente, que incluye los filtros cruzados del
polarizador y analizador y dos divisores de haz del prisma
de Wollaston. Junto con las diferencias de fase introducidas por los divisores del haz, el retardo adicional de luz
impuesto por la muestra produce una imagen en la cual el
fondo es gris, los bordes de la mano izquierda son brillantes, las reas centrales son grises y los bordes de la mano
derecha son oscuros. Esto da a los objetos en la trayectoria de la luz un aspecto casi tridimensional, con organelos
como la mitocondria y los ncleos definidos con claridad.
En condiciones ideales, la microscopia de CDI satisface el
estudio de los organismos vivos. Asimismo, ha encontrado
apoyo en el estudio de rutina de muestras hmedas como el
sedimento urinario.
La descripcin de la tcnica microscpica moderna no
estara completa sin al menos hacer una referencia breve
a la microscopia confocal, la cual representa una modificacin importante de la microscopia epifluorescente. La
diferencia principal entre la microscopia confocal y los
mtodos ya explicados radica en que aqulla depende de la
iluminacin de punto ms que de la iluminacin de campo.
Figura 6-6 Trayectoria de la luz en un microscopio confocal que

realiza el escrutinio con lser.
Esta ltima la proporciona un rayo lser enfocado, que se

aplica a la muestra a una profundidad especfica (fig. 6-6).
La imagen que se produce es un compuesto generado por
computadora formado por las intensidades que difieren de
la luz emitida por las diferentes regiones de la muestra. En
consecuencia, la calidad de la imagen depende al final de
la sensibilidad de la luz y la resolucin de la cmara electrnica, as como tambin de la calidad de los elementos
pticos del microscopio y el montaje del instrumento. La
microscopia confocal puede proporcionar imgenes muy
ntidas desprovistas de la imagen desenfocada relacionada
con la observacin convencional de fluorescencia y desde
el interior de muestras relativamente gruesas (<100 m).
Micrografa
La buena micrografa es an cierto objeto de arte en los laboratorios cientficos y se describe de manera ms detallada en varios textos (Bradbury y Bracegirdle, 1998; Smith,
1990; Rost y Oldfield, 2000; Olympus Microscopy Resource Centre, noviembre 2004). La capacidad para crear un
registro conveniente y permanente de las imgenes deriva-
LECTURAS ADICIONALES
das del microscopio es importante en muchos campos de la

patologa diagnstica y por lo tanto la mayora de los laboratorios posee uno o ms fotomicroscopios. Por ejemplo, la
micrografa es en particular til para registrar las muestras
teidas con fluorescencia, que tienden a decolorarse con el
tiempo. Entre los instrumentos disponibles figuran los microscopios bsicos de laboratorio con un cuerpo de cmara
convencional de 35 mm unido por medio de un adaptador
simple y los microscopios con complejos sistemas de medicin de luz y una o ms cmaras adjuntas. Mejoras recientes
en la sensibilidad de la luz, resolucin y accesibilidad de las
cmaras electrnicas, sea las cmaras tradicionales de tubo
o las de dispositivo acoplado de carga y las de semiconductor complementario de xido metlico, le han conferido
aceptacin para este propsito. Adems, la rpida disponibilidad de las poderosas computadoras personales y los programas especializados satisfacen las necesidades del cada
vez ms ocupado laboratorio clnico o de investigacin en
relacin con la automatizacin del microscopio, procesamiento de imgenes digitales y anlisis, as como tambin
del cmputo de los datos.
A pesar de los cada vez ms asequibles sistemas digitales,
muchos laboratorios clnicos todava cuentan con cmaras
de pelcula convencionales. La calidad del fotomicrgrafo
tradicional depende de varios factores. La resolucin registrada obviamente se afecta por la calidad de los componentes
pticos del microscopio, pero tambin depende del tamao
del grano de la pelcula, lo que determina la nitidez de la
imagen fotogrfica. Desafortunadamente, la sensibilidad de
la luz o velocidad del filme fotogrfico se relaciona inversamente con el tamao del grano; al elegir la opcin correcta
del filme adecuado se consideran estos dos parmetros. La
interpretacin exacta del color de la muestra exige atencin
cuidadosa, sobre todo porque la sensibilidad espectral de las
emulsiones fotogrficas difiere de la del ojo humano. Por lo
67
tanto, la seleccin cuidadosa de filtros que compensan el color respecto de la temperatura del color de la luz de iluminacin (que vara cuando el voltaje de la lmpara se ajusta)
es tambin necesaria para registrar una representacin fiel
del aspecto original de la muestra.
La micrografa digital y la microscopia de video cada
vez encuentran una funcin mayor en la consulta, educacin e investigacin remotas entre sitios geogrficos
distantes. Basta sealar que la telepatologa implica la
transmisin unidireccional de datos, incluidas imgenes
digitales, entre los sitios, quizs a travs del correo electrnico. Pese a ello, los desarrollos ya mencionados en la
automatizacin del microscopio, junto con las asequibles y
disponibles conexiones de internet de banda ancha, significan que la telepatologa verdaderamente dinmica implica
el control interactivo de un microscopio remoto (incluidos
la posicin de la muestra, enfoque, amplificacin, iluminacin, etc.) y enlaces en vivo simultneos por videoconferencia, los cuales se han convertido en una emocionante
realidad en la patologa clnica de rutina.
Bradbury S. Bracegirdle B. Introduction to Lighy Microscopy.
1998: Bios Scientific, Oxford, UK.
Determan H, Lerpusch F. The Microscope and Its Application.
1998: Wild Leitz, Wetzlar.
Lacey AJ. Light Microscopy in Biology, 2nd ed. 1999: IRL Press,
Oxford, UK.
Smith RF. Microscopy and Photomicrography. 1990: CRC Press,
Boca Raton, FL.
Rost F, Oldfield R. Photography with a Microscope. 2000: Cambridge University Press, Cambridge, MA.
Olympus Microscopy Resource Centre: http//www.olympusmicro.
com/ (accessed November 2004).
7
Mtodos cuantitativos en patologa tisular
Peter W Hamilton y Derek C Allen
Introduccin
La prctica de la medicin es central para casi todos los aspectos de la investigacin cientfica, ya que proporciona los
medios para comparar observaciones de una manera objetiva, reproducible y confiable. Desde su inicio, la patologa
diagnstica se basa, en buena medida, en la determinacin
visual de la morfologa tisular por microscopia, el uso de
indicios diagnsticos visuales para clasificar la enfermedad y la utilizacin de criterios descriptivos y lingsticos
para sealar la forma de alcanzar este proceso. Al tiempo
que se han observado enormes avances en la identificacin
de signos morfolgicos de relevancia clnica en histologa
y citopatologa, la patologa diagnstica es an un proceso
subjetivo, que a menudo da lugar a una pobre reproducibilidad en la clasificacin del diagnstico entre un patlogo y
otro e incluso entre uno mismo en ocasiones diversas.
La clasificacin de una alteracin maligna inicial, como
la displasia, proporciona un ejemplo. Los estudios demuestran valores de (kappa) tan bajos como 0.15 en la clasificacin de la displasia cervical, 0.27 en la displasia bucal y
0.55 en las lesiones preinvasivas del bronquio. La es una
medida de consenso entre diversos observadores y sus lmites son de 0 (ausencia de consenso) a 1 (consenso unnime).
En la citologa cervical, los ndices de error de 2% se han
cuantificado con valores de tan bajos como 0.46 y la clasificacin de la neoplasia intraepitelial cervical de cortes del
tejido demuestra la falta de consenso hasta en 36% de los
casos. Estos resultados destacan la dificultad de clasificar
con exactitud y consistencia los cambios morfolgicos si se
usa tan slo el ojo humano. Por lo tanto, existen oportunidades de explorar los novedosos recursos diagnsticos que
proporcionan objetividad, consistencia y reproducibilidad.
Se ha reconocido por mucho tiempo que la medicin

de las caractersticas histolgicas y citolgicas puede suministrar datos objetivos para mejorar en grado notable la
capacidad de tomar decisiones diagnsticas. En patologa,
la medicin se conoce de muchas formas, entre ellas morfometra, microscopia cuantitativa, patologa cuantitativa,
anlisis de imagen y morfologa matemtica. La cuantificacin tiene diversas ventajas. Permite describir en trminos numricos los cambios morfolgicos que observa el
ojo. Esto revela, a partir de datos cuantitativos y objetivos,
la informacin que es reproducible y puede utilizarse de
modo estadstico para ciertas hiptesis sobre los cambios
morfolgicos del tejido. Adems, la medicin permite la
deteccin de caractersticas sutiles, subvisuales, apenas
distinguibles para el ojo. En ambos casos, la medicin puede ser una herramienta invaluable para la interpretacin
objetiva de anormalidades morfolgicas y para la clasificacin cuantitativa de la enfermedad humana.
Mtodos
Existen diversos mtodos disponibles que permiten obtener informacin microscpica cuantitativa. Las mediciones
lineales simples se pueden realizar mediante un instrumento graduado (una pieza plana de cristal que incluye una
regla o rejilla microscpica de dimensiones definidas que
puede insertarse en el tubo ocular de cualquier microscopio). La regla se sobrepone a la imagen de la muestra y se
puede utilizar para registrar datos cuantitativos (ver figs.
7-1 y 7-11). Con un ajuste simple, esto puede emplearse para medir distancias lineales de profundidad o espesor (ver figs. 7-11 y 7-12). Por otra parte, la estereologa
70
CAP. 7
MTODOS CUANTITATIVOS EN PATOLOGA TISULAR
Figura 7-1 a) Uso de un marco reticulado para

determinar el porcentaje del rea ocupada por
los ncleos. La rejilla consiste en 30 puntos, 14
de los cuales se hallan dentro de los ncleos, lo
que representa un valor de 47%. Esta tcnica se
adopta en la estereologa para obtener mediciones
bidimensionales y tridimensionales a partir de las
imgenes microscpicas. b) Gravado lineal para
inferir el rea superficial de las microvellosidades
a partir de una biopsia de intestino delgado.
(a)
es una aproximacin que usa sondas de punto o lineales

que se sobreponen a la imagen (ver fig. 7-1). Esta tcnica
antigua y bien establecida, aunque simple, todava encierra
un valor considerable para obtener las medidas tridimensionales (p. ej., volumen, rea superficial, longitud) a partir
de imgenes de dos dimensiones (es decir, cortes de tejido). Dichos mtodos se aplican rara vez en la investigacin
y la prctica de la patologa. Esto es as no porque sean
ineficaces, sino ms bien porque la tendencia a la automatizacin y el anlisis de una gran cantidad de muestras ha
convertido a la computadora en el instrumento central para
la medicin en patologa, ms an por la gran disponibilidad de computadoras personales; stas, con los programas
apropiados, tienen mayor capacidad de medir parmetros
morfolgicos lineales, estereolgicos y ms complejos a
partir de imgenes microscpicas de muestras tisulares y
celulares.
Computadoras
Las computadoras han tenido un efecto esencial en muchos aspectos de la prctica y la investigacin mdicas.
En patologa, estas mquinas son parte importante de la
infraestructura del laboratorio y en tareas como los sistemas de informacin de los pacientes, la generacin de
informes de patologa, la identificacin de la muestra y
la fotomicroscopia digital. Las computadoras tambin se
han convertido en la herramienta principal para la medicin del tejido y la clula en la microscopia de luz. Cuando se suministran las coordenadas del contorno de una
estructura tisular o celular, el programa puede efectuar
con rapidez una gran variedad de mediciones referentes al
contorno, como rea, permetro, dimetro mximo, dimetro mnimo, morfologa, etc. Esta informacin se puede
almacenar de manera electrnica en una base de datos y
se analiza de modo estadstico para comparar grupos de
(b)
diagnstico, muestras de tejido de pacientes con pronstico diferente y cambios morfolgicos posteriores al
tratamiento. A continuacin se describen en extenso dos
tcnicas computarizadas.
Medicin interactiva automatizada
Esta modalidad confa por completo en el usuario humano
para trazar o marcar los lmites de las estructuras tisulares
o celulares a medir. Consiste en una computadora con un
dispositivo de trazo (el ratn o una pluma digital), y una
tabla para efectuar dibujos ms especializados. Al delinear
el lmite de un objeto especfico, el sistema registra las
coordenadas x y y (fig. 7-2). stas se pueden utilizar para
medir caractersticas del tamao y la forma o definir el
lmite dentro del cual pueden computarse las mediciones
densitomtricas. Es posible trazar los lmites a partir de las
microfotografas simples, las imgenes reales transmitidas a
la pantalla mediante una cmara de video o las imgenes digitales almacenadas (vase la seccin siguiente). Casi todas
las computadoras de escritorio se pueden fijar con facilidad
para que funcionen como aparatos de medicin interactivos. El programa para facilitar la medicin est disponible
en el comercio. Un programa gratuito, que desarrollaron
los National Institutes of Health, est tambin disponible
en el portal de Scion Imaging (www.scioncorp.com). Esta
herramienta es por tanto econmica, fcil de practicar y utilizable en una amplia variedad de aplicaciones.
Imgenes digitales en patologa
La capacidad de registrar imgenes microscpicas digitales ha tenido un efecto importante en el almacenamiento
electrnico de una gran cantidad de imgenes y tambin en
la rpida obtencin de la informacin numrica a partir de
71
MTODOS
Figura 7-2 Trazo interactivo de ncleos a partir de la imagen microscpica viva. El panel izquierdo muestra la imagen original. El panel
derecho demuestra cmo el contorno de la superficie de cada ncleo se traza con el ratn y se utiliza para computar el rea nuclear. El
ncleo sobre la parte superior derecha est en proceso de delinearse. Estos valores nucleares se pueden almacenar y utilizar para calcular
con rapidez diversas mediciones estadsticas sobre la muestra, incluidas la media, la desviacin estndar y la variacin del tamao nuclear.
Esta tcnica ha demostrado ser muy til en la caracterizacin de los cambios sutiles del tamao y la forma nucleares en relacin con
malignidad.
estas imgenes para la evaluacin cuantitativa. Las cmaras

fotogrficas digitales se pueden conectar a un microscopio mediante un adaptador estndar. La cmara fotogrfica
registra la imagen en una tarjeta de memoria interna, que se
transfiere despus a una computadora para el procesamiento y anlisis. De manera alternativa, las cmaras de video
digitales o anlogas se pueden conectar a un microscopio
y la computadora digitaliza las imgenes de modo directo a travs de una tarjeta digital de imagen. Cualquier opcin puede ser satisfactoria, aunque para las aplicaciones
especiales es vital el control sobre los ajustes de la cmara
fotogrfica, como la velocidad del obturador, el aumento y
la temperatura del color.
La mayor parte de las cmaras digitales, fijas o de video,
muestrean imgenes cuando menos a tres megapixeles.
Algunos equipos de captura de imagen especiales pueden
registrar imgenes solas hasta de seis megapixeles.
Dos factores determinan la calidad de la imagen: la
resolucin espacial y la del color. La primera depende
del nmero de pixeles que representan un rea definida del
campo. Cada pixel (contraccin del ingls picture element)
representa una caja que define un punto en la imagen.
55 (25 pixeles)
2525 (625 pixeles)
Cuantos ms pixeles tenga una imagen, mayor es la resolucin espacial (fig. 7-3).
Mientras que el nmero de pixeles en una imagen determina su resolucin espacial, tambin es necesario determinar cuntos valores se permiten para la representacin
de la densidad o el color. En la figura 7-4 se observa que
cada pixel se puede representar por un solo valor de gris. A
mayor nmero de valores de grises, mejor resolucin de la
imagen. En tanto que el ojo humano slo puede distinguir
de modo confiable cerca de 64 valores de grises, 256 valores de grises suministran habitualmente una representacin
exacta de la imagen original. Cada pixel puede asignarse a
cualesquiera de los 256 valores de grises posibles segn sea
la densidad de ese punto en la imagen original (0 = negro
y 255 = blanco). En consecuencia, una imagen digital es
tan slo una matriz de nmeros que se puede almacenar y
recuperar para proyectarla en un monitor de computadora.
Las imgenes a color se realizan con pixeles de intensidades diferentes de los colores primarios: rojo, verde
y azul. De nueva cuenta, el nmero de posibles valores
disponibles para representar las contribuciones rojas, verdes y azules a un color particular determina la resolucin
100100 (10 000 pixeles) 500500 (250 000 pixeles)
Figura 7-3 La misma imagen con diferentes resoluciones espaciales. Puede verse
que cuanto mayor es la resolucin del pixel,
mejor es la definicin de la imagen y sus estructuras.
72
CAP. 7
Figura 7-4 La misma imagen con diferentes resoluciones de valores grises. En condiciones normales, 256 valores grises representan el
nmero mximo de las densidades usadas para
representar una imagen.
2 valores grises
Figura 7-5 Cada imagen de color se realiza

con tres imgenes de valores grises que representan los componentes rojos, verdes y azules.
Cada valor gris determina la contribucin de ese
color a un pixel particular.
A todo color
del color de la imagen final. Como en las imgenes de grises, cada color puede representarse por valores en lmites
de 0 a 255, lo que supone un nmero posible de combinacin de 16 millones de colores (256 [rojo] 256 [verde]
256 [azul]). Cada imagen de color se puede por tanto
descomponer en tres imgenes de nivel de gris y cada una
representa los componentes rojos, verdes y azules de la
imagen a color (fig. 7-5).
Segmentacin automtica de la imagen
Tener una representacin digital de una imagen histolgica
permite efectuar numerosos procedimientos imposibles
con una imagen anloga. Al trazar un histograma de frecuencia en el nivel de los grises se obtiene un resumen de
la densidad de informacin dentro de la imagen. Si se fija
un umbral en este histograma es posible excluir todos los
pixeles que rebasan por arriba o abajo el umbral. ste es el
llamado umbral del nivel de gris y permite de forma especfica identificar los objetos dentro de la imagen que tiene
ciertas caractersticas de densidad, por ejemplo los ncleos
(fig. 7-6). La identificacin de objetos de esta manera se denomina segmentacin. La computadora puede precisar de
manera automtica el lmite del contorno de los objetos
que segmenta y derivarse a partir de estas caractersticas
morfomtricas.
Fijar slo un umbral del nivel de gris no siempre posibilita la segmentacin exacta de todos los ncleos. En la
figura 7-6 se puede ver que algunos ncleos juntos se han
identificado como un objeto solo. Si la computadora midiera el rea de estos objetos de modo automtico, los resultados seran inexactos. Sin embargo, puesto que se dispone
de la informacin almacenada en un formato digital, existe
4 valores grises
Canal rojo
16 valores grises
Canal verde
256 valores grises
Canal azul
una variedad de procedimientos que pueden utilizarse para

resolver este problema. Cada contorno nuclear sospechoso
se puede examinar por separado en relacin con sus caractersticas morfomtricas (tamao, forma, etc.). Si stas no
rebasan los lmites definidos, entonces el objeto se puede
aceptar como ncleo. Si, pese a ello, las caractersticas del
objeto exceden el lmite definido, puede procesarse ms
para determinar si puede obtenerse un mejor resultado de
la segmentacin. Por ejemplo, se puede buscar el contorno del objeto por transiciones destacadas en la direccin
(llamadas cspides). Si se encuentra que ocurren dos
en los lados opuestos del objeto, puede activarse una funcin divisora y el objeto se divide (fig. 7-7). Est disponible
un catlogo extenso de algoritmos que procesa la imagen
y ello permite que, en casi todas las circunstancias, se segmenten de manera confiable objetos o estructuras dentro de
una imagen histolgica o citolgica.
La capacidad de identificar componentes importantes de
la imagen mediante algoritmos de la computadora y medir
con rapidez caractersticas morfolgicas, y utilizar stas
para clasificar un caso dado, lleva a preguntar si esto se
puede hacer de una manera automatizada. La automatizacin se ha desarrollado con rapidez en otras disciplinas del
laboratorio, como hematologa y bioqumica clnica, pero
ha sido lenta en patologa. La carencia de la automatizacin en patologa diagnstica no est del todo injustificada
hasta la fecha. La patologa de diagnstico requiere la visualizacin directa de las estructuras tisulares y celulares
complejas con el microscopio de luz estndar, lo cual hace
de la automatizacin un proceso en extremo difcil en comparacin con el uso de las pruebas bioqumicas o cuentas
celulares. Sin embargo, con los progresos del anlisis de
imagen computarizada y la visin de una computadora, es
posible en teora automatizar la tarea de la interpretacin
MTODOS
73
10 000
5 000
Valor de gris
10 000
5 000
Valor de gris
Figura 7-6 Uso del histograma de umbral para identificar objetos dentro de la imagen. A. Imagen original
del nivel de gris. B, Histograma del nivel de gris para la
imagen que muestra los lmites de los valores de grises
del pixel de 0 a 255. C. Se define un umbral que instruye a la computadora para seleccionar todos los pixeles
con valores a la izquierda de la lnea del umbral. D. La
imagen ilustra regiones segmentadas que, debido a su
densidad ms alta (valores grises ms bajos), son sobre
todo ncleos.
Figura 7-7 Algoritmos de divisin para la

segmentacin exacta del ncleo.
morfolgica y la clasificacin del diagnstico. El mayor

esfuerzo en este campo se observa en el desarrollo de los
dispositivos de exploracin cervical automatizados (discutidos ms adelante), pero en la actualidad se experimentan
las tcnicas en la histologa tisular.
Por supuesto, el desarrollo de un sistema por completo automatizado con la visin de una computadora lleva
tiempo; una opcin por la que se inclinan muchos es la de
utilizar una combinacin de algoritmos de segmentacin
de imagen y de trazo interactivo para asegurarse de que
todos los componentes de la imagen se identifiquen con
exactitud.
Densitometra y textura
Como se ha visto, cuando las imgenes se registran en formato digital, la informacin cuantitativa se almacena en la
densidad de cada pixel dentro de la imagen. En patologa,

esta informacin se puede utilizar con eficacia para cuantificar la densidad ptica (DO) de la reaccin de una tincin
particular. Esto se consigue al medir el valor de gris de una
serie de filtros de DO y trazar una curva de calibracin para
convertir el valor de gris en DO. Mientras que la informacin geomtrica es ms fcil de estandarizar y no necesita
equipo especial para la captura de imagen, las medidas densitomtricas exigen la estandarizacin y el control de los
niveles de luz de una imagen a la siguiente, lo cual requiere
la calibracin cuidadosa del microscopio y todo el aumento automtico, la temperatura del color y los ajustes del
obturador sobre la cmara fotogrfica al apagarse. La medicin de la DO es la ms eficaz cuando la reaccin de tincin es estequiomtrica, es decir, cuando la densidad de la
tincin es proporcional al sustrato que se mide. Esto se encuentra cuando se usa la reaccin de Feulgen para marcar el
DNA, en la cual la medicin de la densidad ptica nuclear
CAP. 7
Clulas de control/diploides
Tincin de Feulgen
DNA aneuploide
Densidad ptica
Figura 7-8 Citometra de DNA. Al cuantificar la densidad ptica de los ncleos teidos para DNA puede obtenerse una medida
cuantitativa del contenido (ploidia) del DNA. Al comparar con las
clulas del control, cuyo estado de DNA diploide se conoce (p.
ej., linfocitos), pueden identificarse las desviaciones a partir de
valores normales de ploidia del DNA y medirse. Esto se conoce
a menudo como DNA aneuploide y es en particular evidente en
la neoplasia.
integrada por densitometra proporciona una medida cuantitativa del contenido de DNA. Como el contenido de DNA
se altera, en particular en la enfermedad maligna, esta medicin se ha explorado de forma extensiva como un indicio
cuantitativo til en el diagnstico y pronstico. La identificacin de distribuciones alteradas en el contenido del DNA
(fig. 7-8) tiende a vincularse con la inestabilidad del cromosoma y ello se incrementa en las tumoraciones, casi
siempre con un pronstico pobre. Otros mtodos, como la
citometra de flujo, permiten una medicin ms rpida del
contenido del DNA y las alteraciones de ploidia en muestras clnicas. No obstante, la citometra de DNA que usa
la proyeccin de imagen automatizada tiene en cuenta un
Figura 7-9 El anlisis de la textura de la cromatina nuclear implica la revisin de las relaciones espaciales de los valores de grises dentro
de un ncleo teido. Esto se puede utilizar para
generar una huella nuclear de cromatina, que
proporciona indicios sutiles pero muy sensibles
de la patobiologa fundamental de la clula.
anlisis ms especfico de poblaciones definidas de clulas

dentro de una seccin o frotis de tejido.
En el diagnstico convencional, la distribucin de
la cromatina nuclear o el fenotipo de la cromatina es un
indicio visual que suministra informacin vital sobre la actividad biolgica de una clula. Al emplear la informacin
numrica proporcionada a travs de imgenes digitales es
posible cuantificar la organizacin de la cromatina y determinar la distribucin espacial de los valores de gris dentro
de un ncleo (fig. 7-9). Puesto que una matriz de nmeros
que representan la densidad de cada pixel delinea el ncleo
de modo digital, puede inferirse un grupo de caractersticas estadsticas de tal manera que se puede medir la distribucin espacial de valores de gris dentro del ncleo (fig.
7-9). Este grupo de caractersticas se conoce como textura y proporciona una medida objetiva del fenotipo de la
cromatina. Asimismo, al suministrar apoyo cuantitativo
para los cambios visuales evidentes en la organizacin de la
cromatina, se ha demostrado que estas medidas ilustran las
propiedades de la cromatina que no son obvias para el ojo.
Estas caractersticas se han utilizado en la identificacin
de los cambios vinculados con malignidad (CVM), que se
discuten ms adelante.
Por convencin, el anlisis de la textura se ha realizado
sobre los ncleos teidos de forma especfica para el DNA
mediante la reaccin de Feulgen. No obstante, en fecha
reciente se ha utilizado la hematoxilina para la medicin
de la textura nuclear y ha demostrado ser muy eficaz. Esta
tincin es fcil de aplicarse y es la ms usada en la patologa diagnstica de rutina. Pese a ello, no proporciona
una reaccin estequiomtrica y requiere estandarizacin y
control cuidadosos.
Mediciones espaciales nucleares
El aglomerado nuclear, las distancias entre los ncleos y
sus patrones dentro de los tejidos representan indicios
Escala de valores
74
75
APLICACIONES DE LA MEDICIN EN LA PATOLOGA DIAGNSTICA
Imagen original
Teselacin de Veronoi
Triangulacin de Delauney
rbol conector mnimo
Figura 7-10 Mediciones espaciales nucleares generadas a partir de una citologa de aspiracin con aguja fina. Las posiciones nucleares
se identifican y se utilizan como puntos trazados sobre una grfica. Las mediciones espaciales generadas de estas grficas proporcionan
datos cuantitativos sobre la cohesin celular.
nicos de la extensin de la enfermedad fundamental y

en especial de la gravedad de las lesiones preinvasivas. Se
pueden usar diversas tcnicas para medir el espaciamiento
nuclear, la mayor parte basada en la teora grfica que determina las caractersticas espaciales de un grupo de puntos en
el espacio bidimensional. De manera general se denominan
anlisis sintcticos de la estructura o sociologa celular.
Existe un nmero de mtodos disponibles para el anlisis
sintctico de la estructura, incluidos la teselacin de Voronoi, la triangulacin de Delaunay y el rbol conector
mnimo. La triangulacin de Delaunay es la formacin de
tringulos entre cada grupo posible de puntos: se aceptan
slo los tringulos en los cuales la circunferencia no contiene otros puntos que los del tringulo (fig. 7-10). La teselacin complementaria de la grfica de Delaunay es la
teselacin de Voronoi. A partir de estas grficas puede extraerse una variedad de mediciones, por ejemplo, el nmero
de puntos, la longitud lineal promedio del tringulo, la longitud total de lneas, la media, la desviacin estndar, la
oblicuidad, la curtosis y la entropa de las longitudes lineales, el rea del tringulo, las reas del objeto incluidas, etc.
Por otra parte, el rbol conector mnimo es un grfico sin
asas y conecta todos los puntos donde la suma mnima de la
longitud de las lneas vincula los puntos. Como se indic,
diversas mediciones pueden obtenerse de esta grfica, que
reflejan cambios adyacentes en la estructura aglutinada de
ncleos. Ejemplos de estos tres mtodos se ilustran en la figura 7-10. Las aplicaciones de este tipo de tcnica en la morfologa cuantitativa se han demostrado en la clasificacin
de la displasia colorrectal, determinacin de la atrofia gstrica y definicin de los patrones de distribucin nuclear en
muestras endomtricas citolgicas.
Aplicaciones de la medicin
en la patologa diagnstica
Para establecer el diagnstico en la prctica diaria, los
patlogos utilizan con regularidad la cuantificacin. Las
mediciones lineales simples del dimetro del tumor determinan la progresin patolgica en la clasificacin internacional TNM (tumor/ganglios/metstasis) y tambin
suministran la informacin pronstica en varios cnceres
comunes, como el de mama. La precisin de los mrgenes quirrgicos del tumor es importante para predecir la
posibilidad de recurrencia local del tumor y seleccionar a
los sujetos para quimioterapia o radioterapia coadyuvantes
posoperatorias en las neoplasias de mama y colorrectal. El
tratamiento ptimo del melanoma maligno y el carcinoma
cutneos es la reseccin quirrgica completa y la excisin
y delineacin completa del margen, y debe determinarse en
la muestra patolgica. Las tcnicas bsicas son apropiadas,
como el uso de la estadificacin microscpica de Vernier,
una retcula o regla ocular. Son en particular tiles las lupas
(amplificadores) de cristal o Perspex que incorporan una
escala lineal. Los clculos porcentuales semicuantitativos
del compromiso tumoral en la biopsia con aguja de centros
prostticos son un buen indicador del volumen total de la
masa y la probabilidad de que el cncer se extienda ms
all de la glndula.
Varias aplicaciones estndar se detallan ms adelante,
pero algunos de los desarrollos potenciales ms recientes
son:
Cuantificacin patolgica de los trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer.
76
CAP. 7
Distincin de lesiones melanocticas benignas y malignas mediante una combinacin de inmunoexpresin

cuantitativa con protena S100, rea nuclear y citometra de DNA.
Cuantificacin de las poblaciones celulares y la distribucin del tejido en los padecimientos hematolgicos
en biopsias de mdula sea.
Anlisis de la estructura del tejido en las fibrosis pulmonar y heptica.
Medida de Breslow para el grosor del melanoma
sta es una de las mediciones de uso ms general en la histopatologa diagnstica y cuantifica la profundidad de la invasin del melanoma por debajo de la capa celular granular
de la piel (fig. 7-11). Breslow defini este mtodo y su valor pronstico. Las mediciones se pueden efectuar con un
ocular graduado y hoy da se ha convertido en una prctica

aceptada para clasificar el melanoma maligno como fino
(< 0.76 mm), de grosor intermedio (0.76 a 1.5 mm) o grueso (> 1.5 mm), con un porcentaje de supervivencia libre de
enfermedad de 100, 70 y 40, respectivamente.
Biopsia del hueso
El anlisis morfomtrico puede suministrar datos en extremo valiosos para el diagnstico de la enfermedad metablica sea. Las biopsias del hueso se toman de la cresta
iliaca y el anlisis se realiza con cortes sin descalcificar
y microscopia con luz transmitida, polarizada cruzada y
ultravioleta. Se pueden realizar y utilizar las mediciones
del volumen trabecular y osteoide, superficies osteoides y
mineralizadas y el grosor del osteoide para diagnosticar
la osteoporosis y la osteomalacia (fig. 7-12). Son posibles
mediante rejillas de punto/lnea y procedimientos estereolgicos. En la actualidad, el uso del anlisis computarizado
de imagen se ha convertido en un medio ms atractivo para
medir esas caractersticas.
Biopsia muscular
La valoracin de las caractersticas de la fibra muscular
en cortes longitudinales y transversales es central para el
diagnstico de los trastornos neuromusculares, incluidas
las miopatas congnitas, metablicas y destructivas y la
distrofia muscular. La medicin morfomtrica del tamao
y el nmero de fibras del msculo se realiza sobre cortes
transversales, teidos de modo diferencial para el tipo de
Figura 7-11 Medida de Breslow para calcular la invasin del melanoma en la piel. Se muestra el ocular graduado (unidades principales en milmetros) sobrepuesto en la seccin del tejido canceroso.
Figura 7-12 El clculo cuantitativo del hueso, el osteoide y la mdula en biopsias de hueso permite identificar el hueso normal (N), la
osteomalacia (Om) y la osteoporosis (Op).
APLICACIONES DE LA MEDICIN EN LA PATOLOGA DIAGNSTICA
77
Figura 7-13 Morfometra de la biopsia de msculo

en la valoracin de los trastornos neuromusculares. La
imagen izquierda muestra una biopsia teida con la
reaccin de la ATPasa para distinguir las fibras musculares tipos I y II. No slo puede contarse el nmero de
fibras, sino tambin se puede medir la superficie menor
de la fibra muscular (derecha) para determinar la hipertrofia y la atrofia de la fibra.
fibra mediante la reaccin de la APTasa de miosina (fig.

7-13). La atrofia y la hipertrofia de la fibra se determinan
por la medicin del tamao de la fibra, que se toma por
convencin como el dimetro de la fibra muscular que cruza la superficie menor del contorno.
Cncer de mama
Porcentaje de pacientes sobrevivientes
El mtodo de Bloom y Richardson para clasificar el cncer

de mama es un intento de introducir criterios semicuantitativos simples al diagnstico histopatolgico. Esto requiere la clasificacin subjetiva del pleomorfismo nuclear,
esto es, un clculo del porcentaje del tumor que muestra formacin de tbulos y una cuenta de mitosis por 10
campos de alto poder. El nmero de mitosis parece ser en
particular relevante en el pronstico de sujetos con cncer
de mama (fig. 7-14). Se ha demostrado en ensayos clnicos
a gran escala que el clculo de un ndice pronstico mul-
IAM = 0
IAM = 4
IAM = 16
IAM = 36
IAM = 81
tivariado basado en cuentas mitticas, tamao del tumor y

estado linftico del ganglio puede proporcionar una medida valiosa del pronstico en el cncer de mama, sobre todo
en mujeres premenopusicas. El anlisis cuantitativo de la
estructura del conducto y la valoracin del patrn epitelial pueden tambin suministrar datos de utilidad para la
discriminacin de la hiperplasia intraductal y el carcinoma
ductal in situ.
Endometrio
La medicin del tamao y la forma nucleares es de gran
valor en la diferenciacin del endometrio normal respecto
de la hiperplasia atpica y el carcinoma endometrial. Estas
ventajas pueden completarse con el anlisis cuantitativo
de las caractersticas estructurales que, en combinacin,
permiten la identificacin de casos de hiperplasia atpica
que progresan hacia una entidad maligna. Un sistema de
clasificacin morfomtrica multivariado ha demostrado
una correlacin slida con la profundidad de la invasin
miometrial y es ms especfico que los esquemas de clasificacin subjetiva, como el de Kurman. En los Pases Bajos,
el anlisis de la morfometra endometrial por curetaje o de
muestras de histerectoma se efecta de modo sistemtico
en un intento por reducir el sobretratamiento de estas lesiones. Se ha considerado que esto podra ahorrar alrededor
de 15 millones de dlares por ao en Estados Unidos. La
combinacin del eje nuclear medio ms corto, ploidia del
DNA y profundidad de la invasin miometrial tambin ha
demostrado tener un valor pronstico de importancia, en
especial en cnceres endometriales de etapa I de la FIGO
(International Federation of Gynecology and Obstetrics).
Meses despus del diagnstico
Figura 7-14 Esta figura ilustra el papel de las cuentas mitticas

en la prediccin de la supervivencia en pacientes con cncer de
mama. Mientras el ndice de actividad mittica (IAM = nmero
de mitosis por 10 campos de alto poder) aumenta, el porcentaje de
los pacientes que sobreviven por periodos ms largos dentro de ese
grupo disminuye.
Citologa cervical automatizada

La citologa cervical automatizada representa uno de los
esfuerzos principales en los ltimos 30 aos para introducir la automatizacin en un proceso diagnstico de gran
exigencia visual. Esta tcnica se ha desarrollado luego de
78
CAP. 7
reconocer, primero, la notoria reduccin de la mortalidad

del cncer cervical tras la introduccin de los programas
de deteccin de cncer cervical y, segundo, la demandante carga de trabajo que sta propici. Result claro que
los tcnicos con trabajo excesivo y los citlogos clnicos
podan diagnosticar casos difciles de modo errneo. El
desarrollo de dispositivos de escrutinio computarizados
comenz a finales del decenio de 1950, pero slo en fecha
reciente han salido al mercado sistemas con capacidades
automatizadas en esta rea.
En esencia, estos sistemas se basan en el mismo principio: las imgenes se proyectan en un microscopio, se someten
a una exploracin mecnica, se ordena en forma secuencial y se graban en formato digital; las clulas se identifican
y segmentan, y despus se sujetan al anlisis cuantitativo
(fig. 7-15). Se registran mltiples propiedades, como tamao, forma, densidad y textura nucleares. Cada ncleo se
Control de calidad
La exploracin de la citologa cervical exige una valoracin
de la calidad para la reexploracin sistemtica de al menos
10% de los portaobjetos o la rpida revisin de todos los
portaobjetos. Esto lo realizan por convencin individuos experimentados del equipo de citologa y es un proceso que
consume tiempo. Se puede utilizar un sistema de exploracin
cervical automatizado para someter a escrutinio una proporcin de portaobjetos, lo cual exime al citlogo de efectuar
esta tarea. Se delinean discrepancias entre la clasificacin
humana y la de la mquina del mismo caso y se formula una
explicacin posible. Puesto que la mquina posee una exactitud definida de clasificacin, se asegura el mantenimiento
de la calidad de los procedimientos diagnsticos.
Preescrutinio
Hasta 95% de los frotis cervicales es normal. Los sistemas
automatizados pueden seleccionar una gran proporcin
de frotis normales y dejar las muestras visuales ms complejas para la valoracin del citlogo humano. De nueva
cuenta, esto podra representar una reduccin notable de la
carga de trabajo de un laboratorio y un enriquecimiento del
trabajo de exploracin, dado que el citlogo slo analizara
los casos ms conflictivos.
Automatizacin completa
Figura 7-15
Identificacin automtica de ncleos celulares
cervicales a partir de un frotis. La caracterizacin cuantitativa
permite la clasificacin del tipo de clula y el reconocimiento de
clulas malignas.
clasifica entonces como normal o potencialmente anormal.

Esta informacin se puede procesar de varias maneras.
Algunos sistemas estn diseados para almacenar todas
las imgenes de anormalidades, que ms adelante revisa
el citlogo para confirmar un diagnstico de enfermedad
maligna. Esto requiere experiencia humana en el proceso
de tomar decisiones finales, pero reduce en grado significativo la carga de trabajo, dado que la mquina selecciona los
campos sospechosos de manera automtica.
Como alternativa, el sistema puede determinar una clasificacin diagnstica sin requerir la intervencin humana.
Esta clasificacin por completo automatizada de frotis cervicales se puede utilizar con varios propsitos.
Los dispositivos por completo automatizados, que proporcionan un diagnstico definitivo de todos los frotis presentados, reclamados por tantos aos, ahora son una posibilidad.
Existen aspectos medicolegales que deben superarse, pero la
automatizacin completa podra ser importante en el abastecimiento de servicios de exploracin cervical en los pases
en los que no existe un programa de investigacin.
Es probable que en los prximos aos se desarrolle con
rapidez el uso de sistemas automatizados con proyeccin de
imagen en la citologa diagnstica del cervix y otros sitios.
Dichos sistemas se introdujeron ya en algunos laboratorios
como dispositivos del control de calidad y se promueven
ahora como sistemas de preescrutinio. Con los avances de
la tecnologa informtica, la deteccin de la computadora
y los procedimientos de clasificacin, es probable que los
sistemas por completo automatizados funcionen a niveles
que superen las mejores cualidades humanas.
Fenotipo de la cromatina y cambios vinculados
con la malignidad (CVM)
Las caractersticas cuantitativas del fenotipo de la cromatina
se han demostrado en muchas situaciones para proporcionar
AUTOMATIZACIN EN HISTOLOGA
ndice del fenotipo de la cromatina
indicios nicos de procesos celulares subyacentes y pueden

utilizarse como un medio objetivo para clasificar la enfermedad y, ms importante an, para predecir resultados clnicos.
El anlisis de la textura de la cromatina parece tener un papel
relevante en el diagnstico, la clasificacin y el pronstico de
las neoplasias vesicales. Adems, la evidencia sugiere que el
anlisis de la medicin del fenotipo de la cromatina antes
del tratamiento se pueda emplear para anticipar la reaccin
a la quimioterapia y radioterapia en el cncer de vejiga. La
textura de la cromatina nuclear tambin se puede usar para
discriminar entre los carcinomas de prstata, los sensibles a
hormona y los resistentes a la misma, y ha demostrado ser
til en el pronstico predictivo del cncer metastsico de la
prstata.
Las alteraciones sutiles de la configuracin nuclear de
la cromatina se han demostrado no slo en las clulas malignas, sino tambin en las clulas de apariencia normal
de sujetos con un tumor maligno. Estas transformaciones
se han llamado cambios vinculados con la malignidad o
CVM. Tales cambios pueden cuantificarse de modo confiable mediante el anlisis automatizado de la textura de
79
los ncleos (fig. 7-16) y destacar a menudo las caractersticas nucleares que no son evidentes al ojo humano. Por
ejemplo, se ha demostrado en citologa cervical que en un
anlisis de tan slo 30 clulas que parecan normales por
muestra podra identificarse hasta 70% de muestras con
displasia moderada o grave. Esto subraya su papel en los
dispositivos cervicales automatizados de exploracin y
muchos de los sistemas actuales emplean la textura nuclear
como una caracterstica diagnstica. Los CVM tambin se
han demostrado en el colon, la vejiga, la mama y el pulmn
(fig. 7-16). No es del todo preciso si estos cambios en las
clulas al parecer normales indican un cambio premaligno primario en la clula o si se trata de cambios secundarios atribuibles a la exposicin de clulas circundantes a
los factores relacionados del tumor. El hecho que los CVM
pueden desaparecer despus de la eliminacin de un tumor
se inclina por esto ltimo, al menos en algunos tejidos. El
trabajo reciente sugiere que los CVM se pueden emplear
como un mtodo potencial para la exploracin del cncer
de pulmn. El anlisis de los CVM en biopsias histolgicas
normales del pulmn permiti la identificacin correcta superior a 80% de los pacientes con cncer. Adems, se ha defendido en la exploracin de los pacientes para el cncer de
pulmn la identificacin de texturas alteradas en clulas
que parecan normales a partir de muestras de esputo.
Adenocarcinoma
Adenoma
Adenocarcinoma
adyacente
Adenocarcinoma lejano
Recto normal
Automatizacin en histologa
Figura 7-16 Esta grfica muestra el ndice del fenotipo de la

cromatina cuantificado mediante el anlisis de la textura en la
mucosa normal a una distancia (lejana) a partir del adenocarcinoma colorrectal y en su contigidad. Puede observarse que hay
una tendencia monotnica con el aumento de anormalidades a
medida que es mayor el acercamiento a la tumoracin. Esto destaca los cambios vinculados con la malignidad (CVM) en la organizacin de la cromatina en las clulas normales que circundan
a una lesin maligna. La grfica tambin muestra las alteraciones
principales de la organizacin de la cromatina dentro de adenomas y adenocarcinomas.
El anlisis automatizado de las preparaciones en la citologa

es una tarea exigente. An ms difcil es la interpretacin y
el anlisis automatizados de las muestras histolgicas debido a la complejidad de las imgenes. Hasta hace poco tiempo, el anlisis automatizado de las imgenes histolgicas
se consideraba una tarea insuperable, excepto en las aplicaciones ms simples. Sin embargo, con el desarrollo de los
poderosos procesos de computadora y el uso de la metodologa experta del sistema, ahora es posible el desarrollo de
los sistemas con visin para las tareas complejas de proyeccin de imgenes. Esto requiere la definicin del conocimiento referente a los componentes que comprenden la
imagen y sus interrelaciones. stos se definen en un archivo
y se utilizan para conducir las acciones de un sistema experto de la segmentacin de la muestra. Los objetos se aceptan o rechazan como componentes histolgicos con base en
criterios cuantitativos explcitos. Los objetos rechazados se
pueden seleccionar para el proceso de imagen adicional y
facilitar su identificacin. Una vez que se identifican todos
los objetos, la muestra histolgica se reconstruye y ello permite la medicin de caractersticas histomtricas relevantes.
Esta metodologa ahora se aplica con xito al anlisis de
colon, prstata y mama (fig. 7-17).
80
CAP. 7
Figura 7-17 Automatizacin en histologa. Con un sistema experto de visin se pueden identificar de manera automtica las glndulas
colorrectales y sus componentes; se segmentan y se efectan mediciones que pueden emplearse para medir de modo objetivo el grado
de displasia colorrectal.
Inmunohistoqumica cuantitativa
Uno de los avances principales en patologa diagnstica
durante los ltimos 30 aos es la visualizacin microscpica de protenas mediante mtodos inmunocitoqumicos
(vase cap. 4). A pesar de ello, evaluar la reaccin de tincin es an subjetivo, no slo para evaluar el nmero de
clulas inmunopositivas sino tambin en la determinacin
de la intensidad de la reaccin de marcado. Las tcnicas visuales se basan en un sistema de marcacin numrico para
el porcentaje de clulas positivas y la intensidad con la cual
se suman para proporcionar una inmunomarcacin total en
casos especficos. Incluso este acercamiento bien definido acusa una mala reproducibilidad cuando se compara la
marcacin generada por un experto y la de otro clnico en
la misma muestra de tejido. Por esta razn, muchos fabricantes del instrumento comercializan ahora equipos con
anlisis de imagen, que pueden extraer datos cuantitativos
inmunohistoqumicos a travs del anlisis de la informacin densitomtrica de imgenes digitales de color. Como
la molcula indicadora primaria tiene un color especfico,
es importante que el sistema de la proyeccin de imagen
sea capaz de identificar este color en preparaciones celulares y distinguirla de cualquier otra contratincin. Existen
tambin problemas relacionados con la estandarizacin y
el control de calidad en la inmunocitoqumica cuantitativa
y se recomienda el uso de controles sobre el portaobjetos
de inmunorreactividad definida. El punto principal en el desarrollo de la inmunohistoqumica cuantitativa ha sido la
evaluacin cuantitativa de los receptores de estrgeno y progesterona y positividad de HER2/neu en el cncer de mama.
La automatizacin es tambin la fuerza impulsora principal
y ahora se dispone de muchos sistemas comerciales enfocados en el procesamiento rpido de las microconfiguraciones
de tejido para la identificacin de biomarcadores inmunocitoqumicos potenciales para diagnstico, pronstico y respuesta a la terapia.
El portaobjetos digital
Los avances recientes en proyeccin de imagen digital
proporcionan la capacidad de analizar y registrar de forma
digital un portaobjetos microscpico completo (fig. 7-18).
Figura 7-18 Portaobjetos digital. A la izquierda se muestra la exploracin de un corte completo de tejido de la prstata. La muestra
original del tejido era de 27 9 mm. Con exploracin a 40 se obtuvo una imagen digital de 58 877 42 336 pixeles en 24 bites de
color. La imagen final fue de 456 megabites de tamao. La caja pequea enmedio de la imagen se puede agrandar de manera electrnica
para mostrar el detalle en el cual se registr la imagen (derecha).
Esto se puede realizar a gran amplificacin para conservar

el detalle microscpico de la muestra y el portaobjetos puede verse a cualquier amplificacin digital si se agranda o
reduce la imagen sobre la pantalla. Las dimensiones completas de la imagen habran hecho de esto una tarea imposible hace apenas algunos aos. En la actualidad, con el
procesamiento rpido se ha desarrollado el programa que
permite el anlisis y la revisin rpidos de estas imgenes
en megapixeles. Esto permite que los casos de patologa se
distribuyan entre los centros de forma digital, ya no ms en
las diapositivas. El anlisis de portaobjetos completos tambin facilita el estudio automatizado de las caractersticas
del tejido y la clula con la observacin de la computadora,
esto ltimo cada vez ms importante en la evaluacin de
las microconfiguraciones de tejido. El anlisis de imgenes
completas de esta manera todava es exigente, pero con la
utilizacin automatizada de portaobjetos, dado que es posible sin la intervencin humana, tiene un potencial enorme
para facilitar el anlisis automatizado en la investigacin y
la prctica de la patologa.
Conclusin
Sin duda alguna, la medicin en patologa mejora la interpretacin visual convencional. Sin embargo, la incorporacin de tcnicas a la prctica comn ha sido lenta y lo es
todava. Esto se atribuye a diversos factores y a la carencia
de pruebas clnicas a gran escala para probar la eficacia de
la medicin de problemas diagnsticos. La mayor parte
de los estudios se ha realizado en una cantidad relativamente pequea de casos bajo condiciones semicontroladas. Aun
cuando los estudios a gran escala han ilustrado el valor y
81
la relacin costo-beneficio de la medicin de la muestra

tisular, pocos centros han adoptado estas tcnicas. Esto
se debe muchas veces a las restricciones financieras y de
tiempo impuestas a los patlogos, lo cual limita el esfuerzo
adicional necesario para generar datos numricos a partir
de las muestras del enfermo. Las escasas instituciones que
ofrecen la medicin en la patologa de rutina (sobre todo
en los Pases Bajos y Estados Unidos) cobran este servicio
adicional. Dicho costo lo absorbe el paciente, el asegurador o el proveedor del cuidado mdico y las mediciones
las efecta sobre todo el personal tcnico. La promocin
del fabricante de equipo y la introduccin de tcnicas ms
automatizadas, en combinacin con la necesidad de cuantificar nuevos marcadores desarrollados por las compaas
farmacuticas, pueden ser cuestiones que definan el futuro
de la medicin en la patologa diagnstica de rutina. Esto
podra modificar en grado notable la forma de practicar la
patologa y complementar la capacidad diagnstica del patlogo; con ello se proporcionara el soporte objetivo para
tomar decisiones diagnsticas y delinear el pronstico.
Baak JPA, Janssen E. Expert Opinion: DNA Ploidy analysis in
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8
Marcadores de proliferacin en histopatologa
Cheryl E Gillett y Diana M Barnes
Introduccin
En los tumores, la tasa a la cual las clulas proliferan tiene un efecto significativo sobre el pronstico. Puesto que
la actividad proliferativa se calcul primero de modo muy
general al medir el cambio del tamao de una masa durante un periodo, el tema completo de la proliferacin y
la forma de medirla han prosperado y ahora se dispone de
centenares de publicaciones sobre el tema. Existe una corriente continua de trabajos que ha introducido nuevos marcadores, combinado marcadores establecidos, modificado
las tcnicas de demostracin y promovido tcnicas novedosas de evaluacin. Tal informacin es una perspectiva
desalentadora para la persona inexperta que desea medir
la proliferacin y obliga a formular la pregunta: cul es la
mejor manera de hacerlo?
Antes de describir algunas de las diversas maneras de
cuantificar la proliferacin es importante tener una comprensin bsica del ciclo celular, ya que todos los marcadores demuestran un aspecto particular. El ciclo celular
completo o la etapa fraccin de crecimiento tiene cuatro fases: Gap 1 (G1), sntesis del DNA (S), Gap 2 (G2)
y mitosis seguida por citocinesis (M). Durante la fase del
ciclo celular completo, la clula produce de manera secuencial las protenas necesarias para posibilitar la rplica
del DNA y divisin nuclear y celular subsiguientes. Los
puntos de comprobacin existen en todas las fases del ciclo
para determinar el estado de la clula antes de ingresar a
la fase prxima. En condiciones normales, slo las clulas
con DNA normal progresan a la siguiente fase. Las clulas defectuosas de cierta manera se detienen hasta que se
repara el DNA o se dirigen hacia la muerte programada de
la clula (apoptosis). Todas las clulas pueden ingresar a
una fase de no proliferacin o aciclicidad, que se conoce

como Gap 0 o (G0). Las clulas conservan su viabilidad y
pueden moverse de nueva cuenta dentro del ciclo cuando
sea necesario.
El trmino tasa de proliferacin se utiliza con frecuencia para describir la cantidad de un marcador de proliferacin en material clnico. Por lo regular, estas mediciones
se realizan en una pieza de tejido en un momento especfico y, por lo tanto, el trmino tasa es inadecuado. Actividad proliferativa es una expresin ms exacta de esta clase
de evaluacin y el concepto tasa debe reservarse para los
mtodos que miden el cambio respecto del tiempo.
Marcadores de proliferacin
El nmero de los llamados marcadores de proliferacin
sigue en aumento. Se describen a continuacin los que estn razonablemente bien establecidos y han proporcionado
informacin pronstica.
Cuenta mittica o ndice de actividad mittica (IAM)
Las mitosis son los nicos marcadores proliferativos
que se pueden identificar y cuantificar en un corte teido
con hematoxilina y eosina (H-E) convencional (fig. 8-1).
Sin embargo, no son siempre fciles de reconocer y pueden
confundirse con los ncleos hipercromticos o los ncleos
en las fases iniciales de la apoptosis. La fijacin inadecuada, corte deficiente de la seccin y el sobreteido pueden
conducir a dificultades en el reconocimiento de las mitosis
y pueden incluso afectar el nmero de las mitosis identificadas.
84
CAP. 8
MARCADORES DE PROLIFERACIN EN HISTOPATOLOGA
Otra forma de identificar figuras mitticas consiste en

emplear anticuerpos como el MPM2. Estos mtodos se dirigen a reducir las ocasiones de incluir cuerpos apoptticos
en una cuenta mittica y tambin son susceptibles al anlisis automatizado.
Regiones organizadoras del nucleolo (RON)
Figura 8-1 Figuras mitticas en una muestra teida con hematoxilina y eosina (H-E) convencional (400 ).
Calcular la actividad proliferativa de una pieza de tejido de acuerdo con el nmero de mitosis presentes puede
parecer al principio una tarea sencilla. No obstante, se han
desarrollado varios mtodos de evaluacin a travs de los
aos, y a pesar del valor reconocido de las mitosis como
marcadores de la proliferacin, no ha dejado de ser controversial el mtodo correcto de evaluacin. El primer
mtodo formal de evaluacin usado fue una cuenta mittica, esto es, una escala de clculo (0, +, ++) usada por
muchos patlogos. Una cifra mittica cuenta el nmero de
mitosis presentes en un nmero de campos de alto poder
(CAP) y presenta los resultados como el nmero medio de
mitosis por CAP. Para hacer ms reproducible el mtodo
se han hecho algunas depuraciones, incluidas la evaluacin
de las clulas en la periferia de la lesin, realizacin de la
cuenta en campos consecutivos y definicin del rea de los
CAP. La cuenta mittica es una parte integral de la clasificacin de la infiltracin de los carcinomas mamarios,
mediante los criterios modificados de Bloom y Richardson;
tambin se utiliza en la determinacin del diagnstico y el
pronstico de los sarcomas de tejido blando.
Para superar algunas de las inconsistencias relacionadas
con una cuenta mittica se introdujo el ndice de la actividad mittica. Con este mtodo de evaluacin el nmero de
mitosis se expresa como una proporcin del nmero de clulas en interfase. El nmero total de clulas en interfase y
las figuras mitticas se cuentan en CAP consecutivos hasta
que el corte se muestrea lo suficiente. Puesto que el IAM
mide la proporcin de mitosis en la lesin, no se relaciona
o lo afecta el rea del CAP. Tambin considera variaciones
de la celularidad de la lesin y el tamao de la clula. Un
ndice de actividad mittica dura alrededor de 10 minutos
ms que una cuenta mittica, pero es una manera ms exacta de comparar la proporcin de mitosis presentes en los
tumores.
Las RON son los sitios de los genes del rDNA y estn presentes en grupos o asas sobre un nmero de cromosomas
especficos. Al tener varios sitios de transcripcin, la clula
puede continuar con la demanda de los ribosomas siempre
que sea necesario. Las protenas relacionadas con RON,
como lo indica su nombre, se sitan muy cerca de las
RON y se ha demostrado que funcionan como marcadores
de la proliferacin. Las protenas relacionadas con RON
son argirfilas, se demuestran con una tcnica de plata y
Figura 8-2 Las regiones organizadoras del nucleolo (AgNOR)

relacionadas con protenas se demuestran mediante una tcnica
de plata (1 000 ).
se les conoce entonces como AgNOR. stas pueden verse

como puntos negros pequeos dentro del ncleo (fig. 8-2).
Se considera que el nmero de AgNOR presente refleja la
produccin de ribosomas y por tanto la sntesis protenica
dentro de la clula. La valoracin de las AgNOR resultantes se ha considerado no slo como un marcador de la actividad proliferativa, sino tambin como un mtodo para
distinguir entre lesiones benignas y malignas, una medida
del tumor ploide y del grado de malignidad.
Las AgNOR son en extremo difciles de contar y algunos autores anteriores tambin se refirieron a su patrn
dentro del nucleolo como racimos y AgNOR satlites.
La evaluacin no era reproducible, lo que explic en buena
medida la variacin notificada de su valor pronstico. Diversas publicaciones describen el uso de los analizadores de
MARCADORES DE PROLIFERACIN
imagen para cuantificar la presencia de AgNOR y muchas

han demostrado que el rea media ocupada por las AgNOR
dentro del ncleo proporciona informacin pronstica.
Demostracin inmunohistoqumica de la proliferacin
El primer anticuerpo que se reconoci como marcador de la
actividad proliferativa fue el Ki67 monoclonal (mKi67). El
significado funcional de la protena Ki67 es an impreciso,
a pesar de que se la ha estudiado bien en el plano molecular. Pese a ello, se ha establecido que la protena se expresa
durante todas las fases del ciclo celular, pero no durante
la etapa de aciclicidad. El mKi67 se ha usado en muchos
estudios y la medida resultante de la actividad proliferativa
se equipara bien con otros marcadores establecidos para la
proliferacin, entre ellos las cuentas mitticas y el ndice
de marcado con timidina (fig. 8-3a,b). No obstante, la desventaja con el anticuerpo mKi67 consiste en que el rea
del antgeno que reconoce es muy sensible a la fijacin y
la antigenicidad se pierde despus de los procedimientos
estndar de fijacin con formaldehdo e infusin en parafina. En consecuencia, es posible llevar a cabo de forma
prospectiva estudios pronsticos con mKi67 en muestras
de tejido fresco congelado.
El potencial del mKi67 como marcador de la proliferacin proporcion el impulso para producir anticuerpos
similares a las protenas que eran funcionales durante el
ciclo celular, pero lo suficientemente resistentes para sobrevivir a la fijacin con formalina y al procesamiento con
parafina, lo cual dot al marcador de una aplicacin mucho
ms amplia. Cuando se desarroll un anticuerpo contra el
antgeno nuclear de la clula en proliferacin (PCNA), se
lo consider el equivalente resistente al fijador de mKi67
(fig. 8-4). Sin embargo, despus del entusiasmo inicial, se
encontr que el PCNA (tambin conocido de forma con-
85
fusa como ciclina en algunos trabajos) desempeaba un

papel en la rplica del DNA y la reparacin del DNA. Esta
dualidad condujo a la gran variacin en cuanto a su valor
como marcador de proliferacin. Su expresin parece relacionarse con la proliferacin en tejidos que tienen clulas
embrionarias activas, pero la relacin es menos clara en
las lesiones epiteliales. La protena tambin tiene una vida
media larga y por tanto se detecta an ms tiempo despus de su periodo funcional dentro del ciclo celular. Otro
anticuerpo, KiS1, tambin se consider de manera inicial
como sobresaliente contra el antgeno Ki67 y un equivalente resistente al fijador de mKi67. Pese a ello, la evaluacin
subsiguiente del anticuerpo ha demostrado que detecta
la topoisomerasa II alfa, una de las enzimas que controla
los rompimientos de trenzado simple y doble en el DNA
durante la replicacin y la transcripcin. A pesar de este
nuevo hallazgo, el KiS1 todava se utiliza como un marcador de la actividad proliferativa cuando se expresa en
Figura 8-4 El antgeno nuclear de la clula en proliferacin se

identific por el anticuerpo de la PC10 en tejido fijado en formalina impregnado en parafina (400 ).
Figura 8-3 El antgeno Ki67 se reconoce con el anticuerpo monoclonal Ki67 en tejido congelado a partir de un tumor que prolifera
con rapidez (a) y lentitud (b) (200 ).
86
CAP. 8
Figura 8-5 La topoisomerasa II alfa se detect mediante el anticuepo KiS1 en tejido fijado en formalina impregnado en parafina a partir
de un tumor que prolifera con rapidez (a) y lentitud (b) (400 ).
todas las fases del ciclo celular (fig. 8-5a,b). Sin embargo,
el KiS1 es apenas menos especfico que el mKi67, dado
que detecta un cierto nivel de protena despus que la clula completa el ciclo y se halla en una fase acclica. Varias
publicaciones, que son necesarias para proporcionar una
informacin proliferativa ms exacta y reproducible, han
notificado el uso de estos anticuerpos con modificaciones
para el mtodo y el procedimiento de evaluacin.
Los anticuerpos establecidos para detectar Ki67, y por
consiguiente las clulas en proliferacin, son el Ki67 policlonal (pKi67) y el MIB1 monoclonal. Ambos reconocen la
parte de la protena estructural Ki67 y pueden continuar la
unin al antgeno despus de la fijacin y la impregnacin
en parafina (fig. 8-6). El MIB1 y la expresin de pKi67 han
demostrado un nexo cercano con el anticuerpo mKi67 y
su informacin de la actividad proliferativa se correlaciona
bien con otros marcadores. Se han aadido al desarrollo
de estos anticuerpos las mejoras recientes de los mtodos de recuperacin del antgeno ms all de la digestin
proteoltica. La recuperacin con mediacin de calor del
antgeno es esencial para el uso de ambos anticuerpos en
material embebido en parafina y fijado en formalina. Incluso el mKi67 se puede utilizar en material impregnado en
parafina despus de la recuperacin del antgeno, aunque
los resultados no son tan constantes como en los casos de
pKi67 o MIB1.
ndice de marcado con timidina (IMT)
y bromodesoxiuridina (IMB)
Ambas tcnicas implican la incorporacin de un nucletido
durante la fase S que puede demostrarse a continuacin.
En el caso del IMT, la timidina se grada y se demuestra su incorporacin mediante autorradiografa (fig. 8-7).
Para la bromodesoxiuridina, la incorporacin se evidencia
Figura 8-6 Antgeno Ki67 reconocido mediante anticuerpo

MIB1 en tejido fijado en formalina e impregnado en parafina de
un tumor que prolifera con rapidez (400).
tras emplear la inmunocitoqumica con un anticuerpo antibromodesoxiuridina (fig. 8-8). Una desventaja es que ambos mtodos necesitan material viable para incorporar los
nucletidos dentro del DNA. Adems, la deteccin de la
timidina radiomarcada trae consigo problemas de equilibrio con la velocidad del desarrollo de las autorradiografas
y con aspectos de seguridad de la tcnica. No obstante, los
resultados son buenos cuando los realizan mdicos experimentados y proporcionan una evaluacin exacta de la
proporcin de clulas en la fase S. stas son tcnicas especializadas y no se incorporan con facilidad en laboratorios
de histopatologa con cualquier grado de confiabilidad.
En fecha reciente se ha empleado el marcado de bromodesoxiuridina en combinacin con la citometra de flujo
para medir la proliferacin in vivo y ha proporcionado una
medida real de la tasa de proliferacin. A los pacientes
se les inyecta bromodesoxiuridina, que se incorpora en las
clulas durante la sntesis del DNA. De la lesin se recoge
MARCADORES DE PROLIFERACIN
Figura 8-7 Deteccin autorradiogrfica de la timidina incorporada dentro del ncleo de clulas en proliferacin (200 ).
Figura 8-8 Deteccin inmunohistoqumica de bromodesoxiuridina incorporada dentro del ncleo de clulas en proliferacin
(400 ).
87
puede crear un histograma que revela los nmeros de clulas con cantidades similares de DNA. El anlisis automatizado de estos histogramas permite calcular la proporcin
de clulas en cada fase del ciclo celular. En consecuencia,
la informacin de la actividad proliferativa es la proporcin
de clulas en la fase S, o la fraccin de la fase S, que es de
enorme inters.
La citometra de flujo es uno de los mtodos ms objetivos de evaluacin de la actividad proliferativa, pero como el
tejido tiene que desagregarse antes del anlisis, los resultados no se pueden relacionar con la morfologa y la muestra
puede incluir elementos normales, benignos e inespecficos
del tejido bajo estudio. Adems, al usar el material incluido
en parafina, una proporcin sustancial del tejido es necesaria e incluso entonces el nmero de ncleos incompletos o
mal preservados en la muestra significa que alrededor de
una cuarta parte de los histogramas no se puede interpretar
con exactitud. Se han desarrollado en grado considerable
las capacidades del citmetro de flujo desde los inicios al
medir un solo parmetro, el contenido de DNA. Ahora se
dispone de instalaciones para realizar las mediciones mltiples y su uso se ha especializado an ms. La medicin
del contenido de DNA es ms probable que se realice junto
con la medicin de una o ms protenas inmunofluorescentes detectadas, lo cual suministra informacin sobre la relacin entre la fase del ciclo celular y la expresin de la
protena. La tcnica de la citometra de flujo y el anlisis
automatizado de los resultados sugieren un acercamiento
ms cientfico para determinar la proliferacin; empero,
un buen nmero de estudios ha demostrado que puede obtenerse informacin similar por conteo cuidadoso de las
mitosis y positividad al Ki67 o MIB1, que se puede obtener
en laboratorios de histopatologa sin equipo especial.
Otros marcadores
una biopsia de varias horas despus de la inyeccin y a
partir de este tejido se pueden medir en clulas individuales
la presencia de la incorporacin de bromodesoxiuridina y
el contenido de DNA. La relacin entre tiempo, inyeccin
y muestreo, incorporacin de bromodesoxiuridina y contenido de DNA determina la tasa a la cual las clulas en la
lesin proliferan para determinarse.
Citometra de flujo
La citometra de flujo es uno de los mtodos ms confiables
y reproducibles para medir la actividad proliferativa y se
puede usar en material citolgico, fresco o fijado, impregnado en parafina. Al cuantificar la cantidad de DNA en los
ncleos individuales separados de una muestra de tejido se
No han dejado de aparecer otros marcadores potenciales de

la proliferacin; muchos de ellos son anticuerpos cultivados
contra las protenas que presentan un nivel creciente de expresin durante el ciclo celular. En una manera similar al
Ki67 y PCNA, se ha aceptado que si un antgeno est presente durante una fase especfica o fases del ciclo celular,
entonces su deteccin significa que puede utilizarse para
identificar las clulas que se encuentran en proliferacin.
Entre estos supuestos marcadores figuran diversos miembros
de la familia de la ciclina y sus cinasas dependientes de la
ciclina (cdks) y la protena del retinoblastoma (pRb). Otras
protenas relacionadas con la replicacin del DNA tambin
se han identificado como marcadores potenciales, incluidas
protenas de mantenimiento del minicromosoma (Mcm). Estas protenas Mcm (de las cuales hay seis, Mcm 2, 3, 4, 5, 6
88
CAP. 8
y 7) intervienen en el inicio de la replicacin del DNA y la

prevencin de la re-replicacin de un solo ciclo celular.
Infortunadamente, muchos de estos marcadores celulares relacionados con el ciclo poseen una expresin alterada
en clulas malignas, debido a los cambios del trayecto regulador de las protenas que controlan el ciclo celular y no
son marcadores convenientes de la actividad proliferativa.
Como consecuencia del gran inters en identificar las protenas que controlan el ciclo de la clula, se desarrollan con
frecuencia nuevos anticuerpos y se comercializan a gran
escala. Esto sobrepasa el ritmo al cual su potencial como
marcadores de la proliferacin puede evaluarse del todo. Por
consiguiente, debe tenerse cuidado al usar cualquier anticuerpo nuevo para asegurar una validacin adecuada antes
de aceptarse como marcador de proliferacin. No obstante, muchos de los anticuerpos son de inters como blancos
relacionados con tratamientos biolgicos especficos, no
tanto como herramientas para medir la proliferacin.
La hibridacin in situ tambin se utiliza para demostrar la actividad proliferativa. La expresin del mRNA de
la histona 3 (H3) se ha reconocido bien como tal marcador
por varios aos y se equipara con otros marcadores que
proporcionan informacin pronstica. Las histonas son el
componente protenico principal de la cromatina y desempean la funcin de empaquetar filamentos de DNA en
una forma compacta, el nucleosoma. Como las histonas se
vinculan de modo tan estrecho con el DNA, tambin se
producen durante la sntesis del DNA. Por lo tanto, la de-
NA
SP
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His itom
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PC d e
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B
IM
IM
2-7
AgNOR
Topoisomerasa II
Ki-67 y KiS5
teccin de niveles crecientes del mRNA de la H3 en la fase

S refleja la actividad proliferativa de los tejidos. Se conoce
que los valores del mRNA de H3 disminuyen con rapidez
durante la G2 y ninguna sntesis ocurre una vez que la clula entra a la fase G0, lo que las convierte en uno de los
marcadores ms especficos de la actividad proliferativa.
Empero, este mtodo no se emplea de forma extensa, sobre
todo porque la tcnica de hibridacin in situ requerida para
detectar el mRNA no es asequible para la mayor parte de
los laboratorios; adems, tampoco los resultados son significativamente mejores que los de otros marcadores que no
requieren un mtodo de deteccin especializado. Las tcnicas de hibridacin in situ, y en especial las no isotpicas, se
han introducido de modo gradual en ms laboratorios, as
que tal vez los datos de la proliferacin se obtengan en el
futuro con ms frecuencia mediante el mRNA de la H3.
La figura 8-9 muestra cmo los diferentes marcadores
de la actividad proliferativa se relacionan uno con otro y
con las diferentes fases del ciclo celular.
Uso prctico de marcadores

La eleccin del mtodo de medicin para la actividad proliferativa depende en buena medida del tipo de material
que se evala. Si un estudio retrospectivo se conduce con
material impregnado en parafina, no pueden utilizarse los
mtodos como IMT, IMB y mKi67.
Cu PM2
ent
am
itt
ica
/n
dic
e
Muerte
de
ac
tiv
id
ica
tt
mi
ad
G0
Cclico
Acclico
Figura 8-9 Relacin de diferentes marcadores de proliferacin con las fases del ciclo celular.
MTODO DE EVALUACIN
Los puntos a considerar para la preparacin del tejido

incluyen el tipo de fijador usado, puesto que ste influye en
todos los marcadores, y el efecto que puede causar un retraso de la fijacin. Las figuras mitticas son muy difciles de
distinguir de los cuerpos apoptticos en algunos fijadores
con base de alcohol; asimismo, tambin puede ser difcil
identificar la AgNOR. La expresin del antgeno se reduce
e incluso se pierde en algunas soluciones fijadoras, a pesar
del uso de la recuperacin del antgeno regulada por calor.
Aun en la citometra de flujo los colorantes nucleares son
incapaces de ligar la cromatina cuando se utiliza un fijador
que contiene metal. Algunos estudios muestran que un retraso de la fijacin reduce el nmero de mitosis en el tejido
y, por consiguiente, se subestima la actividad proliferativa.
Por ltimo, casi nunca se considera que el espesor de la
muestra tenga un efecto importante sobre la demostracin
y evaluacin de los marcadores. No obstante, as como se
altera la calidad de la tincin, las cuentas mitticas y de
AgNOR varan segn sea el espesor de la seccin y en la
inmunohistoqumica la tincin resultante cambia de intensidad, un factor importante si sta se incluye como parte de
la evaluacin. Todos los cortes que se someten a la recuperacin del antgeno regulada por calor deben montarse en
portaobjetos cubiertos con adhesivo y calentarse; de otra
forma las muestras se levantan y algunas se desprenden por
completo.
Mtodo de evaluacin
Una vez que se selecciona el marcador ms conveniente de
la proliferacin y se pone en prctica el mtodo, la siguiente
pregunta es: cmo se efecta la cuenta? Esto se considera a menudo como la etapa final y ms fcil de la tcnica,
pero requiere un acercamiento metdico para obtener resultados constantes y reproducibles. En esta fase la citometra
de flujo tiene una ventaja sobre otros marcadores, ya que
miles de clulas se pueden determinar con rapidez con un
grado satisfactorio de consistencia entre una muestra y otra.
El resto de los mtodos en los cuales se demuestra un marcador de proliferacin en un corte histolgico tiene varios
criterios similares que deben cumplirse.
Primero, el tiempo tomado para realizar la evaluacin
debe equilibrarse contra el valor de la informacin obtenida. Sera intil tomar 20 minutos para llevar a cabo una
cuenta formal sobre una muestra si puede conseguirse tal
informacin del pronstico mediante un mtodo semicuantitativo que toma una fraccin de ese tiempo. En segundo
lugar, cualquier mtodo de evaluacin empleado debe ser
confiable y consistente.
Casi todos los mtodos de evaluacin usados con los
marcadores descritos aqu son cuentas o clculos convencionales, pero existe en el mercado un nmero creciente de
89
sistemas basados en el anlisis de la imagen que usan un

mtodo diferente de evaluacin. Con mtodos manuales,
varios criterios tienen que cumplirse para reducir la subjetividad relacionada con la evaluacin, de tal modo que sean
posibles las comparaciones, sea entre las muestras o los
evaluadores. Los siguientes puntos siempre deben considerarse antes de emprender cualquier valoracin y no deben
soslayarse durante el curso del estudio.
Qu reas de la muestra deben evaluarse?
Por tradicin, el borde creciente de un tumor se considera el rea ms apropiada para la evaluacin. sta tiende
a ser la ms proliferativa y es con frecuencia el rea en la
que se calcula la cuenta mittica para un grado histolgico.
Una alternativa consiste en utilizar el rea peor o ms
mal diferenciada, pero ello proporciona deficientes caractersticas para el pronstico. Seleccionar el borde creciente
es virtualmente imposible en algunas formas de preparacin del tejido, como las biopsias con aguja fina o las
resecciones transuretrales de la prstata. Por otra parte, el
IMT y los mtodos del IMB requieren que el tejido fresco est cortado en piezas muy pequeas para permitir el
acceso de los nucletidos al ncleo. De nueva cuenta, es
casi imposible evaluar el borde creciente.
Si se lleva a cabo una cuenta formal, entonces debe evaluarse un nmero suficiente de clulas para ser representativo de la muestra y de ese modo se reduce el efecto de la
seleccin del rea; si se realiza un clculo de la frecuencia
del marcador, entonces se evala la seccin completa. Los
sistemas automatizados tienen el beneficio de efectuar una
evaluacin formal en reas seleccionadas a travs de la
muestra completa.
Qu mtodo de valoracin debe usarse?
Ya no es muy apropiado llevar a cabo una valoracin de
proliferacin sin definir los criterios utilizados para alcanzar el resultado final. Es importante decidir si la intensidad
de la tincin es una caracterstica importante. Desde luego,
sta no es una consideracin para evaluar las mitosis o las
AgNOR, pero con marcadores basados en la inmunohistoqumica puede representar un aumento de la expresin de
la protena sobre su nivel basal habitual, como en el caso
del PCNA. Si la intensidad de la tincin es relevante, entonces debe combinarse con una cuenta o un clculo de la
proporcin de clulas teidas.
La cuantificacin exacta de cualquier marcador exige hacer una cuenta formal de las clulas que expresan
el marcador y de aquellas que no lo hacen, de tal manera que se obtiene un ndice proliferativo. Una mirada
90
CAP. 8
rpida a las publicaciones que notifican una cuenta revela

la considerable variacin del nmero total de clulas evaluadas. Para ser estadsticamente correctos es necesario
evaluar suficientes nmeros de clulas para reducir el
error de conteo a un nivel aceptable; en condiciones normales, se considera que ste debe ser menor de 5%. Si tan
slo se evalan algunas clulas, el resultado podra sobrestimar o subestimar en grado notorio la actividad proliferativa verdadera. Al aumentar el nmero de las clulas
incluidas en la evaluacin se reduce este error de manera
gradual. Una cifra universal para el nmero de clulas a
contar no puede aplicarse a todos los marcadores y a los
diversos tipos de tejido. En general, las cuentas necesitan
incrementarse en tejidos heterogneos y cuando es baja
la incidencia de la demostracin del marcador. Por ejemplo, el MIB1 detecta clulas en todas las fases del ciclo
celular excepto en la G0, mientras que un ndice mittico
detectaslo en una parte limitada del ciclo celular. Por
lo tanto, en cualquier pieza del tejido la proporcin de
clulas que expresan MIB1 es mucho ms alta respecto
de las que experimentan mitosis. Por consiguiente, para
alcanzar el mismo nivel aceptable de error para ambos
marcadores, el nmero total de clulas evaluadas por el
ndice de la actividad mittica necesitara ser ms grande
en comparacin con la cuenta MIB1.
Existe poco trabajo publicado enfocado en comparar
mtodos de conteo, pero en general las cuentas superiores
a 1 000 clulas parecen reducir el error de conteo a mrgenes aceptables. Algunas veces, la cuenta de tantas clulas puede ser un problema en muestras muy pequeas,
por ejemplo, biopsias de aguja fina, o cuando la lesin de
inters forma slo una parte pequea del tejido examinado, como el carcinoma ductal mamario in situ u otras neoplasias intraepiteliales. En tales casos puede ser necesario
evaluar muestras mltiples del tejido para conseguir un
registro exacto de la actividad proliferativa.
Como ya se mencion, es importante equilibrar el tiempo gastado en evaluar un marcador proliferativo con la
cantidad de informacin proporcionada. Aunque la determinacin de ms clulas incrementa la exactitud, muchas
veces no es prctico y desde luego no suscita la disposicin
de un histopatlogo ocupado. Han ganado aceptacin las
valoraciones semicuantitativas debido a su velocidad relativa de valoracin y porque correlacionan bien con marcadores evaluados de modo ms cuantitativo. Por muchos
aos se han contado y expresado las mitosis por campo de
alto poder, que es en verdad una valoracin semicuantitativa. La informacin pronstica para la mama y los tumores
de msculo liso ha mejorado con una tcnica ms rigurosa
para contar las mitosis, aunque conserva el uso de campos
de alto poder. Ahora existen pautas en cuanto a los CAP a
examinar y el rea de la muestra bajo evaluacin. Tambin
se observa considerable variacin del tamao de los CAP

entre diferentes microscopios, por lo que es importante
citar el rea del CAP utilizada para efectuar la cuenta mittica. Con apego a estas pautas generales se ha alcanzado una
reduccin considerable de la variabilidad del observador.
Si se utiliza una valoracin semicuantitativa, es importante recordar que tan slo se trata de una estimacin y que
los resultados no deben ser tan precisos; en condiciones
normales es suficiente el uso de cuartiles. La ventaja con
este tipo de evaluacin radica en que puede hacerse con bastante rapidez para el conjunto de la muestra que se evala,
sin la necesidad de definir el rea del corte examinada. Si
es apropiado, una medida de intensidad de la tincin puede
combinarse con la proporcin de clulas teidas para suministrar un registro total.
En el cuadro 8-l se muestra una comparacin directa de
los diversos mtodos de evaluacin y el tiempo que toman
la tcnica y la evaluacin para marcadores establecidos.
Controles
Como en cualquier tcnica, es importante tener controles
durante el procedimiento. No slo se necesitan las muestras de control metodolgico sino tambin deben realizarse
revisiones para asegurar la consistencia de la demostracin
y la evaluacin de los marcadores entre las muestras.
El material de control debe siempre incluirse al demostrar un marcador de proliferacin. Las mismas muestras de
control deben utilizarse a travs de un estudio para supervisar la consistencia del interanlisis. Los controles internos,
cuando se conocen los patrones de la tincin de los elementos especficos del tejido, tambin son muy tiles para
constatar la calidad de la demostracin. Pueden emplearse
tambin para hacer ajustes al registro cuando los cortes
son ms gruesos (y por lo tanto la tincin es ms intensa) o
cuando el mtodo de fijacin es subptimo.
La reproducibilidad del procedimiento de evaluacin
tambin debe incluirse como parte del aspecto del control de calidad de cualquier estudio o caso individual.
Si se introduce un marcador o un mtodo de evaluacin
nuevo, o bien no se ha determinado antes la actividad proliferativa, entonces un evaluador experimentado debe
realizar la valoracin. La comparacin de los datos de
ambos asesores proporciona una gua para la variabilidad
entre un clnico y otro. Cualquier valor discordante se
puede reexaminar con la consulta comn. Las habilidades del evaluador tienden a mejorar con la prctica; por
lo tanto, lo que se determina al principio de un estudio
debe repetirse al final para asegurar que el resultado es
el mismo y que el mtodo de evaluacin ha permanecido
consistente.
91
MTODO DE EVALUACIN
Cuadro 8-1 Comparacin del tiempo consumido para demostrar y evaluar diferentes marcadores
de la actividad de proliferacin
Marcador
Mtodos de conteo
Mitosis
pKi67/mKi67/MIB1/KiS5
KiS1
PCNA
IMT
IMB
Histona 3 de mRNA
AgNOR
Mtodos automatizados
Fraccin de fase S
(citometra de flujo)
Mtodos de anlisis de imagen
pKi67, MIB1
AgNOR
Mtodo de evaluacin
Tiempo para la tcnica
Mitosis/10 CAP
Mitosis/2 000 clulas
Ncleos positivos/1 000 clulas
Ncleos positivos fuertes/2 000 clulas
Ncleos marcados/2 000 clulas
Nmero medio/100 clulas
Tiempo para la
evaluacin (minutos)
5 minutos
5 minutos
2 horas
5
15
5-10
2 horas
10 a 14 das
3 horas
24 horas
15 a 45 minutos
15-20
15-20
15-20
15-20
20-35
Cantidad de tincin nuclear/

clula en > 10 000 clulas
2 a 3 horas
>5
Porcentaje de tincin positiva

en relacin con todos los no positivos en
un rea seleccionada
rea media de AgNOR que ocupan
ncleos en 150 clulas
2 horas
15-20
15 a 45 minutos
15-20
Ahora existen diversos sistemas automatizados de anlisis de imagen disponibles en el comercio, con los programas
especficos diseados para detectar y cuantificar marcadores
de proliferacin relacionados con Ki67. Por otra parte, stos pueden adaptarse para el uso con cualquier antgeno
nuclear detectado por medios inmunohistoqumicos. La
evaluacin de los marcadores de proliferacin puede ser
ms exacta y confiable con la ayuda de sistemas automatizados, y la evaluacin de AgNOR se ha beneficiado en particular del anlisis semiautomatizado. Los AgNOR son en
extremo difciles de contar con grado de confiabilidad y su
valor de proliferacin se ha objetado. La medicin del rea
media total de sedimentacin de plata por ncleo mediante
el anlisis de imagen muestra una relacin constante con la
actividad proliferativa medida por otros medios y ha mejorado de modo considerable la credibilidad de los AgNOR.
El reconocimiento de clulas individuales en una
seccin histolgica es todava una tarea difcil para un
analizador de imagen y para distinguir una clula dbilmente inmunoteida positiva de una clula negativa; aunque parezca fcil para el ojo humano, es difcil para un
sistema de anlisis. Si una pieza se toma a travs de una
esfera, por ejemplo cuando se secciona un ncleo, entonces
los bordes internos de la esfera son menos densos que las
reas centrales. Si esto se considera en el contexto de un
ncleo teido por medios inmunohistoqumicos, el ncleo
posee una intensidad de color reducida en la periferia, que

puede ser difcil de distinguir del citoplasma sin teir. Infortunadamente, los programas que pueden reconocer las
diversas caractersticas vinculadas con los ncleos que experimentan mitosis todava no estn disponibles.
Uno de los problemas principales que debe superar
la progresiva adopcin de los mtodos automticos de
evaluacin es la necesidad de romper con la idea de que
el anlisis de imagen debe proporcionar la informacin
en un formato idntico al de una valoracin visual. En
varios estudios, en los cuales los marcadores inmunohistoqumicos han demostrado ser tiles en trminos del
pronstico, los sistemas del anlisis de imagen compararon reas de color. Por ejemplo, en cada CAP o rea
especfica marcada, el analizador compara el rea total
de marrn, que revela DAB de un anticuerpo relacionado
con la proliferacin, con el rea total de azul, que muestra
los ncleos teidos con hematoxilina. Estos parmetros
se miden dentro de esas reas seleccionadas y la actividad
proliferativa resultante se muestra por el cociente del rea
total del marcador de la proliferacin en relacin con el
rea total de los ncleos. A condicin de que slo los grupos de clulas malignas se seleccionen, algunos sistemas
de anlisis transforman los resultados para presentarlos
en una forma convencional, es decir, como porcentaje de
clulas positivas.
92
CAP. 8
Conclusin
La confusin inicial que padecen los principiantes en la
medicin de la actividad proliferativa puede remediarse
con facilidad si se considera cada aspecto del procedimiento a un tiempo. En primer lugar, algunos de los marcadores,
como TLI o mKi67, pueden descontinuarse si los tejidos de
inters estn fijados e impregnados en parafina. La eleccin
del marcador tambin depende de los recursos disponibles
en el laboratorio. Los proyectos especficos, con un nmero limitado de casos, pueden emprenderse a menudo junto
con un laboratorio con instalaciones especializadas. Esto
permitira aplicar mtodos como el anlisis citomtrico de
flujo o la autorradiografa con timidina marcada. Sin embargo, si la medicin de la proliferacin es una necesidad
continua, entonces el tipo de mtodo usado para detectar
las clulas que proliferan debe satisfacer al propio laboratorio. Por esta razn se observa una inclinacin por los
mtodos morfomtricos ms convencionales, como las
mitosis y AgNOR o los mtodos inmunohistoqumicos,
para utilizarse en laboratorios de histopatologa.
Los mejores mtodos para medir la actividad proliferativa en cortes histolgicos se basan an en el examen
de la proporcin de mitosis o clulas que expresan MIB1.
Ambos estn bien documentados en diversos trastornos,
son fciles de demostrar en trminos tcnicos, y siempre
que las muestras estn bien preparadas, son relativamente
fciles de determinar. Tambin suministran resultados reproducibles que se comparan bien con otros mtodos ms
laboriosos o dependientes de una mquina, como el IMT
y la citometra de flujo. Persiste la gran discusin acerca
de cmo las mitosis y el MIB1 sirven como marcadores de
la actividad proliferativa. Las mitosis demuestran slo una
parte relativamente pequea del ciclo celular y a partir de
la cuenta mittica o ndice mittico resultante ninguna inferencia puede hacerse alrededor del resto del ciclo celular;
empero, no hay problemas con la falta de especificidad con
este marcador. El MIB1 identifica una protena presente a
lo largo del ciclo celular, aunque algunas clulas no expresan el antgeno con rapidez en G1 y este efecto representara de modo equvoco la actividad proliferativa en esos
tejidos particulares. Al igual que la deteccin de muchas
protenas expresadas durante el ciclo de la clula, el MIB1
puede tambin detectarse si la clula ha dejado apenas el

ciclo celular. Se han realizado algunos intentos por desarrollar nuevos marcadores, en particular anticuerpos, para
superar algunos de los problemas de especificidad. Estos
marcadores novedosos deben proporcionar datos de la proliferacin y el pronstico, ms all de lo que proporcionan
las mitosis o el MIB1 si se aceptaran como alternativas viables. Un desarrollo reciente consiste en que la mayora de
los antgenos relacionados con el ciclo celular, que alguna
vez se evaluaron como marcadores de proliferacin, ahora
se han examinado por su potencial como blancos relacionados con terapias.
Al parecer, el debate de la evaluacin continuar durante algn tiempo ms. Por ejemplo, las mitosis se han
reconocido como marcadores de proliferacin por dcadas
y an se promueven nuevos mtodos mejorados de evaluacin. Empero, no debe olvidarse que una vez que se aplica
alguno de los criterios de evaluacin, sin importar cul sea
el mtodo de valoracin elegido, la regla de oro consiste
en ser consistentes entre un caso y otro. Por supuesto, el
anlisis automatizado mejora la exactitud y la consistencia
al cuantificar algunos marcadores de proliferacin, pero
todava no es conveniente para todos los casos. Mientras
tanto, pueden obtenerse resultados suficientemente exactos
mediante una cuenta formal o una evaluacin semicuantitativa, siempre que se practique una tcnica consistente y
se utilicen los controles adecuados.
Baak JPA. Mitosis counting in tumors. Hum Pathol 1990; 21:
683-685
Rschoff J, Plate KH, Contractor H et al. Evaluation of nucleolus
organizer regions (NORs) by automatic image analysis: a contribution to standardization. J Pathol 1990; 161: 113-118.
Cattoretti G, Becker MHG, Key G et al. Monoclonal antibodies
against recombinant parts of the Ki67 antigen (MIB-1 and
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Quirke P. Flow cytometry in the quantitation of DNA aneuploidy
and cell proliferation in human disease. In JCE Underwood
(ed.) Current Topics in PathologyPathology of the Nucleus.
1990: Springer-Verlag, New York, 215-256.
SECCIN 2
CITOLOGA
9
Citopatologa
Adrian T Warfield
El captulo proporciona una sinopsis de los principios generales de la citopatologa diagnstica. ste es, en buena
medida, un tema visual y por lo tanto se incluyen abundantes ejemplos e ilustraciones. No es de ninguna manera un
tratado tcnico o diagnstico. Para la cobertura sistemtica
y detallada se remite al lector interesado a consultar uno de
los trabajos de referencia, algunos de los cuales se enumeran en la parte final de este captulo.
Introduccin
La citologa es el estudio cientfico de la estructura y la
funcin celulares. La citopatologa es una rama de la medicina de laboratorio relacionada con el examen de clulas,
en la salud y la enfermedad, para propsitos de exploracin, diagnstico e investigacin. La exploracin implica
la revisin de las muestras de individuos asintomticos
para detectar cambios premalignos o malignos tempranos.
El trabajo diagnstico supone la valoracin del material de
los pacientes con signos o sntomas establecidos de enfermedad.
Es una premisa bsica que el contenido de una muestra
de la citologa debe representar de forma exacta y reproducible la poblacin celular del tejido o la lesin. En realidad,
un buen nmero de variables de confusin atenta algunas
veces contra esta suposicin en mayor o menor grado.
Una cuidadosa valoracin citomorfolgica por microscopia de luz es fundamental para la prctica de la citopatologa de diagnstico y mucha informacin se deriva
de la comparacin directa de las muestras celulares con
las muestras histolgicas correspondientes. Sin embargo,
ciertas limitaciones son inherentes en tales estudios de

extrapolacin, incluso en muestras apropiadas, bien preservadas y teidas.
El cultivo celular utiliza lneas de clulas inmortalizadas para detectar efectos citopticos vricos y otros
txicos. Esto y las novedosas tcnicas especializadas de
microscopia, microaspiracin y microdiseccin permiten
el discernimiento en la fisiologa dinmica del protoplasma vivo. No obstante, en la actualidad stas se consideran
marginales en la citopatologa diagnstica corriente y se
reservan por lo regular para el trabajo de diagnstico o
investigacin de virus.
Tipos de muestra citolgica

La mayor parte de las muestras clnicas de la citologa procede de uno de los procesos siguientes.
Exfoliacin
Las clulas muestreadas se toman (exfoliadas) de una superficie epitelial. Los ejemplos incluyen las clulas presentes en esputo (expectorado), orina (expulsada o mediante
catter o cistoscopio) y secrecin del pezn (exprimido)
(figs. 9-1 y 9-2). De manera espontnea, las clulas exfoliadas difieren en su aspecto de las sustradas por medios
mecnicos, que tienden a desagregarse y disponerse de manera individual o en racimos pequeos. Tales clulas adoptan a menudo una forma esfrica, segn sean los factores,
como la membrana celular, fuerzas citoesquelticas inhe-
96
CAP. 9
CITOPATOLOGA
Figura 9-1 Muestra de esputo. a) Esputo mucoide teido con sangre obtenido por aspiracin directa (trampa de esputo). Esto ofrece
menos contaminacin por secreciones bucofarngeas que una muestra expectorada. b) Las clulas epiteliales bronquiales y los macrfagos
alveolares pulmonares indican un muestreo ms bajo de las vas respiratorias. Las barras terminales y las microvellosidades superficiales se
pueden ver en los pices de las clulas bronquiales en medio de un fondo mucoinflamatorio ralo (Pap, 250 ).
rentes, tensin de superficie, naturaleza del microambiente

local y tiempo transcurrido desde la obtencin. Tales clulas son susceptibles a una serie de cambios degenerativos
que alteran al citoplasma y al ncleo, como se delinea ms
adelante.
Abrasin
Figura 9-2
Clulas transicionales superficiales normales en
orina. Estas clulas uroepiteliales exfoliadas muestran multinucleacin variable correspondiente a clulas en paraguas en cortes histolgicos. Obsrvese el fondo sin rellenar (limpio) (Pap,
100 ).
Las muestras celulares son el resultado del muestreo de clulas a partir de la exfoliacin por fuerza fsica (abrasin).
Ejemplos: cepillado (p. ej., bronquio, cervix), raspado
(p. ej., pezn, piel, cervix) o lavado (p. ej., bronquio); en
tales casos se instila una solucin salina isotnica y el
lquido reaspirado se somete a revisin. En contraste con
las clulas exfoliadas de forma natural, estas clulas tienden a conservarse mejor, a menudo en grupos ms grandes
o agregados cohesionados.
TIPOS DE MUESTRA CITOLGICA
97
Figura 9-3 Aspirados pleurales malignos. a) Muestra teida con

sangre de un derrame pleural unilateral en un paciente sometido
a mastectoma por carcinoma de mama. La microscopia (b y c)
demuestra las clulas pleomrficas sin cohesin del adenocarcinoma; muchas tienen una morfologa de sello anular con abundante mucina intracitoplsmica a la que indenta el ncleo perifrico (b, Pap, 100 ; c, MGG, 100 ).
Aspiracin
Existen pocos rganos o sitios del cuerpo que representan
un acceso difcil para recoger con aguja cierta clase de
material celular para su examen. Las tcnicas radiolgicas
de proyeccin de imagen pueden ayudar a localizar pequeas lesiones profundas y mviles que de otra manera
es difcil delinear. Las clulas se obtienen a travs de una
aguja, con o sin aspiracin, de una cavidad llena de lquido
o un tejido slido. Son ejemplos los tumores, los lquidos
pericrdico, pleural o peritoneal (paracentesis) y cefalorraqudeo (puncin lumbar o cisternal) y el humor vtreo (figs.
9-3 y 9-4).
La aspiracin con aguja fina utiliza un instrumento de
calibre fino (19 a 25) unido con firmeza a una jeringuilla y
se introduce en una lesin. El mbolo de la jeringuilla se
retira de modo parcial, de tal manera que se crea un vaco
y se aspiran las clulas de la lesin. Hay que realizar varios
movimientos en diferentes direcciones a travs de la lesin
mientras dura la aspiracin para aumentar la recoleccin celular. Al trmino de esto, el mbolo se libera para
igualar la presin anterior a la extraccin de la aguja de

la lesin. Varios accesorios para tomar la pistola, diseados para facilitar la sujecin con una sola mano, estn
disponibles en el comercio (la mano opuesta se libera para
la palpacin; fig. 9-5). Algunos clnicos prefieren el muestreo por aguja sin aspiracin para las lesiones localizadas
en un plano superficial. La aspiracin con aguja fina ha ganado gran aceptacin, en gran parte porque es econmica,
rpida y mucho menos traumtica y, por lo tanto, se tolera bien con pocas complicaciones y contraindicaciones.
Las lesiones percutneas casi nunca requieren anestesia
local. Las vas transrectal, transvaginal, transpleural y
transperitoneal mediante un endoscopio tambin pueden
aspirarse.
Las aspiraciones de la mdula sea son el campo del
hematopatlogo de diagnstico.
El fracaso para obtener una aspiracin satisfactoria no
es atribuible en todos los casos a una tcnica deficiente.
Las lesiones desmoplsicas, hialinizadas o vasculares, la
necrosis extensa, el cambio cstico o la hemorragia pueden
imposibilitar el muestreo celular adecuado (fig. 9-6).
98
CAP. 9
CITOPATOLOGA
Figura 9-4 Lquido asctico. a) Alcuota de lquido asctico turbio

y maloliente, aspirado de un paciente con peritonitis fecal poco
antes de morir. Las microscopias b y c muestran innumerables
bacterias variformes con clulas de pus. El detrito y el pigmento
son de origen estercorceo (b, Pap, 100 ; c, MGG, 100 ).
Tumor
viable
Inflamacin
perilesional
Necrosis
y cambios
qusticos
Figura 9-5 Accesorio de la pistola para la aspiracin con aguja fina. Preparacin de la jeringuilla desechable cargada con la
aguja de calibre 23; este dispositivo permite la manipulacin con
una sola mano, de manera que se libera la otra mano para la palpacin.
Hemorragia
intralesional
Figura 9-6 Diagrama esquemtico de un tumor durante la aspiracin con aguja fina. La porcin slida viable del tumor se perfora con la aguja 1 para proporcionar el material potencialmente
diagnstico; la aguja 2 cruza reas con necrosis, hemorragia o
cambios qusticos; la aguja 3, que recoge muestras de tejido perilesional, es poco probable que se utilice de esta manera.
TCNICAS DE CONCENTRACIN CELULAR
Tcnicas para la preparacin de frotis

El frotis ideal debe extenderse sin relieves, de modo uniforme, fino y liso, para permitir un secado y una fijacin
rpidos y facilitar la penetracin ptima del colorante. Las
tcnicas directas para preparar un frotis implican extender
el material fresco a travs de un portaobjetos, mediante otro
portaobjetos, instrumento punzante o esptula (fig. 9-7).
Las tcnicas indirectas para preparar un frotis emplean el
material suspendido en lquido, por ejemplo una solucin
salina o medio de transporte. Puede realizarse un procedimiento de concentracin celular como un paso intermedio
para aumentar el rendimiento de una muestra hipocelular.
La formacin de un cogulo puede retener en gran medida el componente celular de una muestra y ello impide la
transferencia adecuada del material a un portaobjetos. Si
un cogulo no se puede dispersar por medios mecnicos,
debe procesarse como bloque celular o someterse a una
histologa convencional y examinarse a fondo (fig. 9-8).
Los depsitos celulares de trasudados, lavados con
solucin salina y de orina pueden no adherirse bien a los
portaobjetos de cristal. Los adhesivos, casi siempre del tipo
protenico (p. ej., albmina de suero bovino) o inico (p.
ej., poli-l-lisina), pueden efectuar la adherencia y maximizar el material celular para el examen.
Otras tcnicas empleadas menos comunes incluyen las
impresiones de tacto, el raspado y las preparaciones concentradas; esta ltima tiene aceptacin en el diagnstico
neuroquirrgico preoperatorio y se prefiere a la histologa
convencional en cortes congelados.
Fijacin de la muestra
99
sobre el portaobjetos, ms que de forma pasiva. Este mtodo tiende a aplanar las clulas con un alargamiento evidente en comparacin con la fijacin hmeda (figs. 9-9 y
9-10). Las preparaciones secadas al aire se fijan despus
casi de manera invariable en metanol luego de secarse para
prevenir peligros de infeccin cruzada.
Los materiales como el lquido de quiste o de lavados
con aguja fina por aspiraciones pueden recogerse en un medio de transporte. Debe recordarse que cualquier muestra
biolgica fresca constituye un peligro biolgico potencial
para el personal del laboratorio y deben acatarse siempre
las medidas recomendadas de salud y de seguridad.
Tcnicas de concentracin celular

Centrifugacin
Este mtodo es aconsejable para muestras voluminosas,
como los derrames serosos, orina o muestras lavadas con
solucin salina.
Citocentrifugacin
La citocentrifugacin utiliza alcuotas pequeas de esputo
lquido sobre el portaobjetos del microscopio para formar
una monocapa localizada de clulas (figs. 9-11 a 9-13). Es
aconsejable para muestras de poco volumen con celularidad moderada; no obstante, parte del material se pierde de
modo inevitable dentro de la tarjeta del filtro. Las muestras
viscosas o celulares son inapropiadas.
Fijacin hmeda
Filtracin con membrana
La fijacin hmeda deshidrata el protoplasma y coagula las

protenas, casi siempre con empleo de un lquido basado en
alcohol, sea por inmersin o cobertura. Tal fijacin induce
un grado de contraccin celular en la preparacin final. El
lquido de Carnoy lisa de forma selectiva a los eritrocitos
y puede ser provechoso en muestras teidas de sangre con
intensidad. Otros fijadores, como el glutaraldehdo o la formalina, pueden preferirse bajo ciertas circunstancias. El
glicol de polietileno en alcohol proporciona una capa cerosa protectora para el envo postal, que debe eliminarse
antes de una tincin subsiguiente.
La presin positiva o la filtracin al vaco se emplean con

varios tipos de filtro y un poro de tamao predeterminado,
por ejemplo acetato de celulosa o policarbonato. Es conveniente para una amplia gama de muestras de gran volumen
o lquido hipocelular y permite obtener mayor captura de
clulas que los mtodos de centrifugacin.
Secado al aire
El secado al aire se basa en la evaporacin, que debe ser
rpida, y se facilita con el movimiento del aire forzado
Preparacin del bloque celular

Las clulas se agrupan en un estado parecido a un tejido
que permite cortar las secciones de forma similar a como se
hace en la histologa convencional. Los mtodos incluyen
coagulacin con trombina plasmtica y plasma y el bloque
celular con agar caliente. Son convenientes para la mayor
parte de las suspensiones celulares y hacen posible una tincin especial, incluida la inmunocitoqumica.
100
CAP. 9
CITOPATOLOGA
Figura 9-7 A, Tcnica directa para la preparacin de frotis para

muestras mucoides. a) Una gota de la muestra se aplica sobre un
portaobjetos. b) Un segundo portaobjetos se coloca encima con
ligera presin para extender el lquido de manera uniforme. c) Los
portaobjetos se separan en un solo movimiento y se fijan de inmediato. d) Un mtodo alternativo consiste en extender la muestra
tan uniformemente como sea posible con un instrumento agudo o
una esptula. B, Mtodo de la pelcula de sangre para muestras no
mucoides. a) Se aplica una gota de la muestra a un portaobjetos.
b) Un portaobjetos esparcidor se desliza hacia la muestra. c) El
frotis se realiza con suavidad. d) Los agregados celulares tienden
a distribuirse hacia la periferia y el extremo del frotis. C, Mtodo de la presin para muestras no mucoides. a) Una gota de la
muestra se aplica a un portaobjetos. b) Un portaobjetos esparcidor
se coloca encima de ste y con presin uniforme al extender el
frotis. c) Los agregados celulares tienden a distribuirse de modo
uniforme en toda la preparacin.
TCNICAS DE CONCENTRACIN CELULAR
Figura 9-8 Tumor mucingeno benigno del ovario. Este cogulo de fibrina secuestra virtualmente todo el epitelio aspirado
del lquido de este ovario qustico. Las citopreparaciones correspondientes consistieron casi en forma exclusiva de sangre y,
en el aislamiento, se juzgaron poco satisfactorias para propsitos
diagnsticos. Esto ilustra la importancia de examinar cualquier
cogulo presente en lquidos aspirados (H-E, 25 ).
Citologa basada en lquido

La depuracin de las tcnicas anteriores para el procesamiento y preparacin de muestras citolgicas ha sido graCitoplasma
Ncleo
Figura 9-9 Efecto de la fijacin hmeda y el secado al aire sobre

las clulas. a) Una clula desmontada en solucin adopta a menudo
una forma esfrica. b) La clula se coloca sobre un portaobjetos y se
aplana de manera parcial. c) Al final, la fijacin hmeda contrae en
cierto grado a la clula. d) El secado al aire causa aplanamiento y extensin de la clula con el alargamiento evidente en su estado final.
Una clula esfrica puede presentar un dimetro dos veces mayor
respecto de su tamao original, mientras que una clula escamoide
madura revela poco aumento evidente de tamao.
101
dual durante un largo periodo. No obstante, las mayores

expectativas en aos recientes condujeron a la revaloracin
de muchos aspectos de la metodologa tradicional, sobre
todo en busca de formas de aplicar los ltimos avances tecnolgicos.
La citologa basada en lquido se ha desarrollado al margen del deseo de aumentar la sensibilidad y la especificidad de la citologa, como una modalidad de investigacin
y diagnstico. En la actualidad estn disponibles varios
sistemas basados en manuales especficos del fabricante,
protocolos semiautomatizados o por completo automatizados. Pese a ello, los principios de operacin son muy
similares, con el objetivo de que se produzca una muestra
homognea, ms limpia y plana, que cubra un rea ms
pequea del portaobjetos. Esto facilita un examen ms fcil
y rpido, con una atenuacin concomitante de la frecuencia
de muestras insatisfactorias. La tecnologa se ha adaptado
con xito en ginecologa y otras reas mdicas.
Por lo general, las muestras se recolectan de la manera
usual y se transfieren dentro del lquido especificado de transporte o preservacin para formar una suspensin celular. Algunos sistemas emplean cepillos o escobas patentados, que
agitan el lquido, con lo cual se asegura la obtencin de la
muestra completa, mientras que otros utilizan un procedimiento de depuracin para recolectar la poblacin celular
designada. En el laboratorio, el material se procesa para eliminar el exudado sanguneo, inflamatorio y protenico. Una
alcuota de la suspensin se deposita al final como una capa
fina y uniforme sobre un portaobjetos de cristal. La dispersin
uniforme, la buena preservacin de la clula, la clula constante que se tie, el detalle microscpico mejorado y la disminucin de artefactos se comparan de manera favorable
con los frotis preparados por tcnicas convencionales. Todas
las capas y grupos de la clula tienden a ser ms pequeos y
hay menos imprecisin por los elementos de fondo.
El mtodo ThinPrep (Cytyc Corporation) emplea un
tubo de plstico desechable abierto y forrado con un filtro.
La muestra se recolecta en un medio que contiene metanol
y se centrifuga. Una muestra del centrifugado celular se
transfiere entonces a un lquido preservador que contiene
metanol. Hay tres etapas principales ms de la preparacin:
primero, dispersin celular, en la cual la mquina inserta el
tubo filtrador en el vial de la suspensin celular y lo agita
para dispersar mucosidad y cualquier agrupacin celular;
segundo, recoleccin celular, en la que un pulso leve de
vaco desplaza el lquido hacia el tubo a travs del filtro,
sobre el cual se deposita una capa de material celular; un
poco de sangre, clulas inflamatorias y detritos celulares
pueden pasar a travs del filtro y el flujo del lquido se vigila para optimizar la captacin celular; tercero, transferencia
celular, cuando el tubo del filtro se invierte y se presiona
con suavidad contra un portaobjetos cargado en sentido
102
CAP. 9
CITOPATOLOGA
Figura 9-10 Clulas apocrinas metaplsicas de un quiste de mama. Estas clulas epiteliales benignas estaban presentes en el lquido de
un quiste e ilustran la naturaleza complementaria de las tinciones de Papanicolaou y May-Grnwald-Giemsa. La disparidad evidente en
el tamao de las clulas en la ampliacin idntica es por las fijaciones hmeda y seca, respectivamente (a, Pap, 50 ; b, MGG, 50 ).
electrosttico. El portaobjetos se sumerge inmediatamente en el fijador y queda listo para la tincin subsiguiente,
manual o automatizada. El procedimiento completo es relativamente rpido, menor de 30 minutos, y requiere poco
tiempo tcnico. El rea de la sedimentacin celular mide 1.9
cm de dimetro y contiene alrededor de 100 000 clulas.
El mtodo SurePath Prep (TriPath Imaging Inc.) comienza con la recoleccin de la muestra en un medio con etanol.
En el laboratorio se agita el vial para dispersar las clulas
y la suspensin experimenta una fase de enriquecimiento
celular mediante centrifugacin por gradiente de densidad.
Esto tambin elimina la sangre y otros detritos contaminantes. Se elimina el lquido sobrenadante, el sedimento celular se suspende de nuevo y se centrifuga por segunda vez.
Una alcuota del sedimento celular se transfiere entonces
por medios robticos a un compartimiento de asentamiento,
donde las clulas se sedimentan por gravedad para crear una

capa delgada en un portaobjetos de microscopio cubierto
con poli-l-lisina. La mquina tie a continuacin los portaobjetos de modo automtico. Este proceso toma alrededor
de 60 minutos y requiere un grado de intervencin manual.
El depsito circular mide ms o menos 1.3 cm de dimetro
e incluye alrededor de 100 000 clulas.
El mtodo de citoexploracin es un proceso manual que
se basa en la fotometra para evaluar la celularidad de la
suspensin celular antes de la centrifugacin sobre un portaobjetos de cristal. El Labonard Easy Prep es otro mtodo manual en el que una alcuota de lquido de la muestra
se carga en un compartimiento de separacin unido a un
portaobjetos de cristal, que contiene papel absorbente. Las
clulas se colocan en una capa delgada y la preparacin se
tie mediante procedimientos normales de laboratorio.
103
MTODOS DE TINCIN
Tarjeta de filtro
Suspensin
celular
Portaobjetos
de vidrio
Direccin de
la fuerza
centrfuga
Burbuja de aire
Cmara para
la muestra
Figura 9-13 Diagrama esquemtico del montaje de la citocentrfuga. La fuerza centrfuga conduce la suspensin celular a travs
de la tarjeta del filtro y sobre el portaobjetos de cristal. Esto es inconveniente para las muestras mucoides.
Figura 9-11 Una moderna mquina citocentrifugadora.
La citologa basada en medio lquido no utiliza la muestra completa y en consecuencia ofrece la oportunidad de
efectuar procedimientos con pruebas auxiliares, por ejem-
Figura 9-12 Componentes de la cmara citocentrfuga. Cmara

de aspiracin, tarjeta del filtro, portaobjetos de vidrio y gancho del
resorte antes del ensamblaje.
plo hibridacin in situ o tcnicas de captacin hbridas

para detectar virus del papiloma humano u otros agentes
infecciosos. Las preparaciones son tan favorables respecto
de otros procedimientos de tincin, como la inmunocitoqumica, como las tcnicas convencionales, con la ventaja adicional de que el fondo limpio es menos susceptible
de teirse en falso. En ciertas muestras no ginecolgicas,
en que la prdida de material del fondo y la variacin
de las caractersticas estructurales pueden ser un problema,
los procedimientos basados en medio lquido se pueden
emplear junto con tcnicas tradicionales como un complemento til.
Mtodos de tincin
Muchas tcnicas aplicadas a los cortes tisulares se pueden
tambin realizar sobre las citopreparaciones. En general, la
tincin de Papanicolaou se emplea para el material fijado en
hmedo. El patrn diferencial de tincin es til para muestras
ginecolgicas y no ginecolgicas y permite periodos prolongados de microscopia con una tensin mnima del ojo.
Las tinciones de Romanowsky (May-GrnwaldGiemsa [MGG], Diff Quik, etc.) se realizan casi siempre
en preparaciones secadas al aire y son favorables para ambas tcnicas, automticas y manuales rpidas. Este mtodo
se emplea sobre todo en material no ginecolgico.
La tincin con hematoxilina y eosina es mucho ms comn en cortes histolgicos convencionales.
Puede utilizarse una amplia variedad de tinciones histoqumicas auxiliares, como se indic antes. Los ejemplos
incluyen al cido perydico de Schiff, con o sin predigestin
con diastasa de las mucosustancias neutrales y glucgeno,
tinciones tricrmicas, tinciones de Ziehl-Neelsen, Gram y
metenamina de plata de Grocott, entre otras ms.
104
CAP. 9
CITOPATOLOGA
Figura 9-14 Linfoma no Hodgkin de grado bajo. a) Este aspirado

de humor vtreo del ojo contiene innumerables linfocitos, moderadamente pleomrficos e inmaduros, con cantidades variables
de citoplasma (MGG, gran potencia). b) La inmunocitoqumica
confirma reactividad extendida de CD45 (antgeno comn del
leucocito) (inmunoperoxidasa, gran potencia).
El repertorio de tcnicas inmunocitolgicas es comparable al de las utilizadas en muestras tisulares. La inmunocitoqumica puede ser inestimable para comprobar la
presencia de microorganismos o demostrar la diferenciacin celular del tumor (fig. 9-14).
Citodiagnstico
El procedimiento citodiagnstico es un proceso complejo. La
consecucin de una conclusin depende de muchos factores,
entre ellos el conocimiento del sitio especfico detallado junto con la experiencia de la normalidad, la familiaridad con
los aspectos mltiples de muchos procesos patolgicos, el
conocimiento de simuladores y artefacto y la conciencia de
las limitaciones de la tcnica, adems de los detalles especficos del paciente y el contexto clnico (vase el cuadro 9-1).
El material abundante y bien preservado siempre produce la

mejor oportunidad de alcanzar un diagnstico definitivo. Sin
esta informacin de fondo, la citopreparacin est en peligro
de convertirse en un artefacto de dos dimensiones, teido
y brillante, que puede ser tan engaoso como til. Algunas
veces puede ser mejor establecer un diagnstico morfolgico inicial a ciegas a partir de los primeros principios para
evitar un sesgo preconcebido. Esto puede modificarse, si se
consideran tales variables como apropiadas, antes de determinar un diagnstico y formular cualquier consejo sobre el
prximo control del paciente.
En condiciones normales, una citopreparacin es una
mezcla compleja de componentes en proporciones que
varan, segn sean el tejido o la lesin muestreadas. Las
clulas normales y anormales pueden estar presentes y hay
que determinar de manera sistemtica el contenido, la disposicin y la distribucin celular dentro de una muestra.
CITOMORFOLOGA
Cuadro 9-1
Variables que pueden modificar la interpretacin

final de una citopreparacin
Detalles especficos
del paciente
Detalles especficos
del sitio
Poblacin celular
Citomorfologa
Informacin auxiliar
Edad y sexo
Estado hormonal, como embarazo
Impresin clnica
Tratamientos previos, como
radioterapia, operacin
Material previo, como histologa,
citologa
Otras pruebas de laboratorio
Conocimiento de la anatoma local
Caractersticas radiolgicas
Conocimiento de los errores y
simulaciones
Limitaciones tcnicas
Grado de celularidad
Clulas presentes, como poblacin
bifsica o nica
Poblaciones ajenas o naturales
Morfologa normal o anormal
Antecedentes
Distribucin y cohesin celulares
Morfologa de la clula individual
Tinciones histoqumicas
Inmunocitoqumica
Anlisis de imagen
Citometra de flujo
Citogentica
No todas las caractersticas son relevantes para cualquier

muestra particular.
105
vos secundarios a la influencia hormonal, el envejecimiento

o la degeneracin, como en la apoptosis.
No hay un solo criterio citomorfolgico o grupo limitado de criterios que por s mismos permitan una distincin
confiable entre las condiciones biolgicamente benignas y
malignas bajo todas las circunstancias. Las diferencias citonucleares entre las clulas regeneradoras o hiperplsicas y
las clulas neoplsicas de grado inferior pueden ser sutiles
y en ocasiones indistinguibles. Los cambios posteriores a
la radioterapia o quimioterapia, los vricos y otros pueden
inducir aspectos que imitan en sumo grado los observados
en la neoplasia (fig. 9-15).
Figura 9-15 Atipia de radiacin en un frotis de la bveda vaginal.

Clulas escamosas gigantes anormales (macrocitos) despus de
la radioterapia. Cambios extraos similares pueden aparecer tras
la quimioterapia y acompaan a la deficiencia de vitamina B12 o
folato y pueden ocurrir en los condilomas vricos. Obsrvense la
multinucleacin y el aumento en ambas reas, nuclear y citoplsmica. Las clulas inflamatorias del fondo y las escamas superficiales son caractersticas tiles de referencia (Pap, 100 ).
Citomorfologa
Celularidad de la muestra
Gran parte de la carga del trabajo diagnstico en la mayora
de los laboratorios se preocupa en diferenciar entre lesiones
no neoplsicas, preneoplsicas y neoplsicas. Las clulas
normales se caracterizan por su uniformidad morfolgica.
La morfologa nuclear refleja el estado de proliferacin de
una clula y su capacidad reproductiva. El citoplasma de una
clula casi siempre ofrece una indicacin de su origen, estado funcional y grado de diferenciacin.
La actividad creciente de la clula puede ser fisiolgica,
como en la hiperplasia, debido a la modulacin hormonal,
o reconstructiva y regeneradora en respuesta al dao. Un
estado de proliferacin anormal y descontrolado implica
un proceso neoplsico.
La disminucin de la actividad de la clula puede tambin ser fisiolgica debido a la atrofia, los cambios involuti-
El nmero y el tipo de clulas proporcionan informacin

importante sobre el tejido designado. Ambos estn sujetos
a factores lesionales y no lesionales, en especial el mtodo
de muestreo empleado. Por lo general, la hipercelularidad
incrementa el ndice de sospecha para un proceso proliferativo, hiperplsico o neoplsico. No obstante, de modo
inverso, la hipocelularidad no es en todos los casos una caracterstica inocua, debido que la ausencia de clulas anormales no excluye de ninguna manera una afeccin grave.
Las neoplasias de grado inferior pueden exfoliarse apenas y producir clulas que muestran una desviacin mnima
de la normalidad. Una escasez de material adecuado puede
ser un factor limtrofe crucial en el grado de confianza de
la interpretacin de una muestra.
106
CAP. 9
CITOPATOLOGA
Modelos de citoestructura
Con frecuencia no se reconocen en las citopreparaciones
muchos de los indicios estructurales presentes en cortes histolgicos convencionales. Las acumulaciones ms grandes
de clulas (microbiopsias), si bien presentes, a menudo
reproducen el modelo histolgico del tejido designado (fig.
9-16). El epitelio normal de muchos sitios se caracteriza
Figura 9-16 Glndula partida normal. Este aspirado con aguja

fina contiene una microbiopsia que comprende tejido conjuntivo adiposo sumamente mezclado con el tejido secretor acinoso
normal de un sujeto de mediana edad (Pap, 80 ).
por conservar la polaridad y la cohesin intercelular. El

epitelio glandular produce con regularidad hojas dispuestas
en monocapa; stas, cuando se observan de frente, ofrecen
un aspecto de panal, y de perfil un modelo en palizada o vallado (fig. 9-17a,b). El epitelio hiperplsico y el
neoplsico benigno casi siempre conservan tambin la co-
hesin, pero pueden exhibir un contorno inusual, como una

configuracin papiliforme, de rosetn o morular. La formacin del sincitio con lmites celulares mal definidos y alguna
orientacin errtica son sospechosas de neoplasia. Las clulas epiteliales malignas (carcinoma) se presentan habitualmente como clulas mal polarizadas, superpuestas, a veces
en grupos tridimensionales (esferas de proliferacin), con
una tendencia a perder cohesin y desagregarse. Las clulas
linfoides normales poseen una cohesin intercelular escasa,
al igual que sus contrapartes neoplsicas (linfoma), y el modelo celular dispersado del carcinoma mal diferenciado y el
linfoma de grado alto pueden ser indistinguibles sin recurrir
a las tcnicas auxiliares. Las clulas estrmicas normales,
reactivas o neoplsicas (mesenquimatosas), pueden ser evidentes y los adipocitos, tubos capilares u otros fragmentos
del tejido conjuntivo emanan a menudo de un sitio perilesional. Los elementos estrmicos benignos se manifiestan
las ms de las veces como clulas ovoides o fusiformes, de
pobre cohesin o con ncleos desnudos (clulas centinelas
o bipolares), de acuerdo con las circunstancias particulares.
Las clulas estrmicas malignas (sarcoma) demuestran un
modelo similar pero con las caractersticas nucleares y citoplsmicas anormales sobrepuestas.
Caractersticas nucleares
Las anormalidades de la morfologa nuclear se conocen
como discariosis y pueden calificarse como menores o moderadas a graves o bien como de grados alto y bajo segn sea
el grado de desviacin respecto de la normalidad. En la clula diferenciada como terminal normal (madura) el ncleo
es relativamente pequeo, en comparacin con el volumen
Figura 9-17 Epitelio glandular gstrico normal. a) Las clulas epiteliales glandulares columnares altas semejan una palizada regular o
un vallado cuando se ve de perfil. Ntese la polaridad preservada y los ncleos redondos, espaciados con uniformidad, con uno o dos
nucleolos pequeos (Pap, 80 ). b) La monocapa del epitelio glandular cohesionado, bien orientada e isomrfica, muestra un modelo de
panal cuando se observa de frente. Una vez ms, estn bien delineados los ncleos espaciados de forma regular con nucleolos pequeos ocasionales y el contorno nuclear redondeado (Pap, 40 ).
CITOMORFOLOGA
total de la clula, casi siempre de forma redonda u ovoide con un contorno nuclear liso, distribuido de modo uniforme, con cromatina fina y granular y poca variacin entre las
clulas de tipo similar (isomrficas o monomrficas).
En una citopreparacin bidimensional el tamao nuclear
es proporcional al rea nuclear relativa y puede expresarse
como el ndice citonuclear, cociente nuclear:citoplsmico
o cuantificarse como un porcentaje. Las clulas con pobre
diferenciacin poseen ncleos agrandados (cariomegalia o
nucleomegalia) y dado que poseen el mismo volumen citoplsmico absoluto tienen por tanto un cociente nuclear:citoplsmico elevado.
La mayora de las clulas normales muestra una cromatina nuclear razonablemente homognea con una distribucin
fina y granular y una afinidad discreta por los tintes nucleares. El aumento del contenido del DNA nuclear propicia
una mayor densidad de tincin nuclear (hipercromasia). La
cromatina distribuida de forma irregular con una textura
gruesa y rugosa y un envolvimiento nuclear engrosado se
denomina carioteca. La variacin de tamao y forma de los
ncleos entre las clulas se llama anisocariosis o anisonucleosis y con el incremento de la anormalidad la membrana
nuclear puede ser irregular en el contorno, con estriacin,
indentacin o crenacin. La constelacin de variaciones
anormales de tamao, forma e intensidad de la tincin nuclear se conoce como pleomorfismo nuclear (fig. 9-18).
Figura 9-18 Carcinoma celular escamoso con pobre diferenciacin. Estas clulas malignas de vellosidades bronquiales son
muy pleomrficas, con pobre polarizacin, y muestran una membrana nuclear con macronucleolacin. La queratinizacin fue ms
evidente en las biopsias bronquiales acompaantes (Pap, 100 ).
Los ncleos normales pueden contener nucleolos pequeos, discretos y compuestos por RNA y protenas relacionadas. Se observan multinucleacin y macronucleolos en
estados de proliferacin, neoplsica y no neoplsica. La
cromatina degenerativa puede aparecer como una masa
densa, contrada (cariopicnosis), con fragmentos densos
107
(cariorrexis) o puede experimentar disolucin (carilisis o

cromatlisis). La citlisis puede producir remanentes nucleares expuestos o descubiertos, a menudo hipocromticos, y la fragilidad de la membrana nuclear inherente a
algunas clulas ocasiona fluidez nuclear o artefacto en el
frotis. Esto afecta a menudo a las clulas linfoides o puede
ser una caracterstica del carcinoma anaplsico de clula
Figura 9-19 Carcinoma anaplsico celular pequeo en esputo.

Las clulas apenas cohesionadas del carcinoma, en gran parte degeneradas hasta clulas de avena, yacen dentro de una franja
mucosa. En algunas, la cromatina finamente dispersa (sal y pimienta) es apenas perceptible, al igual que el moldeado nuclear
focal. En su mayor parte, poseen citoplasma mnimo con ncleos
hipercromticos y cariopicnticos. Las escamas superficiales, eritrocitos y linfocitos representan una indicacin del tamao relativo (Pap, 100 ).
pequea (fig. 9-19). Lo anterior se puede delimitar de modo

estrecho por dao vorticoso cuando las clulas se expulsan
a travs de una aguja de calibre fino sobre un portaobjetos.
La mayora de las clulas posee un solo ncleo aunque
algunas, que experimentan actividad de regeneracin o reparacin, por ejemplo hepatocitos y condrocitos, pueden
ser binucleadas. Los osteoclastos y sincitiotrofoblastos son
casi siempre polinucleados. La multinucleacin puede ser
una caracterstica de anomalas inflamatorias y neoplsicas
(figs. 9-20 y 9-21).
Es inusual encontrar mitosis en citopreparaciones. Un
incremento del nmero de mitosis implica proliferacin
celular y es difcil identificar formas anormales del huso
(tripolar, tetrapolar, etc.) en condiciones benignas.
Caractersticas citoplsmicas
La variacin del tamao y forma de clulas similares se
denomina anisocitosis. El volumen citoplsmico de una
clula anormal puede ser ms grande o pequeo que su
contraparte normal, de tal modo que puede influir en el n-
108
CAP. 9
CITOPATOLOGA
Figura 9-20 a) Clula gigante de Langhans en la tuberculosis. Esta clula gigante multinucleada en un aspirado con aguja fina es
de origen histioctico. La orientacin perifrica en herradura de los ncleos es caracterstica. Otros tipos de clulas gigantes pueden
observarse en diversos trastornos inflamatorios y neoplsicos (MGG, 250 ). b) Granuloma celular epitelioide en la tuberculosis. Este
grupo notoriamente arracimado de histiocitos epitelioides mal definidos del mismo aspirado con aguja fina es evidencia de una reaccin
granulomatosa. La necrosis fibrilogranular fue obvia en otra parte y se aislaron bacilos resistentes al cido y el alcohol a partir de una
muestra similar (MGG, 100 ).
Figura 9-21 Linfoma de Hodgkin. La clula central de ReedSternberg muestra la binucleacin en imagen de espejo con
macronucleolos de ojo de bho evidentes. El fondo variforme
de clulas plasmticas polimorfas eosinfilas y neutrfilas, linfocitos e histiocitos es tpico de esta tumoracin (MGG, 100 ).
dice nuclear:citoplsmico, con independencia de cualquier

cambio nuclear acompaante. La composicin ultraestructural del citoplasma, esto es, la concentracin del aparato
de Golgi, ribosomas, retculo endoplsmico, mitocondrias
y cualquier producto del metabolismo, ejerce una importante influencia en la afinidad de varias reacciones de tincin. Los productos almacenados, como mucina, lpidos,
carbohidratos, hormonas o cristaloides, se pueden destacar
por tinciones especiales y apropiadas. Los glbulos de mucina, microvacuolacin espumosa, bordes en cepillo de microvellosidades y cilios pueden ser perceptibles en clulas
normales o bien diferenciadas. La queratinizacin indica
diferenciacin escamosa y las clulas extraas alargadas
o caudadas (no isodiamtricas) pueden ser ms evidentes
que las de formas redondas o poligonales (isodiamtricas)
ms frecuentes (fig. 9-22).
Las clulas adyacentes pueden mostrar moldeado citoplsmico o, en casos extremos, engullimiento (abrazamien-
CITOMORFOLOGA
Figura 9-22 Carcinoma celular escamoso. Esta clula escamosa

alargada y anmala (caudada, clula renacuajo o cometa) posee un ncleo hipercromtico agrandado y yace en medio de la
ditesis tumoral y remanentes celulares escamosos disqueratsicos degenerados. Algunas veces pueden verse formas similares
a una correa (clula de fibra o serpiente) y naranjfilas brillantes (clula de zanahoria) (Pap, 100 ).
109
terial teido de modo intenso con sangre o una respuesta

inflamatoria vigorosa, por ejemplo, a menudo ocultan detalles citonucleares de cualquier poblacin celular epitelial,
lo cual limita la cantidad de informacin disponible.
Adems de los componentes estrmicos del tejido
conectivo, sealados con anterioridad, pueden ser perceptibles el material de la membrana basal, la sustancia
granulada, mucosidad, cristales, exudado fibrinopurulento,
coloides, lquido rico en protenas o incluso microbiopsias
del tejido condroide (fig. 9-24). La mineralizacin puede
manifestarse como depsitos amorfos del calcio o algunas
veces como cuerpos de psamoma (fig. 9-25).
El tumor invasivo puede vincularse con detritos sanguneos, necroinflamatorios y de degeneracin (ditesis tumoral) (fig. 9-26).
to o canibalismo celular evidente (fig. 9-23a,b). Esto se

reconoce en condiciones benignas y malignas, pero es ms
comn en estas ltimas.
Los cambios citoplsmicos degenerativos incluyen la
hinchazn o cambio hidrpico, vacuolacin y prdida de
la integridad de la membrana plasmtica con derramamiento del contenido celular (citlisis).
Entorno y artefactos del fondo
El contenido del fondo de una citopreparacin puede incluir
material de procedencia celular y no celular. Esto puede ser
til para precisar un diagnstico o un contratiempo. El ma-
Figura 9-24 Sustancia granulada de un adenoma pleomrfico

salival benigno. La sustancia granulada mucomixoide fibrilar
(plumosa) propensa a la tincin de Giemsa casi oculta a las
clulas epiteliales; la sustancia fue mucho menos notoria con la
tincin de Papanicolaou (MGG, 125 ).
Figura 9-23 Clulas mesoteliales reactivas dispuestas de forma individual o en grupos pequeos. Los bordes en cepillo de las microvellosidades son apenas observables alrededor de algunas clulas. Los espacios intercelulares vacos (ventanas) son una caracterstica
habitual. Pueden verse el moldeado nuclear y el engullimiento (abrazamiento o canibalismo) celular evidente (a, Pap, 250 ; b, MGG,
250 ).
110
CAP. 9
CITOPATOLOGA
Figura 9-25 Cuerpo de psamoma. a) Psamocalcificacin central que revela un aspecto tpico de laminacin concntrica, apenas
retrctil, entre un fondo de linfocitos y clulas sanguneas rojas (Pap, 250 ). b) Carcinoma epitelial-mioepitelial de la glndula partida.
Las clulas epiteliales mal cohesionadas, un poco pleomrficas, rodean a los glbulos densamente teidos del material de la membrana
basal, lo cual refleja los aspectos histolgicos. Modelos similares pueden reconocerse en diversos tumores de origen glandular salival y
no salival de la glndula, benignos y malignos (MGG, 250 ).
Figura 9-26 Carcinoma celular transitorio de la vejiga. Se identifica un racimo apenas cohesionado, con pobre polarizacin, de
clulas pleomrficas uroepiteliales. Existe hipercromasia nuclear,
un contorno nuclear irregular y macronucleolacin. La biopsia
confirm un carcinoma celular transitorio de grado alto. Obsrvese el fondo citoltico e inflamatorio (sucio) (Pap, potencia
media).
Algunas veces est indicada una bsqueda de microorganismos o parsitos. Los comensales incluyen Lactobacillus en frotis cervicovaginal y Candida en muestras
bucofarngeas. Los patgenos incluyen virus, bacterias,
hongos y protozoarios, entre otros. Algunos pueden ser visibles con el microscopio de luz, mientras que la mayora
de las infecciones vricas est implcita por sus efectos citopticos. La coilocitosis en el virus del papiloma humano, la
multinucleacin con nucleoplasma de cristal granulado
en Herpes simplex y las inclusiones nucleares de ojo de
bho en infecciones por Cytomegalovirus son ejemplos
caractersticos (figs. 9-27 y 9-28).
Un artefacto es un producto artificial o un cambio morfolgico en una citopreparacin originado en la degradacin
fsica de una muestra o durante el muestreo, el transporte o
la preparacin del frotis. Los contaminantes son cuerpos
ajenos que se introducen durante estos procesos. Su importancia se debe sobre todo al hecho de que pueden atenuar la exactitud de la interpretacin del aspecto microscpico. Los artefactos pueden clasificarse como intrnsecos,
CITOMORFOLOGA
111
Figura 9-27 Efecto citoptico del virus del papiloma humano. a) La histologa muestra multinucleacin con halos claros alrededor de los
ncleos hipercromticos e irregulares (coilocitosis) (H-E, potencia media). b) Coilocitos similares presentes en un frotis cervical. Ntese
de nueva cuenta la multinucleacin, clarificacin perinuclear del citoplasma y leve condensacin citoplsmica perifrica (Pap, 100 ).
Figura 9-28 Clulas epiteliales en un frotis cervical que muestra el efecto citoptico vrico de Herpes simplex. Se ha comparado
el aspecto general, con agrandamiento nuclear, aglomerado, superposiciones, amoldamiento, plurinucleacin y reas de carioplasma
de cristal granulado con semillas de granada.
originados a partir de una fuente endgena, como fibras

vegetales o crnicas y cristales de colesterol (fig. 9-29), o
extrnsecos, por ejemplo depsitos del colorante y grnulos
de talco o algodn provenientes de los guantes quirrgicos
(fig. 9-30). Una fijacin deficiente, en particular por secado
al aire seguido de la fijacin en alcohol, las preparaciones
Figura 9-29 Cristales romboidales de colesterol aspirados de

un quiste tiroideo benigno. Tal sedimentacin puede ser una consecuencia de hemorragias anteriores (MGG, 50 ).
teidas con Papanicolaou, el artefacto de xileno y las burbujas de aire confieren apariencias tpicas (fig. 9-31). Elementos inorgnicos, como fibras de asbestos, se reconocen
de modo ocasional (fig. 9-32).
La transferencia de material celular (contaminacin
cruzada, transportadores o flotadores), por el paso
de una muestra a otra durante el transporte, la fijacin o los
procedimientos de tincin, constituye una fuente potencial
112
CAP. 9
CITOPATOLOGA
Figura 9-30 Numerosos grnulos de almidn que contaminan

esta muestra de un lavado bronquioloalveolar, tal vez procedentes
del polvo del guante quirrgico. Su tpico aspecto de cruz de Malta
se reconoce mejor mediante transiluminacin con luz polarizada
cruzada (MGG, 50 , polarizada).
Figura 9-31 Clulas en hojuela de maz en un frotis cervical.

Un depsito marrn apenas refrctil cubre los ncleos y el citoplasma de estas clulas escamosas. Esto es ms comn en frotis
cervicales y se cree que es el resultado del aire atrapado en la superficie celular durante la fijacin. Rara vez es tan extenso para
producir un frotis del todo indescifrable (Pap, 100 ).
para establecer resultados positivos falsos de la malignidad y se debe evitar a toda costa. Es posible prevenir lo
anterior con una tcnica rigurosa y una buena higiene del
laboratorio.
La contaminacin ambiental espuria procede casi siempre del agua o el aire y puede ser de naturaleza biolgica o
no (figs. 9-33 y 9-34).
Exactitud y limitaciones de la citologa

Es til alguna medida de la confiabilidad y la exactitud
de la citologa diagnstica en varias circunstancias para la
Figura 9-32 Cuerpo ferruginoso en esputo. Un macrfago multinucleado alveolar pulmonar engulle en parte un cuerpo ferruginoso
refrctil. El aspecto marrn de cuentas ensartadas se atribuye a la
incrustacin del pigmento frrico en una fibra decolorada, quiz de
asbesto. Los grnulos intracitoplsmicos oscuros comprenden una
mezcla de pigmento antractico y hemosidertico (Pap, 1 000 ).
comparacin y se expresa a menudo en trminos estadsticos (cuadro 9-2). La sensibilidad (fraccin de verdaderos positivos) es una medida de la eficacia con la cual una
prueba reconoce a pacientes con el trastorno bajo consideracin. La especificidad (fraccin de verdaderos negativos)
indica qu tan bien excluye una prueba a esos individuos
sin la enfermedad. Los valores predictivos positivo y negativo indican el modo preciso en que la prueba reconoce la
presencia o ausencia de la afeccin, respectivamente. Un
resultado falso negativo seala que la prueba no identifica
una enfermedad que luego s se demuestra. Esto puede deberse a los errores de la investigacin o las dificultades de
la interpretacin. Un falso verdadero negativo se presenta
cuando la revisin retrospectiva del material confirma la
suficiencia de la muestra y corrobora un resultado negativo
genuino. Las posibles explicaciones para esto incluyen el
muestreo perilesional en lugar del lesional o el inicio de
la enfermedad despus de practicar el mtodo de la prueba (intervalo de la enfermedad). La sensibilidad de una
prueba disminuye mientras el nmero de falsos negativos
aumenta. Un resultado falso positivo aparece si la prueba
se informa como positiva pero la enfermedad no puede demostrarse con posterioridad. Esto puede ser consecuencia
de dificultades en la interpretacin o del aspecto de ciertas anormalidades, que pueden semejarse de forma estrecha. La especificidad de una prueba disminuye mientras el
nmero de falsos positivos aumenta. La eficiencia de una
prueba es una medida de cun bien clasifica a los pacientes
que deben recibir el tratamiento y aquellos para los que el
tratamiento es innecesario.
Los valores estadsticos absolutos de una prueba particular se pueden modular por la inclusin o exclusin de
113
CITOPATOLOGA GINECOLGICA Y EXPLORACIN CERVICAL
Figura 9-33 Contaminantes areos. Estas condias (zapatos para la nieve) micticas segmentadas de manera interna se hallaban en el
borde de un frotis. Tales elementos son consistentes con Alternaria spp. y son presuntos contaminantes areos (a, Pap, 250 ; b, MGG,
250 ).
Cuadro 9-2 Algunos de los parmetros ms tiles para medir
la exactitud de la citologa y formas de calcularlos
Enfermedad
positiva (a c)
Enfermedad
negativa (b d)
Prueba positiva
(a b)
Verdadero positivo
(a)
Falso positivo
(b)
Prueba negativa
(c d)
Falso negativo
(c)
Verdadero negativo
(d)
a
ac
d
Especificidad
bd
Sensibilidad
Figura 9-34 Un caro libre descubierto como contaminante exgeno en un frotis cervical. No es de consecuencia clnica (Pap,
250 ).
muestras inadecuadas o insatisfactorias. La inclusin de

stas suministra una indicacin global de la eficacia clnica de la prueba, en tanto que la exclusin refleja con ms
exactitud el funcionamiento del laboratorio.
a
ab
d
Valor negativo predictivo
cd
ad
Exactitud
abcd
Valor positivo predictivo
Fraccin de probabilidad
de una prueba positiva
sensibilidad
1 especificidad
Fraccin de probabilidad 1 sensibilidad

de una prueba negativa especificidad
Citopatologa ginecolgica
y exploracin cervical
Las muestras de citologa de la zona genital femenina representan una proporcin considerable del procesamiento
de rutina de la mayora de los laboratorios de diagnstico,
en gran parte como resultado de la exploracin cervical.
El primer objetivo de la prueba del frotis cervical es la deteccin del carcinoma celular escamoso y sus precursores
en mujeres asintomticas. Tambin se utiliza en la investigacin de las pacientes que sufren sntomas ginecolgicos y como parte del proceso de vigilancia despus del
tratamiento. De importancia secundaria es la deteccin de

lesiones glandulares del cervix u otros sitios ginecolgicos,
el reconocimiento de una variedad de anomalas inflamatorias y contagiosas, y la valoracin del estado hormonal.
La exploracin cervical ha demostrado ser eficaz en la
reduccin de la mortalidad y la morbilidad del carcinoma
cervical en varios pases, aunque no por medio de ensayos
controlados aleatorios. Un programa de exploracin cervical ha estado en funcionamiento en el Reino Unido desde
114
CAP. 9
Unin escamocolumnar original
Zona de transformacin con nueva

unin escamocolumnar
CITOPATOLOGA
Eversin endocervical (ectropin)

con unin escamocolumnar
original
Unin escamocolumnar dentro

del canal endocervical despus
de la menopausia
S = epitelio escamoso C = epitelio columnar E = fondo de las glndulas endocervicales en el epitelio escamoso metaplsico
Figura 9-35 Diagrama esquemtico de la anatoma del cervix. Se ilustra la morfologa cambiante de la zona de transformacin cervical y
la unin escamocolumnar con el paso de los aos.
1964. La llamada sistemtica de la poblacin se introdujo

en 1988 bajo auspicios del NHS Cervical Screening Programme (NHSCSP) con el establecimiento de una red de
coordinacin nacional. Esto propicia la clasificacin uniforme de las anomalas, la estandarizacin de la terminologa, el seguimiento de frotis anormales, la institucin de
mecanismos para el control de calidad, la evaluacin de la
efectividad del programa mediante el entrenamiento multidisciplinario de auditora y la vigilancia de los profesionales del cuidado de la salud.
Cuando todos los aspectos del proceso de investigacin se
realizan de forma ptima, la prueba es un mtodo muy sensible para la deteccin de los precursores del carcinoma
celular escamoso, excepto para el carcinoma invasivo. Sin
embargo, debe recordarse que como prueba de exploracin
tiene un margen de error diagnstico bajo pero de importancia. La erradicacin del carcinoma cervical tiene todava que realizarse por esta va.
El objetivo de un frotis cervical es muestrear de manera
representativa la zona de transformacin cervical que limita
la unin escamocolumnar, que es el sitio con el riesgo ms
alto de cambio neoplsico (fig. 9-35). Es en ltima instancia
tarea del clnico visualizar el cervix y recoger muestras de
la circunferencia cervical entera, sin importar cul sea la
celularidad o el contenido celular del frotis (fig. 9-36). Los
indicadores de la probable transformacin de la zona que
se muestrea incluyen las clulas escamosas metaplsicas
inmaduras o el epitelio glandular endocervical con mucosidad. No existen indicadores confiables de la transformacin
de la zona que se muestrea en frotis atrficos.
El frotis cervical normal
La citomorfologa de las clulas escamosas superficiales,
intermedias y parabasales refleja en gran parte la estructura histolgica del epitelio escamoso estratificado maduro
(fig. 9-37). El espesor mucoso y el contenido de glucgeno
dependen de la actividad hormonal. En condiciones normales, las clulas superficiales se exfolian de forma natural y
no existe casi nunca queratinizacin. Las clulas muestran
escasa cohesin y se disponen casi de modo individual.
Por su parte, las clulas glandulares endocervicales poseen
una amplia variacin en el aspecto, segn sean su preservacin y orientacin. Tienden a conservar la cohesin y
pueden mostrar modelos citoestructurales comparables a
los de otros sitios glandulares. Las clulas de la reserva
subcolumnar estn casi siempre presentes como ncleos
descubiertos e isomorfos. Las clulas escamosas metaplsicas son un componente normal de un frotis durante los
aos reproductivos. Mientras son inmaduras no se exfolian
de modo espontneo y cuando se eliminan por abrasin
115
exhiben a menudo proyecciones citoplsmicas (clulas en

araa). Una vez que alcanzan la madurez completa son
indistinguibles de las clulas escamosas del ectocervix
original. Las clulas estrmicas endometriales, las clulas
glandulares y los histiocitos (xodo) pueden observarse
al principio del flujo menstrual hasta el da 12 del ciclo
menstrual. Fuera de este intervalo se consideran anormales
y dicha hiperexfoliacin puede deberse a irregularidades
menstruales y dispositivos anticonceptivos intrauterinos,
adems de plipos, hiperplasia y neoplasia. Los leucocitos
polimorfonucleares estn invariablemente presentes y son
ms evidentes cerca de la menstruacin. Los linfocitos, los
eosinfilos, los mastocitos y las clulas plasmticas suelen
ser escasos. La mera presencia de clulas inflamatorias no
implica infeccin en todos los casos. Los espermatozoides
pueden persistir por varios das despus de la unin sexual.
El trofoblasto y el estroma deciduoide pueden perderse
durante el embarazo o el aborto y las clulas seudodeciduoides pueden ser el resultado de la terapia hormonal.
La queratinizacin anormal (hiperqueratosis) produce
escamas sin ncleo, profundamente naranjfilas en preparaciones con Papanicolaou. La paraqueratosis demuestra
espigas (ramitas) o perlas de escamas similares que poseen
ncleos picnticos. Ambos modelos pueden verse en condiciones inflamatorias y neoplsicas. Puede hallarse una
variedad de contaminantes, incluidos los helmintos, piojos,
hongos, polen y gel lubricante.
Citologa hormonal
La evaluacin citohormonal se basa en la maduracin del
epitelio escamoso vaginal en respuesta a las hormonas
gonadotrpicas circulantes en combinacin. El epitelio es
delgado e inmaduro cuando carece de estrgeno y progesterona. El estrgeno sin oposicin promueve el crecimiento y la maduracin. La progesterona induce descamacin
y exfoliacin con citlisis y clulas naviculares. Los
andrgenos estimulan la maduracin parcial de clulas
intermedias en el epitelio atrfico con un efecto recproco
sobre el epitelio maduro.
Los modelos caractersticos son reconocibles en el
periodo posnatal, durante la pubertad, los estados de madurez sexual, de embarazo, el puerperio, la lactancia y la
premenopausia y posmenopausia establecidas, con modulacin de influencias hormonales exgenas o fuentes
hormonales endgenas anormales, como los tumores ovricos.
Se pueden utilizar diversos ndices para registrar cambios hormonales, entre ellos el ndice de maduracin, el
valor de maduracin, el ndice cariopicntico, el ndice
eosinfilo y el ndice celular plegado.
116
CAP. 9
CITOPATOLOGA
Treponema pallidum, Candida albicans, Herpes simplex

virus y virus del papiloma humano; muchas de estas infecciones son de transmisin sexual (figs. 9-38 y 9-39).
Las influencias yatrgenas incluyen la ablacin con lser, el dao trmico, la operacin, la radioterapia, el reemplazo o la manipulacin hormonales y los dispositivos
Figura 9-36 Dispositivos cervicales de muestreo. La esptula,

en particular la de tipo extendido (Aylesbury), proporciona un mejor rendimiento celular y se recomienda para la exploracin. Los
dispositivos con cepillo para el muestreo endocervical pueden ser
benficos en caso de un frotis anormal. La tcnica de muestreo y la
visualizacin del cervix son de enorme importancia, sea cual sea el
diseo empleado.
Figura 9-38 Clula indicadora en la vaginosis bacteriana. El
crecimiento excesivo de cocos confiere un aspecto granular a una
clula escamosa superficial (clula indicadora) en un frotis cervical. Por lo regular, se debe a la flora bacteriana mixta, incluida
Gardnerella vaginalis. Su presencia no es una indicacin invariable
de sntomas clnicos (vaginosis bacteriana) (Pap, 250 ).
anticonceptivos intrauterinos. stos pueden dar lugar a

varias hiperplasias y metaplasias, adems de complicar la
interpretacin exacta del frotis cervical.
Discariosis, neoplasia intraepitelial cervical
y carcinoma cervical
Figura 9-37 Maduracin epitelial escamosa ectocervical normal.
Obsrvense la polaridad desde el estrato basal hasta las escamas
superficiales y la ausencia de queratinizacin superficial (H-E, potencia media).
Inflamacin y cambios regenerativos

La inflamacin en la zona genital femenina tiene un origen
infeccioso y puede algunas veces mostrar un patrn agudo, crnico o granulomatoso. Es un proceso dinmico en el
que los cambios degenerativos y regenerativos se observan
de forma sincronizada.
Las infecciones ms comunes incluyen cervicitis folicular con notorio vnculo con Chlamydia spp., Lepthothrix
spp., a menudo acompaada de Trichomonas vaginalis, vaginosis bacteriana por Gardnerella vaginalis, Actinomyces
spp., Neisseria gonorrhoeae, Mycobacterium tuberculosis,
Al carcinoma celular escamoso invasivo del crvix lo antecede un prdromo de cambios precancerosos (displasia)
del epitelio de la zona de transformacin cervical, la llamada neoplasia intraepitelial cervical (NIC). ste es un espectro biolgico continuo que se subdivide o se califica de
forma arbitraria en cortes histolgicos como NIC 1, 2 y 3,
de acuerdo con el aumento de la gravedad de la displasia
(figs. 9-40 y 9-41). Cada fase representa el potencial para la
progresin de la regresin. Estas categoras corresponden a
discariosis celular escamosa leve, moderada y grave en las
preparaciones de los frotis de transferencia cervical (fig.
9-40). El sistema estadounidense de Bethesda utiliza una
nomenclatura apenas diferente para los mismos aspectos
citomorfolgicos (vase el cuadro 9-3). Cuanto ms alto
sea el grado de anormalidad, mayor es el riesgo estadstico
de progresin al carcinoma invasivo.
117
Figura 9-39 Tricomonas y Candida en un frotis cervical. a) Trichomonas protozoon binucleadas y flageladas (Pap, 250 ). b) Blastosporos y seudohifas de Candida (Pap, 250 ).
Epitelio
maduro
normal
Neoplasia cervical intraepitelial

Grado 3
Grado 2
Displasia
Displasia
moderada
grave
Grado 1
Displasia
leve
Invasin estrmica inicial sobrepuesta o

carcinoma microinvasivo
Figura 9-40 Precursores del carcinoma celular escamoso invasivo del cervix. Representacin esquemtica de la progresin potencial de la neoplasia intraepitelial cervical al carcinoma cervical
invasivo.
Figura 9-41 Discariosis celular escamosa moderada. Obsrvense la nucleomegalia desproporcionada, el ncleo que ocupa hasta
dos tercios del rea citoplsmica, la hipercromasia nuclear, el
contorno nuclear irregular y los bordes celulares angulados (Pap,
100 ).
118
CAP. 9
CITOPATOLOGA
Cuadro 9-3 Comparacin amplia de las terminologas ms recientes aplicadas a las clulas escamosas
anormales en la citologa cervical
Contraparte histolgica
WHO, 1973
NIC 1
NIC 2
NIC 3
Displasia menor
Displasia moderada
Displasia grave
Carcinoma in situ
Carcinoma epidermoide
Carcinoma invasivo
BSCC, 1986*
Bethesda, 1991
Limtrofe
Discariosis menor
Discariosis moderada
Discariosis grave
CEAII
LIE grado bajo
LIE grado alto
LIE grado alto
Discariosis grave
Carcinoma invasivo?
Carcinoma escamoso
WHO, World Health Organization; CEAII, clulas escamosas atpicas de importancia incierta; BSCC, British Society of Clinical Cytology; LIE,
lesin intraepitelial escamosa.
*Enmiendas propuestas por la BSCC en 2002 para emplear una clasificacin simplificada de dos grados (es decir, discariosis de grados bajo y alto),
en lugar de la estadificacin actual de tres grados de discariosis (esto es, menor, moderada y grave), la cual debe an ratificarse en el Reino Unido.
La invasin estrmica inicial, la microinvasin y el carcinoma celular escamoso invasivo indican la transgresin
de la membrana basal a grados variables, en el caso extremo
con tumefaccin. Esto se evala mejor mediante el examen
histolgico, en tanto que la discariosis grave NIC 3 puede
ser indistinguible en el plano citomorfolgico respecto de
la discariosis grave que se observa en el carcinoma invasivo. Las clulas disqueratsicas extraas y la ditesis tumoral pueden ser caractersticas distintivas tiles, pero no son
patognomnicas ni estn presentes en todos los casos.
Se han establecido programas de exploracin para detectar carcinoma de mama en mujeres asintomticas en varios pases y los resultados iniciales parecen alentadores.
Citologa basada en lquidos en la exploracin cervical
En aos recientes, junto con el reconocimiento de la eficacia de la prueba del frotis cervical, tambin se han identificado de modo ms extenso algunas de las limitaciones
del proceso. La sensibilidad aceptada de un frotis cervical
solo oscila entre 50 y 60%, lo que contrasta en grado considerable con la elevada expectativa pblica, muchas veces
infundada. Los mtodos empleados han cambiado poco en
varias dcadas y estn sujetos al escrutinio creciente, con
la finalidad de reducir ms la mortalidad del cncer cervical. Se cree que slo una pequea proporcin de los frotis
falsos negativos son consecuencia del error humano de observacin o interpretacin durante el examen microscpico
por el personal del laboratorio. Los factores de confusin
ms significativos se reconocen ahora durante las etapas
anteriores al muestreo y la preparacin. Por ejemplo, la
esptula de madera convencional no muestrea las clulas
anormales de manera uniforme y transfiere slo 10 a 60%
de las clulas recolectadas a un portaobjetos. Por lo tan-
to, la distribucin del material puede ser desigual y poco

representativa. Esto, y en verdad cualquier factor de la mucosa, inflamacin u otro pueden ser perjudiciales para la
fijacin, dado que provocan artefactos, tinciones insuficientes y prdida del contorno citonuclear; todo ello representa
una proporcin inadecuada del frotis global de casi 10%.
Las tcnicas de citologa basadas en lquido reducen al
mnimo muchos de estos problemas. A partir de octubre de
2003, el National Institute of Clinical Excellence (NICE)
ha recomendado al NHS en Inglaterra y Pas de Gales que
se introduzca la citologa basada en lquido como medio
primario del procesamiento de muestras en el NHSCSP. Se
anticipa que tomar cerca de cinco aos para que esto se instituya por completo. Esta decisin incluye la evaluacin de
dos diferentes sistemas comerciales establecidos, ThinPrep
(Cytyc Corporation) y Sure-Path Prep (TriPath Imaging
Inc.). Estos productos ganaron la aprobacin similar de la
US Food and Drug Administration (FDA) varios aos antes. Es probable que otros productos comerciales insistan
en la validacin oficial a su debido tiempo. Estudios piloto
predicen efectividad clnica reforzada (mayor sensibilidad
y especificidad, menos frotis limitados), mejor relacin
costo-beneficio (menos frotis inadecuados, tiempos ms rpidos de consulta y mejor productividad del laboratorio) y
una mejor aceptacin (del pblico y los profesionales del
cuidado mdico) en comparacin con las tcnicas convencionales del frotis cervical.
Exploracin automatizada y anlisis de la imagen
Los sistemas de anlisis de imagen de alta resolucin se
pueden semiautomatizar o automatizar por completo y
conectarse a la poderosa red neural de computadoras. El
objetivo de evitar la subjetividad de la valoracin manual y
119
la posibilidad de que las mquinas autnomas reduzcan el

error humano durante el proceso de exploracin son puntos
atractivos. El requerimiento de calidad ptima y muestras
uniformes han conducido en gran parte al avance de la citologa basada en lquido. Varios paquetes comerciales se han
desarrollado y comercializado en poco tiempo. No obstante,
hasta la fecha parece discreta la perspectiva de reemplazar
a la mayora de los citlogos expertos y la relacin costobeneficio de esta tecnologa todava no se establece.
Los dispositivos de la microscopia asistidos por una
computadora se han utilizado como adjunto del entrenamiento de los citlogos y para registrar los datos del control
de calidad, pero an no se emplean de rutina en la mayor
parte de los laboratorios.
La telepatologa y la teleconferencia aprovecharon
los enlaces remotos en tiempo real con los usuarios, alejados desde el punto de vista geogrfico, y ello hizo posible
las consultas interactivas para el entrenamiento, revisin
grupal o del experto y la valoracin de calidad.
La microscopia con lser confocal procesa las imgenes

digitales, que pueden manipularse ms para reconstruir la
microtopografa tridimensional de las clulas; es conveniente en particular para las preparaciones gruesas y los
productos fluorescentes que pueden cuantificarse.
La citometra con lser es una tcnica hbrida que
combina las caractersticas de la citometra de flujo con
el anlisis de imagen esttica de clulas marcadas por los
fluorocromos multicolores; puede determinar la ploidia
del DNA e incorporar mtodos de hibridacin in situ fluorescentes mediante citopreparaciones convencionales y
basadas en lquido.
Las tcnicas de microdiseccin con captura de lser
permiten la seleccin de una subpoblacin relativamente
pura de clulas seleccionadas de un portaobjetos de la citologa o la histologa. Un lser infrarrojo de baja energa se
emplea para extender un adhesivo plstico sobre las clulas seleccionadas, que despus se desprenden con suavidad
para el estudio adicional.
Tcnicas auxiliares
en la citologa diagnstica
En ocasiones, la valoracin citomorfolgica es un proceso muy subjetivo y por tanto propenso a las diferencias de
reproducibilidad entre el propio clnico y entre ste y otro.
Se ha tratado de depurarla y cuantificarla de modo ms riguroso, con grados variables de xito.
La citometra de flujo implica la valoracin automatizada de clulas en suspensin, las ms de las veces para el
anlisis del DNA o con propsitos de inmunofenotipificacin. La microfluorimetra permite el enfoque sobre clulas individuales en un campo para evaluar la cantidad de
actividad fluorescente dentro de ncleos marcados.
El anlisis citogentico detecta anormalidades cromosmicas, algunas de las cuales son tpicas de ciertos tumores, como el t(x:18) en el sarcoma sinovial y el t(11:22) en
el tumor de Ewing. No obstante, casi ninguna neoplasia
muestra tales translocaciones consecuentes tpicas.
Las regiones del organizador nucleolar teidas con plata se incrementan en la mayora de los ncleos malignos.
Infortunadamente, la superposicin de anormalidades benignas y malignas es considerable con frecuencia.
El escrutinio y la microscopia electrnica de transmisin pueden identificar los detalles ultraestructurales tiles
e imperceptibles para la microscopia de luz y ello hace posible una clasificacin ms exacta de diferenciacin celular,
como grnulos neurosecretorios de centro denso, uniones
firmes, tonofilamentos, etctera.
Las tcnicas de hibridacin in situ se pueden utilizar
para identificar el material nuclear vrico y reconocer la
activacin oncgena en los tumores.
El propsito de un programa de aseguramiento de calidad

es evaluar el proceso diagnstico en su prctica. El control
de calidad interno indica una serie de procedimientos dentro de un laboratorio particular. Esto supone la educacin
continua, el adiestramiento, la revisin de los procedimientos del laboratorio y su implementacin, la reevaluacin, la doble valoracin y la auditora. El aseguramiento
de calidad externo indica la evaluacin de la ejecucin
contra un grupo externo, ya sea en el plano regional o el
nacional, y esto puede ser parte de un esquema de acreditacin, voluntaria u obligatoria.
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Young JA (ed). 1993: Fine Needle Aspiration. Blackwell Scientific. London.
SECCIN 3
MICROBIOLOGABACTERIOLOGA
10
Microscopia en bacteriologa:
aplicacin y preparacin de la muestra
Dugald R Baird
Introduccin
A finales del siglo xvii, el tapicero y cientfico aficionado
holands Antonie van Leeuwenhoek puli lentes pequeas
de extraordinaria calidad y pudo observar microorganismos
por primera vez. Desde entonces, la microscopia desempea un papel fundamental en la bacteriologa clnica. El
examen microscpico de una muestra clnica puede ayudar
a valorar la propiedad de la muestra (vase la seccin sobre
esputo ms adelante) y puede por s mismo indicar inmediatamente la probable naturaleza del agente patgeno
bacteriano en sitios casi siempre estriles, como el lquido
cefalorraqudeo (LCR) o cultivos de sangre. Los mtodos
en un laboratorio de diagnstico clnico incluyen las microscopias de luz y fluorescencia; las muestras pueden estar teidas o carecer de tincin, segn sea su aplicacin.
Microscopia de luz
La microscopia de luz puede emplearse de tres maneras: la
forma ordinaria transmitida (campo brillante), la de campo
oscuro y la de contraste de fase; la ms utilizada, sin duda,
es la primera. Un microscopio moderno es capaz de alcanzar una ampliacin de mil veces y un poder de resolucin
aproximado de 0.2 m. La mayor parte de los microscopios
se disea de tal modo que el observador mira a travs de
los oculares, que se inclinan a un ngulo conveniente, en direccin del portaobjetos, que contiene el objeto a examinar.
Una disposicin alternativa (el microscopio de placa inver-
tida) se ide para observar la muestra desde abajo. La iluminacin de campo oscuro aumenta de forma eficaz el poder
de resolucin del microscopio de luz por abajo de 0.2 m.
Las muestras se iluminan de manera indirecta, dispersan la
luz y aparecen brillantes contra un fondo oscuro. Mediante
esta tcnica es posible visualizar bacterias, como las espiroquetas, que tienen un dimetro cercano a 0.1 m. La microscopia de contraste de fase permite el examen de estructuras
internas finas de tejidos y bacterias vivas sin teir y las diferentes estructuras aparecen en distintas tonalidades de gris.
Microscopia de fluorescencia
La fluorescencia se emite cuando una molcula se somete
a la luz de una longitud de onda particular e irradia luz de
una longitud de onda ms larga. Los fluorocromos (tintes
fluorescentes) absorben luz ultravioleta invisible y emiten
luz visible. Un microscopio fluorescente utiliza una lmpara de vapor de mercurio que irradia luz ultravioleta de alta
intensidad (luz de excitacin) y un espejo la dirige hacia la
muestra desde un plano superior. Las bacterias teidas con
un fluorocromo absorben esta luz de longitud de onda corta, emiten luz de longitud de onda ms larga y se delinean
como objetos verdes o amarillos radiantes contra un fondo
oscuro. La microscopia de fluorescencia permite el uso de
objetivos de poder ms bajo y por lo tanto puede analizarse
con rapidez un rea mucho ms grande de la muestra. Esto
es importante, por ejemplo, al buscar micobacterias en una
muestra de escasos microorganismos.
124
CAP. 10
MICROSCOPIA EN BACTERIOLOGA: APLICACIN Y PREPARACIN DE LA MUESTRA
Muestras para microscopia

Los especmenes pueden ser de dos tipos principales: a)
frotis secos de muestras lquidas o escobillados o bien de
cultivos bacterianos, extendidos sobre un rea de 1 a 2 cm
de dimetro en portaobjetos de 31 y fijados por calor
(pelculas); b) preparaciones hmedas de lquidos,
examinadas bajo un cubreobjetos o cmaras especiales.
Los escobillados contenidos en un medio de transporte
estn hmedos y se pueden frotar directamente sobre la
superficie de un portaobjetos, mientras las pelculas de
muestras lquidas, como pus, aspirados, LCR, etc., se preparan al extenderse sobre una capa fina. Los especmenes
de tejido se presionan sobre las superficies de los portaobjetos para crear las impresiones, o bien pueden suspenderse
en un volumen pequeo de agua peptonada. Las colonias
de bacterias que crecen en medios slidos se examinan al
remover con un asa la colonia y emulsificar sta en una
gota de solucin salina sobre el portaobjetos, de tal manera
que se obtenga una suspensin muy ligera para que las clulas individuales se distingan con claridad.
Examen de muestras sin teir

por transmisin de luz
El examen de muestras lquidas en una cmara de conteo
sobre un portaobjetos con un cubreobjetos se utiliza para
evaluar la presencia de indicios de infeccin o inflamacin
en lquidos corporales habitualmente estriles, como la
orina, LCR, aspirados y excreciones de dilisis peritoneal.
La luz transmitida se emplea con o sin contraste de fase
y la muestra se examina mediante el objetivo 25 para
eritrocitos y leucocitos, agentes patgenos, cilindros o cristales, segn sea apropiado para la muestra. Las cuentas de
clulas pueden expresarse en trminos cuantitativos, si se
emplea una cmara de conteo, o semicuantitativos (p. ej.,
por campo de alto poder).
Las bacterias que crecen en medios de cultivo lquidos
pueden examinarse por la motilidad con un objetivo de 50 .
Al acercar el condensador aumenta el contraste y la visualizacin de los microorganismos resulta ms fcil; en caso contrario puede ser de utilidad el microscopio de contraste de fase.
El examen de monocapas de cultivo de clulas de tejido
para efectos citopticos es en particular competencia de la
virologa, pero tiene una aplicacin en la bacteriologa para
identificar la citotoxina de Clostridium difficile en extractos fecales o sobrenadantes de cultivos.
Lquido cefalorraqudeo (LCR)
En condiciones normales, el LCR es estril y contiene no
ms de cinco clulas blancas por milmetro cbico, sobre
todo linfocitos. El primer paso en el examen consiste en la

microscopia del lquido sin centrifugar para cuantificar el
nmero de clulas presentes y su tipo. Se usa una cmara
de conteo, casi siempre la Fuchs-Rosenthal modificada. Se
trata de un portaobjetos que contiene un hueco, el piso del
cual est grabado con una rejilla de nueve cuadros grandes,
cada uno de 1 mm2 de rea. Estos cuadros estn a su vez
subdivididos en 16 cuadros pequeos. Cuando un cubreobjetos se aplica encima de la cmara de conteo y el lquido
se traslada mediante una pipeta de Pasteur, la profundidad
del lquido es de 0.2 mm. El volumen del lquido que cubre
cinco cuadros grandes es por consiguiente de 1 mm3.
Un cubreobjetos se aplica al portaobjetos para crear un
sello firme uniforme sobre la cmara de conteo, tras presionar con suavidad sus bordes hasta que los colores del
arco iris se ven de manera uniforme alrededor de los lados
del cubreobjetos (anillos de Newton); esto confirma que
el cierre e incluso el contacto se efectuaron entre el cubreobjetos y la cmara. El LCR se introduce en la cmara
con una pipeta de Pasteur fina aplicada de modo cuidadoso
en el borde para que el lquido pase al interior y llene por
completo la cmara, sin burbujas de aire.
Despus de unos cuantos minutos de reposo, las clulas se cuentan con un objetivo de 40 ; los nmeros de
cuadros existentes examinados dependen del nmero
de clulas presentes. El LCR que contiene una gran cantidad de clulas blancas o el densamente teido de sangre,
en un caso como resultado de hemorragia intracerebral
y en otro por la puncin accidental de vasos sanguneos
pequeos durante la puncin lumbar, debe diluirse antes de
realizar un conteo celular exacto. Para este propsito se utiliza un lquido que contenga cido actico y cristal violeta
diluido: se rompen los eritrocitos y se tie el ncleo de las
clulas blancas, lo cual las hace ms visibles. La identificacin de los tipos de clulas se facilita al centrifugar una
alcuota de LCR y crear una pelcula, que se impregna con
una tincin diferencial como la de Leishman.
Orina
No todos los laboratorios realizan la microscopia como una
rutina en las muestras de orina. En los especmenes tomados de pacientes mediante catteres (muestras de catter
de orina) est justificado, ya que la ausencia de clulas de
pus en esos especmenes no excluye la infeccin. Sin embargo, en las muestras obtenidas con limpieza sin catteres
(orina del chorro medio), la ausencia de piuria sugiere que la
relevancia de un aislado es en el mejor de los casos incierta;
puede tratarse de un contaminante y en tal caso se aconseja
la repeticin del muestreo. La microscopia tambin es til
para detectar eritrocitos, cilindros y cristales, que pueden
ser de importancia diagnstica. En consecuencia, la infor-
125
TINCIN DE LAS MUESTRAS
macin que se puede obtener de la microscopia de la orina

es valiosa y debe solicitarse siempre que sea posible.
La microscopia se realiza sobre orina fresca sin centrifugar. La visualizacin de microorganismos en tales preparaciones es de importancia secundaria puesto que es la
cuantificacin del crecimiento bacteriano lo que importa en
la evaluacin de los aislados de una muestra de orina. Los
neutrfilos se excretan en nmeros variables en la orina y
slo cifras mayores de 104/ml pueden considerarse anormales en las muestras del chorro medio. Las clulas rojas
se encuentran como contaminantes en la orina de mujeres
saludables muy jvenes, en relacin con la menstruacin,
pero pueden tambin indicar afecciones graves del sistema
renal, como clculos, neoplasias o enfermedad glomerular.
En este ltimo caso, la morfologa de los eritrocitos puede
ser anormal (dismorfismo) y se reconocen fragmentacin,
crenacin u otras formas extraas.
Los laboratorios que procesan pocas muestras de orina
pueden examinarlos en cmaras de conteo, como se describi
para el LCR, pero casi todos usan un mtodo semicuantitativo. ste suele incluir tan slo un portaobjetos y un cubreobjetos de cristal ordinarios, cmaras de conteo desechables
o un microscopio de placa invertida. Este ltimo permite el
procesamiento por lotes de muchas muestras en pozos de
fondo plano dentro de una placa plstica. Se usa un objetivo
40 y, si se conocen el rea de campo (campo de alto
poder) y la profundidad de la orina, el nmero de clulas
visibles se puede expresar en cuentas/ml, aunque en la prctica la mayor parte de los laboratorios registra las cuentas
slo como escasas, moderadas o numerosas.
Otras muestras
Las tcnicas descritas para la orina se pueden aplicar a otros
lquidos estriles, como los aspirados de articulaciones (en
los cuales tambin es importante el examen de cristales
como el cido rico), lquidos serosos y secreciones de
dilisis peritoneal. La microscopia de heces se emplea para
el diagnstico de infecciones parasitarias, pero no para el
diagnstico de la gastroenteritis bacteriana.
Examen de muestras sin teir mediante

iluminacin de fondo oscuro
Tiene una aplicacin en la bacteriologa clnica, sobre todo
en el examen de material tomado de un chancro primario
cuyos agentes patgenos pueden ser causantes de sfilis
(Treponema pallidum). El material se recoge de la lesin
sospechosa y se crea una pelcula hmeda bajo un cubreobjetos, que se examina de inmediato para identificar la
motilidad de los treponemas.
Tincin de las muestras

Se emplea luz transmitida porque el ndice de refraccin de
las bacterias es similar al del fondo oscuro y es necesario
incrementar el contraste por el uso de tinciones. El mtodo
ms utilizado de tincin de bacterias es an el que introdujo Christian Gram en 1884. Aunque no es un colorante,
sino un mtodo de tincin, el trmino tincin de Gram se
utiliza de modo universal; la tcnica delinea las diferencias
de la estructura de la pared celular que existen entre varias
clases de bacterias. El material que se tie puede ser una
muestra clnica, un caldo de cultivo o una suspensin en
solucin salina de un microorganismo tomado de una placa
de agar. En todos los casos se realiza un frotis fino sobre
un portaobjetos y se seca de manera natural o con calor de
baja intensidad, despus de lo cual el frotis se fija al portaobjetos, sea que ste se pase rpidamente tres veces por
un mechero de Bunsen o se emplee una placa calentada.
El mtodo de tincin de Gram, que tiene varias modificaciones, somete el frotis de modo sucesivo a lo siguiente: a)
una tincin bsica de carga positiva, casi siempre cristal de
violeta; b) mordiente de yodo acuoso; c) decoloracin con
acetona, y d) contratincin con carbol fucsina o safranina.
La mayor parte de las bacterias se tie al principio con el
cristal violeta y yodo, que forma complejos insolubles dentro de la pared bacteriana. Las bacterias que poseen capas
gruesas de peptidoglucano en sus paredes celulares, y en
consecuencia retienen la tincin despus del tratamiento con
acetona y adquieren una tonalidad morada, se definen como
grampositivas. Los microorganismos que tienen capas ms
delgadas de peptidoglucano, que pierden con rapidez el complejo con la acetona y por lo tanto se tien con el reactivo de
tincin rosa, se conocen como gramnegativos. Los ejemplos
de ambos se hallan en el cuadro 10-1. Algunas bacterias se
tien slo de modo muy discreto con la tincin de Gram
(p. ej., especies de Legionella), algunas son irregulares en el
Cuadro 10-1 Algunos ejemplos de gneros bacterianos

clasificados de acuerdo con su morfologa y tincin de Gram
Forma
Grampositivos
Gramnegativos
Cocos (esferas)
Staphylococcus
Streptococcus
Peptococcus*
Neisseria
Moraxella
Veillonella*
Bacilos (bastones)
Bacillus
Listeria
Corynebacterium
Clostridium*
Enterobacteriaceae
Pseudomonas
Haemophilus
Bacteroides*
*Gnero anaerbico.
126
CAP. 10
grado de tincin (gramvariables, como Gardnerella vaginalis) y otras no se tien en absoluto (p. ej., micobacterias).
Se requieren mtodos especiales de tincin para las micobacterias debido a la peculiar composicin de sus paredes
celulares, que contienen altas concentraciones de cidos
(grasos) miclicos. La tincin de Ziehl-Neelsen implica
el tratamiento de las pelculas con carbol fucsina caliente, seguido por pasos sucesivos de decoloracin con cido
sulfrico concentrado y alcohol; al final se contratien con
malaquita verde o azul de metileno. Las micobacterias aparecen rojas contra un fondo verde o azul (fig. 10-1).
Figura 10-2 Esputo teido con fenol de auramina y visualizado
bajo luz ultravioleta; se reconocen micobacterias radiantes con
una fluorescencia de tono verde o amarillo (400 ). Cortesa de
B. Watt.
Figura 10-1 Esputo teido por el mtodo de Ziehl-Neelsen

que muestra micobacterias (rojo) contra un fondo azul (1 000 ).
Cortesa de J. Winning.
El otro mtodo de tincin usado para las micobacterias

es el fenol de auramina. Los frotis secos y fijados por calor (esputo, lquidos pleural y asctico, primera orina del
da, LCR, pus, etc.) se tratan con fenol de auramina y se
decoloran con cido clorhdrico al 1% en alcohol metilado
industrial, seguido de solucin diluida de permanganato de
potasio. Los especmenes se observan bajo luz ultravioleta
con el objetivo de 40 y las micobacterias brillan en tonos
verdes y amarillos contra un fondo oscuro (fig. 10-2). Esta
tcnica permite la rpida proyeccin de un frotis y es til si
el nmero de bacterias en la muestra es pequeo.
Otros dos mtodos de tincin se emplean en microscopia de fluorescencia, la acridina naranja y la fluorescena,
que usan anticuerpos conjugados. La tincin con acridina
naranja es un mtodo til para demostrar las bacterias que
no pueden destacarse con claridad en una tincin de Gram
(como en los cultivos de sangre; vase ms adelante). Bajo
luz ultravioleta, las bacterias aparecen anaranjadas.
Se dispone de dos tcnicas inmunofluorescentes principales que usan conjugados de anticuerpos de fluorescena,
las pruebas directa e indirecta de anticuerpo fluorescente (DFAT e IFAT, respectivamente). La DFAT utiliza un
fluorocromo, casi siempre isotiocianato de fluorescena, conjugado con un anticuerpo especfico que se une directamente al antgeno superficial bacteriano. La IFAT es un proceso
de dos etapas: el anticuerpo especfico (p. ej., preparado en
un conejo) se liga al antgeno y lo detecta un anticuerpo conjugado (p. ej., anticonejo). La ventaja de la IFAT es que un
solo anticuerpo conjugado puede usarse para identificar
una gama entera de anticuerpos especficos.
En la bacteriologa clnica los principales usos de estas
tcnicas de inmunofluorescencia son: a) la deteccin de las
especies de Legionella, que son fastidiosas y de lento crecimiento, pero pueden visualizarse con rapidez en esputo, lavados bronquioalveolares y tejido pulmonar (fresco o fijado
en formalina), sea con DFAT o IFAT, y b) la demostracin
directa de clamidias en muestras genitales o respiratorias.
A continuacin se describen algunos ejemplos adicionales del uso de la microscopia de las preparaciones teidas
en microbiologa clnica.
Muestras de sitios estriles
Con estas muestras, la microscopia es una herramienta
poderosa para predecir el probable agente patgeno causal.
El hallazgo de microorganismos en el lquido cefalorraqudeo, aspirado o secreciones de dilisis peritoneal, por
ejemplo, en particular cuando se acompaan por un infiltrado de clulas de pus, es un indicador seguro de infeccin
y la apariencia sola de las bacterias puede ser diagnstica.
Debe realizarse una investigacin minuciosa de las bacterias, dado que algunas veces son muy escasas en las muestras, y se examinan por centrifugacin (p. ej., 3 000 rpm
por 10 minutos); se desecha el sobrenadante y se crea una
pelcula del depsito, que a continuacin se tie por el mtodo de Gram o bien con auramina o con tincin de Ziehl-
TINCIN DE LAS MUESTRAS
Neelsen, si la situacin clnica sugiere una posible infeccin micobacteriana.

Casi todos los laboratorios utilizan ahora alguna forma
del sistema de cultivo en sangre semiautomatizado; el primer paso para la identificacin del microorganismo es el
examen de una gota teida de Gram del caldo de un tubo
que muestra crecimiento. La microscopia puede ser por s
misma diagnstica; por ejemplo, los estreptococos en la
sangre de un paciente con fiebre y un soplo cardiaco apoyan
un diagnstico clnico de endocarditis infecciosa (vase fig.
10-3). Por otro lado, los cocos grampositivos en racimos
son casi siempre estafilococos, pero Staphylococcus aureus
no se puede distinguir por microscopia de las diversas es-
Figura 10-3 Tincin de Gram de un cultivo en sangre que muestra cocos grampositivos en cadenas largas. El agente patgeno era
Streptococcus sanguis y el paciente tena endocarditis infecciosa
(1 000 ). Cortesa del Dr. A McLay.
pecies coagulasa negativas, y puesto que estas ltimas son

microorganismos de la piel, resultan los contaminantes ms
comunes de los cultivos de sangre. La relevancia de los estafilococos identificados en un cultivo de sangre deben casi
siempre esperar una identificacin adicional. Los patgenos
gramnegativos en los cultivos de sangre son algunas veces
difciles de visualizar contra la tincin rosada del fondo;
cuando los microorganismos no son visibles es a menudo
til solicitar una tincin de acridina.
Muestras de sitios con una flora bacteriana
residente normal
127
ra artificial. Las pelculas de escobillados bucales muestran

muchas clulas de pus y un gran nmero de espiroquetas y
bacilos fusiformes (aspecto de huso) gramnegativos.
Esputo
Todas las muestras de esputo se registran como potencialmente peligrosas para el operador, ya que pueden contener
bacilos tuberculosos, y la preparacin se lleva a cabo en un
gabinete de seguridad alojado en un laboratorio de contencin de categora 3. Aunque el esputo se origina en las vas
respiratorias inferiores casi siempre estriles, se contamina
de forma inevitable antes de la coleccin por la flora de las
vas respiratorias superiores. Es necesario tener cuidado al
interpretar los especmenes con tincin de Gram del esputo
y slo de modo ocasional puede predecirse con seguridad el
agente patgeno causal de la neumona con base en la microscopia. No obstante, los especmenes con tincin de Gram
son tiles porque las muestras de esputo que poseen menos
de 10 neutrfilos por clula epitelial escamosa representan
probablemente saliva, ms que esputo, e indican que el cultivo puede ser engaoso. Cuando se sospecha una infeccin
micobacteriana, se examinan los preparados teidos de auramina y se confirman positivos con la realizacin de muestras frescas y teidas con el mtodo de Ziehl-Neelsen.
Las desventajas del esputo se superan en buena medida
con la prctica del lavado bronquioalveolar, un procedimiento empleado cada vez ms en el diagnstico de neumona en los sujetos muy enfermos o inmunosuprimidos.
Las muestras obtenidas estn libres de la contaminacin de
la flora de las vas respiratorias superiores y pueden examinarse por las tcnicas de tincin de Gram, auramina y
Ziehl-Neelsen, adems de las tcnicas de inmunofluorescencia para las especies de Legionella y un amplio espectro
de agentes patgenos protozoarios, micticos y vricos.
Lesiones de la piel
Los escobillados de lesiones de la piel encierran escaso
valor diagnstico debido a la presencia de la flora normal
de la piel, con una excepcin notoria: el examen microscpico del material raspado de las lesiones purpricas
relacionadas con la infeccin meningoccica. En sta, la
presencia de cocos gramnegativos en pares, con su aspecto
caracterstico, es diagnstica.
Escobillados bucales
La microscopia es el nico mtodo que diagnostica la angina
de Vincent (estomatogingivitis anaerbica), puesto que los
microorganismos causales (que actan de modo sinrgico
para provocar la infeccin) no se pueden cultivar de mane-
Pus y escobillados de heridas

El valor de la microscopia de estas muestras es variable
y depende de ciertos factores, ms all del control del
128
CAP. 10
laboratorio. El pus o escobillados de pus de sitios como la

piel o infecciones de tejidos blandos puede sugerir infeccin con estafilococos, estreptococos o anaerobios, mientras que las muestras similares de sitios intraabdominales
pueden mostrar un cuadro mezclado, no siempre fcil de
relacionar con los hallazgos posteriores del cultivo. En
muchos de estos casos, la administracin previa de antibitico puede explicar las discrepancias. Sin embargo, es a
menudo til suministrar un informe provisional indicativo
de que es probable una muestra o escobillado de pus, por
ejemplo, originada por estafilococos o, de manera alternativa, de que los microorganismos mezclados tienen un probable origen fecal.
Escobillados vaginales altos
Las muestras con tincin de Gram se utilizan para determinar la presencia de clulas de pus y tambin la de clulas
epiteliales cubiertas con pequeos bacilos gramvariables
(clulas indicativas). El hallazgo de estos ltimos es un
indicador de un trastorno conocido como vaginosis bacteriana. En medicina genitourinaria, los escobillados uretral
y endocervical se examinan para reconocer clulas de pus
que contienen cocos intracelulares gramnegativos en pares,
esto es, Neisseria gonorrhoeae (vase fig. 10-4).
(b)
Figura 10-4 Espcimen de una supuracin uretral que ilustra numerosos cocos intracelulares gramnegativos de Neisseria
gonorrhoeae (1 000 ). Cortesa de J. Winning.
Bishop BJ, Neumann G. The history of the Ziehl-Neelsen stain.
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11
Medios de cultivo en bacteriologa
Eric Y Bridson
Medios de cultivo en microbiologa

Bulloch escribi la historia de las plagas y pestes desde los
primeros registros del gnero humano hasta principios del
siglo xx. Aunque los trminos contagio e infeccin se
usaban ya en tiempos medievales, el papel de los diminutos
agentes infecciosos no pudo probarse sino hasta el trabajo
de Louis Pasteur (1822-1895). En buena medida, el trabajo
de este cientfico supuso la demolicin de las teoras de
Galeno sobre la enfermedad infecciosa y la generacin espontnea de la vida microscpica.
Sin embargo, el padre de los medios de cultivo fue
Robert Koch (1843-1910; fig. 11-1), quien cre los mtodos para el cultivo, aislamiento e identificacin de las bacterias. Primero Pasteur demostr que stas eran la causa
de la infeccin en seres humanos, animales y alimentos,
pero slo el trabajo de Koch confirm que agentes patgenos especficos ocasionaban enfermedades especficas.
En esencia, el trabajo de Koch consisti en apartarse de
los cultivos lquidos, con sus meticulosas diluciones y frecuente contaminacin, y adoptar una simple pero poderosa
tcnica que usaba un medio slido. Al agregar gelatina, y
ms tarde agar, a su caldo de extracto de carne cre la placa
rayada con sus colonias aisladas. Ms tarde demostr que
al mezclar de forma cuidadosa material sospechoso dentro
del medio fundido y verterlo en una placa se produca una
valoracin cuantitativa de los nmeros bacterianos, una tcnica utilizada ahora en extenso en la forma de la placa rayada. Richard Petri, uno de los asistentes de Koch, reemplaz
la placa de vidrio de Koch por la placa de Petri. Este diseo
permaneci sin cambio por ms de 100 aos.
Koch fue consciente de que un medio universal para
bacterias patgenas era imposible. Mostr tambin que
Mycobacterium tuberculosis no poda crecer sobre el me-
Figura 11-1 Robert Koch (1843-1910), el padre de los medios

de cultivo.
dio de agar de infusin de carne. Para este microorganismo

utiliz suero coagulado, huevo o papa rebanada. A finales
del siglo XIX un libro de texto de bacteriologa mdica describa siete medios. La adicin ms importante al caldo de
infusin de carne de Koch fue la peptona, un digerido pptico de protena que sugiri Loeffler. Este ltimo tambin
incorpor 0.5% de peso/volumen de cloruro de sodio y su
medio de nutrimentos es a la fecha el cimiento de los medios de cultivo complejos e indefinidos para microorganis-
130
CAP. 11
MEDIOS DE CULTIVO EN BACTERIOLOGA
mos quimiohetertrofos (es decir, aquellos que requieren

utilizar compuestos de carbn orgnico, en oposicin a las
bacterias auttrofas, las cuales sintetizan compuestos de
carbn a partir del dixido de carbono).
Muchas formulaciones ms de medios de cultivo surgieron en las primeras dcadas del siglo XX, cuando los medios
de enriquecimiento y seleccin y los indicadores se idearon para agentes patgenos aislados en reas que no eran
mdicas, como la agricultura, manufactura de alimentos
y bebidas, farmacutica, etc. Alrededor de 1930, un estudio sobre medios describi 2 540 formulaciones, muchas
de ellas variaciones pequeas de los medios ya publicados.
El nmero creci en proporcin enorme desde entonces,
pero ningn estudio similar se repiti.
Formulacin de los medios de cultivo

Las formulaciones empleadas para los diversos medios
pueden contener tan poco como tres ingredientes (caldo
nutriente de Loeffler) hasta 10, como muchos medios para
microorganismos exigentes. El nmero de ingredientes tiene poca relacin con su crecimiento. Un cultivo simple
puede ser complejo y del todo indefinido. Una estructura
comn de los medios de cultivo para agentes patgenos
quimiohetertrofos es la siguiente:
Base amina-nitrgeno (peptona, protena hidrolizada, infusin o extracto de protena). Pocos agentes patgenos
pueden utilizar protenas coaguladas; se proporcionan
los derivados predigeridos o cidos hidrolizados. Los
pptidos y aminocidos se pueden transferir dentro de
la clula y usarse como fuentes de carbn para energa
o polimerizacin de las protenas funcionales.
Factores de crecimiento suplementarios (sangre, suero, extracto de levadura, nucletidos, vitaminas). Los
microorganismos descritos como nutricionalmente exigentes, como Neisseria, Bordetella, Legionella, exigen
factores de crecimiento adicionales. El considerable beneficio de la sangre entera en estos microorganismos se
atribuy con anterioridad a los factores de crecimiento
agregados. Se considera ahora que el papel principal de
la sangre entera es proteger a los agentes patgenos vulnerables de los procesos txicos de la oxidacin.
Fuentes de energa, excepto pptidos (azcares, alcoholes y carbohidratos complejos). Estas sustancias casi
siempre se agregan a los medios indicadores para realzar
los cambios de pH de los microorganismos que pueden
fermentar la fuente de energa. Los patgenos quimiohetertrofos pueden metabolizar muchas otras molculas
orgnicas para proporcionar energa.
Sales amortiguadoras (fosfatos, acetatos, citratos).

Los amortiguadores suelen agregarse a las formulaciones con grandes cantidades de carbohidratos (p. ej., las
que contienen peptona de soya) para prevenir los cambios excesivos de los niveles de pH. Infortunadamente, muchos amortiguadores tienden a quelar metales
esenciales y deben utilizarse con cautela. Los pptidos
y aminocidos pueden actuar como agentes amortiguadores a travs del efecto zwitterion de las agrupaciones
NH2/COOH.
Sales minerales y metales (fosfatos, sulfatos, Ca++,
Mg++, Fe++, Mn++, metales traza). Estas sustancias pueden adicionarse por separado como macrocantidades o
microcantidades en los casos en que son evidentes las
demandas particulares. Es importante que los metales se
hallen en la forma soluble y no formen complejos dentro de las formas insolubles durante el procesamiento de
calor. Por lo general se asume que los tejidos de plantas
o animales hidrolizados contienen suficientes minerales
y metales para el crecimiento ptimo.
Agentes selectivos (qumicos, antimicrobianos y algunos colorantes de anilina). Como lo seala su nombre,
estos agentes se agregan en una concentracin suficiente para inhibir a los agentes patgenos indeseables, pero
se permite la multiplicacin de microorganismos seleccionados. Se requiere un cuidado extremo al determinar
la concentracin ptima en el medio. Todos los agentes
selectivos poseen cierta toxicidad para algunas especies
y es posible que de forma ocasional no supriman a todas las especies indeseables. Una regla general es que
cualquier incremento de los nutrimentos en el medio
requiere un aumento del agente selectivo y viceversa.
Los agentes selectivos pueden interactuar en forma mutua para acentuar o atenuar su selectividad; por ejemplo,
las sales biliares disminuyen la toxicidad de los colorantes. Los agentes selectivos pueden tambin afectarse
por sustancias (p. ej., casi todos los amortiguadores) que
quelan cationes; por ejemplo, ciertos colorantes y sales
biliares pueden volverse ms txicos. Este efecto puede
revertirse con la adicin de cationes (Mg/Ca).
Colorantes indicadores (rojo fenol, rojo neutral, bromocresol morado). Estos colorantes indican cambios en el
valor del pH posteriores a la fermentacin, desaminacin
o descarboxilacin. Los medios de cultivo cromgenos
desarrollados para indicar colonias que producen actividades enzimticas especficas son casi siempre mezclas
de colorantes indicadores. Todos los colorantes requieren
cuidadosa dosificacin para evitar la inhibicin selectiva.
Agentes de gelificacin (agar, gelatina, alginato, gel de
slice). El agar extrado de las especies de algas marinas
MEDIOS DE CULTIVO DEFINIDOS Y MEDIOS COMPLEJOS INDEFINIDOS
del genero Gelidium es el agente habitual de gelificacin

para el crecimiento de los microorganismos quimiohetertrofos. Aunque la calidad del agar mejor mucho desde
sus comienzos, no puede considerarse un gel polmero
inerte. ste aporta metales, minerales y piruvatos que
pueden influir en el crecimiento de los microorganismos.
No todos los agares son similares: las diferencias de la
fuente del agarofito y los procesos industriales de extraccin pueden inducir un desempeo significativamente
diferente en el crecimiento y la difusin del antibitico.
Las ocho categoras de materiales mencionadas cubren casi todas las variaciones de las formulaciones publicadas de
los medios de cultivo. Detalles adicionales sobre estos materiales y su manufactura pueden encontrarse en otras obras.
Enriquecimiento y seleccin en medios lquidos

Los procesos de enriquecimiento y seleccin en medios
lquidos no son mutuamente excluyentes. Por lo general,
el enriquecimiento se describe como un proceso que incrementa los nmeros de un agente patgeno desde menos
de 10 clulas hasta cantidades detectables. Los caldos enriquecidos pueden contener factores de crecimiento que se
adicionan para reducir la fase de retraso de los nmeros
bajos de microorganismos. Cultivar sangre es el ejemplo
ms comn de dicho proceso de enriquecimiento.
En una poblacin microbiana mezclada, el trmino enriquecimiento tambin se utiliza cuando una especie se selecciona para el crecimiento preferencial. Para ello se
emplean formulaciones especficas, incluidos qumicos
selectivos o electivos, y ajustes del pH o una temperatura
favorable de incubacin. En los medios lquidos rara vez
es posible incrementar de manera particular el agente patgeno deseado y suprimir a los dems microorganismos
presentes. Las dinmicas de crecimiento de cultivos mixtos
de agentes patgenos en caldo son complejas. Los microorganismos indeseables pueden retrasarse por un periodo inicial, pero pueden invadir despus a los agentes de inters.
Aunque los periodos fijos de incubacin y subcultivo
suelen determinarse por las horas de trabajo del laboratorio, en realidad pueden no ser ideales para la recuperacin
exitosa de agentes patgenos particulares. La funcin ms
importante de los caldos enriquecidos es elevar el nmero
de microorganismos deseados a valores que resulten suficientes para un asa del caldo de subcultivo para producir un
nmero cuantificable de colonias reconocibles sobre placas
de agar selectivas. Es probable que 104 microorganismos
patgenos/ml en el caldo sea la cifra mnima para la deteccin por este mtodo.
Debe recordarse que la funcin de los caldos enriquecidos se determina por los resultados del subcultivo para
131
un medio slido selectivo. La interaccin entre qumicos

selectivos en el caldo y aquellos presentes en la placa de
agar puede inhibirse para nmeros pequeos de agentes
patgenos. El caldo de tetrationato subcultivado con agar
de MacConkey puede registrar nmeros ms grandes de
salmonelas o shigelas respecto de cuando se subcultiva en
agar de desoxicolato-citrato.
En suma, los siguientes factores afectan en grado significativo el enriquecimiento exitoso de microorganismos
particulares de medios lquidos: a) la formulacin de los
medios y sus agentes selectivos; b) el tamao del inculo de
los microorganismos deseados; c) los nmeros y la variedad
de los agentes patgenos competidores; d) la presencia/ausencia de material orgnico en el caldo; e) la temperatura de
incubacin; f) el periodo anterior al subcultivo; g) la interaccin de los componentes de enriquecimiento del caldo con
la placa de agar selectiva usada para el subcultivo.
No es de sorprender que las publicaciones muestren
demasiadas opiniones contrapuestas en relacin con este
asunto, si se considera la complejidad de la posible variacin de los resultados finales.
Medios de cultivo definidos

y medios complejos indefinidos
Hasta mediados del siglo xx los microbilogos aceptaron
que los medios de cultivo eran ms bien preparados culinarios y no formulaciones cientficas. Casi sin excepcin,
todos los ingredientes empleados eran materiales naturales
variables indefinidos. El comportamiento del crecimiento vari en grado amplio y esto suscit el deseo de crear
medios sintticos o qumicamente definidos que reprodujeran un comportamiento estndar. Entre 1950 y 1975, los
microbilogos intentaron fusionar aminocidos, nucletidos, vitaminas, minerales y metales seleccionados para
que crecieran agentes quimiohetertrofos al mismo ritmo
y con las mismas caractersticas que en medios indefinidos. Las revistas microbiolgicas de ese periodo contenan
cientos de frmulas de medios de cultivo, pero todas ellas
mostraban comportamientos del crecimiento inferiores respecto de los medios indefinidos o se limitaban slo a unas
cuantas especies. Ninguna poda recomendarse como un
medio de enriquecimiento general para microbios mdicos.
La dificultad de idear y probar medios definidos, junto con
los decepcionantes resultados obtenidos, propici al final
una prdida de inters. Un factor fue el reemplazo de los
medios de materia prima preparados en el laboratorio con
productos equivalentes deshidratados preparados de modo
comercial. Los beneficios de las mejores especificaciones
de las materias primas, manufacturas controladas a gran
escala y la prueba rigurosa del control de calidad superaron
los principales problemas de variacin del comportamiento
132
CAP. 11
del medio. En fecha ms reciente, los medios preparados

comerciales sustituyeron en gran medida a la preparacin
elaborada con anterioridad en los laboratorios de microbiologa.
Aunque resulte paradjico, en 1966 un nuevo medio
de agar sangre indefinido apareci bajo el nombre de agar
Columbia. Este agente contena una mezcla precisa de
peptonas de diversas fuentes de protenas, hidrolizadas
por enzimas diferentes, lo cual creaba un amplio espectro de pptidos, desde el aminocido ms grande posible
(peso molecular [PM] = 5 000) hasta el ms simple (PM
= 100). Un gramo de almidn, 5 g de cloruro de sodio y
12 g de agar componan la frmula. El agar Columbia, un
complejo medio indefinido, se ha convertido en el medio
de enriquecimiento utilizado de forma ms amplia, en las
formas de caldo y agar, para recuperar una amplia variedad de agentes patgenos exigentes. Esto pareca ser un
triunfo de quienes deseaban reemplazar tales medios con
formulaciones sintticas o definidas.
El dilema de los medios definidos o indefinidos no se ha
resuelto todava. Al parecer, los hidrolizados de protena y
los factores de crecimiento son los dos grupos de materiales
que pueden ocasionar ms dificultades. Parecera que las
mezclas de aminocidos no pueden sustituir a una mezcla
compleja de pptidos. Es posible que se requiera una seleccin amplia de varios factores de crecimiento para asegurar
la recuperacin de microorganismos atenuados o exigentes.
Es improbable que un medio definido comparable al agar
Columbia pueda desarrollarse o justificarse sobre la relacin costo-beneficio.
Factores ambientales de crecimiento

La presencia de nutrimentos esenciales del crecimiento
no garantiza por s misma el desarrollo ptimo de los microorganismos deseados. Todos los medios de cultivo son
susceptibles a la oxidacin si se exponen a la luz, calor y
aire, es decir, fotooxidacin, termooxidacin y quimiooxidacin. Alguna vez se consider que los procesos de oxidacin afectaban en grado menor a los microbios patgenos
quimiohetertrofos aerbicos y anaerbicos facultativos y
slo los anaerobios obligados los padecan. Ahora es evidente que todos, salvo unas pocas especies bien protegidas,
son vulnerables a los efectos de la oxidacin. Los radicales txicos de oxgeno (superxido, singletos, hidroxilos)
formados por los electrones capturados adicionales pueden
daar a los cidos nucleicos y las enzimas. Para protegerse, los microorganismos producen enzimas protectoras que
pueden neutralizar a estos radicales txicos. Son ejemplos
la catalasa, dismutasa de superxido y peroxidasa. Algunos aminocidos son secuestradores efectivos de oxidantes
txicos. Pueden adicionarse agentes protectores a los
medios de cultivo para el mismo propsito, como sangre

completa, carbn vegetal, piruvato y sales de hierro reducidas. Puede ser esencial incluir estos agentes para los agentes patgenos que son en particular vulnerables, por ejemplo Neisseria, Bordetella, Campylobacter, Legionella. Los
componentes sulfhidrilo, como tioglucolato y cistena, se
agregan a los medios anaerbicos para reducir el potencial
de oxidacin-reduccin con grupos -SH, que neutralizan a
los agentes txicos oxidantes. Algunos medios se autooxidan en el autoclave, sobre todo los medios que contienen
cistena, glucosa, fosfatos y algunos metales.
Actividad del agua

Los microorganismos tienen agua libre en la cual crecen y
esto se aplica en especial a las placas de agar. El traslado de
nutrimentos a la colonia y la movilizacin del residuo txico desde sta dependen del agua libre presente en el agar.
El agua puede estar ligada o formar complejos con tanta
firmeza con las protenas o polmeros que los microorganismos no pueden utilizarla. El hielo es una forma de agua
ligada y otras se refieren a menudo como cuasi-hielo.
El lmite biolgico de la actividad del agua es de 0.97
(1.00 si es agua pura) a 0.61 (la superficie del pescado seco
salado). Slo los hongos xerfilos pueden crecer (con lentitud) en la cifra ms baja. Los medios lquidos son casi
siempre convenientes para el crecimiento de todos los agentes patgenos, a menos que se adicionen solutos al medio
(cloruro de sodio o glicerina) para atenuar la actividad del
agua y hacerla selectiva para estafilococos u hongos.
Las placas de agar recin preparadas tienen concentraciones satisfactorias de agua libre, pero en el almacenamiento la evaporacin reduce la actividad del agua de la
superficie del agar. Las placas de agar supersecas o demasiado almacenadas pueden ser inhibitorias, muestran
colonias pequeas y no pueden recuperar los inculos
atenuados (fig. 11-2).
Almacenamiento de los medios de cultivo

Una regla bsica seala que los medios recin preparados
son mejores que los almacenados. Sin embargo, rara vez es
posible preparar medios justo antes de usarse y por tanto
es inevitable alguna forma de almacenamiento. Los medios de cultivo almacenados se deben utilizar estrictamente
por turnos para evitar almacenamientos demasiado largos.
Todos los contenedores de medios deben fecharse y numerarse por lote.
Los medios de cultivo deben almacenarse lejos de la luz
para prevenir la fotooxidacin. Todos los medios lquidos se
almacenan en frascos o tubos cerrados, de preferencia con
133
PRUEBAS DE CALIDAD
Colonias pequeas
Gel de gran fuerza
Colonias lenticulares
Colonias grandes
Gel de baja fuerza
Colonias esfricas
Figura 11-2 Efecto de la prdida de agua en las placas de agar. a) Reduccin del tamao de las colonias superficiales. b) Cambios en
la forma de las colonias sumergidas, de esfrica a lenticular.
tapones de rosca, a 2 a 8C, excepto el caldo de tioglucolato, que se preserva mejor a 15 a 22C. Los medios lquidos,
sin antibiticos u otros ingredientes lbiles, pueden almacenarse por muchas semanas en el fro y lejos de la luz.
Las placas vertidas deben almacenarse a 2 a 8C, empaquetadas en pelcula de plstico adherente. sta es preferible a las bolsas de polietileno que retienen la humedad
en la forma de acumulaciones de lquido en cada bolsa.
La vida til en estantera de las placas preparadas depende
de la formulacin y las condiciones de almacenamiento y
transporte al laboratorio. Con placas empaquetadas en pelculas semipermeables y almacenadas en cajas de poliestireno expandido en la temperatura correcta, la vida til de
estantera puede ser de muchos meses. No deben conservarse o usarse las placas tras ese lapso. Una inspeccin til
consiste en medir la prdida de agua durante el almacenamiento. Una prdida de peso de 5% sugiere que las placas
alcanzaron un estado terminal.
Pruebas de calidad
La mayor parte de los laboratorios microbiolgicos adquiere medios de cultivo en formas deshidratadas o preparadas.
La responsabilidad de la prueba de calidad ha recado en
los fabricantes y stos deben proporcionar los detalles de
su protocolo y resultados de prueba a los compradores individuales. No obstante, debe advertirse que estas pruebas se
han llevado a cabo en medios de cultivo recin elaborados
y que el tiempo de almacenamiento, antes y despus de la
entrega, puede reducir la calidad del medio.
El aumento del uso de los medios preparados ha protegido a los medios de cultivo con agar de los efectos oxidativos complejos e impredecibles de la esterilizacin por
autoclave de los medios de cultivo insolubles. El descenso
de los valores del pH y el oscurecimiento del color indican
sobrecalentamiento, que da lugar a que se formen complejos de carbohidrato-pptido.
Cuando se prueban medios de cultivo comprados deben
ser suficientes tres cepas seleccionadas de microorganismos
apropiados. Pueden adquirirse cepas estndar de microorganismos patgenos y es preciso realizar una valoracin
cuantitativa. Los medios selectivos deben probarse para la
inhibicin de microorganismos indeseables, al igual que
para el enriquecimiento de cepas seleccionadas.
Si se elige un nuevo proveedor o se firm un gran contrato, entonces puede ser apropiada una prueba ms extensa
mediante un control de medios inoculados en paralelo. Se
utilizan inculos pequeos e incluso algunos agentes patgenos atenuados en la prueba. Snell y colaboradores (1991)
proporcionan ms informacin sobre este tema.
La recuperacin de microorganismos atenuados en la
prueba del control de medios de cultivo se estudia cada
vez ms. Los aislados microbiolgicos clnicos estn con
frecuencia atenuados puesto que son agentes patgenos
aislados de alimentos calentados o procesados. Los microorganismos muy atenuados, viables pero no cultivables,
representan una forma extrema de atenuacin. Stephens y
colegas (1997) usaron Salmonella atenuada de laboratorio
y mostraron que la recuperacin de estos agentes patgenos variaba entre la misma formulacin de medios de cultivo de diferentes fabricantes. Este trabajo demostr una
134
CAP. 11
distribucin muy amplia de tiempos de retraso entre las diferentes marcas del mismo medio cuando se utiliz un solo
inculo de clulas, con algunos tiempos de retraso de ms
de 20 horas. En el pasado, los fabricantes de medios empleaban una mezcla de aislados clnicos y cepas NCTC/ATCC
estndar de microorganismos para probar lotes de medios
de cultivo. El uso de aislados clnicos se ha suspendido en
la industria y slo las cepas estndar de agentes patgenos
son de uso general. Estos microorganismos no se atenan
cuando se reconstituyen de forma apropiada y pueden ocultar deficiencias en los lotes de medios de cultivo. El uso de
cepas estndar, atenuadas en el laboratorio por la exposicin a temperaturas altas o bajas, se investiga cada vez ms
y podran reemplazar la prdida de aislados clnicos.
El futuro de los medios de cultivo

La placa de agar de Koch, que es barata, simple y muy
verstil, es un amplificador muy poderoso de inculos pequeos. Si la preparacin es apropiada, crecen todos los
microorganismos esperados y muchos insospechados de
las muestras. Los dispositivos modernos de diagnstico
que tal vez sustituyan a la microbiologa convencional son
costosos, complicados y muy especficos. Es probable que
la microbiologa convencional no se modifique demasiado
en este siglo.
Indudablemente, se dispondr de mejoras metodolgicas, como el marcado semiautomtico, la inoculacin y
sealizacin con tecnologa de pelcula mediante microscopia lser confocal para la deteccin temprana del crecimiento y los marcadores de identificacin incorporados
para la actividad especfica enzimtica. Se observar una
mejor recuperacin de los agentes patgenos daados en la
fase de retraso de crecimiento. Estos procedimientos mejorados de recuperacin han de despejar las dudas sobre
algunas teoras de esterilizacin cinticas existentes y resolvern algunos de los misterios que rodean a los microorganismos viables pero no cultivables. El viejo axioma
bacteriolgico lo que no crece, no existe desaparecer.
Es improbable que la microbiologa se lleve a cabo por automatizacin, de modo similar a la bioqumica o la hematologa. Gran parte de la actividad en microbiologa consiste
en igualar imgenes de colonias o campos del microscopio
con el banco de datos que contiene la cabeza del microbi-
logo. El cerebro humano es increblemente mejor en ese

quehacer que cualquier computadora.
Microbiologa cuntica
Las grandes poblaciones de microbios se adecuan a las
reglas taxonmicas, pero las clulas individuales exhiben
incertidumbres causadas por la mutacin y adaptacin a los
ambientes locales. Tales clulas representan variantes que
pueden convertirse en los ancestros de la siguiente poblacin seleccionada. Las mutaciones son procesos cunticos
en los que intervienen molculas que son impelidas sobre
una barrera de energa desde una configuracin estable a
otra diferente. Las sustancias qumicas complejas siguen
las leyes de la mecnica cuntica y la ciencia de las clulas
microbianas individuales se puede llamar microbiologa
cuntica. Existe una analoga entre la fsica clsica/mecnica cuntica y la microbiologa clsica/microbiologa
cuntica. Ahora se necesita un sistema para estudiar las
clulas individuales.
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12
Andrew J Hay
Introduccin
La identificacin de bacterias en poco tiempo y con exactitud es una capacidad que requiere muchos aos de experiencia en el laboratorio. El propsito de este captulo es
describir la tcnica que adoptaron los laboratorios clnicos
britnicos para reconocer bacterias comunes de importancia mdica. Se pretende que el lector adquiera una visin
bsica del proceso y sea capaz de consultar los excelentes
textos detallados con ms seguridad.
Las bacterias pueden identificarse de modo directo en
las muestras de los pacientes o, ms a menudo, en el crecimiento posterior de los microorganismos en cultivos. Aunque se consideran por separado, estos dos mtodos pueden
combinarse.
Identificacin directa
Microscopia
Las bacterias pueden visualizarse en muestras clnicas
mediante microscopia y uso de colorantes; aunque es til,
proceder de esta manera rara vez permite la identificacin
completa. En la actualidad, la tincin de Gram es el procedimiento diferencial ms utilizado en los laboratorios de
bacteriologa clnica. Existen muchas modificaciones, pero
el principio es el mismo. Se aplica una solucin de violeta
de metilo seguida por una solucin de yodo a una preparacin de bacterias fijada por calor en un portaobjetos del
microscopio. Despus de lavarse, la preparacin se expone
a un decolorante (alcohol o acetona) por algunos segundos,
antes de que se aplique una contratincin roja (p. ej., safra-
nina). Las bacterias grampositivas no se decoloran con alcohol o acetona y se tien de prpura. Las bacterias gramnegativas se decoloran y permiten que las clulas adquieran la
contratincin roja. Esta reaccin depende de las diferencias
estructurales de la pared celular entre las bacterias grampositivas y gramnegativas. Tambin se tienen en cuenta el
tamao y la forma de las bacterias: redondas (cocos) o en
bastones (bacilos).
Sin embargo, muchas bacterias se tien mal o no lo hacen
en absoluto con la tincin de Gram, por ejemplo, las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis que requieren
tinciones acidorresistentes, como la tincin de ZiehlNeelsen. Estas tinciones se basan en el principio de que
ciertas bacterias, despus de teirse con soluciones calientes
de carbol fucsina, pueden resistir la accin decolorante del
cido clorhdrico y el alcohol. Las modificaciones de estas
tinciones permiten visualizar otras bacterias, por ejemplo las
especies de Nocardia.
En el pasado se usaron tinciones con anticuerpos fluorescentes para detectar bacterias especficas, como Legionella, pero hoy da el desempeo deficiente imposibilita su
uso en la bacteriologa regular.
Deteccin de anticuerpos y antgenos
Estas pruebas son tiles para las bacterias que no se cultivan de rutina en medios slidos, como las espiroquetas, y
los agentes patgenos intracelulares obligados Rickettsia,
Coxiella y Chlamydia. Las infecciones consecutivas a estos
gneros se diagnostican casi siempre por la deteccin del anticuerpo en el suero (serologa) o, en el caso de la infeccin
genital por Chlamydia, por la identificacin del antgeno.
136
CAP. 12
IDENTIFICACIN DE BACTERIAS
La deteccin del antgeno puede usarse para el diagnstico

rpido de infecciones bacterianas graves, como en los casos
de meningitis; los antgenos bacterianos en el lquido cefalorraqudeo pueden reconocerse con la aglutinacin en ltex.
Una variacin es la deteccin de un producto bacteriano,
por ejemplo, el uso de un inmunoensayo enzimtico para
identificar la toxina de Clostridium difficile en las heces, un
causante de la diarrea relacionada con antibiticos.
Mtodos moleculares
Desde la ltima edicin de este libro se han observado progresos importantes en el campo de la bacteriologa molecular diagnstica. Aunque es verdad que algunas de estas
tcnicas experimentan la transicin de un laboratorio de
investigacin y referencia a uno de bacteriologa clnica, el
crecimiento del nmero de reactivos de prueba disponibles
en el comercio representa una posibilidad distinta para el
futuro prximo, en particular si el costo relativamente alto
de estos mtodos moleculares puede reducirse. Algunos
ejemplos se proporcionan ms adelante.
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y las
sondas gnicas han sido satisfactorias en la identificacin
rpida de Mycobacterium tuberculosis en muestras clnicas.
Los mtodos convencionales toman varias semanas para
identificar a este agente patgeno de lento crecimiento. De
forma similar, las pruebas de amplificacin de los cidos
nucleicos, como PCR o reaccin en cadena de la ligasa, se
recomiendan para el diagnstico de la infeccin genital por
Chlamydia trachomatis. En muestras de heces, la PCR se
utiliza para reconocer genes que codifican a las verotoxinas
de Escherichia coli, como E. coli O157. La deteccin simultnea del DNA de Neisseria meningitidis, Streptococcus
pneumoniae y Haemophilus influenzae en el lquido cefaloraqudeo o sangre completa por PCR mltiple se ha convertido en un procedimiento invaluable en el diagnstico rpido
de la meningitis bacteriana. Tambin se han desarrollado
sistemas comerciales para la deteccin rpida (menos de tres
horas) de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina y
especies de Enterococcus resistentes a la vancomicina mediante PCR en tiempo real (Roche Diagnostics, Mannheim,
Alemania). Estos mtodos deben permitir el inicio temprano
de la quimioterapia antimicrobiana efectiva y las precauciones de control de la infeccin, con lo cual se mejoran los
resultados clnicos. En otros captulos se discuten de modo
ms detallado los mismos mtodos.
Identificacin despus del cultivo
conduce a demorar informes o suministrar resultados engaosos de laboratorio.

El material clnico debe colocarse en medios primarios
de aislamiento, de tal manera que buena parte del crecimiento consista en colonias bien aisladas (fig. 12-1). Las colonias
obtenidas deben examinarse de manera cuidadosa con una
lente de mano y buena iluminacin, y las colonias aisladas
se seleccionan y transfieren para la investigacin a un medio
no selectivo mediante un alambre recto y mano firme. Si este
proceso falla para proporcionar un crecimiento adecuado de
un cultivo puro, debe repetirse. Acortar el proceso en esta
etapa retrasa la identificacin, se desperdician reactivos y
tal vez se produzcan resultados engaosos; esto es frustrante para el bacterilogo y el clnico y supone un tratamiento
potencialmente incorrecto para el paciente.
Debe observarse que en esta etapa se utiliza un medio
no selectivo, ya que los medios primarios de aislamiento
selectivos o inhibitorios interfieren a menudo con las tcnicas de identificacin bioqumicas y otras subsiguientes.
El arte de la identificacin
Cuando se analiza una placa de aislamiento primario que
contiene hasta una docena de agentes patgenos o especies
diferentes de bacterias comensales, y se sabe adems que
casi cualquier bacteria puede ocasionar la enfermedad, el
bacterilogo principiante puede desesperarse ante el apremio de proporcionar un informe significativo. Sin embargo,
la experiencia en examinar estas placas, combinada con el
conocimiento del sitio muestreado, el cuadro clnico, los
probables agentes patgenos y la flora comensal, suministra
una idea razonablemente exacta de los microorganismos que
requieren identificacin y pruebas de sensibilidad. Este enfoque permite al bacterilogo elegir las pruebas que pueden
conducir a la identificacin rpida del agente patgeno.
Si lo anterior no puede confirmar al agente causal ms
probable, el investigador debe actuar con mente abierta y
ampliar las investigaciones. Esta conducta, que se conoce
como el mtodo progresivo, requiere el establecimiento de
algunas caractersticas fundamentales del microorganismo
y, a partir de stas, los grupos subsecuentes de pruebas se
eligen hasta identificar al agente patgeno.
Por ltimo, si todo lo anterior falla, puede adoptarse el
mtodo del trabuco, en el cual se realiza cada prueba y se
compara con las descritas en textos de bacteriologa. Rara
vez es necesario, pero se requiere para verificar, por ejemplo, una nueva especie.
Cultivo puro
Identificacin preliminar
El primer paso en la identificacin de una bacteria consiste

en establecer un cultivo puro. Esto no siempre es posible y
La capacidad de las bacterias para crecer bajo condiciones

aerobias o anaerobias, sus requerimientos de crecimiento,
137
IDENTIFICACIN DESPUS DEL CULTIVO
Depsito del inculo

Se flamea
el asa
Asa de
alambre
Se flamea
el asa
El material clnico se aplica en
un tercio de la placa con agar
Se flamea
el asa
El material se extiende hacia

fuera desde el depsito del
inculo. La placa se incuba
Despus de la incubacin se elige

una sola colonia bien aislada mediante un alambre recto a partir
del crecimiento mezclado
El microorganismo se extiende
hacia fuera como en (b). La placa
se incuba
Se transfiere la colonia a una

placa no selectiva capaz de
mantener el crecimiento
Se obtiene un cultivo puro
Figura 12-1 Forma de establecer un cultivo puro.
morfologa de la colonia, efecto sobre el medio (p. ej., hemlisis en agar-sangre), motilidad en medio lquido, capacidad para formar esporas, y aspecto y reaccin en la
tincin de Gram permiten efectuar una identificacin preliminar. El uso subsiguiente de algunas pruebas simples y
rpidas indica entonces qu tcnicas adicionales (si acaso)
se requieren para concluir la identificacin.
cuidado cada vez que se realizan, por ejemplo mediante

cepas testigo y reacciones conocidas.
Despus de la tincin de Gram: la caja

de herramientas de los bacterilogos
1. Prueba de la catalasa. Los microorganismos que producen catalasa, cuando se exponen al perxido de hidrgeno, producen burbujas visibles en un plazo de 30
segundos. Esta prueba puede ayudar a distinguir a los
estafilococos, que son positivos a la catalasa, de los estreptococos, que son negativos.
Como un artesano, el bacterilogo experto selecciona las

herramientas requeridas para completar la identificacin
basada en los resultados de la morfologa de las colonias
y la tincin de Gram. Estas pruebas pueden agruparse en
amplias categoras, que se enumeran a continuacin. Pueden realizarse de forma secuencial o simultnea, segn sea
el microorganismo a identificar. Deben controlarse con
Deteccin de enzimas
La capacidad de una bacteria para producir una enzima se
demuestra al exponerla a un sustrato y detectar el producto
resultante. Las pruebas comunes son las siguientes:
2. Prueba de la oxidasa. Esta prueba investiga la presencia

de la oxidasa de citocromo. Las bacterias positivas a la
oxidasa, como Pseudomonas, pueden oxidar el reactivo
138
CAP. 12
diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina para precipitar un cambio de color. Enterobacteriaceae son negativos a la oxidasa.
3. Prueba de la ureasa. Ciertas especies producen una enzima potente que degrada la urea hasta amoniaco; este
ltimo se puede detectar por un cambio de color con un
indicador de pH incorporado en el medio de crecimiento. Esta prueba ayuda a diferenciar Proteus mirabilis,
positivo a la ureasa, un comensal del intestino, de Salmonella spp. y Shigella spp., agentes patgenos intestinales importantes que son negativos.
4. Prueba de la coagulasa. Staphylococcus aureus posee
una enzima que coagula al plasma in vitro. Otros estafilococos son negativos.
Esta lista no es exhaustiva. Existen muchas otras pruebas,
que a menudo son incorporadas en reactivos comerciales.
Enterobacteriaceae que no la fermentan, y agar de tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS), que reconoce a Vibrio

cholerae que fermenta la sacarosa de otras especies. Otras
pruebas detectan la capacidad del agente patgeno para
utilizar un carbohidrato como fuente nica de carbn, por
ejemplo, la utilizacin del citrato. Los paneles de carbohidratos pueden probarse de forma conveniente y simultnea
con reactivos comerciales.
Factores de crecimiento
El requerimiento absoluto de compuestos definidos para el
crecimiento bacteriano en un medio particular se utiliza
como herramienta para la identificacin; as, las especies
de Haemophilus difieren en sus requerimientos por dos
factores presentes en la sangre, X (hematina) y V (nucletido de difosfopiridina), para el crecimiento en agar nutritivo. Slo Haemophilus influenzae, el agente patgeno ms
importante del gnero, requiere de ambos.
Deteccin del antgeno

Metabolismo de protenas
La deteccin de antgenos celulares por antisueros especficos se utiliza con amplitud en bacteriologa para determinar la especie y el tipo de microorganismos. Dos ejemplos
son los siguientes:
1. Clasificacin de Lancefield. Un antgeno del grupo de
la pared celular se extrae a partir de los estreptococos
hemolticos beta por una enzima. El antgeno se detecta
entonces por la aglutinacin con el antisuero unido a las
partculas del ltex.
2. Tipificacin O y H. Los antgenos de la pared celular (O) y antgenos flagelares (H) se reconocen en
bacilos gramnegativos como Salmonella, tras mezclar
suspensiones de microorganismos con antisuero especfico sobre un portaobjetos o un tubo de ensayo. Una
reaccin positiva se observa por la aglomeracin de los
microorganismos.
Metabolismo de los carbohidratos
La capacidad de un microorganismo para utilizar ciertos
azcares como glucosa, sea por oxidacin (aerobio) o fermentacin (independiente del oxgeno), u otros carbohidratos, como almidn, es casi siempre una caracterstica til en
la identificacin. La prueba requiere un medio definido que
contenga al carbohidrato y un sistema de deteccin para el
producto metablico, a menudo un indicador de pH.
La utilizacin del azcar puede incorporarse en medios
primarios de aislamiento, como agar de MacConkey, que
distingue Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa de
Se somete a prueba la capacidad de una especie bacteriana

para metabolizar una protena o un aminocido a un producto definido. Los sistemas de deteccin para el producto
y la necesidad de un medio especfico son similares a los
requeridos para la utilizacin del carbohidrato. Es el caso
de diversas especies de Enterobacteriaceae que divergen en
su capacidad para lo siguiente: a) licuefaccin de la gelatina; b) descarboxilacin o desaminacin de aminocidos;
c) produccin de cido sulfhdrico a partir de aminocidos
que contienen azufre, y d) elaboracin de indol a partir de
triptfano. Estas pruebas se realizan a menudo con productos comerciales.
Pruebas de susceptibilidad
La susceptibilidad de una especie a un compuesto se puede
utilizar no slo para precisar el tratamiento con antibiticos, sino tambin para contribuir a la identificacin. Dos
ejemplos de uso general son representativos, ambos probados mediante la colocacin de un disco de papel filtro, que
contiene el compuesto, sobre una placa de cultivo; la muestra se incuba y despus se observa una zona de inhibicin.
1. Prueba con optocina. Streptococcus pneumoniae es
sensible a la optocina (clorhidrato de etilhidrocuprena).
Otros estreptococos similares en agar-sangre son resistentes.
2. Sensibilidad al metronidazol. Los anaerobios verdaderos casi siempre son sensibles a este antibitico. Los
IDENTIFICACIN DESPUS DEL CULTIVO
aerobios que pueden crecer de forma anaerobia son invariablemente resistentes.

Produccin de toxinas
Esta importante caracterstica puede ayudar a diferenciar
las especies patgenas de las que no lo son. Ejemplos:
1. Prueba de Elek. Esta prueba se utiliza para diferenciar
cepas de Corynebacterium diphtheriae productoras de
toxinas (por lo tanto patgenas), que causan la difteria,
de especies no patgenas. Se coloca una tira del papel filtro que contiene la antitoxina de la difteria sobre un medio
definido. El microorganismo se extiende sobre el agar de
forma perpendicular a la tira. Despus de la incubacin
pueden verse las lneas precipitantes que representan al
complejo antgeno (toxina)-anticuerpo (antitoxina).
2. Citotoxina. Se puede detectar una citotoxina que producen las cepas de Clostridium difficile relacionadas con
diarrea y antibiticos por la neutralizacin de la antitoxina en un cultivo celular.
Sistemas de identificacin comercial
El desarrollo de los sistemas comerciales para la identificacin rpida de bacterias patgenas ha simplificado en gran
medida la vida del bacterilogo clnico. Antes de su introduccin, cada prueba bioqumica tena que prepararse de
modo individual en un tubo de ensayo o botella de cristal,
lo que conduca a la exhibicin de una impresionante cristalera de laboratorio. Los sistemas comerciales permiten
que muchas pruebas bioqumicas se realicen de manera simultnea a partir de un cultivo puro. El patrn obtenido de
los resultados de la prueba se compara entonces con los patrones derivados de bacterias conocidas conservadas en un
banco de datos automatizado. Las pruebas estadsticas se
utilizan para determinar la identidad probable del aislado
clnico. El banco de datos tambin puede sugerir pruebas
adicionales si la identificacin es dudosa. Los sistemas de
uso general en el Reino Unido son los sistemas API y Vitek,
ambos comercializados por Bio Merieux (Bio Merieux UK
Ltd, Basingstoke, England), BD Phoenix (BD Diagnostic
Systems Europe, Le Pont de Claix, France) y Mastascan
elite (Mast Group Ltd, Bootle, Merseyside, UK).
1. Sistema de identificacin API (appareils et precedes
didentification). Este sistema consiste en cpulas de
plstico que contienen diversos sustratos y productos
qumicos indicadores fijados a una tira plstica. Cada
cpula comprende una prueba bioqumica diferente. La
adicin de un inculo estndar del agente patgeno de
prueba a cada cpula en la tira, despus de la incuba-
139
cin, precipita una serie de cambios de color que puede

advertirse a simple vista. El patrn de los resultados obtenidos puede interpretarse con facilidad al compararlo
con el banco de datos. Se dispone de tiras modificadas
para la identificacin de estafilococos, estreptococos,
bacterias coriniformes, Enterobacteriaceae, anaerobios
y bacterias gramnegativas que no fermentan.
2. Sistemas Vitek y BD Phoenix. Estos sistemas se basan en
principios similares. Las pruebas bioqumicas se realizan
de manera simultnea en celdillas insertadas en una tarjeta plstica (Vitek) o tira (BD Phoenix). Las celdillas se
llenan con la suspensin bacteriana mediante aspiracin
por vaco (Vitek) o vaciamiento (BD Phoenix). Despus
de la incubacin, un lector modificado controlado por
computadora analiza las tarjetas y los sistemas automatizados interpretan los resultados. Se produce una gama de
tarjetas para identificar bacterias comunes de importancia
mdica, a menudo en un plazo de cuatro a seis horas. Las
ventajas de estos sistemas incluyen la capacidad de realizar la prueba de susceptibilidad antibitica, la semiautomatizacin que requiere poco tiempo del operador y un
sistema incluido para mayor seguridad del laboratorio.
3. lite de Mastascan. Este sistema emplea la inoculacin de
puntos mltiples en medios de identificacin con cajas
de Petri. Despus de la incubacin, las placas se exponen a
un lector que analiza e interpreta de manera automtica
las pruebas de identificacin incorporadas en los medios
de prueba. El sistema tambin permite la comprobacin de
la susceptibilidad antibitica y la inoculacin directa de las
placas con muestras de orina, de tal modo que se elimina la necesidad del cultivo primario de orina.
Todos los sistemas requieren un apego estricto a las instrucciones del fabricante para prevenir errores. La omisin
de comenzar con un cultivo puro es una fuente comn de
error que puede evitarse si se inocula una placa para purificar la tarjeta o la tira mediante la suspensin de inoculacin
usada. Si la placa muestra un crecimiento inconsistente, las
pruebas se repiten. Los bacterilogos inexpertos aceptan a
menudo los resultados de estos sistemas sin objecin, sin
importar qu tan improbables pueden ser en clnica. Los
trabajadores experimentados interpretan los resultados en
su contexto clnico y confirman o repiten identificaciones
improbables o inusuales.
Nuevos desarrollos
Tcnicas moleculares
Como ya se explic, los mtodos moleculares son tiles para reconocer los agentes patgenos que crecen con
140
CAP. 12
trado la produccin de impresiones digitales espectrales

caractersticas de la masa que permiten la identificacin en
el lapso de minutos despus de remover una colonia de una
placa de cultivo. Aunque slo el tiempo establecer si esta
tcnica se ha de incorporar al laboratorio clnico comn,
representa sin duda un desarrollo interesante.
lentitud y los incultivables en muestras clnicas. Adems,

se han adoptado estos mtodos para la tipificacin de bacterias por laboratorios de investigacin y de referencia o
bien para la caracterizacin de nuevas especies.
Es en particular apasionante el desarrollo de la tecnologa de DNA con chip, como los microensayos de DNA,
en los cuales se producen los millares de oligonucletidos
localizados en un soporte slido (chip). Tienen aplicacin
para secuenciar productos de la PCR. Asimismo, estn
disponibles los chips bioelectrnicos que utilizan campos
elctricos para mover muestras hacia las diferentes reas
analticas; visto de cierto modo, se trata de un laboratorio
en un chip. Para una discusin adicional, vase Nolte y
Caliendo (2003).
de importancia mdica
La siguiente es una breve introduccin a la identificacin
de bacterias de relevancia mdica. Para mayor informacin, vanse las Lecturas adicionales.
Espectrometra de masas
Cocos grampositivos
Los avances en las tcnicas de espectrometra de masas

han estimulado su aplicacin al campo de la identificacin
bacteriana. Por ejemplo, la espectrometra de masas con
ionizacin por desorcin de lser asistida por matriz en
tiempo de vuelo de microorganismos intactos ha demos-
La capacidad de un coco grampositivo de producir catalasa

es una prueba rpida y til que diferencia gneros positivos
a la catalasa, como Staphylococcus y Micrococcus, de los
gneros negativos, como Streptococcus y Enterococcus. La
identificacin siguiente se relaciona con la figura 12-2.
Cocos aerobios grampositivos

Staphylococcus
Micrococcus
Positiva
Prueba de la
catalasa
Streptococcus
Enterococcus
Negativa
Crecen de
forma anaerbica
Hemlisis
en agar-sangre
Ninguna
No
Prueba
de la
coagulasa
Negativa
N gea tiive
Estafilococos
coagulosa
negativos
Hidrlisis
de la esculina
Tolerancia de 40%
a sales biliares
Enterococcus
Grupo de
Lancefield
Sensible a
la optocina
Soluble en
sales biliares
No
Positiva
S
Micrococos
Staphylococcus
aureus
Reactivo
comercial
Especies
individuales
Streptococcus
viridans
Strep. pneumoniae
Grupo A = Streptococcus
pyogenes
Grupo B = Streptococcus
agalactiae
Grupo C = Streptococcus
Grupo G = Streptococcus
Figura 12-2 Identificacin de cocos aerobios grampositivos de relevancia mdica.
Reactivo
comercial
Especies
individuales
IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA MDICA
Staphylococcus y Micrococcus
Estos gneros positivos a la catalasa producen de modo caracterstico clulas dispuestas en racimos cuando crecen en
medio lquido. Los estafilococos se pueden diferenciar de
los micrococos por su capacidad para crecer bajo condiciones anaerobias.
Staphylococcus aureus, una causa comn de infeccin
de la piel, las heridas y el pulmn, se puede diferenciar de
otros estafilococos comensales de la piel por su capacidad
para coagular el plasma y producir la enzima termoestable
DNAasa. La actividad de la coagulasa se reconoce en pocas horas, lo que proporciona una identificacin rpida y
confiable. Las cepas de estafilococos negativas a la coagulasa pueden clasificarse de acuerdo con su especie mediante reactivos comerciales.
Streptococcus y Enterococcus
En medio lquido estos gneros negativos a la catalasa producen clulas dispuestas en pares o cadenas. En agar-sangre
producen colonias con un dimetro de 0.1 a 1.0 mm despus
de 24 horas de incubacin y el tipo de hemlisis observada
alrededor de las colonias suministra una clasificacin inicial
de utilidad.
Los estreptococos hemolticos beta se demuestran mejor
en los cultivos con crecimiento anaerobio. Las cepas que
producen aclaramiento completo del medio de crecimiento que contiene sangre alrededor de la colonia (hemlisis
beta) incluyen varias especies patgenas importantes que
se diferencian por la clasificacin de Lancefield. Esto puede realizarse por las pruebas comerciales en menos de una
hora. Por lo general, lo anterior es suficiente para completar
la identificacin, aunque los reactivos bioqumicos comerciales de la prueba se pueden utilizar en casos de duda.
Los estreptococos hemolticos alfa producen hemlisis parcial (hemlisis alfa), una decoloracin verdosa del
medio de crecimiento que contiene sangre alrededor de la
colonia. La especie patgena ms importante es el neumococo, Streptococcus pneumoniae. ste se diferencia de
la otra especie hemoltica alfa por el aspecto de su colonia
(colonias delineadoras), sensibilidad a la optocina y solubilidad de sus colonias en una solucin de sales biliares.
Otras especies hemolticas alfa se encuentran como comensales en las vas respiratorias superiores, pero pueden
causar de modo ocasional sepsis grave, como la endocarditis bacteriana subcutnea. Pueden clasificarse de acuerdo
con su especie mediante reactivos comerciales.
De manera caracterstica, los enterococos no son hemolticos en agar-sangre, aunque las cepas individuales pueden
mostrar hemlisis alfa o beta. Los enterococos, al contrario
de la mayor parte de los estreptococos, pueden crecer en
141
un medio que contiene 40% de bilis y pueden hidrolizar la

esculina; estas propiedades se utilizan para identificarlos en
el laboratorio clnico. Poseen a menudo el antgeno grupo
D de Lancefield y pueden clasificarse de acuerdo con su
especie, si se requiere, con reactivos comerciales.
Bacilos grampositivos
Los gneros de relevancia mdica se identifican de manera inicial por el aspecto de sus colonias, capacidad para
formar esporas y necesidad de condiciones de crecimiento
aerobias o anaerobias (fig. 12-3).
Bacillus y Clostridium
Estos gneros formadores de esporas pueden diferenciarse
por la catalasa y las condiciones requeridas para el crecimiento. Las especies de Clostridium, negativas a la catalasa, incluyen anaerobios estrictos. Los bacilos son positivos
a la catalasa y todos crecen de forma aerbica. Clostridium
perfringens, la causa de la gangrena gaseosa, se puede
identificar de manera preliminar por la prueba de Nagler,
que detecta una enzima especfica, la lecitinasa, que produce esta especie. Ambos gneros pueden clasificarse de
acuerdo con su especie con pruebas bioqumicas.
Listeria y Corynebacterium
Estos gneros aerobios, no formadores de esporas, pueden
confundirse con cualquier otro en medios de aislamiento
primario. Listeria monocytogenes, un causante de sepsis
y meningoencefalitis, muestra motilidad en volteretas
caracterstica en caldo de cultivo a temperatura ambiente,
pero no a 37C, puede hidrolizar la esculina y es a menudo hemoltica beta en agar-sangre. Corynebacteria spp.
comprende comensales de la piel, patgenos oportunistas
y varios microorganismos de importancia. Pocas especies
son hemolticas beta. El agente patgeno ms importante
es Corynebacterium diphtheriae, que puede aislarse a partir de escobillados de la garganta en medios selectivos que
contienen telurito. Las cepas toxgenas se identifican con
la prueba de Elek.
Cocos gramnegativos
Existen tres agentes patgenos humanos importantes en
este grupo: Neisseria gonorrhoeae (el gonococo), que provoca la gonorrea; Neisseria meningitidis (el meningococo),
un causante de septicemia y meningitis, y Moraxella catarrhalis, un factor de infecciones respiratorias y oculares.
142
CAP. 12
Bacilos grampositivos
S
No
Forma
esporas
Crece de
forma aerbica
Produccin de
catalasa
S
Bacillus
Crece de
forma aerbica
Hidrlisis de
Positiva
la esculina
Listeria
Motilidad a temperatura
monocytogenes
ambiente
No
No
Pruebas
bioqumicas
Negativo
Filamentos
ramificados
Clostridium
Reaccin
de Nagler
Negativa
Positiva
Especies
individuales
Corynebacterium
Pruebas
bioqumicas
Prueba de la
toxina
Reactivos
comerciales
Coriniformes
Otras especies
Especies de
Actinomyces
Clostridium
perfringes
Corynebacterium
diphtheriae
Figura 12-3 Identificacin preliminar de bacilos grampositivos de importancia mdica.
Deben distinguirse entre s y de otras especies que son comensales humanos comunes mediante las caractersticas
de crecimiento y pruebas bioqumicas (cuadro 12-1). Son
positivos a la oxidasa y catalasa.
Bacilos aerobios gramnegativos
Requerimientos simples para el crecimiento
Los sistemas comerciales simplificaron en gran media la
identificacin de este grupo; empero, todava se requieren
algunas pruebas simples para el examen externo de la flora

comensal de agentes patgenos potenciales y la eleccin de
la tarjeta o la tira correcta de la prueba (fig. 12-4). La prueba de la oxidasa es una investigacin preliminar til que
toma apenas algunos segundos. Los gneros negativos a
la oxidasa abarcan muchas especies que son comensales y
patgenas del tracto gastrointestinal (Enterobacteriaceae).
La fermentacin de la lactosa se observa casi siempre en
el agar de MacConkey que apoya el crecimiento de estos
microorganismos en el aislamiento primario. Los no fermentadores de la lactosa pueden examinarse mediante la
Cuadro 12-1 Identificacin de cocos aerobios gramnegativos de importancia mdica
cido de*
Glucosa
Maltosa
Lactosa
Sacarosa
Crece en agar nutritivo
Tributirina**
DNAasa
Neisseria
gonorrhoeae
Neisseria
meningitidis
Especies comensales
de Neisseria
Moraxella
catarrhalis

v
v
v
v
v

v variable, segn sea la especie.

* prueba realizada en medio libre de suero.
** detecta la capacidad de la bacteria para descomponer el tributirato de glicerilo.
143
IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA MDICA
Bacilos aerobios gramnegativos
Requerimientos para
el crecimiento
Fermenta
azcares
Positiva
Exigentes
Simple
Oxidasa
Morfologa
+
cultivo
Filamentos
curvos
Microaerobios
Crece a 43C
Negativa
No
No
Fermenta
azcares
Vibrio
Pasteurella
Aeromonas
Sistemas
comerciales
Fermentacin
de lactosa
Especies
individuales
Cocos-bacilos
Especies individuales
Stenotrophomonas
S
Acinetobacter
Negativa
Ureasa
Positiva
Campylobacter
Positiva
Negativa
Proteus
Pseudomonas
Sistemas
comerciales
No
Escherichia
Klebsiella
Enterobacter
Salmonella
Shigella
Sistemas
comerciales
Sistemas
comerciales
+
serologa
Coco-bacilo
5-10% CO2
Haemophilus
Bordetella
Brucella
Figura 12-4 Identificacin preliminar de bacilos aerobios gramnegativos de importancia mdica.
prueba de la ureasa o con un reactivo comercial para la

presencia posible de Salmonella y Shigella, que luego se
confirma con ms pruebas bioqumicas y de aglutinacin
O (Salmonella y Shigella) y H (slo Salmonella). Los
gneros positivos a la oxidasa pueden diferenciarse: aquellos que fermenten azcares, como Vibrio y Aeromonas, y
los no fermentadores, como Pseudomonas. Pueden requerirse diferentes tiras y tarjetas de pruebas comerciales para
fermentadores y no fermentadores.
Haemophilus spp. se aslan habitualmente a partir de

muestras respiratorias. Se clasifican de acuerdo con su especie por sus requisitos distintos de los factores X y V para
el crecimiento en agar nutritivo. De modo inicial, Bordetella se puede identificar por la aglutinacin con el antisuero
especfico. El agente patgeno Brucella puede clasificarse de acuerdo con su especie (casi siempre por los laboratorios de referencia por razones de salud y seguridad),
susceptibilidad a la fucsina y la tionina de los colorantes,
requerimiento para la produccin de CO2 y H2S.
Requerimientos estrictos para el crecimiento

Anaerobios
Dentro de este grupo, Campylobacter spp. se identifica con
facilidad por su morfologa y capacidad para crecer en una
atmsfera microaerobia a 42C, pero no en el aire a 37C.
Haemophilus, Bordetella y Brucella son bacilos muy
pequeos, sobre todo gramnegativos inmviles que crecen
comparativamente mal en agar-sangre y poco o nada en lo
absoluto en agar de MacConkey. Esto les permite diferenciarse con facilidad de Pseudomonas y Enterobacteriaceae.
Requieren medios enriquecidos, que contienen sangre para
el aislamiento primario y la adicin de 5 a 10% de CO2
mejora el crecimiento.
Los anaerobios estrictos se diferencian por su incapacidad

para crecer en presencia de oxgeno y la sensibilidad al metronidazol, detectada por un disco colocado en la placa de
aislamiento primario. Pueden clasificarse en relacin con su
especie mediante reactivos comerciales o la identificacin
de sus productos metablicos por cromatografa de gaslquido. Sin embargo, esto se realiza rara vez en laboratorios
clnicos, a menos que el anaerobio se asle a partir de un sitio estril, como sangre o tejido blando. Los gneros grampositivos incluyen Peptostreptococcus (cocos), Clostridium
144
CAP. 12
y Actinomyces (bacilos). Los gneros gramnegativos comunes incluyen Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas (bacilos anaerobios) y Veillonella (cocos).
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13
Pruebas automatizadas en bacteriologa
Paul C Boreland
Automatizacin: uso del equipo automtico para

ahorrar trabajo mental y manual. The Concise Oxford
Dictionary.
encuentran con regularidad en los laboratorios de microbiologa clnica del Reino Unido.
Sistemas de cultivo sanguneo

Introduccin
Aunque la instrumentacin automatizada se introdujo en
el laboratorio clnico de microbiologa unos 30 aos antes,
muchos clnicos han mostrado cierta renuencia a aceptar
del todo este sistema. Esto se debe en parte a una actitud
conservadora entre los microbilogos, que perpetan el uso
de los mtodos para detectar el crecimiento de microorganismos desarrollados a finales del siglo xix. Otros factores relevantes son la variedad y naturaleza de las muestras
sometidas a anlisis, la mayor complejidad de las pruebas microbiolgicas, la dificultad de integrar un instrumento a las prcticas de laboratorio existentes, adems de que
muchas de las primeras mquinas no se fabricaron de forma
adecuada. Pese a ello, los recientes progresos en tecnologa
y la interconexin bidireccional entre los instrumentos y
los sistemas informticos del laboratorio han hecho ahora
de la automatizacin una alternativa prctica y rentable.
En la actualidad, los instrumentos son parte integral de
muchos laboratorios de microbiologa clnica y el equipo
automatizado est disponible para el reconocimiento de
cultivos sanguneos positivos, la comprobacin de la sensibilidad antimicrobiana, la identificacin de agentes patgenos, el examen de las muestras de orina para bacterias y el
aislamiento y la sensibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis en muestras clnicas. No se describe en
este captulo la totalidad de los sistemas automatizados que
pueden hallarse en el mercado mundial, pero s los que se
La deteccin rpida de microorganismos en la sangre es

importante para el diagnstico y el pronstico. Por lo tanto,
los cultivos sanguneos son esenciales en el diagnstico y
el tratamiento de los agentes etiolgicos de la septicemia.
Como sta constituye una de las enfermedades infecciosas
ms graves, la identificacin rpida de los patgenos bacterianos de la sangre es una funcin esencial del laboratorio
de microbiologa clnica. En consecuencia, en los ltimos
30 aos se desarrollaron y perfeccionaron los sistemas automatizados del cultivo sanguneo. El primer instrumento
semiautomatizado empleado, el BACTEC 460 (Johnston
Laboratories Inc.), reconoci dixido de carbono radiactivo metabolizado por microorganismos que crecan en un
medio lquido con 14C incorporado. Esto condujo pronto
al desarrollo del BACTEC 660/730 no radiomtrico que
utiliz la deteccin infrarroja del dixido de carbono.
Con posterioridad surgi un buen nmero de instrumentos por completo automatizados, cada uno de los cuales se
compone de tres unidades bsicas: una incubadora, un detector y una computadora. Los recipientes o los frascos de
cultivo sanguneo inoculados se colocan en estantes y pueden o no agitarse. Cada envase se vigila de modo continuo
en relacin con el crecimiento cada 10 a 15 minutos y la
computadora analiza los datos por medio de un algoritmo
predeterminado e indica cundo un cultivo es positivo. Si se
identifica un recipiente positivo, puede retirarse del sistema
para aislar e identificar al agente patgeno. A diferencia de
146
CAP. 13 PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN BACTERIOLOGA
los instrumentos ms antiguos, el crecimiento microbiano

se cuantifica por medios no invasivos. La mayor parte de
los mtodos de deteccin se basa, directa o indirectamente,
en la produccin de gases (en particular dixido de carbono) o los cambios del pH que resultan del crecimiento de
microorganismos en el caldo de cultivo.
Las series BACTEC 9000 (9240, 9120, 9050) de los instrumentos para cultivo sanguneo (Becton Dickinson) se
disean para reconocer en poco tiempo agentes patgenos
en muestras clnicas. La muestra se inocula en un frasco,
que se introduce en el instrumento para la incubacin y la
lectura peridica. En la base de cada frasco existe un sensor
de pH que contiene fluoroqumicos que reaccionan con el
dixido de carbono insertados en una matriz. El dixido de
carbono que producen los microorganismos al metabolizar los nutrimentos en el medio de cultivo, se difunde a
travs de la matriz y ello propicia una disminucin del pH
que detectan los fluoroqumicos. Los fotodetectores del
instrumento miden de forma especfica el grado de fluorescencia que emite el sensor cada 10 minutos, un aumento el
cual es proporcional a la cantidad creciente de dixido de
carbono o a la cantidad decreciente de oxgeno presente en
el envase. Las mediciones se interpretan con un programa
de computadora de acuerdo con parmetros de positividad
preestablecidos.
El sistema BacT/Alert 3D (bioMerieux) incuba, agita y
vigila de modo continuo el crecimiento de microorganismos en cultivos sanguneos. Unido a la base de cada recipiente con cultivo sanguneo, se coloca un sensor colorimtrico cubierto por una membrana de exclusin inica que
es permeable al dixido de carbono pero impermeable a los
iones de hidrgeno libres, los componentes del medio y la
sangre completa. Cuando el dixido de carbono se libera
por el crecimiento de los agentes patgenos, se difunde a
travs de la membrana, disminuye el pH y se inicia un cam-
Figura 13-1 Deteccin de la produccin acelerada de dixido

de carbono a partir del crecimiento microbiano. Reproducido con
la autorizacin de bioMerieux.
bio de color del sensor, de verde a amarillo. Este cambio lo

reconoce una luz reflejante a partir de un diodo que emite
luz roja fuera del sensor sobre un fotodiodo (fig. 13-1). La
seal del voltaje producida es proporcional a la intensidad
de la luz reflejada y por tanto a la concentracin del dixido de carbono en el recipiente. Los datos obtenidos por la
computadora se trazan como una curva de crecimiento de
unidades de reflexin contra el tiempo.
antimicrobiana y sistemas de identificacin
La identificacin y comprobacin de la sensibilidad antimicrobiana de aislados bacterianos son dos de las tareas
ms importantes del laboratorio de microbiologa clnica.
Varios sistemas estn disponibles, desde los instrumentos
semiautomatizados hasta los automatizados por completo,
y casi todos ofrecen la identificacin de agentes patgenos,
as como la comprobacin de la sensibilidad antimicrobiana con opciones de incubacin convencional o rpida
y tiempos de anlisis. Algunos instrumentos disponen de
tiras que pueden inocularse de forma automtica o manual,
incubarse externamente y despus colocarse en un lector,
que interpreta reacciones de color y los puntos finales del
crecimiento. Con los sistemas por completo automatizados, las celdillas o las tarjetas de la microdilucin se incuban dentro del instrumento que, de manera continua, vigila
e interpreta el crecimiento o las reacciones bioqumicas.
Cada sistema requiere un paso de estandarizacin del
inculo en condiciones normales con un densitmetro, para
medir la densidad bacteriana, que puede expresarse en unidades McFarland. Para el reconocimiento de los cambios
de color o crecimiento en el medio lquido que contiene
los sustratos o las diluciones de los antibiticos, la mayor
parte de los lectores automticos emplea una combinacin
de tres mtodos de medicin de luz: a) transmisin de la luz
en cuatro regiones del espectro, la colorimetra; b) intensidad de la luz transmitida, que es inversamente proporcional
a la cantidad de crecimiento bacteriano, la turbidimetra, y
c) intensidad de la luz dispersada a 30, que es directamente proporcional a la cantidad de crecimiento bacteriano, la
nefelometra. Las mediciones de la luz se convierten con
facilidad en impulsos elctricos y luego se cuantifican.
Algunos instrumentos utilizan la hidrlisis del sustrato
fluorgeno para identificar el crecimiento bacteriano y pueden proporcionar resultados en un plazo de cuatro a cinco
horas. Todos los sistemas estn equipados con una computadora y programas capaces de interpretar los resultados a
partir de un lector. Las concentraciones inhibitorias mnimas (CIM) producidas se derivan de un algoritmo o valores de corte; de ese modo se identifican microorganismos a
partir de una base de datos que contiene varios biocdigos
y efecta anlisis estadsticos y epidemiolgicos.
COMPROBACIN DE LA SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA Y SISTEMAS DE IDENTIFICACIN
El sistema Vitek (bioMerieux) utiliza tarjetas reactivas

de plstico del tamao de una tarjeta de crdito que contienen cantidades pequeas del medio de crecimiento y antibiticos o medios de pruebas bioqumicas en celdillas de
prueba. Las tarjetas estn disponibles para la identificacin
de 300 especies de bacterias y levaduras y una gama de
17 antibiticos a los cuales aqullas resultan susceptibles
(S), intermedias (I) o resistentes (R); tambin proporcionan
resultados de la CIM. Cada tarjeta de identificacin cuenta
con 30 celdillas de reaccin que contienen diversas pruebas
bioqumicas, sin la necesidad de agregar reactivos. La tarjeta de la sensibilidad contiene 45 celdillas de reaccin que
incluyen una gama de 17 antibiticos, cada uno presente
sobre lmites de concentracin. Las pruebas especficas
para deteccin de los mecanismos de resistencia tambin
se incluyen en esta tarjeta. El sistema cuenta con un mdulo de llenado y sellado para la inoculacin y el cierre
hermtico de las tarjetas, adems de una incubadora y un
lector; las tarjetas se sostienen en un carrusel y los cambios
de color bioqumico y la densidad ptica se miden por medios fotomtricos cada hora. El sistema utiliza mediciones
cinticas determinadas de modo turbidomtrico del crecimiento en presencia de antibiticos para realizar anlisis de
regresin lineal y, por ltimo, para determinar las CIM derivadas del algoritmo.
Por lo regular, los resultados estn disponibles en un
plazo de cuatro a 18 horas, con la identificacin y la sensibilidad antimicrobiana de un microorganismo individual
que se deriva del anlisis computarizado de los datos.
El Vitek 2 es una versin automatizada del Sistema Vitek, con procesamiento automatizado y anticipacin de la
muestra, incluidos la dilucin inicial del inculo, la verificacin de la densidad y los pasos de llenado y sellado de
la tarjeta. El instrumento transfiere de forma automtica las
tarjetas al lector-incubadora y las traslada a un compartimiento de eliminacin al trmino de la comprobacin. El
sistema permite el anlisis cintico tras analizar las pruebas
cada 15 minutos. El sistema ptico combina las lecturas de
multicanales del fluormetro y el fotmetro para registrar
seales fluorescentes de turbiedad y colorimtricas. El sistema Vitek 2 emplea una tarjeta con 64 celdillas y permite
el escrutinio hasta con 20 antibiticos.
El sistema de microbiologa automatizado Phoenix (Becton Dickinson) usa un recipiente de plstico moldeado y
sellado mediante autollenado, con los depsitos de inoculacin en la tapa para llenado, y contiene 136 microceldillas.
Se utiliza con el instrumento para probar la identificacin del
microorganismo o la sensibilidad antimicrobiana (AST), o
una combinacin de ambos.
Para la identificacin bacteriana, el rea para la identificacin del panel de la mquina Phoenix utiliza una serie de
pruebas bioqumicas convencionales, cromgenas y fluo-
147
rgenas en 51 celdillas. Los sustratos basados en el crecimiento y las enzimas se emplean para cubrir los diversos
tipos de reactividad dentro de los lmites establecidos. Las
pruebas se basan en la utilizacin y la degradacin microbianas de sustratos especficos detectados por varios sistemas indicadores. La produccin de cido se indica por
un cambio en el indicador rojo de fenol cuando un aislado
es capaz de utilizar un carbohidrato como sustrato. Los
sustratos cromgenos producen un color amarillo sobre la
hidrlisis enzimtica de los compuestos p-nitrofenilo o pnitroanilida. La hidrlisis enzimtica de sustratos fluorgenos resulta de la liberacin de un derivado fluorescente
de la cumarina. Los microorganismos que usan una fuente especfica de carbn reducen el indicador basado en
reazurina. Adems, existen otras pruebas que detectan la
capacidad de un agente patgeno de hidrolizar, degradar,
reducir o utilizar en otra forma un sustrato.
La prueba de sensibilidad antimicrobiana mediante el
sistema Phoenix se basa en la microdilucin y usa un indicador redox para la deteccin del crecimiento del agente
patgeno en presencia de un antibitico. Las mediciones
continuas de los cambios del indicador, as como de la turbiedad, se emplean en la determinacin del crecimiento
bacteriano. Cada configuracin del panel de AST contiene
varios antibiticos con una extensa gama de concentraciones de doble dilucin. La identificacin del microorganismo tambin se utiliza en la interpretacin de valores CIM
de cada antibitico.
El Sensititre ARIS (AccuMed International Ltd) detecta
crecimiento bacteriano por medio de compuestos conocidos como fluorforos. stos consisten en diversos sustratos, como pptidos y steres, ligados a los compuestos
que emiten luz fluorescente: 4-metilumbeliferona (4 MU)
y 7-aminometilcumarina (7 AMC). En condiciones normales, estos complejos no son fluorescentes, pero durante el
crecimiento bacteriano se producen enzimas especficas
que inciden sobre los sustratos de los fluorforos, lo que
posibilita que la 7 AMC o la 4 MU despidan fluorescencia
bajo luz ultravioleta. La sensibilidad a un antibitico especfico se registra como la ausencia de fluorescencia, es
decir, ningn crecimiento, y la resistencia como fluorescencia debido a la produccin enzimtica de bacterias que
crecen en forma activa. Por lo regular, los resultados toman
slo cuatro a cinco horas, pero pueden requerir incubacin
por toda la noche. El sistema se integra con un inoculador,
una incubadora, un fluormetro que lee la fluorescencia a
450 m y una computadora. Las pruebas se realizan en celdillas sobre bandejas preparadas de microtitulacin y los
programas emplean un algoritmo que interpreta las seales
y produce el punto de corte o los resultados de la CIM. El
sistema de identificacin trabaja de modo similar e incluye
slo las pruebas bioqumicas que puedan producir fluores-
148
cencia o registrar su ausencia. El microorganismo se identifica con una base de datos de la computadora.
Mastascanelite (Mast Group Ltd) es un sistema modular nico que utiliza la tecnologa de multipunto para
inocular en agar una dilucin para pruebas de sensibilidad
antimicrobiana, punto de corte y CIM, adems de pruebas
bioqumicas de identificacin. Consiste en un analizador
que contiene una cmara de video a color, un inoculador de
multipunto y una computadora. Las esferillas liofilizadas
y predosificadas con antibiticos se emplean para preparar
el punto de corte y las placas para CIM y observar tambin
diversos cultivos para el reconocimiento bacteriano. Las
placas de agar se inoculan con 96 diferentes microorganismos, se incuban y el crecimiento se visualiza con 19 o 36
macrocolonias. Despus, stas se colocan en el analizador
y la cmara de video las inspecciona en los puntos predeterminados. Los tres colores bsicos, rojo, azul y verde, se
emiten como seal elctrica cuantitativa al microanalizador, que convierte las seales en nmeros. Para el punto
de corte y las placas CIM, en los cuales la sensibilidad o
la resistencia se definen como crecimiento o ausencia del
mismo, las seales de tres colores se combinan para producir el equivalente de una seal en blanco y negro. Cuando
se examinan las placas de agar para la identificacin bioqumica, los detalles de los colores medidos se usan para
definir resultados positivos o negativos de los diversos microorganismos probados. La tecnologa de multipunto puede tambin utilizarse para examinar la orina.
La creciente necesidad de contar con mtodos estandarizados y cuantitativos de la AST, como los que recomienda
la British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC)

o el National Committee on Clinical Laboratory Standards
(NCCLS), ha llevado a varios fabricantes a producir los
instrumentos semiautomatizados basados en la tecnologa
de difusin con disco, la cual requiere la medicin exacta de
los dimetros de la zona de inhibicin. Los instrumentos
Aura Image (Oxoid Ltd), BIOMIC (Giles Scientific Inc.),
Mastascanelite (Mast Group Ltd), Osiris (Sanofi Diagnostic Pasteur) y Sirscan 2000 (i2a Montpellier) son sistemas
de anlisis de imagen que utilizan una cmara de video para
medir el dimetro de la zona de inhibicin e interpretar los
resultados de las placas de agar para sensibilidad mediante
la difusin con disco. La placa de agar se coloca en un recipiente corredizo motorizado y aparece una imagen clara
con los dimetros calculados en la pantalla de video. Una
zona de inhibicin se interpreta como S, I, R de acuerdo
con las tablas BSAC/NCCLS para antibiticos.
La mayor parte de los sistemas tiene un sistema experto
basado en reglas programadas por el usuario y una base de
datos epidemiolgica detallada.
Sistemas de examen de la orina

El examen de las muestras de orina para identificar bacteriuria y piuria representa una proporcin considerable de
la carga de trabajo y el costo del funcionamiento de un laboratorio de microbiologa clnica. Tan slo 20 a 30% de
estas muestras produce resultados clnicos de importancia
y, por lo tanto, se han hecho varias tentativas de automati-
Figura 13-2 Anlisis de las partculas de la orina mediante citometra de flujo y medicin de la impedancia. Reproducido con autorizacin de Sysmex UK Ltd.
SISTEMAS DE IDENTIFICACIN Y SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANAS PARA MICOBACTERIAS
zar el proceso para prevenir la obtencin de muestras negativas. Es preciso contar con un instrumento que detecte
bacterias y otras partculas en la orina, como eritrocitos y
leucocitos, procese las muestras con rapidez y tenga un alto
valor predictivo negativo. En la actualidad slo est disponible un instrumento que emplea la tecnologa de partcula
que satisface estos criterios.
El UF-100 (Sysmex UK Ltd) combina la citometra de
flujo con la deteccin de la impedancia para reconocer y
contar directamente las clulas y los microorganismos en
la orina (fig. 13-2). Cada muestra de orina se mezcla con un
diluyente y se agrega un colorante fluorescente dual con
afinidad por el DNA y el RNA. La muestra teida se enva
entonces a una celda de flujo, que irradia un lser de argn.
Los rayos lser se dispersan por las clulas de la muestra y
la luz dispersada hacia adelante (fluorescente y no fluorescente), que es proporcional al rea de seccin transversal
de las clulas, se cuantifica mediante un fotodiodo. Un fotomultiplicador calcula la fluorescencia emitida, que indica
el grado de nucleacin de la clula. Mediante cinco seales
de altura y anchura fluorescentes y no fluorescentes, ms las
mediciones de la impedancia, el instrumento distingue las estructuras celulares tridimensionales en sus tipos y cantidades celulares apropiadas y cuenta los microorganismos. La
distribucin celular se puede mostrar en diagramas de dispersin e histogramas, con el programa Adaptive Cluster
Analysis.
Sistemas de identificacin y sensibilidad

antimicrobianas para micobacterias
La reaparicin de tuberculosos y la incidencia creciente de
brotes de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes
a mltiples frmacos ha conducido a la necesidad de contar
con sistemas automatizados para las pruebas de deteccin,
identificacin y sensibilidad antimicrobiana rpidas de las
micobacterias. La mayor parte de los sistemas disponibles
en la actualidad se ha desarrollado a partir de la tecnologa
que cultiva sangre existente y usa una instrumentacin similar. Todos los instrumentos tienen caractersticas de seguridad diseadas para proteger al operador y prevenir la
contaminacin del ambiente.
El BACTEC 460 TB (Becton Dickinson) fue el primer
instrumento semiautomatizado empleado para la deteccin
rpida de micobacterias. Se trata de un mtodo radiomtrico que usa viales con base para caldo Middlebrook 7H12,
que contiene cido palmtico radiomarcado como sustrato
y cinco agentes antimicrobianos para reducir la contaminacin. El dixido de carbono radiomarcado se libera en el
espacio libre del frasco por las micobacterias de la muestra
inoculada y se metaboliza el cido palmtico. La radiacti-
149
vidad en el dixido de carbono se mide por un contador

de centelleo y se convierte a un valor del ndice de crecimiento (IC). Un valor de IC de 10 o ms indica la presencia de micobacterias. El complejo M. tuberculosis (MTB)
puede diferenciarse de otras micobacterias al inocular una
alcuota a partir de un vial positivo en un vial BACTEC que
contiene fosfato de cido nucleico (prueba NAP). Ningn
aumento o disminucin del valor del IC revela la presencia
del complejo M. tuberculosis. El sistema puede tambin
utilizarse para la prueba de sensibilidad antibitica de los
aislados de este complejo.
El Sistema BACTEC 9000 MB (Becton Dickinson) se
dise para el aislamiento rpido de micobacterias a partir
de muestras clnicas y utiliza tecnologa fluorescente para
identificar micobacterias que crecen en medio de cultivo
lquido. Cada vial de cultivo contiene un sensor fluorescente, que reacciona a la concentracin de oxgeno presente.
Si hay agentes patgenos, los nutrimentos del frasco se
metabolizan y el resultado es un agotamiento del oxgeno
en el medio. Los fotodetectores del instrumento miden el
grado de fluorescencia, que corresponde a la cantidad de
oxgeno consumido. El anlisis del grado de disminucin
del oxgeno, cuando se mide mediante la fluorescencia creciente, permite al instrumento determinar si el vial es un
instrumento positivo. Los frascos se acomodan en seis
estantes, cada uno de los cuales aloja 40 viales. Los estantes se incuban de manera continua a 37C y se agitan
a intervalos de 10 minutos para la recuperacin mxima
de microorganismos. Los viales se prueban cada 10 minutos por diodos electroluminosos que activan los sensores
fluorescentes. Una determinacin positiva indica la posible
presencia de micobacterias viables y se indica por medio
de una luz que emite el instrumento en el monitor.
El mdulo de BacT/ALERT 3D (bioMerieux) para las
pruebas de crecimiento, deteccin y sensibilidad de las micobacterias tiene un sistema de deteccin idntico al empleado en los cultivos sanguneos. Un sensor en la base de
cada envase detecta el dixido de carbono como indicador
de crecimiento, con el cambio del verde al amarillo que
vigila de modo constante un reflectmetro en la unidad de
deteccin. El mdulo de la incubacin tiene cuatro compartimientos de 60 celdillas cada uno y stos poseen un
mecanismo de agitacin independiente para procesar cultivos estticos o con agitacin dentro del mismo sistema.
El Sistema BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson) es
un instrumento con gran capacidad, completamente automatizado, de vigilancia continua, que puede analizar hasta 960 tubos MGIT de 7 ml para reconocer micobacterias
(usa la misma tecnologa de fluorescencia incluida en el
sistema BACTEC 9000 MB). Los tubos de cultivo contienen un sensor fluorescente que responde a la concentracin
de oxgeno en el medio de cultivo. Los fotodetectores del
150
instrumento miden la fluorescencia en cada tubo cada 60

minutos. La intensidad de la fluorescencia corresponde a
la cantidad de oxgeno que consumen los microorganismos
que, a su vez, es proporcional al nmero de bacterias presentes.
El instrumento puede tambin utilizar el reactivo BACTEC MGIT 960 SIRE como un procedimiento cualitativo
rpido para la prueba de sensibilidad de Mycobacterium
tuberculosis a partir de un cultivo para estreptomicina, isoniacida, rifampicina y etambutol.
Comentario
Para realizar pruebas microbiolgicas en tiempo real,
es decir, envo de la informacin al mdico con un diagnstico clnico de laboratorio, es inevitable que los microbilogos incorporen cada vez ms la instrumentacin
automatizada. Esto tambin contribuir a aliviar la presin de los presupuestos, cada vez menores, las reducciones de personal y una carga de trabajo siempre creciente.
Las numerosas ventajas de las pruebas automatizadas
incluyen la liberacin del personal calificado del trabajo repetitivo para efectuar tareas complicadas y exigentes, con
lo cual mejora la calidad total del trabajo en el laboratorio;
tiempos de respuesta menores; mejor estandarizacin de
las pruebas al suprimir la subjetividad y el error humano,
y un funcionamiento rentable de las pruebas, al reducir la
proporcin de muestras negativas que requieren un procesamiento adicional. Es difcil imaginar la desaparicin de
la placa de agar y el asa de alambre despus de un siglo
de uso; empero, se acerca el momento en que el microbilogo elija como primeras herramientas clnicas los instrumentos automatizados.
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14
Tcnicas de bacteriologa molecular:
preparacin y aplicacin de la muestra
Richard E Holliman y Julie D Johnson
Necesidad de mtodos
moleculares
Preparacin
de la muestra
Con objeto de justificar la importancia de los recursos necesarios para desarrollar y realizar mtodos moleculares de
diagnstico, una infeccin bacteriana debe satisfacer algunos criterios bsicos. Primero, debe representar un problema
clnico relevante en trminos de la cantidad de casos, morbilidad y mortalidad. Segundo, el diagnstico temprano de
la infeccin debe mejorar el pronstico del paciente; casi
siempre est disponible una terapia especfica y eficaz. Por
ltimo, la propuesta existente del diagnstico basado en los
mtodos tradicionales de microscopia, cultivo y serologa
debe proporcionar un rendimiento inferior. Existe poca justificacin clnica para desarrollar un mtodo de diagnstico
de base molecular para una infeccin bacteriana que puede
identificar y probar con facilidad la sensibilidad antimicrobiana en el laboratorio de rutina. La aplicacin de mtodos
moleculares avanzados debe enfocarse en las bacterias que
son exigentes y difciles para crecer en cultivo; bacterias
que se daan en grado subletal; las que no pueden distinguirse de forma simple de las bacterias no patgenas similares; aquellas en las que no puede evaluarse con seguridad la
sensibilidad microbiana, y las especies que no pueden distinguirse con razonable seguridad mediante los mto-dos de tipificacin existentes. Este captulo se concentra en los mtodos
moleculares relacionados con cidos nucleicos bacterianos.
El xito de cualquier tcnica empleada para estudiar los cidos nucleicos bacterianos confa de manera inicial en la liberacin y purificacin de los cidos nucleicos designados. No
existe hasta ahora un mtodo de aceptacin general para la
preparacin de muestras clnicas, pero hay muchos factores
interrelacionados que se deben tomar en cuenta. Luego de
seleccionar al agente patgeno, el tipo de muestra clnica lo
impone la patogenia de la enfermedad. Para maximizar la posibilidad de deteccin debe considerarse la carga bacteriana
dentro de la muestra (el nmero de microorganismos por volumen de muestra). En condiciones ptimas, esto es, cuando
la carga bacteriana es baja, debe examinarse un volumen de
muestra conveniente ms grande; empero, las tcnicas moleculares utilizan a menudo volmenes 100 l. En ltima
instancia, se necesita la concentracin de los agentes designados en un volumen pequeo. Esto requiere una concentracin elevada en las muestras, como el esputo para Mycobacterium tuberculosis y la sangre para la bacteriemia, pero bajas
en muestras como orina para Chlamydia con la finalidad de
conseguir la sensibilidad. Los volmenes grandes de muestra
exigen tcnicas complejas de extraccin, como la precipitacin por etanol y la apropiacin de los cidos nucleicos objetivo, que propician una disminucin de la sensibilidad del
anlisis. Los volmenes grandes de muestra pueden tam-
152
CAP. 14
TCNICAS DE BACTERIOLOGA MOLECULAR: PREPARACIN Y APLICACIN DE LA MUESTRA
bin contener niveles ms grandes de cido nucleico inespecfico con DNA ajeno, lo cual puede comprometer el
anlisis. El tipo de muestra y la forma de procesarla durante y despus de la coleccin revisten importancia. Las
muestras de lquido cefalorraqudeo, orina y esputo pueden
contener inhibidores. El hem (a 0.8 M) y sus productos
metablicos son inhibidores conocidos de las polimerasas de DNA, debido a la unin del hem o la porfirina a la
enzima de amplificacin. Los polisacridos cidos, componentes de las glucoprotenas en el esputo, son tambin
inhibidores. Pueden ser necesarias medidas adicionales
para eliminar los inhibidores de muestras como esputo y
sangre en comparacin con orina o lquido cefalorraqudeo
(Woodford y Johnson, 1998).
Para la deteccin de enfermedades de transmisin sexual,
como Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae y
Trichomonas vaginalis, las novedosas tcnicas de muestreo
de autoadministracin que usan muestras recolectadas con
tampn han resultado ms sensibles por PCR que el anlisis urinario (Tabrizi et al., 1998).
Los reactivos utilizados en la recoleccin de la muestra,
como EDTA y heparina, tambin inhiben a las enzimas de
amplificacin. Si el objetivo est presente en abundancia,
la dilucin de la muestra puede eliminar el efecto inhibitorio, al tiempo que mantiene los cidos nucleicos a un grado
al cual la frecuencia de copias cero analizadas es baja. En
contraste, la destruccin qumica o enzimtica de los cidos
nucleicos reduce el nmero efectivo de objetivos amplificables de cido nucleico. Los microorganismos objetivo y
la durabilidad de su pared celular poseen un efecto notable
sobre el procedimiento de extraccin; por ejemplo, la pared celular de M. tuberculosis es en particular resistente a la
lisis, mientras que la de Mycoplasma spp. se lisa de modo
espontneo. Es tambin importante proteger al personal del
laboratorio que aplica tcnicas moleculares cuando agentes patgenos como M. tuberculosis son los agentes de estudio; por tanto, puede ser necesario incluir medidas de
esterilizacin dentro del procedimiento de extraccin. Es
necesario reducir al mnimo la manipulacin de la muestra y acatar protocolos estrictos con requerimientos reducidos de equipo especializado. La amplificacin extensa
del DNA bacteriano exige el procesamiento de la muestra
que libere el DNA desde una matriz de microorganismos
blanco y abata los factores inhibitorios. Para aumentar
la deteccin de agentes patgenos con paredes celulares
de lisis difcil, la purificacin del DNA con columnas de
filtro de fibra de vidrio, con una medida adicional de sonicacin, ha probado ser tan buena como la extraccin estndar con fenol-ter de DNA (Rantakokko-Jalava y Jalava,
2002). Los procedimientos de preparacin de la muestra
contribuyen a la confiabilidad de la deteccin del objetivo
dentro de las muestras clnicas; existen numerosos equipos
comerciales y se recomienda que las tcnicas de extraccin

de DNA se seleccionen de forma cuidadosa, con particular
atencin en el tipo de muestra. Los equipos comerciales
han probado superioridad para la extraccin de DNA de
muestras fecales (McOrist et al., 2002) y la extraccin rpida de DNA en los estudios moleculares epidemiolgicos
de Plasmodium falciparum (Henning et al., 1999); incluso
la lisis no comercial que incluye la serie lavado-lcali-calor ha probado ser el mtodo ms sensible y simple para
la extraccin del DNA de bacterias, levaduras y hongos a
partir de material de cultivo en sangre (Miller et al., 2000).
Algunos trabajadores han modificado los equipos comerciales para maximizar la recuperacin y pureza del DNA
extrado, en especial con protozoarios intestinales (da Silva
et al., 1999). Si la preparacin de la muestra es ineficiente,
se generan resultados falsos negativos (cuadro 14-1).
Amplificacin
Los cidos nucleicos pueden ser DNA o RNA, de doble
hlice o simple, y deben estabilizarse una vez aislados
para prevenir la degradacin. El RNA es ms difcil de
estabilizar que el DNA. Es un requisito del aislamiento de
RNA la ausencia de DNA contaminante. La extraccin o
destruccin selectivas de DNA o RNA permite slo dirigirse al cido nucleico apropiado. El rRNA puede estabilizarse en soluciones caotrpicas por meses a temperatura ambiente. Son problemticos los agentes patgenos
que tienen una etapa de RNA y una de DNA en su ciclo
vital. La reaccin en cadena de la polimerasa con transcripcin inversa (RT-PCR) detecta mRNA pero tambin
DNA, a menos que se tomen medidas para destruir este
objetivo (Dilworth y McCarrey, 1992). La amplificacin
basada en la secuencia del cido nucleico puede tambin
usarse para detectar mRNA; sta es una reaccin isotrmica que no requiere un ciclador trmico. En fecha ms
reciente, la amplificacin por desplazamiento de hebra de
la transcriptasa inversa (RT-SDA) tambin se ha utilizado
como indicador de la viabilidad bacteriana (Keer y Birch,
2003). Los mtodos de amplificacin como la replicacin
de secuencia autosostenida, que en teora son capaces de
usar slo moldes de RNA, no deben amplificar DNA salvo que se incluya una medida de desnaturalizacin como
parte de la tcnica de extraccin. Es importante determinar
si el DNA de hlice simple interfiere en realidad con este
planteamiento de RNA especfico. De manera anloga, la
PCR reconoce slo DNA, a menos que un paso de transcripcin inversa preceda a la PCR. Las investigaciones con
tinciones de sangre y semen en patologa forense han mostrado que el DNA y el RNA pueden aislarse de modo simultneo desde la misma muestra para el anlisis median-
153
PRCTICA ACTUAL
Cuadro 14-1
Solucin de problemas en la preparacin de la muestra
Contexto clnico
Problema
Solucin
Muestras de gran volumen
Grandes cantidades de DNA extrao

comparado con volumen pequeo de
procesamiento
Grados variables de inhibicin de enzima
Inhibicin de la enzima
Extraccin rigurosa de DNA

Maximizar amplificacin de la
sensibilidad
Individualizar las tcnicas de extraccin
Dilucin
Agentes quelantes
Controles positivos
Procesamiento rpido de la muestra
Condiciones ptimas de almacenamiento/
transporte
RT-PCR
Tipos de muestras clnicas

Qumicos utilizados en la recoleccin de
la muestra
Agentes patgenos para examen
Estabilidad variable del objetivo
Pacientes con tratamiento parcial
Presencia de agentes patgenos viables o

inviables
La contaminacin de muestras crea
reacciones falsas positivas
Presencia de muestras clnicas y

productos de amplificacin previa en
el laboratorio
te precipitacin con etanol y extraccin cida con fenol y

cloroformo (Bauer y Patzelt, 2003). Los mtodos de amplificacin de cidos nucleicos estables pueden detectar
microorganismos muertos, inactivos y en replicacin. El
reconocimiento de todas las formas de los agentes patgenos puede ser ventajoso cuando la viabilidad se pierde
en poco tiempo durante el transporte o almacenamiento o
si el agente no puede cultivarse. Sin embargo, la discriminacin de microorganismos muertos y viables representa
un problema si los agentes patgenos inviables o inactivos
permanecen una vez que la infeccin activa es evidente.
Control de calidad
Cuando se asla, el blanco debe colocarse en un ambiente
acuoso compatible con la amplificacin. Muchos reactivos utilizados en biologa molecular inhiben a las enzimas
de amplificacin para la purificacin de cidos nucleicos;
stos incluyen detergentes como el sulfato de dodecilo de
sodio o caotrpicos como clorhidrato de guanidinio, que
se utilizan para solubilizar la membrana celular o inactivar
nucleasas, sobre todo en la extraccin del DNA bacteriano y de levadura de productos sanguneos (Golbang et al.,
1996). Se deben tomar medidas adicionales para remover
o neutralizar dichos reactivos. El control de calidad de los
reactivos y el equipo en las tcnicas clnicas de biologa
molecular es de enorme importancia. Con tcnicas tan poderosas y sensibles como la PCR, el riesgo de reacciones
falsas positivas debido a la contaminacin y falsas negati-
Pipetas de desplazamiento positivo/

taponadas
Estaciones de trabajo para el anlisis
antes y despus de la PCR
Equipo especializado
vas debido a los inhibidores de reaccin ha llevado a idear

procedimientos escrupulosos de anulacin, que hacen a la
tcnica relativamente cara y limitada a quienes disponen
de tiempo, instalaciones y destreza necesarios. De importancia particular en la microbiologa diagnstica es el uso
de controles para anular los falsos negativos; por ejemplo,
los controles intrnsecos de DNA de un nmero bajo de copias de una secuencia de control pueden incluirse en la
muestra clnica. Si el control no se amplifica, puede asumirse que la muestra es inhibidora. Los requisitos especiales del equipo incluyen puntas taponadas o pipetas de
desplazamiento positivo, estaciones de trabajo separadas,
termocicladores y equipo bsico de deteccin. Todo ello
requiere un gasto financiero inicial grande. Debido a la falta de validacin y protocolos estndar, adems de reactivos
y equipos de calidad variable, las tcnicas moleculares son
todava la herramienta de los laboratorios de referencia y
unidades de investigacin. La European Commission ha
aprobado la investigacin en la validacin y estandarizacin del uso del diagnstico por PCR para la deteccin de
bacterias patgenas en los alimentos (Malorny et al., 2003)
y se espera que desarrollos similares en el diagnstico clnico puedan generalizarse en el futuro.
Prctica actual
A principios del ao 2000 una cantidad creciente de infecciones bacterianas se convirti en material para los mtodos moleculares de diagnstico en el curso de la prctica
154
CAP. 14
Cuadro 14-2
Aplicacin clnica de la metodologa molecular
Funcin
Bacterias
Mtodos convencionales
Mtodos moleculares
Deteccin del agente

patgeno
Neisseria meningitidis
Identificacin de aislados
Staphylococcus spp.
Sensibilidad antimicrobiana
Mycobacterium tuberculosis
Microscopia del cultivo

en medios de agar para
detectar antgenos
Examen de caractersticas
fenotpicas, como
produccin de la enzima
coagulasa
Cultivos sobre/en medios que
contienen antibiticos
Tipificacin
Streptococcus pyogenes
Amplificacin por PCR y

sondeo DNA de productos
de amplificacin
Amplificacin por PCR con
cebadores especficos para
especies por secuencias del
gen 16S rRNA
Electroforesis de los productos
de la PCR para detectar
diferencias genticas
relacionadas con resistencia
Amplificacin por PCR de
16S rRNA y examen de los
fragmentos del producto de
la enzima de restriccin
clnica de rutina. Un nmero ms grande de dichos mtodos se ha analizado en el laboratorio de investigacin y

algunos de ellos pueden encontrar un papel clnico en el
futuro. Los mtodos de laboratorio habituales se emplean
en funciones diversas en el proceso diagnstico; stos comprenden la deteccin de microorganismos en una muestra
clnica, identificacin del aislado, pruebas de sensibilidad
y tipificacin epidemiolgica. Los mtodos moleculares
se han aplicado a cada una de estas cuatro funciones; el
cuadro 14-2 lista los ejemplos representativos. Desde la
perspectiva clnica, los mtodos moleculares se usan en el
diagnstico de infecciones bacterianas de las vas respiratorias, tejidos blandos, sistema urogenital, aparato digestivo y sistema nervioso central (Mandell et al., 2000).
Vas respiratorias
Muchas bacterias causantes de la infeccin de vas respiratorias crecen o se identifican con dificultad en cultivos. En
consecuencia, es conveniente la aplicacin de mtodos moleculares avanzados en estas infecciones. Puede detectarse
Mycoplasma pneumoniae en escobillados de garganta mediante la PCR, en tanto que Legionella pneumophila puede
identificarse en secreciones profundas del pulmn por PCR
y sondas de DNA (Mandell et al., 2000). Se ha desarrollado un anidado de PCR en un tubo simple que incorpora un
sistema de deteccin basado en EIA para el diagnstico de
la infeccin por Chlamydia pneumoniae (Clewley, 1996).
Pueden identificarse con rapidez, por hibridacin con sondas especficas de DNA, aislados del complejo intracelular
Mycobacterium avium cultivados sobre desperdicios o en
Serotipificacin de la
protena M
medios lquidos. Los mtodos moleculares pueden utilizarse para reconocer Mycobacterium tuberculosis en muestras clnicas, identificar aislados que crecen in vitro, valorar
sensibilidad, vigilar la respuesta a la terapia (por la cuantificacin de los valores de mRNA) y distinguir las cepas en
los estudios epidemiolgicos.
Tejidos blandos
Los mtodos establecidos para la identificacin de especies
de estafilococos se basan en las caractersticas fenotpicas.
Dichos mtodos no suministran suficiente confiabilidad debido a la variable expresin de estos factores fenotpicos.
El gen 16S rRNA posee regiones reservadas y variables. Al
disear cebadores de PCR para secuencias especficas dentro del gen se logr clasificar, de acuerdo con la especie,
los aislados de estafilococos con mayor exactitud (Clewley,
1996).
Los aislados de estreptococos del grupo A (Strepto-coccus pyogenes) pueden someterse a genotipificacin por
el anlisis del patrn de la enzima de restriccin de 16S
rRNA, un proceso conocido como ribotipificacin. El gen
pirgeno de la exotoxina se puede detectar por amplificacin con PCR. Otro esquema de tipificacin se basa en la
amplificacin con PCR y la digestin con la enzima de restriccin del reguln de virulencia, un grupo de genes que
comprende factores de virulencia como el factor inactivador
del complemento y la actividad antifagoctica bajo control
de la transcripcin de un gen de virulencia (Clewley, 1996).
Los exmenes moleculares de muestras de piel han alcanzado una sensibilidad hasta de 68% para el diagnstico de
la enfermedad de Lyme.
PRCTICA ACTUAL
Sistema urogenital
Es posible detectar Chlamydia trachomatis en muestras
genitales mediante prueba de ELISA, tcnicas de inmunofluorescencia y sondas de DNA, pero estos mtodos son
menos sensibles que los cultivos convencionales. En contraste, la amplificacin por PCR parece ser ms sensible
que el cultivo de Chlamydia, al tiempo que conserva alta
especificidad y puede aplicarse a muestras de orina y escobillados endouretrales.
El diagnstico de gonorrea se basa an en el aislamiento de la bacteria por cultivo convencional. Sin embargo, el
sondeo de DNA, la amplificacin por PCR o la reaccin
en cadena de la ligasa pueden ser de valor cuando el aislamiento es imprctico debido a las dificultades de transporte
del espcimen o la falta de acceso inmediato a un laboratorio con instalaciones de cultivo. Las sondas de DNA para
Neisseria gonorrhoeae tienen un lmite aproximado de sensibilidad de 103 patgenos por muestra. La precisin de
los diversos mtodos de amplificacin iguala o excede la
del cultivo, pero la experiencia clnica es limitada (Mandell et al., 2000). Se han descrito mtodos moleculares
para el diagnstico y estudios epidemiolgicos de Haemophilus ducreyi y Treponema pallidum, adems de agentes
patgenos relacionados con la vaginosis bacteriana.
Sistema digestivo
En general, los mtodos moleculares son de valor limitado
para el diagnstico de la infeccin gastrointestinal. Aunque
los mtodos convencionales de microscopia y cultivo son
relativamente insensibles y consumen tiempo, la mayora
de los pacientes requiere slo tratamiento de apoyo y un
diagnstico especfico, que a menudo no afecta la teraputica. Una posible excepcin es la infeccin por Campylobacter, en la cual los mtodos actuales de identificacin se
basan en factores bioqumicos poco fiables. Los cebadores
de PCR especficos para el gnero Campylobacter y las especies del gnero, como C. upsaliensis, C. helveticus, C.
fetus, C. hyointestinalis y C. lari, se basan en las regiones
conservadas y variables del gen 16S rRNA. La digestin
por las enzimas de restriccin de los productos amplificados puede utilizarse para desarrollar un esquema de tipificacin para seguir la extensin de las cepas en roturas
(Mandell et al., 2000). La amplificacin molecular tambin ha encontrado un papel en la deteccin de Escherichia
coli 0157:H7.
Sistema nervioso central
Las sondas de DNA no han sido capaces de proporcionar
un nivel clnico de sensibilidad til cuando se usan para la
deteccin de bacterias en el LCR; los mtodos de ampli-
155
ficacin de DNA han mostrado mayor utilidad. La PCR

para Neisseria meningitidis en las muestras del LCR alcanza grados de sensibilidad y especificidad por arriba de
90% en comparacin con los cultivos convencionales. Esta
tcnica puede ser de particular valor cuando el paciente recibe antibiticos antes de la puncin lumbar y representa
un avance significativo respecto de los mtodos de deteccin del antgeno. Estudios moleculares de la diversidad
de meningococos han identificado linajes hiperinvasivos
y posibilitado la introduccin de vacunas nuevas. La PCR
tambin se emplea para reconocer Listeria monocytogenes
en individuos inmunosuprimidos con meningitis y Treponema pallidum en el diagnstico de la neurosfilis sintomtica. La sensibilidad y especificidad de estas aplicaciones
todava no se establece (Mandell et al., 2000).
Amplificacin de 16S rRNA y secuenciacin
Los cebadores universales para la amplificacin de los genes 16S rRNA, con la secuenciacin subsiguiente de los
productos, se pueden utilizar para la identificacin de
los aislados bacterianos y la deteccin de agentes patgenos en las muestras clnicas; este planteamiento ha sustentado el diagnstico de endocarditis infecciosa y el examen
de muestras de LCR en el caso de sospecha de meningitis.
La principal ventaja de los cebadores universales radica
en que las alcuotas de muestras clnicas son innecesarias
cuando se buscan con base en un lmite particular de agentes patgenos, de tal forma que se conserva el volumen de
la muestra y se evitan errores vinculados con la seleccin
especfica de microorganismos del anlisis. En la actualidad se utiliza esta tecnologa para buscar causas infecciosas antes desconocidas de la enfermedad clnica, como la
esclerosis mltiple. La causa de la angiomatosis bacilar,
Bartonella henselae, se reconoci de esta manera.
Microensayos de DNA/RNA
Dado que ya se han establecido las secuencias genmicas
parciales o completas de muchos agentes patgenos bacterianos, se puede emplear la tecnologa de microensayos
para medir los grados de transcripcin y detectar polimorfismos de la secuencia. Las sondas de DNA se inmovilizan
sobre un soporte slido y se utilizan para reconocer DNA
o RNA luego de la amplificacin por PCR. Los trozos de
baja densidad son ms convenientes para las aplicaciones
clnicas de rutina debido a su simplicidad, fcil procesamiento de datos, reproducibilidad incrementada y bajo costo. Los microensayos se pueden desarrollar para detectar
lmites de agentes patgenos en una sola muestra clnica
(por ejemplo, LCR) o establecer con rapidez resistencia
y sensibilidad antibiticas en un solo aislado. Hoy en da
156
CAP. 14
tales aplicaciones se restringen a laboratorios de investigacin, pero es probable que ingresen al uso diagnstico en
un futuro prximo.
Deteccin molecular de resistencia microbiana
Por tradicin, la resistencia antimicrobiana se determina
con el crecimiento de un agente patgeno bacteriano en
presencia de concentraciones apropiadas de agentes teraputicos seleccionados. Para mala fortuna, las tasas de
crecimiento variables de bacterias tienen como efecto un
retraso inherente, de modo que los resultados slo estn
disponibles muchas horas despus del aislamiento inicial
del agente. El incremento de la comprensin de la base gentica de la resistencia ha permitido el desarrollo de mtodos moleculares para detectar en poco tiempo los cambios
genmicos hallados en los fenotipos de resistencia. Este
principio se ha aplicado a la identificacin del gen Mec A
que codifica la resistencia a la meticilina en estafilococos,
la protena que liga la penicilina en Streptococcus pneumoniae y varios de los determinantes de la resistencia a la
rifampicina en Mycobacterium tuberculosis. No obstante,
los mtodos moleculares tienen ciertas limitaciones: los
mecanismos de resistencia desconocidos o novedosos pueden omitirse, y cuando el nmero de genes diferentes que
inducen la resistencia es grande, los mtodos moleculares
son costosos. Como resultado, los anlisis fenotpicos son
todava el mtodo de opcin para analizar a la mayor parte
de las bacterias.
Epidemiologa y tipificacin
Los mtodos convencionales de tipificacin aplicados a
las bacterias incluyen fagotipificacin y serotipificacin.
Muchas veces, dichos mtodos muestran un poder bajo
de discriminacin y escasa reproducibilidad, sobre todo
cuando se aplican a microorganismos de crecimiento lento, como Mycobacterium tuberculosis. Las secuencias IS
6110 repetidas del DNA muestran suficiente polimorfismo
para permitir un esquema de tipificacin basado en la amplificacin por PCR de la secuencia de insercin y la tcnica Southern blotting de los fragmentos de la enzima de
restriccin. Las cepas que portan slo una copia nica de la
secuencia de insercin no pueden separarse por la tipificacin de la IS 6110. Tales aislados pueden investigarse con
otro elemento repetitivo, la secuencia DR (Clewley, 1996).
En cada caso, el gen posee repeticiones directas separadas
por secuencias nicas. La variabilidad de estas secuencias
nicas conduce a diferentes patrones de bandas despus del
corte con enzimas de restriccin (polimorfismo de longitud
de fragmentos de restriccin). El mtodo desarrollado para
amplificar y marcar secuencias de DNA en la regin DR se

conoce como espaciador de oligotipificacin o espoligotipificacin (Marshall y Shaw, 1996). Estos mtodos han
revelado microepidemias insospechadas y delinean la importancia creciente de la tuberculosis como enfermedad de
reciente adquisicin. La tipificacin secuencial multilocus
ha hecho posible reconocer las vas de diseminacin de los
tipos individuales de Staphylococcus aureus multirresistente. Tal herramienta tiene ventajas sobre la electroforesis
en gel de campo pulsado (PFGE), entre ellas la facilidad
del ingreso de informacin en una base de datos.
Problemas con los mtodos moleculares

Aunque los mtodos moleculares han conducido a avances
en el diagnstico y tratamiento de la infeccin, an son
problemas de importancia. Los recursos necesarios de estas tcnicas suelen ser ms grandes que los de los mtodos
convencionales que tratan de reemplazar. El equipo especializado y los reactivos, junto con la necesidad de entrenamiento adicional del operador, han limitado la aplicacin
de los mtodos moleculares en los laboratorios de diagnstico comunes. La importancia clnica de la sensibilidad incrementada de los anlisis basados en el sondeo del
DNA, en particular la amplificacin del DNA, puede ser
incierta. Por ejemplo, un frotis positivo de una muestra de
esputo en la microscopia habitual puede contener alrededor
de 104 bacilos tuberculosos. A pesar de esta falta relativa de
sensibilidad, los hallazgos son de gran valor clnico para
predecir la infectividad. En contraste, es menos segura la
importancia de un anlisis positivo con PCR para M. tuberculosis realizado sobre una muestra de esputo tomada
de un paciente sometido a terapia apropiada.
Est bien documentado el dao de las reacciones falsas
positivas debido a la prctica excesiva de la amplificacin
del DNA. En contraste, los volmenes limitados de prueba
utilizados en estos mtodos pueden dar lugar a resultados
falsos negativos en virtud del error de muestreo relacionado
con la distribucin irregular de los agentes patgenos en las
muestras clnicas. Por ltimo, los mtodos moleculares de
primera generacin se disearon para detectar slo la presencia o ausencia de un agente patgeno y no suministran
informacin acerca de la viabilidad del microorganismo.
Las tcnicas convencionales para determinar la viabilidad
dependen de la demostracin de la integridad o la actividad celulares y es escasa la correlacin entre la deteccin
del DNA y la viabilidad. Los objetivos moleculares para
valorar la viabilidad incluyen mRNA y rRNA. Las especies
de rRNA de vida media ms larga y su retencin variable secundaria a una variedad de tratamientos bacterianos
hacen del rRNA un indicador menos exacto de viabilidad
que los objetivos mRNA (Keer y Birch, 2003). Aunque los
APLICACIN FUTURA
anlisis posteriores corrigieron este defecto, tienden a ser

complejos y ms difciles de realizar.
Aplicacin futura
Es posible que se desarrollen mtodos moleculares apropiados para otros agentes patgenos cuyo crecimiento es
difcil en cultivo, como las bacterias anaerobias, o en los
casos en que la terapia antibitica antecede a la obtencin
de las muestras para el diagnstico, como la infeccin de
las vas respiratorias y la osteomielitis. Los mtodos moleculares pueden proporcionar informacin til en cuanto
a la virulencia probable de los aislados clnicos de estafilococos negativos a la coagulasa y estreptococos hemolticos alfa. La genotipificacin puede ser de utilidad en
estudios sobre la extensin de la resistencia antibitica y
los mecanismos de la infeccin cruzada en los hospitales.
Si bien los mtodos moleculares no han revolucionado en
gran proporcin el campo de las enfermedades infecciosas, la introduccin de estaciones de trabajo automatizadas
mejorar la estandarizacin, reducir costos y conducir a
una aplicacin ms amplia de los mtodos moleculares en
el laboratorio clnico.
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15
Otras pruebas en bacteriologa
Darrel Ho-Yen
Introduccin
Una parte importante del trabajo en un laboratorio de bacteriologa diagnstica es el cultivo de bacterias. Tal identificacin posibilita el diagnstico definitivo, sobre todo
cuando crecen agentes patgenos; empero, cuando el crecimiento es de microorganismos comensales, su papel no
puede relacionarse con la enfermedad. Otros problemas de
la tcnica de cultivo en relacin con el diagnstico son el
difcil crecimiento de algunas bacterias (p. ej., Legionella
pneumophila, causante de la enfermedad de los legionarios), la imposibilidad de cultivar algunas (p. ej., Treponema pallidum, que provoca la sfilis) y el peligro notable
que entraa el cultivo de otras (como Brucella abortus, que
ocasiona la brucelosis). A pesar de estas limitaciones, el
cultivo de bacterias es todava el apoyo principal del laboratorio de bacteriologa diagnstica.
Este captulo considera otros mtodos de identificacin
de bacterias como origen potencial de la enfermedad. Las
aproximaciones directas para el diagnstico son la identificacin de bacterias (deteccin del antgeno) o el reconocimiento de anticuerpos especficos para la presencia de
bacterias (deteccin del anticuerpo). Las tcnicas para detectar anticuerpos, IgM, aumentos cudruples del anticuerpo
IgG, baja avidez de IgG o valores elevados de IgA pueden
develar la infeccin en curso. Es importante recordar que
si bien los resultados de un anticuerpo pueden delinear la
infeccin, sta puede no ser la causa de la enfermedad. Por
lo tanto, una prueba especfica sensible de IgM para Toxoplasma gondii puede ser positiva sin tener relacin con los
sntomas; puede tratarse tan slo de una infeccin pasada.
La formacin del complejo inmunitario es un proceso
natural durante cualquier infeccin. Por muchas dcadas
han existido mtodos intrincados e imaginativos que tratan de identificar microorganismos especficos dentro de
los complejos inmunitarios. El xito ha sido limitado, pero
esta rea constituye todava un gran desafo intelectual para
los microbilogos. Por ltimo, las pruebas indirectas de la
infeccin bacteriana se realizan en muchos laboratorios de
bacteriologa. Estas pruebas se incluyen en dos grupos. En
el primero, los marcadores de una infeccin particular pueden utilizarse para reconocer al agente patgeno (como la
cromatografa de gas-lquido y las pruebas de respiracin).
El segundo grupo emplea los marcadores generales de las
infecciones y no son especficos de una bacteria particular
(como la protena C reactiva).
Pruebas para el anticuerpo

Aunque todos los lquidos corporales se pueden analizar
para anticuerpos, en la bacteriologa diagnstica se analiza por lo regular una muestra srica. En individuos inmunocompetentes, la infeccin por bacterias produce casi
siempre el anticuerpo especfico contra ese agente. Los anticuerpos son protenas elaboradas en el suero (el compartimiento de la sangre libre de clulas) y conforman molculas
complejas de diversos tipos (llamadas inmunoglobulinas).
Las inmunoglobulinas participan en diversos mecanismos
de defensa contra bacterias invasivas. Hay cinco tipos de
inmunoglobulinas en el ser humano, pero para la bacteriologa diagnstica, IgM e IgG son las de mayor uso (IgA
e IgE son mucho menos importantes). El anticuerpo IgM
aparece al inicio del curso de la infeccin (durante la primera semana) y es diagnstico de la infeccin en curso.
El anticuerpo IgG se forma ms tarde en la infeccin
160
CAP. 15
OTRAS PRUEBAS EN BACTERIOLOGA
(en la segunda semana) y las ms de las veces es indicativo de infeccin e inmunidad pasadas. El anticuerpo IgG
tambin cruza la placenta y confiere inmunidad al recin
nacido. La IgA es la inmunoglobulina mucosa principal
y la IgE interviene en particular en reacciones alrgicas;
no obstante, ambas son incapaces de cruzar la placenta
y tienen utilidad diagnstica en el recin nacido. La IgM
no cruza la placenta, pero una cuarta parte de los neonatos no produce IgM. Los aumentos y descensos de estas
inmunoglobulinas (IgM, IgG, IgA e IgE) en el suero son
diferentes y tales diferencias pueden usarse para medir el
inicio de una infeccin, por ejemplo el diagnstico de la
infeccin durante el embarazo.
Pruebas ms antiguas
Pruebas de aglutinacin
Los anticuerpos especficos presentes en el suero pueden
aglutinar a las partculas bacterianas o partculas de ltex cubiertas con antgenos bacterianos. Un ejemplo de una prueba de aglutinacin es el mtodo de aglutinacin directa para
la deteccin del anticuerpo contra Brucella abortus. En esta
prueba, una suspensin de B. abortus se agrega a una serie
de diluciones con suero del paciente contenida en tubos de
ensayo. Los tubos se incuban por una hora o ms tiempo,
casi siempre a 37C, y a continuacin se interpreta el resultado. Para detectar la aglutinacin ms tenue, la prueba se
puede incubar durante la noche para incrementar su sensibilidad. La aglutinacin se observa al golpear con suavidad los
tubos para perturbar las clulas; stas ascienden en el lquido
en la forma de agregados o, como en el caso de los controles
negativos, como suspensin fina dispersada. Las pruebas de
aglutinacin se pueden adaptar con facilidad al uso en portaobjetos y resultan rpidas y fciles de realizar.
Las pruebas de aglutinacin son en particular sensibles
en presencia de anticuerpos de IgM dado que esta clase de
inmunoglobulina se aglutina mejor que otras. No obstante,
debe recordarse que el anticuerpo IgM no induce siempre
aglutinacin y son posibles resultados falsos negativos. Un
problema tcnico es el efecto prozona, en el cual la aglutinacin no se observa a concentraciones ms altas del anticuerpo debido a la inhibicin estrica en los sitios de unin con
el anticuerpo; slo es obvia cuando se diluye la muestra.
Los eritrocitos (como los de oveja) pueden tambin
cubrirse con antgenos bacterianos. El anlisis de hemaglutinacin de Treponema pallidum (TPHA) se emplea para el
diagnstico de la sfilis. Estas pruebas de la partcula revestida tienen la ventaja de no sufrir ninguna autoaglutinacin,
es decir, la aglutinacin de las partculas se efecta a travs
de la simple adherencia de la protena, lo cual es un problema frecuente con las suspensiones bacterianas.
Pruebas de fijacin del complemento

El suero del paciente se calienta primero a 56C para destruir
el complemento. En la segunda etapa se mezcla el suero en
una gama de diluciones con el agente patgeno o sus antgenos. Se agrega una fuente del complemento, que en condiciones normales es una alcuota de suero fresco de cobayo,
y la mezcla se incuba. Los complejos antgeno-anticuerpo
formados entre las bacterias y la muestra del paciente activan el complemento del cobayo y por tanto lo eliminan
de la mezcla. Al final del periodo de incubacin, todas las
mezclas se eliminan en la tercera etapa de la prueba, para la
cual los reactivos se preparan de eritrocitos de una especie
conveniente sensibilizada con el anticuerpo contra los antgenos del eritrocito. De manera caracterstica se utilizan
los eritrocitos de la oveja, que se sensibilizan con el anticuerpo del eritrocito antioveja del conejo, de tal forma que
los eritrocitos se cubren con el anticuerpo en ausencia del
complemento. Si el complemento se encuentra presente en
la segunda etapa, los eritrocitos sensibilizados se lisan. Por
lo tanto, la lisis indica que las muestras del paciente en la
segunda etapa del procedimiento no tenan algn anticuerpo presente, mientras que la ausencia de lisis seala que el
anticuerpo estaba presente y que el complemento se utiliz
hasta la segunda etapa.
Las pruebas de fijacin del complemento se han usado con
alguna frecuencia para muchos propsitos, como el diagnstico de la infeccin por Brucella. Existen muchos problemas
potenciales con estas pruebas. Su confiabilidad depende de la
estandarizacin de todos los reactivos de la prueba antes de su
realizacin. Adems, no es raro encontrar sustancias en suero
que ejercen efectos anticomplemento.
Pruebas de precipitacin
El principio seala que un anticuerpo, en especial IgG, precipita al antgeno soluble. La precipitacin se puede realizar en solucin acuosa en tubos de ensayo, pero se efecta
con ms frecuencia mediante el mtodo de Ouchterlony.
Esta prueba utiliza una placa (placa de Petri) que contiene
1 a 2% de agar comn, con celdas perforadas que se llenan
de antgeno (del agente patgeno de inters) o el anticuerpo (suero del paciente). El formato general se muestra en
la figura 15-1. El antgeno y el anticuerpo se difunden uno
hacia el otro a travs del agar y donde se encuentran se
forma una lnea de precipitacin. Casi cualquier antgeno
puede usarse, a condicin de que se difunda con facilidad.
Con un anticuerpo de especificidad conocida puede precisarse la identidad de un antgeno desconocido. Esta clase
de prueba se puede emplear con las toxinas bacterianas,
como las relacionadas con el ttanos y la difteria.
PRUEBAS PARA EL ANTICUERPO
Figura 15-1 Formato de la prueba de precipitacin de Ouchterlony.
Pruebas recientes
El principio de estas pruebas establece que el anticuerpo del
paciente presente en el suero se une a un sustrato que se proporciona bajo la forma de bacterias o sus productos unidos a
una superficie slida. Despus, las protenas indeseables del
suero se lavan a partir del sustrato y un segundo anticuerpo, casi siempre cultivado en conejos, ovejas o cabras, que
es especfico contra el anticuerpo humano y est marcado
de forma apropiada, se agrega en la segunda etapa de la
prueba. Si el anticuerpo del paciente se une al sustrato en
la primera etapa, el anticuerpo de la segunda etapa tambin
se liga. El marcador, o la marca, es variable, pero en cualquier caso debe cuantificarse con facilidad. Por ejemplo, en
la tcnica del anticuerpo fluorescente, este marcaje se realiza con fluorescena, que puede visualizarse bajo luz ultravioleta, mientras que en el ensayo inmunoabsorbente ligado
a enzimas (ELISA) se emplea una enzima que puede actuar
con posterioridad sobre un sustrato conveniente para producir un cambio de color mensurable. El nmero de marcajes
disponibles es muy grande e incluye marcados radiactivos,
pero el principio es el mismo para todas estas pruebas.
Pruebas con anticuerpos fluorescentes
Se utilizan portaobjetos especiales, muchas veces cubiertos
con tefln, los cuales tienen 10 lugares para que puedan
examinarse varias muestras en un solo portaobjetos. Una
suspensin del microorganismo de la prueba se seca sobre
el portaobjetos, se fija en acetona o etanol y se aaden los
161
sueros de los pacientes. Despus de la incubacin (por lo

regular 30 min) se lava la laminilla y se agrega la inmunoglobulina antihumana (IgG, IgM o IgA), que se ha marcado
con fluorescena. Despus de la incubacin y el lavado, se
aplican los cubreobjetos y el portaobjetos se examina bajo
un microscopio ultravioleta. Si la muestra contiene el anticuerpo contra el patgeno de la prueba, ese anticuerpo se
une a l y reacciona con la antiinmunoglobulina marcada
para producir microorganismos que emiten fluorescencia
verde brillante bajo la luz ultravioleta. Mediante una serie
de diluciones del suero del paciente es posible cuantificar
la cantidad de anticuerpo presente. Existen varios problemas con estas pruebas; por ejemplo, son muy laboriosas y
la lectura del resultado final es subjetiva y depende de la
experiencia del observador. Adems, la luz ultravioleta da
lugar a que la fluorescencia se atene, de modo que las observaciones deben ser bastante rpidas. Por lo regular, estas
pruebas son mejores con los antgenos de la pared celular,
dado que los anticuerpos casi nunca penetran en los agentes patgenos para detectar antgenos internos. La prueba
no es fcil de utilizar para la medicin del anticuerpo IgM.
A pesar de estas dificultades, las pruebas con anticuerpos
fluorescentes han sido muy tiles y todava se usan en el
diagnstico de la sfilis.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Este mtodo sumamente difundido puede estar por completo automatizado, pero por lo regular es semiautomtico.
De manera caracterstica, se usan microplacas de plstico
con 96 celdillas, que pueden alojar una gran cantidad de
muestras as como controles que pueden lavarse de manera automtica y centrifugarse en caso necesario; los resultados los genera y analiza un lector automtico. Muchas
tcnicas de ELISA estn disponibles en el comercio. Las
muestras se pipetean dentro de las celdillas revestidas con
el antgeno, se incuban y se lavan, y se aade la inmunoglobulina antihumana marcada con una enzima. Despus de la
incubacin y el lavado extensos se agrega un sustrato para
la enzima. Existe un cambio de color del sustrato si la enzima est presente y el lector automtico lo puede analizar.
La intensidad del color es proporcional a la cantidad de anticuerpo que se une al antgeno; por lo tanto, el mtodo es
del todo cuantitativo. Sin embargo, es importante recordar
que esto es verdad slo si hay un exceso de antgeno unido
a la placa y si se proporciona un exceso de inmunoglobulina antihumana en las fases posteriores. Estas condiciones
estn garantizadas en los dispositivos comerciales, pero es
importante atender estos detalles con tcnicas internas.
La antiinmunoglobulina usada puede ser anti-IgM, antiIgG, anti-IgA, etc., y por tanto la prueba ofrece una ruta
fcil para determinar el tipo de anticuerpo presente en las
162
CAP. 15
diferentes etapas de la infeccin. El aspecto ms valioso de

esto es la medicin de IgM como marcador temprano de infeccin aguda. Los mtodos de ELISA son fciles de utilizar, baratos y menos laboriosos que muchos otros mtodos
serolgicos. Como una nota tcnica de menor importancia,
para los anlisis internos es esencial reconocer que las filas
externas de las placas de ELISA suelen ser dudosas como
adsorbentes. Este problema puede superarse si se usan slo
las filas internas.
Mtodos radioinmunomtricos
stos fueron los precursores de las pruebas ELISA y el
principio es el mismo. Por lo general, se realizan en tubos en lugar de celdillas; la nica diferencia significativa
radica en que la antiinmunoglobulina agregada est radiomarcada, casi siempre con 131I o 125I. Debido a los peligros
potenciales de la radiactividad, estas pruebas se utilizan rara
vez hoy da, aunque tienen mayor sensibilidad que la tcnica ELISA y pueden emplearse en ciertos trabajos de investigacin en los que se requiere una medida meticulosa.
Pruebas para el antgeno

Las pruebas para el antgeno microbiano ganan cada vez ms
aceptacin. La razn principal de ello es que el antgeno est
presente en fase temprana de la infeccin y por lo tanto su
deteccin proporciona informacin clnica de utilidad. Un
buen ejemplo es la deteccin de los antgenos de Legionella pneumophila en la orina de pacientes con la Enfermedad
de los Legionarios. Estas pruebas son a menudo positivas
cuando el sujeto est grave y agudamente enfermo, si otros
procedimientos diagnsticos no son convenientes.
Sin embargo, existen otros ejemplos, uno de los cuales,
la identificacin de los antgenos de Neisseria meningitidis
en casos de septicemia o meningitis por este microorganismo, ha funcionado por muchos aos. De manera original,
este mtodo emple una tcnica llamada contrainmunoelectroforesis, que es una variante de los mtodos de precipitacin que se presentaron antes. En esencia, el suero
del paciente se separa en un gel de agar al pasar un potencial elctrico a travs de l, lo cual da lugar a que las
protenas humanas y el antgeno meningoccico migren
a posiciones diferentes y se separen. A continuacin, se traza una ranura en sentido longitudinal en el gel junto a las
protenas separadas y se aade en la misma un anticuerpo
especfico contra el antgeno microbiano de inters. La difusin del anticuerpo hacia las protenas separadas detecta
la presencia del antgeno microbiano, si se encuentra all.
Al igual que otros mtodos de precipitacin, la contrainmunoelectroforesis es relativamente insensible y la mayor
parte de los ensayos para detectar y medir el antgeno microbiano utiliza ahora los sistemas de ELISA. La modificacin requerida a la tcnica de ELISA consiste en utilizar
el anticuerpo especfico para el antgeno de inters en la
superficie de las celdillas de la microplaca. Este anticuerpo,
las ms de las veces un anticuerpo monoclonal, se usa para
capturar el antgeno de la muestra del paciente. En una
segunda etapa, el anticuerpo, que es especfico para el antgeno y est marcado por medios enzimticos, se agrega y
se lleva a cabo el resto del procedimiento. Suele aceptarse
que la captacin del anticuerpo y la deteccin del anticuerpo deben ser diferentes, aunque la prueba trabaje con el
mismo anticuerpo en ambos lados del emparedado. Emplear los anticuerpos monoclonales para ambos propsitos
o usar uno policlonal y uno monoclonal son, en esencia,
una cuestin de ensayo y error.
Esta clase de aproximacin ha sido en particular til
para el diagnstico de infecciones vricas como el HIV y
los virus de la hepatitis. Para las bacterias se ha observado
una tendencia a tratar de simplificar los mtodos mediante
las partculas de ltex en una prueba de aglutinacin; las
partculas se cubren con el anticuerpo contra el antgeno
de inters. Como todas las pruebas de aglutinacin, stas
son relativamente insensibles y no han demostrado ser tan
tiles, como se pens al principio.
Como nota tcnica, si se utilizan muestras de orina o
esputo para reconocer un antgeno, muchas veces es necesario eliminar a los inhibidores. La naturaleza de stos
no est bien establecida, pero con frecuencia basta calentar
la muestra al punto de ebullicin por dos o tres minutos
para eliminarlos. Esto no tiene casi nunca efectos de deterioro sobre el antgeno. En los prximos aos se dispondr
tal vez de mejoras en los mtodos de ELISA para la deteccin del antgeno. En especial, deben usarse no slo para
detectar el antgeno, sino para cuantificarlo por completo,
algo que el mtodo puede realizar sin problemas.
Prueba del complejo inmunitario

especfico del antgeno
La figura 15-2 muestra un anlisis terico de los sucesos
ocurridos durante una infeccin. El crecimiento de un microorganismo produce cantidades crecientes de antgeno
microbiano a las cuales responde el husped infectado con
la elaboracin de anticuerpo especfico. Al final, en una reaccin eficaz, la cantidad de anticuerpo formada suprime
el crecimiento del agente patgeno. Varios puntos merecen
cierta consideracin a partir de este diagrama. Primero, en
una fase inicial hay ms antgeno disponible para la medicin en comparacin con el anticuerpo. En segundo lugar,
el anticuerpo mensurable libre slo aparece de modo tardo
en el curso de la infeccin. Tercero, en el transcurso de
OTRAS PRUEBAS
163
prueba supone romper los complejos y reconocer el componente del antgeno. Esto puede lograrse por calentamiento
(60C por 30 min), con la adicin de un amortiguador de
pH bajo (p. ej., glicina/HCl) o uno de molaridad alta, como
fosfato 1 M. Despus de la rotura de los complejos, se prueba el antgeno mediante uno u otro de los mtodos descritos
con anterioridad, como la tcnica de ELISA.
Medicin directa de ELISA
Figura 15-2 Diagrama de los aspectos tericos de las interacciones antgeno-anticuerpo en una infeccin.
la mayor parte de la infeccin, los complejos inmunitarios

se forman entre el antgeno y el anticuerpo, segn lo representa el rea delineada en el diagrama. Dado que estos complejos inmunitarios contienen los antgenos de los
microorganismos infectantes, su medicin proporciona un
medio para el diagnstico.
Se ha conocido por muchos aos que la mayor parte de
las infecciones microbianas sistmicas produce valores elevados de complejos inmunitarios en la sangre del paciente. Es raro que este reconocimiento se aproveche con fines
diagnsticos, quiz porque las tcnicas para la medicin de
los complejos han resultado difciles en el pasado. En los
ltimos aos se han descrito los mtodos para diagnosticar
pulmona neumoccica, endocarditis contagiosa, enfermedad de Lyme, lepra, meningitis tuberculosa e infeccin por
virus C de la hepatitis, que usaban ensayos del complejo
inmunitario. Algunas de las tcnicas practicadas se discuten a continuacin.
Mtodos que usan polietilenglicol
En estas pruebas, los complejos se precipitan a partir del suero por la adicin del polietilenglicol. Esto funciona porque
los complejos poseen un tamao diferente de la inmunoglobulina o el antgeno natural. El polietilenglicol se deja actuar
por varias horas, casi siempre toda la noche, y al final de ese
tiempo la muestra de suero se centrifuga y el precipitado se
elimina para el anlisis adicional. La etapa siguiente de la
Estas pruebas utilizan anticuerpos monoclonales especficos contra los antgenos de inters unidos a las celdillas de
las microplacas y con reactivo de captacin. Se agrega la
muestra del paciente y se captan los complejos presentes.
En una segunda etapa se aade la inmunoglobulina antihumana marcada de forma enzimtica y se liga a cualquier anticuerpo humano unido a la superficie de la placa mediante
un complejo inmunitario. Esta versin confa en la elevada
especificidad de los anticuerpos monoclonales para fijarse
slo a los antgenos de inters. Tambin debe observarse
que el diagnstico por este mtodo se infiere, no se prueba,
puesto que se aduce que el anticuerpo del paciente no puede estar presente a menos que se una al antgeno captado
en la placa de ELISA.
Pruebas que utilizan agentes de unin
de complejos inmunitarios
Se conocen muchas sustancias que unen de modo especfico
los complejos inmunitarios, como C1q, separado y purificado (el primer componente del complemento), factor reumatoide (un anticuerpo desarrollado en algunos pacientes y
dirigido contra IgG humana) y conglutinina (una protena
del suero vacuno); todas ligan complejos inmunitarios. Estas
sustancias se pueden aplicar a las celdillas de la microplaca
de la manera descrita para los ensayos de ELISA en general
y las sustancias fijan despus cualquier complejo inmunitario
presente en la muestra del paciente; entonces se determina la
naturaleza del complejo con un anticuerpo marcado por medios enzimticos contra los antgenos de inters. Muchos de
los informes sobre el uso de esta clase de anlisis son en la
actualidad experimentales, pero ofrecen rapidez y economa
y muestran ser ms sensibles que los mtodos ya descritos.
Tal vez se empleen con regularidad en el futuro.
Otras pruebas
Pruebas cromatogrficas
Como se describi con anterioridad, se puede utilizar la
deteccin del antgeno de los microorganismos como un
164
CAP. 15
marcador de su presencia en una infeccin. De la misma

forma, la deteccin de metabolitos de los agentes patgenos se utiliza para sealar la presencia del microorganismo. La identificacin de los metabolitos se realiza por
cromatografa de gas-lquido o cromatografa lquida de
alta resolucin, aunque la primera representa el ejemplo
de diagnstico mejor conocido.
La cromatografa de gas-lquido se utiliza para separar
e identificar cidos grasos voltiles y no voltiles al hacer
pasar una muestra a travs de una sustancia de separacin
conveniente (p. ej., Chromasorb) mediante un flujo de gas
acarreador. Los diferentes cidos grasos se separan en
tiempos diferentes. Una aplicacin temprana fue la identificacin del arabinitol en el suero de individuos con infeccin sistmica por Candida albicans. De manera inicial se
pens que las concentraciones elevadas de este metabolito
se vinculaban slo con esa infeccin, pero investigaciones
subsecuentes probaron que la medicin fue un marcador
diagnstico poco confiable. Se afirma que la presencia de
esos microorganismos en pus y exudados puede determinarse de modo directo, aunque no es prctica comn utilizar el mtodo en muestras de rutina. Ms acertado ha sido
el uso del mtodo para identificar y clasificar bacterias
anaerobias, en particular patgenos gramnegativos.
Pruebas de respiracin
Estas pruebas no invasivas se han empleado para identificar Helicobacter pylori, ahora reconocido como causal
de lceras duodenales. H. pylori tiene una enzima de gran
alcance, la ureasa, que puede hidrolizar la urea marcada
de forma radiactiva e ingerida para liberar el CO2 marcado; a continuacin se mide en la respiracin exhalada. Para
la prueba se usan dos istopos, 13C y 14C: el primero es
ms seguro pero ms costoso que el segundo. Las pruebas
son semicuantitativas, y puesto que la urea se distribuye a
lo largo del estmago, no hay error de muestreo. La sensibilidad y la especificidad de estas pruebas se comparan
bien con el cultivo y la histologa. Las pruebas se pueden
emplear para el diagnstico de H. pylori o supervisar la
respuesta al tratamiento.
Desarrollos futuros
Existen varios desafos en el rea general de la serologa.
El primero es tratar la cuestin de la velocidad de los resultados. Un resultado lento (es decir, varios das) es de
inters acadmico o intil en trminos del diagnstico y el

tratamiento de la infeccin. Es claro que el antgeno o la
deteccin del complejo inmunitario especfico del antgeno
ofrecen una va ms rpida para el diagnstico respecto del
reconocimiento del anticuerpo y por lo tanto es deseable el
desarrollo de estos anlisis.
Adems, el antgeno y los anlisis del complejo inmunitario especfico del antgeno pueden ser por completo cuantitativos, y utilizados de forma correcta con mediciones
seriadas, pueden valorar la gravedad de cualquier infeccin
y la respuesta a la teraputica. No deja de ser decepcionante que estos mtodos se usen hasta la fecha casi siempre de
manera cualitativa; en el futuro se espera ms un cambio
de esta posicin que las mejoras de la tecnologa.
Un desafo real para el futuro es la aplicacin de algunos de los mtodos mencionados a las infecciones consecutivas a patgenos comensales. Existen muchos casos,
pero el diagnstico y el control de la infeccin grave por
Escherichia coli sirven como ejemplo til. Las tcnicas
convencionales son con frecuencia intiles y los mtodos
de PCR, como se emplean hoy da, tienen poco qu ofrecer
porque slo identifican la presencia del microorganismo.
El reto consiste en saber lo que hace el agente patgeno.
En consecuencia, el futuro debe enfocarse en la cuantificacin cada vez ms compleja del antgeno, se halle ste
libre o en complejos; es probable que los inmunosensores
o sus equivalentes participen en este desarrollo. Dado que
la mayor parte de los mtodos serolgicos depende de la
interaccin antgeno-anticuerpo y sta ocurre en el lapso
de minutos, es sorprendente que casi todas las pruebas disponibles tomen varias horas y deban utilizar suero aislado.
Los mtodos que pueden cuantificar el antgeno microbiano dentro de cinco minutos, mediante secreciones de
sangre completa o del cuerpo, son antiguas y su desarrollo
representa un verdadero desafo para el futuro.
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16
Control de la quimioterapia antimicrobiana
Ian M Gould
Introduccin
Los primeros postulados de la quimioterapia
Puede afirmarse que la era moderna de la quimioterapia

empez hace ms de 100 aos con el trabajo pionero de
Robert Koch; l y otros describieron la teora del germen
de la enfermedad que permiti el desarrollo del concepto de balas mgicas, es decir, agentes que destruan a los
microbios sin daar al husped. Las primeras sustancias,
derivadas del mercurio, antimonio y arsnico, demostraron
ser muy txicas para su uso general, aunque encontraron un
papel marginal en el tratamiento de la sfilis. Desde entonces se hicieron grandes avances en la mayor parte de las
reas de la quimioterapia antimicrobiana, pero los derivados de estos primeros agentes todava se emplean para ciertas enfermedades parasitarias, como la leishmaniosis y la
enfermedad del sueo.
En el decenio de 1930, industriales y cientficos alemanes trabajaron juntos para crear los primeros antimicrobianos modernos, las sulfamidas, medicamentos derivados
de los colorantes. A stas les sigui en poco tiempo el descubrimiento de los antimicrobianos naturales (antibiticos),
como la penicilina (que descubri en realidad Alexander
Fleming en 1928, aunque primero se us para tratar las infecciones durante la Segunda Guerra Mundial). Al principio el frmaco era tan escaso que los mdicos recolectaban
la orina de los pacientes tratados para extraer la droga del
milagro y reutilizarla en otros enfermos.
En consecuencia, la era de la quimioterapia, tal y como
se entiende ahora, comenz durante los decenios de 1940,
1950 y 1960, lapso en el que se hicieron grandes avances
con los descubrimientos de nuevos antibiticos, se aprendi a sintetizarlos y se elaboraron frmacos por completo
nuevos, como las quinolonas.
Desde la dcada de 1940 se comprendi que los diversos

antibiticos actuaban de forma sinrgica con las bacterias
de diferentes maneras, de tal modo que poda afectarse el
rgimen posolgico ptimo. Un decenio ms tarde result
evidente la resistencia a casi cualquier antibitico desarrollado despus de su uso prolongado. Las primeras aplicaciones clnicas de estos dos principios fundamentales de
la ciencia de la quimioterapia tuvieron lugar en el tratamiento de la tuberculosis, una enfermedad con una incidencia anual y un ndice de mortalidad medidos en millones.
El principio original del control de la terapia aprendido
en esos primeros das fue la aplicacin del conocimiento
sobre los parmetros de dosis y respuesta (farmacodinmicos) de la interaccin antimicrobiano-microbio, que condujo al tratamiento intermitente (dos veces por semana)
con rifampicina e isoniacida. Esto fue factible debido al
efecto supresor prolongado de estos antimicrobianos sobre el crecimiento del bacilo tuberculoso mucho despus
de la excrecin de los frmacos y permiti la indicacin de
regmenes teraputicos de uso ms fcil, lo que se tradujo
en notorias mejoras. Esta supresin prolongada del crecimiento se conoce como efecto posantibitico.
Cuando se elabor el primer frmaco antituberculoso, la
estreptomicina, se reconoci que la respuesta inicial conduca a la recada despus de algunas semanas debido a que
las bacterias sobrevivientes se tornaban resistentes al mismo. En efecto, ahora se entiende que la terapia simultnea
con tres frmacos activos (terapia triple) es esencial para
la remisin de la tuberculosis sin el riesgo del desarrollo
de cepas resistentes. ste es el segundo principio, de suma
relevancia para el tratamiento antimicrobiano de muchas
166
CAP. 16
CONTROL DE LA QUIMIOTERAPIA ANTIMICROBIANA
infecciones, e ilustra cun necesaria resulta la prueba primaria de la sensibilidad de los aislados como gua teraputica. El uso habitual de esas pruebas de sensibilidad
por los laboratorios de diagnstico clnico empez en ese
momento (finales del decenio de 1950 y principios del de
1960) y ahora tienen un uso extendido en todo el mundo.
La observancia de la terapia es otro principio importante del control de la quimioterapia, aprendido en aquellos
primeros das del tratamiento de la tuberculosis, y es en
particular importante para las enfermedades en las que la
curacin depende de la terapia prolongada (seis a 18 meses). Para mala fortuna, muchas de las vctimas de la tuberculosis provenan de estratos sociales empobrecidos,
lo que haca difcil la observancia teraputica. Pronto se
conoci que el tratamiento fracasaba con frecuencia en esta
situacin, a menudo debido al desarrollo de microorganismos resistentes. Por lo tanto, gan aceptacin la terapia de
observacin directa. De manera alternativa, puede analizarse la orina de los enfermos para reconocer la presencia
de frmacos excretados. En fecha reciente, estas lecciones
bsicas tuvieron que reaprenderse en Nueva York, en donde los recortes de los servicios sociales y mdicos condujeron a la cesacin de la terapia de observacin directa, lo
que propici un enorme brote de tuberculosis multirresistente con un alto grado de letalidad.
Resistencia antibitica (cuadro 16-1)
Desafortunadamente, el propio xito de la quimioterapia
antimicrobiana condujo a su declinacin. Los mdicos y
pacientes consideran a los antimicrobianos como una panacea que cura toda afeccin, as que los antimicrobianos se
prescriben de manera irrestricta. Este sobreuso se vincula
de forma inextricable con la resistencia, bajo la forma de
Cuadro 16-1
un fenmeno de seleccin natural que permite la supervivencia de cepas resistentes. La mayor parte de la poblacin
del mundo puede comprar antibiticos legal o ilegalmente,
aunque en muchos pases estn disponibles slo con receta mdica. Estos medicamentos representan una industria
mundial multimillonaria y se ha creado un gran mercado
negro con estos frmacos. Los habitantes del Tercer Mundo, que requieren los antibiticos con ms frecuencia debido a sus ndices de infeccin muy elevados, no pueden
permitirse el consejo mdico apropiado, las pruebas de laboratorio o los cursos completos de tratamiento necesarios
para erradicar las infecciones; en consecuencia, la resistencia antibitica es un problema particular en estas reas
del mundo, sobre todo en las zonas urbanas necesitadas.
Incluso en los pases ricos de Europa occidental y Norteamrica, los clnicos emplean mal los antimicrobianos y
en los ltimos 10 aos se han identificado tendencias muy
preocupantes de la resistencia. El mal uso incluye prescripciones en las cuales el agente, la dosis, la duracin o la va
de administracin no se indican o son incorrectos. Mientras que el uso ejerce una presin acumulativa sobre la seleccin de cepas resistentes (casi siempre por mutacin o
adquisicin de plsmidos resistentes) en los planos individual y social, las dosis bajas por periodos prolongados
suscitan resistencia con ms probabilidad que el mismo
peso total del frmaco administrado como una dosis ms
alta por un periodo ms corto. Ante esta situacin, muchos
pases han introducido campaas educativas pblicas y
profesionales. Las del Reino Unido han sido en especial
exitosas en la reduccin del uso de antibiticos por la comunidad, aunque la utilizacin hospitalaria contina quiz
en aumento y prosiguen todava los problemas principales
de la resistencia, como el caso del multirresistente Staphylococcus aureus.
Tendencias en los niveles de resistencia (%)

1997
Penicilina/neumococos
Penicilina/meningococos
Staphylococcus aureus multirresistente
Glucopptido/enterococos
Ciprofloxacina/E. coli
Gentamicina/Pseudomonas
Ceftacidima/Klebsiella
Amoxicilina/Haemophilus
Amoxicilina/Moraxella
Ciprofloxacina/Campylobacter
2003
Reino Unido
Sur de Europa
Reino Unido
Sur de Europa
10
0
5
1
2
3
1
20
80
1
50
40
75
5
15
40
20
30
80
40
5
0
40
5
8
7
10
15
95
10
50
40
75
10
30
50
40
40
95
60
PRINCIPIOS GENERALES DEL CONTROL DEL LABORATORIO DE LA QUIMIOTERAPIA
167
Principios generales del control

del laboratorio de la quimioterapia
En la actualidad existen ms de 100 antibiticos autorizados para uso clnico en el Reino Unido y muchos ms a
escala mundial. El papel principal del laboratorio de diagnstico de un hospital consiste en definir a los agentes
patgenos causantes de la enfermedad en pacientes cuyas
muestras se procesan y, en la medida de lo posible, someter el aislado a prueba para determinar la sensibilidad con
antibiticos relevantes. En condiciones normales, la prueba
se realiza slo en relacin con una serie limitada y predeterminada de antibiticos con importancia clnica para la
infeccin y, de manera presumible, activos contra el agente patgeno aislado.
El proceso para determinar los antimicrobianos que se
someten a anlisis es complejo y debe considerar factores como el sitio y la gravedad de la infeccin, el mtodo
de excrecin o el metabolismo del antimicrobiano, la funcin heptica y renal del paciente, la toxicidad, las vas de
administracin disponibles, el costo, la necesidad de una
terapia de combinacin, el beneficio clnico probado, el
tratamiento actual con antimicrobianos u otros frmacos
y las interacciones del agente. Aunque hay cerca de 100
antimicrobianos autorizados en el Reino Unido, stos se
componen slo de algunas docenas de clases de frmacos
diferentes y a menudo basta probar un agente representativo de cada clase.
Muchas veces los pacientes iniciaron ya el tratamiento
emprico, antes de contar con los resultados del cultivo y la
sensibilidad, con la esperanza de que el laboratorio confirme las muestras. No obstante, an es importante procesar
los especmenes a la brevedad posible y, en caso de que
el tratamiento necesite modificarse a la luz de los resultados del cultivo y la sensibilidad, se prescribe un agente
ms potente o menos txico. De igual modo, es importante
trasladar con propiedad las muestras y establecer una buena comunicacin para obtener con facilidad un dictamen
y que ste se transmita con rapidez. Tambin es til para
que el laboratorio publique los resmenes de las sensibilidades a varios microorganismos, los clnicos elijan la terapia emprica ms adecuada y los laboratorios participen
en los esquemas de vigilancia con objeto de proporcionar
la advertencia oportuna de la aparicin de variantes raras
o nueva resistencia. Esto permite a los mdicos y funcionarios de salud pblica utilizar la informacin y planear
el tratamiento apropiado, adems de contener la expansin
de estas nuevas variantes resistentes; cabe sealar que en el
mundo moderno la propagacin de un pas a otro o de un
continente a otro toma muy poco tiempo (fig. 16-1).
Existen otras maneras mediante las cuales el laboratorio
puede dirigir o controlar de manera provechosa la terapia
Figura 16-1 Un ejemplo de un paciente con notable inmunosupresin que sufre infeccin en piel y ojo por Pseudomonas, con la
circulacin sangunea extendida, despus de recibir terapia contra
el cncer que redujo las defensas del cuerpo contra la infeccin.
Alguna vez este tipo de infeccin mataba a los pacientes; en la
actualidad, el tratamiento con antibiticos modernos suele tener
xito. Sin embargo, cada vez son ms comunes estos individuos a
medida que la medicina moderna es ms exitosa y radical. Por lo
tanto, los antibiticos se utilizan cada vez ms, tanto en el hospital
como en la prctica general.
antimicrobiana. La ms importante es la medicin de las

concentraciones sanguneas, y en ocasiones hsticas, de los
frmacos, para asegurar que se obtienen los valores teraputicos adecuados en pacientes muy graves; de ese modo
puede asegurarse una toxicidad reducida al mnimo o nula.
Estas mediciones no son necesarias en la mayora de los
pacientes, slo en aquellos en quienes es necesario utilizar
los antimicrobianos en una proporcin teraputica reducida, es decir, agentes cuyas dosis efectivas necesarias se
aproximan a las que pueden ser txicas. Los aminoglucsidos y los glucopptidos son los ejemplos ms obvios de estos grupos de antibiticos. El uso de dichos medicamentos
en particular txicos debe reservarse para las infecciones
graves en las cuales la eleccin de agentes activos est limitada, a menudo por problemas de resistencia.
No se solicita con frecuencia la medicin de la actividad
antimicrobiana en el paciente, pero se logra con facilidad al medir la actividad inhibitoria o cidal del antimicrobiano en el suero; para ello se toman casi siempre
muestras antes de administrar una dosis (nivel mnimo) y
una hora despus (nivel mximo). Por lo regular, la distribucin del antimicrobiano en los tejidos es completa para
entonces. Segn sean la farmacodinamia del antimicrobiano y el estado de la enfermedad, puede ser importante
alcanzar niveles inhibitorios o cidales altos en los puntos
mximos de la muestra; por ejemplo, los aminoglucsidos,
como la gentamicina, tienen una actividad dependiente
de la concentracin. En cambio, en los lactmicos beta es
importante tener actividad durante el periodo completo de
dosificacin debido a su carencia de un efecto posantibitico contra muchas bacterias (dependencia del tiempo).
En individuos muy enfermos suele ser til evaluar beneficios potenciales de la terapia de combinacin en el la-
168
CAP. 16
boratorio para predecir los regmenes ms activos. Estas

pruebas pueden ser tiles, sobre todo en la fibrosis qustica
y en los sujetos inmunosuprimidos o con infecciones como
endocarditis o meningitis, casos en los que es necesario
aniquilar al microbio con los antibiticos sin la ayuda del
sistema inmunitario del husped.
El concepto de prueba de sensibilidad se ha conservado
desde que se introdujo a una escala amplia hace casi 40
aos. Por necesidad, las pruebas deben ser simples, ya
que un laboratorio clnico que atiende a una poblacin de
250 000 sujetos efecta las tcnicas en cientos de microorganismos cada ao. Pese a su simplicidad, las pruebas han
resultado de suma utilidad durante aos para orientar la terapia. Esto es lo que ms sorprende cuando se considera
la complejidad de los casos individuales, en los cuales el
microbio interacta con el sistema inmunitario del husped
en diversas afecciones, quiz sin relacin con el trastorno
sometido a prueba en el laboratorio.
Existen cuatro mtodos para la prueba de sensibilidad
de uso comn: a) difusin en agar (fig. 16-2); b) incorporacin en agar; c) macrodilucin en caldo, y d) microdilucin
en caldo. El primero es el ms usado en el Reino Unido (en
cerca de 85% de los laboratorios es el mtodo habitual). En
este mtodo, las cantidades escrupulosamente controladas
de los antibiticos se alojan en discos de papel; stos se
colocan de manera previa en una superficie de la placa de
agar inoculada con un nmero controlado de las bacterias
sometidas a anlisis. Por lo regular se prueban hasta seis
antibiticos por placa. Las placas se incuban en condiciones controladas por 18 a 48 horas, segn sea el ndice de
crecimiento bacteriano. Se miden las zonas de inhibicin
del crecimiento por accin del antimicrobiano difundido y
se relacionan con las bacterias sensibles y resistentes conocidas del control. Los resultados se informan como sensibles o resistentes, con base en el conocimiento de la
farmacocintica especfica de cada antimicrobiano, incluidas las concentraciones alcanzadas del frmaco en el sitio
de la infeccin. Muchos laboratorios del Reino Unido han
adoptado en fecha reciente los mtodos de difusin en agar
con disco, mucho ms estandarizados, con objeto de permitir una comparacin ms exacta de los resultados para
propsitos de vigilancia (British Society for Antimicrobial
Chemotherapy y National Committee for Clinical Laboratory Standards; vanse las Lecturas adicionales).
De manera alternativa, en la dilucin en agar, las concentraciones preestablecidas de un antimicrobiano se incluyen
en placas de agar antes de que se vierta y entonces, cuando
se solidifica, las bacterias se observan sobre la superficie.
Hasta 30 microbios pueden probarse con un solo agente
Figura 16-2 Un ejemplo de las pruebas de sensibilidad por

disco. ste es el mtodo ms comn que prueba la sensibilidad
en el Reino Unido. La zona de inhibicin del crecimiento de bacterias del husped se determina por la concentracin del antibitico
en cada uno de los discos de papel y la sensibilidad de la bacteria.
En este ejemplo la bacteria es totalmente resistente a cuatro antibiticos. Hay zonas pequeas de inhibicin alrededor de dos discos
(la bacteria es an resistente) y zonas grandes de la inhibicin alrededor de otros dos discos (sensibles). Este ejemplo de un agente
patgeno multirresistente es cada vez ms comn. La zona impar,
no circular, de la inhibicin de dos discos se debe a que el disco
adyacente entre ellos contiene un antibitico que interacta con
ellos, lo cual da lugar al antagonismo de la accin (intercepcin) y
la sinergia (forma de campana), respectivamente.
por placa. La concentracin ms baja del antimicrobiano

que inhibe el crecimiento visible de las bacterias despus
de la incubacin es la concentracin inhibitoria mnima
(CIM).
Las pruebas de dilucin en caldo para la sensibilidad
antimicrobiana se realizan en tubos de ensayo (macrodilucin) o placas de microtitulacin (microdilucin). Se incuba, a las concentraciones conocidas del antimicrobiano,
un inculo controlado de manera cuidadosa del microbio
que se prueba; ste, a diferencia de la prueba en agar, puede
ser un virus (si se incluye una variedad celular) o ciertos
hongos o parsitos protozoarios, como los parsitos del
paludismo, adems de las bacterias. La CIM es la concentracin ms baja que inhibe el crecimiento (segn lo revela la turbiedad a simple vista). Casi siempre es adecuado
evaluar slo los valores del antimicrobiano que inhibe el
crecimiento; el sistema inmunitario del husped permite la
curacin al destruir a la mayor parte de los microbios despus de someterse a control por el antimicrobiano.
AUTOMATIZACIN
169
A diferencia de las pruebas de agar, las concentraciones

bactericidas mnimas (CBM) pueden evaluarse si se crea
un subcultivo de las concentraciones inhibitorias para buscar cualquier sobreviviente. La concentracin ms baja con
la eliminacin de 99.9% del inculo original es la CBM.
Para las infecciones complicadas puede ser importante establecer los valores para agentes patgenos individuales y
cerciorarse de que dichos niveles de actividad se logran en
el paciente.
Las pruebas de CIM, y algunas veces de CBM, se solicitan aun en el tratamiento de infecciones difciles, como la
endocarditis y la osteomielitis.
Pruebas con microbios diferentes de las bacterias
La comprobacin de la sensibilidad para microbios distintos a las bacterias es, por comparacin, muy limitada.
Hasta hace poco tiempo las investigaciones relativas eran
escasas, tal vez debido a la ausencia relativa de antimicrobianos eficaces para muchos de estos microbios. Esto
supona que no haba opcin teraputica en caso de resistencia. Desde luego, tambin se han soslayado de cierta
manera los problemas de resistencia. No obstante, en la
actualidad se observa una verdadera explosin de nuevos
agentes, en particular antimicticos y antivricos, en respuesta a las necesidades crecientes generadas por nuevas
enfermedades, como el SIDA. Esta enfermedad no slo requiere terapia antivrica especfica para el virus HIV, sino
tambin tratamiento para muchas otras infecciones vricas,
micticas, bacterianas y protozoarias, a las cuales pueden
ser ms susceptibles los pacientes.
Es frecuente prescribir terapia antimicrobiana supresora
en los pacientes con HIV por muchos meses o aos, puesto que en virtud de la profunda inmunosupresin, es casi
imposible erradicar los microbios de la infeccin. ste es
un ejemplo claro de la aparicin de resistencia, como sucedi con la tuberculosis; stas son tambin lecciones para
mejorar la eficacia teraputica y prevenir la aparicin de
la resistencia y, sin duda, sern de utilidad para idear un
tratamiento apropiado del SIDA.
La resistencia es un problema particular en la teraputica de la infeccin vrica primaria por HIV; en sta, para
el momento en que la enfermedad se hace evidente, se advierte una carga vrica enorme con capacidad de desarrollar mutantes resistentes naturales que pueden sobrevivir a
la terapia y multiplicarse. Ahora que ya estn disponibles
nuevos agentes anti-HIV, la deteccin de esas cepas ser
importante en el futuro, de tal modo que pueda individualizarse la mejor terapia de combinacin para cada paciente.
Los recientes desarrollos han permitido la averiguacin
de CIM de bacterias y hongos en placas con agar mediante
el uso de pruebas E, que contienen gradientes antimicro-
Figura 16-3 Un ejemplo de la prueba E para la comprobacin

de la sensibilidad. Las concentraciones graduadas de un antibitico
se incluyen en cada una de las tiras plsticas. Un microorganismo control de sensibilidad conocida se coloca en el exterior de
cada tira y el agente patgeno de la prueba en el interior. En este
caso el microorganismo prueba es muy resistente. El grado de
resistencia o CIM (vase el texto) puede leerse fuera de la tira.
bianos en tiras plsticas, y el valor inhibitorio puede leerse

despus de la incubacin, casi de la misma forma como se
interpretan las zonas de inhibicin en la prueba tpica de
difusin en agar con disco (fig. 16-3).
Automatizacin
Mientras la automatizacin se generaliza en los laboratorios, se llevan a cabo tentativas para adaptar los mtodos de prueba existentes para la sensibilidad. Las pruebas
de microdilucin en caldo son tal vez las ms favorables
para la modificacin y las placas prepreparadas disponibles
pueden interpretarse de modo automtico por espectrofotometra. La lectura automatizada de las zonas con inhibicin en las pruebas de difusin en agar con disco tambin
es promisoria en cierto grado.
Los mtodos ms recientes para comprobar la sensibilidad son mucho ms susceptibles a la automatizacin y, en
realidad, a menudo la requieren. stos incluyen la nefelometra, la bioluminiscencia, la impedancia o vigilancia de
la conductancia y la citometra de flujo. Mientras estos mtodos directos no suministren resultados rpidos (dentro
de una a dos horas) acerca de la actividad inhibitoria y quizs tambin de la actividad cidal de los antimicrobianos,
por el momento slo son tcnicas de investigacin.
Muchos de los valores sricos de los antimicrobianos
se cuantifican de rutina por mtodos automatizados, por
170
CAP. 16
ejemplo EMIT y TDX, que utilizan reacciones y fluorescencia enzimticas. Los valores de los antimicrobianos
ms recientes se pueden analizar por cromatografa lquida
de alta resolucin o por la tcnica tradicional con placa,
en la cual el suero o la muestra hstica del paciente toman
el lugar del disco que contiene el antibitico en la prueba
de difusin en agar con disco y el campo del organismo se
convierte en una cepa control sensible. Es posible utilizar
la concentracin del frmaco en el suero (volumen conocido) o el tejido (peso conocido) y el tamao de la zona de
la inhibicin para calcular la concentracin del frmaco.
En tanto el anlisis de los valores sricos de ciertos antimicrobianos no se transforme en una prueba de rutina, el
anlisis de las concentraciones hsticas es slo una tcnica
de investigacin.
Control del hospital y enlace clnico

La base del conocimiento adquirido a partir del trabajo en
el laboratorio se puede emplear para coordinar el trabajo
de varios grupos de personas relacionadas con la infeccin
que trabajan en la comunidad y los hospitales. Entre estos
individuos figuran el equipo de enfermeras y mdicos del
control de la infeccin, adems de los clnicos de la salud
pblica encargados del control de la infeccin en la comunidad. Con una alerta oportuna es posible prevenir con
eficacia los brotes. La infeccin adquirida en el hospital es
muy comn (quiz cerca de 10% de los pacientes admitidos), de manera tal que cualquier informacin sobre prevencin y actualizacin de los ltimos microorganismos
epidmicos puede prevenir muchas infecciones y limitar el
uso inadecuado de los antibiticos.
Es til el conocimiento de los patrones locales de sensibilidad con objeto de que los mdicos establezcan el tratamiento emprico de la infeccin, aunque la comunicacin
rpida de los resultados de pacientes individuales tambin
Cuadro 16-2
es relevante para orientar la terapia antimicrobiana a partir de una base racional. La mayor parte de los hospitales
y algunas prcticas generales han redactado lineamientos
correspondientes; asimismo, los datos de sensibilidad que
ponen a disposicin los laboratorios locales crean una base
til para disear estas pautas y proporcionan las recomendaciones locales para instituir el tratamiento emprico ms
apropiado. Est probado que ello evita la exposicin innecesaria a los antibiticos, algunos de ellos costosos y txicos, y mejora el resultado del paciente.
El laboratorio tambin debe ser una plataforma para la
educacin de clnicos y pblico acerca del mejor uso de
los antimicrobianos. Este tema apenas si se toca entre los
estudiantes universitarios y todava constituye un campo
complejo; adems, la cantidad de frmacos crece de forma constante, lo cual hace cada vez ms difcil que el clnico los prescriba de forma apropiada. En fecha reciente
se ha propuesto que los estudiantes universitarios y posgraduados enseen la terapia antimicrobiana (www.bsac.
org.uk). Otra manera de reducir la exposicin antibitica
consiste en disminuir la cantidad de agentes notificados a
slo aquellos que parecen ms apropiados (quiz dos o tres)
o no divulgar ninguna sensibilidad para aislados que careCuadro 16-3 Nuevos antibiticos (2003)
Grampositivos
Respiratorios
Sinercida
Linezolida
Daptomicina
Dalbavancina
Ortavancina
Iclaprima
Cefalosporinas anti-PBP2
Cetlidos
Quinolonas
De amplio espectro
Tigeciclina
Ertapenem
Prescripcin de antibiticos: tipos de intervencin y administracin
Educativa
Reguladora
Organizacional
Estructural
Restrictiva
Lineamientos*
(ACUERDO)
Reembolso
Equipos
multidisciplinarios
Prescripcin
computarizada
Listas limitadas,
formularios
Sustitucin teraputica
(incluido el cambio)
Ciclismo
Pruebas/informes del
lmite de sensibilidad
Fechas de suspensin
automtica
Programas
Detalles de extensin/
acadmicos*
Auditora/
retroalimentacin*
Talleres interactivos*
* Revisin de Cochrane.
Formas de orden
CONCLUSIN
cen de relevancia clnica. Sin embargo, estas medidas no se

han evaluado de manera adecuada y confan demasiado en
la informacin que suministra el mdico al laboratorio. El
cuadro 16-2 enumera las medidas actuales aplicadas para
mejorar la administracin antimicrobiana. La base de la
evidencia para tales conductas se revisa con frecuencia, sea
en los hospitales o en la comunidad (www.cochrane.org).
Es importante redoblar los esfuerzos para limitar el uso inadecuado del antibitico. Esto resulta ms importante, ya
que en una reunin europea reciente se confirm que varias
compaas farmacuticas importantes suspendieron o redujeron la investigacin en antibiticos. La aparicin de
nuevos y prometedores antimicrobianos se ha restringido
en comparacin con 30 aos antes (cuadro 16-3). Slo se
introdujo una clase nueva por completo de antimicrobianos
en los ltimos 40 aos.
Conclusin
Pasteur o Fleming no se expondran a ningn apuro en un
laboratorio diagnstico del hospital comn en estos aos.
No se han observado grandes avances en los mtodos de
prueba, no los imaginables si se considera el trabajo actual
de la gentica microbiana. Este trabajo ha incrementado
en gran proporcin el conocimiento y entendimiento de
los mecanismos resistentes y, sin duda alguna, tendr un
efecto en la manera de probar la resistencia en el laboratorio de diagnstico en los prximos 10 o 20 aos. Incluso
ahora, los laboratorios ms grandes pueden probar directamente por sonda de DNA una pequea seleccin de genes
resistentes, como el mec A que convierte a Staphylococcus
aureus en un supermicrobio resistente a todos los antimicrobianos lactmicos beta. De forma similar, se prueba de
rutina la presencia de enzimas lactmicas beta en algunas
bacterias en vez de evaluar la expresin fenotpica de estas
enzimas (que puede ser difcil por mtodos de prueba tradicionales para la sensibilidad). Desde luego, las pruebas genotpicas directas se utilizarn de modo ms extenso en el
futuro, dado que delinean el perfil de resistencia potencial
de un microorganismo, en vez de su resistencia al momento de la comprobacin y bajo las artificiales condiciones
experimentales del laboratorio. Por otra parte, el progreso
para establecer estas nuevas pruebas en los laboratorios de
diagnstico ha sido lento.
ste es un perfil optimista y realista del papel futuro del
laboratorio en este campo. Empero, no es posible ayudar
sin ser pesimista acerca del potencial de las bacterias para
tornarse resistentes a todos los antimicrobianos, a menos
que se administren de modo mucho ms cuidadoso. El des-
171
cubrimiento de los mecanismos de los microbios, segn lo

atestigua el uso de los integrones, transposones, operones,
regulones, sinergones, etc., indica que los microbios son
muy adaptables y estn casi siempre cuando menos un
paso adelante de la batalla microbiana-antimicrobiana.
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pp 13-17.
SECCIN 4
MICROBIOLOGA
Virologa, Micologa
y Parasitologa
17
Microscopia en virologa:
aplicacin y preparacin de la muestra
Marie M Ogilvie
Introduccin
La microscopia de luz ha desempeado un papel significativo
en la virologa desde su uso ms temprano en el examen de
las preparaciones teidas de la clula o los cortes de tejido.
Hoy en da ningn microscopio se encuentra en la banca de
virologa de muchos laboratorios de microbiologa, puesto que el trabajo de diagnstico regional general se basa en
el uso de los reactivos de inmunoensayo para la deteccin
del antgeno o anticuerpo vricos. Cada vez ms, incluso
en el laboratorio de diagnstico especializado en virus, la microscopia se emplea con menos frecuencia, mientras que los
mtodos ms sensibles de deteccin de virus, basados en la
amplificacin del cido nucleico por la reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR), se introducen junto con mtodos existentes de deteccin del antgeno. Sin embargo, en los primeros aos del nuevo milenio los microscopios son an de uso
regular en el trabajo de diagnstico de virologa, ya que los
cultivos celulares se examinan para efectos citopticos debido al crecimiento del virus, y las clulas teidas con reactivos
fluorocromomarcados se examinan para antgenos del virus.
Histopatologa: cuerpos de inclusin

y clulas multinucleadas gigantes
El histopatlogo que examina frotis fijos teidos de clulas
o cortes de tejido observa los cambios morfolgicos caractersticos que se vinculan con la presencia de infecciones especficas de virus. Las ms conocidas de estas caractersticas
distintivas son los cuerpos de inclusin partculas acumuladas de virus (como en el cuerpo de Negri comn de la rabia)
o exceso de protenas sintetizadas durante la replicacin de
virus y las clulas multinucleadas gigantes. Estas ltimas,
una consecuencia de la fusin entre las membranas plasmticas de las clulas adyacentes, son una caracterstica de infeccin con los virus envueltos, que poseen una glucoprotena que
induce la fusin independiente del pH en la superficie celular,
por ejemplo el virus sincitial respiratorio (RSV) y el virus de
la inmunodeficiencia humana (HIV). Los virlogos usan el
trmino sincitio (del griego, syn = unin) para tal clula. Los
virus del herpes simple (HSV) y la varicella-zoster (VZV)
producen clulas multinucleadas in vivo e in vitro (en un
cuerpo viviente y en vidrio, es decir, en cultivo). An se
da el nombre de Tzanck a los frotis de clulas preparados por
este mtodo para obtener raspados de la base de una lcera o
vescula, que despus se tien y examinan en busca de clulas
gigantes del herpes (HSV o VZV) (fig. 17-1).
El bien conocido cuerpo de inclusin ojo de bho visto
en las clulas infectadas con citomegalovirus (CMV) es una
inclusin intranuclear rodeada por un halo claro, dentro de
una clula considerablemente agrandada (meglica), aunque
slo hay casi siempre un ncleo. El CMV puede producir
clulas multinucleadas gigantes in vivo; stas son de origen
endotelial y su presencia en la circulacin representa enfermedad sistmica grave. La evidencia de localizacin intracelular
de CMV es importante en la confirmacin del significado
patolgico del hallazgo de este virus, lo que no siempre puede proporcionar el simple aislamiento del microorganismo.
176
CAP. 17
MICROSCOPIA EN VIROLOGA: APLICACIN Y PREPARACIN DE LA MUESTRA
Figura 17-1 Corte de una lesin herptica de piel, teido con

hematoxilina y eosina. La flecha seala una clula multinucleada
gigante. Cortesa del Dr. K McLaren, Department of Pathology,
University of Edinburgh.
Virologa
El xito del aislamiento del virus (por cultivo) o la deteccin de antgenos vricos en las clulas del material clnico depende en gran medida de la obtencin de la muestra
correcta, su manipulacin apropiada y el uso de la gama
de cultivos celulares y sondas inmunofluorescentes ms
convenientes para la deteccin del virus. No hay recursos
disponibles para el examen indirecto de cada virus posible,
aunque la inoculacin de una gama de cultivos celulares
permite que cualquiera se pueda cultivar para su crecimiento. Deben consultarse los textos normativos modernos
sobre el trabajo de diagnstico para obtener detalles ms
completos de los aspectos discutidos ms adelante; uno de
ellos, el que editaron Mahy y Kangro (vanse las Lecturas
adicionales), proporciona una buena introduccin para el
investigador.
clulas. Las muestras no deben congelarse antes del procesamiento, pero deben trasladarse al laboratorio de virus tan
pronto como sea posible y mantenerse enfriadas sobre hielo
o en un refrigerador si hay algn retraso. Cuando el periodo
entre la recoleccin de una muestra y su inoculacin en el
cultivo celular se reduce al mnimo, se aumenta el ndice
de aislamiento y el virus se detecta en menos tiempo. Si no
es posible inocular las clulas apropiadas dentro del mismo
da, la muestra se puede guardar a 4C toda la noche. Un
almacenamiento mayor para mantener la viabilidad debe
plantearse a temperaturas muy bajas, por lo general en un
ultracongelador a 70C. (Los congeladores ms comunes del laboratorio que funcionan a temperaturas de 18 a
20C no son convenientes para la preservacin del virus;
se observa un descenso considerable de la infectividad en
esos lmites de temperatura.)
Procesamiento de la muestra e inoculacin
de los cultivos celulares
Las formas de solicitud que acompaan a las muestras deben
indicar con claridad el carcter de la enfermedad, la fecha
de inicio, la naturaleza de la muestra, el sitio del cual se recolect y la edad del paciente para efectuar investigaciones
apropiadas. El procesamiento de la muestra para la inoculacin de los cultivos celulares o la preparacin de las clulas
para la tincin inmunofluorescente es casi siempre un procedimiento estandarizado, de acuerdo con la naturaleza de
la muestra. Los cultivos tienen que examinarse para cualesquiera de los efectos citopticos (ECP: el cambio morfolgico celular resulta de la replicacin del virus), sobre una base
diaria durante los primeros cinco das despus de la inoculacin, para no perder algunas seales, aunque una lectura
posterior de los tubos en das alternos suele ser suficiente
para captar los cambios ms graduales de los virus de crecimiento ms lento como el CMV y muchos adenovirus.
Recoleccin y transporte de la muestra

Muchas infecciones son relativamente cortas respecto del
periodo de replicacin vrica activa una vez que se manifiestan los sntomas, de modo que las muestras que contienen
el virus infeccioso y las clulas que expresan el antgeno se
obtienen mejor en los primeros dos a tres das de la enfermedad. El material debe contener clulas del sitio afectado:
clulas epiteliales de la parte posterior de la nariz y la garganta o la base de una lcera. En lactantes, las secreciones
respiratorias se pueden recolectar por aspiracin con un catter fino y en sujetos mayores por enjuague, pero las clulas recolectadas con una escobilla se colocan en un medio
de transporte de virus. Se puede utilizar cualquier lquido
isotnico amortiguado que contenga protena estabilizadora
para preservar la infectividad y evitar la desecacin de las
Requisitos para el diagnstico rpido

de infecciones vricas
Pocos virus pueden identificarse en los cultivos celulares
de rutina en menos de tres das (el virus del herpes simple
es el nico regular). Para la atencin clnica son importantes el control de la infeccin dentro de las salas del hospital
(y la terapia antivrica especfica donde est disponible),
la confirmacin ms temprana de un diagnstico clnico o la
identificacin de una infeccin insospechada. Con este fin,
las muestras apropiadas se examinan en forma directa para
reconocer evidencia de virus especficos, por microscopia
de inmunofluorescencia (IF) para infecciones respiratorias,
drmicas y otras en las cuales las clulas infectadas se obtienen con facilidad. Las secreciones respiratorias primero
INMUNOFLUORESCENCIA
se deben diluir y lavar en una solucin amortiguada salina

para preparar las clulas epiteliales respiratorias (libres de
moco) que puedan depositarse sobre el portaobjetos. Por
lo general se usan varios lugares o celdillas, pero una preparacin citocentrifugada es til y rpida si el agente patgeno de estudio es un virus predominante, como en una
influenza epidmica o por RSV de temporada. Una vez que
se secan al aire, los portaobjetos se fijan por inmersin en
acetona fra por 10 minutos, lo que asegura que las clulas
permanezcan sobre el portaobjetos, retengan antigenicidad
y sean permeables al anticuerpo, aunque en la mayor parte
de los casos carecen de infectividad residual.
177
Un periodo de incubacin (en promedio de 15 a 30 min) en

una cmara hmeda permite al anticuerpo reaccionar con algn antgeno especfico de virus en las clulas. El anticuerpo
separado se elimina al lavarlo con una solucin salina amortiguada; antes, el portaobjetos se seca al aire y se monta para
observarse en un microscopio especial con una fuente de luz
ultravioleta incidente. El lquido de montaje consiste en glicerol de grado analtico (50%) en una solucin salina amortiguada de fosfato a un pH ptimo de 8.6 para maximizar
la fluorescencia. sta se atena con rapidez al exponerse a la
irradiacin ultravioleta, de modo que la observacin prolongada no es recomendable y los registros fotogrficos deben
obtenerse cuando se requieran.
Inmunofluorescencia
En los decenios de 1980 y 1990 los laboratorios de diagnstico de virus ampliaron su uso de la microscopia, en particular
como una ayuda para el diagnstico rpido de infecciones
vricas. La disponibilidad comercial de los reactivos de alta
calidad en la forma de anticuerpos monoclonales apoya la
aplicacin de la inmunofluorescencia (IF) para una amplia
gama de antgenos vricos. Se puede aplicar el anticuerpo
especfico (o un conjunto de anticuerpos) conjugado con un
fluorocromo colorante a una preparacin celular en una prueba directa de inmunofluorescencia (DIF) para el antgeno a
detectar. ste es el mtodo ms utilizado para el diagnstico
rpido por microscopia de luz, en especial conveniente para
las muestras simples, pero tambin aplicado a las secreciones
respiratorias diarias de lactantes y nios; lo anterior constituye una parte importante del trabajo de un laboratorio de
virus que suministra servicio a una unidad peditrica durante
la epidemia anual de enfermedades respiratorias.
Los mismos reactivos tambin pueden ser tiles para
la tincin de las clulas de los cultivos celulares, sea para la
confirmacin del cultivo, y tipificacin en el caso de HSV,
o para el examen de la deteccin temprana (pre-ECP) de
antgenos, en particular til para los virus de crecimiento
ms lento, como el CMV y los adenovirus. Ms adelante se
proporcionan ejemplos de la gama y aplicaciones. Algunas
pruebas serolgicas para los anticuerpos vricos todava se
basan en la inmunofluorescencia indirecta, casi siempre para
los anticuerpos del virus de Epstein-Barr, parvovirus humano
(eritrovirus B19) o virus humano del herpes 6 (HHV6).
En virologa, el fluorocromo, colorante ms utilizado es el
isotiocianato de fluorescena (FITC), que confiere una fluorescencia verde manzana brillante. Es provechoso si se incluye una contratincin, de modo que las clulas que contrastan
con el fondo negativo sean visibles (teidas de rojo apagado
si se emplea el colorante azul de Evans). El anticuerpo apropiado se aplica a la celdilla o portaobjetos que tiene las clulas
examinadas, un frotis o depsito de clulas directas de un
paciente, clulas de un cultivo o un cubreobjetos shell vial.
Virus respiratorios
La inmunofluorescencia directa es el procedimiento de IF
ms comn en la virologa diagnstica para la deteccin
rpida de antgenos y puede ser la nica prueba empleada
para diagnosticar la infeccin del RSV en nios; en realidad, en manos experimentadas puede ser tan confiable
que ya no se considera necesario el aislamiento paralelo
del virus. La mayora de los lactantes se infecta con RSV
en su primera estacin invernal y uno de cada 100 recin
nacidos admitido en el hospital desarrolla la alarmante
complicacin de bronquiolitis. Puesto que el RSV temporal de la epidemia anual invernal es con mucho el agente
patgeno respiratorio ms comn en lactantes y nios, es
una prioridad principal la prueba rpida para RSV. En la
figura 17-2 se muestra la apariencia caracterstica (glbulos intracelulares que se tien de verde manzana) de una
Figura 17-2 Tincin de inmunofluorescencia directa de clulas

epiteliales respiratorias de un lactante con bronquiolitis aguda. La
tincin verde manzana brillante de las clulas marcadas con el anticuerpo fluorescente del RSV indica la infeccin con este virus; las
clulas no infectadas contrateidas con el colorante azul de Evans
aparecen en rojo apagado en el contraste.
178
CAP. 17
prueba positiva de DIF para el RSV en clulas respiratorias

de secreciones de un lactante. Se dispone de tratamiento
antivrico especfico para la infeccin por RSV en sujetos
con riesgo especial por una enfermedad grave y a menudo
se requiere la prueba DIF (o un equivalente marcado de
forma enzimtica) como procedimiento urgente.
Preparaciones celulares de la piel o mucocutneas
Las clulas raspadas de la base de lesiones vesiculares de la
piel se examinan con frecuencia mediante DIF con los anticuerpos especficos para HSV-l, HSV-2 o VZV (si no es obvia
en clnica la infeccin presente). Puesto que est disponible
la terapia antivrica especfica, y las infecciones por herpes
son graves en los huspedes inmunosuprimidos, es importante un diagnstico rpido. Para ser efectivos, los frmacos
antivricos deben suministrarse tan pronto como sea posible
y la dosificacin vara de acuerdo con el virus. La naturaleza
contagiosa del VZV es tambin un problema para el control
de la infeccin (alrededor de 10% de los adultos jvenes no
contrajo varicela y se halla en riesgo si se expone al VZV).
Clulas de cultivo
Es un procedimiento muy similar a DIF en las clulas del
paciente. Los beneficios de la confirmacin rpida de un ECP
supuesto son clnicos y ahorran tiempo y recursos del laboratorio. Como los HSV-l y HSV-2 tienen diferentes relaciones y
su tendencia a causar enfermedad recurrente en diferentes sitios es variable, es til conocer el tipo del virus, lo cual es posible con los anticuerpos de tipo especfico. Se puede emplear
el anticuerpo monoclonal para los antgenos especficos de
grupo comunes presentes en los adenovirus (antgeno hexon)
o los enterovirus (antgeno VP1) para confirmar el ECP que
producen los miembros de estos grupos, respectivamente.
Antgenos vricos producidos en fase temprana

del ciclo de crecimiento
Cuando el citomegalovirus se reconoci como un agente
patgeno peligroso en los receptores de trasplante que requeran terapia antivrica result esencial detectarlo con
mayor rapidez que en el pasado. Gleaves en Estados Unidos y Griffiths en el Reino Unido establecieron el valor de
reconocer los antgenos tempranos del CMV que aparecen
despus de unas cuantas horas, en comparacin con los das
que se toman para el DNA vrico y los antgenos posteriores,
y con el tiempo necesario para la aparicin de un ECP. En
Estados Unidos se acu el trmino shell vial, mientras que
en el Reino Unido la prueba se conoci como DEAFF (Detection of Early Antigen Fluorescent Foci). Los antgenos
tempranos del VZV tambin se buscan de manera ocasional.
Un uso ms amplio del sistema shell vial ha ganado aceptacin en Estados Unidos y Europa continental, donde muchos laboratorios lo utilizan, en particular, para la deteccin
respiratoria del virus. En la propia experiencia del autor ha
mostrado gran utilidad para la identificacin temprana de las
infecciones del ojo por adenovirus y tambin para el ndice
rpido y mejorado del aislamiento del VZV. Algunos ejemplos de IF por shell vial se ilustran en la figura 17-3.
Examen microscpico de los cultivos celulares

Aunque ciertos cambios notables en el cultivo celular son
visibles a simple vista, como en el desafortunado caso de
la turbiedad o acidez por el crecimiento de bacterias u
hongos, es necesario el examen microscpico antes que se
reconozcan los cambios que produce el crecimiento del virus. Las observaciones seriadas se realizan por das, y aun
por semanas, y quiz deba trasladarse el virus a medios de
cultivo frescos para pruebas subsecuentes, de manera que
Figura 17-3 Tincin por DIF de cultivos shell vial HEF infectados 48 horas despus de la inoculacin con un escobillado de conjuntiva
teido con anticuerpo monoclonal especfico del grupo de adenovirus (a); escobillado de la garganta teido con el anticuerpo especfico
contra el grupo A de la influenza que muestra tincin nuclear y ninguna extensin fuera de las clulas originales infectadas (b).
EXAMEN MICROSCPICO DE LOS CULTIVOS CELULARES
los cultivos se examinan sin teirse. Un soporte sostiene el

tubo de cultivo sobre la platina del microscopio, mientras
que el rea entera de la monocapa celular se explora de
modo cuidadoso a bajo poder (con objetivos de 4 o 10)
con el condensador inferior a la platina hacia abajo. Las
reas focales de clulas alteradas se examinan entonces a
una mayor ampliacin. No es difcil notar la diferencia entre una monocapa de clulas por completo sanas (tubo control sin inocular del mismo lote de clulas) y una en la cual
los hoyos aparecen como clulas redondeadas y descendidas, o bien grupos de clulas que forman racimos grandes;
esto exige gran experiencia y cuidado y observacin constante para desarrollar destreza en el reconocimiento de los
efectos citopticos caractersticos que producen los virus
especficos en cultivos diferentes.
179
ECP sincitial tpico: marca caracterstica del RSV que

crece en clulas HEp2 frescas (fig. 17-4), aunque las clulas multinucleadas gigantes tambin se observan con
el sarampin y el VZV en lneas celulares sensibles.
Las caractersticas son diferentes para el ojo adiestrado
en cada caso.
El HIV no se cultiva de rutina, pero su crecimiento se puede
reconocer por la aparicin del sincitio en los cultivos de clulas mononucleares sanguneas que crecen en suspensin,
no como monocapas. El virus del herpes humano tipo 6
(HHV6) se descubri en 1986 cuando produjo ECP sincitial
en cultivos de sangre perifrica (fig. 17-5) y, en el examen
adicional, result no ser HIV sino un virus herpes desconocido. El ECP ms famoso y reciente fue el observado en
los primeros cultivos del desconocido coronavirus humano
relacionado con el sndrome respiratorio agudo grave.
Efectos citopticos en los cultivos celulares comunes

ECP degenerativo: reas dispersadas con clulas redondas y contradas, que degeneran pronto la superficie del
tubo (se observan con los enterovirus como poliovirus y
rinovirus).
Clulas redondas, retrctiles y abultadas en grupos: se
identifican con adenovirus (racimos de uvas en clulas HEp2) y HSV. Este ltimo crece con gran rapidez,
primero en pocas zonas (placas) el da posterior a la
inoculacin y luego se propaga a lo largo de la monocapa al da siguiente. Se reconocen sincitios pequeos, en
especial con HSV-2.
ECP del citomegalovirus: aparece por completo nico,
con progresin muy lenta y focos alargados de clulas
(citomeglica) abultadas en cultivos de fibroblastos humanos.
Figura 17-5 ECP en un sincitio con forma de globo (sin teir)

que produce el virus del herpes humano tipo 6 (HHV6) en cultivo
de suspensin de la lnea celular linfoblastoide (JJhan).
Crecimiento vrico no citoptico en cultivo celular

El microscopista de virologa sabe que algunos virus se
reproducen en los cultivos celulares sin producir citopatologa evidente. El mejor ejemplo conocido es el de los
virus de la influenza que crecen en las clulas del rin del
mono, donde la presencia del virus se puede revelar mediante hemadsorcin. Una glucoprotena (hemaglutinina)
codificada por el virus e insertada dentro de la membrana
de clulas plasmticas es capaz de atacar a los eritrocitos de
la sangre aadidos a la superficie. En las etapas ms tempranas de cualquier replicacin vrica, cuando slo se infectan las clulas individuales, el ECP no es obvio pero los
antgenos vricos estn presentes.
Figura 17-4 Efecto citoptico sincitial tpico del RSV al crecer

en cultivos de clulas HEp2 (sin teir), cinco das despus de la
inoculacin de la muestra respiratoria del paciente.
Investigaciones adicionales de los agentes citopticos

El microscopista no ha acabado cuando ya se observa un
ECP reconocible en un cultivo inoculado. Se espera la con-
180
CAP. 17
firmacin del diagnstico informada y se puede indicar

una identificacin adicional. El juicio del microscopista,
quien selecciona la prueba de confirmacin con base en el
ECP, la lnea celular, la muestra y otros factores, es crtico
para formular un diagnstico rpido y ahorrar recursos. La
confirmacin y tipificacin del HSV ya se mencionaron. El
ECP del adenovirus o el enterovirus se puede ahora confirmar mediante IF de las clulas, pero la tipificacin requiere un ensayo de neutralizacin porque existen muchos
tipos diferentes. Esto exige mezclar alcuotas de un aislado
bien desarrollado con celdillas de antisuero que cubran los
tipos comunes, tras inocular cultivos frescos y observar el
antisuero que inhibe al ECP, es decir, la neutralizacin de
la infectividad vrica. Estos ejercicios de tipificacin raras
veces afectan el control clnico, pero son importantes para
los estudios epidemiolgicos.
Desarrollos
El virlogo de diagnstico debe disponer de la mejor de
las tcnicas para identificar las infecciones vricas. La
deteccin rpida es crtica por las razones ya explicadas.
En tanto se emplee la microscopia de IF para las muestras
individuales, pueden utilizarse los inmunoensayos o la inmunofiltracin enzimtica para la captacin del antgeno,
mtodos menos subjetivos, que pueden automatizarse, para
el examen de cantidades ms grandes de muestra y lquidos
de cultivo amplificados. La amplificacin molecular del
cido nucleico por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) proporciona el medio ms sensible de deteccin
de una gama cada vez mayor de virus y los laboratorios
se orientan cada vez ms en esa direccin, con menor uso
del aislamiento y la microscopia habituales. Todava se requieren los intentos paralelos al aislamiento del virus en
un laboratorio que ofrezca un servicio completo, incluidas
la tipificacin epidemiolgica y las pruebas de susceptibilidad antivrica. Hoy en da se aplica el cultivo mejorado y
se (b)
advierte una bsqueda continua de clulas sensibles, en
particular para los virus incultivables. El rea que emerge
de la ingeniera gentica celular puede proporcionar tcnicas novedosas, como los sistemas inducidos por virus
ligados a enzimas (ELVIS), ya probados para el HSV (Olivo 1996), que combinan tres cultivos celulares (viejos y
nuevos), la deteccin del antgeno y la tecnologa de DNA
recombinante, sin excluir la microscopia.
Reconocimientos
Merecen un agradecimiento especial los siguientes clnicos por las figuras utilizadas en este captulo: figura 17-1,
fotografa del Dr. K McLaren, consultor histopatologista,
Universidad de Edimburgo; figuras 17-2 a 17-5, fotografas
de AJ MacAulay FIMLS, principal cientfico biomdico en
el Clinical Virology Laboratory, Department of Medical
Microbiology, University of Edinburgh. Las copias presentadas de todas las figuras se prepararon como impresos a
color en la Medical Photography Unit del Royal Infirmary
of Edinburgh, Little France.
Lennette EH, Lennette DA, Lennette ET (eds). Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, 7th edn.
1995: American Public Health Association, Washington, DC.
Mahy BWJ, Kangro HO (eds). Virology Methods Manual. 1996:
Academic Press, London.
Olivo PD. Transgenic lines for detection of animal viruses. Clin
Microbiol Rev 1996; 9: 321-343.
Simmons A, Marmion BP. Rapid diagnosis of viral infections. In
Mackie & McCartneys Practical Medical Microbiology, 14th
edn. Collee JG, Fraser AG, Marmion BP, Simmons A (eds).
1996: Churchill-Livingstone. Edinburgh.
Zuckerman AJ, Banatvala JE, Pattison JR Griffiths PD, Schoub
BD (eds). Principles and Practice of Clinical Virology, 5th
edn. 2004 Wiley, Chichester.
18
Microscopia electrnica en virologa
Hazel Appleton
Introduccin
Los virus se consideran agentes malignos que causan enfermedad y dolor. Sin embargo, cuando se visualizan en el
microscopio electrnico se reconocen diversas estructuras.
Los tipos de los mltiples grupos vricos parecen diferentes
y es esa morfologa caracterstica la base para su identificacin mediante microscopia electrnica. sta proporciona
los medios para detectar e identificar con rapidez los virus
en el material tomado directamente de los pacientes (cuadro
18-1). Un diagnstico rpido puede facilitar la atencin y el
tratamiento de los enfermos. El diagnstico tiene tambin
implicaciones de salud pblica para el control de brotes y
la propagacin de las enfermedades infecciosas en la comunidad. A largo plazo, la microscopia electrnica desempea
un papel en la vigilancia epidemiolgica de la enfermedad
infecciosa. A diferencia de muchas pruebas diagnsticas,
que se seleccionan para un agente particular, la microscopia
electrnica es un mtodo que puede detectar cualquier virus
o una mezcla de virus en la muestra. Esto es en particular
til en el diagnstico y el estudio de los virus que no pueden
cultivarse con facilidad in vitro. El uso de la microscopia
electrnica ha conducido al descubrimiento e identificacin
de muchos agentes vricos nuevos en aos recientes y tiene
una funcin principal en el estudio de los virus nuevos.
La preparacin de la muestra es simple y los resultados se

pueden obtener con rapidez. Empero, la tcnica depende
de la presencia de nmeros suficientes de partculas del virus en la muestra (se requiere casi siempre un mnimo de
106 partculas del virus por mililitro de muestra) y de la
integridad estructural de las partculas del virus que permanecen intactas, de tal modo que puedan reconocerse e
identificarse. Algunas veces la sensibilidad se puede acrecentar mediante el uso de sueros inmunitarios (microscopia
electrnica inmunitaria, MEI). Los virus que no se delinean con claridad en relacin con el material del entorno,
por ejemplo los parvovirus, pueden agregarse en grupos si
se mezcla la muestra con un antisuero especfico de manera que puedan observarse con facilidad. En caso contrario,
los virus pueden llevarse a una rejilla revestida con antisuero (microscopia electrnica inmunitaria de fase slida).
Los mtodos de MEI se pueden utilizar para la tipificacin
antignica de los virus. Cuando un virus se identifica por
tincin negativa simple se reconoce como miembro de un
grupo o una familia de virus, pero casi nunca es posible
distinguir entre los miembros del grupo sin pruebas adicionales; por ejemplo, el virus del herpes causante de la
varicela (virus de la varicela-zoster, VZV) posee una apariencia idntica respecto del virus del herpes causante de
ampollas febriles (virus del herpes simple, HSV).
Mtodos
Corte fino
Tincin negativa
La microscopia electrnica de corte fino es til para el

examen de muestras en las que hay nmeros escasos de
partculas vricas para reconocerlas en las suspensiones negativas teidas. Algunos virus, como los retrovirus, tienen
Es el mtodo ms utilizado en virologa diagnstica y recurre a la tincin del entorno vrico, no tanto al virus mismo.
182
CAP. 18
MICROSCOPIA ELECTRNICA EN VIROLOGA
Cuadro 18-1 Virus detectados mediante microscopia electrnica

Muestras examinadas
Ejemplos de virus detectados
Piel: lquidos
vesiculares o
raspaduras de
lesiones*
Heces*
Virus del herpes: herpes simple,

virus de la varicela-zoster
Poxvirus: ectima, molusco contagioso
Virus del papiloma (verruga humana)
Virus de la gastroenteritis: rotavirus,
adenovirus, astrovirus, norovirus,
sapovirus (hepatitis A y E,
enterovirus)
Suero
Parvovirus B19
Hepatitis B
Orina
Poliomavirus BK
Citomegalovirus
Adenovirus (cistitis hemorrgica)
Hgado
Hepatitis B
Hgado fetal
Parvovirus B19 (hidropesa fetal)
Cerebro
Virus del sarampin (SSPE)
Poliomavirus JC
Virus del herpes
Tumor
Virus de Epstein-Barr
Cultivos celulares
Cualquier virus cultivado, como
de laboratorio para
influenza, parainfluenza, sarampin,
la identificacin
paperas, adenovirus, poliomavirus,
rpida de los aislados* enterovirus, virus del herpes,
retrovirus (virus exticos, p. ej.,
Marburg, bola)
cfico. El virus se une a las perlas y se recubre con oro. La

tcnica parece ofrecer poca ventaja respecto de la MEI de
tincin negativa y tiene la desventaja de oscurecer la morfologa caracterstica del virus, adems de que los reactivos
son costosos.
Usos de la microscopia electrnica

La microscopia electrnica empez a sobresalir en la virologa diagnstica en el decenio de 1960 con el diagnstico
rpido de la viruela. Las lesiones de piel que se producen
en esta enfermedad y las consecutivas de la varicela pueden confundirse en clnica. Las alarmantes implicaciones
de la infeccin de la viruela llevaron en poco tiempo a diferenciar estas infecciones bsicas. Las lesiones de piel,
y en particular los lquidos de las vesculas, son ricos en
partculas vricas. Basta mezclar la muestra con una gota
de un colorante negativo para ver con precisin el virus,
sin necesidad de recurrir a la concentracin. La viruela se
debe a un miembro de la familia del poxvirus y la varicela
al VZV. Los poxvirus y los virus del herpes tienen morfologas muy diferentes y se pueden distinguir con facilidad
mediante el microscopio electrnico (figs. 18-1 y 18-2). El
virus de la viruela, variola, y el virus vaccinia utilizados
en la vacuna son indistinguibles y se requirieron pruebas
*Principales usos habituales de la microscopia electrnica en virologa

diagnstica.
estructuras que se identifican de modo ms fcil en cortes finos en comparacin con las preparaciones negativas.
Aunque la sensibilidad puede acrecentarse, no es una tcnica rpida y tiene aplicacin limitada en un laboratorio de
diagnstico. Es til para estudiar la patogenia de la infeccin y puede emplearse para la confirmacin diagnstica
en biopsia y muestras post mortem. Las estructuras del virus son resistentes a la lisis celular y la preservacin pobre
del tejido; es posible obtener resultados positivos a partir
de material que aparenta ser poco prometedor.
Microscopia electrnica de barrido
Pocos laboratorios de diagnstico tienen acceso a un microscopio electrnico de barrido o incluso un accesorio de
barrido para un microscopio electrnico de transmisin.
Este ltimo se utiliza sobre todo como herramienta para
investigar la fijacin y patogenia del virus y hasta el momento ha tenido poco uso en virologa diagnstica. Se ha
observado cierto inters en los inmunoensayos de fase slida, con perlas de ltex cubiertas con el anticuerpo espe-
Figura 18-1 Vaccinia: un ortopoxvirus (180 000 ).
USOS DE LA MICROSCOPIA ELECTRNICA
183
Figura 18-2 Virus del herpes de una lesin de la piel (180 000 ).
Figura 18-3 Ectima: un parapoxvirus (180 000 ).
para diferenciarlos: por lo regular se realiza la distincin

en cultivo de la membrana corioalantoica de los huevos de
las gallinas, lo cual toma unos tres das. La deteccin de un
virus del herpes evit la necesidad de todas las medidas
sanitarias pblicas que deban activarse en presencia de un
caso de viruela.
que causa erupciones benignas en la piel y es similar en

apariencia a los virus ortopox. La microscopia electrnica
tambin se utiliza de modo ocasional en la deteccin del virus del papiloma humano (HPV) que provoca verrugas.
Lesiones de la piel
El descubrimiento de los virus que causan la gastroenteritis

condujo a la expansin del uso de la microscopia electrnica en laboratorios de diagnstico y salud en las dcadas de
1970 y 1980. Diversos virus pueden causar gastroenteritis
y todos se descubrieron en el examen por microscopia electrnica de muestras fecales. Result sorprendente que los
virus podan visualizarse en ese complejo material, pero en
verdad estos virus se excretan en nmeros inmensos dentro
del contenido intestinal y pueden reconocerse con facilidad
si las muestras se recogen en el momento apropiado.
Los virus de la gastroenteritis no crecen en los cultivos
celulares convencionales y la microscopia electrnica ha
sido el mtodo principal para su identificacin. Algunos
virus de la gastroenteritis, como los rotavirus y adenovirus, tienen tales morfologas distintivas que slo necesitan
observarse una o dos partculas para el reconocimiento positivo (figs. 18-4 y 18-5). Las muestras pueden ser tan ricas
en virus que no se precisa ninguna concentracin (se calculan concentraciones de 1012 partculas/g). A menudo es
En 1980, la Organizacin Mundial de la Salud declar que la

viruela se haba erradicado, pero la microscopia electrnica
no ha dejado de tener un papel importante en el diagnstico
rpido de la infeccin por el virus del herpes. Esto es en
particular til para los individuos inmunocomprometidos,
en los cuales el uso de frmacos antivricos apropiados
puede facilitar el tratamiento. Adems, puede auxiliar en la
atencin de los sujetos de las unidades de trasplante, en las
cuales un brote de varicela podra tener consecuencias graves y algunas veces mortales. La microscopia electrnica todava se utiliza en el diagnstico de otras dos infecciones del
poxvirus, el ectima y el molusco contagioso, ninguno de los
cuales se puede identificar con facilidad por otros medios. El
ectima es una infeccin zoontica adquirida de las ovejas,
secundaria a un virus parapox, el cual es ms pequeo y alargado que los virus ortopox, como el vaccinia y el cowpox
(fig. 18-3). El molusco contagioso es un poxvirus humano
Gastroenteritis
184
CAP. 18
Figura 18-4 Rotavirus: una causa importante de gastroenteritis

en recin nacidos y nios menores. Los rayos tpicos pueden
verse alrededor de las partculas. La partcula del centro perdi su
cpside (180 000 ).
suficiente emulsionar una muestra pequea de heces en una

gota de agua destilada, mezclar con colorante negativo y
colocar sobre una rejilla. Para otros virus de las gastroenteritis, como astrovirus y norovirus, la identificacin es ms
difcil y deben examinarse ms partculas para realizar una
identificacin exacta (figs. 18-6 y 18-7). En estos casos, por
lo general, es necesario concentrar el virus de la muestra.
Se han desarrollado pruebas comerciales, como ELISA, tcnicas de aglutinacin de ltex, PCR e incluso
pruebas con tira reactiva, y ahora se emplean como tcni-
Figura 18-5 Adenovirus: se relacionan en gran medida con las

infecciones de las vas respiratorias y oculares. Dos adenovirus
se vinculan con la gastroenteritis e infectan sobre todo a nios
jvenes (180 000 ).
Figura 18-6 Astrovirus. Pueden verse estrellas de cinco o seis

puntas en la superficie de algunas partculas (180 000 ).
ca primaria en muchos laboratorios de diagnstico. Esto

permite que nmeros ms grandes de muestras se sometan
a examen, en comparacin con la microscopia electrnica, y muchas veces con mayor sensibilidad. Sin embargo,
Figura 18-7 Norovirus. Este virus provoca muchos brotes de

gastroenteritis en la comunidad (180 000 ).
USOS DE LA MICROSCOPIA ELECTRNICA
estas pruebas tienen limitaciones puesto que son selectivas para un tipo especfico del virus y no detectan todas
las cepas dentro de un grupo del virus. Las muestras que
arrojan resultados negativos o equvocos se pueden examinar posteriormente mediante microscopia electrnica.
El Health Protection Agency Centre for Infections rene
los informes de los virus detectados en casos de gastroenteritis en Inglaterra y el Pas de Gales. Esto ha facilitado que
se represente un panorama epidemiolgico de los grupos
de edad afectados por los diferentes agentes vricos, las
distribuciones estacionales, los patrones de excrecin y los
modos de transmisin. Esta informacin hace posible proporcionar el consejo apropiado sobre factores como el control de brotes, tiempo que debe apartarse de los alimentos a
quienes los manipulan y tiempo ptimo para la recoleccin
de muestras.
Rotavirus
De los virus de la gastroenteritis, el mejor conocido e identificado con facilidad es el rotavirus (de la palabra latina
rota, rueda: la disposicin de los capsmeros vistos en la
superficie de las partculas del virus se asemeja a los rayos
de una rueda) (fig. 18-4). El rotavirus es una causa importante de la gastroenteritis en recin nacidos y nios. En el
Reino Unido y otros pases desarrollados propicia el nmero ms grande de admisiones al hospital en este grupo
de edad, y en pases subdesarrollados se calcula que causa
alrededor de medio milln de muertes por ao. La infeccin ocurre sobre todo en los meses del invierno en climas
templados. Los brotes tambin se observan entre ancianos,
al parecer debido a la declinacin de la inmunidad.
El rotavirus se encontr primero en los cortes finos de
biopsias duodenales de nios en Australia, pero tales tcnicas invasivas no son necesarias ya que el virus puede
verse en las emulsiones simples de muestras fecales. Los
equipos comerciales para la deteccin de los rotavirus se
utilizan con amplitud. No obstante, estos equipos slo detectan el tipo ms comn de los rotavirus conocidos, como
los rotavirus del grupo A. Otros tipos, como los rotavirus
del grupo C, tambin infectan a los seres humanos, aunque
se observan con menor frecuencia. Los rotavirus del grupo
C infectan a todos los grupos de edad y se han vinculado
con un buen nmero de brotes en familias y escuelas. En
muchos laboratorios, las muestras se examinan slo por
microscopia electrnica si los resultados de una prueba de
ELISA o ltex son negativos. Los rotavirus que no pertenecen al grupo A se identifican casi siempre cuando surge una
discrepancia entre el resultado negativo del equipo y uno
positivo hallado con la microscopia electrnica. La caracterizacin se lleva a cabo por el anlisis PAGE o PCR.
185
Adenovirus
El examen de muestras fecales de nios con gastroenteritis
condujo al descubrimiento de dos adenovirus nuevos. Por
mucho tiempo los adenovirus se haban relacionado con las
infecciones respiratorias y oculares y se aislaban en cultivos celulares. Los dos adenovirus nuevos, los denominados
tipos 40 y 41, se vinculan de manera especfica con la gastroenteritis y no pueden cultivarse con facilidad. La microscopia electrnica tiene limitaciones y puede indicar slo la
presencia de los adenovirus (fig. 18-5) y no de manera especfica los tipos 40 y 41, para los cuales se requieren pruebas
adicionales. Los adenovirus respiratorios comunes se aslan
algunas veces de muestras fecales, pero esto se considera un
hallazgo incidental. Del mismo modo que para el rotavirus,
ahora se dispone de los equipos de ELISA y tira reactiva.
Los tipos 40 y 41 de los adenovirus tienen una epidemiologa similar al rotavirus dado que infectan sobre todo a jvenes y se observan durante los meses invernales.
Astrovirus
Otro virus vinculado con la gastroenteritis es el astrovirus,
un virus original, nombrado as por la estrella de cinco o
seis puntas delineada en la superficie de una gran proporcin de partculas (fig. 18-6). Los astrovirus explican alrededor de 1 a 2% de los informes de virus causales de
gastroenteritis en el Reino Unido. La infeccin se notifica
sobre todo en los muy jvenes y se han descrito brotes en
las unidades neonatales; no obstante, se sugiere que la infeccin en otros grupos de edad se encuentra subestimada. Como el rotavirus, los brotes se reconocen de modo
ocasional en los ancianos. En raras ocasiones se refiere la
transmisin que producen los alimentos. La microscopia
electrnica es todava el mtodo principal de deteccin.
Norovirus
Los norovirus, conocidos antes como virus similares al
Norwalk o virus pequeos redondos estructurados (SRSV),
se consideran la causa ms comn de la gastroenteritis en
la comunidad. Se reconocen en todos los grupos de edad y
se relacionan de modo frecuente con brotes en hospitales,
hogares residenciales y escuelas. Los virus de la gastroenteritis casi siempre se transmiten en forma directa de persona a persona a travs de la va fecal-bucal o en gotitas
de aerosol. A veces tambin se pueden transmitir algunos
a travs del alimento o el agua y en estas situaciones los
norovirus son los que se notifican ms a menudo. El primer
virus del grupo se descubri por microscopia electrnica
186
CAP. 18
en 1972. Originado de un brote en la ciudad de Norwalk, en

Estados Unidos, se conoci como el agente Norwalk. El
trmino virus pequeo redondo estructurado o SRSV
se relaciona con el aspecto del virus en el microscopio
electrnico (fig. 18-7). Las partculas del virus miden 30 a
35 nm de dimetro y tienen una superficie amorfa y un
contorno irregular. Los norovirus se clasifican dentro de la
familia Caliciviridae. Hay muchas cepas diferentes y stas
forman dos genogrupos amplios. Hay tambin un tercero,
el genogrupo emparentado de forma ms lejana, llamado
sapovirus porque se aisl en una guardera en Sapporo, Japn. Los sapovirus tienen el aspecto tpico de un calicivirus,
con depresiones similares a una taza vistas en la superficie
de las partculas del virus. Estas depresiones en forma de
taza casi nunca se identifican en los norovirus. La diferenciacin entre norovirus, calicivirus y tambin astrovirus
por microscopia electrnica puede ser difcil y requiere la
intervencin de un microscopista experimentado.
Los norovirus no se pueden cultivar y la mayor parte de
los diagnsticos se establece por microscopia electrnica.
Empero, los norovirus se excretan slo en nmeros suficientes para la deteccin por cerca de 48 horas despus del inicio
de los sntomas y por tanto suele ser difcil obtener muestras
apropiadas. Los norovirus tienden a no excretarse en nmeros grandes, como el rotavirus y los adenovirus, y puesto que
no tienen tales caractersticas morfolgicas distintivas, son
mucho ms difciles de detectar en trminos tcnicos. Por lo
tanto, los norovirus no aparecen en una enorme proporcin
de los informes. La microscopia electrnica no es bastante
sensible para reconocer el virus en el alimento o muestras
ambientales. Se han desarrollado los ensayos de PCR para
los norovirus, pero estn slo disponibles en laboratorios especializados. Estos ensayos son muy sensibles: pueden detectar al virus en las muestras clnicas por hasta una semana
despus del inicio de los sntomas y pueden emplearse para
examinar los alimentos y las muestras ambientales. Sin embargo, no detectan todas las cepas del norovirus. En 2003 se
dispuso ya de los equipos comerciales de ELISA que identifican una amplia gama de los norovirus de los genogrupos
1 y 2. stos tienen sensibilidad similar a la de la microscopia electrnica, pero son mucho ms fciles de usar, pueden
procesar nmeros ms grandes de muestras y han tenido un
efecto significativo en el examen de los norovirus. Existe
una gran diversidad dentro del grupo del norovirus y, pese
a ello, las tcnicas ELISA no detectan todas las cepas. En
consecuencia, la microscopia electrnica juega todava un
papel esencial en el diagnstico.
Otras infecciones
La microscopia electrnica tuvo un papel importante en el
descubrimiento de otros virus, en especial algunos de los
virus de la hepatitis, los papovavirus y el parvovirus B19.

Otras pruebas sustituyeron en gran medida a la microscopia electrnica en el diagnstico.
Virus de la hepatitis
El virus que causa la hepatitis A se descubri en 1972 por
microscopia electrnica inmunitaria de muestras fecales de
los pacientes incluidos en los estudios de voluntarios. Sin
embargo, se demostr en poco tiempo que la mayor parte
de la excrecin del virus ocurre en la fase prodrmica de
la enfermedad y el diagnstico se establece ahora por la
deteccin del anticuerpo IgM especfico de la hepatitis A.
Aunque no se utiliz para el diagnstico, fue la microscopia electrnica la que revel que el otro virus transmitido
por va entrica, el de la hepatitis E, tiene la morfologa de
un calicivirus. La hepatitis E no se identifica con frecuencia en el Reino Unido, pero se vincula con brotes transmitidos en reas en va de desarrollo del mundo y la infeccin
es en particular grave en mujeres embarazadas.
La microscopia electrnica fue ms til en el diagnstico
de la infeccin de la hepatitis B. Las partculas y antgenos
vricos, sobre todo el antgeno de superficie de la hepatitis
B, estn presentes en el suero por periodos prolongados. El
diagnstico puede determinarse con facilidad si se reconocen
partculas completas del virus, pero a menudo slo pueden
verse esferas de 22 nm de la capa protenica del virus (antgeno superficial). El antgeno superficial es difcil de distinguir de otro material de fondo en el suero. Para aumentar la
sensibilidad y la identificacin del caso, el suero del paciente se mezcla con un antisuero especfico en una prueba MEI,
la cual no es conveniente para examinar una gran cantidad
de muestras y debe emplearse de manera selectiva.
Parvovirus B19
Mientras se buscaba el virus de la hepatitis B por MEI del
suero se descubri primero el parvovirus B19. Con posterioridad se reconoci que ste era el agente etiolgico del
eritema infeccioso, una infeccin comn de salpullido de la
niez que tambin se conoce a menudo como sndrome de
la cara abofeteada. La infeccin en el embarazo puede causar dao fetal. Puede tambin precipitar crisis aplsica grave
en individuos con trastornos hematolgicos como la anemia
falciforme. La confirmacin del laboratorio de la infeccin
por B19 puede modificar en grado notorio la atencin de estos
pacientes. Aunque no se han utilizado por ms tiempo para el
diagnstico de rutina, los resultados contradictorios entre las
pruebas para la infeccin por el parvovirus B19 (p. ej., una
PCR positiva pero un resultado negativo de la IgM) se pueden
resolver en poco tiempo mediante microscopia electrnica.
REACCIN RPIDA DE URGENCIA
Cerebro
Cuando los frmacos antivricos estuvieron disponibles
para el tratamiento de la encefalitis herptica se realizaron
intentos para detectar al herpesvirus en suspensiones teidas negativas de material cerebral. El diagnstico rpido
y exacto era importante porque los medicamentos antivricos tempranos eran en extremo txicos. Sin embargo, la
microscopia electrnica no mostr particular sensibilidad
y pronto la sustituyeron la microscopia de fluorescencia y
luego las tcnicas de PCR. El paramixovirus helix del sarampin se ha identificado en cortes finos de tejido cerebral
de personas con panencefalitis esclerosante subaguda. El
primer poliomavirus humano, JC, se descubri en cortes
finos de tejido cerebral de pacientes con leucoencefalopata
multifocal progresiva. Aunque la microscopia electrnica
fue til para establecer la causa de estas dos anormalidades, las tcnicas de fluorescencia y las pruebas de PCR son
ms sensibles para examinar material cerebral.
187
agente citoptico, en especial si estn presentes varios tipos

vricos. Se utiliza cuando otras pruebas suministran resultados inconsistentes, equvocos o aun negativos; por ejemplo,
las pruebas de PCR y ELISA para el norovirus no identifican todas las cepas y la microscopia electrnica puede
proporcionar resultados positivos sobre muestras al parecer
negativas. La microscopia electrnica tambin se usa para
comprobar los antgenos vricos, como los virus del sarampin y la rubeola y preparados de otras pruebas, y detectar
los contaminantes vricos que aparecen de forma natural
en los cultivos celulares, como SV40 (fig. 18-8).
Orina
Los intentos para hallar virus en las muestras de orina han
tenido un xito variable. Mediante microscopia electrnica
se descubri un segundo poliomavirus humano conocido
como virus BK. ste infecta de manera regular a los individuos sometidos a trasplante y se excreta en la orina.
Muestra un crecimiento muy lento en los cultivos celulares
y la microscopia electrnica ha sido en extremo til para
el diagnstico. Se han desarrollado pruebas de PCR y son
ahora el mtodo habitual empleado para fines diagnsticos.
El citomegalovirus (CMV), un miembro del grupo del virus
del herpes, tambin se elimina en la orina, pero se reconoce
slo por microscopia electrnica cuando est presente una
gran cantidad de partculas vricas. Los sntomas de las infecciones con los virus CMV y BK pueden semejar a los
del rechazo del rgano. El diagnstico de una causa vrica
da lugar a una mejor atencin del paciente, puesto que el
uso inadecuado de los agentes inmunosupresores prolongara en realidad la infeccin del virus.
Laboratorio de virologa
Adems de su papel primario en el diagnstico, la microscopia electrnica tiene muchas otras funciones en un
laboratorio de virologa. Proporciona tambin apoyo en el
desarrollo de nuevas pruebas alternativas de diagnstico
y con frecuencia es til en proyectos de investigacin. La
microscopia electrnica se utiliza para la identificacin rpida de los virus aislados en cultivos celulares y puede reducir en gran proporcin el tiempo invertido en identificar un
Figura 18-8 Poliomavirus encontrado como un contaminante en

un cultivo celular (180 000 ).
Reaccin rpida de urgencia

Los acontecimientos actuales del mundo condujeron a una
conciencia del potencial de la actividad bioterrorista, y las
agencias de gobierno revisan de forma continua los planes
para enfrentar algn acontecimiento de esta naturaleza. La
viruela se ha identificado como un agente posible para la liberacin intencionada. Puesto que la microscopia electrnica es el mtodo ms rpido para detectar un ortopoxvirus,
los microscopistas han revisado protocolos y examinado paneles externos de aseguramiento de la calidad para garantizar una respuesta. Despus de la erradicacin, la vacunacin
ces y por lo tanto casi todo el personal del laboratorio carece de vacunacin. Mientras que la amenaza de infeccin sea
an muy baja, se considera que los riesgos relacionados con
188
CAP. 18
la vacunacin pueden tener ms peso que los de la viruela.

Para proteger al personal que puede enfrentarse inesperadamente a un espcimen de la viruela, se recomienda inactivacin del microorganismo antes del proceso. Es esencial
que cualquier mtodo elegido no comprometa la capacidad
de identificar a los poxvirus y virus del herpes. Se ha observado que una solucin de formaldehdo al 5% amortiguada
con fosfatos inactiva al virus sin enmascarar las caractersticas morfolgicas identificables. El glutaraldehdo se usa
muchas veces como un fijador para la microscopia electrnica. Algunos microscopistas prefieren no fijar la muestra, teir sobre una rejilla y despus impregnar la rejilla preparada
en una gota de glutaraldehdo. No obstante, si la muestra se
trata con glutaraldehdo antes del procesamiento, la estructura superficial de cualquier virus teido de forma negativa
se oscurece por completo. Si un ortopoxvirus se reconoce
por microscopia electrnica, se requieren pruebas adicionales para identificarlo. Por lo regular, esto se realiza mediante
PCR en laboratorios especializados. El ortopoxvirus que se
presenta ms veces en el Reino Unido es el cowpox, que
suele adquirirse de gatos domsticos. En 2003 tuvo lugar un
brote de una enfermedad con lesiones vesiculares en seres
humanos en Estados Unidos que caus preocupacin y difusin considerables. Un ortopoxvirus se reconoci en poco
tiempo mediante microscopia electrnica y con posterioridad se identific como el monkeypox, adquirido de roedores
domsticos de latitudes lejanas. Aunque la infeccin por el
monkeypox puede ser muy grave, este poxvirus no es por
fortuna muy transmisible entre los seres humanos.
Virus de nueva aparicin

Nuevos virus se descubren y la microscopia electrnica
se halla a la vanguardia en la bsqueda y caracterizacin
inicial de estos microorganismos. La facilidad de los vuelos internacionales supone que las nuevas infecciones se
pueden transmitir alrededor del mundo a las poblaciones
no inmunizadas en un tiempo muy corto. Por ejemplo, en
la primavera de 2003 se identific el sndrome respiratorio
agudo grave, que se origin en el Extremo Oriente, como
una enfermedad nueva. Se observ un esfuerzo mundial,
que coordin la Organizacin Mundial de la Salud, para
identificar el agente etiolgico. La microscopia electrnica
desempe un papel prominente al identificar con rapidez
un coronavirus nuevo como la causa (fig. 18-9).
Conclusiones
La microscopia electrnica desempea un papel esencial
en la respuesta pronta a las situaciones de urgencia en las
Figura 18-9
(180 000 ).
El virus del sndrome respiratorio agudo grave
cuales la salud pblica se pone en riesgo, tanto si la liberacin de un agente biolgico es deliberada como si se trata de
una nueva infeccin de surgimiento natural. La microscopia
electrnica se utiliza a menudo como mtodo de diagnstico primario en las etapas tempranas despus que un virus
se descubre hasta el desarrollo de pruebas ms fciles. La
microscopia electrnica implica un trabajo intensivo y no es
conveniente para examinar una gran cantidad de muestras.
Por lo tanto, si las pruebas alternativas convenientes pueden
estar disponibles, la microscopia electrnica tiende a tomar
un papel ms bien confirmatorio. El nfasis principal de la
microscopia electrnica en virologa parece enfocarse ms
en los aspectos de la investigacin, donde ha tenido siempre
un papel esencial. El costo primario del equipo supone que
la microscopia electrnica no est disponible en todos los
laboratorios. Adems, un servicio satisfactorio requiere personal experto y experimentado y tiempo en el mantenimiento del equipo en condiciones de trabajo ptimas. Si bien
la microscopia electrnica ha sufrido una declinacin en la
virologa de rutina, puede ser prctico colaborar con los microscopistas electrnicos en otros campos de la patologa y
ofrecer una gama completa de tcnicas de microscopia electrnica. Esto puede funcionar con eficiencia, siempre que
las diferentes necesidades de todos los usuarios se atiendan
y haya acceso conveniente y fcil para todos ellos.
La microscopia electrnica se ha utilizado en extenso

para la deteccin de virus en las muestras fecales de pacientes con gastroenteritis y en particular para la investigacin
de lactantes con diarrea. Es probable que la introduccin de
equipos ELISA comerciales nuevos reduzca los nmeros
de muestras examinadas por microscopia electrnica. Estos equipos ofrecen pruebas ms baratas y la capacidad de
examinar gran cantidad de especmenes, pero tienen limitaciones y no pueden identificar todas las cepas vricas. La
microscopia electrnica es todava el mtodo ms rpido
para el diagnstico de lesiones vesiculares por virus y tiene
importancia especial en la atencin de los pacientes inmunocomprometidos. La microscopia electrnica tambin posee una funcin relevante en la identificacin rpida de los
virus aislados de muestras clnicas en cultivo celular.
Muchos virus nuevos se han descubierto gracias al uso
de la microscopia electrnica, en especial desde los primeros aos de la dcada de 1970. La microscopia electrnica
tiene una contribucin importante en el descubrimiento y
caracterizacin de los virus nuevos, junto con los avances
recientes de la virologa molecular. Por ejemplo, 40% de
las infecciones de gastroenteritis todava permanece sin
diagnosticar. Algunos virus de la hepatitis y retrovirus an
requieren la caracterizacin por microscopia electrnica
y sta se emplea asimismo para buscar virus en tumores.
No dejar de utilizarse para comprender la patogenia de
las infecciones vricas y el papel de los antgenos vricos,
189
que podran conducir al desarrollo de tratamientos eficaces

y vacunas. Tales estudios pueden auxiliarse del desarrollo
de tcnicas mejoradas y pruebas automatizadas de preparacin para el corte fino y la exploracin. Los avances
recientes en el diseo del microscopio electrnico, como
los microscopios ambientales de exploracin que no requieren procedimientos de secado complejos y extensos,
significan que no slo las muestras pueden procesarse de
modo ms rpido y fcil, sino que se evita la contraccin
y la distorsin de la muestra. Como los microscopios se
tornan cada vez ms de uso amable, la investigacin de
virus por microscopia electrnica ser ms fcil.
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19
Cultivo tisular
William L Irving y Alan Pawley
Introduccin
Seleccin de los cultivos celulares
Las partculas vricas consisten en material gentico (cido

nucleico) ms una pequea cantidad de protenas, de ah la
memorable cita de sir Peter Medawar los virus son problemas envueltos en una capa de protenas. Algunos virus,
adems, poseen un recubrimiento de lpidos. No hay organelos internos, como mitocondrias, ribosomas o aparato
de Golgi. Por lo tanto, los virus son parsitos intracelulares obligatorios, es decir, slo pueden reproducirse dentro
de clulas vivas, de modo que usurpan la generacin de la
energa y la maquinaria biosinttica de la clula husped.
El aislamiento de los virus a partir del material clnico representa entonces varios desafos del todo distintos de los
que se encuentran en un laboratorio de bacteriologa, en el
cual las bacterias pueden crecer en medios inanimados. La
presencia de clulas vivas en una forma u otra es el primer
requisito esencial para el crecimiento exitoso de los virus.
Por muchos aos, los virus crecieron en huevos de gallinas fecundas. Una alternativa consiste en utilizar animales
experimentales completos. Aunque ambas tcnicas pueden
todava ser de valor en circunstancias especializadas, las
han reemplazado en gran parte los cultivos celulares derivados de una variedad de tejidos en los laboratorios vricos
de rutina y crecen como monocapas sobre superficies de
cristal o plstico (es decir, tubos o frascos). En este captulo se discuten los detalles prcticos del funcionamiento de
un laboratorio de cultivo celular para el aislamiento de los
virus y se resaltan las ventajas y desventajas de esta aproximacin al diagnstico de la infeccin vrica.
El primer paso en el ciclo de la rplica de cualquier virus es la unin a su clula objetivo. ste es un proceso muy
especfico que implica la interaccin precisa entre un ligando sobre la superficie del virus y un receptor sobre la
superficie de la clula objetivo. En consecuencia, no todos
los virus infectan y crecen en todos los tipos celulares; las
clulas que carecen del receptor apropiado para un virus
particular son resistentes a la infeccin por ese virus. Esto
crea un problema para el laboratorio de diagnstico: para
proporcionar un servicio detallado para el aislamiento de
todos los virus posibles se requerira la disponibilidad de diversos tipos celulares. En la prctica, la mayor parte de los
laboratorios analiza slo dos o tres diferentes tipos de clula,
cada uno de los cuales apoya el crecimiento de una gama
de virus todo lo amplia posible. Los cultivos celulares ms
comunes se enumeran en el cuadro 19-1, que tambin seala qu virus pueden crecer en cada uno. Aunque esta lista incluye a muchos de los virus comunes hallados en la
prctica clnica, algunos virus importantes (por ejemplo,
el virus de la inmunodeficiencia humana [HIV], los virus
de la hepatitis, los virus de la gastroenteritis, incluidos rotavirus y adenovirus entricos, y el virus de Epstein-Barr
[EBV]) no figuran all, al igual que otros ms. El aislamiento de algunos de estos microorganismos se puede
alcanzar por medio de tcnicas especializadas de cultivo
celular, como el cultivo de rgano. Las caractersticas diferenciales del tejido de origen pueden mantenerse en el
cultivo de rgano; por ejemplo, los anillos traqueales fetales
192
CAP. 19
Cuadro 19-1
CULTIVO TISULAR
Cultivos celulares comunes
Tipo de cultivo
Virus capaces de crecer
Cultivos primarios/secundarios
Virus de la influenza, virus
Clulas renales del mono
de la parainfluenza,
enterovirus, virus de las
paperas
Lneas celulares semicontinuas Virus del herpes simple
(HSV), virus de la varicela
Fibroblastos embrionarios
zoster, citomegalovirus,
humanos
enterovirus, adenovirus,
rinovirus
HSV, virus de las paperas
Lneas celulares continuas
Clulas Vero (derivadas del
rin del mono)
Clulas Hep-2/clulas HeLa Virus sincitial respiratorio,
adenovirus
Clulas renales caninas de
Madin Darby (MDCK)
Virus de la influenza
humanos tienen clulas epiteliales ciliadas que funcionan

en el tracto respiratorio capaces de apoyar la replicacin
de los virus comunes del resfriado. De manera alternativa,
pueden utilizarse cultivos celulares especializados, como
el HIV y el EBV, que pueden crecer en linfocitos humanos
de la sangre perifrica, y algunos de los virus de la hepatitis, que crecen en cultivos primarios del hepatocito, o
algunos de los virus de la hepatitis, que crecen en cultivos
de hepatocitos primarios o estirpes celulares derivadas del
hepatoma. Sin embargo, las dificultades de la disposicin
de una fuente regular de estos cultivos ms especializados
significa que el aislamiento de estos virus se restringe a
los laboratorios de referencia o de investigacin. Otros virus (por ejemplo, los virus del papiloma humano, el virus
de la hepatitis C) son tan exigentes en sus requerimientos
para el crecimiento que el aislamiento en cultivo celular ha
demostrado ser casi imposible. El diagnstico de la infeccin con estos virus debe apoyarse siempre en otras tcnicas distintas del aislamiento en cultivo celular.
Preparacin de cultivos celulares

El funcionamiento eficiente de un laboratorio de virologa
diagnstica requiere la disponibilidad de: a) clulas comunes que crecen a gran escala y b) clulas maduras en nmeros pequeos. Estas ltimas se preservan en un receptculo
(casi siempre un tubo, aunque las placas de microtitulacin para cultivo celular son una alternativa) listo para la
inoculacin con el material clnico apropiado, a medida
que dicho material llega al laboratorio. Cuando estos tu-
bos se utilizan, se sustituyen por tubos frescos preparados

a partir de los cultivos de reserva.
Todos los tipos celulares estndar enumerados en el cuadro 19-1 crecen como clulas de adhesin, no tanto como
suspensiones celulares. Esto significa que se unen a una superficie plana (por lo regular frascos de plstico con cultivo
celular) y entonces se multiplican y dividen, a condicin
de que el medio de cultivo contenga los nutrimentos necesarios, hasta que se cubra la superficie completa. En este
punto, casi todas las clulas dejan de dividirse debido a la
inhibicin por contacto. Este proceso se conoce como crecimiento de confluencia. Una vez que una placa celular es
confluente, las clulas pueden desprenderse de la superficie
mediante una enzima proteoltica como la tripsina diluida
en un medio de cultivo, y verterse de nueva cuenta dentro
de una cantidad de frascos nuevos (p. ej., tres o cuatro),
donde crecen entonces otra vez para confluir. Este proceso
se conoce como pasaje celular y, de esta manera, el nmero de las clulas disponibles puede ampliarse con rapidez.
De forma alternativa, las clulas de un frasco confluente
pueden distribuirse en concentraciones celulares bajas en
un estante para tubos con cultivo celular que, una vez que
las clulas se instalan y alcanzan la confluencia, esperan la
inoculacin con el material clnico.
Las clulas se diferencian en su capacidad de someterse
a pasajes repetidos. Los cultivos primarios, es decir, aquellos establecidos de manera directa a partir del tejido (por
ejemplo, clulas renales del mono) no sobreviven ms de
dos o tres pasajes in vitro. Esto es una desventaja importante para su uso, ya que el suministro continuo de cultivos
primarios frescos es costoso e inconveniente. En realidad,
existe una considerable preocupacin de que el suministro
de clulas renales del mono pueda cesar por varias razones.
Estas clulas se han replicado para el aislamiento de los virus circulantes de la influenza y ha existido un gran esfuerzo para encontrar los sustratos celulares alternativos para
estos virus. Por comparacin, las lneas celulares tumorales
(por ejemplo, clulas Hep-2, clulas HeLa) pueden dividirse de modo indefinido cuando se transforman in vitro y
por lo tanto se conocen como lneas celulares continuas.
Entre estos dos extremos, las clulas diploides derivadas
del tejido embrionario humano (por ejemplo, fibroblastos
embrionarios humanos) pueden crecer con xito en 30 o 40
pasajes antes de cesar y, por lo tanto, se denominan lneas
celulares semicontinuas.
Las clulas se cultivan en frascos de cultivo bajo condiciones estriles. La preparacin se efecta a menudo en
gabinetes con flujo laminar vertical, pero se puede realizar
en un lugar abierto con un mechero de Bunsen y la tcnica
asptica apropiada. El medio agregado a los frascos debe
ser isotnico y con un pH conveniente (por ejemplo, 7.2 a
7.4), casi siempre basado en soluciones salinas fisiolgi-
IDENTIFICACIN DEL CRECIMIENTO VRICO
camente equilibradas. La composicin exacta del medio

puede variar de acuerdo con el tipo de clula: las frmulas
detalladas estn disponibles en guas prcticas. Es til agregar un colorante indicativo para permitir el reconocimiento
del metabolismo celular por un cambio del color (clulas
sanas que al crecer producen un medio cido). Para el crecimiento, son necesarios los aminocidos esenciales y la
protena y stos se proporcionan bajo la forma de suero procedente de un bovino fetal. Los antibiticos se agregan al
medio de crecimiento como precaucin adicional contra la
contaminacin bacteriana o mictica, cuyas fuentes principales son las bacterias flotantes, las levaduras a partir de
la fuente de dixido de carbono y las especies de Mycoplasma a partir de reactivos contaminados o del operador.
Estos ltimos reducen en grado notable la capacidad de las
clulas para apoyar el crecimiento del virus.
Una vez que se alcanza la confluencia, las clulas se pueden desprender con procedimientos fsicos mediante un raspador de caucho de silicn estril (conocido como polica
de caucho) o, las ms de las veces, mediante el tratamiento
con tripsina y EDTA, que interrumpen la adhesin de las
clulas a la superficie plstica y dan lugar a que las clulas
se agrupen y desprendan. En esta etapa las clulas se pueden
contar en un hemocitmetro y se calcula el volumen apropiado para la resuspensin (para proporcionar la concentracin de siembra ptima). Sin embargo, con experiencia, es
suficiente un clculo aproximado del volumen necesario.
Si las clulas no se transforman ms, como las que se hallan listas en los tubos para la inoculacin, entonces el medio
de crecimiento se sustituye por un medio de conservacin,
una vez que se alcanza la confluencia; la diferencia radica en
que en el ltimo la concentracin de suero est sumamente
reducida. Las clulas confluentes en los tubos de cultivo celular con medio de conservacin sobreviven por varios das,
pero se atenan al final con lentitud a pesar de los cambios
del medio, punto en el cual deben desecharse.
Las clulas generadas para las investigaciones con virus
pueden, cuando se exceden los requisitos, conservarse como
reservas de semillas congeladas en nitrgeno lquido. Las
clulas se suspenden en un medio que contiene dimetilsulfxido, que previene la formacin de cristales de hielo que
destruyen a las clulas. Si es necesario, en caso de contaminacin bacteriana de las clulas en uso, las clulas pueden
descongelarse con rapidez y prepararse los cultivos frescos.
Especmenes clnicos
para el aislamiento de virus
No hay ninguna restriccin en la naturaleza del material
clnico que impida inocular en cultivo celular para el aislamiento de virus. Las muestras lquidas (por ejemplo, lquido
cefalorraqudeo, saliva, orina, lquido vesicular, aspirados
nasofarngeos, lquido de lavado broncoalveolar, sangre,
193
heces diarreicas) pueden enviarse al laboratorio en un contenedor estril y agregarse a tubos de cultivo celular apropiados y limpios o sometidos a dilucin en un medio de
conservacin. Los escobillados (por ejemplo, de conjuntivas, garganta, base de la lcera, cuello cervical, recto) se
deben introducir en el medio vrico de transporte (lquido
isotnico ms los antibiticos para inhibir el sobrecrecimiento microbiano), puesto que los virus no sobreviven en
los escobillados secos. Despus de verter la botella para
liberar tanto material celular como sea posible a partir del
escobillado en el medio, el medio de transporte se inocula
sobre las placas celulares. Las biopsias tisulares (por ejemplo, cerebro, intestino, pulmn) se deben tambin colocar
en el medio de transporte vrico. El tejido puede picarse
muy fino y el material celular y el sobrenadante inocularse en cultivo.
Identificacin del crecimiento vrico

Una vez que un espcimen clnico se inocula en los tubos
de cultivo celular, stos se incuban bajo condiciones que se
asemejen, tanto como sea posible, a aquellas de las que
se obtuvo el material. La mayor parte de los cultivos se
mantiene a 37C, pero algunos virus, sobre todo los de las
vas respiratorias superiores, crecen mejor a una temperatura ligeramente ms baja, como 33C, y en presencia de
5% de dixido de carbono. Los cultivos se pueden rotar
lentamente con un tambor de rodillo, que mejora la aireacin de la placa celular, o mantenerse inmviles. El
desafo para el microbilogo consiste entonces en determinar si un cultivo celular dado contiene o no clulas en las
cuales se replica un virus. Existe una cantidad de opciones
disponibles para lograr este objetivo.
Efectos citopticos
Cuando los virus se replican dentro de las clulas, stas
pueden experimentar cambios morfolgicos como acrecentamiento debido a la alteracin de la permeabilidad de
la membrana, contraccin por la muerte celular o formacin de clulas gigantes multinucleadas por la presencia
de una protena de fusin que el virus codifica. Estos cambios de la morfologa celular, visibles bajo el microscopio
de luz, se refieren como efecto citoptico (ECP) y los virus
que inducen estos cambios son citopatgenos. Por consiguiente, la presencia de un virus dentro de un cultivo celular puede determinarse por el examen regular (por ejemplo,
cada dos das) del cultivo bajo la lente de bajo poder de un
microscopio de luz para reconocer el desarrollo de un ECP.
El aspecto exacto de un ECP es variable, de acuerdo
con el virus causante y el tipo de clula en que ocurre. Las
clulas pueden aumentar de tamao con rapidez, secarse o
fundirse en el sincitio (clulas multinucleares gigantes). El
efecto puede extenderse a lo largo de la placa celular en-
194
CAP. 19
CULTIVO TISULAR
(a)
(b)
(c)
Figura 19-1 Efectos citopticos. a) Una placa celular normal de

fibroblastos. Las clulas han crecido para confluir y toman la forma de huso. b) Algunas de las clulas estn redondeadas y agrandadas. Este aspecto en focos discretos separados por las clulas
que parecen normales es tpico del efecto citoptico que induce
el citomegalovirus. c) Varias clulas se han agrupado por toda la
placa celular para conferir un aspecto de salpicadura. ste es el
aspecto caracterstico del ECP que induce un rinovirus.
tera o puede ser mucho ms focal en naturaleza. Puede

verse de manera predominante, cuando no exclusiva, en el
borde de la placa, tanto como en el centro. El ritmo de desarrollo del ECP puede variar de tan poco como 18 horas
hasta incluso cuatro semanas. Si se tienen en cuenta todos
estos factores, ms los detalles clnicos relevantes de un
espcimen particular, un virlogo puede diagnosticar qu
virus est presente en el cultivo a travs de la observacin
por microscopia de luz de tan slo el ECP. En consecuencia, un ECP que se origina en un escobillado de una vescula, que posee clulas agrandadas que aparecen despus de
24 horas de cultivo y que se extienden con rapidez para
destruir la placa celular entera, es muy probable atribuirlo al virus del herpes simple. En cambio, un escobillado
de una vescula que da lugar a que un ECP aparezca slo
despus de 10 das de cultivo, en slo dos o tres focos de
clulas agrandadas en el centro de la placa, y que se extiende en forma lenta durante varios das despus, es probable
que se explique por el virus de la varicela-zoster. En la figura 19-1 se listan las caractersticas de los ECP para virus
especficos.
Pasaje de los virus
La replicacin de los virus dentro de una placa celular no
es la nica causa de un ECP visible. El material inoculado
sobre la placa puede ser citotxico, un problema en especial frecuente con muestras fecales; puede ocurrir tambin
la contaminacin con otros microorganismos, a pesar de
todas las precauciones tomadas. Si existe alguna duda en
cuanto a los orgenes de un ECP, una manera simple de
distinguir entre un virus comparado con un efecto txico
consiste en procurar el pasaje del virus supuesto. Las clulas que permanecen en la placa celular se raspan dentro
del sobrenadante del cultivo y algunas gotas del material
resultante se inoculan en un tubo con cultivo celular fresco.
Si haba en verdad un virus en el cultivo original, entonces no slo reaparece el ECP dentro del tubo nuevo, sino
que el ritmo de desarrollo debe ser ms elevado; asimismo, la cantidad, o el ttulo, del virus se tiene que incrementar de forma significativa luego del crecimiento vrico en el
primer cultivo. Empero, si el ECP original surge debido a
algn componente txico del espcimen, entonces ste se
diluye en el segundo tubo y el ECP subsiguiente debe desarrollarse de forma ms lenta y extenderse menos, si acaso.
El pasaje de virus es til por otras dos razones. En primer lugar, algunos virus pueden no producir un ECP visible cuando crecen primero en un cultivo, aun cuando,
en efecto, la rplica tenga lugar. Sin embargo, en el pasaje
repetido en el mismo sustrato celular, un ECP puede ser
evidente despus de la adaptacin del virus al crecimiento
en ese tipo particular de clula. El proceso del pasaje de vi-
IDENTIFICACIN DEL CRECIMIENTO VRICO
rus a partir de clulas al parecer normales se conoce como

pasaje ciego, quiz porque en esa etapa el virlogo no puede reconocer la presencia del virus. La identificacin del
virus de la rubeola que crece en clulas renales de conejo
(RK13) puede requerir varios pasajes ciegos. En segundo
lugar, el pasaje de virus es un buen mtodo que incrementa
la cantidad de virus disponibles para otros estudios, como
en la prueba de neutralizacin (vase ms adelante).
195
rie de tubos y a cada tubo se agrega un antisuero diferente

(por ejemplo, antipolio 1, antipolio 2, antipolio 3 a los tubos 1, 2 y 3, respectivamente). Despus de la incubacin
del virus ms el antisuero por una hora, las mezclas se agregan a los tubos individuales con cultivo celular y el aspecto del ECP se supervisa durante los das siguientes. La
ocurrencia de un ECP tpico en los tubos 1 y 3, combinada
con la ausencia de un ECP en el tubo 2, indica que el virus
original era un poliovirus de tipo 2.
Confirmacin del aislamiento del virus

En la mayor parte de los casos, el tipo de virus en un cultivo celular se puede determinar con certeza razonable
mediante la observacin de las caractersticas del ECP presente en la placa celular, segn lo descrito antes. Pese a
ello, hay casos en que puede requerirse la confirmacin de
la identidad del virus, por ejemplo, si el ECP es atpico, no
se realiza bien el pasaje o est ausente o, de manera alternativa, cuando se requiere ms informacin sobre la cepa
particular del virus. Esto se puede conseguir con el uso de
la microscopia electrnica, la deteccin del antgeno o las
pruebas de neutralizacin.
El proceso del cultivo celular acta como medio para
incrementar el ttulo vrico a un grado suficiente que permita la visualizacin por microscopia electrnica (ME).
De esta manera, a condicin de que haya acceso a ME,
casi todos los problemas relacionados con ECP atpicos
o inusuales pueden resolverse con rapidez por el examen
apropiado con ME de las clulas o el sobrenadante del cultivo. Los virus necesitan tener una concentracin 106
partculas/ml para utilizar esta tcnica con xito.
Las clulas infectadas con un virus particular expresan
los antgenos derivados de ese virus. Estos antgenos pueden detectarse si se tien con anticuerpos. Por lo tanto, la
identidad especfica de un virus que crece en cultivo celular puede determinarse al teir las clulas con un panel de
anticuerpos monoclonales apropiados, marcados de manera
conveniente con una marca inmunofluorescente. Las clulas pueden rasparse o aspirarse fuera de los tubos con
cultivo celular y despus secar sobre un portaobjetos de
cristal con multisitios cubiertos con tefln o, si se conoce
que es necesaria la deteccin del antgeno, las clulas pueden crecer sobre una superficie plana, como un cubreobjetos, dentro del tubo con cultivo celular, que puede entonces
recuperarse, fijarse y teirse. La deteccin del antgeno
hace posible la distincin entre, por ejemplo, virus de la
influenza A y B o los virus de la parainfluenza 1, 2, 3 o 4,
todos los cuales producen una prueba positiva similar a la
hemadsorcin (vase ms adelante).
Las pruebas de neutralizacin se utilizan casi siempre
para distinguir entre los diversos enterovirus que crecen
en cultivo o para la serotipificacin de adenovirus. En principio, el virus aislado en cultivo se distribuye en una se-
Adaptaciones del cultivo celular

En condiciones normales, el aislamiento del virus por cultivo celular es mucho ms lento que el aislamiento bacteriano en medios inanimados. El crecimiento vrico ms
rpido, el del virus del herpes simple, puede producir un
ECP despus de 18 horas, pero casi todos los virus requieren varios das (o aun semanas) para hacerlo. Esto es una
desventaja considerable! As, se han introducido diversas
modificaciones del cultivo celular con el propsito de acelerar el proceso. Dos de ellas, adoptadas por los laboratorios de diagnstico son la hemadsorcin y la deteccin de
los focos fluorescentes del antgeno temprano.
Algunos virus (por ej., los virus de influenza y parainfluenza y los de las paperas) poseen una hemaglutinina (es
decir, una protena que se une a los eritrocitos). Las clulas
infectadas expresan esta molcula en sus superficies. De
esta manera, si los eritrocitos se aaden a un tubo con cultivo celular en el cual el virus se halla bajo replicacin, al
final se adhieren a la placa celular, un fenmeno conocido
como hemadsorcin (fig., 19-2a). La hemadsorcin es demostrable (al girar con suavidad el tubo con cultivo) por
algunos das antes de que el ECP sea evidente. La naturaleza exacta del virus hemadsorbente puede determinarse tras
teir con anticuerpos monoclonales.
La deteccin de focos fluorescentes del antgeno temprano (prueba de DEAFF) se desarroll de modo especfico
para acelerar la identificacin del citomegalovirus (CMV)
en cultivo celular. En esencia, la DEAFF es una adaptacin de la deteccin del antgeno en la cual los antgenos
a detectarse se seleccionan como aquellos que aparecen en
fase temprana (dentro de las 24 a 48 h) en el ciclo de la
replicacin del virus (de ah la denominacin de antgenos tempranos). Entonces, el material clnico se inocula
sobre una placa celular que creci sobre un cubreobjetos
u otra superficie plana (un tipo de cultivo conocido como
shell vial). Hay un paso de centrifugacin (2 500 g h)
que aumenta en grado considerable la infectividad de la
placa celular por el virus. Despus de 24 horas, la placa
se lava y en seguida se tie con un anticuerpo monoclonal marcado con fluorescena dirigido contra un antgeno
temprano del CMV. El cubreobjetos se examina entonces
bajo luz ultravioleta. Un resultado positivo se indica por la
196
CAP. 19
CULTIVO TISULAR
(a)
(b)
Figura 19-2 Adaptaciones del cultivo celular. a) Hemadsorcin. La placa celular (rin del mono) es normal, esto es, ningn
efecto citoptico visible se ha desarrollado an. Sin embargo, muchas clulas dentro de la placa expresan una hemaglutinina
codificada de forma vrica sobre su superficie, como los eritrocitos, aqu observados como puntos pequeos que cubren la placa
celular, y se han unido a la placa. b) Prueba de DEAFF. La placa celular se tie con un anticuerpo monoclonal anti-CMV marcado
de modo fluorescente. Un solo ncleo se advierte en tono verde manzana, intenso y brillante, bajo la luz ultravioleta, lo que indica
la presencia del CMV en esta clula. Todas las clulas (contrateidas con el colorante azul de Evans) son normales en trminos
morfolgicos.
presencia de ncleos fluorescentes en las clulas aisladas

(es decir, focos), que parecen normales desde el punto de
vista morfolgico (vase la fig. 19-2b). Esta tcnica se ha
extendido a otros virus de crecimiento lento; por ejemplo,
los adenovirus pueden reconocerse mucho antes que sea
evidente cualquier ECP si se tien con anticuerpos contra
antgenos tempranos del adenovirus.
Conclusiones
El aislamiento de virus en cultivos celulares es todava una
tcnica importante para el diagnstico de las infecciones
vricas. En teora, una sola partcula vrica dentro de un
espcimen clnico puede crecer en cultivo celular y, de ese
modo, extenderse por muchos rdenes de magnitud, lo cual
permite la deteccin y caracterizacin exactas. Los altos
grados de sensibilidad y especificidad inherentes al aislamiento del virus son los estndares de oro contra los que
deben compararse las nuevas tcnicas. La metodologa es
apropiada para una amplia gama de especmenes clnicos y
diferentes virus (cuadro 19-2). En raras ocasiones, su uso
da lugar a la identificacin de virus inesperados o incluso sin identificacin previa: el HIV y los virus del herpes
humano 6 y 7 se descubrieron primero en cultivo celular
y el ltimo virus que se identific de esta manera es el coronavirus del sndrome respiratorio agudo grave. Es una
tcnica que analiza todo y est bien adaptada a la identificacin de lo desconocido en especmenes clnicos.
Los dos inconvenientes principales de esta tcnica son,
primero, que no todos los virus pueden crecer en cultivo
y, segundo, que algunos virus experimentan adems crecimiento lento. El desarrollo de los nuevos tipos de cultivo
Cuadro 19-2
Aislados vricos potenciales obtenidos

de material clnico
Espcimen clnico
Lquido o escobillado de una
vescula
Aspirado nasofarngeo o
escobillado de la garganta
Heces
Lquido cefalorraqudeo
Orina
Escobillado conjuntival
Sangre (placa
leucoplaquetaria)
Virus que pueden aislarse en

cultivos celulares comunes
Virus del herpes simple (HSV),
virus de la varicela zoster
Virus sincitial respiratorio,
virus de la influenza A y B,
virus de la parainfluenza
1-4, adenovirus, rinovirus,
enterovirus, HSV,
citomegalovirus (CMV)
Enterovirus, adenovirus
Enterovirus, virus de las paperas
CMV, virus de las paperas
HSV, adenovirus
CMV
celular, que contribuyen a disponer de un arsenal cada vez

ms extenso de virus, puede superar en cierto grado el problema anterior, aunque hay varias adaptaciones del cultivo
celular que pueden acelerar el proceso de identificacin vrica.
Lennette EH, Schmidt NJ (eds). Diagnostic Procedures for Viral
Rickettsial and Chlamydial Infections, 7th ed. 1996: American
Public Health Association, Washington, DC.
Cann AJ (ed.). Virus Culture: A Practical Approach. 1999: Oxford
University Press, Oxford.
20
Pruebas serolgicas en virologa
Goura Kudesia
Introduccin
El sistema inmunitario produce los anticuerpos en respuesta
a varios estmulos, incluidas las infecciones, y la serologa
es la ciencia de la cuantificacin de estos anticuerpos en el
suero. Por convencin, el trmino serologa tambin incluye el estudio del suero para el antgeno y, por extensin, se
define cualquier prueba que implica una reaccin antgenoanticuerpo como prueba serolgica. Las pruebas serolgicas
aprovechan el hecho de que la mayor parte de las infecciones
vricas y muchas bacterianas, micticas y parasitarias obtienen buenas reacciones del anticuerpo. Estas pruebas se han
utilizado para el diagnstico de enfermedades vricas u otras
enfermedades en las que los microorganismos no se aslan
con facilidad, por ejemplo Toxoplasma y sfilis. En infecciones vricas como la hepatitis B, en la que hay una fase virmica prolongada, se pueden utilizar tcnicas similares para
detectar el antgeno del virus. Este captulo, aunque se limita
sobre todo a la serologa del virus, tambin considera otras
pruebas serolgicas empleadas hoy da en los laboratorios de
serologa para el diagnstico de enfermedades infecciosas y
describe los principios, tcnicas, interpretacin y futuro de
estas pruebas.
Principios
La clase del anticuerpo producido y las propiedades funcionales pueden explotarse para medir la respuesta inmunitaria despus de la infeccin. Las clases de anticuerpo
ms tiles para la medicin son IgM e IgG. La cuantificacin del anticuerpo IgA secretorio y srico puede tambin
ser til, pero es ms exigente en trminos tcnicos y por lo
tanto no se utiliza de rutina en laboratorios de diagnstico.

El anticuerpo inicial que se produce despus de la infeccin
primaria es de la clase IgM y se vuelve casi siempre perceptible uno a dos das despus del inicio de los sntomas y as
permanece seis a 12 semanas. El anticuerpo IgG especfico
comienza a aumentar en una a dos semanas y es perceptible
por muchos aos, cuando no el resto de la vida, despus de
la infeccin. Por consiguiente, el anticuerpo IgG especfico
del virus slo se relaciona con la infeccin pasada y en casi
todos los casos denota inmunidad para la infeccin futura.
Por otra parte, como el anticuerpo IgM especfico del virus
suele ser imperceptible despus de tres meses, su presencia
indica una infeccin reciente. La figura 20-1 muestra una
representacin grfica de la reaccin de IgM e IgG despus
de la infeccin primaria. La medicin de los anticuerpos
IgG e IgM especficos del virus en una sola muestra del
suero puede por tanto auxiliar en el diagnstico y ayudar a
distinguir la infeccin vrica reciente de la pasada. Muchas
tcnicas, como el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA
o EIA), el ensayo inmunofluorescente (IFA, por sus siglas
en ingls) y el radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en
ingls), se han desarrollado para medir IgG e IgM especficas. En condiciones normales, estas pruebas se usan para
resultados cualitativos, es decir, un resultado de la prueba positivo o negativo y no son cuantitativas. Tienen principios similares por los cuales la reaccin del anticuerpo
con el antgeno se detecta por la adicin de un segundo
anticuerpo dirigido contra la inmunoglobulina humana. La
antiinmunoglobulina se marca con la fluorescena (IFA),
la enzima (ELISA) o el radioistopo (RIA). Estas tcnicas
se pueden tambin emplear para la deteccin del antgeno.
El anticuerpo producido en respuesta a una infeccin
puede tambin ser distinto en su aspecto funcional, esto es,
198
CAP. 20
PRUEBAS SEROLGICAS EN VIROLOGA
Precipitacin
El mtodo de doble difusin (DD) de Ouchterlony se puede utilizar para detectar el anticuerpo o el antgeno. En el
primer caso se usa un antgeno conocido y en el segundo
un anticuerpo de especificidad conocida. El anticuerpo y el
antgeno se difunden el uno hacia el otro en gel de agarosa y una lnea de precipitacin blanca indica una reaccin
positiva. La contrainmunoelectrofluorescencia (CIE) dirige
de manera especfica el movimiento del antgeno y el anticuerpo el uno hacia el otro en un campo elctrico y por
lo tanto es ms rpido que el DD. La CIE fue el mtodo
usado de manera original en la identificacin del antgeno
superficial de la hepatitis B. Estos mtodos se han sustituido sobre todo por tcnicas mucho ms sensibles, aunque
algunos laboratorios todava las utilizan para las pruebas
de anticuerpos de hongos.
Figura 20-1 Reaccin de IgM e IgG en las infecciones temprana, reciente, convaleciente y pasada.
puede ser fijador del complemento, hemaglutinante o neutralizante. Los antgenos presentes en el virus determinan
las caractersticas funcionales del anticuerpo producido
en respuesta, de modo que slo los virus (p. ej., rubeola,
sarampin o influenza) que poseen hemaglutinina desencadenan anticuerpos hemaglutinantes. Puede utilizarse
el conocimiento de la estructura antignica de los virus para
concebir pruebas serolgicas convenientes, como fijacin
del complemento (FC), hemaglutinacin (HA) o pruebas de
inhibicin de la hemaglutinacin (IHA). Estas pruebas detectan las clases de IgG e IgM del anticuerpo al mismo tiempo y
pueden cuantificar la reaccin serolgica. Es posible solicitar
diluciones seriadas del suero para determinar el ttulo del anticuerpo presente. Se requieren muestras del suero agudas y
de convaleciente pareadas para establecer un diagnstico de
la infeccin reciente: un aumento del cudruple o mayor en
el valor del anticuerpo es diagnstico.
Tcnicas
Las tcnicas serolgicas se pueden dividir con base en la
complejidad de la prueba. Las ms simples son aquellas
en las cuales la presencia del anticuerpo se demuestra por
una interaccin simple con el antgeno (las pruebas de
precipitacin o aglutinacin). Las siguientes son las que
implican sistemas indicadores para reconocer la reaccin
antgeno-anticuerpo (neutralizacin o fijacin del complemento). Las pruebas ms complejas suponen el uso de un
segundo sistema con anticuerpo marcado, como el ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o IFA.
Hemaglutinacin e inhibicin
de la hemaglutinacin (HA e IHA)
La hemaglutinina de ciertos virus, como los virus de la influenza, el sarampin y la rubeola, tiene la propiedad de
aglutinar a los eritrocitos de las especies seleccionadas. Las
pruebas de HA son las ms utilizadas con los virus de la
influenza. Las influenzas A y B aglutinan a los eritrocitos
del grupo O humano, del cobayo y las gallinas a 4 y 20C,
mientras que la influenza C aglutina slo a eritrocitos de
gallinas. Las pruebas de HA son por tanto tiles en la deteccin y titulacin del antgeno vrico. La IHA utiliza la
presencia de la hemaglutinina en el virus para identificar al
anticuerpo. La prueba se basa en el principio segn el cual
el anticuerpo especfico se combina con la hemaglutinina
e inhibe a la HA. Se permite que diluciones seriadas del
suero del paciente reaccionen con una cantidad especificada de hemaglutinina y entonces se agregan los eritrocitos
indicadores apropiados. Si el anticuerpo especfico est
presente, bloquea la hemaglutinina y por consiguiente se
advierte una reaccin positiva por la ausencia de la hemaglutinacin. Donde est ausente el anticuerpo especfico,
la hemaglutinina vrica est libre para aglutinar a los eritrocitos indicadores (reaccin negativa). En el pasado, las
pruebas de IHA se usaron de modo amplio para establecer
el estado inmunitario y diagnosticar infecciones recientes
del virus de la rubeola. Sin embargo, la IHA es complicada
por el hecho de que el suero necesita tratamiento anterior
para retirar los inhibidores inespecficos, y por lo tanto se ha
reemplazado con tcnicas ms sensibles y especficas para
el diagnstico de la rubeola. Pese a ello, los laboratorios de
referencia todava utilizan la IHA para la identificacin y
tipificacin de los virus de la influenza. Las tcnicas de HA
se pueden tambin emplear para los virus que no poseen
199
TCNICAS
Figura 20-2 Prueba de aglutinacin de partculas

de gel con Mycoplasma pneumoniae.
hemaglutinina; esto se logra al hacer acoplar el antgeno

vrico a la superficie de los eritrocitos por un agente acoplador como el cido tnico. Cuando se mezclan con el
suero que contiene el anticuerpo especfico, los eritrocitos
se aglutinan porque el antgeno vrico se liga a su superficie
(HA indirecta o pasiva). La HA indirecta se ha usado para
el reconocimiento del anticuerpo contra el toxoplasma. No
obstante, debido a la inestabilidad de los eritrocitos, en la
actualidad se utilizan partculas inertes de portador, como
partculas de ltex, gelatina y carbn.
Pruebas de aglutinacin de partculas
Muchas pruebas se basan en la aglutinacin de la partcula.
Estas pruebas se llevan a cabo sobre un portaobjetos o una
diapositiva de cartn o bien en celdillas de microtitulacin.
Lo que sigue no es una lista exhaustiva, sino ejemplos de
algunas de las pruebas ms comunes de uso actual.
Aglutinacin de ltex (AL)
Las micropartculas de ltex de poliestireno se sensibilizan
o cubren con el antgeno vrico aglutinado cuando se mezclan con el suero del paciente que contiene el anticuerpo
especfico. Las partculas de ltex revestidas con el antgeno
se mezclan con el suero del paciente sobre un portaobjetos
o en una celdilla de microtitulacin. Un patrn visible de
aglutinacin aparece si el anticuerpo especfico est presente. Estas pruebas son de uso amplio en los laboratorios de
virus debido a su rapidez, simplicidad y facilidad de uso. En
la actualidad estn disponibles buenas pruebas de AL para la
rubeola, el toxoplasma y el citomegalovirus. Las pruebas
de AL se utilizan para el examen de una sola muestra de

suero para establecer inmunidad y los sueros pareados para
diagnosticar una infeccin reciente.
Prueba de aglutinacin de partcula de gelatina
Las partculas de gelatina se cubren con el antgeno y las
diluciones seriadas del suero de un paciente se prueban en
celdillas de microtitulacin. El ttulo del anticuerpo se determina por la dilucin ms alta del suero que aglutina las
partculas revestidas de antgeno. Puede ocurrir la aglutinacin inespecfica y por lo tanto las partculas de gelatina sin
cubrir se incluyen siempre como controles (fig. 20-2).
VDRL
VDRL es una prueba serolgica para el examen de la infeccin de sfilis. Una modificacin de la prueba utiliza el
antgeno que contiene carbn microparticulado para examinar el anticuerpo reagina. El uso de las partculas de carbn incrementa la lectura visual del resultado de la prueba
en un fondo blanco.
Fijacin del complemento (FC)
El suero del paciente, despus de la inactivacin a 56C por
30 minutos para destruir el complemento nativo, se agrega
a una cantidad conocida del antgeno vrico y del complemento de conejo. Si ocurre la reaccin anticuerpo-antgeno,
entonces se activa el complemento, se fija o se liga. Luego
se agrega un sistema detector del antgeno y el anticuerpo,
200
CAP. 20
Figura 20-3 Inmunoensayo de enzimas de IgG e

IgM de la varicela zoster.
bajo la forma de eritrocitos de oveja sensibilizados con

el anticuerpo del conejo para los eritrocitos de oveja (hemolisina). Si la primera reaccin antgeno-anticuerpo fija
el complemento, los eritrocitos de oveja no se lisan, lo
cual indica una reaccin y una presencia positivas del anticuerpo especfico en el suero. La hemlisis de eritrocitos
sensibilizados de las ovejas por el complemento seala una
reaccin negativa. La prueba FC es cuantitativa. El suero se
diluye de modo seriado y el valor del anticuerpo se expresa
como recproco de la dilucin ms alta del suero que da lugar a la hemlisis de 50% de los eritrocitos sensibilizados.
Un aumento del cudruple del ttulo o la seroconversin
entre una muestra aguda y otra de suero de convaleciente
son diagnsticos. Esta tcnica requiere destreza considerable y mucho trabajo, pero el suero se puede probar contra antgenos mltiples en una sola ocasin con el mismo
sistema indicador. Las pruebas de FC se efectan slo en
laboratorios de virologa especializados y son todava las
pruebas de opcin para el diagnstico serolgico de las infecciones vricas respiratoria y bacteriana atpicas.
Neutralizacin
La interaccin del anticuerpo especfico con el virus neutraliza la infectividad y previene la infeccin de un sistema husped viviente susceptible a ese virus. Una desventaja
importante de estas pruebas es que se requiere un sistema
husped vivo, bajo la forma de un cultivo celular o animales
vivos y por lo tanto muchas de estas pruebas se han reemplazado con otras tcnicas. Las pruebas de neutralizacin
todava se utilizan para detectar el anticuerpo del poliovirus
y ciertas toxinas, como en el caso de Clostridium difficile.
Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA)

sta es la prueba serolgica ms difundida de uso corriente. Se conocen muchas variaciones de la metodologa, pero
todas implican la fijacin del antgeno a una fase slida,
la cual es casi siempre una placa o gota de poliestireno o
polivinilo. Se agrega el suero del paciente y despus de
una extensin apropiada de tiempo para permitir al anticuerpo unirse al antgeno sobre la fase slida, se eliminan
mediante lavado el material ligado de forma inespecfica y
el exceso de suero. Entonces se agrega una inmunoglobulina antihumana marcada por la conjugacin con una enzima (conjugado). El conjugado se une al anticuerpo en el
complejo de antgeno-anticuerpo. El exceso de conjugado
se lava entonces para removerlo y la presencia de la inmunoglobulina antihumana marcada ligada se identifica por la
adicin de un sustrato conveniente para la enzima marcadora. Si han ocurrido las reacciones apropiadas, entonces
el sustrato se convierte en un producto absorbente de luz y
aparece coloreado. En ausencia del anticuerpo, no se produce ningn color (fig. 20-3). La intensidad del color se relaciona directamente con la cantidad del anticuerpo ligado
al antgeno. El cambio del color puede cuantificarse a simple vista o lo registra un espectrofotmetro para revelar la
intensidad exacta de la reaccin. Los sistemas de enzimasustrato de uso corriente son peroxidasa del rbano (HRP),
O-fenilendiamina (OPD) y fosfatasa alcalina y fosfatasa de
p-nitrofenilo. Para adaptar la prueba a la deteccin del antgeno, la fase slida se cubre con el anticuerpo especfico
para el antgeno a detectar. Un segundo anticuerpo marcado se aade entonces para detectar cualquier complejo antgeno-anticuerpo en la superficie de la fase slida. Segn
sea la secuencia de reaccin, las pruebas ELISA se dividen
TCNICAS
Figura 20-4 Diferentes formatos de la prueba ELISA.

(a) ELISA indirecta:
1. Fase slida de la capa con el antgeno vrico.
2. Incubar con el suero del paciente. El anticuerpo especfico
presente se fija al antgeno unido a la fase slida.
3. Agregar la enzima marcada anti-IgG o anti-IgM.
4. Agregar el sustrato; cambia el color si la reaccin es positiva.
(b) ELISA de captura:
1. Fase slida de la capa con anti-IgG o IgM.
2. Incubar con el suero del paciente. Todas las IgG o IgM
presentes se capturan en la fase slida.
3. Agregar el antgeno; ste une a cualquier anticuerpo especfico capturado.
201
4. Agregar el antivrico IgG marcado con enzima.

5. Agregar el sustrato; cambia el color si la reaccin es positiva.
(c) ELISA competitiva:
1. Fase slida de la capa con el antgeno.
2. Agregar el suero del paciente y el anticuerpo especfico
marcado con enzima. El anticuerpo especfico compite con
el conjugado para unirse a la fase slida.
3. Agregar el sustrato. La reaccin positiva se muestra sin color
en (a), ya que el anticuerpo especfico bloque al conjugado.
La reaccin negativa se muestra por el color en (b), ya que el
anticuerpo marcado con enzima no se bloque.
202
CAP. 20
en directas, indirectas, de captura o competitivas. La figura

20-4 explica algunas de las diferencias entre estos mtodos. Las pruebas son especficas para IgM o IgG, segn
sea que se emplee IgM antihumana o IgG como el segundo
anticuerpo. Para una revisin detallada, vase la obra de
Booth, 1983 (vanse las Lecturas adicionales).
ELISA es una tcnica muy sensible porque una cantidad
pequea de enzima puede procesar una cantidad grande de
sustrato. Los resultados negativos falsos de IgM pueden
ocurrir en presencia de valores altos de IgG especfica, que
compiten por el antgeno en la fase slida. Esto puede evitarse si se remueve la IgG antes de la prueba de la muestra.
Las reacciones inespecficas en el ensayo de IgM pueden
tambin ocurrir debido a la presencia del factor reumatoide (RF). El RF de la clase de IgM se une a los antgenos
nuevos expuestos debido a los cambios configuracionales
en la regin Fc de la molcula IgG especfica cuando sta
se liga al antgeno en la fase slida. El RF de la IgM no
puede distinguirse de la IgM especfica del virus, pero el
RF se puede remover por absorcin con el agregado de IgG
antes del examen para la IgM. Se prefieren los ensayos de
captura para IgM, ya que no se afectan con el RF o la IgG
especfica en el suero del paciente. Las pruebas ELISA tienen la ventaja de ser objetivas, se pueden automatizar con
facilidad y no requieren gran destreza tcnica. Son pruebas
rpidas y la mayor parte de los mtodos se pueden completar dentro de dos a tres horas. Casi todos los laboratorios
microbiolgicos, si no todos, estn equipados para realizar
ELISA, que son de uso extenso para la investigacin y el
diagnstico serolgico del HIV, hepatitis vrica, rubeola,
citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus de la varicela
zoster, sarampin, paperas, toxoplasma, Chlamydia trachomatis, etctera.
Inmunofluorescencia (IF)
En la IF indirecta para la deteccin del anticuerpo, las clulas infectadas por virus o el antgeno bacteriano se fijan
a las celdillas en portaobjetos cubiertos de tefln, se aade
el suero del paciente y se detecta la reaccin antgeno-anticuerpo por la adicin de la inmunoglobulina antihumana marcada con el colorante fluorescena (isotionato de
fluorescena). La reaccin se registra debajo de un microscopio de luz fluorescente y las reacciones positivas se
indican por la fluorescencia verde manzana tpica. Se han
utilizado por muchos aos las pruebas de IF indirectas para la
identificacin de los anticuerpos IgM e IgG para los citomegalovirus, el virus de Epstein-Barr y el virus de la varicela zoster. Las reacciones positivas falsas secundarias a la
expresin de receptores sobre las clulas infectadas, a las
cuales se puede unir el anticuerpo especfico no vrico de
la clase IgM, son un problema. Las pruebas de IF tambin
requieren equipo especializado, como un microscopio de

fluorescencia, y estn sujetas al criterio del operador en la
lectura. Por lo tanto, las han sustituido las pruebas ELISA
para la deteccin del anticuerpo. Por otra parte, la disponibilidad de los anticuerpos monoclonales de buena calidad
para una variedad de antgenos vricos ha convertido a la
IF directa en el mtodo ideal para la deteccin del antgeno en varios tejidos y muestras. El material infectado se
fija encima de un portaobjetos con la ayuda de acetona o
alcohol y se tie con el anticuerpo monoclonal marcado
con fluorescena dirigido contra el antgeno bajo prueba.
La IF directa se utiliza extensamente para el diagnstico
rpido de virus respiratorios por el examen de las clulas
epiteliales de aspirados nasofarngeos para el virus sincitial respiratorio, los virus A y B de la influenza, los virus
1, 2 y 3 de la parainfluenza y los adenovirus.
Radioinmunoensayos (RIA)
stos se basan en los mismos principios que los mtodos
ELISA. Las pruebas de RIA usan un radioistopo marcado
en vez de una enzima marcada. Debido a la corta vida til
del radiomarcador y los requisitos especiales para eliminar
la radiactividad, las tcnicas ELISA los han reemplazado.
Western blot (WB) o inmunoensayo en lnea (LIA)
Representan una herramienta muy especfica y sensible
para detectar y caracterizar a los anticuerpos contra microorganismos en virtud de su enlace a los antgenos fijados
a las membranas de nitrocelulosa. Para la prueba WB se
separan las protenas vricas o bacterianas semipurificadas
por electroforesis en un gel de poliacrilamida y despus
se transfieren de modo electrofortico a una membrana de
nitrocelulosa. En el inmunoensayo en lnea los antgenos
vricos, producidos por tcnicas moleculares recombinantes o sintetizados de manera artificial (pptidos sintticos),
se unen directamente a la membrana de nitrocelulosa.
La membrana de nitrocelulosa se incuba con el suero del
paciente para permitir al anticuerpo unirse a los antgenos
fijados en la membrana. Se agrega la inmunoglobulina
antihumana con enzima marcada con base en un principio similar al de la prueba ELISA. Se siguen los pasos de
lavado apropiados. En la adicin del sustrato pueden ser
visibles las bandas del antgeno para las cuales el anticuerpo especfico est presente.
La tcnica es nica en el sentido de que puede identificarse el anticuerpo contra las protenas vricas o bacterianas simples o los epitopos antignicos, lo que torna a la
prueba muy especfica. Se utilizan en extenso como pruebas de confirmacin para el HIV y el virus de la hepatitis C
y para el diagnstico de la enfermedad de Lyme.
INTERPRETACIN Y USO DE LAS PRUEBAS SEROLGICAS
Pruebas de avidez del anticuerpo

Las tcnicas para medir la avidez del anticuerpo IgG se han
desarrollado para ayudar a la cronologa de la infeccin por
serologa. El anticuerpo de avidez baja se produce de forma inicial despus de la infeccin primaria, mientras que el
anticuerpo de avidez alta lo hace despus de la reinfeccin
o la recrudescencia. Las pruebas de avidez del anticuerpo
se basan en el principio de que los complejos antgenoanticuerpo de avidez alta requieren ms energa para la disociacin o prevencin de la formacin del complejo. En la
celdilla de prueba, el anticuerpo de avidez baja se remueve
por lavado con 8 M de urea (disociacin) o los enlaces se
previenen desde la formacin con el uso del agente desnaturalizante de la protena clorhidrato de guanidina en el
lquido diluyente del suero. Las celdillas control se tratan
con lavado normal y lquido diluyente. Los anticuerpos en
forma de complejos de la fase slida se detectan entonces en las celdillas de prueba y control. Si un anticuerpo
muestra avidez alta, no hay diferencia significativa entre
la lectura de la celdilla de prueba y la de control dado que
estos complejos no se disocian ni se previenen con facilidad desde que se forman. Los ensayos de avidez han sido
inestimables en la atencin de la rubeola e infecciones por
Toxoplasma en el embarazo y han contribuido a establecer
la cronologa de la infeccin.
Serologa en muestras no sricas
Las pruebas ELISA de captura de IgG e IgM se han adaptado para el examen de muestras de orina y saliva. Puesto
que stas son muestras no invasivas, se prefieren para los
nios y otros grupos, como los consumidores de drogas
intravenosas, en los que es difcil obtener muestras de sangre. El diagnstico serolgico por el examen de la saliva
est disponible ahora para el sarampin, paperas y rubeola.
La serovigilancia a gran escala de la infeccin del HIV se
efecta mediante revisin de orina y saliva.
Interpretacin y uso de las pruebas

serolgicas
La capacidad con los mtodos ELISA semiautomatizados o
automatizados generaliz su disponibilidad para un nmero
extenso de laboratorios. Las pruebas ms antiguas eran difciles desde el punto de vista tcnico y las practicaban slo
algunos laboratorios especializados. Las notorias mejoras
tecnolgicas del mtodo ELISA, junto con el conocimiento de la importancia de las infecciones vricas en muchos
grupos vulnerables de pacientes, convirti a la serologa en
un pilar fundamental del diagnstico del virus.
203
En la actualidad, la serologa se establece para el diagnstico de las infecciones, en especial enfermedades vricas. La tecnologa ms reciente significa que muchas de
las pruebas diagnsticas comunes se pueden realizar por
medio de microbiologa general o por otros laboratorios no
especializados.
Diagnstico de las infecciones agudas
Los estudios serolgicos contribuyen en grado notorio al
diagnstico de las enfermedades infecciosas. De manera habitual, una confirmacin serolgica requiere el examen de
una muestra de suero tomada inmediatamente despus del
inicio de la enfermedad (aguda) y una segunda muestra de
una a dos semanas despus (convaleciente). Un incremento del cudruple del anticuerpo o de la seroconversin del
estado negativo al estado positivo del anticuerpo entre las
muestras aguda y convaleciente indica infeccin aguda. Sin
embargo, las nuevas tecnologas para la deteccin especfica de IgM e IgG permiten al laboratorio precisar un diagnstico o descartar una infeccin sospechada en una sola
muestra de suero. Para ello, las tcnicas ELISA se emplean
de forma amplia en los laboratorios de microbiologa. Si no
se reconocen IgM o IgG, entonces el paciente no estuvo expuesto al microorganismo o la muestra se recogi demasiado pronto. Como el anticuerpo IgM para la mayor parte de
los virus se puede identificar dentro de una semana tras el
inicio de los sntomas, una muestra tomada en ese tiempo,
si es negativa para IgM vrica, es suficiente para descartar
una infeccin reciente o actual. La IgM especfica se puede detectar slo por tres meses, pero algunas pruebas ms
sensibles pueden reconocer IgM ms all de los 12 meses.
Como la IgG est slo presente ms adelante, una reaccin
positiva de la IgM, con o sin la presencia de IgG especfica,
indica una infeccin reciente. La IgG especfica permanece
positiva por toda la vida y por tanto la presencia exclusiva
de IgG con IgM negativa indica una infeccin pasada y en
casi todos los casos inmunidad a la infeccin futura contra
ese agente patgeno especfico. Est claro que la seleccin
de la prueba y la interpretacin del resultado dependen de
la afeccin clnica y la fecha de inicio de los sntomas, que
deben por tanto comunicarse siempre al laboratorio.
Deteccin del anticuerpo para verificar la inmunidad
La verificacin de la inmunidad a las infecciones se requiere en muchas situaciones clnicas, como el periodo posterior a la vacunacin, solicitudes de empleo, embarazo,
condiciones anteriores al trasplante o pacientes inmunosuprimidos que pueden entrar en contacto con infecciones.
Las pruebas para reconocer al anticuerpo protector tienen
204
CAP. 20
que ser sensibles y requieren el examen para IgG especfica.

Se utilizan las pruebas vricas ELISA de IgG especfica, IFA
o anticuerpo total, como la prueba de aglutinacin de ltex.
Las encuestas seroepidemiolgicas posteriores a la vacunacin para determinar seroconversin e inmunidad despus de la vacunacin para sarampin, paperas, rubeola y
hepatitis B han formado una parte vital de la evaluacin
de la eficacia de los programas de vacunacin. Los mtodos ELISA automatizados y sensibles han hecho factible
el examen masivo de la etapa posterior a la vacunacin.
El anticuerpo para la hepatitis B se expresa en unidades
internacionales y esta capacidad de cuantificar permite al
clnico decidir sobre la cronologa de las revacunaciones
consecutivas.
La inmunidad para la rubeola y la hepatitis B es un requisito de empleo para muchos trabajadores de la atencin
sanitaria. La inmunidad a otras infecciones, como el virus de la varicela zoster, sarampin y paperas, es tambin
deseable, sobre todo para aquellos que trabajan con nios
o pacientes inmunocomprometidos, sea para protegerse o
para prevenir la propagacin de la infeccin a los pacientes
susceptibles. Quienes son susceptibles a la infeccin por
varicela zoster y los que se exponen a la varicela se deben
excluir del trabajo, para no exponer a los pacientes susceptibles a la infeccin.
Durante el embarazo, el examen para identificar el anticuerpo protector contra la rubeola se ofrece a todas las
personas y se vacuna a las mujeres susceptibles despus del
parto. Se recomienda examinar a todas las pacientes para el
virus de la hepatitis B y se suministra inmunizacin de la
hepatitis B a los recin nacidos de madres infectadas para
prevenir la transmisin vertical de la infeccin. El examen
del HIV para las madres en riesgo permite el tratamiento con el medicamento especfico de la madre durante el
embarazo y el parto para reducir el riesgo de la transmisin vertical del HIV. El examen del anticuerpo para otros
microorganismos, como varicela zoster, toxoplasma y citomegalovirus, permite al clnico aconsejar a pacientes susceptibles acerca de la forma de evitar la infeccin. Todos
estos controles requieren una prueba simple de aglutinacin
de ltex o ELISA de IgG. Sin embargo, en caso de contacto
reciente con una infeccin, los mtodos de IgM tienen que
realizarse adems de asegurarse que la IgG detectada es de
una infeccin pasada y no de una actual.
Pacientes sometidos a trasplante e inmunosuprimidos
Estos individuos son en particular propensos a desarrollar
infecciones por citomegalovirus (CMV). Los pacientes positivos al anticuerpo CMV que reciben un rgano de un
donante positivo al CMV requieren profilaxis para prevenir
el desarrollo de la infeccin por CMV primaria. Adems,

la infeccin por toxoplasma adquirida del donante es un
problema grave en el receptor del trasplante del corazn,
as que todos los donantes y receptores se examinan en relacin con el anticuerpo contra el toxoplasma y se aplica
profilaxis en los receptores negativos de un corazn de donantes positivos para anticuerpos contra el toxoplasma. Los
pacientes inmunosuprimidos tambin se examinan para las
infecciones comunes, como varicela, herpes simple y sarampin, puesto que ellos pueden sufrir enfermedad grave
si se exponen a ellas.
Examen para la donacin de sangre, rganos y tejidos
Muchos microorganismos, en especial virus transportados en la sangre, se pueden transmitir por va sangunea y
productos de la sangre, trasplante de rganos y tejidos. Es
esencial que la sangre se examine antes de la transfusin.
En el Reino Unido toda la sangre se examina para HIV,
hepatitis B, hepatitis C y sfilis. En el caso del HIV y el
virus de la hepatitis C, la presencia del anticuerpo significa infeccin actual y el examen para el antgeno vrico es
innecesario. La sangre destinada para pacientes inmunosuprimidos tambin se examina para CMV. Debido a la importancia de desechar la sangre infectada, slo se emplean
las pruebas ms sensibles. Las donaciones que se encontraron positivas se someten a pruebas confirmatorias por
los laboratorios de referencia especializados. Para hacer
frente al volumen de exmenes requeridos, los laboratorios de transfusin de sangre tienen sistemas ELISA automatizados para el examen microbiolgico de la sangre.
Los donantes de rganos y tejidos se someten a procedimientos de revisin similares.
Diagnstico de infeccin congnita
Como la IgG materna cruza la placenta y llega al feto, la
presencia de IgG con especificidad vrica en la sangre neonatal no indica en todos los casos infeccin. La persistencia
del anticuerpo IgG ms all de los seis meses de edad seala infeccin congnita, dado que el anticuerpo derivado
de la madre desaparece para entonces. La presencia de IgM
especfica en o poco despus del nacimiento supone infeccin congnita o vertical, ya que la clase IgM del anticuerpo no cruza la placenta.
Futuro de la serologa
Aunque muchas infecciones se pueden diagnosticar con
rapidez por la deteccin de IgM especfica del virus por
FUTURO DE LA SEROLOGA
las tcnicas descritas en este captulo, para otras como las

infecciones respiratorias del virus slo es posible un diagnstico retrospectivo porque se requiere una muestra de
suero convaleciente para el examen por CFT. Es posible
que muchos pacientes inmunosuprimidos no activen una
buena respuesta del anticuerpo y por tanto la ausencia de
una reaccin de IgM especfica para el virus no descarta
siempre la infeccin en este grupo de personas.
Los avances en las tcnicas de amplificacin del cido
nucleico, en especial en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real con tecnologa automatizada,
han permitido a los laboratorios ofrecer PCR para el diagnstico comn de las infecciones vricas. Los mtodos basados en la PCR son rpidos: la PCR en tiempo real puede
demorar dos a tres horas. Muchos laboratorios se inclinan
ahora por realizar las tcnicas de PCR para diagnosticar
la infeccin. En virtud de la deteccin vrica de RNA o
DNA, se puede reconocer la infeccin mucho antes que se
establezca una reaccin del anticuerpo (segn lo establecen
los mtodos serolgicos). Esto puede ser de utilidad, sobre
todo en pacientes inmunosuprimidos.
Sin embargo, las pruebas serolgicas de IgM se emplean
todava para diagnosticar infecciones recientes en quienes
no las manifiestan de inmediato, ya que la IgM se puede
detectar ms all de tres meses tras la infeccin y algunas
veces mucho tiempo ms. Los procesos serolgicos tambin tienen un papel crucial para establecer evidencia de
inmunidad a la infeccin, como resultado de una infeccin
205
pasada o consecutiva a la vacunacin. Son tambin una

herramienta epidemiolgica importante en los estudios de
serovigilancia, que establecen la prevalencia de la infeccin.
En el futuro, aunque las tcnicas de amplificacin de
cidos nucleicos rpidas y sensibles (como la PCR) pueden reemplazar a la serologa para diagnosticar la infeccin
actual por muchos virus, la serologa no dejar de desempear un papel importante en el acompaamiento de la PCR
para el diagnstico de una infeccin reciente. Lo que es ms
importante, ser an el pilar fundamental en la medicina
preventiva al establecer la evidencia de inmunidad posterior
a la vacunacin, identificar a los individuos susceptibles a
la infeccin para protegerlos y estudiar la epidemiologa
de las infecciones vricas.
Booth JC. The use of the enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) technique in clinical virology. Recent Advances in
Clinical Virology, Waterson AP (ed.). 1983: Churchill-Livingstone, Edinburgh, 73-98.
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12(2): 97-102.
21
Pruebas automatizadas en virologa
Roger P Eglin
Introduccin
Durante los ltimos 50 aos la comprobacin diagnstica
en laboratorios clnicos se ha desarrollado a partir de la operacin manual de pruebas como el examen de los frotis de
sangre y los mtodos qumicos simples mediante tcnicas
que requieren cantidades relativamente grandes de sangre,
suero o plasma. En el decenio de 1960 se desarroll el analizador multicanal para la qumica clnica y se introdujeron
mtodos de conteo electrnico, como el contador de Coulter. El desarrollo continuo de estas comprobaciones automatizadas comenz a concentrarse en mejoras de la calidad
y la consistencia de los resultados y en reducir los tiempos requeridos para las pruebas y el volumen de la muestra
exigido para cada una. Aunque los sistemas automatizados
complejos son ya una prctica comn en otras reas de la
patologa desde los ltimos 20 aos, la microbiologa y en
particular los laboratorios de virologa han utilizado mtodos de comprobacin tradicionales. Para la virologa, stos se basaron en el cultivo celular y el aislamiento vrico
con las pruebas del anticuerpo mediante reactivos producidos en buena medida en casa. Los inmunoensayos
enzimticos (IEE) aparecieron en la dcada de 1970 y sus
desarrollos comerciales posibilitaron la transicin hacia
la automatizacin. El impulso se origin tras el desarrollo
de estos equipos a solicitud del Blood Transfusion Service
(ahora National Blood Authority) para examinar las donaciones de sangre para una gama limitada pero en aumento
constante de infecciones vricas transmitidas por la sangre.
Primero se emple el antgeno HBs en el decenio de 1970,
despus sigui el anti-HIV en 1984, el anti-CMV selectivo
en 1980 y el anti-HCV en 1991. La gran expansin de la
gama de IEE comerciales en el decenio de 1980 ampli el
uso de protocolos estndar e impuls la fabricacin de sistemas automatizados. Slo hasta comienzos de la dcada de
1990 se desarroll un equipo ideado de modo especfico para
el laboratorio de virologa diagnstica. En la actualidad se
halla en el repertorio de estas mquinas automatizadas una
amplia variedad de pruebas diagnsticas. En trminos generales, los mtodos disponibles se basan en la tcnica de IEE.
Los primeros sistemas se desarrollaron para las pruebas de
examen solicitadas con ms frecuencia, es decir, antgeno
de HBs, anti-HBs, IgG de la rubeola y antgeno de Chlamydia trachomatis. Despus de la dificultad inicial para comercializar los equipos automatizados en los primeros aos
del decenio de 1990, el mercado adquiri estabilidad en la
poca actual. Ahora se han identificado diferentes clases de
mquinas y el tipo de carga de trabajo ms apropiado para
cada clase de instrumento. Las definiciones bsicas del tipo
de automatizacin se discuten a continuacin.
Procesador de lquidos (PL)
Un PL completa la preparacin de una microplaca que contiene muestras diluidas de forma apropiada y controles especficos de la prueba mediante una hoja de trabajo para identificar las muestras y los protocolos especficos para la prueba
requerida; asimismo, completa la separacin del suero a partir de un cogulo de sangre y de ese modo prepara un almacn de suero a partir de las muestras de sangre recibidas.
Procesador automatizado de IEE
Un procesador automatizado de IEE completa un IEE
con tan slo el suministro de las muestras y los reactivos
208
CAP. 21
PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN VIROLOGA
especficos para esa prueba; adems, termina un IEE con

la simple adicin de una microplaca que contiene muestras
correctamente diluidas y los reactivos especficos para esa
prueba. En consecuencia, el equipo puede subdividirse en
las siguientes clases:
Acceso aleatorio/comprobacin por lote. Por lo general,
los procesadores de IEE se disean para pruebas especficas sobre muestras que se acumulan como un lote y se
identifican con una hoja de trabajo especfica. Algunos
procesadores son tambin capaces de analizar pruebas de
muestras nicas para satisfacer la respuesta a la demanda
clnica urgente. Estas pruebas nicas requieren calibradores de control para la prueba, adems de la muestra para
la prueba. Es posible interrumpir la prueba para procesar
una muestra urgente o puede introducirse en un momento
conveniente entre los lotes de otras pruebas. Estas mquinas de acceso aleatorio requieren mdulos de la prueba
especficos del fabricante o el uso de controles permanentes sobre el tablero para operar la prueba.
Formato con tubo nico/formato con microplaca. Algunos procesadores llevan a cabo un muestreo directo
del tubo y realizan todas las operaciones subsecuentes
como pruebas nicas del tubo, por ejemplo los equipos
VIDAS, E7001. Otros procesadores aceptan muestras
nicas del tubo, pero preparan la prueba con microplacas. Este formato de la placa puede ser especfico del
fabricante o aceptar cualquier microplaca basada en IEE
de uso estndar.
Sistema de prueba especfico del fabricante/mtodo de
microplaca estndar. El sistema de procesamiento del
fabricante es nico y el uso del procesador impone la
necesidad de utilizar los equipos del fabricante, por
ejemplo VIDAS, AXSYM, PRISM. Se han diseado
otros procesadores para analizar cualquier IEE basado
en microplaca y la eleccin depende del laboratorio y de
las caractersticas de ejecucin de la prueba. En el cuadro 21-1 se proporcionan algunos ejemplos del equipo
actual disponibles de cada clase.
Cuadro 21-1 Qu equipo automatizado es ms apropiado?

Tipo de mquina
Ventajas
Desventajas
Acceso aleatorio: pruebas

especficas del fabricante
Comprobacin rpida de muestras nicas

Requiere un grupo completo de muestras
control una vez/mes
No requiere grupo completo de control
para cada prueba, usa calibradores
Gama amplia de pruebas disponibles
que cubren varias disciplinas
Compartir costos con otros usuarios de la
mquina (bioqumica, inmunologa)
El rendimiento diario puede ser pequeo, p. ej., 300/da

El rendimiento del laboratorio total en un da de
trabajo normal puede ser >400 muestras
Recargo pagado para el mismo proveedor comercial
nico de los mdulos y el equipo de prueba
Pueden estar disponibles mrgenes limitados de
pruebas para enfermedades infecciosas
Si se usa como una instalacin de laboratorio central,
pueden interrumpirse en realidad las pruebas actuales?
Comprobacin por lote:

sistema basado en dos o
tres microplacas
Tambin puede incluir la omisin de la

muestra
Pueda ser capaz de procesar cualquier
sistema basado en microplacas
Deben ser pruebas especficas del fabricante, p. ej.,

AXSYM (quimioluminiscencia). Est disponible
una gama completa de pruebas para enfermedades
infecciosas?
Puede procesar slo tres lotes en un da normal de
trabajo
Puede requerirse la planificacin cuidadosa del
procesamiento de la prueba
Sistema basado en
microplacas de acceso
abierto
Usa cualquier prueba de placa de

microtitulacin basado en IEE
Puede aceptar la placa de la prxima
prueba en cualquier momento
Puede ser necesario separar la muestra que dispensa

el equipo
Sistema que no requiere

muestra
Permite la manipulacin de pruebas no

marcadas o vinculadas
Puede usarse para otros propsitos, como
alcuotas de la muestra para almacenar
suero en recipientes/microplacas, CFT,
SRH
Los costos pueden incrementarse
AUTOMATIZACIN EN EL LABORATORIO DE DIAGNSTICO
Automatizacin en el laboratorio
de diagnstico
Para discutir este asunto es necesario considerar las siguientes presuposiciones: en primer lugar, el laboratorio
utiliza un programa de diagnstico para procesar la base
de datos de los pacientes; en segundo lugar, se identifican
mediante un sistema de cdigo de barras las etiquetas que
se aplican a la solicitud, el tubo de sangre primario y la
muestra de suero archivada, y en tercer lugar, el laboratorio
emplea un sistema automatizado que comprende un PL y
un procesador de IEE basado en microplaca.
Luego de la recepcin de la muestra y el formato de
solicitud en el laboratorio, muchas veces las primeras dos
etapas del procesamiento ocurren de forma simultnea.
Hojas de trabajo
Se ordena una serie de pruebas en conformidad con los detalles clnicos y la fecha de inicio anotados en el formato de
solicitud. Este grupo de pruebas se almacena en la computadora y ello conduce a la creacin de hojas de trabajo especficas de la prueba, las cuales pueden cancelarse cuando
sea necesario de acuerdo con la hoja de planificacin diaria
del sistema automatizado.
Separacin del suero
Despus de centrifugar el tubo primario con la sangre, para
centrifugar el cogulo de sangre, el suero se separa por PL
o de forma manual en un tubo de almacenamiento, que se
etiqueta con la misma identificacin de cdigo de barras
que el tubo primario con la sangre.
Preparacin de las microplacas para el ensayo
Si un sistema de acceso aleatorio se halla en uso, entonces
el recipiente del almacenamiento con el suero se carga directamente en el sistema con las diluciones requeridas que
efecta la mquina. El PL debe ser capaz de identificar los
tubos con la muestra o los tubos primarios con sangre en
estantes o carruseles. Verifica que todas las muestras en la
hoja de trabajo actual estn presentes y luego lleva a cabo
las diluciones apropiadas del suero en las celdillas, segn el
protocolo especfico. La placa se identifica con un cdigo
de barras para permitir la identificacin positiva y la seleccin del protocolo correcto por el programa. Esto permite
a la computadora ordenar los reactivos apropiados para el
IEE especfico. Debe tambin agregar los estndares apropiados, los suministrados por los fabricantes y el laboratorio
209
en las muestras internas, y las muestras de calibracin cuando sea necesario para permitir el control de calidad (QC) de
la prctica de la prueba. Estas muestras de QC se distribuyen en las celdillas designadas en el protocolo. El sistema
indica si en una muestra no se recolect el lquido.
Procesador IEE
La placa se identifica con un cdigo de barras y el programa
reconoce la hoja de trabajo y el protocolo correctos correspondientes a esa prctica especfica de la prueba. La mquina revisa la colocacin exacta de los reactivos solicitados
para el IEE en el sistema y se verifican los volmenes de
estos reactivos con base en el peso. La comprobacin incluye la solucin amortiguadora de lavado y los reactivos de
la prueba y verifica que el volumen del recipiente de desechos es suficiente. El primer paso, que es parte del control
de calidad que vigila el sistema, consiste en tomar una lectura espectrofotomtrica de la placa para comprobar que se
agreg una muestra a cada una de las celdillas previstas. Una
lectura discrepante de la densidad ptica (DO) identifica el
punto donde no hay muestra. El procesador activa al IEE y
a continuacin el protocolo se almacena en el programa. Si
un sistema de acceso abierto se halla en funcin, el procesador recalcula los espacios de tiempo para los anlisis en
proceso y el ajuste en la nueva placa para procesar cuanto
antes. El tiempo de inicio aparece junto con una advertencia,
si el retraso antes del anlisis excede el lapso predefinido por
el sistema. Por lo general se evitan los IEE que utilizan incubaciones a temperatura ambiente porque, aunque los periodos
de la incubacin suelen ser ms largos que los de las incubaciones a 37C, las primeras reacciones de la incubacin
comienzan inmediatamente despus que la muestra diluida
se distribuye en las celdillas. Las incubaciones a 37 o 40C
permiten un tiempo de inicio determinado, lo cual es necesario para las mquinas de acceso abierto. El protocolo del IEE
debe incluir la vigilancia despus de cada paso que requiera
la adicin de reactivos lquidos y tambin la revisin de las
cabezas de lavado despus de cada operacin para constatar
que todas las celdillas se lavaron de modo apropiado. Debe
mostrar la lectura a partir de la vigilancia de cada adicin
lquida cuando el IEE contina y cualquier error detectado
se seala de inmediato. Si una mquina de acceso abierto se
encuentra en uso, cada serie de reactivos de la prueba debe
aadirse cuando lo requiera el procesador.
Procesamiento de los datos
Las lecturas finales de la DO, tomadas al trmino del ensayo, se envan de forma automtica al programa del sistema
para el procesamiento que realiza el paquete de reduccin
de datos. Este paquete requiere, segn sea el tipo de prueba,
210
CAP. 21
calcular el valor de intercepcin a partir de los controles

y aplicarlo a los valores de la DO de la muestra; en este
caso, los resultados se expresan como positivos, negativos
o ambiguos para cada muestra; asimismo, debe generar una
curva estndar a partir de los controles y aplicarla a las lecturas de la muestra; esta vez los resultados para las muestras
se expresan como unidades/ml.
El programa tambin constata que los calibradores y los
estndares del fabricante incluidos en el examen se hallen
en los lmites permitidos y que no hay indicadores de cualquier discrepancia. Si los calibradores tienen valores aceptables, los valores estndar almacenados se aplican a la
DO de las muestras para el examen de la prueba. Despus
de la validacin de los resultados que presenta el tcnico
experimentado, stos se transfieren de manera automtica
a la hoja de trabajo. sta se puede imprimir para almacenar
la copia dura, que contiene toda la informacin necesaria
para rastrear los detalles de la prueba si se descubre ms
adelante cualquier problema. Estos pormenores incluyen la
placa del anlisis y los reactivos relacionados, tipo, nmero
de lote, fecha de caducidad de la placa y reactivos, fecha de
la prueba, solicitante de la hoja de trabajo, operador del
mtodo y verificador de los resultados. A partir de la hoja
de trabajo, los resultados se transfieren por medios electrnicos a los registros individuales de los pacientes en la base
de datos del laboratorio.
El programa tambin verifica el control de calidad interno exigido (sistema de control del proceso) en la prueba
mediante lo siguiente: a) anotacin de los 20 promedios
registrados para las muestras de control y marcacin de
cualquier resultado discrepante y b) proyeccin de las grficas de Shewhart (Costongs et al., 1995) con los nuevos
resultados del control. A continuacin se aplican las reglas
de Westgard seleccionadas para verificar que la prueba es
vlida y puede proporcionarse. Cualquier resultado fuera
de los lmites de estos criterios activa a los indicadores para
realizar una accin inmediata.
En la evaluacin microbiolgica realizada en los laboratorios de comprobacin de los NBS Centres puede revisarse un
modelo en el cual este procesamiento automatizado y el control de proceso alcanzan un valor muy alto de aseguramiento de la calidad. Estos 10 centros procesan un total aproximado
de 10 000 donaciones por da en la evaluacin automatizada
para HBsAg, anti-HCV y anti-HIV. Todos los reactivos de
la prueba deben vigilar la adicin de la muestra, con una revisin positiva en cada adicin del reactivo como ideal. El
ndice de error del proceso es menor de 0.1%. Los resultados
de la determinacin se emiten directamente en el sistema IT
nacional alrededor de las 2 pm un da despus de la coleccin,
para la publicacin de los componentes producidos de la donacin de sangre. Estos laboratorios se ajustan a la General
Manufacturing Practice y se revisan con regularidad.
Debe automatizarse el laboratorio?

Las consideraciones anteriores describen la operacin de un
sistema automatizado dentro del laboratorio. Antes de ello
debe tomarse la decisin de adoptar un sistema automatizado para la prueba de IEE. El trabajo preparatorio para alcanzar esta decisin es considerable e incluye varios pasos
analticos. Tambin supone cambios relevantes en los patrones de trabajo del laboratorio y el personal debe intervenir
en el desarrollo de este proyecto para adquirir nuevas formas de trabajo. La prxima seccin describe algunos de los
factores importantes que deben tomarse en cuenta durante
este proceso de revisin.
Anlisis del laboratorio actual
Esto incluye pormenorizar la gama de virus, tipos y cantidad de pruebas que realiza el laboratorio y revisar los
tiempos de respuesta reales de los resultados requeridos
por la suscripcin de un contratado. Hay lugar para que la
adopcin del sistema satisfaga las demandas clnicas con
resultados ms oportunos?, la comprobacin por acceso
aleatorio es una opcin realista para una pequea cantidad de cualquier prueba que se realiza por lote para una o
dos pruebas a la semana? Si se identifican los volmenes
grandes de algunos anlisis de evaluacin, se basan estas
pruebas en IEE y, si no es as, puede ajustarse la prueba
con xito a IEE sin prdida de la calidad y quizs con meComprobacin antgeno/anticuerpo
Sistema basado en IEE

NO
Es posible adoptar las pruebas IEE?

AUTOMATIZAR
NO
Cmo puede hacerse?
Figura 21-1 Diagrama de flujo de la automatizacin.
jor sensibilidad y especificidad (fig. 21-1)? Debe decidirse

cmo tratar por lotes las pruebas de evaluacin regulares
para una o dos pruebas al da (unas 30 pruebas es habitualmente el nmero mnimo por lote por razones econmicas); se necesita un procesamiento diario?, se trata de un
servicio que proporciona el resultado el mismo da? Hay
que definir tambin los requerimientos para una comprobacin externa urgente o en la guardia y calcular cuntas
pruebas pueden incluirse en un procesamiento normal sin
que se retrase demasiado el resultado (fig. 21-2).
211
DEBE AUTOMATIZARSE EL LABORATORIO?
Usa en la actualidad el equipo para lquidos en otras pruebas o produce alcuotas sricas?
NO
Cuntas pruebas de IEE o placas se procesan/da?
<9 placas
Usa microplacas
basadas en lote
>9 placas
Usa procesador de acceso
abierto basado en microplacas
<9 placas/<300 pruebas

Usa acceso aleatorio/sistema
por lote con microplacas
>9 placas/<300 pruebas

Usa acceso aleatorio/sistema
abierto con microplacas
Figura 21-2 Qu tipo de equipo elegir?
Qu tipo de equipo elegir?

Un laboratorio primario (laboratorio general del hospital
del distrito) que emprende una determinacin regular de una
cantidad relativamente pequea de muestras puede elegir
una mquina especializada pequea; hacer uso del analizador grande del departamento de patologa para atender
todo el espectro de pruebas infecciosas, y asegurar el costo
del equipo al procesar una prueba de diagnstico de la
mquina a usarse por acceso al azar, como los anlisis de
antibiticos.
Un laboratorio secundario (laboratorio de enseanza
hospitalaria, laboratorio grande de referencia) emprende una
amplia serie de pruebas sobre una gran cantidad de muestras: se requiere un rendimiento considerable de muestras
cada da y proporciona una amplia gama de pruebas; considera procesamientos por lote, decide cuntas pruebas por
da se necesitan (la mayor parte de los IEE se termina en un
plazo de tres horas). Esto permite dos procesamientos en el
da laborable normal y uno durante la noche. Para un sistema
de tres placas esto equivale a nueve placas/da. Los sistemas de acceso abierto completan ocho placas de la prueba
cada cinco horas.
La opcin final del equipo requiere la comparacin detallada de su funcionamiento, la mecnica, los sistemas de
calidad y del programa, y rebasa los alcances de este captulo.
Cuestiones de calidad
La transferencia a un sistema automatizado representa varias ventajas para el laboratorio. El sistema elimina subjeti-
vidad en todos los aspectos de los procedimientos usados.

Los procesamientos se concluyen en trminos de reproducibilidad y se contina el protocolo del mismo modo en
cada ocasin. Las variaciones de los protocolos ocurren
slo cuando el encargado del sistema modifica el protocolo. Esta estandarizacin mejora la reproducibilidad de los
mtodos, a juzgar por los CV de los estndares (Westgard
et al., 1981). El sistema automatizado asegura la identidad
positiva de la muestra a lo largo de la prueba y permite que
el laboratorio se adecue a los estndares ya exigidos de los
laboratorios NBS. Esta seguridad de la identidad reside en
la codificacin con barras de todas las muestras y las placas
IEE a lo largo del sistema. La vigilancia de las adiciones
lquidas y las fases de lavado confirma que todos los pasos del protocolo se realizaron con xito. Esto permite la
identificacin del punto crtico en el sistema en caso de
que un procesamiento de la prueba no logre la validacin
por control de calidad. La transferencia automatizada de la
hoja de trabajo del programa de diagnstico de laboratorio
al programa del sistema automatizado y el retorno de los
resultados validados directamente a la base de datos del
paciente elimina los errores de transcripcin de raz. Los
tiempos de regreso para la comprobacin tal vez se reducen
con los resultados producidos en un periodo que es efectivo
para la atencin del paciente.
Consideraciones financieras
Las prcticas de trabajo adoptadas en fecha reciente permiten que los miembros del personal procesen cantidades crecientes de pruebas. Esto conduce a la generacin de mayor
ingreso o al desahogo de la carga de trabajo original con
212
CAP. 21
menos personal; asimismo, si el nmero de clnicos no cambia, entonces se puede efectuar el nuevo trabajo adicional
conducido por los requerimientos del cliente. El aumento
de la cantidad de pruebas distribuye los costos del personal
sobre una gran cantidad de muestras y ayuda a reducir los
costos directos por prueba. A mayor nmero de pruebas terminadas en el sistema automatizado, menores gastos indirectos por prueba por la depreciacin de capital del sistema
y las cargas anuales del mantenimiento. Debe tomarse la
eleccin entre la compra absoluta en lugar del alquiler con
opcin a compra o la renta del reactivo y depende en buena
medida del tipo de equipo requerido y la posicin financiera
del laboratorio en ese momento. Si se decide usar un sistema especfico del fabricante, el recargo que se paga debe
calcularse con base en el costo de los IEE de rutina para la
misma prueba. Si se requiere el equipo de acceso aleatorio,
debe estimarse el nmero previsto de muestras que requiere
este tratamiento urgente y una prueba de determinacin comn real identificada que pueda procesarse en este equipo
para calcular los costos, como en el caso de los antibiticos
en un AXSYM.
Mejorar la competitividad del laboratorio

La adquisicin de un sistema automatizado en el laboratorio
permite la confirmacin del papel del laboratorio dentro del
departamento de patologa. Debe ser posible convertirlo en
la instalacin central para el suministro de la comprobacin
basada en IEE dentro de la patologa y cubrir un amplio espectro de comprobaciones para la virologa, bacteriologa,
inmunologa y bioqumica. Debe conseguirse una mejora
notoria en algunos tiempos de respuesta de los resultados.
El laboratorio puede realizar bien la funcin de encargarse
del trabajo de evaluacin para los nuevos desarrollos de la
prueba y las investigaciones de campo antes de que el producto llegue al mercado. El laboratorio almacena grandes
cantidades de muestras para todas las pruebas de rutina y
puede ofrecer la comprobacin reproducible, despus de la
instalacin de los protocolos financiados por la compaa
comercial.
Otros desarrollos de la automatizacin

Este captulo describe la automatizacin del IEE del anticuerpo y el antgeno para la cual se dispone en la actualidad de
una opcin amplia de equipo. La prxima rea de comprobacin que se automatice ser la del anlisis de la amplificacin
del cido nucleico y, de manera especfica, la prueba de la
PCR. Esto ya es posible al usar los sistemas automatizados
que procesan de manera automtica lotes de amplificaciones y las detecciones de la PCR. En el prximo ao o dos
se anticipa que la extraccin de cidos nucleicos a partir de
las muestras relativamente limpias, como suero y plasma, se
automatizar, lo cual supone la creacin de un sistema por
completo automatizado, desde la muestra hasta el resultado.
Conclusiones
La automatizacin es la nica solucin para darle rentabilidad a un laboratorio. Los gastos del laboratorio se abaten
cada vez ms, desde las reducciones de costos esperadas
ao con ao en contratos hasta las demandas cada vez
mayores de ms procesamientos y una gama creciente de
nuevas pruebas. Es esencial desprenderse de la vieja tecnologa. Estn disponibles nuevos sistemas y el laboratorio
ha experimentado modificaciones para darle mejor uso a
sus sistemas. Esto exige conseguir la confianza del personal para llevar a cabo estos cambios. Es necesario ver los
beneficios de la implementacin de nuevos sistemas y la
aparicin de reas de trabajo del todo nuevas, como la carga vrica, que se acrecienta de modo continuo a una tasa sin
precedente. Para hacer frente a estos cambios importantes
es esencial invertir en el personal, sea en capacitacin o
aprendizaje de nuevas capacidades.
Costongs GM, van Oers RJ, Leerkes B, Janson PC. Evaluation of
the DPC IMMULITE random access immunoassayanalyser.
Eur J Clin Chem and Clin Biochem 1995; 33, 887-892.
Westgard JO, Hunt MR, Groth T. A multi-Shewhart chart for
quality control in clinical chemistry. Clin Chem 1981; 27(1):
493-501.
22
Tcnicas moleculares en virologa
Paul E Klapper
Introduccin
Las tcnicas biolgicas moleculares saturan la virologa.
Su aplicacin en el descubrimiento de frmacos antivricos
ha contribuido al diseo racional de los medicamentos y
mejorado de forma radical el ritmo del descubrimiento y la
aplicacin de compuestos antivricos; tales pruebas promovieron el desarrollo de vacunas antivricas y aumentaron la
gama de vacunas disponibles para su aplicacin; adems,
revolucionaron la virologa clnica y no han dejado de hacerlo. La aplicacin de estos procedimientos permiti el
descubrimiento de muchos de los virus patgenos humanos de reciente descripcin (cuadro 22-1) y acort de forma notable el periodo desde el reconocimiento inicial de
un agente causal hasta la caracterizacin completa, el desarrollo de la prueba diagnstica y la produccin de pruebas
serolgicas confiables de la infeccin (p. ej., el sndrome
respiratorio agudo grave consecutivo al coronavirus originado en la provincia de Guandong, Repblica Popular de
China, en noviembre de 2002). No slo los procedimientos
de diagnstico molecular figuran entre los principales mtodos actuales para el diagnstico de la infeccin vrica,
sino tambin tienen un papel cada vez ms importante en el
control cotidiano de la terapia antivrica de los pacientes.
co el cido nucleico presente en una muestra se amplifica

directamente a un grado en el que puede detectarse con
facilidad. En la TAAN de la sonda la accin para vincular una secuencia especfica de la sonda de cido nucleico
conduce a la amplificacin y el reconocimiento subsiguiente de la sonda. En la TAAN de la seal la vinculacin
inicial a una molcula blanco genera una seal que por s
misma se amplifica a un grado en que la seal puede identificarse con facilidad. La distincin entre las tcnicas se
anula a menudo porque los procedimientos de amplificacin del blanco incluyen con frecuencia un elemento de
la amplificacin de la seal o la sonda, o ambas.
Varios mtodos disponibles en el comercio son tiles
para emplearse bajo estos formatos, basados en principios
diferentes y pasos tcnicos distintos. Sin embargo, los productos comerciales estn slo disponibles para una cantidad
limitada de virus patgenos y, en consecuencia, la mayor
parte de los laboratorios clnicos utiliza una combinacin de
pruebas disponibles en el comercio y sus propios mtodos
de prueba internos (es decir, elaborados en los propios laboratorios); estos ltimos se basan casi de manera exclusiva en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
Amplificacin del blanco
Tcnicas de amplificacin del cido nucleico
Las tcnicas de amplificacin del cido nucleico (TAAN)

son el soporte principal de las tcnicas empleadas en un
laboratorio clnico moderno de virologa. Las tcnicas pueden clasificarse como procedimientos de amplificacin del
blanco, la sonda o la seal. En la TAAN del blan-
Debido a su flexibilidad y facilidad de uso, la primera que

se estudia de las TAAN, la PCR, es tambin la tcnica ms
empleada. Este procedimiento implica el uso de dos molculas sintticas oligonucletidas, cada una de las cuales
hibridiza a una cadena del DNA blanco de doble cadena
214
CAP. 22
TCNICAS MOLECULARES EN VIROLOGA
Cuadro 22-1 Lista representativa de virus patgenos humanos recientes caracterizados mediante tcnicas biolgicas moleculares
Virus
Enfermedad relacionada
Tcnica de su descubrimiento
Virus de la hepatitis E
Hepatitis infecciosa
Virus de la hepatitis C
Hepatitis relacionada con la transfusin
Virus sin nombre

Virus del herpes humano 8
Virus GBV a-c
Virus TTV
Virus Nipah
Sndrome pulmonar por hantavirus

Sarcoma de Kaposi, enfermedad de Castlemaine
Encefalitis y neumona
Metaneumovirus
Enfermedad respiratoria
Virus SEN
Sndrome respiratorio agudo

grave (coronavirus)
Enfermedad respiratoria aguda grave
Transcripcin inversa
PCR con cebadores aleatorios +
experimentos de transmisin animal
PCR con cebadores aleatorios para
producir genotecas del cDNA
Acuerdo general de PCR basado en la secuencia
Anlisis de diferencia representacional
PCR con cebadores aleatorios
(dsDNA). Estas molculas oligonucletidas se disean de

modo cuidadoso para unirse a una regin blanco especfica
dentro del cido nucleico del virus que se amplifica y atraviesan una regin definida dentro de ese cido nucleico.
La hibridacin del oligonucletido con el DNA acta
como un cebador (iniciador) para una enzima polimerasa
del DNA (casi siempre una enzima termoestable derivada originalmente de la bacteria termfila Thermus aquaticus, conocida como polimerasa Taq). La enzima crea
una cadena complementaria de DNA al agregar desoxinucletidos de forma secuencial. Para iniciar este proceso, el
dsDNA blanco se calienta a una temperatura superior a
90C. A esta temperatura las cadenas del DNA se separan.

La mezcla de reaccin se enfra entonces a una temperatura
de 50 a 70C y las molculas del cebador de oligonucletido sinttico se unen a cada una de las cadenas del DNA.
La temperatura se eleva un poco, 72 a 76C, la cifra ptima
para que la polimerasa Taq efecte la extensin de la cadena complementaria del DNA. Al repetir el ciclado de la
temperatura unos 30 ciclos o ms repetitivos se producen
millones de copias de la secuencia original del blanco. El
lmite del cambio de la temperatura y magnitud del tiempo
los controla un ciclador trmico programable (fig. 22-1).
Al trmino de la amplificacin, la mezcla de reaccin se
Figura 22-1 Termociclador programable. Un termociclador programable tpico, junto con un perfil de temperaturas idealizado de un
solo ciclo PCR. D, desnaturalizacin; A, hibridacin de cebadores; E, extensin del DNA. El instrumento programable automatiza esa
extensin, el calentamiento y los ciclos de enfriamiento de la tcnica PCR.
TCNICAS DE AMPLIFICACIN DEL CIDO NUCLEICO
Figura 22-2 Electroforesis en gel de poliacrilamida con tincin de bromuro de etidio. Representacin de los productos de
PCR separados sobre geles de poliacrilamida al 8%. El ejemplo
mostrado es de un mtodo para tipificar adenovirus por digestin
con una enzima de restriccin de los productos de PCR. El bromuro de etidio se intercala con el DNA de doble cadena y se
revela por la transiluminacin de la luz ultravioleta en el gel. M,
escala del peso molecular usada para calibrar el tamao de los
productos de PCR.
analiza para determinar si tuvo lugar la amplificacin especfica. El mtodo convencional consiste en someter a
electroforesis la mezcla de reaccin en geles de agarosa
o poliacrilamida en presencia de bromuro de etidio. Este
ltimo se intercala con la dsDNA y, cuando se expone a la
luz ultravioleta, emite luz fluorescente para revelar el cido
nucleico (fig. 22-2). Puede utilizarse la tcnica Southern
blotting para confirmar la especificidad del producto de la
reaccin de la prueba. En la prueba Southern blotting un
oligonucletido marcado designado para unirse a la regin
intercebadora del producto de reaccin del cido nucleico
se deja hibridar con el producto separado de forma electrofortica y su vinculacin se revela mediante autorradiografa. Un mtodo de deteccin menos laborioso que la
hibridacin consiste en desnaturalizar el DNA amplificado
y capturar el DNA de una sola cadena sobre una fase slida
(por lo regular una placa de microtitulacin de poliestireno) mediante avidina o biotina incorporadas dentro de uno
de los cebadores del oligonucletido. Un oligonucletido
marcado se deja unir al amplicn del DNA capturado y su
nexo se revela en una reaccin que incluye conversin catalizada de manera enzimtica de un sustrato cromgeno.
Con la finalidad de detectar virus RNA es necesaria una
reaccin inicial para producir una copia de DNA (cDNA)
de la plantilla o molde del RNA. Esto se logra con el uso de
la transcripcin inversa, que se realiza mediante la adicin
de una enzima transcriptasa inversa separada o enzimas con
capacidad de transcripcin inversa termoestable y actividad
de polimerasa del DNA.
215
Es posible una amplia variedad de modificaciones del

procedimiento PCR bsico, incluida la PCR anidada, que
supone el uso de cuatro oligonucletidos del cebador en dos
reacciones separadas. Los productos de una primera ronda
de amplificacin PCR se reamplifican en una segunda ronda de amplificacin trmica, mediante un segundo grupo de
oligonucletidos del cebador interno para el grupo utilizado en la primera ronda de la amplificacin trmica.
La opcin de la metodologa depende de los requerimientos de sensibilidad y especificidad, adems de las
circunstancias prcticas bajo las cuales debe realizarse la
PCR. Es necesario tener una gran capacidad tcnica, junto
con instalaciones y equipo especializados, para todos los
procedimientos PCR, pero la PCR anidada exige reas especializadas adicionales debido a la necesidad de separar
fsicamente los procedimientos de la primera y segunda
rondas para prevenir la adherencia del remanente del DNA
amplificado (amplicones) de la amplificacin de la primera ronda a la de la segunda, lo que arrojara resultados
falsos positivos de la prueba.
Para mejorar la utilidad de la PCR en el marco clnico
del laboratorio de virologa se han desarrollado PCR capaces de detectar cidos nucleicos blanco vricos mltiples.
De manera caracterstica, estas tcnicas PCR multiplex
incorporan varios pares de oligonucletidos cebadores
dentro de una sola reaccin. Es posible la amplificacin de
cualesquiera de los cidos nucleicos blancos, con las mismas condiciones trmicas del ciclo completo y la misma
composicin de la mezcla de reaccin.
La mayor parte de los mtodos PCR en uso actual proporciona slo respuestas cualitativas (s/no). La determinacin de la cantidad de virus presente en una muestra,
llamada cuantificacin vrica o vigilancia de la carga
vrica, es cada vez ms importante en la evaluacin del
efecto de la quimioterapia antivrica y en la vigilancia de
la progresin de la enfermedad. Por ejemplo, la vigilancia
de la sangre de los receptores del trasplante de mdula sea
para el DNA de citomegalovirus (CMV) permite suministrar la terapia anticipada con el frmaco antivrico ganciclovir para prevenir el desarrollo de la enfermedad por
CMV. La terapia antivrica se instituye casi siempre cuando se detecta un aumento notable de los valores sanguneos
del DNA del CMV. La dilucin seriada de una muestra en
paralelo con un estndar que contiene cantidades elevadas
conocidas de cido nucleico vrico puede proporcionar la
cuantificacin cruda, pero est sujeta al error por la amplificacin diferenciada de las dos muestras, lo cual suministra comparaciones entre una prueba y otra de difcil
cuantificacin. Una cuantificacin ms exacta se consigue
por la coamplificacin competitiva de un cido nucleico de
control interno de concentracin conocida, junto con el cido nucleico de la muestra de concentracin desconocida; la
216
CAP. 22
Figura 22-3 Disposicin interna del instrumento Cobas

Amplicor de Roche Diagnostics. El ciclo trmico y la deteccin del producto por un sistema de ensayo basado en
micropartculas ligadas de manera enzimtica estn automatizados en este instrumento.
molcula del control interno que se designa amplifica con

igual eficacia al blanco de la muestra. El mtodo constituye
la base de los mtodos comerciales eficientes para los virus
de las hepatitis B y C, el virus de inmunodeficiencia humana (HIV) y el citomegalovirus. En el ltimo sistema, un
alto grado de automatizacin del ensayo y la deteccin del
producto reducen de modo adicional la variabilidad entre
las pruebas (fig. 22-3).
PCR en tiempo real
La PCR cintica o en tiempo real es un mtodo que sustituye cada vez ms a la PCR convencional. Esto es posible
por el marcado de los cebadores, las sondas o el amplicn
con molculas fluorgenas. Cuando un producto especfico
se acumula, la fluorescencia incrementada emitida a partir de la reaccin revela la acumulacin. En contraste con
la PCR convencional, no es necesaria la deteccin de la
amplificacin posterior del producto a travs de la manipulacin de la mezcla de reaccin. El producto se identifica
dentro de un tubo de muestreo cerrado. La posibilidad de
contaminacin cruzada derivada del amplicn de las pruebas se reduce as en gran proporcin y, dado que la acumulacin del cido nucleico amplificado se reconoce mientras
sucede, la prueba se termina en menos tiempo. Adems, los
lmites de concentraciones sobre los cuales es posible la
cuantificacin exacta del producto son mucho ms grandes

respecto de los que pueden alcanzarse en formatos PCR
competitivos ms convencionales.
Varios mtodos estn disponibles para lograr la deteccin de la fluorescencia en PCR en tiempo real. En su modo
ms simple, los compuestos como bromuro de etidio o el
verde 1 SYBR se aaden a la mezcla de reaccin. stos se
unen al dsDNA y despiden luz fluorescente cuando se excitan con luz de una longitud de onda apropiada. Esta aproximacin no es ideal dado que la formacin de artefactos por
los dmeros cebador-cebador y la amplificacin inespecfica
del DNA que no es blanco y es irrelevante pueden emitir
seales fluorescentes falsas positivas. Este problema puede
tratarse si se calienta el producto final y se mide la temperatura de disociacin de los productos. Los dmeros cebadores
se disocian a una temperatura ms baja que la empleada
para el producto PCR especfico.
La especificidad de la PCR en tiempo real se mejora
muchas veces mediante el marcado de sondas de oligonucletido con una sonda fluorescente. En realidad, se tiene
acceso a una variedad de mtodos de marcado y deteccin
de la sonda. Dos de los ms difundidos son la sonda hbrida o los mtodos de sondeo con endonucleasa 5 (tambin
conocidos como Taqman). La hibridacin de las sondas
requiere dos oligonucletidos de la sonda; uno se marca con
un fluorforo donador 3 y el segundo con un fluorforo receptor conveniente. Los oligonucletidos se unen al cido
217
Figura 22-4 PCR en tiempo real. a) Sondas de hibridacin. Los oligonucletidos se unen al DNA blanco adyacente; cuando se excitan
por luz de una longitud de onda conveniente, el fluorforo donador (D) transfiere energa mediante resonancia fluorescente al fluorforo
receptor (A), que emite luz fluorescente. b) Sondas Taqman. Cuando la polimerasa Taq de DNA extiende la cadena del DNA, encuentra
la sonda de hibridacin unida al DNA de la plantilla. La actividad de la endonucleasa 5-3 de Taq desplaza y degrada a los oligonucletidos, con lo cual libera al fluorforo indicador (R) a partir del oligonucletido y lo separa por consiguiente del fluorforo extintor (Q) de
manera que el indicador despide luz fluorescente.
nucleico blanco adyacente a otro y, cuando el fluorforo se

activa por la luz a una longitud de onda conveniente, libera
luz fluorescente y, por un proceso conocido como transferencia de energa de resonancia fluorescente, transfiere energa al fluorforo receptor 5 adyacente, que entonces emite
la luz a una diferente longitud de onda (fig. 22-4). La deteccin de esta emisin seala la vinculacin especfica de las
sondas adyacentes del oligonucletido a su cido nucleico
blanco. Una alternativa para el uso de estas sondas duales
es la utilizacin de un solo oligonucletido y la capacidad de
la polimerasa Taq para actuar como endonucleasa 5-3. Un
fluorforo se une al extremo 5 de un oligonucletido de la
sonda y un segundo fluorforo se agrega al extremo 3 del
oligonucletido de la sonda. Bajo circunstancias normales,
la excitacin de un fluorforo conduce a la transferencia de
energa de resonancia fluorescente al otro fluorforo. Esto
lleva a la emisin de la luz de una diferente longitud de
onda, que no suele reconocerse. Se dice que la fluorescencia
se extingue. Cuando el oligonucletido se hibridiza con su
cido nucleico blanco, los fluorforos se liberan por hidrlisis y la fluorescencia ya no se extingue ms (fig. 22-4).
Existen numerosas alternativas para lo anterior, incluidas
las sondas de un pptido del cido nucleico (sondas Luzup), sondas del oligonucletido horquilla (faros moleculares) y amplicones autofluorescentes (p. ej., cebadores
Sunrise o Scorpion).
En la actualidad existe una extensa variedad de instrumentos para usar la PCR en tiempo real. Uno de los ms rpidos
de stos es el Lightcycler (fig. 22-5). Un capilar de cristal
asentado en plstico se utiliza como el recipiente de la reac-
cin. El capilar permite calentamientos y enfriamientos muy

rpidos de los reactantes y tambin posibilita la deteccin directa de fluorescencia dentro del recipiente de la reaccin. El
calentamiento y el enfriamiento se alcanzan con un elemento
trmico y un ventilador. Los capilares se rotan delante de un
diodo que emite un lser azul y la fluorescencia intracapilar
se vigila a travs de tres diodos de fotodeteccin, cada uno
con filtros de longitud de onda diferentes para la activacin.
El calentamiento y el enfriamiento rpidos alcanzados en este
sistema (20C/seg) significan que un perfil del ciclo trmico
tpico de 40 ciclos puede completarse en 20 minutos.
Automatizacin y PCR
El alto nivel de capacidad tcnica requerido para realizar la
PCR convencional se ha resuelto en cierto grado con la creciente disponibilidad de productos comerciales de la prueba.
Un obstculo importante que causa retrasos es la necesidad
de mtodos confiables de alto rendimiento para la extraccin de cidos nucleicos. Los recientes progresos en robtica y la estandarizacin de los reactivos han conducido al
desarrollo de varias plataformas capaces de automatizar la
preparacin de la muestra y la disposicin del mtodo. Estos
procedimientos reducen la exigencia tcnica requerida para
realizar la PCR, mejoran la reproducibilidad de la prueba
y promueven la comprobacin de alto rendimiento, con lo
cual es posible introducir la comprobacin NAAT para un
espectro ms amplio de laboratorios clnicos y una gama
ms extensa de virus patgenos.
218
CAP. 22
Figura 22-5 El instrumento Lightcycler. Diagrama de la estructura interna del aparato. Reproducido con autorizacin de www.lightcycler-online.com.
Amplificacin mediada
por transcripcin
Amplificacin basada en la secuencia

del cido nucleico
Se han desarrollado varios mtodos alternativos para la

amplificacin del blanco; la amplificacin mediada por
transcripcin (AMT) es un ejemplo. Despus de una tcnica de extraccin propietaria para liberar y estabilizar el
cido nucleico a partir del virin, la muestra de la prueba
se calienta brevemente a 95C para desnaturalizar el cido
nucleico blanco. Para amplificar el cido nucleico, un oligonucletido se une al blanco de manera especfica, al cual
se adhiere una secuencia impulsora para la polimerasa de
RNA. Si el cido nucleico blanco es el RNA, en una reaccin isotrmica, una enzima transcriptasa inversa (TI) crea
una copia de DNA de la plantilla del RNA por extensin a
partir del extremo 3 del cebador-promotor. El RNA en el
dplex RNA-DNA se degrada entonces por la accin de la
RNAasa de la transcriptasa inversa. Un segundo oligonucletido se une al cDNA copiado y una nueva cadena del
DNA se sintetiza por TI. El dplex de DNA con el promotor del RNA adherido acta como plantilla para la transcripcin por la polimerasa del RNA. Las copias del RNA
recin sintetizadas tambin actan como plantillas nuevas
que vuelven a entrar al proceso AMT, lo que produce una
nueva ronda de la rplica, que conduce a un aumento exponencial de los amplicones de RNA. La adicin de una sonda
del DNA marcado con ster de acridinio, que une de modo
especfico a los amplicones del RNA blanco, permite, despus de la desnaturalizacin qumica de la sonda separada,
la deteccin del producto con quimioluminiscencia.
La amplificacin basada en la secuencia del cido nucleico

(ABSAN) es en apariencia muy similar a la AMT; empero,
mientras que la AMT utiliza dos enzimas en una amplificacin isotrmica, la ABSAN usa tres. Despus de la extraccin del cido nucleico con un mtodo propietario para
la extraccin del cido nucleico basado en slice, un cebador del oligonucletido con un promotor de la polimerasa
de T7 RNA adherido se ampla por la accin de la TI, que
acta en una direccin 3 a 5. Una enzima RNAasa degrada
entonces la cadena del RNA y un segundo cebador se une
a la molcula del cDNA y la TI produce la molcula de
DNA de doble cadena (en repeticiones recientes de la tcnica se ha utilizado una enzima que combina la actividad
de la polimerasa de DNA en la transcripcin inversa y la
RNAasa de la misma forma que en la tcnica AMT).
La polimerasa T7 produce luego transcripciones del RNA a
partir del DNA de doble cadena y acta como plantilla adicional para el procedimiento de ABSAN. La deteccin de
amplicones se logra por hibridacin con un oligonucletido
ligado a perlas paramagnticas revestidas de estreptavidina
y una sonda marcada con rutenio. Las perlas paramagnticas que lleva el complejo hbrido amplicn-sonda se capturan en la superficie de un electrodo por medio de un imn.
El voltaje aplicado a este electrodo desencadena una reaccin electroquimioluminiscente. Se han descrito mtodos
para una amplia gama de blancos y un desarrollo reciente es el uso de faros moleculares en esta tecnologa que
permite la deteccin y la cuantificacin en tiempo real

del RNA del HIV.
Amplificacin por desplazamiento de la cadena
La amplificacin por desplazamiento de la cadena es un
comparativo recin llegado al campo de la amplificacin
del cido nucleico, pero ha ganado una amplia aceptacin.
Dicho mtodo se basa en la capacidad de las polimerasas
de DNA para iniciar la sntesis del DNA mediante un corte
a una sola cadena dentro de una molcula blanco de DNA
de doble cadena. Despus de la extraccin y la desnaturalizacin de la molcula de DNA blanco, un oligonucletido
cebador que contiene una secuencia especfica del blanco y
una secuencia que posee un sitio que reconoce una enzima
de restriccin (casi siempre BsopI) se unen a la molcula
blanco de DNA de una cadena. Una enzima polimerasa de
DNA copia entonces la molcula de DNA. Sin embargo,
los trifosfatos de desoxinucletido (dNTP) usados para
este alargamiento se modifican mediante la sustitucin del
tiol alfa. Cuando una enzima de restriccin se aade a la
reaccin, sta intenta cortar el DNA en el sitio de reconocimiento BsopI, pero puede cortar slo una de las cadenas
del DNA porque la cadena recin sintetizada contiene el
dCTP sustituido por tiol alfa, que la enzima de restriccin
no puede seccionar. La cadena recin sintetizada del DNA
se desplaza y el dplex cebador-DNA puede actuar como
iniciador para una ronda nueva del copiado conducido por
la polimerasa de DNA. Las copias liberadas pueden servir
como plantilla adicional para la reaccin. La acumulacin
del producto puede detectarse por quimioluminiscencia.
Amplificacin de la seal
219
microcelda. Se permite que un grupo de sondas blanco hibridice al RNA vrico y las sondas del preamplificador. Las
sondas de captura, que comprenden a 17 extensores individuales de captura, y las sondas blanco, que incluyen a 81
extensores individuales blanco, unen a las diversas regiones
del gen pol del RNA vrico. La sonda del amplificador hibridiza al preamplificador y forma un complejo DNA ramificado (bDNA). Las copias mltiples de una sonda marcada con
fosfatasa alcalina (AP) se hibridan a este complejo inmovilizado. La deteccin se logra tras incubar el complejo con un
sustrato quimioluminiscente. La emisin de luz se relaciona
directamente con la cantidad de RNA del HIV-1 presente en
cada muestra y un analizador del luminmetro registra los
resultados como unidades de luz relativas (RLU). Una curva
estndar se define por la emisin de luz a partir de los estndares que contienen concentraciones conocidas del virus.
Las concentraciones de RNA del HIV-1 en las muestras se
determinan a partir de esta curva estndar.
Captura hbrida
Otra amplificacin de la seal disponible en el comercio
ofrece una sensibilidad ms limitada que el mtodo bDNA.
El mtodo de captura hbrida implica la suspensin de la
muestra para liberar el DNA blanco. Despus, el DNA se
combina con las sondas especficas del RNA en la solucin
y los hbridos DNA-RNA se capturan sobre una placa de
microtitulacin o un tubo de reaccin mediante anticuerpos
monoclonales especficos para los hbridos DNA-RNA.
Los hbridos capturados se detectan con el uso de los anticuerpos mltiples conjugados con fosfatasa alcalina. La
fosfatasa alcalina ligada se identifica mediante una reaccin quimioluminiscente con un sustrato del dioxetano.
DNA de cadena ramificada
Amplificacin de la sonda
Un ejemplo de un mtodo de amplificacin de la seal

para la deteccin y la cuantificacin del cido nucleico se
encuentra en el mtodo con cadenas ramificadas de DNA
(bDNA) disponible en el comercio. Se hallan en el mercado
tres productos para identificar y cuantificar el DNA del virus
de la hepatitis B, el RNA del virus de la hepatitis C y el RNA
del virus de inmunodeficiencia humana. El mtodo usado
para la deteccin del RNA del HIV es un procedimiento de
hibridacin del cido nucleico emparedado para la cuantificacin directa del RNA del HIV-1 en plasma humano. El
HIV-1 se concentra primero en el plasma por centrifugacin.
A continuacin se utiliza un procedimiento de extraccin
propietaria del cido nucleico para liberar el RNA a partir
de los viriones. Un conjunto de sondas especficas que capturan el oligonucletido sinttico atrapan el RNA en una
Reaccin en cadena de la ligasa

La reaccin en cadena de la ligasa (LCR) supone la unin de
dos secuencias complementarias del oligonucletido de la
sonda a un DNA blanco (despus de la extraccin del cido
nucleico a partir del virin y la desnaturalizacin del DNA).
Una enzima ligasa de DNA se utiliza para unir los dos pares
de sondas complementarias despus que hibridan a la molcula blanco. La reaccin se calienta para separar las cadenas del DNA y las dos secuencias de una cadena de DNA
forman las plantillas para la unin de la sonda adicional. El
mtodo acusa ciertas limitantes por la alta anexin debido al
enlazamiento del extremo cohesivo de los dplex de la sonda
y las condiciones de la hibridacin deben ser rigurosas para
reducir la unin inespecfica de la sonda. Sin embargo, la
220
CAP. 22
tcnica encontr aplicacin comercial en los mtodos para

Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, las micobacterias y Borrelia spp. No obstante, en fecha reciente los
proveedores comerciales de esta tecnologa parecen abandonar el procedimiento en favor de una tcnica PCR para la
deteccin de blancos microbianos.
Anlisis de la secuencia
La determinacin de la secuencia del cido nucleico de
un virus tiene aplicacin prctica importante en la virologa clnica. Mientras que el uso del aislamiento del cultivo
celular del virus ha declinado en favor de mtodos ms
rpidos de identificacin del mismo (como la deteccin
directa de antgenos o cidos nucleicos vricos), se observa una reduccin de la cantidad de informacin epidemiolgica referente a cepas de virus circulantes. Para tratar
este problema se introdujeron los mtodos genmicos de
rastreo epidemiolgico. La informacin epidemiolgica
es de importancia en el control del paciente individual, en
medidas para prevenir o contener la extensin de la infeccin, en el rastreo del contacto y en el diseo de vacunas y
antivricos para prevenir o tratar la infeccin. En contraste
con los esquemas tipificantes epidemiolgicos basados en
caractersticas biolgicas como la capacidad para hemaglutinar ciertos tipos de clulas rojas o en la tipificacin
serolgica sustentada en la capacidad de los antisueros
aislados para unir y neutralizar la infectividad de la contagiosidad vrica el anlisis genmico proporciona casi
siempre una clasificacin biolgica ms exacta.
En el proceso de identificacin de un virus desconocido,
los datos de la secuencia, obtenidos a partir de cualquier regin del genoma vrico, se pueden comparar con todas las
secuencias vricas conocidas a travs del uso de los programas de gran alcance de la alineacin secuencial (muchos
de los cuales estn disponibles, p. ej., a travs de internet),
hallados en bases de datos internacionales de cido nucleico de acceso abierto, como las que pone a disposicin el
European Molecular Biological Laboratory o la base de
datos de Los lamos en Estados Unidos. Con los virus conocidos, las bases de datos menores estn disponibles para
las comparaciones de la secuencia. Por supuesto, no todos
los virus humanos se han secuenciado todava, pero el nmero de secuencias vricas completas aumenta ao con ao
y para muchos ms virus la informacin de secuencia parcial est disponible; esto significa que la informacin de
la secuencia se ha convertido en el mtodo de facto para la
identificacin y la clasificacin de un nuevo virus.
La informacin de la secuencia tambin juega un papel importante en el control de ciertas enfermedades; por
ejemplo, se sabe que el genotipo del virus de la hepatitis C
es un determinante importante en la respuesta a la terapia.

A los pacientes identificados como crnicos e infectados
con el virus de la hepatitis C (persistencia del RNA vrico
de la hepatitis C en plasma) se les puede ofrecer una combinacin del frmaco antivrico ribavirina y el interfern
alfa formulado con una cadena lateral de glicol de polietileno (interfern pegilado); empero, se ha encontrado que
la respuesta a la terapia de un individuo se correlaciona
notoriamente con el genotipo del virus. En consecuencia,
los individuos sometidos a tratamiento tienen el genotipo
de un virus determinado. Aquellos en quienes se determina
que portan virus de los genotipos 1 o 4 requieren terapia
antivrica prolongada para lograr la curacin.
Un uso muy importante de la tecnologa de secuenciacin se encuentra en el control de los sujetos infectados con
el HIV. En Europa, por lo menos 20% de los nuevos casos
de la infeccin con HIV implica la transmisin del virus a
partir de una persona que ya experiment la terapia con un
frmaco antivrico y es portadora de virus resistentes, por
lo menos a algunos de los frmacos antivricos usados en el
tratamiento de combinacin para el HIV. La determinacin
del patrn de resistencia al frmaco puede ser crucial para
la teraputica efectiva. El procedimiento tambin desempea una funcin vital para seleccionar una combinacin
apropiada de compuestos antivricos en quienes fracasa
la terapia antivrica. Hay dos pruebas principales para la
resistencia antirretrovrica, la que detecta resistencia genotpica y la que reconoce resistencia fenotpica.
Las pruebas genotpicas buscan la alteracin en la secuencia base de los genes del HIV que se vinculan con el
desarrollo de la resistencia al frmaco. Por ejemplo, una
mutacin especfica, M184V, en el gen de la transcriptasa
inversa confiere resistencia al nuclesido anlogo 3TC. Las
pruebas fenotpicas miden la concentracin requerida de
un frmaco para inhibir la rplica vrica por 50 o 90% (IC50
o IC90, respectivamente) y requieren el cultivo del virus o
la construccin de los virus recombinantes indicadores.
La comprobacin de la resistencia fenotpica para el
HIV se basaba (hasta finales del decenio de 1990) en los
mtodos de reduccin de la placa o los mtodos de cultivo
de clulas de monocapa de sangre perifrica (CMSP), que
exhiban distintas desventajas. Los mtodos de reduccin
de la placa del HIV requirieron el cocultivo del virus con
clulas HeLa-CD4+ y slo as se podan utilizar para la minora de los aislados clnicos que pueden inducir al sincitio
en el cultivo celular (es decir, virus que son CXCR4 trpicos). Los mtodos de cultivo de clulas de monocapa de
sangre perifrica son ms verstiles, pero requieren 10 a
14 das de cocultivo de las CMSP del paciente con CMSP
estimuladas por el mitgeno a partir de individuos seronegativos al HIV, junto con la vigilancia del crecimiento
a travs de un marcador sustituto de la infeccin, como el
ANLISIS DE LA SECUENCIA
antgeno HIV p24. Hoy en da se utiliza con regularidad

una tcnica molecular fundada en tal comprobacin. En
dos variantes de la tcnica disponibles en el comercio se
emplea una PCR de transcripcin inversa para amplificar
la proteasa, la mayor parte de las TI y una porcin de los
genes gag del HIV-1. En uno de estos mtodos el cDNA
se incorpora en un virus recombinante pol-suprimido para
crear un aislado HIV-1 recombinante por la recombinacin
homloga en cultivo celular. Este aislado recombinante
es capaz de infectar una lnea de clulas estndar y puede
usarse para medir la rplica vrica en presencia de concentraciones variables de frmacos antirretrovricos mediante
la observacin de la muerte celular inducida por el virus
recombinante. En el otro mtodo directo se usa la ligadura para combinar el cDNA producido con el vector HIV-1
pol-suprimido y prueba la construccin del recombinante
durante una sola ronda de la rplica con el mtodo del gen
indicador de la luciferasa. Ambos mtodos poseen la sensibilidad del frmaco en trminos de la concentracin micromolar del agente requerido para inhibir la rplica del HIV-1
en 50%. Aunque la comprobacin fenotpica proporciona
un mtodo ms directo de medir la resistencia, en la actualidad la duracin del tiempo necesario para realizar la
prueba (hasta varias semanas) reduce su utilidad clnica.
Los cambios fenotpicos se originan a partir de las transformaciones en el genotipo y de ese modo la comprobacin
genotpica puede proporcionar indicios sobre la resistencia
del frmaco antes de las pruebas fenotpicas. El virus extrado del plasma se transcribe de manera inversa y se efecta
una serie de PCR, diseada para permitir la amplificacin de
regiones de la proteasa vrica, la transcriptasa inversa u otras
regiones del genoma (p. ej., el gen de envoltura protenica
del gp41 del HIV-1 en los sujetos sometidos a la terapia con
frmacos inhibidores de la fusin del HIV). A continuacin
221
se secuencian los productos marcados de forma apropiada

(vase la fig. 22-6). La secuencia del cDNA se alinea con
una cepa de tipo silvestre del HIV y se compara con una
base de datos en la cual se documentan las mutaciones de
punto y las combinaciones de las mutaciones de punto correlacionadas con el desarrollo de la resistencia a combinaciones individuales o mltiples de frmacos. A las bases de
datos las mantienen los proveedores comerciales de la prueba o estn disponibles a travs de bases de datos de colaboracin internacional de acceso gratuito, como la base de datos
de la Stanford University HIV RT and Protease Database.
En el examen de los virus RNA, como el virus de la
hepatitis C o el HIV, el RNA extrado a partir del plasma
se transcribe en forma inversa y el cDNA se amplifica por
PCR. Luego se puede examinar la secuencia de varias maneras. En el mtodo InnoLipa, disponible en el comercio
para la genotipificacin de la hepatitis C, el cDNA desnaturalizado se hibrida con las tiras de nitrocelulosa a las cuales estn unidos los oligonucletidos que corresponden a
las secuencias presentes en los genotipos aislados del virus
de la hepatitis C. Uno de los cebadores del oligonucletido
usado en la PCR se marca con una molcula de biotina. El
modelo de unin del cDNA se revela por la reaccin del
cDNA inmovilizado con un complejo avidina-enzima, seguida por un sustrato cromgeno; el patrn de bandas que
aparece en la tira revela el genotipo del virus. Los mtodos de resistencia comerciales similares de la transcriptasa
inversa y la proteasa del HIV-1 emplean principios metodolgicos similares, pero en este caso las sondas del oligonucletido inmovilizadas sobre la nitrocelulosa se disean
para seleccionar mutaciones de la resistencia en los genes
de la proteasa o la TI del HIV-1.
Pese a ello, en condiciones normales, el cDNA se marca
en una PCR adicional en presencia de 2,3trifosfatos de
Figura 22-6 Secuenciacin. Un ejemplo que muestra la secuenciacin de la proteasa del HIV-1 y los genes de la TI. Las bases que se
elucionan a partir del secuenciador capilar se codifican por color (azul, citosina; negro, guanina; rojo, timina; verde, adenina), lo que
permite que la secuencia se construya y compare con la secuencia de una cepa de tipo silvestre de la secuencia HIV-1 para determinar los
cambios de base dentro de la cepa de prueba del virus que puedan vincularse con el desarrollo de la resistencia al frmaco antivrico.
222
CAP. 22
didesoxinuclesido (ddNTP). Se usa una mezcla optimizada de manera cuidadosa de los trifosfatos de desoxinucletido (dNTP) y los ddNTP, junto con los oligonucletidos
en una PCR convencional. La sntesis de la cadena nueva
se termina de modo aleatorio por la incorporacin de un
ddNTP, que se marca con un colorante especfico de la base
que ste marca. Al final de la reaccin de establecimiento de
la secuencia, el tubo donde se produce la misma posee una
mezcla de las copias parcialmente sintetizadas del DNA.
Cada una tiene un extremo 5 comn (definido por el oligonucletido cebador usado en la reaccin), pero sus longitudes son diferentes (varan por una base de longitud en el
extremo 3). La mezcla se analiza mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida y fluorometra o secuenciacin en
gel capilar automatizada de alto rendimiento (fig. 22-6). En
el ltimo mtodo, los fragmentos ms pequeos del DNA
marcado presentan la mayor movilidad y se elucionan primero a partir del capilar. Cada fragmento que se eluciona
con posterioridad del capilar es una base ms larga que
aquella que la precede. Los fragmentos separados del DNA
se revelan por excitacin con lser. Cada uno de los colorantes
unidos a una base terminal 23 emite luz en una diferente
longitud de onda que permite distinguir la base terminal individual. Los cuatro colores, y por lo tanto las bases, pueden
reconocerse con facilidad. La secuencia del fragmento se
lee en forma directa a partir del eluido capilar.
Las alternativas a este procedimiento incluyen el uso de
portaobjetos de cristal, lminas de silicn o membranas
de nylon con oligonucletidos incorporados (microchips de
DNA). Para la genotipificacin del HIV-1 se ide una serie para analizar la secuencia completa del gen de la proteasa del HIV-1 y una regin de 1 200 pares de bases del
gen de TI. El chip inclua 18 000 sondas de 18 a 22 pares
de bases y se dise para abarcar todas las combinaciones
posibles de la mutacin dentro de esta secuencia. Cada
nucletido en la secuencia por analizar requiere por lo
menos cuatro sondas del oligonucletido para determinar
si el nucletido en esa posicin es una A, T, C o G. Para
utilizar la serie, el cDNA que resulta de una TI PCR del
virus derivado del plasma se transcribe al RNA de una cadena y se marca con molculas indicadoras fluorescentes.
Despus de la hibridacin, se explora el chip mediante un
lser para activar la marca fluorescente y el modelo de la
vinculacin se revela por el examen con un microscopio
confocal. Las molculas indicadoras despiden luz fluorescente en proporcin con la astringencia con la cual se une
la sonda al cido nucleico. Las sondas que no se unen a
ningn cido nucleico no emiten luz fluorescente, mientras que las sondas unidas con un solo par de bases mal
emparejadas tienen hasta 35 veces menos fluorescencia
respecto del emparejamiento completo de la secuencia.
El enderezamiento automatizado del modelo de la unin
observada permite la vinculacin de las secuencias derivadas de sondas superpuestas para determinar la secuencia a
partir de la secuencia de tipo silvestre del RNA del HIV-1
representada en el chip. La variacin gentica del HIV representa un gran desafo para el uso de los chips de DNA.
En comparaciones con la secuenciacin didesoxinucleotdica se encontr que el chip es menos confiable en la deteccin de la mutacin y menos capaz del discernimiento de
inserciones o deleciones de la secuencia. El chip tampoco
es del todo apropiado para secuenciar cepas que no son
del subtipo B de HIV-1, el subtipo en el cual se dise el
chip. A pesar de este retroceso, las capacidades y el alto
rendimiento de los microchips de DNA condujeron a su
desarrollo comercial continuo y los chips para el anlisis
genotpico de los virus de las hepatitis B y C no estn lejos de su aparicin en el mercado. Un enfoque interesante
para el uso ms amplio de esta tecnologa es la descripcin
de una microconfiguracin del DNA de un oligonucletido
largo (70-mer) que ha demostrado ser capaz de detectar e
identificar centenares de diversos virus humanos. Mediante una PCR de transcripcin inversa aleatoria fue posible
reconocer junto con esta tecnologa virus mltiples en especmenes respiratorios sin el uso de PCR, a partir de cebadores especficos de la secuencia o degenerados.
Resumen
No han dejado de multiplicarse las aplicaciones de las tcnicas biolgicas moleculares en virologa, sobre todo en la
virologa clnica. Los mtodos moleculares de diagnstico
reemplazaron en poco tiempo a los mtodos convencionales de diagnstico, como el aislamiento en cultivo celular,
la serologa, la microscopia de fluorescencia y la microscopia electrnica. La automatizacin ha atenuado la complejidad tcnica de la comprobacin, al tiempo que mejora
reproducibilidad y confiabilidad. Su aplicacin desplaz a
la virologa clnica de una bsqueda de mero inters acadmico a una ciencia clave determinante en el diagnstico de
la fase aguda y el tratamiento de los enfermos.
Los ltimos datos sobre los patrones antirretrovricos de la resistencia (comprobacin genotpica) se pueden encontrar en: Antiviral Drug Resistance Online, www.viral-resistance.com; en
la Stanford University HIV RT and Protease Database, http://
hivdb.stanford.edu/hiv; y en la base de datos de la secuencia
del HIV de Los lamos, http://hiv-web.lanl.gov
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23
Virologa: otras pruebas
Alex WL Joss
Este captulo incluye la descripcin de las tcnicas no

descritas en las secciones anteriores; tales metodologas se
agrupan en tres reas que salen del mbito de los laboratorios de diagnstico vrico: enfermedad por prion, susceptibilidad antivrica e inmunidad mediada por clulas.
Deteccin de la enfermedad por prion

Los priones se clasifican como una entidad infecciosa independiente porque la mayora de los investigadores cree que
carecen de cualquier cido nucleico y que consisten tan slo
en partculas proteinceas infecciosas. Se incluyen en esta
seccin por varias razones: son subvricos en tamao; en el
plano histrico se denominaron infecciones vricas lentas,
y la opinin de la minora sostiene an que se trata en realidad de virus, nemavirus. Son la causa de la enfermedad
cerebral, encefalopata transmisible espongiforme (ETE),
por la cual la acumulacin de la protena prion da lugar a la
vacuolizacin del tejido nervioso y neurodegeneracin, que
se manifiesta en clnica como demencia de lenta progresin,
ataxia, sueo y trastornos de la alimentacin y conduce de
modo inevitable a la muerte. Las enfermedades incluyen
temblor en ovejas, encefalopata bovina espongiforme (EBE)
en el ganado y cuatro tipos de enfermedad humana: enfermedad de Gerstmann-Straussler-Schinker (GSS), insomnio
familiar mortal (IFM), enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
(ECJ) y kuru, adems de una quinta si se incluye la variante
de la ECJ (vECJ) relacionada con la EBE epidmica (fig. 23-1).
Es demasiado temprano para determinar si una segunda infeccin zoontica, por una ETE de los ciervos o los alces
(enfermedad caquectizante crnica), debe tambin incluirse,
aunque tres hombres han muerto de enfermedad neurodege-
nerativa despus de banquetes de caza silvestre en Estados

Unidos. Antes de considerar la cuestin del diagnstico, es
esencial entender algo del fondo y el mecanismo terico del
proceso infeccioso. Slo entonces es posible reconocer las
dificultades inherentes al diagnstico rpido.
La esencia de la enfermedad por prion es la alteracin
de la conformacin helicoidal alfa de una protena normal
y esencial de la membrana neuronal (PrPc) a una conformacin de lmina beta resistente a la proteasa (PrPRes), la
eliminacin de la cual conduce a la degeneracin neurolgica (fig. 23-1). La presuposicin de que slo la protena
(PrPRes) puede inducir este cambio se apoya en evidencia
in vitro. Datos nuevos sugieren que la neurodegeneracin
se desencadena por el estrs oxidativo debido a que la afinidad de unin al metal de la PrPc se altera. sta es un antioxidante que se une al cobre fijado a las membranas celulares
neuronales y el efecto protector se puede perder cuando la
PrPRes se liga a otros metales, como zinc y manganeso.
De las enfermedades humanas por priones, la GSS e
IFM surgen de varias mutaciones puntuales en el gen PrPc,
las cuales se transmiten genticamente dentro de las familias (fig. 23-1). La ECJ surge de modo espordico (ECJe),
otra vez con la evidencia de la mutacin puntual, o quiz
tambin con la sobreexpresin del gen PrPc. El aspecto infeccioso de la ECJ es su probada transmisin yatrgena a
partir de injertos durales o crneos, instrumentos neuroquirrgicos o extractos de la hormona pituitaria y la posibilidad
de infeccin accidental por la manipulacin del tejido cerebral. El kuru, reconocido como la consecuencia de prcticas
canbales en Papa, Nueva Guinea, se ajusta ms a la imagen
de un proceso infeccioso. De manera similar, el canibalismo
artificial de cerebro ovino o bovino conduce a la infeccin
por EBE, y la ingestin subsiguiente de tejido neural infec-
226
CAP. 23
VIROLOGA: OTRAS PRUEBAS
Figura 23-1 Mecanismos de transmisin y evolucin de la enfermedad por prion.
DIAGNSTICO
tado de EBE provoca vECJ, la cual es distinta de la ECJe

en trminos histolgicos y epidemiolgicos. Es ms fcil
y estrecha la transmisin interespecies en relacin con la
PrPc en el receptor en comparacin con la fuente. Las PrPc
ovina y bovina difieren slo en siete residuos, mientras que
las PrPc bovina y humana lo hacen en 30 residuos. Sin embargo, todas las ETE, con excepcin del IFM, se han transmitido de manera experimental a un grupo de especies.
227
prion al ligarse el anticuerpo especfico, el cual se visualiza

por la reaccin con una enzima marcada (biotina-estreptavidina
o peroxidasa-antiperoxidasa) o conjugado fluorescente. Cepas diferentes de prion producen proporciones variadas de
las dos anomalas principales, placas amiloides (GSS, kuru)
o depsitos sinpticos punteados (ECJe), mientras que la
vECJ humana y los cerebros del mono macaco infectados
con EBE producen abundantes placas corticales floridas entremezcladas con vacuolas en un patrn de margarita.
Diagnstico
Las caractersticas que hacen tan difcil el diagnstico son
el sitio de la enfermedad, el parentesco cercano del agente
patgeno con su husped equivalente y la falta notoria de
cido nucleico. Es poco probable realizar una biopsia del
cerebro cuando la terapia es an inasequible, a menos que
se excluyan otras enfermedades tratables, y las muestras pequeas pueden ser falsamente negativas. Los signos clnicos
de la ECJ, como demencia de rpida progresin, mioclono,
ataxia, trastornos visuales o sndrome de la mano ajena, no
son diagnsticos, pero pueden serlo en una persona ms joven, como en la vECJ. Las mediciones fisiolgicas son casi
siempre intiles.
Las partculas tubulofilamentosas, a menudo de 1 m de

largo, son caractersticas diagnsticas observadas en impresiones de tejido cerebral humedecido recin cortado,
dispuestas sobre las rejillas del microscopio electrnico y
teidas negativamente con cido fosfotngstico. Son distinguibles de los filamentos neurofibrilares identificados en
la enfermedad de Alzheimer. El diagnstico de la microscopia electrnica puede fallar debido al muestreo aleatorio
de tejido no infectado, pero puede encontrarse evidencia
positiva de la infeccin en animales antes de que sean evidentes otros cambios histolgicos.
Histologa
Cultivo
El diagnstico definitivo de la enfermedad por prion requiere evidencia de la eliminacin de PrPRes en el propio
cerebro humano o despus de la transmisin al cerebro animal. Las placas amiloides teidas de rojo Congo, depsitos
de PrP sinptica, cambios espongiformes, maraas neurofibrilares y gliosis subcortical son todos caractersticas
histolgicas consistentes con el diagnstico. No obstante,
todos estos signos se comparten en grados diversos con
otros trastornos neurodegenerativos, como las placas amiloides en la enfermedad de Alzheimer. Pueden relacionarse
de manera especfica con la enfermedad por prion con medios inmunohistoqumicos.
El anticuerpo especfico de prion no es fcil de producir,
pero se ha cultivado el antisuero policlonal de conejo contra ncleos de placa amiloide purificados del cerebro humano, o el cerebro de ratn infectado con ECJ, y contra los
pptidos sintticos equivalentes a las secuencias alteradas
en el prion humano. Puede examinarse el tejido incluido en
parafina y fijado en formalina, pero despus de la desparafinizacin es esencial el pretratamiento con una protena
desnaturalizante para incrementar la inmunorreactividad.
El cido frmico es el desnaturalizante ms simple y
eficaz, si bien se puede reemplazar con el autoclave hidroltico a 121C por 10 minutos en una concentracin apropiada de cido clorhdrico. Se identifica la eliminacin del
Adems del IFM, las infecciones por prion se pueden

confirmar por el pase en ratones o cricetos. El diagnstico
es lento y requiere por lo menos 60 das para demostrar la
histologa caracterstica en los cerebros inoculados, y ms
tiempo an que el periodo de vida de un ratn para algunas
cepas de crecimiento lento. El xito de la transmisin puede ser bajo, pero las EBE cruzan la barrera de la especie
con mayor facilidad y se pueden transmitir por va bucal.
Los priones humanos se pueden expresar en cultivo tisular
(p. ej., clulas del ovario del criceto chino), pero no hay
efecto citoptico evidente. Se ha desarrollado el cultivo in
vitro sin clulas, si puede describirse as; en ste, la PrPc
radiomarcada se convirti en PrPRes en dos das de exposicin al prion de la encefalopata espongiforme ovina sin
marcado. Sin embargo, la segunda tuvo que purificarse y
agregarse ms de 50 veces, lo que indic que la tcnica
requera depuracin para tener aplicaciones diagnsticas.
Inmunoblotting
Es posible establecer el diagnstico rpido, en plazo de un
da, en muestras pequeas del cerebro por inmunoblotting.
El tejido digerido por la proteinasa K se separa en geles de
poliacrilamida SDS y se transfiere de modo electrofortico a
228
CAP. 23
las membranas de nitrocelulosa, con lo cual se producen tres

o cuatro bandas de 16 a 31 kDa de peso molecular que reaccionan con el antisuero especfico del prion. Sus cocientes de
tamao e intensidad pueden distinguir la vECJ de la ECJe.
stas no se encuentran en la enfermedad de Alzheimer y la
proteinasa K digiere por completo a la PrPc normal.
proporciona el impulso para idear tcnicas ms rpidas y

menos invasivas. El examen del LCR para la protena
14-3-3 ahora es el estndar de oro y los progresos en
resonancia magntica han mejorado las perspectivas del
diagnstico no invasivo.
Pruebas de susceptibilidad antivrica

Pruebas en otros tejidos o lquidos corporales
Todos los mtodos discutidos hasta ahora se realizan en tejido cerebral; el diagnstico sera ms simple en un material
ms accesible. El anticuerpo monoclonal del PrPc se puede
utilizar para diagnosticar la ECJ tras detectar la proteasa resistente de PrP en muestras distintas de las cerebrales. La
PrPRes se ha identificado en la orina de los pacientes con
ECJ por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS e inmunoblotting de bolitas de ultracentrifugacin digeridas por
la proteinasa K. Puede tambin identificarse en amgdalas y
ganglios linfticos incluidos y fijados en formalina, despus
de la desparafinizacin, el tratamiento de cido frmico y el
autoclave hidroltico mediante el conjugado biotina-avidina, aunque slo en pacientes con vECJ.
Las pruebas en el lquido cefalorraqudeo para los marcadores sustitutos de la destruccin neuronal ahora son
parte del repertorio aceptado para el diagnstico de la ECJ.
El utilizado ms a menudo es un anlisis de inmunotransferencia con el anticuerpo policlonal de conejo para detectar
una protena neuronal muy conservada de 30 kDa, 14-3-3.
Como la presencia de esta protena en el LCR puede ocurrir en otras enfermedades neurodegenerativas, incluidos
algunos casos de Alzheimer, la prueba es especfica slo
en una proporcin de 88 a 95%. Es menos sensible para
la vECJ (50%) que para la ECJe, pero con la adicin de
la prueba ELISA comercial para la tau, una fosfoprotena
microtubular del axn, puede mejorar la sensibilidad a la
vECJ hasta 86 por ciento.
Tcnicas no invasivas
Por lo general se considera til la electroencefalografa,
aunque inespecfica. Los complejos peridicos de onda
agudos y la reactividad a estmulos externos o frmacos son
observaciones notorias. La prueba ordinaria imagenolgica
de eleccin es la resonancia magntica de difusin ponderada,
que produce hiperintensidades corticales y subcorticales
multifocales; esta tcnica es un marcador que posee 100%
de sensibilidad y especificidad en pacientes con ECJe.
En conclusin, la naturaleza de la enfermedad por prion
limita de manera notable los procedimientos habituales para
el diagnstico y ste suele ser lento, invasivo y muchas veces slo se determina en la necropsia. Sin embargo, la vECJ
Los mtodos de susceptibilidad antivrica todava no se llevan a cabo con regularidad en muchos laboratorios de rutina de virologa. Las pruebas toman varios das o semanas
para realizarse y por lo tanto es probable que beneficien slo
a los sujetos que requieren terapia extensa para los problemas clnicos muy graves. Es ms probable que se efecten
en los laboratorios que atienden a gran cantidad de pacientes
inmunocomprometidos, quiz para supervisar la resistencia
antivrica del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) o
identificar virus resistentes del grupo del herpes en tales pacientes. En la prctica, las decisiones para cambiar la teraputica antivrica se basan a menudo en la evidencia emprica de
la resistencia, es decir, el fracaso para responder en clnica
(fig. 23-2). De manera alternativa, se miden los marcadores
sustitutos de la resistencia, como fracaso del antgeno vrico o los valores del cido nucleico en sangre para descender
en respuesta al tratamiento. Los mtodos de susceptibilidad
confiables se agrupan en dos categoras: los fenotpicos, que
miden el efecto del antivrico sobre el crecimiento del virus
in vitro, y los genotpicos, que detectan en forma directa la
presencia de los mutantes que confieren la resistencia.
Ensayos fenotpicos
Los anlisis fenotpicos proporcionan la prueba definitiva
de la resistencia antivrica. Miden la concentracin antivrica requerida para inhibir el efecto citoptico (ECP)
total del crecimiento del virus en el cultivo celular o las
etapas especficas del metabolismo vrico, esto es, sntesis
de DNA o protena. El virus debe propagarse primero en el
cultivo tisular, un paso que por s mismo puede confundir
el resultado al alterar la proporcin de mutantes resistentes
examinados con posterioridad. Por lo tanto, las pruebas se
realizan de preferencia en aislados de escaso pase. El HIV
se asla a menudo de clulas mononucleares perifricas de
la sangre por cocultivo con una lnea celular linfoblastoide,
otra complicacin agregada.
Pruebas de reduccin de placa (RP)
Cuando las monocapas celulares se siembran con el virus
diluido en condiciones que limitan el movimiento del virus,
PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIVRICA
es decir, bajo un agar o recubrimiento de celulosa, o lquido que contenga inmunoglobulina antivrica, cada unidad
vrica formadora de placa produce una placa discreta de
ECP. La adicin de un antivrico diluido de forma seriada,
junto con cantidades tituladas fijas de virus (15 a 500 unidades formadoras de placa), permite la medicin de la susceptibilidad antivrica como la concentracin que causa
50% de reduccin de la placa (ID50). Los mtodos de RP
detectan slo cepas resistentes que constituyen ms de 20 a
25% del aislado. Proporciones ms bajas se pueden detectar mediante un umbral de reduccin de placa de 90%, pero
las mediciones ID90 son menos exactas que la ID50.
229
Las pruebas de RP utilizan tcnicas de cultivo relativamente baratas, pero las desventajas son los volmenes de
los reactivos, los medios y el virus utilizados y el tiempo
requerido para estandarizar las concentraciones celulares,
vricas y antivricas, y para contar de manera manual las
placas en cultivos replicados. El tiempo total de la prueba
es cuando menos de dos semanas. El cociente virus:clula
se debe optimizar para evitar que se generen clculos altos
o bajos falsos de la susceptibilidad cuando los cocientes
son, respectivamente, demasiado bajos o altos. Los resultados preliminares de la susceptibilidad del herpes simple
(HSV) se pueden obtener en tres das por examen prelimi-
Figura 23-2 Medidas para determinar la resistencia antivrica.
230
CAP. 23
nar de los aislados en paralelo con la titulacin de su infectividad por la incubacin de diluciones vricas seriadas,
con o sin aciclovir, a 1.5 veces la concentracin aceptada
del umbral de resistencia.
Los ensayos de RP son el estndar de oro para la deteccin de la resistencia del HSV, citomegalovirus (CMV)
y varicela zoster (VZV). Se han establecido los umbrales
de resistencia aceptados: 2 g/ml para el aciclovir, 100
g/ml para el foscarnet y un aumento triple a cudruple de
ID50 para el ganciclovir en comparacin con el tratamiento previo. Pese a ello, la duracin de los procedimientos
y las tasas bajas de aislamiento, muchas veces tan bajas
como 30%, hacen en clnica menos tiles los mtodos de
RP del HIV que las pruebas genotpicas ms rpidas.
para detectar resistencia en cepas de HSV, CMV y VZV. Las

desventajas son su costo y la vida til breve de las sondas.
La resistencia al aciclovir en cepas de HSV o VZV puede
confirmarse tras demostrar el mecanismo de la resistencia.
La mayor parte de las cepas resistentes muestra mutacin
en el gen de la cinasa de timidina (TK), lo cual las incapacita para fosforilar y activar al aciclovir. La deficiencia
de TK se puede medir en pruebas de incorporacin de radiomarcador en las lneas celulares apropiadas, como una
seal reducida sobre autorradiografa de la placa, mediante
125I-yododesoxicitidina o 14C-timidina. Esto se correlaciona bien con la imposibilidad de fosforilar al aciclovir.
Captacin del colorante (pruebas CC)
Para algunos virus, el crecimiento se puede supervisar por

el aspecto de las protenas fcilmente identificables del
virus en cultivos celulares. El mejor ejemplo es la hemaglutinina de la influenza A, que se puede detectar en monocapas de rin canino 18 horas despus de la infeccin con
el anticuerpo monoclonal en una prueba inmunoabsorbente
ligada a enzimas (ELISA). La resistencia a la amantadina
o la rimantadina se demuestra como una falla para reducir
las lecturas de densidad ptica del mtodo ELISA, es decir, sntesis de hemaglutinina, excepto en concentraciones
elevadas del antivrico. Esta prueba discrimina con claridad
la resistencia de cepas susceptibles con ms xito que los
mtodos de RP y es la prueba de opcin para la influenza A.
Con el advenimiento de los agentes antineuraminidasa oseltamivir y zanamivir, la resistencia antivrica se puede medir
como la inhibicin disminuida de la actividad enzimtica
vrica en sobrenadantes del cultivo tisular de influenza mediante un sustrato fluorgeno. Los mtodos de expresin
del antgeno vrico tambin se encuentran disponibles para
HSV, VZV y CMV y reconocen las protenas tempranas o
tardas. El grado de inhibicin de la expresin del antgeno
por antivricos se puede medir por citometra de flujo, que
es ms rpida que los mtodos de RP y ms automatizada.
La tecnologa semiautomatizada de una prueba CC conviene

a los laboratorios con un rendimiento ms alto. Principios
similares se aplican al examinar concentraciones constantes
del virus contra diluciones seriadas del antivrico, pero el
ECP despus de dos a tres das de incubacin se mide por
medios espectrofotomtricos. Las cantidades del colorante
rojo neutral absorbido por las clulas viables sobrevivientes, en una hora, entonces eluidas en alcohol amortiguado,
producen lecturas de densidad ptica que son inversamente proporcionales al ECP y a los ttulos del virus. Pueden
interpretarse de modo objetivo y calcularse de manera automtica a los valores ID50. Puesto que se utilizan recubrimientos lquidos, los valores ID50 calculados son ms altos
que en los mtodos de RP y los umbrales de resistencia se
elevan en consecuencia, por ejemplo de 2 a 3 g/ml para el
aciclovir. La tcnica, en placas de microtitulacin, requiere
menos reactivo y detecta cepas resistentes que constituyen
slo 3 a 9% de un aislado total; empero, los mtodos de RP
predicen de forma ms exacta la falla clnica atribuida a la
resistencia.
Pruebas de sntesis de protena
Pruebas de sntesis de DNA

Mtodos genotpicos
La sntesis del DNA vrico en cultivos celulares se puede
cuantificar por la hibridacin con sondas de DNA especficas radiomarcadas. Se mide el valor ID50 antivrico como
la concentracin que causa la reduccin de 50% de la seal
de la sonda ligada. El DNA de las clulas lisadas al final de
un periodo definido del crecimiento del virus se transfiere a
filamentos de nylon y se cuantifica mediante sondas marcadas con 125I (mtodos comerciales Hybriwix), o filtros de
nitrocelulosa y despus se hibridan con sondas marcadas
con 32P. Estos anlisis son ms rpidos que los mtodos RP,
producen resultados en cuatro a seis das y se han utilizado
Cuando se conoce que las mutaciones puntuales dentro de

genes especficos del virus confieren resistencia antivrica,
pueden probarse de forma directa, en cualquier aislado o
muestra clnica, las ms de las veces sangre. Por lo general,
las mutaciones se identifican mediante amplificacin de la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) de las secuencias de DNA pertinentes en las muestras clnicas, seguido
por los anlisis de secuencia o hibridacin con las sondas de
mutacin especficas. Una gama considerable de mtodos
comerciales o internos estn disponibles hoy da; es proba-
INMUNIDAD MEDIADA POR CLULAS
ble que los anlisis de secuencia sean el mtodo de deteccin

ms sensible. La complejidad de la metodologa y su interpretacin obligan a efectuar las pruebas en los laboratorios
especializados, donde la prueba para la resistencia del HIV
se realiza de rutina. Los resultados de la susceptibilidad se
notifican sobre antivricos individuales dentro de cada uno
de los tres grupos anti-HIV principales: inhibidores nuclesidos de la transcriptasa inversa, inhibidores no nuclesidos
de la transcriptasa inversa e inhibidores de la proteasa. Las
mutaciones en los genes fosfotransferasa o polimerasa de
DNA del CMV y el gen de la protena transmembranosa de la influenza A tambin se vinculan con la resistencia
antivrica y as proporcionan blancos para los ensayos
genotpicos. La ventaja de esta tcnica es su directividad,
que evita la necesidad de aislar, cultivar y cuantificar el virus. Esto no es slo ms rpido en trminos tcnicos; los
mutantes de resistencia se pueden identificar en la sangre
antes de que se asle el virus resistente. Las desventajas son
la incapacidad para detectar resistencia cuando se ignoran
las mutaciones especficas o reconocer las mutaciones presentes como una proporcin baja (p. ej., <10 a 25%) de la
poblacin vrica total en una muestra.
Conclusin
En la prctica clnica es probable que continen las decisiones de cambiar la terapia antivrica a partir de evidencia
emprica o del marcador sustituto. Sin embargo, todava
existe un lugar para la prueba de susceptibilidad in vitro
para confirmar la resistencia. La resistencia del CMV o
HIV puede demostrar heterogenicidad focal, por ejemplo
los aislados retinales de CMV resistente junto con los aislados sistmicos sensibles, que modifican el tratamiento.
Los aos recientes han visto que la innovacin rpida en la
terapia antivrica y la bsqueda de compuestos tiles han
suministrado buenos mtodos de susceptibilidad. La introduccin de nuevos antivricos, la evaluacin de la terapia
combinada y la investigacin de los datos inconsistentes
acerca de la resistencia in vitro e in vivo deben incrementar la demanda de esta tecnologa. Con la atencin actual
mejorada de la infeccin por HIV con terapia de mltiples
frmacos, la prueba genotpica de resistencia antivrica del
HIV se ha vuelto parte del repertorio de atencin cuando
falla el tratamiento.
Inmunidad mediada por clulas

Una inmunorrespuesta celular eficaz es importante en la superacin de la infeccin vrica, aun si las investigaciones de
laboratorio se centran casi de modo exclusivo en la reaccin humoral. Las pruebas de inmunidad celular son mucho
231
menos favorables al rendimiento grande que las pruebas serolgicas. Adems de los estudios de investigacin, estas
pruebas se reservan para el anlisis de deficiencias, como
el fracaso para superar las infecciones del grupo del herpes.
Los mtodos tpicos in vitro valoran dos aspectos de la funcin del linfocito, la capacidad de reconocer al virus (mediante pruebas de proliferacin) y la capacidad de destruir
las clulas infectadas (con mtodos de citotoxicidad).
Pruebas de proliferacin
Los linfocitos de la sangre perifrica (LSP) en el medio de
cultivo se estimulan para proliferar por activadores externos
y mitgenos, como fitohemaglutinina (PHA) o, de forma
ms especfica, los antgenos vricos. Se requieren varios
das de incubacin, despus de la cual la proliferacin se
mide como la cantidad de timidina radiomarcada que se incorpor dentro del DNA en las ltimas horas, cuantificada
por el contador de centelleo lquido de cido precipitado,
y las clulas se lavan. Las pruebas comparan la respuesta
de los linfocitos T del paciente a un virus particular de los
controles sin estimular (negativo) o estimulados con PHA
(positivo). Los mtodos se realizan por lo menos por triplicado y, cuando se llevan a cabo en diluciones seriadas de
LSP, se calcula el nmero de linfocitos T circulantes que
reconocen el antgeno del virus y la frecuencia de la clula
reactiva. Pueden determinarse los antgenos purificados individuales o los extractos ordinarios de la clula infectada.
Pruebas de citotoxicidad
Los ensayos de citotoxicidad se pueden realizar en una
variedad de poblaciones de leucocitos (clulas asesinas
dependientes de anticuerpo, clulas asesinas naturales
inespecficas, monocitos), pero es la respuesta citotxica
del linfocito T (CTL) la ms relevante en este contexto. Las
clulas se pueden enriquecer a partir de la fraccin de LSP
por procedimientos de adsorcin-elucin y los anticuerpos
monoclonales o la citometra de flujo. La prueba implica
otra vez cultivo de varios das para medir la actividad efectora en las clulas blanco que contienen al virus. Las clulas blanco deben ser histocompatibles con los CTL de los
pacientes y pueden ser fibroblastos, linfocitos B, macrfagos o clulas del tumor que expresan antgenos vricos, ya
sea despus de infeccin, transfeccin o pulsaciones con
pptidos vricos. La actividad de CTL se cuantifica por la
emisin del cromo radiactivo de las clulas blanco marcadas sobre un corto periodo al final de la incubacin. Las
pruebas de cultivos replicados, habitualmente de los CTL
diluidos en serie, miden el nmero de las clulas efectoras que destruyen a un porcentaje especfico de un nmero
232
CAP. 23
predeterminado de clulas blanco. El anlisis de datos es

complejo y es esencial un protocolo de la prueba bien controlado, con metodologa estadstica apropiada. Los CTL
activos deben ser perceptibles en pacientes con infeccin
vrica aguda, persistente o reactivada.
Citometra de flujo
Desde el punto de vista tcnico, la medicin de los marcadores CD4 en la infeccin por HIV es una investigacin de
inmunocompetencia celular. La citometra de flujo se utiliza para medir los cocientes CD4:CD8 en individuos con
HIV para determinar la progresin o recuperacin inmunitarias despus del tratamiento. En fecha ms reciente el
mtodo se ha utilizado para determinar la persistencia de la
inmunidad mediada por clulas despus de la vacunacin
del sarampin o la varicela. Los linfocitos del paciente se
incuban con el antgeno vrico por varios das y la expresin subsiguiente del antgeno CD25 en la poblacin CD4
indica inmunidad persistente. Estos datos proporcionan
evidencia tranquilizadora para la eficacia de la vacunacin
de la varicela en los sujetos inmunocomprometidos.
En suma, los mtodos de proliferacin y citotoxicidad consumen tiempo, utilizan radiactividad, tienen todos
los problemas del mantenimiento de los mtodos internos ms complejos y requieren un suministro regular de
LSP frescos, con control de edad y sexo de los voluntarios.
Los mtodos controlados de manera correcta de citotoxicidad deben vigilar la variacin diaria de los resultados de
los CTL de control, con alta y baja toxicidad criopreser-
vada. Los lmites normales se deben establecer a partir de

un grupo grande de voluntarios. Por lo tanto, las pruebas
se realizan en centros especializados, las ms de las veces
con propsitos de investigacin. Sin embargo, los pacientes individuales con infecciones graves y recurrentes de
HSV, VZV o EBV requieren investigacin para revelar la
disfuncin exacta de la inmunidad celular, de tal modo que
puedan sugerirse y supervisarse las medidas teraputicas.
La citometra de flujo se utiliza para personas inmunocomprometidas, pero su alcance se limita por su costo y requerimiento de equipo complejo y destreza interpretativa.
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24
Micologa
David W Warnock
Introduccin
De las 50 000 a 250 000 especies de hongos que se han
descrito, menos de 500 se identifican como patgenos humanos. Con pocas excepciones, estos microorganismos
se encuentran en el ambiente y las infecciones humanas se
adquieren a travs de inhalacin, ingestin o implantacin
traumtica. Las enfermedades micticas humanas pueden
dividirse en tres amplios grupos: superficiales, subcutneas
o sistmicas.
Las micosis superficiales son infecciones limitadas a las
capas exteriores de la piel, uas y pelo, adems de las membranas mucosas. Las infecciones principales en este grupo
son la dermatofitosis y la candidiasis. Los agentes etiolgicos de estas enfermedades dependen del husped viviente
para su supervivencia, pero difieren uno de otro en la manera
por la cual se logra esto. Los agentes etiolgicos de la dermatofitosis (las especies de dermatfitos Epidermophyton,
Microsporum y Trichophyton) dependen de la propagacin
de una persona a otra para su supervivencia, mientras que los
agentes etiolgicos de la candidiasis, de los cuales Candida
albicans es la ms importante, son comensales normales del
aparato digestivo. Estos microorganismos no producen enfermedad a menos que un cambio en el husped atene sus
defensas naturales. En esta situacin, la infeccin endgena
da lugar a la infeccin superficial o sistmica.
Las micosis subcutneas son infecciones que afectan a
la dermis, los tejidos subcutneos y el hueso adyacente.
Entre las infecciones de este grupo se hallan la micosis por
el cromoblasto, el micetoma y la esporotricosis. Estas anormalidades son las ms comunes en las regiones tropicales y
subtropicales y se adquieren casi siempre como resultado
de la implantacin traumtica de los microorganismos que
se encuentran en el ambiente. La enfermedad puede confinarse al sitio de la implantacin o extenderse al tejido blando y el hueso adyacentes. Es rara una diseminacin ms
extensa de la infeccin, a travs de la sangre o los linfticos, y ocurre casi siempre slo si el husped se encuentra
de alguna manera debilitado o inmunocomprometido.
Las micosis sistmicas son las infecciones que suelen
originarse en aparato respiratorio o digestivo, pero pueden
propagarse a muchos otros rganos. Los agentes que causan
estas anomalas pueden dividirse en dos grupos distintos:
los patgenos verdaderos y los oportunistas. El primero de
estos grupos consiste en una pequea cantidad de microorganismos, como los incluidos en la especie Histoplasma
capsulatum, que pueden invadir los tejidos de un husped
normal sin predisposicin reconocible. Adems de la histoplasmosis, las infecciones principales por miembros de este
grupo son blastomicosis, coccidioidomicosis y paracoccidioidomicosis. En muchos casos, estas infecciones son asintomticas o leves y de corta duracin. Los individuos que
se recuperan de estos padecimientos gozan a menudo de
resistencia duradera a la reinfeccin, mientras que aquellos
con enfermedad crnica o residual tienden con frecuencia
a sufrir una enfermedad subyacente intensa.
El segundo grupo de hongos patgenos sistmicos, los
oportunistas, comprende a un grupo mucho ms grande
de microorganismos menos adaptables, como Aspergillus
fumigatus, que slo pueden invadir tejidos debilitados o inmunocomprometidos del husped. Aparte de la aspergilosis, las infecciones principales secundarias a los miembros
de este grupo son la candidiasis, criptococosis y mucormicosis (zigomicosis). Con excepcin de la candidiasis, que
de manera habitual se adquiere a partir del reservorio endgeno propio del individuo, la mayor parte de las infecciones
234
CAP. 24
MICOLOGA
micticas oportunistas se adquiere a partir del ambiente, no

tanto como resultado de la propagacin de persona a persona. Estas infecciones se vinculan con altas tasas de mortalidad, pero se piensa que las estimaciones de su incidencia
son absolutamente conservadoras en comparacin con su
verdadera magnitud, dado que muchos casos no se diagnostican o informan.
Como en el caso de otras infecciones microbianas, el
diagnstico de las infecciones micticas depende de una
combinacin entre la observacin clnica y la investigacin
de laboratorio. Las infecciones superficiales y subcutneas
producen a menudo lesiones caractersticas que sugieren el
diagnstico, pero las pruebas de laboratorio son esenciales
cuando ste no es el caso porque los signos clnicos semejan
los de otras enfermedades o un tratamiento previo altera el
aspecto de las lesiones. En casi todas las situaciones en las
cuales la infeccin mictica sistmica se considera como
un diagnstico, la manifestacin clnica es inespecfica y
puede deberse a una amplia gama de infecciones, enfermedades subyacentes o complicaciones del tratamiento.
El diagnstico acertado de laboratorio de las infecciones micticas depende en buena medida de la recoleccin
de especmenes adecuados para la investigacin. Tambin
guarda relacin con la seleccin de los procedimientos de
prueba microbiolgicos, serolgicos e histopatolgicos
apropiados. stos difieren de una enfermedad a otra y dependen del sitio de la infeccin, as como de los sntomas
presentados y los signos clnicos. La interpretacin de los
resultados de las investigaciones de laboratorio puede en
ocasiones establecerse con confianza, pero algunas veces
los resultados pueden ser intiles o incluso engaosos. En
estas circunstancias es esencial el enlace cercano entre el
clnico y el laboratorio.
Los mtodos de laboratorio para el diagnstico de las
infecciones micticas se apoyan todava en tres amplias
tcnicas: deteccin microscpica del agente etiolgico en
el material clnico; aislamiento e identificacin en cultivo,
y deteccin de una reaccin serolgica del agente patgeno
o de algn otro marcador de su presencia, como un componente mictico de la clula o un producto metablico.
En la actualidad se desarrollan nuevos procedimientos de
diagnstico basados en la deteccin del DNA mictico en
material clnico, pero todava no han tenido un efecto de
importancia en los laboratorios clnicos. En las secciones
que siguen se revisan el valor y las limitaciones de los procedimientos de diagnstico actuales para las infecciones
micticas.
Examen microscpico
Por lo regular, el examen microscpico directo del material clnico es til en el diagnstico de laboratorio de las
infecciones micticas. Diversos mtodos pueden utilizarse: se pueden observar preparaciones humedecidas sin teir mediante iluminacin de campo claro, campo oscuro o
contraste de fase, o bien es posible teir y examinar frotis
secos. En algunos casos, el examen microscpico directo
hace posible establecer un diagnstico preliminar o definitivo, mucho antes de que el crecimiento sea evidente en
el cultivo. En otros casos, la observacin de elementos micticos en un espcimen clnico es ms significativa que
aislar el hongo en cultivo, sobre todo si el agente es un
contaminante comn.
Aunque las clulas micticas son ms grandes que
las bacterianas, estos microorganismos se encuentran a
menudo presentes en cantidades mucho ms pequeas en
los especmenes clnicos. Por esta razn es esencial aumentar la concentracin de elementos micticos en un espcimen antes de examinarlo. Los lquidos y las secreciones
deben centrifugarse y el sedimento conservarse para la investigacin micolgica. Otras muestras, como el esputo, se
deben digerir antes de la centrifugacin.
Figura 24-1 Frotis de lquido de drenado peritoneal teido con

Gram que muestra racimos de clulas de levadura y numerosas
clulas bacterianas mucho ms pequeas.
Existen varios mtodos para preparar los especmenes

para el examen microscpico directo. Los frotis teidos
con Gram son de uso frecuente para detectar clulas micticas en lquidos y secreciones (fig. 24-1). La tinta de
la India es til para la tincin negativa del sedimento del
lquido cefalorraqudeo (LCR) y as revelar clulas encapsuladas de Cryptococcus neoformans. La tinciones de
Giemsa y Wright se pueden emplear para perfilar las clulas
de Histoplasma capsulatum en preparaciones de la mdula
sea o frotis de sangre. La tincin de Papanicolaou se usa
en el esputo u otras muestras de las vas respiratorias para
reconocer elementos micticos.
Los raspados de piel y otros especmenes dermatolgicos deben examinarse despus de la digestin con solucin
235
CULTIVO
Figura 24-2 Preparacin de la piel con hidrxido de potasio

sin teir que muestra la presencia de hifas de dermatfitos ramificantes, algunos de los cuales estn fragmentados en artrosporas.
de hidrxido de potasio al 10 a 20%, que aclara el espcimen sin daar las clulas micticas. Estas muestras pueden
examinarse sin tincin, como preparacin hmeda (fig. 24-2).
La adicin de abrillantadores qumicos, como el blanco de
calcoflor, es til en la demostracin de elementos micticos en preparaciones hmedas de stos y otros materiales
clnicos, como esputo, cuando se examinan bajo un microscopio de fluorescencia. Los elementos micticos aparecen
en tonos brillantes teidos contra un fondo oscuro.
En ciertas situaciones, el examen microscpico directo de
lquidos u otro material clnico puede establecer el diagnstico de una infeccin mictica subcutnea o sistmica. Los
casos incluyen el reconocimiento de clulas encapsuladas de
Cryptococcus neoformans en LCR o clulas de Histoplasma
capsulatum en frotis de sangre perifrica. Empero, con ms
frecuencia, slo puede determinarse un diagnstico presuntivo de infeccin mictica profunda con base en el examen
microscpico. No obstante, esto puede ayudar a determinar
si un agente recuperado ms adelante en cultivo es un contaminante o un patgeno y puede ser de utilidad en la seleccin
de las condiciones ms apropiadas de cultivo para recuperar
los microorganismos visualizados en un frotis directo.
El examen histopatolgico de los cortes tisulares es uno
de los mtodos ms confiables para establecer el diagnstico de infecciones micticas subcutneas y sistmicas. Pese
a ello, la facilidad con la cual puede reconocerse un hongo
patgeno en tejido depende no slo de su abundancia, sino
tambin de la distincin de su aspecto. Muchos hongos se
tien de modo incorrecto con hematoxilina y eosina, un
mtodo que resulta insuficiente para revelar elementos micticos en el tejido. Existe un buen nmero de tinciones
especiales para detectar y resaltar microorganismos micticos, entre ellas la metenamina-plata (Grocott o Gomori)
y el cido perydico de Schiff. El mucicarmn se puede
utilizar para teir la cpsula de Cryptococcus neoformans.
Estos mtodos de teido, aunque tiles para revelar la presencia de elementos micticos en tejidos, rara vez precisan el
gnero mictico exacto identificado. Por ejemplo, la deteccin de la hifa septada y ramificada sin tincin es tpica de la
infeccin por Aspergillus, pero es tambin caracterstica de
una gran cantidad de microorganismos menos comunes,
como las especies de Fusarium y Scedosporium. Asimismo,
el reconocimiento de clulas micticas pequeas en fases
tempranas permite slo de modo ocasional un diagnstico
especfico. Las clulas que forman el tejido de Histoplasma
capsulatum y Blastomyces dermatitidis, por ejemplo, pueden parecer similares y se confunden muchas veces con las
clulas de Cryptococcus neoformans sin cpsula.
Para superar este problema se han desarrollado diversos
mtodos para la identificacin especfica de microorganismos micticos en tejido. La inmunoperoxidasa y los reactivos inmunofluorescentes de tincin, sea monoclonales o
policlonales, estn disponibles para algunos hongos y pueden
facilitar la identificacin de elementos micticos atpicos y
la deteccin de cantidades pequeas de microorganismos.
En la actualidad est bajo investigacin una serie de tcnicas que incluye la unin especfica de las sondas del DNA
al cido nucleico del agente mictico directamente sobre el
portaobjetos (hibridacin in situ) o en un tubo de prueba.
Cultivo
El aislamiento en cultivo hace posible identificar a la mayor parte de los hongos patgenos. Casi ninguno de estos
microorganismos es exigente en sus requerimientos nutricionales y crece en los medios usados para el aislamiento
bacteriano a partir de especmenes clnicos. Sin embargo, el
crecimiento en estos medios puede ser lento y el desarrollo
Figura 24-3 Cultivo tpico de Aspergillus nidulans sobre el

agar-dextrosa de Sabouraud. Obsrvese el aspecto polvoriento de
la superficie colonial debido a la presencia de nmeros enormes
de esporas.
236
CAP. 24
MICOLOGA
de las esporas y otras estructuras usadas en la identificacin

mictica puede ser deficiente. Por estas razones, la mayora de los laboratorios utiliza un medio especfico, como el
agar-dextrosa de Sabouraud, para aislar hongos (fig. 24-3).
Muchos especmenes clnicos sometidos al cultivo mictico
se contaminan con bacterias y es esencial aadir antibiticos antibacterianos a los medios de cultivo micticos. Si
se aslan hongos dermatfitos o dimorfos, la cicloheximida
(actidiona) tambin se debe agregar al medio para prevenir
el crecimiento excesivo de hongos que crecen ms rpido.
La temperatura ptima de crecimiento para los hongos
patgenos se aproxima a 30C. El material de pacientes con
sospecha de una infeccin superficial se debe incubar de 25
a 30C porque la mayor parte de los dermatfitos no crece a
temperaturas ms elevadas. El material de sitios subcutneos o profundos se debe incubar a dos temperaturas, 25 a
30C y 37C, porque varios hongos patgenos importantes,
entre ellos Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis y Sporothrix schenckii, son dimorfos y el cambio en su
forma de crecimiento, que depende de las condiciones de la
incubacin, es til en la identificacin. A 25 a 30C estos
microorganismos se desarrollan como mohos en el agardextrosa de Sabouraud, pero a temperaturas ms altas sobre
un medio enriquecido (como la infusin de agar-cerebrocorazn), estos microorganismos crecen como levaduras.
Algunos hongos patgenos crecen con lentitud y los
cultivos deben conservarse por lo menos dos semanas, y en
algn caso hasta cuatro semanas, antes de desecharse como
negativos. No obstante, muchos hongos patgenos comunes, como las especies Aspergillus y Candida, producen
colonias identificables en un plazo de uno a tres das. Los
cultivos deben examinarse con regularidad (por lo menos
tres veces por semana) y se realizan los subcultivos apropiados, en especial a partir de medios enriquecidos con sangre,
en los cuales a menudo los hongos no pueden esporular.
Es importante reconocer que el crecimiento de un agente en cultivo no establece en todos los casos su papel como
patgeno. Slo si el microorganismo se identifica como patgeno inequvoco, por ejemplo Trichophyton rubrum o
Histoplasma capsulatum, puede establecerse el diagnstico
con firmeza. Si, pese a ello, se recupera un agente oportunista como Aspergillus fumigatus o Candida albicans, su
aislamiento puede carecer de relevancia clnica, a menos
que haya evidencia adicional de su participacin en un proceso patgeno. En esta situacin, los resultados del cultivo
deben compararse con los del examen microscpico. El aislamiento de hongos patgenos oportunistas a partir de sitios
estriles, como sangre o LCR, proporciona muchas veces
evidencia confiable de una infeccin grave, pero su aislamiento a partir de material como pus, esputo u orina se debe
interpretar con cautela. Debe prestarse atencin a la cantidad
de hongo aislada y solicitar investigaciones adicionales.
Muchos mohos desconocidos se han informado como

causales eventuales de la infeccin sistmica mortal en
pacientes inmunocomprometidos. Ningn aislado debe excluirse como un contaminante sin la consideracin cuidadosa de la afeccin clnica del sujeto, el sitio del aislamiento, el
mtodo de coleccin del espcimen, la cantidad de microorganismos recuperados y la probabilidad de contaminacin.
Aunque el cultivo establece con frecuencia el diagnstico
definitivo de una infeccin mictica, tambin tiene algunas
limitaciones; la principal es la falla para recuperar el agente.
Esto puede deberse a la recoleccin inadecuada del espcimen o el transporte tardo de las muestras. Los procedimientos incorrectos del aislamiento o los periodos inadecuados
de incubacin son otros factores de consideracin.
Identificacin
Una vez aislados en cultivo, los mohos y los dermatfitos
(hongos filamentosos) se identifican con base en sus caractersticas morfolgicas macroscpicas (colonias) y microscpicas. Las propiedades macroscpicas, como forma colonial, color superficial y pigmentacin, son a menudo tiles
en la identificacin, pero es esencial examinar las preparaciones en portaobjetos del cultivo bajo un microscopio.
Si estn bien preparadas, stas suministran casi siempre la
suficiente informacin sobre la forma y la disposicin de
las esporas y las estructuras que posibilitan la esporulacin
para el reconocimiento del hongo (fig. 24-4).
Figura 24-4 La tincin de lactofenol azul de algodn de Cladophialophora carrionii muestra las largas cadenas de ramificacin
tpicas de las esporas que identifican a este microorganismo.
Dado que la identificacin es dependiente de la visualizacin de las estructuras particulares que un microorganismo produce cuando esporula, el reconocimiento depende
por lo regular de la capacidad del agente para esporular.
Los mohos crecen a menudo mejor en medios ricos, como
PRUEBAS SEROLGICAS
el agar-dextrosa de Sabouraud, pero la superproduccin del

micelio da lugar con frecuencia a la prdida de la esporulacin. Si un aislado de mohos no puede producir esporas
despus de dos semanas, debe subcultivarse en un medio
menos rico para promover la esporulacin. El uso de los
mtodos de identificacin basados en DNA puede eliminar
en un futuro este requisito.
De manera habitual, las levaduras (hongos unicelulares
recientes) se identifican a partir de sus caractersticas morfolgicas y bioqumicas. Las caractersticas morfolgicas
tiles incluyen el color de las colonias, el tamao y la forma de las clulas, la presencia de una cpsula alrededor
de las clulas y la produccin de hifas o seudohifas. Las
pruebas bioqumicas tiles incluyen la asimilacin y la fermentacin de azcares y la asimilacin de nitrato y urea.
La mayor parte de las levaduras vinculadas con infecciones
humanas puede identificarse mediante uno de los numerosos sistemas comerciales de identificacin, como el API
20C AUX (bioMerieux-Vitek Inc., Hazelwood, MO), que
se basan en la asimilacin diferencial de varios compuestos de carbono. Sin embargo, es importante recordar que el
examen morfolgico de cultivos en la placa Dalmau sobre
agar de harina de maz es esencial para evitar la confusin entre los microorganismos con perfiles bioqumicos
idnticos. Se han ideado varias pruebas rpidas simples
para la presunta identificacin de algunos de los agentes
patgenos humanos ms importantes. La principal de stas
es la prueba en tubo con suero de germen para Candida
albicans, que puede realizarse en menos de tres horas, y
la prueba de la ureasa para Cryptococcus neoformans. En
fecha reciente se desarroll un buen nmero de pruebas
comerciales rpidas, entre las que se incluyen el sistema
de RapID Yeast Plus (Innovative Diagnostic Systems, Norcross, GA) que contiene los sustratos convencionales y cromgenos y requiere cuatro horas para realizarse. La mayor
parte de estos sistemas de pruebas rpidas es ms exacta en
la identificacin de levaduras patgenas comunes, no tanto
de las raras.
En el pasado, los hongos dimorfos como Blastomyces
dermatitidis e Histoplasma capsulatum se identificaron al
observar la conversin del crecimiento miclico a 25C al
crecimiento como levadura a 37C. Empero, el desarrollo
de las pruebas basadas en sondas de DNA (Accuprobe,
GenProbe Inc., San Diego, CA) ha permitido identificar
estos agentes patgenos con tan slo una cantidad pequea
de material miclico.
Pruebas serolgicas
La comprobacin serolgica proporciona a menudo los
medios ms rpidos para diagnosticar una infeccin
237
mictica sistmica. Casi todas las pruebas se basan en la deteccin de anticuerpos contra hongos patgenos especficos,
aunque las pruebas para antgenos micticos muestran ahora
una amplia disponibilidad. Las pruebas serolgicas individuales pueden ser diagnsticas, como las pruebas de antigenemia en la criptococosis y la histoplasmosis. Pese a ello,
en general los resultados de la comprobacin serolgica son
rara vez ms que sugestivos o se inclinan por un diagnstico mictico. Estas pruebas deben interpretarse con cautela y
considerarse junto con los resultados de otras investigaciones clnicas y de laboratorio.
Las pruebas de anticuerpos han probado ser tiles en
diagnosticar infecciones, como la histoplasmosis y la coccidioidomicosis, en personas inmunocompetentes. En estos
individuos, el intervalo entre la exposicin y el desarrollo
de los sntomas (dos a seis semanas) es casi siempre suficiente para que se desarrolle una reaccin humoral. Las
pruebas para los anticuerpos de Histoplasma capsulatum y
Coccidioides immitis son muy provechosas cuando se obtienen especmenes de suero (agudo y convaleciente), al
grado que puede determinarse si los ttulos se incrementan
o disminuyen. Las pruebas de anticuerpos tambin tienen
un uso diagnstico establecido en las diferentes formas de
infeccin de Aspergillus que ocurren en individuos inmunocompetentes. En contraste, estas pruebas rara vez son
provechosas para el diagnstico de aspergilosis invasiva en
personas inmunocomprometidas, muchas de las cuales son
incapaces de activar una respuesta humoral detectable a la
infeccin. Las pruebas para los anticuerpos contra Candida se han evaluado de forma extensa, pero son todava
de utilidad limitada en el diagnstico de formas invasivas de
candidiasis. Estas pruebas se complican con resultados
falsos positivos en pacientes con la colonizacin mucosa
o infeccin superficial y con resultados falsos negativos
en individuos inmunocomprometidos.
La comprobacin de antgenos micticos en suero, LCR
u orina es un procedimiento establecido para el diagnstico
de la criptococosis y la histoplasmosis; en la actualidad se
evalan pruebas similares para aspergilosis y candidiasis.
La prueba LPA para el antgeno polisacrido capsular de
Cryptococcus neoformans es sensible y especfica y arroja
resultados positivos con especmenes de suero y LCR en
ms de 90% de los pacientes infectados. Los ttulos altos o
ascendentes indican la progresin de la infeccin, mientras
que los ttulos descendentes sealan la regresin de la enfermedad y la buena respuesta al tratamiento. La deteccin
del antgeno en orina ha probado ser un mtodo til para
el diagnstico rpido de la histoplasmosis en los pacientes que se presentan con enfermedad aguda, as como en
aquellos con la infeccin diseminada. En la enfermedad
aguda, el antgeno puede detectarse en orina dentro del
primer mes despus de la exposicin, antes que aparezcan
238
CAP. 24
MICOLOGA
los anticuerpos. Se han desarrollado varios formatos de la

prueba, incluidos RIA y ELISA.
Las pruebas para la deteccin del antgeno tambin se
han evaluado con amplitud para el diagnstico rpido de
las formas invasivas de aspergilosis en individuos inmunocomprometidos. Se han comercializado dos pruebas para
detectar el galactomanan circulante, un componente importante de la pared celular de la especie Aspergillus. Ambas
utilizan el mismo anticuerpo monoclonal, o en un formato
LPA o ELISA tipo emparedado. La ltima prueba (Platelia
Aspergillus, Sanofi Diagnostics Pasteur, Pars, Francia) es
ms sensible que la primera (Pastorex Aspergillus, Sanofi
Diagnostics Pasteur) y puede detectar el galactomanan en
suero en una fase temprana de la infeccin.
Nuevas direcciones en el diagnstico

Los nuevos mtodos diagnsticos de infecciones micticas
invasivas incluyen la deteccin de las secuencias micticas genmicas en especmenes clnicos. La mayor parte de
los mtodos de diagnstico que se han diseado se basa en
el uso de los formatos PCR convencionales, pero muchas
tcnicas modificadas tambin se han evaluado, incluidos
los mtodos PCR multiplex y PCR anidada. Varias regiones dentro del genoma mictico se han evaluado como
blancos potenciales para la deteccin, pero gran parte del
esfuerzo se ha centrado en el complejo gen del DNA ribosmico (rDNA). Esta seccin del genoma incluye las
regiones relativamente conservadas de los genes 18S, 5.8S
y 28S y regiones espaciadoras transcritas intervencionales
ms variables. Los ltimos desarrollos en el diagnstico
molecular mictico implican el uso de mtodos PCR en
tiempo real, en los cuales el termociclado se combina con
la vigilancia de la fluorescencia del producto amplificado
durante su generacin. Estas tcnicas permiten la cuantificacin de las cantidades de cido nucleico mictico presentes en especmenes clnicos, lo cual permite medir la
carga microbiana.
A pesar del reciente progreso, el objetivo de contar con
pruebas clnicas simples, rpidas y rentables en vas de
desarrollo para el diagnstico molecular de infecciones
micticas agudas peligrosas para la vida an est lejos de
alcanzarse. Aunque los numerosos laboratorios de investigacin ahora ofrecen procedimientos internos para la
deteccin molecular de la infeccin mictica a partir de especmenes de tejido o lquidos corporales, la sensibilidad,
la especificidad y el valor pronstico de estas pruebas no
siempre se han investigado a fondo. Debe esperarse que, en
el futuro, se demuestre la importancia de la vigilancia seriada de los antgenos micticos y las secuencias del cido
nucleico especficas micticas en sangre y otros lquidos
biolgicos y que las pruebas confiables estn disponibles
para un grupo mucho ms amplio de laboratorios clnicos.
Campbell CK, Johnson EM, Philpot CM, Warnock DW. Identification of Pathogenetic Fungi. 1996 Public Health Laboratory
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Chen SC, Halliday CL, Meyer W. A review of nucleic acidbased diagnostic tests for systemic mycoses with an emphasis
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Richardson MD, Warnock DW. Fungal Infection: Diagnosis and
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15: 465-484.
25
Parasitologa
Robert WA Girdwood
Introduccin
En el contexto de este libro, la parasitologa de diagnstico
se puede definir como la demostracin de evidencia de microorganismos protozoarios o metazoarios que viven en los
seres humanos u otros animales (los huspedes). La evidencia puede ser directa o indirecta. Los hallazgos directos
proceden del examen de las muestras del supuesto husped, como heces, orina, sangre y otros tejidos, en una fase
del parsito o en una porcin de ste. La evidencia indirecta puede obtenerse tras demostrar reacciones inflamatorias
caractersticas, productos del parsito o los anticuerpos especficos en el supuesto husped. La demostracin directa
de una fase del parsito en una muestra del husped, por
ejemplo un huevo del helminto en una muestra de heces,
es casi siempre la evidencia indiscutible de infeccin, pero
siempre debe considerarse la posibilidad de la contaminacin del espcimen. A la inversa, un fracaso para demostrar
huevos en una muestra fecal no descarta en todos los casos
un diagnstico, ya que se requiere tiempo para que los parsitos maduren en sus huspedes y lleguen a la fase en la
que pueden observarse o el estadio del parsito puede estar presente de forma escasa o intermitente en las muestras
examinadas. La evidencia indirecta de la infeccin, como
la demostracin de anticuerpos, debe tambin tratarse con
precaucin, sobre todo debido a la posibilidad de reacciones cruzadas con otros parsitos. Es por estas razones que
un conocimiento detallado de los ciclos vitales del parsito, los modos de transmisin y los tiempos tomados para
que las diversas fases se completen son requisitos para determinar el diagnstico. Es preciso este conocimiento para
decidir qu muestras se envan a examen y cules son las
ms apropiadas en relacin con el posible tiempo de expo-
sicin a la infeccin y las manifestaciones de la enfermedad, si se presenta.

La piedra angular de la mayor parte de la parasitologa
de diagnstico se basa en la morfologa y parmetros morfomtricos. En consecuencia, aunque en trminos microbiolgicos los estadios de transmisibilidad (es decir, huevos,
quistes, ooquistes o larvas) tienden a ser relativamente grandes (en el orden de decenas a centenares de micrones [m]),
el convencional microscopio de transmisin es todava la
herramienta diagnstica ms importante. De modo similar,
aunque la mayor parte de los gusanos adultos y casi todos
los parsitos artrpodos (o vectores) son macroscpicos,
casi siempre se requiere la microscopia para detectar las caractersticas morfolgicas, a menudo sutiles, necesarias
para la identificacin de la especie. En este ltimo caso, tiene mayor utilidad el estereomicroscopio de bajo aumento.
Microscopia
El convencional microscopio de luz transmitida, que proporciona magnificaciones totales de 100, 400 y 1 000 , es
el instrumento bsico de los parasitlogos. Dado que es muy
importante una medicin exacta del tamao de los quistes
del protozoario, los ooquistes y los huevos del helminto, es
esencial disponer de una escala grabada del ocular calibrado con precisin. La microscopia de luz transmitida exige
que el espcimen sea lo suficientemente transparente para
permitir que la luz pase a travs de l y que proporcione la
definicin adecuada de la morfologa. Esto significa que las
muestras tienen que ser finas, en el orden de micrones, y
cuando son relativamente opacas deben adquirir transparencia mediante agentes clarificadores. Cuando los parsitos
240
CAP. 25
PARASITOLOGA
tienen por s mismos un ndice de refraccin similar al de la

muestra que los contiene, requieren una tincin diferencial,
de tal modo que los colorantes usados se capten de manera
preferencial por los parsitos. Con menos frecuencia, los
tejidos o el medio circundante pueden teirse y los parsitos
contenidos permanecen sin teir: sta es la tincin negativa.
Un mtodo alternativo consiste en utilizar diferentes sistemas de iluminacin como la microscopia de campo oscuro,
la de contraste de fases o la de contraste de interferencia
diferenciada (Nomarski).
Montajes hmedos
En parasitologa, lo ms frecuente para examinar la muestra es el montaje hmedo, en el cual unas cuantas gotas del
espcimen o una suspensin de ste se colocan sobre un
portaobjetos del microscopio, se cubren con un cubreobjetos y se examinan a amplificaciones totales de 100 y 400.
Los detalles especficos de la preparacin del espcimen
dependen del nmero de parsitos probables en la muestra en relacin con la presencia de material contaminante u
oscurecedor. Por consiguiente, mientras que pueda ser til el
examen directo de gotas sin concentrar de sangre u orina o
suspensiones salinas de heces, casi siempre es necesaria la
concentracin de la muestra porque el parsito se halla en
cantidades pequeas respecto del volumen del espcimen
que se requiere examinar. Los lquidos transparentes, como
la orina, pueden analizarse por centrifugacin y examen
de un montaje hmedo del sedimento resuspendido o filtracin y examen similar del sedimento. El material fecal
representa un problema ms complejo dado que los escasos
parsitos pueden estar presentes en una masa de detritos
opaca y oscurecida. Se emplean tcnicas de concentracin
selectiva, en las cuales los huevos, quistes y ooquistes del
parsito se concentran y se separan del detrito fecal, o
viceversa (fig. 25-1). Tales tcnicas utilizan la flotacin o

centrifugacin, en las cuales se explotan las diferencias entre las densidades de los estadios del parsito y el detrito
contaminante mediante varios medios de suspensin de diferentes densidades especficas. Segn sea la tcnica usada,
la muestra concentrada limpia para examinar al microscopio se obtiene a partir del sedimento centrifugado, es decir, la interfaz entre los medios en suspensin de diferentes
densidades especficas y el menisco superficial flotante.
Ejemplos de estas tcnicas incluyen la flotacin/centrifugacin diferencial en formol ter de Ridley, la concentracin del gradiente de sucrosa y la flotacin de sulfato de
zinc. Los mismos principios se utilizan para la deteccin
de quistes, ooquistes y huevos del parsito en muestras ambientales, como agua, suelo, lodo y aguas residuales. En dichas muestras los parsitos son a menudo ms escasos y se
utilizan ahora tcnicas de concentracin adicionales, como
anticuerpos antiparasitarios ligados a partculas magnetizadas.
Los parsitos en la circulacin sangunea estn presentes
en concentracin baja y, de nueva cuenta, se emplean las
tcnicas que incluyen la concentracin de parsitos y permiten el examen de volmenes ms grandes de sangre. En
consecuencia, la deteccin de la microfilaria, que tiende a
ser muy escasa aunque es relativamente grande (200 a 300
m), exige cualesquiera de estas tcnicas: a) la filtracin de
un volumen grande de sangre anticoagulada a travs de un
filtro de membrana que retiene a las microfilarias y permite
que pasen componentes celulares ms pequeos de la sangre, con tincin, aclaracin y microscopia subsecuentes del
filtro, o b) lisis de los eritrocitos en un volumen grande de
sangre (cerca de 5 ml) y la sedimentacin de cualquier microfilaria contenida, que se examinan en un montaje hmedo del sedimento resuspendido.
Extendidos y frotis
Figura 25-1 Huevo de una especie de Taenia. Suspensin fecal

concentrada en formol ter (400 ).
Los extendidos y frotis se utilizan con amplitud para detectar parsitos en muestras de sangre, mdula sea y heces.
Las muestras de sangre para la identificacin de parsitos
protozoarios, como los del paludismo y tripanosomas, se
examinan por lo general en la forma de extendidos finos o
gruesos teidos con tincin de Romanowsky (fig. 25-2). Los
extendidos finos de sangre, del grosor de una clula, se fijan
antes de teirse y, debido a ello, conservan la morfologa de
los eritrocitos as como, en el caso del paludismo, los parsitos intracelulares contenidos. Con los extendidos gruesos
los eritrocitos se lisan antes de teirse y fijarse; de ese modo,
la preparacin final revela slo leucocitos, plaquetas y parsitos. La ventaja de la pelcula gruesa es que puede examinarse ms material, pero son desventajas la imposibilidad
de reconocer los cambios morfolgicos importantes en los
MICROSCOPIA ELECTRNICA
241
Fluorescencia
Figura 25-2 Tripomastigotos de Trypanosoma rhodesiense. Frotis de sangre delgada teida con Romanowsky (400 ).
eritrocitos que produce el parsito del paludismo y que los

parsitos se pueden confundir con plaquetas y viceversa.
Los frotis de mdula sea teidos con una tincin de Romanowsky se usan para identificar Leishmania spp. intracelulares.
Se requieren frotis fijados y teidos para la deteccin
de los trofozotos del protozoario en heces. Dichas tcnicas son indispensables porque se requieren la rotura de los
trofozotos en material sin fijar y la visualizacin de los detalles finos de la estructura nuclear y las inclusiones
intracitoplsmicas para la identificacin de las especies de
amebas. La hematoxilina frrica, las tinciones tricrmicas
y el Giemsa se emplean en extenso para estos propsitos.
Adems, los frotis fecales teidos se utilizan para reconocer ooquistes de Cryptosporidium spp. y esporas de microsporidios.
Con menos frecuencia, los frotis de impresin teidos
de biopsia tisular o material de necropsia se emplean para
diagnosticar infecciones por Leishmania spp.
Histopatologa
Las secciones tisulares convencionales pueden proporcionar informacin diagnstica al parasitlogo o revelar
reacciones caractersticas del tejido para la infeccin o la
demostracin del parsito (protozoario) o cortes del parsito (metazoario). De nueva cuenta, la micrometra es importante y, en el contexto del examen de cortes histolgicos de
gusanos y sus huevos, es preciso el conocimiento adecuado
por la contraccin debida a la fijacin y las dimensiones
alteradas si los cortes son adems distintos de los transversales o sagitales. Con frecuencia se emplean tinciones
especiales para acentuar ciertos componentes de las secciones del parsito, pero la descripcin de su uso rebasa los
alcances de este captulo.
La capacidad de los materiales de emitir luminosidad cuando se observan con luz ultravioleta se emplea en la parasitologa diagnstica de tres maneras: autofluorescencia,
tincin con fluorocromo y marcado con fluorocromo. La
autofluorescencia se refiere a la caracterstica intrnseca
del microorganismo o un componente de ste para emitir
luz fluorescente y lo ejemplifica el aspecto azulado de los
ooquistes de Cyclospora spp. cuando se observan en montajes hmedos sin tincin bajo luz ultravioleta. La tincin
con fluorocromo se refiere a una tincin directa del microorganismo o un componente de ste con el fluorocromo. La
fluorescencia verde manzana que producen los ooquistes
de Cryptosporidium spp. cuando se tien con el fenol de
auramina es un ejemplo de este mtodo. El marcado con
fluorocromo incluye casi siempre mtodos inmunolgicos,
en los cuales los anticuerpos (policlonales o monoclonales)
especficos del parsito se conjugan con un fluorocromo,
como el isotiocianato de fluorescena, y se utilizan para
acentuar la detectabilidad de los parsitos en el material
clnico. El xito de esta tcnica depende en gran parte de
la especificidad del anticuerpo usado para unir la marca
fluorescente al parsito. Ejemplos de ensayos tiles incluyen la deteccin de quistes de Giardia duodenalis estructuralmente daados en muestras fecales y la deteccin de
trofozotos de Entamoeba histolytica en cortes o abscesos
tisulares. Los mtodos indirectos, que utilizan microscopia
fluorescente y el parsito especfico como sustrato fijado
para detectar anticuerpos en suero, se describen de modo
sinptico en la seccin de serologa ms adelante. La incorporacin o la exclusin de fluorocromos se postula cada
vez ms como mtodo sustituto para determinar la viabilidad y, por lo tanto, la contagiosidad potencial de los quistes
o los ooquistes aislados a partir de muestras ambientales.
Por consiguiente, la exclusin del yoduro de propidio y
la inclusin de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por los
ooquistes de Cryptosporidium spp. se hallan bajo evaluacin actual.
A excepcin de las infecciones por microsporidios, la
microscopia electrnica ocupa un lugar discreto en la parasitologa diagnstica. Aunque se han desarrollado procedimientos de diagnstico alternativos, la microscopia
electrnica de transmisin de heces, biopsias intestinales
y otros tejidos es la tcnica definitiva, aunque algo inconveniente, para diagnosticar infecciones con estos microorganismos, sobre todo porque son pequeos (1 a 2 m),
intracelulares y se tien de modo deficiente.
242
CAP. 25
PARASITOLOGA
Cultivo
Una forma muy bsica de cultivo se emplea para el diagnstico y especiacin de larvas de nematodo, como las uncinarias
y Strongyloides spp. Mientras que las larvas de Strongyloides
se evacuan en las heces del husped y los huevos casi nunca estn presentes, lo contrario es vlido para las uncinarias
Ancylostoma duodenale y Necator americanus, en los cuales
los huevos slo se eliminan en heces frescas. Como los huevos de los dos ltimos son indistinguibles desde el punto de
vista morfolgico, para efectuar la especiacin basta crear las
condiciones en las cuales el huevo se incube y se desarrolle
en larvas de tercer estadio. Adems, la motilidad de las larvas de las tres especies se utiliza para facilitar la recoleccin.
Esto es en particular til en el diagnstico de la estrongiloidiosis, en la cual las larvas presentes en heces pueden ser
escasas y no se concentran bien cuando se aplican tcnicas
convencionales, como la de ter formol. Las condiciones que
pertenecen a la transmisin natural de estos parsitos se reconstruyen con la tcnica de Harada-Muri (o una similar).
En sta, el material fecal se frota sobre tiras de papel filtro,
cuyos extremos inferiores se suspenden en un pozo con agua
destilada contenido en tubos de prueba sellados y se incuba
a 28C por alrededor de 10 das. Bajo estas condiciones, las
larvas de uncinarias incubadas y las de Strongyloides migran
hacia abajo del papel filtro para recolectarse en el agua. Las
larvas se clasifican entonces por especie y se reconocen las
diferencias morfolgicas. Debe observarse que ninguna rplica de los parsitos ocurre en esta tcnica de cultivo.
El cultivo in vitro de material clnico para propsitos de
diagnstico se utiliza relativamente poco en parasitologa
en comparacin con otras disciplinas microbianas. Esto se
debe a que los protozoarios y metazoarios tienen requerimientos metablicos ms complejos; stos, en la mayor
parte de casos, no pueden reunirse en sistemas de cultivo in
vitro actuales. Sin embargo, los mtodos de cultivo replicativos nicos tienen un papel limitado en la parasitologa
diagnstica, en la que se emplean mtodos alternativos,
con otras limitaciones. Por lo tanto, el sistema de cultivo
de Robinson para el aislamiento de Entamoeba histolytica como una tcnica de diagnstico es bastante incmoda
e insensible, pero ofrece la ventaja, cuando es exitosa, de
producir los trofozotos para el anlisis de la isoenzima.
La determinacin cimodmica de aislados puede distinguir entre las cepas patgenas y las no patgenas. De igual
modo, el cultivo in vitro del material de la biopsia se utiliza de modo amplio en el diagnstico de la leishmaniosis,
cutnea y visceral, muchas veces como un adjunto para la
microscopia directa de una porcin convenientemente teida del mismo material. La ventaja de la microscopia radica
en que es rpida y, si es positiva, diagnstica, aunque esto
se atena por la habitual escasez de parsitos. El cultivo es
relativamente lento das a semanas pero tiene la ventaja, cuando es positivo, de producir microorganismos viables
que pueden someterse a especiacin por anlisis molecular,
serolgico o enzimtico y, adems, se puede utilizar para la
comprobacin de la susceptibilidad a los frmacos. Debe
acentuarse otra vez que los resultados negativos del cultivo
no excluyen el diagnstico.
Cada vez ms, con la complejidad creciente de las tcnicas de cultivo in vitro, los parsitos se propagan en cultivo axnico de tal forma que los parsitos, las fracciones
preparadas de ellos o sus productos metablicos pueden
recolectarse, purificarse y caracterizarse para el uso en procedimientos diagnsticos inmunolgicos. Dos ejemplos
bsicos del uso de los mtodos de cultivo para propsitos
inmunodiagnsticos son: primero, cultivo in vitro de los trofozotos de Entamoeba histolytica, que se recolectan, se
adhieren a los portaobjetos del microscopio y se usan como
antgeno en la prueba indirecta del anticuerpo fluorescente
para la amebiosis; segundo, el mantenimiento de las larvas
incubadas de Toxocara canis de segundo estadio in vitro
y la recoleccin, concentracin y estandarizacin de los
productos excretorios/secretorios que producen para el uso
como antgenos en una prueba de ELISA para la deteccin
de los anticuerpos circulantes de Toxocara.
Infeccin animal
La inoculacin o suministro de material clnico dentro de
especies susceptibles de animales experimentales mantenidos en laboratorio fue alguna vez el apoyo principal de
todas las disciplinas de la microbiologa diagnstica. El
diagnstico se estableca mediante el sacrificio de animales, despus de un periodo apropiado de incubacin, y la
demostracin del microorganismo o la enfermedad caracterstica que produca en los rganos o tejidos mediante tcnicas microscpicas e histolgicas convencionales. Cada
vez ms se utilizan mtodos alternativos de diagnstico,
pero todava se requieren animales, ya sea para el mantenimiento de los parsitos para usarse como antgenos, cuando no hay tcnicas de cultivo in vitro disponibles, o para
la produccin de anticuerpos antiparsitos usados en las
pruebas de diagnstico. Parece probable que en el caso anterior el uso de los antgenos constructivos o el desarrollo
de tcnicas de cultivo tisular reduzcan ms este requisito;
por ejemplo, el cultivo celular continuo para la produccin
de T. gondii reemplaz al cultivo animal.
Xenodiagnstico
Este mtodo inusual se halla entre el cultivo y la inoculacin animal y utiliza un vector natural o un husped
MTODOS MOLECULARES
243
intermedio en el ciclo vital del parsito para concentrarlo y de ese modo hacerlo ms detectable. El ejemplo tpico del xenodiagnstico emplea uno de los vectores del
insecto Trypanosoma cruzi para facilitar el diagnstico de
la enfermedad de Chagas (tripanosomiosis sudamericana).
Las ninfas (libres de parsitos) criadas en laboratorio de los
insectos redvidos se habilitan para que se alimenten sobre
el paciente y se sacrifican algunas cuatro semanas despus.
Los contenidos del intestino posterior se exprimen, tien
y examinan al microscopio en busca de tripomastigotos.
Este ejemplo casi nico de xenodiagnstico reconoce que
los parsitos son en extremo escasos en la sangre perifrica
del husped y que los insectos redvidos son vectores muy
eficientes.
antgeno de la filaria en suero, orina y lquido de hidrocele

de pacientes con infecciones por Wuchereria bancrofti (en
la cual la microfilaria es difcil de demostrar en la sangre
perifrica en los estados crnicos), y b) en el suero y la
orina de individuos con infecciones por Onchocerca volvulus. Una ventaja adicional potencial de la deteccin del
antgeno es que la cuantificacin del antgeno circulante o
excretado puede correlacionarse con la carga del gusano
y, por extrapolacin, con los sntomas y la transmisibilidad. La deteccin de complejos inmunitarios no es todava
especfica lo suficiente para propsitos diagnsticos, pero
la disociacin de estos complejos para detectar los componentes del antgeno o el anticuerpo es una tcnica ms
satisfactoria.
Serologa
Mtodos moleculares
El serodiagnstico es menos confiable que los mtodos microscpicos ms directos debido a los problemas de reactividad cruzada (escasa especificidad), sensibilidad baja y,
con frecuencia, incapacidad para distinguir entre infecciones pasadas y actuales. De los tres grupos principales de
mtodos serolgicos, es decir, la deteccin del anticuerpo,
deteccin del antgeno y deteccin de complejos inmunitarios, la primera es la ms utilizada para el diagnstico. En
condiciones normales, dichas tcnicas serolgicas se emplean cuando el material para el examen directo en busca
de parsitos no est disponible. Por lo tanto, las pruebas
serolgicas para el diagnstico de parsitos intestinales
casi nunca se recomiendan, ya que el diagnstico especfico mediante demostracin de huevos o quistes en las heces
sera el mtodo elegido. Por el contrario, en enfermedades
parasitarias invasivas del tejido, como equinococosis, toxoplasmosis o toxocariosis, la demostracin de anticuerpos
circulantes puede ser ms productiva que el examen de la
biopsia tisular. La interpretacin de los resultados serolgicos en relacin con la fase de la enfermedad (aguda o
crnica) producida por el parsito puede mejorarse si se
determina la clase y el isotipo de la inmunoglobulina incluidos en la respuesta del anticuerpo. Algunas veces se
puede lograr mayor sensibilidad y especificidad de la prueba mediante inmunoblotting. De forma similar, una mejor caracterizacin de las preparaciones del antgeno, por
ejemplo mediante anticuerpos monoclonales, puede lograr
el mismo objetivo. Debido a que los anticuerpos pueden
persistir por aos luego de la infeccin y el tratamiento
exitoso, la deteccin del antgeno del parsito en material
clnico es, en teora, ms atractiva porque la presencia del
antgeno debe indicar una infeccin actual o muy reciente. Los ejemplos del valor de este acercamiento son los
siguientes: a) uso de la tcnica ELISA para reconocer el
El uso de sondas de DNA y la tcnica PCR proliferaron

en todos los campos de la microbiologa en los ltimos 20
aos. En tanto que esto es verdad en la investigacin parasitolgica, en la cual predominan ahora dichas tcnicas,
en los campos de la parasitologa diagnstica el papel de
los mtodos moleculares sigue restringido an. La ventaja principal de los mtodos de deteccin basados en los
cidos nucleicos es su sensibilidad. En consecuencia, en
el diagnstico esto ocurre slo cuando la carga del parsito es baja y estas tcnicas pueden mejorar las pruebas
ms convencionales. La tripanosomiosis sudamericana es
un buen ejemplo; en la fase crnica de esta afeccin, las
parasitemias estn tan bajas que se hallan fuera del lmite
de deteccin por mtodos microscpicos convencionales
(vase antes la seccin Xenodiagnstico). Tambin en esta
enfermedad, debido a su carcter endmico, el serodiagnstico no slo carece de especificidad, sino que tampoco
puede distinguir entre la infeccin pasada o presente y el
estado actual de la enfermedad. De manera especfica, una
secuencia de minirrepeticin conservada de los minicrculos del DNA del cinetoplasto usados como sonda, seguida
por la amplificacin PCR, ha demostrado ms sensibilidad
y especificidad que la microscopia, el serodiagnstico o la
serologa. Los mtodos moleculares pueden ser tambin
valiosos con fines diagnsticos si los mtodos ms convencionales estn comprometidos por los cambios en el
husped. Un primer ejemplo es el problema de diagnosticar toxoplamosis en el husped inmunocomprometido.
Toxoplasma gondii tiene una distribucin mundial, con una
alta incidencia de infeccin subclnica. Por lo general, el
diagnstico de infecciones pasadas o presentes se determina tras probar varias clases de anticuerpos especficos.
En el husped inmunocomprometido, la infeccin latente
puede progresar a la enfermedad potencialmente mortal y,
244
CAP. 25
Cuadro 25-1
PARASITOLOGA
Algunas ventajas y desventajas de los mtodos principales usados en la parasitologa diagnstica
Mtodo
Ventajas
Desventajas
Microscopia
Rpida (para espcimen individual)

Visualizacin directa del parsito
Resultado positivo casi siempre definitivo
Requiere un microscopista experimentado

Requiere parsitos relativamente numerosos,
es decir, que el resultado negativo no excluya
el diagnstico
Lenta por la exploracin masiva
Cultivo in vitro
Detecta parsitos slo viables

Proporciona aislados adems de la caracterizacin,
comprobacin de la sensibilidad y preparacin
del antgeno
Lento
Slo disponible para un nmero limitado
de especies/cepas
El cultivo negativo no excluye el diagnstico
Infeccin animal
Como el anterior
Como el anterior
Costoso
Serologa
Simple
Rpida
Puede usarse para la exploracin masiva
Escasez de reactivos estndar (antgenos)

Difcil diferenciar entre infecciones pasadas
y presentes
Resultados falsos positivos debido a la
reactividad cruzada
Xenodiagnstico
Simple
Barata
Especfica
Sensibilidad baja
Aplicacin muy limitada
Lenta
Incmoda?
Mtodos moleculares
Rpida
Sensible
Puede detectar parsitos vivos y muertos
Deteccin directa del parsito
Costosa
Detecta parsitos vivos y muertos
Falsos negativos por inhibidores de PCR
Falsos positivos por contaminacin
en virtud de la deficiencia inmunitaria, el serodiagnstico

es intil. Los mtodos de PCR que se dirigen a los genes
B1 o P30 se han aplicado al lquido amnitico y por lo tanto el diagnstico de la infeccin fetal se puede establecer
sin fetoscopia.
La produccin del antgeno, por hibridacin o la tecnologa de DNA recombinante, ha proporcionado reactivos de diagnstico especficos y sensibles tal vez tiles, y
el uso de tcnicas moleculares para detectar vectores
transportadores de parsitos es otro ejemplo de las posibilidades de la investigacin molecular. Sin embargo, el entusiasmo por el potencial de tales tcnicas debe moderarse
por el conocimiento de las desventajas del costo relativo
y los problemas de resultados falsos positivos debido a la
contaminacin de las muestras.
Los procedimientos de diagnstico principales con algunas de sus ventajas y desventajas se resumen en el cuadro 25-1.
Basic Laboratory Methods in Medical Parasitology. 1991: World
Health Organization, Geneva.
Cook GC (ed.) Mansons Tropical Diseases. 1996: WB Saunders,
London.
Fleck SL, Moddy AH. Diagnostic Techniques in Medical Parasitology. 1988: Wright, London.
Gillespie SH, Hawkey PM (eds). Medical ParasitologyA Practical Approach. 1995: Oxford University Press, Oxford.
Kettle DS (ed). Medical and Veterinary Entomology. 1995: CAB
International, Wallingford.
SECCIN 5
HEMATOLOGA
26
Morfologa de las clulas sanguneas
y de la mdula sea
Supratik Basu
Morfologa de la sangre perifrica
La morfologa de la clula es una parte esencial de cualquier investigacin hematolgica, y se valora mejor con el
examen de una pelcula extendida, bien teida. Una pelcula
sangunea puede formarse a partir de sangre no anticoagulada (natural), que se obtiene de una vena o de un vaso capilar,
o de sangre anticoagulada con EDTA. Un frotis de sangre
bien hecho se extiende de manera uniforme y tiene un borde
torneado en lengeta. Despus, el frotis debe secarse rpido
al aire y fijarse en metanol puro por 10 a 20 minutos.
Tincin
Una vez que se fijan todos los frotis de sangre deben teirse
en seguida. Los frotis de sangre y de mdula sea se tien
con colorante Romanowsky, una mezcla de azul de metileno y de eosina. El primero tie los componentes cidos,
por ejemplo, los ncleos y el RNA citoplsmico de azul,
mientras la eosina tie los componentes bsicos, como la
hemoglobina, de rojo. La tincin popular Romanowsky es
conocida como May-Gruenewald-Giesma. En ciertas situaciones, p. ej., en la diferenciacin de los diversos tipos
de leucemias, se usan tinciones especiales (cuadro 26-5).
aglutinacin anormales. Una vez que la observacin a bajo

aumento es satisfactoria, un rea adecuada de la pelcula se
examina detalladamente a gran aumento o se usa un objetivo de inmersin en aceite.
Morfologa del eritrocito
Cuando son saludables, los eritrocitos varan poco de tamao y forma. La mayor parte son redondos y lisos y de
un dimetro dentro de un rango estrecho (la media es 2
DE) de 6.0 a 8.5 m con una palidez central. Si durante
el examen de una pelcula los eritrocitos se aprecian bien
separados y no se tocan unos a otros, menos de 10% de stos deben tener una forma oval. Un porcentaje muy pequeo (menos de 0.1%) puede contraerse o fragmentarse. En
lactantes prematuros y normales esta proporcin suele ser
ms alta (de 0.3 a 5.6%) (para la morfologa de la sangre
perifrica normal, vase fig. 26-1).
Tcnica para examinar un frotis sanguneo

(un extendido)
Las pelculas deben examinarse primero en bajo aumento,
para tener idea de la calidad de la preparacin, del nmero, distribucin y tincin de eritrocitos, de leucocitos y de
plaquetas. La visualizacin a bajo aumento tambin es ms
adecuada para detectar la presencia de precipitados y de
Figura 26-1 Frotis de sangre perifrica normal que muestra

neutrfilos, linfocitos, monocitos.
248
CAP. 26
MORFOLOGA DE LAS CLULAS SANGUNEAS Y DE LA MDULA SEA
Cuadro 26-1 Alteraciones del eritrocito

Terminologa
Qu significa
Condiciones asociadas
Anisocitosis
Variacin ms grande de lo normal

en el tamao
Poblacin doble de clulas. Algunos
eritrocitos adquieren un tono plido
Clulas pequeas con proyecciones
espiculares regulares, mltiples
Agrupamiento irregular de eritrocitos
Caractersticas no especficas. Pronunciada en anemia

grave
Deficiencia de hierro en pacientes tratados o transfundidos.
Deficiencia hematnica combinada
Posesplenectoma (hiposplnica), fenotipo
McLeod, - lipoproteinemia, inanicin
Enfermedades de la aglutinina fra, anemia hemoltica
autoinmunitaria
Envenenamiento con plomo, deficiencia de pirimidina 5
nucleotidasa, mielodisplasia, anemia megaloblstica,
enfermedad de la hemoglobina inestable, talasemia
Artefacto, hipotiroidismo, vejez, falla renal
Anisocroma
Acantocitosis
Autoaglutinacin
(fig. 26-2)
Punteado basoflico
(fig. 26-3)
Clulas crenadas
Eliptocitosis
Cuerpos de Howell
Jolly (fig. 26-4)
Hipocroma
(fig. 26-5)
Macrocitosis
(fig. 26-6)
Microcitosis
(fig. 26-5)
(fig. 26-7)
Inclusiones pequeas de azul profundo en

el eritrocito. Se ven mejor con el objetivo
de inmersin en aceite
eritrocitos mostrando proyecciones romas
con espacios uniformes
Clulas elpticas u ovales
Teidos oscuros, inclusin como punto
dentro de las clulas (remanente nuclear)
Eritrocitos plidos (MCH <27 pg)
Clulas grandes (MCV >100 fl)
Clulas pequeas (MCV <75 fl)
Presencia de eritrocitos con ncleo
Poiquilocitos
Eritrocitos con forma anormal
Policromasia
Presencia de eritrocitos teidos de gris

azulado. stos son reticulocitos
Hacinamiento de eritrocitos en columnas
Rouleaux
(fig. 26-8)
Esquistocito
(fig. 26-9)
Clula falciforme
(fig. 26-10)
Esferocitos
(fig. 26-7)
Clula en espuela
Estomatocitos
Clulas diana
(fig. 26-11)
Clula en forma
de lgrima
(fig. 26-12)
Eritrocitos fragmentados
Clulas delgadas, en forma de media luna
elongada
Clulas pequeas tensas y densas, sin palidez
central
Clulas con proyecciones irregulares, afiladas
Clulas con una rendija parecida a una boca
en el centro
Eritrocitos con un rea central de coloracin
densa y anormal, borde de hemoglobina en
la periferia, con un anillo claro entre estos dos
Autoexplicatoria (tipo de poiquilocitosis)
Anemia megaloblstica, deficiencia de hierro,

mielofibrosis, eliptocitosis/ovalocitosis hereditaria
Hipoesplenismo de cualquier causa, anemia
megaloblstica
Anemia por deficiencia de hierro, talasemia, anemia
sideroblstica
Anemia megaloblstica, mielodisplasia, hipotiroidismo,
anemia aplsica, enfermedad del hgado
Vense hipocroma
Cualquier anemia grave, mielofibrosis, hemlisis grave,
talasemia (posesplenectoma), infiltracin de mdula.
Normal en sangre del cordn, se encuentran en gran
nmero en la enfermedad hemoltica del recin nacido
Cualquier anemia, especialmente relacionada con
eritropoyesis anormal, por ejemplo, talasemia, mielofibrosis
Hemlisis, prdida de sangre, eritropoyesis extramedular
Cierto grado es normal, mieloma, macroglobulinemia,
infeccin crnica e inflamacin
DIC, carcinoma, anemia hemoltica microangioptica
(MAHA)
Enfermedades de clulas falciformes
Esferocitosis hereditaria, enfermedad hemoltica del
recin nacido ABO, anemia hemoltica autoinmunitaria
Enfermedad del hgado, deficiencia de piruvato cinasa
Estomatocitosis hereditaria, alcoholismo, artefacto
Hemoglobinopatas, por ejemplo, HbCC, enfermedad del
hgado SC
Mielofibrosis, talasemia
EXAMEN Y MORFOLOGA DE LA MDULA SEA
Anormalidades de la morfologa del eritrocito

No es posible una descripcin completa de todas las variaciones normales y de las anormalidades en este captulo (los
detalles morfolgicos deben consultarse en un atlas). Algunas alteraciones comunes que afectan a los eritrocitos con
sus desrdenes relacionados se listan en el cuadro 26-1.
Morfologa del leucocito
Los leucocitos normales de la sangre perifrica se clasifican como leucocitos polimorfonucleares y clulas mononucleares. El ltimo trmino se refiere a los linfocitos y
monocitos. En un frotis (extendido) de sangre los monocitos y los neutrfilos se concentran en el borde y al final de
sta. La informacin vital se obtiene explorando en la pelcula para evaluar la morfologa celular y las alteraciones en
nmero en una ampliacin ms baja. El estudio detallado
de la granulacin y de la morfologa nuclear y citoplsmica
se realiza mejor bajo el objetivo de inmersin en aceite o
con una ampliacin de aumento ms alto.
Morfologa normal
Los leucocitos normales son de cinco tipos:
Neutrfilos. El neutrfilo maduro mide de 12 a 15 m de
dimetro. El citoplasma es acidfilo con grnulos finos.
El ncleo con la cromatina agrupada se divide desde dos
a cinco lbulos distintos, los cuales son filamentos de
heterocromatina densa. En el sexo femenino, algunos
neutrfilos tienen un apndice nuclear en forma de baqueta ligado al ncleo por un filamento. Esto representa
un cromosoma X inactivo (fig. 26-1).
Eosinfilos. Son ligeramente ms grandes que los neutrfilos, 12 a 17 m de dimetro. El ncleo con frecuencia es bilobulado. Los grnulos eosinfilos son esfricos,
grandes, gruesos y de color naranja rojizo (fig. 26-13).
Basfilos. Su tamao es similar al de los neutrfilos, y su
ncleo oscurecido por grnulos negro prpura, gruesos.
Linfocitos. stos miden de 10 a 16 m de dimetro. Los
linfocitos que predominan son los ms pequeos (10 m),
tienen citoplasma escaso y ncleo redondo con cromatina condensada. Cerca de 10% de los linfocitos son ms
grandes, tienen un citoplasma abundante y cromatina
nuclear menos condensada. Los linfocitos pueden tener
una pequea cantidad de grnulos que contienen enzimas lisosomales (grnulos azuroflicos). En ocasiones las
clulas ms grandes, con un citoplasma ms abundante,
tienen grnulos azuroflicos bastante prominentes. stas
249
son llamadas linfocitos granulares grandes (para la morfologa normal del linfocito, vase la fig. 26-1).
Monocitos. Son las clulas ms grandes, con un dimetro de 12 a 20 m; presentan un ncleo irregular y
lobulado; contiene abundante citoplasma de color grisceo-azul. Pueden apreciarse grnulos azuroflicos finos
en estas clulas; su contorno con frecuencia es irregular
y es posible que el citoplasma tambin est vacuolado
(fig. 26-1). El retraso en la elaboracin de frotis de sangre anticoagulada con EDTA propicia cambios en la
protena secuestrina. Esto se muestra como vacuolacin
del ncleo y del citoplasma; ello primero afecta a los
monocitos y luego a los neutrfilos.
Anormalidades de la morfologa de los leucocitos
Algunas alteraciones comunes que afectan a los leucocitos
se listan en el cuadro 26-2.
Plaquetas
Las plaquetas normales miden de 1 a 3 m de dimetro.
Contienen grnulos finos que se dispersan o concentran en
el centro. Es posible efectuar una estimacin aproximada
del nmero de plaquetas mientras se examina una pelcula.
En sangre anticoagulada con edta las plaquetas permanecen por lo general separadas. En los frotis frescos se agrupan
con frecuencia. Una muestra mal colectada puede producir
un conteo falso de plaquetas bajo. Algunas anormalidades
comunes de las plaquetas se listan en el cuadro 26-3.
Examen y morfologa de la mdula sea

La distribucin de la mdula hematopoytica depende de la
edad. En recin nacidos, la mdula hematopoytica ocupa
casi toda la cavidad de la mdula sea. La hematopoyesis
ocurre prcticamente en todos los huesos. Con la edad, la
mdula hematopoytica se contrae y se sustituye por mdula grasa. En adultos jvenes la mdula hematopoytica se
confina al crneo, a la espina dorsal, a las costillas, a la clavcula, al esternn, a la pelvis y a las porciones proximales
de los huesos largos. Sin embargo, la mdula hematopoytica puede expandirse en respuesta a una demanda creciente.
Examen de la mdula sea
Debe examinarse la morfologa de la mdula sea por medio de una biopsia obtenida mediante trepanacin por
aspirado. Las biopsias por aspirado de la mdula sea se
realizan con frecuencia en el esternn, la cresta iliaca o la
250
CAP. 26
Cuadro 26-2 Alteraciones del leucocito

Terminologa
Qu significa
Condiciones relacionadas
Linfocitos atpicos
(fig. 26-14)
Bastones Auer
Infecciones virales, reacciones

a las drogas
Leucemias mieloides
Leucocitosis
Linfocitosis
Linfocitos grandes con citoplasma basflo.

Con frecuencia se rodean de los eritrocitos
Inclusin roja parecida a un bastn en las
clulas inmaduras (blastos)
Clulas primitivas inmaduras
Inclusiones citoplsmicas azules en el
citoplasma neutrfilo
Neutrfilos con granulacin anormal
y reducida
Presencia de eritrocitos nucleados y
granulocitos tempranos en sangre
Recuento de leucocitos ms de 11 109/L
Recuento de linfocitos >4 109/L en adultos
Neutrofilia
>7 109/L en nios

Neutrfilos >7.5 l09/L
Clulas blsticas
Cuerpos de Dhle
(fig. 26-15)
Neutrfilos hipogranulares
Leucoeritroblstico
Anomala de Pelger-Hut
Cambio a la izquierda
Cambio a la derecha
Clula difusa
Granulacin txica (fig. 26-16)
Clulas de Turk/clulas
plasmacticas
Neutrfilos con dos lbulos no segmentados

(bilobulados)
Presencia de clulas mieloides tempranas
Neutrfilos de cinco o ms lbulos
Linfocitos difuminados, degenerando
Neutrfilos con grnulos prpura gruesos
Clulas linfoplasmacticas reactivas
superficie intermedia de la tibia en bebs hasta los 18 meses

de edad. Hay agujas especiales de aspiracin para este procedimiento. Las muestras de aspiracin son apropiadas para
el examen citolgico con fineza y detalle cuando se extienden en forma apropiada sobre un portaobjetos. El aspirado
de mdula sea es tambin conveniente para los estudios
de citometra de flujo, anlisis cariotpicos y moleculares, y
tambin para los estudios de cultivo celular de mdula sea.
Leucemias
Infeccin, inflamacin
Mielodisplasia
Infiltracin de la mdula,
mielofibrosis hemlisis aguda
Infeccin, inflamacin, leucemia
Leucemia linftica crnica,
linfoma en fase leucmica
Pertusis, infeccin viral
Inflamacin, reaccin leucemoide,
leucemia mieloide crnica
Mielodisplasia, leucemia mieloide,
forma hereditaria
(Vase Neutrofilia)
Anemia megaloblstica
Leucemia linftica crnica
Infeccin, inflamacin
Infeccin bacteriana, viral grave,
leucemia rarade la clula plasmtica
Las biopsias de fragmento seo se realizan mejor, y con

mayor facilidad, a partir de la cresta iliaca. Las agujas especiales para biopsia sea se encuentran disponibles para
este propsito. La obtencin de un fragmento de mdula
sea es esencial para una valoracin histolgica y de celularidad correcta. Las clulas de la mdula sea tambin
pueden evaluarse examinando fragmentos de la mdula
que fue aspirada.
Cuadro 26-3 Anormalidades de la plaqueta

Anormalidad
Qu significa
Condiciones relacionadas
Plaquetas grandes
Plaquetas del tamao promedio antedicho
Agrupamiento de
plaquetas
Agrupamiento de plaquetas en el frotis,

dando lugar a un recuento de plaquetas bajo
Trombocitopenia
Recuento bajo de plaquetas <150 109/L
Trombocitosis
(fig. 26-17)
Recuento alto de plaquetas >500 109/L
Trombocitopenia inmunitaria, plaquetas gigantes

del sndrome Bernard-Soulier
Anticoagulante relacionado, muestra mal
colectada, muestras coaguladas parcialmente,
grupos pequeos normales en frotis frescos
Trombocitopenia inmunitaria (ITP), aplasia de mdula,
o infiltracin, mielodisplasia, hiperesplenismo
Infeccin, inflamacin, estados mieloproliferativos
La celularidad disminuye de manera constante con la

edad, con una declinacin acelerada a los 70 aos. Las
biopsias con trpano se realizan siempre que un aspirado seco o una muestra diluida se obtienen por aspiracin.
Esto sucede a menudo cuando una mdula es fibrtica, hipercelular o se infiltra de modo anormal en alguna enfermedad. Las biopsias por aspiracin y con trpano deben
considerarse como procedimientos complementarios.
Morfologa de la mdula sea

Una vez que se aspira la mdula debe extenderse formando
una pelcula, como se describe antes. Los frotis de la mdula
sea, despus de teirse, deben examinarse al microscopio
con un objetivo de bajo aumento (10 ) para el conteo de la
celularidad total, la distribucin de las clulas hematopoyticas, la presencia de grupos anormales de clulas no hema-
251
topoyticas, el nmero de megacariocitos y la morfologa.

La maduracin de los componentes eritroides y mieloides,
sus proporciones relativas y patrones anormales de maduracin (p. ej., megaloblstico o displsico) deben observarse.
El cociente normal mieloide a eritroide (cociente M:E) es
de 2.5:1 a 8:1. Lo ideal es hacer un recuento diferencial
(mielograma) de al menos 200 clulas nucleadas. Esto
es importante si se sospecha de infiltracin anormal con
leucemia, mieloma o linfoma. Los nios tienen una gran
cantidad de linfocitos pequeos; este nmero disminuye al
incrementarse la edad. En adultos cerca de 5 a 15% de las
clulas nucleadas son linfoides. Otras clulas que deben localizarse son los megacariocitos, las clulas plasmticas, los
macrfagos y las clulas cebadas. Tanto su nmero como la
morfologa son importantes. A los parsitos con frecuencia,
se les ubica mejor dentro de los macrfagos.
Una tincin con azul de Prusia de la mdula permite
valorar las reservas y la distribucin del hierro. La mdula
Diagrama A Representacin diagramtica de la hematopoyesis. CFU-S, unidad formadora de colonias-bazo; CFU-GEMM, unidad
formadora de colonias-granulocito, eritrocito, macrfago, megacariocito; LSC (CFU-L), clula linfoide germinal (unidad formadora de
colonias-linfoide); CFU-GM, unidad formadora de colonias-granulocito; BFU-E unidad formadora de colonias-eritroide; CFU-Meg,
unidad formadora de colonias-megacariocito; CFU-NM, unidad formadora de colonias-neutrfilo, monocitos; CFU-Eo, unidad formadora de colonias-eosinfilo; CFU-Bas, unidad formadora de colonias-basfilo; CFU-E, unidad formadora de colonias-eritroide; CFU-M,
unidad formadora de colonias-monocitos/macrfago; CFU-N, unidad formadora de colonias-neutrfilo; N, neutroflica; E, eosinoflica;
B, basoflica; NB, normoblasto.
252
CAP. 26
Diagrama B Mapa de maduracin. Reproducido con permiso de Churchill Livingstone, Atlas of Haematology, G.A.
FIJACIN Y DESCALCIFICACIN
McDonald, J. Paul y B. Cruickshank. 5 edicin, 1989.
253
254
CAP. 26
Figura 26-2 Autoaglutinacin de los eritrocitos.
Figura 26-5 Eritrocitos macrocticos, hipocrmicos.
hematopoytica entera se origina de una clula embrionaria

totipotencial hematopoytica en la mdula. Una representacin diagramtica simple se muestra en el diagrama A.
Eritropoyesis normal
Figura 26-3 Punteado basoflico de los eritrocitos.
El primer precursor eritroide reconocible, el pronormoblasto, se desarrolla en forma progresiva y se diferencia en

un eritrocito normal. En este proceso adquiere ms hemoglobina de forma progresiva, y de manera gradual pierde
su basofilia citoplsmica y su ncleo. Este proceso entero
se divide, en forma arbitraria, en tres etapas: normoblasto
temprano, normoblasto intermedio y normoblasto tardo.
Los normoblastos tardos no se dividen, pierden su ncleo por extrusin y dan lugar a un reticulocito de la mdula. stos pasan hasta dos das en la mdula antes de entrar
en la sangre perifrica, donde constituyen menos de 1% de
la poblacin de eritrocitos. Los reticulocitos poseen una
coloracin gris azulado caracterstica que permite verlos a
detalle y contarlos mejor usando una tincin supravital. Los
eritrocitos maduros son viables cerca de 120 das antes de su
destruccin en el sistema reticuloendotelial. La eritropoyesis normal y la hematopoyesis se ilustran en el diagrama B.
Algunos desrdenes frecuentes que afectan
principalmente la eritropoyesis
Anemia megaloblstica
Figura 26-4 Cuerpos de Howell-Jolly.
sta surge de una deficiencia de la vitamina B12 o del cido flico. Debido sobre todo a la formacin defectuosa del
timidilato, la sntesis del DNA en la fase S del ciclo celular
se retrasa. Esto hace que la divisin nuclear se rezague, y la
sincronizacin citoplsmica nuclear en desarrollo se afecte.

Aparte de los eritroblastos, la mayor parte de las clulas
en proliferacin se modifican, tambin la mucosa intestinal, los granulocitos y los precursores de la plaqueta. La
mdula megaloblstica es hipercelular. La eritropoyesis es
desplazada a la izquierda, con aumento de tamao celular y
apertura del sistema nuclear de la red de cromatina. La adquisicin de hemoglobina de manera temprana con prdida
de sincronizacin del desarrollo citoplsmico nuclear es frecuente (son caractersticas megaloblsticas). Los cambios
paralelos en precursores del granulocito incluyen la presencia de mielocitos o de metamielocitos gigantes y neutrfilos
multilobulados (al desplazarse se mueve a la derecha). Los
megacariocitos tambin muestran hipersegmentacin. La
sangre perifrica muestra la presencia de macrocitos y de
neutrfilos desplazados a la derecha (figs. 26-6 a 26-18).
Figura 26-8
mieloma.
255
Rouleaux con clulas de plasma anormal en el
Figura 26-6 Neutrfilos macrocticos e hipersegmentados.
Anemias hemolticas
Figura 26-9
Eritrocito fragmentado en la anemia microangioptica hemoltica (MAHA).
Las anemias hemolticas (destruccin excesiva de eritrocitos) por cualquier causa muestran hiperplasia compensato-
Figura 26-7 Esferocitos con eritrocitos nucleados en la anemia

hemoltica autoinmunitaria (AIHA).
Figura 26-10 Enfermedad de la clula falciforme.
256
CAP. 26
Figura 26-11 Talasemia con los eritrocitos nucleados.
Figura 26-14
ciosa.
Linfocitos atpicos en la mononucleosis infec-
Figura 26-12 Clulas en forma de lgrima en mielofibrosis.
Figura 26-15 Cuerpo de Dble en neutrfilo.
Figura 26-13 Eosinfilos.
Figura 26-16 Granulacin txica en neutrfilos.
ria eritroide de la mdula. El cociente M:E se reduce, con

hiperplasia normoblstica y supresin de espacios grasos.
A partir de esta caracterstica compartida en comn, otras
pistas de diagnstico tiles se obtienen mejor al analizar la
morfologa del eritrocito perifrico, y de investigaciones suplementarias de laboratorio apropiadas para la hemlisis.
Estados aplsicos e hipoplsicos
Estos desrdenes se presentan con frecuencia con anemia,
leucopenia y trombocitopenia, por ejemplo, la pancitopenia. Las causas pueden variar pero son a menudo idiopticas. La pancitopenia, en algunos casos, puede llegar a
ser progresiva y grave. La anemia es muy normocrmica
y normoctica con reticulocitos indetectables en la sangre
perifrica. La mdula celular es deficiente con un predominio de espacios grasos. Puede detectarse una proporcin un
poco alta de linfocitos y de clulas plasmticas. La mdula
aspirada es acelular y el diagnstico definitivo se mejora al
realizar biopsia sea. La hipoplasia puede afectar slo a un
linaje, como en la aplasia del eritrocito puro cuando el linaje de los glbulos rojos tiene una alteracin predominante.
257
Policitemia
La policitemia proliferativa primaria (PRV o PPP) se caracteriza clnicamente por la hemoglobina alta, hematcrito
alto, cuenta y masa eritrocticas elevadas. Las cuentas de
leucocitos y plaquetas se elevan con frecuencia y la esplenomegalia es comn. La mdula sea muestra obliteracin de
espacios grasos con hiperplasia de los tres linajes celulares.
Pueden ocurrir tambin cambios cromosmicos. La transicin al estado mielofibrtico puede ocurrir hasta en un 15
a 20% de los casos. Cuando esto sucede la muestra obtenida por biopsia sea muestra fibrosis creciente de reticulina
y de la mdula. Los poiquilocitos en forma de lgrima y
las caractersticas leucoeritroblsticas aparecen en la sangre
perifrica. Tambin suele ocurrir transformacin terminal a
leucemia mieloide aguda o a un estado mielodisplsico.
La policitemia secundaria es una condicin que slo
afecta a las series de los eritrocitos sin que muestre leucocitosis o trombocitosis. Esto sucede principalmente en
enfermedades cardiovasculares crnicas o pulmonares,
causando disminucin en la saturacin del oxgeno que, a
su vez, produce policitemia compensatoria. La morfologa
de la hiperplasia eritroide predomina sin un aumento paralelo en otros linajes.
Sndromes mielodisplsicos
Es un grupo con condiciones morfolgicas heterogneas
que se producen por una alteracin adquirida de la clula
madre mieloide, que conducen a la proliferacin anormal
y a la maduracin desordenada de uno o ms linajes de
las clulas hematopoyticas. ste se caracteriza por una
hematopoyesis ineficaz, que causa citopenia sangunea
perifrica y una propensin para la transformacin leucmica. La clasificacin FAB (Francesa, Americana y Britnica) subdivide los sndromes de la mielodisplasia en
varios subgrupos.
La morfologa de la mdula muestra caractersticas displsicas que afectan a los tres linajes. La displasia eritroide
es notoria por una adquisicin de hemoglobina heterognea,
morfologa nuclear anormal e irregular, y puente citoplsmico. En un subgrupo conocido como anemia sideroblstica
en los precursores del eritrocito se observan grnulos siderticos anormales (con tincin azul de Prusia) dispuestos en
forma de anillo alrededor del ncleo del eritroblasto (vase
la fig. 26-27). Los cambios comunes del eritrocito perifrico incluyen anisocitosis, poiquilocitosis, microcitosis y, con
frecuencia, la presencia de hipocroma o un cuadro sanguneo dimrfico. Los cambios correspondientes en las series
del leucocito incluyen neutropenia y la presencia de neutrfilos hipogranulares en sangre perifrica, con los cambios
seudo-Pelger. Anormalidades similares pueden tambin detectarse en precursores granulocticos de la mdula sea.
Anemia por prdida sangunea o deficiencia de hierro

La prdida crnica de sangre produce anemia por deficiencia de hierro. Los eritrocitos perifricos muestran hipocroma y microcitosis con clulas elongadas en forma de
lpiz. La eritropoyesis en la mdula es hiperplsica. Los
eritroblastos son a menudo pequeos, la acumulacin de
hemoglobina es deficiente, el contorno es irregular y desigual (micronormoblastos).
La tincin con azul de Prusia no muestra ningn depsito de hierro. Una condicin llamada anemia de la enfermedad crnica (que ocurre por la inflamacin o surge de la
infeccin crnica) puede dar un cuadro sanguneo similar.
En estas condiciones la mdula exhibe un aumento en el
depsito de hierro. Sin embargo, los depsitos de hierro
intraeritroctico son reducidos.
Eritroleucemia
sta es una forma de leucemia mieloide aguda en la cual
el linaje eritroide afectado es predominante. Los precursores eritroides son en general marcadamente anormales
con lobulacin nuclear extraa. La eritropoyesis puede ser
tambin megaloblstica o sideroblstica. Una prominente
anormalidad del eritrocito aparece en la sangre perifrica,
incluyendo muchos eritrocitos circulantes nucleados.
258
CAP. 26
Anemia leucoeritroblstica (incluyendo mielofibrosis

idioptica)
Esta condicin se caracteriza por la presencia de los poiquilocitos con forma de lgrima, de eritrocitos nucleados y
de granulocitos tempranos en sangre perifrica. Este cuadro
puede presentarse cuando la mdula est infiltrada por un
tumor metastsico o con tejido extrao, o cuando la mdula
est fibrosada. La fibrosis prominente de la mdula puede
ser la manifestacin primaria de un estado mieloproliferativo. sta se designa como mielofibrosis idioptica primaria. La mdula muestra un aumento en la reticulina y en la
fibrosis extensiva. El aspirado de la mdula sea es difcil
o no sirve de ayuda en esta condicin. Una biopsia sea
siempre es segura y diagnstica.
Figura 26-17 Cuenta plaquetaria elevada en trombocitemia esencial con algunas formas grandes
Mielopoyesis y megacariopoyesis normales

Las clulas que pueden identificarse ms tempranamente
en las series granulocticas es el mieloblasto, que da lugar
a una secuencia de promielocitos, mielocitos, metamielocitos, clulas en banda y neutrfilos maduros (diagrama B).
Del promielocito hacia adelante, los grnulos especficos
(neutrfilos, eosinfilos, basfilos) surgen cada vez ms en
el citoplasma y se distinguen de los granulocitos neutrfilos comunes de los precursores eosinfilos y basfilos
menos comunes. Los monocitos y sus precursores, monoblastos y promonocitos slo estn presentes en cantidades
pequeas en la mdula normal. En estados anormales, notables en la leucemia, pueden llegar a ser muy evidentes.
Los megacariocitos se reconocen con facilidad en la
mdula por su gran tamao y por el ncleo lobular. Con
la maduracin el citoplasma se fragmenta y aparecen las
plaquetas. Los megacariocitos son ms pequeos y pueden
tener una apariencia muy similar a los mieloblastos.
Figura 26-18 Mdula sea megaloblstica
Desrdenes comunes que predominan

en la mielopoyesis y en la megacariopoyesis
Leucemia mieloide aguda
En la leucemia mieloide aguda la mdula sea se infiltra
con los mieloblastos primitivos que ascienden a ms de
30% del total de las lneas celulares mieloides. Los mieloblastos tambin estn presentes con frecuencia en la
sangre perifrica. Los mieloblastos son clulas primitivas
que muestran un patrn de cromatina nuclear abierta y un
nucleolo.
La granulacin citoplsmica y los bastoncitos de Auer
pueden o no estar presentes (figs. 26-19 y 26-20). La morfologa de la leucemia mieloide aguda est subdividida en
Figura 26-19 Leucemia mieloide aguda
259
rifrica se encuentren blastos circulantes. El anlisis de la

mdula sea es obligatorio y diagnstico.
Leucemia mieloide crnica
Figura 26-20 Leucemia promieloctica aguda
varios subtipos por el grupo FAB, dependiendo del grado de

diferenciacin y de la naturaleza de las clulas predominantes en la mdula. A veces los mieloblastos y los monoblastos
primitivos son difciles de diferenciarse con facilidad de los
linfoblastos con las tinciones de Romanowsky. Las tinciones
citoqumicas especiales se utilizan, a veces, en esta situacin
(cuadros 26-4 y 26-5). Recientemente, la citoqumica ya se
reemplaza por la inmunofenotipificacin (vase el cap. 32).
La leucemia mieloide aguda es una enfermedad maligna. Los cambios cromosmicos se observan con facilidad
en el 50% de los casos. Clnicamente, es frecuente que el
paciente se presente con anemia, un conteo plaquetario
bajo, sangrado e infeccin. Es normal que en la sangre pe-
Cuadro 26-4
ste es un desorden de la clula embrionaria que se caracteriza por mantener una cuenta leucoctica alta y la presencia
de precursores del granulocito, donde son muy notorios los
mielocitos y metamielocitos, junto con numerosos neutrfilos circulantes. La mdula muestra hipercelularidad con
hiperplasia granuloctica, y eosinofilia o basofilia frecuente
(fig. 26-21). La hiperplasia megacarioctica con una cuenta plaquetaria elevada tambin es comn. La alteracin
cromosmica distintiva es la presencia del cromosoma Ph
(Filadelfia). sta es una translocacin recproca entre segmentos del brazo largo del cromosoma 22 y del brazo largo
del cromosoma 9, t(9:22) (q34:q11). Lo anterior genera
la transferencia del oncogn abl de 9q a un sitio en 22q,
conocido como la regin del punto de ruptura (BCR). La
transformacin a leucemia aguda (AML, o se indica como
ALL) ocurre despus de un periodo variable (tambin se
le llama crisis blstica), siendo el intervalo medio de tres
a cuatro aos.
Cambios reactivos en granulocitos y monocitos
En estados infectivos e inflamatorios la cuenta de WBC se
incrementa cerca de 11 109/L.
Clasificacin Francesa, Americana, Britnica (FAB) de las leucemias mielocticas agudas
Categora
Criterio morfolgico (mdula sea)
M1
M2
Mieloblstica sin maduracin

Mieloblstica con maduracin
M3
Promieloctica
M4
Mielomonoctica
M4
Con eosinofilia
M5
Monoblstica, monoctica
M6
Eritroleucemia
M7
Megacarioctica
90% de clulas de la lnea mieloide son blastos

30 a 89% de las clulas de la lnea mieloide son blastos, >10% son promielocitos para PMN (con frecuencia displsica), <20% son monocitos
Promielocitos hipergranulares con grnulos semejantes a polvo, frecuentes
barras de Auer; el ncleo, bilobulado; la variante microgranular puede ocurrir
30 a 80% de clulas de la lnea mieloide son mieloblastos ms neutrfilos
madurando; >20% de clulas de la lnea mieloide son de linaje monoctico.
Adems, >5 000/L clulas monocticas en sangre perifrica
Como el anterior, con 5% de eosinfilos anormales que pueden tener ncleos
no segmentados y grnulos eosinoflicos y basoflicos grandes
>80% de clulas de la lnea mieloide son monoblastos, promonocitos o
monocitos; en M5a, 80% de clulas de la lnea mieloide son monoblastos;
en M5b, <80% son monoblastos, y el resto son promonocitos y monocitos
50% de las clulas de la mdula sea son precursores eritroides; 30% de
las clulas de la lnea mieloide no eritroides son blastos
Los blastos en mdula o sangre se identifican como linaje megacarioctico;
siempre que la mdula sea inaspirable, la biopsia muestra nmeros grandes
de blastos, con frecuencia con incrementos de megacariocitos y reticulina
PMN: Leucocitos polimorfonucleares.
260
CAP. 26
Cuadro 26-5
Tinciones especiales y ensayos usados en la clasificacin de las leucemias agudas

Tincin
Esterasas
Leucemia
Peroxidasa o
negro de Sudn B
Especficaa
No especficab
PASc
AML-M1
AML-M2
AML-M3
AML-M4
AML-M5
AML-M6
AML-M7
ALL
Neutrfilos normales
Monocitos normales
Linfocitos normales
+
+ a +++
+++
++ a +++
+
_
_
_
+++
+
_
+
+
+++
+ a +++
_
_
0 a ++
_
+++
_
_
_
_
_
+ a +++
+++
_
0 a ++ (moteado)d
_
_
+++
_
_
_
_
_
_
+++
++ (moteado)
+++
+++
+++
a-naftol AS-D
cloroacetato.
acetato esterasa y -naftil butirato esterasa.
ccido perydico de Schiff.
dMegacarioblastos negativos para -naftil butirato esterasa.
b-naftil
particular los que implican displasia de los tres linajes

celulares, muestran de manera progresiva un incremento
en la proporcin de blastos en la mdula, y finalmente
su transformacin en leucemia mieloide aguda. Una subcategora especial, que se conoce como leucemia mielomonoctica crnica (CMML), muestra caractersticas de
displasia y de una condicin mieloproliferativa. sta se
caracteriza por la presencia de monocitosis en sangre perifrica > 1 109/L. Los monocitos son a menudo anormales en la morfologa. Las caractersticas displsicas
relacionadas estn tambin presentes en los eritrocitos y
en otros leucocitos.
Figura 26-21 Leucemia mieloide crnica.
Los neutrfilos muestran un cambio a la izquierda con

granulacin txica. Algunos mielocitos circulantes y mieloblastos ocasionales tambin pueden observarse. La mdula muestra una hiperplasia mieloide con predominancia
de promielocitos y mielocitos.
El cuadro global suele, en casos graves, asemejarse a
un proceso leucmico, que a veces se denomina reaccin
leucemoide. Los antecedentes clnicos del paciente, inmunofenotipificacin, estudios cromosmicos y estudios
de clonalidad son necesarios para separar esta condicin de
la leucemia.
Estados mielodisplsicos
Este grupo heterogneo de desrdenes se menciona antes
(vase pg. 257). Los estados mielodisplsicos graves, en
Megacariocitos y desrdenes plaquetarios

Trombocitopenia
Una cuenta plaquetaria baja < 150 109/L puede ocurrir por un consumo perifrico intenso (inmunitario o no
inmunitario) o por una produccin medular reducida de
plaquetas, es decir, aplasia medular o infiltracin. En la
prpura trombocitopnica idioptica (IT), los anticuerpos
antiplaquetarios causan una destruccin reticuloendotelial
incrementada de plaquetas. En ITP u otros estados fsicos,
la mdula sea muestra un nmero normal a un incremento
de megacariocitos. Los desrdenes en la produccin plaquetaria se diagnostican mejor con la prueba sea. Aqu
los megacariocitos pueden estar ausentes, reducidos, o
mostrar morfologa displsica. El aspirado de mdula sea
tambin muestra la presencia de una infiltracin anormal.
261
Trombocitosis
Una cuenta plaquetaria persistente elevada sobre 1 000
109/L ocurre en la trombocitemia esencial (ET), una enfermedad mieloproliferativa que implica un predominio del
linaje megacarioctico. La presencia de plaquetas grandes
o incluso de fragmentos megacariocticos es tambin una
caracterstica de este desorden. La aspiracin de la mdula
sea puede ser difcil, pues suele coagularse con facilidad
antes de separarse. La biopsia de la mdula sea muestra hipercelularidad con un aumento visible en la cuenta
de megacariocitos, con frecuencia atpicos en la morfologa medular sea.
Tambin es comn un aumento relacionado con la reticulina o la fibrosis medular.
La trombocitosis reactiva (por infeccin o inflamacin)
suele producir, a veces, un cuadro similar y, ocasionalmente, dificultad para diferenciarla de la trombocitemia esencial slo por la morfologa (vase fig. 26-17).
Desrdenes comunes que afectan el linaje

de los linfocitos y de las clulas plasmticas
Leucemia linfoblstica aguda (ALL)
Es una enfermedad neoplsica monoclonal que surge de
los precursores linfoblsticos de los linfocitos. Explica cerca de 85% de todas las leucemias agudas por abajo de los
16 aos. Los linfoblastos anormales permanecen con frecuencia presentes en la sangre perifrica relacionada con
anemia y con una cuenta plaquetaria baja.
La mdula sea muestra infiltracin anormal con linfoblastos que tienen un cociente citoplsmico nuclear ms
alto que un mieloblasto tpico. El grupo FAB clasifica la
leucemia linfoblstica aguda en tres subtipos morfolgicos
(cuadro 26-6). Una distincin morfolgica pura entre un
linfoblasto y un mieloblasto indiferenciado puede ser difcil en algunos casos. La citometra de flujo y las tinciones
especiales son muy tiles en esta situacin (vanse cuadro
26-5 y fig. 26-22).
Linfocitos, clulas plasmticas y sus desrdenes

La variacin morfolgica en linfocitos y en clulas plasmticas cubre una gama mucho ms amplia que entre los
granulocitos. En las infecciones, en particular infecciones
virales, los linfocitos muestran caractersticas de activacin
o inmunoblsticas, con basofilia citoplsmica y el aspecto
de nucleolos.
Los nios tienen con frecuencia linfocitosis relativa,
que disminuye con la edad. Las clulas plasmticas tienen
un tpico citoplasma basoflico ms abundante, con un ncleo excntrico que muestra una cromatina agrupada (con
aspecto de cara de reloj).
La inclusin citoplsmica de inmunoglobulinas puede
verse en algunas ocasiones.
Cuadro 26-6
Figura 26-22 Leucemia linfoctica aguda.
Clasificacin FAB de la leucemia linfoctica aguda
Citologa
L1
L2
L3
Tamao de la clula
Cromatina nuclear
Forma nuclear
Nucleolos
Citoplasma
Basofilia citoplsmica
Incidencia en nios
Incidencia en adultos
Marcadores inmunolgicos
Pequeo
Homognea
Regular
Raros
Escaso
Moderada
85%
35%
B temprano o T tmico
Grande
Inconstante
Irregular
Presentes
Moderado
Inconstante
13%
63%
B temprano o T tmico
Grande, homogneo
Finamente revestida
De oval a redonda
1a3
Moderado, vacuolado
Intensa
2%
2%
B diferenciado (SIg positivo),
leucemia/linfoma tipo Burkitt
262
CAP. 26
Leucemia linfoctica crnica (CLL)

La enfermedad es rara antes que el individuo llegue a una
edad media; su incidencia aumenta con la edad. Es tpico
que se presente con linfocitosis perifrica, linfadenopata
y hepatoesplenomegalia. La sangre perifrica y la mdula sea muestran muchos linfocitos pequeos que parecen
maduros y monomrficos. Es una caracterstica que clulas en forma de mancha se encuentren presentes en este
desorden. Las clulas de la CLL tienen tambin un perfil
inmunofenotpico distintivo (fig. 26-23).
Figura 26-24 Clulas de carcinoma metastsico.
Figura 26-23 Leucemia linfoctica crnica.
Mieloma
Es una enfermedad que se caracteriza por el crecimiento
clonal y neoplsico de las clulas plasmticas. Los pacientes se presentan con paraprotena, hipercalcemia, lesiones
seas lticas, anemia e insuficiencia renal. La mdula sea,
que es diagnstica, muestra la presencia de clulas plasmticas anormales en una proporcin grande (>30%) (vase
fig. 26-8).
Figura 26-25 Parsitos del paludismo en sangre.
Linfomas
Los linfomas son un grupo complejo, heterogneo, de enfermedades neoplsicas clonales que surgen de los ganglios
linfticos, pero que involucran a la sangre perifrica o a la
mdula sea. El linfoma es una enfermedad con muchos
subtipos. Las clulas neoplsicas pueden ser pequeas y
parecer similares a linfocitos pequeos (linfoma de grado
bajo). Por otra parte, algunas clulas del linfoma tienen
morfologa similar a la de un blasto, grande, muy inmaduro
(linfoma de grado alto). La enfermedad de Hodgkin (HD),
la que se clasifica como un tipo de linfoma, se caracteriza
por la presencia de las clulas de Reed-Sternberg.
Figura 26-26 Microfilaria en sangre.
263
especial en presencia de un cuadro sanguneo leucoeritroblstico (fig. 26-24). Los parsitos del paludismo se detectan mejor en un frotis de sangre perifrica. El parsito
microfilaria tambin puede encontrarse en ella, aunque es
poco frecuente (figs. 26-25 y 26-26). La especializacin y
la confianza en la morfologa celular se adquieren con la
prctica. Para una revisin ms exhaustiva en este tema,
vase Hayhoe y Flemans, 1992.
Figura 26-27 Sideroblastos.
Clulas no hematopoyticas y parsitos

en sangre y mdula sea
Un aspirado y una biopsia de la mdula sea es una prueba til para detectar clulas metastsicas de carcinoma, en
Bennet JM, Catovsky D, Daniel MT et al. Proposal for classification of myelodysplastic syndrome. Br J Haematol 1982;
51: 189.
Bennet JM, Cartovsky D, Daniel MT et al. Proposal for classification of acute leukaemia. Br J Haematol 1976; 33: 451.
Hayhoe FGJ, Flemans RJ. A Colour Atlas of Haematological
Cytology, 3rd edn. 1992: Wolfe, London.
Holtbrand AV. Pettit JE. Clinical Haematology, 2nd edn. 1994:
Sandoz Atlas, London.
27
Principios de los contadores automatizados
de clulas sanguneas
Graham Martin
Introduccin
3. Cuantificacin de los reticulocitos y de los RBC nucleados.

4. Cuantificacin de los leucocitos (WBC).
El conteo sanguneo completo (FBC) hace grandes progresos a partir de una simple medicin de hemoglobina y de
componentes celulares en la sangre perifrica. El desarrollo y la adaptacin de diversas tecnologas ha generado una
gran variedad de parmetros celulares, algunos muy tiles;
otros todava tienen que demostrar su valor. En paralelo a
la tecnologa de medicin, se han desarrollado instrumentos automticos que pueden analizar cantidades muy pequeas de sangre usando el muestreo del tubo cerrado y
tener rendimientos muy altos.
Numerosas mediciones que se obtienen por instrumentos
automticos y semiautomticos son principalmente modificaciones de las tcnicas manuales originales; sin embargo, existen varias aplicaciones interesantes de las nuevas
tecnologas. Estos instrumentos son precisos y exactos, y
las mediciones son reproducibles. Hay diferentes fabricantes de instrumentos que emplean tecnologas y sistemas de
medicin similares que evalan el mismo parmetro con ligeras variantes. Existen ventajas y desventajas en todos los
sistemas y podra argumentarse que un grupo de problemas
puede intercambiarse por otro.
En este captulo se propone revisar las diferentes tecnologas y sus principios de operacin. Los principales parmetros son:
1. Cuantificacin de la hemoglobina (Hb).
2. Cuantificacin de los eritrocitos (RBC).
5. Cuantificacin plaquetaria.
Medicin de la Hb
La medicin de la Hb (fig. 27-1) se basa en la relacin lineal entre la cantidad de luz que se absorbe en una banda
de absorcin particular y la concentracin de la entidad de
absorcin en la muestra (ley de Beer) (Skoog DA, West
DM, 1965).
La mayor parte de los contadores automticos emplea el
mtodo de cianometahemoglobina que lee la absorbancia a
longitudes de onda de 525 o 540 nm. Los sistemas Sysmex
utilizan lauril sulfato de sodio, con la ventaja de que se
elimina el cianuro en los desechos del analizador.
Mediciones de los eritrocitos

Los eritrocitos pueden contarse con la impedancia de la
abertura, tcnicas que dispersan la luz, usando lser LED o
tungsteno o una combinacin de las dos tecnologas.
Impedancia de la abertura
Esta tcnica la patent, en 1956, Wallace Coulter y se conoce como el principio de Coulter (fig. 27-2). Se utiliza
266
CAP. 27
PRINCIPIOS DE LOS CONTADORES AUTOMATIZADOS DE CLULAS SANGUNEAS
Amplificador
Derivacin de la Hb
C Bath
Absorbancia = log10 (VR/Vs),

donde VR = el voltaje de referencia
y Vs = el voltaje de la muestra
Fuente de luz
(lser, LED o tungsteno)
Muestra
el cambio en la resistencia crea un solo pulso alto o un pulso de doble pico. Las correcciones estadsticas se aplican
en el software del analizador para corregir esto. Para evitar la recirculacin de clulas alrededor de la abertura, que
produzcan mediciones falsas de cantidades y de volumen,
las clulas se inyectan de manera convencional en el compartimiento de la abertura justo en el centro de una corriente de un fluido envolvente o, una vez contadas, se remueven
de la zona de deteccin con un lquido de arrastre.
Detector
Figura 27-1 Cuantificacin de Hb.
para contar RBC, WBC y plaquetas. Un flujo de corriente

elctrica se establece a travs de una abertura de dimensiones
conocidas. Cuando una clula o una partcula pasa a travs
de la abertura, la clula o la partcula impide el flujo de la
corriente y causa un impulso en el voltaje. El voltaje primero
se eleva y despus cae por debajo de cierto umbral, indicando
que una clula o una partcula pasa por la zona de deteccin.
Las clulas y las partculas se cuentan registrando el nmero
de pulsos de voltaje que ocurren durante un intervalo de medicin especfico. El volumen celular se determina midiendo
la magnitud del pulso que se genera. Se fijan los umbrales o
entradas electrnicas, permitiendo al analizador discriminar
los pulsos de Cuantificaciones de los eritrocitos de los pulsos
ms pequeos de las plaquetas, detritus y del ruido elctrico.
Coincidencia
La inexactitud puede introducirse por coincidencia. Si dos
o ms clulas entran en la abertura de la zona de deteccin,
Tcnicas de dispersin de luz

Con la dispersin de luz se estima el tamao aproximado
de la clula con base en la dispersin frontal, la cual es
sobre todo una medida ms del dimetro transversal. La
cantidad de luz que se dispersa es proporcional al rea superficial y, por tanto, al volumen de la clula. Los lser
tienen caractersticas pticas superiores, al compararse con
las fuentes luminosas de tungsteno, y pueden colocarse detectores para recolectar la luz frontal dispersada en ngulo
amplio y estrecho (fig. 27-3).
La luz lser se utiliza para medir el volumen y la concentracin celular de la Hb en los instrumentos Bayer. La
cantidad de luz dispersada en ngulo bajo (2 a 3) depende
del tamao del RBC, y la cantidad dispersada en ngulo alto (5 a 15) se relaciona con el ndice de refraccin
de la clula. De la manera como se proyecten hacia el
lser, las clulas no esfricas como plaquetas y las cuantificaciones de los eritrocitos pueden dar seales muy
diferentes hacia los detectores. Bayer ha superado este
problema con una tcnica que se conoce como generacin
de esfera isovolumtrica. El dodecil sulfato de sodio y el
Figura 27-2 Principio de Coulter.
267
MEDICIN DE LOS RETICULOCITOS Y RBC NUCLEADOS
Figura 27-3 Sistema ptico de dispersin de luz lser usado por los instrumentos Sysmex.
glutaraldehdo en el reactivo para el eritrocito producen

fijacin parcial y la formacin esfrica a partir de los eritrocitos y de las plaquetas, eliminando resultados errneos. Permite esto medir con exactitud el porcentaje de
las clulas hipocrmicas?; no slo eso, ha demostrado ser
un parmetro til para perfeccionar la terapia con eritropoyetina y hierro (Richardson, et al., 2001).
Medicin de los reticulocitos y RBC

nucleados
Conteo de los reticulocitos
Todos los fabricantes de contadores celulares proporcionan el anlisis del reticulocito en sus instrumentos. Algunos sistemas miden reticulocitos y los parmetros relacionados usando los colorantes fluorescentes para cido
ribonucleico con luz lser (referencias de ALM en Hp90
Takubo et al., 1989; Tichelli et al., 1990; Davis et al.,
1996; Kim et al., 2003). Otros sistemas utilizan colorantes
bsicos supravitales que producen precipitacin y coloracin de la sustancia reticular, la cual se mide, en este
caso, por absorbancia y dispersin de la luz (referencias
de ALM en Hp90 Buttarello et al., 1995, 1996, 1997; Van
den Bossche J et al., 2001; Rudenski, 1997; Wysocka J,
Turowski D, 2000).
Cuadro 27-1 Tcnicas de conteo de reticulocitos
Compaa Analizador
Mtodo
Tincin del
RNA
Abbott
Cell-Dyn 4000 + Fluorescencia CD4K530

Sapphire
ABX
ABX Pentra 120 Fluorescencia Naranja
de tiazol
Bayer
ADVIA 120 +
Dispersin y Oxacina 750
2120
absorcin
en clulas
de luz
esfricas
Beckman GEN-S +
Dispersin
Nuevo azul
Coulter
LH750
de luz
de metileno
en clulas
esfricas
Sysmex
XE 2100
Fluorescencia Auramina O
Resumen de los mtodos actuales

utilizados en los analizadores
Tambin es posible medir la madurez del reticulocito, debido
al hecho de que los reticulocitos inmaduros tienen una proporcin ms grande de RNA, y por tanto, se tien con ms
intensidad o reflejan una fluorescencia mayor. La dispersin
de la luz monocromtica mide el volumen graficado contra
la absorcin y se usa en el Advia para proporcionar un ndice
de la maduracin del reticulocito y su contenido de Hb.
268
CAP. 27
Los fabricantes del instrumento adoptan aproximaciones
que difieren para distinguir a los RBC nucleados. Los ncleos se cuentan usando combinaciones de dispersin de la
luz e impedancia despus de que el citoplasma del RBC ha
sido eliminado (Beckman Coulter). El conteo se hace en el
canal de WBC y el WBC total se corrige por la presencia
de NuRBC. En los analizadores Sysmex, las cuentas de
NuRBC se determinan por medio de citometra de flujo y
Cuadro 27-2
luz lser. La muestra se aspira y se mezcla con una tincin

para RNA/DNA. En el conteo NucRBC usa fluorescencia
lateral, dando informacin del RNA/DNA y de la dispersin frontal, una medida del tamao celular.
En los analizadores la cuenta de NucRBC se expresa
con NucRBC/100 WBC, a partir de la frmula:
%NucRBC=
NucRBC 100
NucRBC WBC
Tecnologas de los analizadores comunes
Compaa
Analizador
Tecnologa
Abbott
Cell-Dyn 3500
ABX
Cell-Dyn 4000 +
Sapphire
Pentra 60
Dispersin frontal de la luz

Dispersin de la luz en ngulo estrecho
Dispersin ortogonal de la luz
Dispersin de luz polarizada
Todo lo anterior, ms cuenta de RBC posterior a la unin con el colorante
fluorescente
Citoqumica
Impedancia por flujo enfocado
Absorbancia de luz
Citometra de flujo
Citoqumica
Impedancia-citometra de flujo enfocada y absorbancia
Absorcin de luz posterior a la tincin de los eosinfilos
Impedancia posterior al desprendimiento preferencial del citoplasma
de los basfilos a un pH bajo
Lser ion-argn
Citoqumica
Impedancia por flujo enfocado
Absorbancia de luz
Citometra de flujo
Dispersin de la luz posterior a la reaccin de la peroxidasa
Absorbancia de luz posterior a la reaccin de la peroxidasa
Dispersin de la luz posterior al desprendimiento del citoplasma
de las clulas, excepto basfilos, por un agente ltico a un pH bajo
Medicin de la impedancia posterior a la lisis diferencial
Mediciones de impedancia y absorbancia citoqumica
Impedancia con corriente electromagntica de baja frecuencia
Conductibilidad con corriente electromagntica de baja frecuencia
Dispersin de luz lser
Impedancia con corriente electromagntica de radiofrecuencia
Impedancia con corriente electromagntica de baja frecuencia a pH bajo
y pH alto
Impedancia con corriente electromagntica de radiofrecuencia
Dispersin frontal de la luz
Dispersin lateral de la luz
Intensidad de la reaccin de fluorescencia posterior a la tincin fluorescente
Pentra 120 Retic
Bayer
Advia 60
ADVIA 120, 2120,

H1, H2 y H3
Beckman Coulter
AcT 5diff
GEN-S + LH750
Sysmex
SE 9000
XE 2100
MEDICIONES DE LOS LEUCOCITOS
269
Mediciones de los leucocitos

Los leucocitos pueden contarse y diferenciarse dentro de
un amplio nmero de categoras por diversas tecnologas.
Existen ventajas y desventajas en todas. El desarrollo de
sistemas de conteo basado en un lquido vehculo, que permite el pasaje de las clulas a travs de la zona de deteccin, condujo al anlisis multiparmetro en la misma clula
combinando las seales de varios sensores. Segn el fabricante, la zona de deteccin puede ser: ptica, de conductancia, de impedancia o una combinacin de todas; y los
sensores colocarse para observar la dispersin frontal de la
luz, la dispersin lateral, la dispersin en ngulo estrecho
o amplio, la dispersin de la luz polarizada o la fluorescencia. Las tecnologas de cada una de las aplicaciones de los
instrumentos actuales se resumen en el cuadro 27-2.
Impedancia de la abertura
Al principio cuando el citoplasma es parcialmente eliminado
en los leucocitos, la impedancia de la abertura (fig. 27-4),
como se describi antes, dar una medicin del tamao
NUM. Linfos Monos
REL. 50-90 fl 90-160 fl
WBC 50
100
Granulocitos
160-450 fl
200
300
400
fl
Figura 27-4 Una presentacin del histograma del canal 256 de

la poblacin celular de WBC entre 35 y 450 fl, usando slo datos
de impedancia de la abertura. Reproducida con el permiso de la
compaa Beckman Coulter
del ncleo y de la granularidad citoplsmica. Usando este

mtodo slo es posible cuantificar linfocitos, monocitos y
granulocitos.
Impedancia de la abertura y dispersin de luz
Los instrumentos Beckman Coulter realizan la diferenciacin de cinco poblaciones con tres mediciones simultneas
sobre cada clula: volumen (v), usando impedancia de la
abertura estndar; conductividad (c), empleando ondas
electromagnticas de alta frecuencia; determinacin de la
complejidad celular y dispersin de luz (s), midiendo las caractersticas de la superficie celular y la lobularidad de cada
clula (anlisis VCS tridimensional grupal, fig. 27-5).
Los algoritmos adaptables de anlisis grupal desplazan en gran parte el uso temprano de discriminadores fijos
Figura 27-5 Anlisis VCS tridimensional grupal. Reproducida

con el permiso de la compaa Beckman Coulter.
como demarcadores entre poblaciones celulares. El desarrollo de sistemas de asistencia diagnstica se considera
como otra mejora en la capacidad del laboratorio para interpretar hallazgos diferenciales electrnicos.
Ambos sistemas diferenciales de tres y cinco partes estn
provistos con algoritmos indicadores, alertando al usuario
de posibles alteraciones morfolgicas o de otro tipo, requiriendo la revisin de los datos o de alguna otra forma de
intervencin, como una revisin de la morfologa.
Citometra de flujo y dispersin de luz
Los conteos de WBC y los diferenciales en los instrumentos Sysmex XE se determinan usando citometra de flujo
combinada con un lser semiconductor. Se obtiene informacin celular usando la dispersin de luz frontal para
determinar el volumen celular; la dispersin de luz lateral
para evaluar la estructura interna de la clula, y la luz fluorescente lateral para dar informacin sobre los cidos nucleicos RNA/DNA. Aspirando la muestra de sangre en seis
canales separados con diferentes reactivos, puede aplicarse
un anlisis complejo del grupo para separar todas las variantes normales y anormales de la clula. Los algoritmos
de aprendizaje competitivos permiten la adaptacin ptima
a las diferencias biolgicas entre las muestras, incluyendo
las clulas extremadamente alteradas.
El colorante polimetina se combina con los cidos nucleicos (DNA y RNA nucleares y en organelos citoplsmicos).
El Sysmex XE tiene la capacidad de contar reticulocitos,
270
CAP. 27
Figura 27-6 La dispersin frontal se grafica contra la dispersin lateral. Reproducida con el permiso de Sysmex UK Ltd.
de reconocer las plaquetas que contienen RNA, de reconocer y de contar los RBC nucleados y de distinguir clulas con caractersticas de clulas progenitoras hematopoyticas (HPC), que pueden utilizarse para predecir un aumento de clulas CD34.
Citoqumica y dispersin de luz
Las series de instrumentos de la compaa Bayer derivan un
diferencial a partir de dos canales. El canal de la peroxidasa
utiliza una reaccin citoqumica en la cual la peroxidasa de
neutrfilos, eosinfilos y monocitos acta sobre un sustrato,
4-cloro-l-naftol, para generar una reaccin que se transforma en un producto de color negro.
La dispersin de luz, que es proporcional al tamao de
la clula, se grafica contra la absorbancia de la luz, que es
proporcional a la intensidad de la reaccin de la peroxidasa. Los neutrfilos, los eosinfilos, los monocitos y los
linfocitos caen en cuatro grupos, separados por umbrales
electrnicos. Debido a que los basfilos caen en la regin
del linfocito, se separan de otras clulas en un canal aparte
con base en su resistencia a la eliminacin cida del citoplasma celular. Los basfilos que son ms grandes que
otras clulas se clasifican por dispersin frontal. Este canal tambin se emplea para detectar blastos. La dispersin
frontal se grafica contra la dispersin de luz de ngulo alto
para medir la densidad y la lobulacin nuclear (fig. 27-6).
Conteo plaquetario
Desde que se identificaron a mediados del siglo xix como
el polvo sanguneo, las plaquetas han presentado un desa-
fo en trminos de exactitud de las tcnicas de conteo. Las

terapias modernas requieren exactitud, no slo en el rango
clnico crtico, sino tambin en la capacidad para diferenciar eritrocitos pequeos y plaquetas grandes. Las plaquetas
pueden contarse y clasificarse por tamao con impedancia,
la dispersin de la luz, una combinacin de las dos y la citometra de flujo que usa la fluorescencia (fig. 27-7).
Impedancia
Los instrumentos de la compaa Beckman Coulter utilizan
impedancia para obtener una cuenta plaquetaria, que se deriva del nmero de clulas bajo la curva (fig. 27-8). Usando software apropiado para la curva, la exactitud de esta
cuenta se mejora cuando las plaquetas presentes superan
el volumen de los 20 femtolitros (fl). La cuenta plaquetaria
fuera del lmite de 35 ft se ampla hasta 70 fl.
Conteo plaquetario ptico

La gama de instrumentos Advia de la compaa Bayer
combina las seales de dispersin en ngulo alto (5 a 15)
y en ngulo bajo (2 a 3) para cada clula. stas se transforman en volumen que se grafica sobre un eje vertical y los
valores del ndice de refraccin sobre el eje horizontal para
dar un citograma de la dispersin plaquetaria (fig. 27-9).
Las lneas curvas representan una cuadrcula del ndice de
refraccin variante a lo largo de la cual las plaquetas caen.
Tambin se grafica el ndice de refraccin contra el rango
del volumen plaquetario, pueden separarse las macroplaquetas y los eritrocitos.
271
Figura 27-7 Fluorescencia graficada contra dispersin lateral. Reproducida con permiso de Sysmex UK Ltd.
Combinacin de impedancia y conteo ptico
Cuenta de
partcula
RBC
PLT
10
20
Volumen celular (fl)
Figura 27-8 Grfica de Coulter que muestra la distribucin del

tamao celular de las plaquetas (PLT) y de los eritrocitos (RBC).
La variedad de instrumentos Sysmex XE emplea un canal de impedancia cuando la cuenta y un canal de fluorescencia fallan en situaciones anormales. Las mediciones
plaquetarias se realizan usando la dispersin frontal para
determinar el tamao, la dispersin lateral que considera
la estructura interna y la fluorescente que mide los cidos
nucleicos RNA/DNA teidos.
Cuentas inmunoplaquetarias
De esta manera por conteo ptico y por impedancia, el CellDyn 4000 y el Sapphire cuentan las plaquetas midiendo la
fluorescencia verde del CD61. Un anticuerpo monoclonal,
presente en uno de los reactivos, se une al antgeno CD61
localizado en todas las plaquetas normales. El isotiocianato
de fluorescena (FITC) es el colorante que se emplea, que
fluorece cuando se excita a una longitud de onda de 488
nm. Esta tcnica es til cuando se observan una gran cantidad de fragmentos de RBC o de WBC.
Figura 27-9 Citograma de la dispersin plaquetaria. 1, plaquetas; 2, plaquetas grandes; 3, RBC; 4, fragmentos RBC; 5.
detritus; 6, fantasmas de eritrocitos. Reproducida con permiso
de Bayer plc.
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272
CAP. 27
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28
Mtodos para la identificacin
de hemoglobinopatas
Nick Jackson y Anne Sermon
Introduccin
Las hemoglobinopatas y las talasemias son los trastornos
genticos heredados ms comunes. Los defectos moleculares se localizan en los genes que codifican para la globina
y afectan la sntesis de hemoglobina (Hb) en el eritrocito
en desarrollo. Clnicamente se manifiestan como anemia
hemoltica y la herencia es del tipo autosmica recesiva o
codominante. Por lo general, las mutaciones que generan
una hemoglobinopata son diversas; el estudio y la caracterizacin del gen humano de la hemoglobina pueden utilizarse como ejemplo para mostrar la mayor parte de los
tipos conocidos de mutacin gentica. Los defectos clnicos significativos se encuentran en los genes y (localizados en los cromosomas 16 y 11, respectivamente), pero
las mutaciones que es posible identificar en cualesquiera
de los genes que codifican para la globina generan alteraciones cualitativas y cuantitativas en la sntesis de Hb. Las
hemoglobinopatas producen una variante de Hb estructural anormal; las talasemias surgen de una reduccin en
la tasa de sntesis en uno o ms de los tipos de cadenas de
globina.
Las mutaciones puntuales que conducen a las sustituciones de aminocido o a la terminacin anormal de la
transcripcin del gen explican la mayor parte de los defectos del gen que codifica para la globina y son tpicas de
las hemoglobinopatas y de la -talasemia. La supresin
del gen es la causa comn de la - y -talasemia. En la
actualidad hay ms de 1 000 variantes identificadas del gen
para la globina, que pueden dividirse ampliamente dentro
de los grupos siguientes: a) clnicamente silenciosas (la

mayor parte); b) hemoglobinas talasmicas; c) hemoglobinas inestables; d) hemoglobinas con afinidad alterada para
el oxgeno; e) efectos atpicos diversos, por ejemplo, de la
hemoglobina falciforme (HbS).
La HbS es la variante clnica significativa ms comn
de la Hb, y en el estado homocigtico (HbSS) o en combinacin con la HbC o el rasgo -talasemia produce problemas graves de salud. La isquemia del tejido, secundaria a la
aglomeracin de clulas falciformes aguda resulta en crisis
dolorosas y con un potencial fatal. La HbS es la ms comn
en las poblaciones oriundas del sub-Sahara, frica, pero
tambin se encuentra en gente de India, de Arabia Saudita y
de la cuenca del Mediterrneo. Las talasemias se localizan
en poblaciones de todas las reas tropicales del mundo y del
Mediterrneo. El tamizaje se dirige por lo general a aquellas
poblaciones tnicas en riesgo de portar estos genes, pero con
el aumento del mestizaje tnico el tamizaje puede llegar a
aplicarse en forma universal para no omitir algunos casos o
individuos portadores.
Tcnicas de tamizaje
La metodologa actual de tamizaje permite la deteccin rpida y la identificacin exacta de los trastornos clnicos significativos de la hemoglobina, as como sus estados heterocigticos. Estas tcnicas tambin son confiables para aplicarse
en el tamizaje de recin nacidos en la deteccin de una enfermedad que no se sospecha, as como la condicin del individuo portador. Es posible determinar el riesgo gentico
274
CAP. 28
MTODOS PARA LA IDENTIFICACIN DE HEMOGLOBINOPATAS
a travs de la identificacin de los portadores y ofrecer el

diagnstico prenatal del feto. Se establecen polticas en la
mayor parte de los laboratorios para el tamizaje de adultos
y recin nacidos. Las tcnicas para el diagnstico prenatal
de fetos se basan en el anlisis de DNA y es una aplicacin
comn en centros nacionales de salud.
Para una interpretacin integral de los resultados del
anlisis de Hb en un individuo, la informacin siguiente
debe estar disponible: edad, sexo, origen tnico, condicin
clnica actual (p. ej., si hay embarazo o no) y conteo sanguneo completo (FBC). Para aquellos con microcitosis del
eritrocito (MCV < 80 fl), una medida confiable del estado
de hierro se requiere (p. ej., de la ferritina srica) para excluir deficiencia de hierro. Las muestras de los pacientes
sealados para el tamizaje deben entonces canalizarse a
travs de un protocolo flexible de las investigaciones de
laboratorio, que puede incluir la cromatografa lquida
de alto rendimiento (HPLC) o la electroforesis, la solubilidad falciforme y la medicin de los niveles de HbA2
y de HbF. El diagnstico de la mayor parte de los estados del portador comn y de la enfermedad, es decir - y
-talasemia, HbS, HbC, HbD y HbE, puede conseguirse
comnmente con la evaluacin de estos parmetros.
Los laboratorios que manejan una pequea cantidad de
muestras pueden utilizar la electroforesis de Hb y la estimacin de HbA2 por microcolumna como sus herramientas
primarias del tamizaje. Sin embargo, con polticas cada vez
ms amplias de tamizaje la mayor parte de los laboratorios
ahora tamizan muestras por HPLC. La electroforesis de Hb
y otras tcnicas se utilizan para confirmar la identidad de
las hemoglobinas variantes que se detectan por HPLC. La
prueba de la solubilidad de la hemoglobina falciforme se
emplea principalmente para la exclusin de los desrdenes
de la clula falciforme antes de la ciruga de urgencia en las
poblaciones en riesgo.
Diagnstico de laboratorio
de hemoglobinopatas y de talasemias
Conteo sanguneo completo, frotis sanguneo y ferritina
En la mayor parte de los estados de individuo portador con
hemoglobinopata estructural el FBC no muestra alteracin,
aunque el frotis sanguneo muestre ciertas caractersticas
(p. ej., las clulas en diana en los rasgos de HbC y de
HbE). El punteado basoflico se halla en el rasgo -talasemia y las clulas contradas en forma irregular en el rasgo
-talasemia. Los ndices de eritrocitos son indicadores importantes en la evaluacin para el rasgo de talasemia, que se
caracteriza por microcitosis y una Hb normal o casi normal.
Un volumen celular medio (MCV) < 80 fl o una Hb celular media (MCH) < 27 pg indican una posible talasemia,
en particular cuando el recuento de RBC es normal o elevado (> 5 1012/L) y la ferritina srica es normal (> 30
g/L). Sin embargo, estos parmetros pueden mostrar una
variacin leve de un laboratorio a otro, segn el mtodo de
medicin automtica y de los rangos normales que asigna
el laboratorio. En el FBC de los pacientes que son sintomticos (p. ej., la -talasemia mayor, HbSS) se observan caractersticas de la anemia en grados variables y alteraciones
morfolgicas ms graves de los eritrocitos. La policitemia
suele encontrarse en los casos de hemoglobinas con afinidad elevada por el oxgeno.
Deteccin, identificacin y cuantificacin

de hemoglobinopatas
Los principios de la deteccin, identificacin y cuantificacin de hemoglobinas se basan en la separacin fsica de
las hemoglobinas en solucin, dependiendo de su carga.
Las sustituciones del aminocido en la mayor parte de las
variantes introducen un cambio en la carga superficial total
esencial para su deteccin. Una limitacin de estas tcnicas,
por tanto, ocurre porque las variantes de la Hb no pueden
distinguirse de la HbA si tienen la misma carga superficial.
Para la interpretacin correcta de todas estas pruebas, es
importante asegurarse de que la muestra no se obtenga en
los tres meses posteriores a una transfusin sangunea.
Deteccin e identificacin
Electroforesis
La metodologa bsica de tamizaje descansa en la migracin de una molcula cargada (Hb) en un campo elctrico
hacia un ctodo o un nodo. La fuerza y la polaridad de la
carga se determinan por el pH del ambiente amortiguado.
La tasa de migracin la gobierna el tamao del poro del
medio de la matriz donde se realiza la electroforesis y la
magnitud de la carga sobre la molcula.
El acetato de celulosa es una matriz de uso general barato
y con una vida til indefinida; el agar es una alternativa muy
empleada. El pH para el control preliminar es alcalino, fijo
a un pH 8.4 a 8.9 con amortiguadores Tris-borato EDTA o
Tris-barbitona. A este pH la mayor parte de las hemoglobinas tienen carga negativa y migran del ctodo hacia el nodo.
En estas condiciones, muchas variantes, aparte de la HbA,
hacen visible la deteccin, es decir, son ms obvias tindolas con un colorante especfico para protena, por ejemplo,
el Ponceau S o el negro de Amido. El patrn de migracin,
marcado por controles de referencia, puede entonces compararse con un mapa de variantes de hemoglobina para dar
con la identificacin probable. Las tcnicas de pH fijas son
DETECCIN, IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE HEMOGLOBINOPATAS
relativamente insensibles a la separacin discreta de los

grupos de variantes con cargas similares. A un pH de 8.4,
dos grupos de las variantes comunes comigrantes: HbS,
HbD y HbG; y HbC, HbE y HbO Arab. Esto hace imposible la distincin entre las variantes de hemoglobina de cada
grupo sin investigacin adicional. Un cambio diferencial
en la carga, en las hemoglobinas, se induce cambiando el
amortiguador a cido (p. ej., a un pH de 6.3, en agar citrato), el cual altera la tasa y el patrn caracterstico de migracin. Las movilidades relativas de la variante Hb a un pH
cido y alcalino se refieren en forma cruzada sobre mapas
de las hemoglobinas variantes y esto permite su identificacin segura, por ejemplo, a un pH de 6.3, la HbC llega a
diferenciarse de la HbE y de la HbO Arab, y HbS se separa
de la HbD y de la HbG. La identidad de algunas variantes
permanece sin resolver, y puede establecerse con anlisis
adicional por diversas tcnicas, por ejemplo, el isoelectroenfoque (IEF) o HPLC. Algunos casos raros requieren la
identificacin de la mutacin a nivel molecular.
Solubilidad de la hemoglobina falciforme

La prueba de solubilidad de la hemoglobina falciforme es
simple, rpida para la presencia de HbS. Un tamizaje positivo no distingue entre los homocigotos y los heterocigotos y
debe tener una sensibilidad debajo de 20% de concentracin
aproximada de HbS. Esta prueba es ms til cuando se requiere un examen rpido, por ejemplo, antes del anestsico
general en un paciente de un grupo tnico en riesgo cuyo
estado de hemoglobinopata es desconocido.
La deteccin de HbS se basa en su insolubilidad relativa
cuando se desoxigena y en la deformacin posterior de la
membrana del RBC en la forma clsica de hoz. En el tubo de
ensayo, la desoxigenacin se induce con ditionito de sodio
con trazas de saponina. Si la HbS est presente, entonces la
forma desoxi se polimeriza para formar cristales tactoides
clsicos. Una prueba positiva conserva un aspecto opaco
(debido a los RBC falciformes en suspensin), mientras que
la desoxihemoglobina en muestras negativas da una solucin
clara de hemoglobina. Hay otras seis variantes raras que tambin tienen caractersticas de falciformacin. Este examen
no es exclusivo para HbS, sino ms bien para hemoglobinas
falciformes. La identidad debe confirmarse siempre por
electroforesis. Inversamente, una banda de la variante que
emigra en la posicin de la HbS debe confirmarse siempre
con una prueba de solubilidad falciforme.
Este examen es insensible a niveles muy bajos de HbS,
como en aquellos encontrados en los recin nacidos, y por
tanto sin utilidad alguna como parte del examen neonatal.
Sin embargo, es posible emplearla para detectar el gen HbS
en individuos donde no est disponible la electroforesis
275
como primera lnea de investigacin, por ejemplo, en pases

del Tercer Mundo.
Isoelectroenfoque (IEF)
El isoelectroenfoque es una forma muy sensible y mucho
ms sofisticada de electroforesis que se basa en la separacin de hemoglobinas segn su punto isoelctrico. Los anfolitos de bajo peso molecular portadores con un rango de
puntos isoelctricos se incorporan en el gel o el agar de poliacrilamida para crear un gradiente del pH. Para los propsitos de separacin de Hb, se utiliza un rango del pH de 5.5 a
8.5. Como las hemoglobinas emigran a travs del gradiente,
llegan a ser neutrales en su punto isoelctrico (pI) y se detiene la migracin, es decir se enfocan en su pI. Puesto que
el pI es especfico en la carga superficial en una molcula,
incluso las hemoglobinas con una carga diferenciada muy
pequea se separan en forma discreta. En geles prefabricados, las hemoglobinas de manera reproducible se enfocan
en el mismo lugar, para obtener, de tal modo, mayor certeza
de la identificacin en una sola separacin (fig. 28-1). Debido a la sensibilidad elevada del IEF, aun las variantes que
estn presentes en concentraciones muy pequeas pueden
determinarse, por ejemplo, con Constant Spring, variantes
A2, H, de Bart. Esta tcnica, por tanto, tambin es conveniente para efectuar el tamizaje sanguneo a partir de sangre
del cordn umbilical de los recin nacidos.
Cuantificacin
La cuantificacin de las fracciones de la Hb se usa principalmente en la distincin de los rasgos - y -talasemia en
gente con microcitosis H de RBC y estado normal de hierro.
Esto tambin tiene valor en: a) la caracterizacin adicional
de algunas variantes, por ejemplo, en las variantes de la cadena , HbE; b) el diagnstico de sndromes compuestos de
hemoglobinopatas; c) el diagnstico de los desrdenes de la
persistencia hereditaria de la Hb fetal (HPFH), y d) la supervisin de los regmenes de transfusin en desrdenes de las
clulas falciformes. La estimacin de las fracciones de Hb
puede conseguirse con una variedad de tcnicas, incluyendo
la separacin de la variante por electroforesis, seguida por
elucin, cromatografa en microcolumna, HPLC, inmunodifusin radial y ELISA.
Cromatografa en microcolumna
La cromatografa en microcolumna se emplea mucho para
determinar el porcentaje de HbA2 en la deteccin del rasgo
-talasemia, pero puede tambin modificarse para la cuan-
276
CAP. 28
Figura 28-1 Representacin diagramtica del isoelectroenfoque en capa fina de hemoglobinas normales y algunas variantes estructurales de la hemoglobina. IB1 e IB2 son hbridos ferrosos-frricos de la HbA. (Cortesa del Dr. Yves Beuzarda).
tificacin de fracciones importantes, por ejemplo, de HbS.

El principio de separacin depende de la adsorcin y la
unin de las molculas de Hb cargadas a una resina con una
cadena lateral polar. Durante la adicin de un amortiguador
desarrollador a la columna, a la protena ligada se le desplaza con iones cargados ms fuertes del amortiguador, de
ah el trmino cromatografa de intercambio inico. Las

hemoglobinas que se desplazan se lavan despus a partir
de la resina en la elucin. La estimacin del porcentaje de
concentracin de la fraccin entonces se mide contra un
total diluido por densitometra ptica. La celulosa DEAE
(dietilaminoetil) es una resina de intercambio de aniones,
DETECCIN, IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE HEMOGLOBINOPATAS
que se acompaa con un amortiguador glicina-KCN o TrisHCl, pH de 8.3.

El rango normal para la HbA2 es de 1.8 a 3.5%, con
niveles elevados (hasta cerca de 7.5%) indicando el rasgo
-talasemia. Los niveles fronterizos (3.3 a 3.7%) necesitan interpretacin cuidadosa, y posiblemente un anlisis
del DNA, para confirmar normalidad o una talasemia (+)
leve. En el rasgo -talasemia, el nivel de HbA2 puede ser
normal o bajo. Los niveles reducidos de HbA2 tambin se
encuentran en la deficiencia de hierro grave, enfermedad
de HbH y -talasemia.
Medicin de HbF
La HbF abarca < 1% en adultos normales, y se incrementa
un poco en cerca de la mitad de los portadores de -talasemia. La HPFH y la -talasemia producen niveles significativos elevados de HbF y se distinguen por mantener
normales, en lugar de reducidos, el MCV y el MCH respectivos. La prueba Kleihauer es probable que tambin sea
til, pues algunos tipos de HPFH son pancelulares (con
una distribucin uniforme de HbF en los RBC), mientras
que otros son heterocelulares (con una distribucin heterognea de HbF en los RBC). En -talasemia, la distribucin tpica es heterocelular. Sin embargo, puede ser
necesario realizar un anlisis de DNA para estar seguro de
esta distincin, en especial si la -talasemia es una condicin coexistente posible que causa un MCV bajo.
Un mtodo de uso frecuente en el anlisis de HbF lo
introdujo primero Betke y se basa en la desnaturalizacin
selectiva de otras hemoglobinas por el lcali, dejando la
HbF intacta, que es resistente. Una solucin lisada diluida
se somete a una incubacin fija de 2 min con NaOH, que
oxida todas las dems fracciones que contiene. Las metahemoglobinas resultantes se precipitan con una solucin de
sal saturada, que tambin neutraliza la oxidacin. La HbF,
que permanece en la solucin puede separarse del precipitado por filtracin, o mejor por centrifugacin de alta velocidad. La proporcin de la fraccin de HbF se determina
por densitometra ptica contra una dilucin de Hb total.
Un nivel de HbF < 1% es el rango normal del adulto; 1 a
5% se encuentra en 50% de los portadores de -talasemia;
5 a 20% es caracterstico del rasgo -talasemia y algunos
casos de HPFH; 20 a 45% es caracterstico de la HPFH
pancelular tipo africano. En algunos casos homocigotos, la
HbF puede representar > 90% de la Hb total.
277
adecuada para examinar una gran cantidad de muestras de

manera rpida, exacta y econmica. El principio de separacin es el mismo de la cromatografa en microcolumna,
aunque la resina tiene una cadena lateral de poliaspartato,
es un intercambiador catin y la fase fluida es un ion Cl.
El anlisis se automatiza con un automuestreador de inyeccin sobre la columna y una bomba que ejerce una presin
constante del amortiguador de elucin en la parte superior
del lisado. Esto controla y regula el tiempo de elucin. El
aumento de la sensibilidad de la separacin es enorme con
el empleo de dos amortiguadores, que difieren en la concentracin del ion o el pH o ambos. Las fracciones de Hb son
eluidas en forma secuencial de la columna por la creacin
de un gradiente de elucin, conseguido al mezclar las dos
fases fluidas. Esto permite la separacin de las variantes de
hemoglobina previas sin identificar, es decir, D de G, y E
de O. La densidad ptica de los eluidos se mide directo cuando pasan desde la columna y se trazan de forma continua
para crear un cromatograma (fig. 28-2). La identificacin
se consigue por la comparacin de los tiempos de retencin contra los de las variantes de hemoglobina conocidas.
Los componentes principales y menores pueden cuantificarse con exactitud integrando el rea bajo cada pico; las
- y -talasemias se distinguen con facilidad, pues el nivel
de HbA2 se calcula de manera automtica. Se recomienda
que la identidad de una variante de Hb que se detecta por
HPLC se confirme con una segunda tcnica (p. ej., electroforesis o solubilidad de la hemoglobina falciforme).
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)

La HPLC combina la deteccin, la identificacin y la cuantificacin de hemoglobinas en una sola tcnica y es muy
Figura 28-2 Diagrama del empalme de los cromatogramas por

HPLC de las variantes comunes de Hb.
278
CAP. 28
Deteccin de cuerpos de inclusin de RBC
Prueba de inestabilidad al calor
La reaccin redox de la tincin supravital se utiliza para

teir los cuerpos de inclusin del eritrocito que se forman
de derivados de Hb. Esta propiedad es til en la caracterizacin adicional de los desrdenes de la Hb.
La HbH es un tetrmero que se forma con el excedente
de cadenas (4) en la -talasemia y es perceptible por
electroforesis o HPLC cuando existen cantidades significativas (es decir, en la enfermedad de HbH). La HbH intracelular
es soluble pero muy inestable y se precipita por incubacin
con azul brillante de cresil. El precipitado se fija a la membrana del RBC para dar un aspecto tpico de pelota de
golf a los RBC, con los cuerpos mltiples teidos. Las inclusiones de HbH estn presentes en 1 a 2 clulas/1 000 en
el rasgo -talasemia, pero pueden ser difciles de detectar
al microscopio. Son mucho ms numerosas y visibles en la
enfermedad de HbH.
Los cuerpos de Heinz (vase hemoglobinas inestables)
no son perceptibles en un frotis teido con Romanowsky
estndar, pero s como precipitados intracelulares grandes,
redondos y normalmente solos despus de la incubacin
con violeta de metilo. Su presencia comn se detecta slo
en la hemlisis aguda y no puede ser obvia si la funcin
esplnica est intacta o si la tincin se realiza sobre sangre
muy fresca.
Este control somete la hemoglobina a una incubacin de

50C, lo que ejerce estrs adicional sobre las fuerzas de van
der Waals internas ya debilitadas, y producir subunidades
al disociar con ms facilidad de lo normal.
Deteccin de hemoglobinas inestables

La inestabilidad molecular de la Hb puede surgir de la
sustitucin del aminocido en los grupos de unin hem,
las reas de contacto o en el interior del hueco del grupo hem. Estos defectos confieren debilidad en los contactos
hem-globina y en las estructuras tetramricas o helicoidales totales. Esto conduce a una tolerancia reducida a estrs
fisiolgico, con una tendencia a la oxidacin irreversible
del hierro del grupo hem y de la precipitacin intracelular
de Hb bajo la forma de cuerpos de Heinz. Hay ms de 180
hemoglobinas inestables conocidas, algunas de las cuales
conducen a las anemias hemolticas congnitas de cuerpos
de Heinz, con una gravedad dependiente de la naturaleza y
de la posicin del defecto molecular.
La electroforesis no es en particular til en el diagnstico de la enfermedad de Hb inestable, puesto que la mayor
parte de estas mutaciones no muestra cambio en la carga
neta de la molcula. La inestabilidad se detecta cuando se
emplean dos controles de desnaturalizacin basados en la
exposicin a un solvente o en la precipitacin por calor.
Las muestras deben estar frescas, y la sangre del cordn
puede utilizarse como un control positivo (la HbF tiene una
intolerancia relativa al calor y al estrs hidrofbico comparada con la Hb normal adulta).
Prueba de estabilidad al isopropanol

La incubacin con isopropanol induce estrs hidrofbico.
El isopropanol es ms polar que el agua y debilita las uniones hidrofbicas, permitiendo que el agua entre en el hueco
del grupo hem y facilite la oxidacin del hierro del grupo
hem. En ambos controles, la hemoglobina normal permanece en solucin, mientras que las variantes inestables se
detectan con la floculacin y precipitacin variables.
Anlisis molecular
Las tcnicas estndares de control descritas antes son adecuadas para la deteccin y la caracterizacin de las mutaciones comunes, pero se limitan a identificar variantes raras y a
especificar los defectos de la talasemia. La identificacin de
la alteracin molecular exacta es esencial para los propsitos de asesoramiento gentico, diagnstico prenatal y, algunas veces, para el manejo clnico. Esto se logra con el anlisis del DNA genmico que se extrae, y luego se amplifica,
a partir de leucocitos de la sangre perifrica, o de muestras
de las vellosidades coriales (CVS) para el diagnstico prenatal. En el desarrollo de las tcnicas de diagnstico para el
anlisis de DNA se ha logrado un progreso rpido que es
reciente. Una descripcin con detalle de las tcnicas y sus
aplicaciones est ms all del alcance de este captulo. Sin
embargo, en seguida se da una breve resea sobre el uso de
la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en el diagnstico de la hemoglobinopata.
La PCR se aplica sobre todo para la deteccin de las mutaciones puntuales, deleciones y polimorfismos del DNA.
Esta tcnica amplifica una regin del DNA de inters, con
sencillez y de manera muy rpida, y en particular es apropiada para el diagnstico prenatal, puesto que requiere slo
de una muestra muy pequea que puede obtenerse por CVS
cerca de las 12 semanas de gestacin.
El principio de la PCR implica la sntesis de DNA usando
iniciadores sintticos (secuencias cortas de DNA de cadena
sencilla), los cuales flanquean la regin del DNA de inters,
y una DNA polimerasa termoestable (polimerasa Taq). La
amplificacin enzimtica de cantidades grandes de DNA

permite la visualizacin directa de los fragmentos de
DNA teidos en un gel de agarosa. Una sola sustitucin
de base puede identificarse por el cambio en el tamao del
fragmento del DNA despus de la digestin del producto
de la PCR con enzimas de restriccin que reconocen secuencias especficas de DNA, seguida por una hibridacin
del tipo Southern blotting. Sin embargo, esto consume
tiempo e involucra el uso de radioistopos.
Se han desarrollado nuevas tcnicas, que se basan en la
PCR, que permiten la prueba para mutaciones especficas
sin el uso de enzimas de restriccin o de radioistopos si
el defecto molecular exacto que se busca ya es conocido,
permitiendo as que los resultados estn disponibles en un
lapso de 24 horas. Una tcnica as es el sistema de amplificacin refractaria de la mutacin (ARMS), cuando
se emplean iniciadores especficos para el alelo. En esta
tcnica dos iniciadores diferentes se utilizan, uno complementario al alelo normal y el otro al alelo mutado, que
difieren slo en el sitio de la mutacin. Los iniciadores dan
un producto de PCR slo si el iniciador y las secuencias
de DNA son complementarios. As, los iniciadores normal
y mutante amplifican los alelos normal y mutante respectivos. Usando esta tcnica, el DNA del paciente puede examinarse para una mutacin especfica del gen, por ejemplo, HbS. Se han sintetizado iniciadores para A, S, C,
E y la mayor parte de los genotipos comunes de -talasemia. En -talasemia, un nmero limitado de defectos
se encuentra con frecuencia en cada grupo tnico. As, el
origen tnico del paciente determina primero el empleo de
una serie particular de iniciadores en el anlisis, con una
alta probabilidad de identificacin positiva en el primer
control.
La GAP-PCR es una tcnica con la cual se detectan
huecos grandes (deleciones) en el DNA, y es til en el
diagnstico de las formas comunes de + y 0 talasemias,
que son sobre todo originadas por delecin. Tambin se
utiliza en el diagnstico molecular de Hb Lepore, -talasemia y las formas delecionales de HPFH. La PCR multiplex es una tcnica til para la demostracin/exclusin
simultneas de un nmero de mutaciones diferentes (p.
ej., en todas las + y 0 talasemias conocidas) en una sola
279
prueba. Las tcnicas que se basan en la PCR que se mencionan antes se utilizan cuando se examinan mutaciones o
deleciones especficas. Sin embargo, si el defecto molecular permanece indeterminado, la mutacin supuesta puede
identificarse secuenciando de modo directo el gen.
Agradecimientos
Gracias a Jaspal Kaeda FIBMS PhD (Leukaemia Unit, Imperial School of Medicine, Hammersmith Hospital, London) por la ayuda con la seccin PCR, y a Yvonne Elliott
CSI FIBMS (Walsgrave Hospital, Coventry) por la revisin
crtica del manuscrito.
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29
Investigaciones especiales del factor de von Willebrand
Mohammad S Enayat
Introduccin
La enfermedad de von Willebrand (vWD) fue descrita primero por Erik von Willebrand en 1926 en varios miembros
de una familia grande del archipilago land, en Finlandia.
En 1953, se identifica una relacin entre la disminucin
de la actividad procoagulante del factor VIII (FVIII) y la
vWD, lo que condujo a cierta confusin referente a la naturaleza de la protena responsable de la hemofilia A y de la
vWD. Pero slo hasta finales de la dcada de 1970 se logr
una mejor comprensin de las estructuras inmunolgica y
molecular del FVIII y del vWF que llevaron al mapeo gentico y la clonacin del cDNA que codifica para el FVIII
en 1986 y del vWF en 1989.
La vWD es el ms comn de los desrdenes sanguneos
congnitos, con un fenotipo heterogneo. Deriva de defectos cuantitativos (tipos 1 y 3) o cualitativos (variantes
del tipo 2) del vWF en plasma o plaquetas, o ambos. Esta
glucoprotena multimrica grande (10 a 20 106 kDa)
tiene dos papeles importantes en la hemostasis; actuando
como portador y protector proteoltico del FVIII, y como
mediador de la adherencia plaquetaria al subendotelio, despus de una lesin vascular. El vWF se sintetiza en las clulas endoteliales y en los megacariocitos por medio de la
transcripcin del mRNA de aproximadamente 9 kb resultante a partir del gen del vWF de 180 kb sobre el extremo telomrico del cromosoma 12 en 12p13.2 S pter (fig.
29-1). Los estudios de localizacin que usan una sonda de
cDNA para la porcin media del vWF identifican no slo
el gen autntico en este cromosoma, sino tambin una secuencia del seudogn en el cromosoma 22 en 22q11-23.
Este seudogn tiene 21 a 29 Kb de longitud, con un DNA
genmico que corresponde tanto a exones como intrones de
la regin codificante de los exones 23 a 34 del gen del vWF

y con slo 3.1% de divergencia en la secuencia. El gen
del vWF tiene 52 exones, mide aproximadamente 178 kb,
que codifican un producto de traduccin precursor (PreprovWF) de 2 813 aminocidos (aa) con una repeticin interna
grande de dominios homlogos. El propptido (de 763 aa)
y la subunidad madura (de 2 050 aa) del vWF se componen
de dominios que se repiten en el siguiente orden: D1-D2D-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK. Antes de la
secrecin, el vWF experimenta un procesamiento postraduccional extenso, que incluye la eliminacin del propptido D1-D2, seguida por la glucosilacin con oligosacridos,
12 N-ligados y 10 O-ligados, y multimerizacin. Algunos
de los oligosacridos N-ligados del vWF tienen la caracterstica rara de portar determinantes del grupo sanguneo
del ABO. Varios dominios funcionales (fig. 29-1) se han
identificado en la molcula del vWF, y la mayor parte de
las mutaciones responsables de varios tipos de la vWD se
han mapeado en estas regiones.
Los resultados a partir de pruebas fenotpicas y genotpicas forman la base del diagnstico y de la clasificacin
de los diferentes tipos de vWD. Sin embargo, como surgen
ms detalles de estos tipos de pruebas, un diagnstico ms
exacto y la clasificacin compleja se hacen regularmente.
Una clasificacin revisada de vWD fue publicada en 1994,
pero no se ha modificado y, como de manera continua se
identifican ms mutaciones responsables de cada tipo de
vWD, se ha propuesto una nueva clasificacin basada en
defectos y mutaciones funcionales. En el ao 2003, en el
XIX Congreso de la Sociedad Internacional de Trombosis
y Hemostasia en Birmingham, Reino Unido, varias ponencias enfatizaron la necesidad de una nueva clasificacin de
vWD, con base en el diagnstico molecular y el anlisis
282
CAP. 29
INVESTIGACIONES ESPECIALES DEL FACTOR DE VON WILLEBRAND
Figura 29-1 Representacin esquemtica del gen y de la protena del vWF humano. De arriba hacia abajo: caractersticas estructurales
del gen, seudogn y cDNA del vWF; localizaciones y numeracin, antigua y nueva, del pptido seal (SP), del vWF prepropptido y
maduro. El vWF prepro contiene 2 813 (2 050 numeracin antigua) aminocidos, de los cuales 1-22 (-22-1 numeracin antigua) son pptidos seal, 23-763 son propptidos y 764-2 813 son subunidades maduras. Las cajas rotuladas denotan regiones de dominios homlogos
internamente repetidos; localizaciones aproximadas del grupo de mutaciones responsables de diversos tipos de vWD; puentes disulfuro
Al y A3 y posiciones de los dominios funcionales; posiciones de los enlaces disulfuro responsables de la dimerizacin y de la multimerizacin del vWF. La glucoprotena de la plaqueta Ilb-IIIa (llb3) se une a la secuencia Arg-Gli-Asp (RGD) indicada en el dominio C1.
multimrico mejorado del vWF. Con tantos pacientes inclasificables en el grupo tipo 1 de vWD, ahora se sugiere
que tal mtodo multimrico mejorado puede ayudar en la
clasificacin futura de estos pacientes.
En este captulo se describen tres pruebas fenotpicas
especiales que se utilizan ahora para el diagnstico y la clasificacin de la vWD. Son el anlisis multimrico de vWF:
Ag, usado para el diagnstico diferencial de todos los tipos
de vWD variante; la agregacin plaquetaria inducida por
la ristocetina, esencial para el diagnstico de la vWD tipo
2B; y finalmente el ensayo de la unin vWF/FVIII para
el diagnstico de vWD tipo N Normanda. Aunque no
hace mucho tiempo que el gen del vWF fue identificado,
las pruebas moleculares ahora se introducen extensivamen-
te, y tambin se describen una breve metodologa y algunas

estrategias para la deteccin de la mutacin.
Pruebas fenotpicas
Anlisis multimrico del VWF
En 1981 una electroforesis en gel de SDS, bajo condiciones
no reductoras, permiti la alta resolucin de los multmeros
vWF:Ag y fue divulgada por Ruggeri y Zimmerman. Este
mtodo original se ha modificado y mejorado desde entonces, pero el principio del mtodo es el mismo. Las modificaciones incluyen variaciones del mtodo actual, tipo de
PRUEBAS FENOTPICAS
medio en el cual se separa la protena, semiautomatizacin,

y diversos tipos de anticuerpos y mtodos de visualizacin
de las bandas del multmero. Todos estos mtodos se utilizan para la identificacin de alteraciones cualitativas del
vWF:Ag, tal como son vistos en la vWD variante o tipo 2,
donde hay prdida de multmeros de peso molecular alto o
intermedio, o ambos. Para el anlisis comprensivo del multmero del vWF:Ag usado en el diagnstico y clasificacin de
la vWD tipo 2, vWF:Ag del plasma y de la plaqueta deben
examinarse en geles de agarosa a concentraciones del 1.0 al
2.2%. El mtodo descrito aqu es la modificacin de Enayat
y Hill (1983) del mtodo original de Ruggeri y Zimmerman
(1981). Esta es una electroforesis en gel de agarosa-SDS
usando una tcnica en gradiente amortiguador. La visualizacin de la banda del multmero es mediante autorradiografa, usando un anticuerpo anti-vWF mono o policlonal
marcado con 125I. Tambin es posible utilizar otros mtodos no radiactivos para la visualizacin de la banda despus de transferir las bandas del multmero de los geles de
agarosa en diferentes tipos de filtros.
Preparacin de gel
Un sistema de sndwich hecho de una pieza del gel unida a
una pelcula (Flowgen), cubierto por una placa de vidrio y
separada de una segunda placa de vidrio por un espaciador
de plstico en forma de U de 1 mm de grueso, se utiliza
para preparar los geles. El gel (Agarosa LGT tipo VII; Sigma) se vierte entre las placas de cristal y, despus de que se
ha fijado, se quita la placa del cristal superior, y una tira de
3 cm de la parte superior de gel se corta y se sustituye por un
gel concentrador compuesto de agarosa a 0.8% (Agarosa de
SeaKem HGT (P), Flowgen Instruments Ltd). Los pozos
de la muestra se cortan en el gel aglomerante. Las muestras
que deben aplicarse se incuban por 30 min a 56C en un
amortiguador que contenga colorante azul de bromofenol,
para vigilar la migracin molecular, y dodecil sulfato de sodio (SDS) para la dispersin completa de las molculas del
vWF y aportar una carga negativa a todos los multmeros.
Condiciones electroforticas
Cada instrumento de la electroforesis se optimiza para este
mtodo pero, por lo general, la electroforesis se realiza rpidamente a 2 mA/cm al inicio, para que las muestras se
muevan de los pozos al gel concentrador. Los pozos vacos
se llenan de gel concentrador fundido y la electroforesis se
realiza durante toda la noche a una velocidad ms baja, 1.0
mA/cm. Cuando se completa la electroforesis, los geles se
fijan en una solucin de isopropanol, se secan con presin
y se lavan con una solucin de suero de conejo al 10%. La
283
autorradiografa se realiza incubando en los geles el anticuerpo (DAKO Ltd) de vWF antihumano marcado con 125I
durante la noche. Despus de un lavado minucioso para
eliminar el anticuerpo sin reaccionar, los geles se secan y
se aplican a placas autorradiogrficas de rayos X y se almacenan a 7C de 2 a 5 das antes del revelado.
Interpretacin de los resultados
La autorradiografa es un mtodo muy sensible y, cuando
se vara el tiempo de exposicin, se pueden obtener diferentes autorradiografas con diversas intensidades de la
seal del mismo gel. El patrn normal del vWF:Ag en plasma muestra la gama completa de bandas del multmero que
corresponde al factor de von Willebrand. ste se compone
de multmeros de peso molecular alto, intermedio y bajo
(fig. 29-2). Cada banda del multmero se integra con un
tro de bandas, una central principal y dos bandas satlites
borrosas pero tambin teidas (a y b). La mejor extensin
de los multmeros de vWF:Ag se observa en gel de agarosa de media resolucin (1.3 a 1.5%), la prdida de multmeros de peso molecular alto se investiga mejor en geles
de agarosa de baja resolucin (1.0 a 1.3%) (fig. 29-2A), y
las anormalidades del tro de bandas en geles de agarosa de
alta resolucin (1.8 a 2.2%) (fig. 29-2B). Por tanto, para un
anlisis multimrico completo deben usarse dos o tres concentraciones diferentes del gel. sta no es una tcnica fcil y cada corrida puede variar y necesitar la optimizacin
individual de las condiciones electroforticas. El anlisis
densitomtrico de cada patrn multmero puede tambin
ayudar en la cuantificacin de la cantidad de multmero
ganada o perdida en algunos pacientes con vWD tipo 2A
(fig. 29-2C).
Las bandas del multmero del vWF:Ag en la plaqueta
normal son diferentes a aquellas observadas en el plasma.
Hay multmeros ms grandes presentes en las plaquetas ms
que en el plasma, y la organizacin multimrica tambin es
diferente (fig. 29-3). Las bandas de multmeros ms pequeas parecen estar compuestas de un do, y las bandas centrales emigran menos que los multmeros correspondientes
en el plasma. La informacin del anlisis del multmero de
la plaqueta puede ayudar a decidir el tipo de tratamiento
de algunos pacientes con vWD tipo 2A y corresponder al
tipo de mutacin presente en ellos.
Ensayo de la agregacin plaquetaria inducida
por la ristocetina (RIPA)
Una de las funciones principales de la glucoprotena del vWF
es promover la adherencia de plaquetas al subendotelio en el
sitio de la lesin vascular, a travs de la interaccin profunda
284
CAP. 29
Figura 29-2 Las autorradiografas de diferentes patrones vistos en los multmeros del vWF:Ag en el plasma del tipo 2A (carril 1), 2D
(carril 2), 2B (carril 3), normal (carril 4) y vWD tipo 1 (carril 5) sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 1.2% (A) y al 1.8% (B).
El tro de la banda 2 es marcado por una llave, y las bandas satlites a y b pueden verse mejor en la banda 1 del plasma en la vWD tipo 2A
(carril 1). La flecha en la parte superior del gel seala la lnea entre los geles concentrador y separador. La direccin de la electroforesis
es de arriba hacia la parte inferior. (C) Un gel al 1.0% que muestra la migracin de multmeros de gran peso molecular, segn lo visto en
la Vincenza tipo 2 (1) y algunos pacientes con vWD tipo 2 no clasificados (2). El panel siguiente ilustra el anlisis densitomtrico de uno
de los dos geles anormales y el rea de los multmeros de gran peso molecular.
con GPIb en el complejo receptor GPIb-IX (glucoprotena

IB-IX) en la membrana plaquetaria. Este dominio funcional que mapea el dominio A1 del vWF desempea un papel
importante en la hemostasis primaria. Los defectos en este
dominio dan lugar a aumento en la afinidad del vWF por el
GPIb plaquetario. Sin embargo, esto no causa trombosis sino,
paradjicamente, sangrado. Este fenotipo raro de una variante del tipo 2 de la vWD se refiere como tipo 2B, y su anormalidad funcional caracterstica se detecta por el ensayo de
la agregacin plaquetaria inducida por la ristocetina (RIPA).
El antibitico ristocetina induce la unin del vWF al GPIb
plaquetario en el plasma rico en plaquetas (PRP) y el grado de aglutinacin plaquetaria con diversas concentraciones
de ristocetina forma la base de este ensayo. Aparte de esta
alteracin, 2B vWD tambin se caracteriza por la ausencia
selectiva de multmeros de peso molecular alto (HMWM)
en el plasma, y es identificada por el anlisis multimrico del vWF:Ag. De hecho, los pacientes con la vWD tipo
2B pueden sintetizar una gama completa de multmeros
del vWF, como se muestra por patrones del multmero del
vWF:Ag multimrico normal en plaquetas y clulas endoteliales, pero los HMWM son eliminados de la circulacin
por la afinidad incrementada del vWF anormal del receptor
GPIb plaquetario.
La metodologa RIPA descrita aqu es una modificacin del trabajo original referido en 1977. La ristocetina
(Paesel-Lore) se reconstituye en una solucin salina Tris
amortiguada, pH 7.4, y cinco soluciones diferentes, dando
concentraciones finales de 0.50, 0.1, 0.125 y 0.15 mg/ml,

se preparan para usarse en el anlisis. La PRP se prepara
centrifugando las muestras sanguneas de la prueba y del
control a 800 rpm durante 10 minutos. La cuenta plaquetaria en el supernadante (PRP) se ajusta aproximadamente
a 250 109/L. Se aaden 200 l de la sangre del paciente
o del control normal (blanco) a las cubetas que contienen
una barra magntica para agitar y se colocan en los bloques de calentamiento a 37C del agregmetro plaquetario
Bio/Data de 4 canales por 2 minutos. Cada cubeta entonces se inserta en uno de los canales del agregmetro y se
comienza la agregacin. Se aaden 20 l de ristocetina (comenzando con la muestra menos concentrada) a cada uno
de los especmenes. Se permite la agregacin durante un
mnimo de 3 minutos. Un trazo del patrn de la agregacin,
que es proporcional a la luz transmitida, se imprime; un
patrn tpico se muestra en la figura 29-4. Las muestras de
vWD tipo 2B requieren menos ristocetina para alcanzar un
patrn de agregacin comparable a las normales.
Ensayo de la unin vWF/FVIII

El vWF y el FVIII mantienen una relacin estrecha y en
el plasma forman un complejo molecular no covalente. La
integridad del dominio de unin del FVIII en la molcula
del vWF es un factor importante para la formacin de ste,
y para la estabilidad y transporte del complejo vWF/FVIII
PRUEBAS GENOTPICAS PARA IDENTIFICAR LA MUTACIN
Figura 29-3 Autorradiografa que muestra diferentes patrones

del multmero observados en el vWF:Ag normal del plasma (Pls)
y de la plaqueta (Plt), separacin electrofortica en agarosa a 1.4%.
La flecha en la parte superior del gel seala los pozos donde se coloc la muestra. Dos flechas pequeas en la parte inferior indican
el patrn de la banda doble mejor observada en agarosa al 1.4%.
Obsrvese la presencia de los multmeros de peso molecular muy
alto en la muestra de la plaqueta.
285
en el plasma. En una investigacin de varios casos de vWD,

se observ que el vWF tiene una capacidad de unin alterada hacia el FVIII, causando la reduccin en el nivel
de este factor, lo que conduce a una condicin similar a la
hemofilia A leve. A esta condicin se le refiere inicialmente como seudohemofilia; ms tarde se le reconoce como
anormalidad del vWF y se renombra Normanda (rea de
donde provino el primer paciente definido) o vWD tipo 2N.
Los multmeros de vWF:Ag en esta variante de la vWD son
normales, pues los defectos mutacionales presentes en estos
pacientes no afectan el mecanismo de multimerizacin del
vWF. Recientemente se han mapeado mutaciones espec-ficas, dentro del vWF y los responsables de esta condicin en
los dominios D y D3, y la mayor parte de las mutaciones se
agrupan en los exones 18 a 24, entre Arg 19 y Cis 297.
El mtodo descrito aqu para determinar la unin del
FVIII al vWF es la modificacin de Nesbitt et al. (1996)
del mtodo que se populariza originalmente. Una concentracin conveniente de un anticuerpo monoclonal anti-vWF,
MAS 533p (de la compaa Sera Lab), se une a las placas
de microtitulacin (Immulon 4, laboratorios Dynatech) interaccionando durante toda la noche a 4C. Las placas se lavan dos veces en 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, a un pH
de 8.0 (TBS), conteniendo BSA a 0.1%. Diluciones seriales
del plasma del paciente que contienen 1 U/dl, 0.5 U/dl, 0.25
U/dl y 0.125 U/dl del vWF:Ag se agregan al amortiguador
TBS que contiene BSA al 3% y se incuba otra vez durante toda la noche a 4C. Se lavan las placas como antes y
el FVIII endgeno en las muestras se elimina incubando
con 0.35 M CaCl2 por una hora a temperatura ambiente.
Un FVIII recombinante (de la compaa Bioclate, Baxter) a
0.05 U/ml se diluye en TBS/BSA al 1% con CaCl2 10 mM y
Tween 20 al 0.002% se adiciona y se incuba por dos horas a
37C. Despus de lavar el FVIII ligado al vWF se determina
usando el equipo cromognico Coamatic FVIII (de la compaa Quadratech) y se realizan lecturas a 405 nm.
Los resultados se grafican como porcentaje de dilucin
del vWF:Ag contra la absorbancia a 405 nm para la vinculacin del FVIII. En el ejemplo que se describe aqu (fig.
29-5), las muestras que se usan son de un control normal,
un control homocigoto y dos pacientes heterocigotos con
vWD tipo 2N (P1 y P2) con la mutacin de Thr28Met
como controles positivos. Para la determinacin de cualquier resultado anormal, debe utilizarse una gama de muestras control normales.
Pruebas genotpicas para identificar la mutacin

Tamizaje para mutaciones
Figura 29-4 Un trazo tpico del patrn de agregacin en plasma
de un individuo normal con plaquetas en presencia de diferentes
concentraciones finales de ristocetina.
Las mutaciones relacionadas con todos los tipos de vWD

se han identificado desde finales de la dcada de 1980. Sin
286
CAP. 29
Figura 29-5 Unin del FVIII al vWF de un control normal, de

dos pacientes heterocigotos, P1 y P2, con la mutacin Thr28Met y
un control homocigoto con la misma mutacin.
embargo, por el gran tamao y complejidad del gen vWF

y la presencia del seudogn en el cromosoma 22, con la exclusin de grandes deleciones, por lo general existe menos
informacin sobre defectos moleculares de la vWD tipo
1 y tipo 3 que del tipo 2. La investigacin de las mutaciones responsables de los subtipos 2A, 2B, 2N y 2M tiene
ms xito porque es el resultado de los datos aportados por
los estudios del fenotipo. Una regin sensible a las proteasas dentro del dominio A2, cercana al sitio de digestin
de Tyr 842 a Met 843, se informa como la que genera los
cambios estructurales similares a aquellos que se observan
en 2A vWD, y este dominio se seala para detectar la mutacin en la 2A vWD. En la 2B vWD, donde hay mayor
afinidad por el GpIb plaquetario, los estudios de la deteccin de la mutacin se dirigen al dominio A1 del vWF, que
contiene el dominio funcional de la unin con el GpIb. De
hecho, casi todas las mutaciones responsables de estos dos
subtipos de vWD se han detectado en el exn 28, donde
mapean los dominios Al y A2 del vWF. De manera similar,
los exones 18 a 24 se estudian para detectar la mutacin en
la vWD tipo 2N. En 1993 se public una base de datos de
mutaciones puntuales, por insercin y delecin identificadas en la vWD, junto con una gran cantidad de polimorfismos que se encuentran en el vWF. Sin embargo, puesto
que esta lista aumenta continuamente mientras ms informacin llega a estar disponible, una nueva base de datos en
lnea de la mutacin y del polimorfismo del vWF se crea
y mantiene por un consorcio de investigadores de la vWD
en Internet. Este sitio ahora ha cambiado y existe uno nuevo a nombre del Comit Cientfico y de Normalizacin
de la ISTH para el vWF, que mantiene la Universidad de
Sheffield del Reino Unido. Este sitio Web (http://www.she
ffield.ac.uk/vWF) contiene la informacin actualizada sobre las mutaciones y polimorfismos ms recientes que se divulgan sobre el gen para el vWF. Aunque la mayor parte de
estas mutaciones reportadas se comprueban con estudios
funcionales, donde el vWF recombinante se expresa en un
cultivo de la lnea celular en la cual la mutacin se introduce por mutagnesis dirigida al sitio, otras tienen todava
que expresarse. En algunas de las mutaciones divulgadas el
gen completo del vWF no se ha investigado para excluir la
posibilidad de cambios en otra parte.
En la vWD tipos 1 y 3, donde las mutaciones se podran encontrar en cualquier parte a lo largo del gen del
vWF, se ha reportado el uso de diferentes tcnicas para
una bsqueda preliminar como son: la deteccin por medio
del corte qumico de la unin alterada entre las cadenas de
DNA (CMCD), la electroforesis en gel que detecta cambios conformacionales (CSGE) o la electroforesis en gel
de gradiente desnaturalizante (DGGE). Para el tamizaje de
la mutacin por CMCD, todo el gen del vWF se amplifica
en siete fragmentos del cDNA, que se obtienen por la transcripcin inversa del mRNA ilegtimo encontrado en linfocitos perifricos por medio de la reaccin en cadena de
la polimerasa (RT-PCR). Estos segmentos pueden entonces
tamizarse por CMCD para la mutacin. La DGGE es tan
sensible como CMCD, pero requiere la sntesis de iniciadores especiales y el uso de la tcnica de electroforesis en
geles. La metodologa de CSGE es un mtodo de deteccin
simple y no radiactivo; sin embargo, implica amplificaciones y anlisis de hasta 60 fragmentos para el anlisis del
gen que codifica para el vWF.
Deteccin e identificacin de la mutacin
Secuenciacin de DNA
Los mtodos de tamizaje tales como CSGE y CMCD identifican slo la posicin y a veces el tipo de un cambio molecular en un segmento pequeo del gen, y donde pudieran
encontrarse mutaciones. La naturaleza real de la mutacin,
sin embargo, slo podra determinarse por la secuenciacin directa del DNA. Los mtodos ms antiguos para la
preparacin de productos PCR de DNA de cadena sencilla necesarios para la secuenciacin (usando cebadores
biotinados apropiados y perlas magnticas revestidas con
estreptavidina, o por PCR asimtrica) han sido sustituidos
en la actualidad por la secuenciacin cclica. Este mtodo
se basa en la sntesis de una hebra nueva de DNA a partir de una cantidad pequea de la plantilla de doble hebra
original en un proceso de secuenciacin cclica, empleando una enzima Taq termoestable especial y dideoxi-dNTP
marcados con compuestos fluorescentes. Con la introduccin de los analizadores genticos automticos con 16 a
96 sistemas capilares de electroforesis, es posible ahora

realizar centenares de secuenciaciones por da.
Despus de la deteccin de una mutacin, sta puede
caracterizarse por mutagnesis dirigida al sitio y expresarse en un cultivo de lnea celular o por uno de los siguientes
mtodos:
1. Anlisis de la endonucleasa de restriccin. Una sola
sustitucin del par de bases puede crear o eliminar un sitio para la restriccin de la enzima endonucleasa. Para la
confirmacin de tal cambio, los productos de restriccin
de PCR relevantes obtenidos por el corte de una de
las cientos de enzimas de restriccin pueden analizarse
por electroforesis en agarosa o en gel de poliacrilamida,
y las bandas de DNA obtenidas por corte se visualizan
por medio de tincin con bromuro de etidio. Dentro del
tipo 2NvWD casi todas las mutaciones reportadas pueden detectarse de esta manera.
2. Hibridacin con oligonucletido iniciador especfica de
alelo (ASO). En mutaciones donde no hay disponible
una enzima de restriccin para detectar el cambio, un
anlisis ASO-H o dot-blot puede utilizarse. Aqu se sintetiza un oligonucletido corto (cerca de 15bp) con secuencias del tipo silvestre y del mutante. Los productos
PCR purificados del exn relevantes se desnaturalizan
en NaOH. Los productos obtenidos por PCR tanto del
alelo normal como del paciente del exn apropiado se
aplican a tiras de nylon Hybond N+ (Amersham International), manualmente o con un aparato disponible en
el comercio. Las tiras de nylon del filtro entonces se hibridan con los dos diferentes tipos de oligonucletidos
marcados con 32P-ATP, usando el fragmento Klenow (de
la compaa Pharmacia) de la DNA polimerasa I. Despus de las hibridaciones, las tiras del filtro se lavan tres
veces en concentraciones que difieren de SSC con SDS
por 10 a 20 min a una temperatura ptima determinada
empricamente para cada sonda del ASO. Por medio de
la exposicin a una autorradiografa, es posible visualizar muestras positivas (hibridacin positiva) y negativas
(hibridacin negativa).
En la actualidad, por lo menos se listan 40 mutaciones de
sentido equivocado, cuatro microdeleciones y una insercin, en la base de datos, como las alteraciones causantes
de la vWD tipo 2A. Una forma dominante rara de la vWD
tipo 2A (formalmente tipo IID) se encontr como causal de
una mutacin de sentido errneo en el dominio CK del carboxiloterminal. Una serie de mutaciones de sentido errneo responsables de la vWD tipo 2B se ha identificado
ahora, y todas se agrupan en el dominio 2A del vWF, que
contiene el dominio de la unin funcional con el receptor
GPIb. Con pocas excepciones, todas se confinan a un pptido corto (540 a 578 aminocidos). La mayor parte de las
287
mutaciones frecuentes son R1306W, R1308W, V1316M y

R1341Q, que explican cerca del 90% de las vWD tipo 2B.
Quince mutaciones de sentido equivocado, en los dominios
D y D3 relacionados con los exones 18 a 24, aparecen actualmente en la base de datos para la vWD tipo 2N, siendo
la mayor parte mutaciones de sentido equivocado R854Q.
Ya que las mutaciones para los tipos 1 y 3 podran estar
presentes en cualquier parte de los 52 exones del gen del
vWF, la deteccin de estas alteraciones en estos tipos de
vWD fue lenta y slo unas pocas, con grandes deleciones,
se han reportado al principio de la dcada de 1990. Sin embargo, en la actualidad con la introduccin y la facilidad
relativa de secuenciacin directa de DNA, una gran cantidad de mutaciones se han comunicado para la vWD tipo 3,
sobre todo en forma homocigota en pacientes de familias
con matrimonios consanguneos. Como resultado de un
estudio europeo multicentro (MCMDM-1vWD) y de un estudio canadiense en el diagnstico y el control de la vWD
tipo 1, muchas ms mutaciones se identifican actualmente.
Estos resultados indican que las mutaciones heterocigotas
de sentido equivocado en el vWF maduro son una causa importante de la vWD tipo 1, y que varios otros tipos de mutaciones pueden dar lugar a niveles reducidos en la expresin
del vWF y contribuir a este fenotipo de la vWD.
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30
Anlisis de plaquetas
Steven Walton y Peter E. Rose
Introduccin
Las plaquetas son fragmentos pequeos de citoplasma de
megacariocito con un dimetro medio de 1 a 2 m y un volumen medio de 5 a 8 fl, teniendo una vida media en la circulacin perifrica de 1 a 10 das. Su funcin es mantener
la integridad de la pared vascular e iniciar la homeostasis
al daarse la red vascular. Su funcionalidad puede dividirse
en tres reas principales: adherencia al endotelio vascular;
agregacin entre s, y liberacin de productos qumicos en
el plasma. Este captulo describe el principio bsico de las
tcnicas usadas para investigar cada una de estas reas.
La prdida de esta funcin clnicamente se manifiesta
en pacientes con contusin grave, erupciones petequiales o
sangrado prolongado posteriores a traumatismos menores,
como puncin venosa o tratamiento dental. Los pacientes
que presentan estos problemas deben sujetarse a una evaluacin de la funcin plaquetaria y a cuantificacin de la
cuenta plaquetaria.
Estructura y funcin
La funcin y la estructura de la plaqueta se relacionan
estrechamente. La membrana externa de la plaqueta es
un organelo muy funcional, que contiene diferentes glucoprotenas que atraviesan la membrana celular bilpida
estndar. Varias de estas glucoprotenas activan diferentes vas bioqumicas dentro de la plaqueta para inducir
algunas funciones requeridas como respuesta normal de
la plaqueta. Se ha demostrado que la funcin plaquetaria anormal se debe a falta de expresin de una o ms de
esas glucoprotenas (cuadro 30-1 y fig. 30-1). La adhesin
anormal plaquetaria se observa en el sndrome de BernardSoulier, en el cual la glucoprotena de membrana plaquetaria interna ha mostrado ser deficiente. Esta glucoprotena
tiene una capacidad de unin especfica por el factor de von
Willebrand de la protena plasmtica, cubriendo la matriz
subendotelial expuesta al plasma, de tal forma que adhiere
las plaquetas al sitio de la lesin vascular por medio de la
glucoprotena Ib. La deficiencia del complejo de la glucoprotena IIb/IIIa causa una alteracin en la capacidad
de las plaquetas para agregarse (fig. 30-1). Esta condicin
se conoce como trombastenia de Glanzman. stas y otras
glucoprotenas actan como receptor fisiolgico para varios agonistas plaquetarios de peso molecular bajo y alto.
Una vez que uno o ms de estos receptores glucoprotenicos se han activado, hay una transduccin de seales en
los organelos internos de la plaqueta. Esto es comn que
ocurra va activacin de la enzima fosfolipasa C, la cual
est expuesta a los extremos internos de las glucoprotenas transmembranales y a la activacin por sus respectivos
ligandos.
En el citoplasma de la plaqueta se encuentran muchas de
las estructuras internas encontradas en otras clulas secretoras; sin embargo, la plaqueta no tiene una gran capacidad
para la sntesis de protenas. La plaqueta contiene un retculo endoplsmico rugoso y aparato de Golgi muy pequeos
(fig. 30-2). Contiene el retculo endoplsmico liso extenso,
que se seala con frecuencia como el sistema tubular denso. El citoplasma tambin contiene muchos -grnulos y
grnulos densos. Estos grnulos contienen una variedad
amplia de compuestos qumicos implicados en la respuesta
inflamatoria y, principalmente, en la aceleracin del proceso de la hemostasia localizada. Los -grnulos contienen los factores de coagulacin V, VII y el fibringeno,
290
CAP. 30
ANLISIS DE PLAQUETAS
Cuadro 30-1 Factores implicados en una respuesta plaquetaria

Glucoprotena
receptora
Ligandos
Funcin
plaquetaria
GP IIb-IIIa
Vitronectina
La agregacin y
Factor de von Willebrand
adhesin a ndices
Fibronectina
de flujos altos
Fibringeno
GP Ia-IIa
Vitronectina
Adhesin
Factor de von Willebrand
Fibronectina
Fibringeno
GMP 140
Varias glucoprotenas
Interaccin plaqueta
(PADGEM) y glucolpidos
a leucocito
Figura 30-2 Representacin esquemtica de la estructura plaquetaria. El diagrama ilustra las estructuras internas principales
de una plaqueta discoide. CS, sistema canalicular conectado a la
superficie; M, mitocondria de la plaqueta; DTS, sistema tubular
denso; DB, cuerpo denso; G, grnulos de la plaqueta; MT, banda
circunferencial de los microtbulos.
mientras que el ATP tiene un efecto inhibidor sobre el ADP

y es, por tanto, una parte del mecanismo de control para localizar la formacin del trombo. La 5-HT es otro agregador
plaquetario de gran alcance; la membrana de la plaqueta
contiene numerosos receptores para 5-HT. Estos receptores
son miembros de la superfamilia de las protenas G, acoplados a un neurotransmisor y un receptor hormonal que se
encuentra en las clulas nerviosas y en el endotelio intestinal en grandes cantidades
Figura 30-1 Representacin esquemtica de los receptores plaquetarios
junto con factores de crecimiento para ayudar a la reparacin vascular, fundamentalmente el factor de crecimiento
derivado de la plaqueta (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial (EGF). Otra sustancia almacenada en los
-grnulos es el factor IV plaquetario; es un compuesto
que se analiza y es uno de los principales factores para determinar la respuesta de liberacin plaquetaria.
Los grnulos densos contienen una proporcin grande
de nucletidos plaquetarios disponibles, principalmente
difosfato y trifosfato de adenina y guanina, junto con iones
calcio y magnesio y 5-hidroxitriptamina (5-HT). El ADP
es un acelerador importante para la agregacin plaquetaria,
Conteo plaquetario
Es importante obtener una cuenta de plaquetas exacta antes de proceder a las pruebas de la funcin plaquetaria.
La cantidad de plaquetas puede estimarse a partir de un
frotis sanguneo analizado por microscopia y teido con
Romanowski. La morfologa de la plaqueta que muestre
el tamao y la granularidad es til en los desrdenes relacionados con plaquetas grandes, como en el sndrome de
Bernard-Soulier.
Las mquinas automatizadas para cuenta sangunea con
capacidad de conteo de plaquetas forman parte del equipo
rutinario de laboratorio (vase el cap. 27). La exactitud ms
grande de las tcnicas manuales permite medir cuentas tan
bajas como 5 109/L y superiores a 1 000 109/L.
INVESTIGACIONES DE LA AGREGACIN PLAQUETARIA
Anticuerpos plaquetarios
La disminucin de la cuenta plaquetaria ocurre por una
falla en la produccin medular (p. ej., despus de la quimioterapia citotxica) o por un aumento en el consumo de la
plaqueta. La produccin del anticuerpo dirigido en contra
de algn componente de la membrana de la plaqueta o para
una sustancia asociada a la membrana plaquetaria puede
dar lugar a un incremento del secuestro por el bazo. La presencia de inmunoglobulinas dirigidas contra la membrana
plaquetaria es, por tanto, una investigacin importante. La
presencia de la inmunoglobulina plasmtica dirigida contra
las plaquetas no se correlaciona con la gravedad clnica de
la trombocitopenia autoinmunitaria, mientras que la concentracin de la inmunoglobulina ligada a la plaqueta es un
mejor marcador de la actividad patolgica.
La demostracin de la inmunoglobulina unida a la plaqueta es ms difcil que identificar la inmunoglobulina
relacionada a la superficie del eritrocito. Debido a las cantidades bajas de plaquetas y a la dificultad para visualizarlas,
se recomienda el mtodo que emplea un citmetro de flujo
y combinar el reactivo de la globulina antihumana con un
colorante fluorescente. Se prepara un plasma rico en plaquetas por centrifugacin a baja velocidad. Este plasma se
centrifuga a gran velocidad en presencia de un amortiguador que contiene EDTA o algn otro inhibidor plaquetario
para formar un botn de plaquetas, el cual es entonces lavado varias veces para eliminar cualquier plasma atrapado
que contenga globulinas humanas. Finalmente, las plaquetas son resuspendidas en albmina bovina al 5%. En seguida una alcuota de plaquetas se mezcla con una globulina
antihumana acoplada a isotiocianato de fluorescena u otro
fluorocromo detectable por citometra de flujo. Despus de
incubar en la oscuridad, las plaquetas se someten a un lavado final con amortiguador PBS EDTA y se resuspenden
en una cantidad suficiente de amortiguador para permitir
el flujo fcil a travs del citmetro de flujo. Las plaquetas del paciente sin colorante fluorescente se usan como un
control negativo. Una reaccin positiva ocurre cuando el
ndice fluorescente es ms alto en las plaquetas marcadas
con el fluorocromo que en aquellas plaquetas sin colorante.
Tiempo de sangrado
Una de las pruebas ms simples de la funcin de la plaqueta
es el tiempo de sangrado. Se hace una incisin en la piel del
antebrazo, con un dispositivo para el sangrado, y se mide
el tiempo consumido para que se detenga el sangrado. Para
mejorar la reproducibilidad del mtodo, la tcnica se realiza haciendo una incisin dual, usando una lanceta cargada
por resorte en el rea convencional. El resorte tiene una
291
tensin estndar para dar una profundidad reproducible al

corte, mientras que un manguito del esfigmomanmetro se
infla a una presin seleccionada de 40 mmHg. El tiempo
hasta que el sangrado cese es medido por un cronmetro y
la deteccin, limpiando el exceso de sangre del brazo con
papel filtro limpio. Cualquier defecto importante de la plaqueta se registra con un tiempo prolongado, como sucede
en las alteraciones de la protena de von Willebrand.
Adherencia plaquetaria
La primera etapa fisiolgica de la activacin plaquetaria
es la adherencia de las plaquetas a la matriz subendotelial.
La medicin de la adherencia de la plaqueta es difcil y
es raro que se realice en los laboratorios rutinarios. Se reportan varios mtodos que pueden utilizarse para dar una
estimacin neta de la funcin de adhesin plaquetaria. El
ms simple indica tomar una muestra sangunea citratada
sin obstruccin venosa y someterla a un conteo plaquetario. Una alcuota de la muestra se pasa a presin constante
sobre un tubo que contiene perlas de cristal estandarizadas,
y un segundo conteo plaquetario se realiza en la muestra
emergente. Ahora, el porcentaje de adherencia de la plaqueta puede calcularse. Una modificacin a esta tcnica estndar usa una matriz subcelular como el colgeno y puede
semejar un cuadro fisiolgico mejor. Los problemas con la
reproducibilidad de los resultados restringieron el uso de
este mtodo en los laboratorios de investigacin, incluso
en compaas farmacuticas que evaluaban la eficacia de
los frmacos que modificaban la adherencia o la activacin
plaquetaria. Un mtodo ms complejo implica un sistema
para simular la presin venosa normal y requiere la elaboracin de un tubo de plstico inerte con un rea de matriz
subendotelial. La sangre entonces se hace pasar dentro del
sistema a tasas fisiolgicas normales de flujo sanguneo.
Investigaciones de la agregacin plaquetaria

Es probable que la medicin de la agregacin plaquetaria
sea la tcnica ms comn usada en la investigacin de los
desrdenes plaquetarios. Los estudios de agregacin se basan en una tcnica fotomtrica. La agregacin se registra
como el cambio en la absorbancia de una mezcla de plasma
rica en plaquetas cuando los agregados se forman. Cuanto ms grandes son los aglomerados, ms pesados son, y
cuando se salen de la trayectoria luminosa se detecta una
transmisin ms alta de la luz. Existen varios agonistas de
uso general, incluyendo ADP, adrenalina, colgeno y el antibitico ristocetina. Esta ltima es un agonista inusual ya
que no tiene ningn efecto directo sobre las plaquetas pero
modifica la parte del complejo del factor VIII, conocido
292
CAP. 30
ANLISIS DE PLAQUETAS
como factor de von Willebrand. Cuando se modifica, esta

protena cambia de una estructura globular a una lineal.
La estructura lineal entonces une a varias plaquetas y facilita la seudoagregacin. Una respuesta anormal a la ristocetina se observa en pacientes con cambios cuantitativos y
cualitativos en la protena de von Willebrand.
Analizador PFA-100 para la funcin

plaquetaria
El dispositivo PFA 100 (Dade) se utiliza cada vez ms en
laboratorios de manera rutinaria para medir el tiempo de
sangrado inducido por colgeno/epinefrina. El dispositivo
mide la formacin del tapn plaquetario sobre un tubo capilar revestido de colgeno bajo tensin del flujo sanguneo. La sangre venosa citratada se conduce a travs de un
tubo capilar para que entre en contacto con una membrana
cubierta con epinefrina, y se activen las plaquetas. Entonces la sangre se aspira a travs de una abertura de precisin
en la membrana, mientras las plaquetas comienzan a adherirse a la circunferencia hasta formar un tapn estable que
ocluye la abertura. El tiempo de sangrado es, por tanto,
el tiempo transcurrido para que deje de pasar la sangre a
travs de la abertura, y una medicin de la formacin del
tapn plaquetario ex vivo. Esta metodologa representa en
la actualidad la primera lnea de investigacin plaquetaria
en muchos laboratorios.
Investigaciones sobre la liberacin

plaquetaria
Las tcnicas que estudian la liberacin de la plaqueta pueden dividirse en dos, las que utilizan radioistopos y las
que emplean la produccin de luz usando la enzima luciferinasa. Las tcnicas isotpicas es posible realizarlas en dos
formas. Las plaquetas pueden incubarse con un radioistopo que pueda incorporarse dentro de la molcula bajo investigacin, tal como 5-hidroxitriptamina (5-HT) marcada
con 14C para observar la liberacin de 5-HT. En estos mtodos, el plasma rico en plaqueta se incuba durante un periodo con un compuesto radiactivo ptimo. Las plaquetas
entonces se separan del plasma y el exceso de radioistopo
se elimina. Para hacer esto, las plaquetas se centrifugan
mediante un gradiente de densidad con albmina, dejando
la pastilla de plaquetas en el fondo y el plasma radiactivo
en la parte superior. Despus la pastilla de la plaqueta se
suspende de nuevo en un amortiguador, se lava otra vez
y se cuenta. Despus de la agregacin plaquetaria con un
agonista potente, el plasma pobre en plaquetas tambin se
cuenta y la cantidad de radiactividad en el plasma pobre en
plaquetas se expresa como un porcentaje de la actividad de

una muestra llena de plaquetas.
Una segunda tcnica que usa radioistopos se emplea
para realizar un ensayo radioinmunitario (RIA). Con esta
metodologa el compuesto bajo investigacin se mezcla con
una porcin del mismo compuesto marcado con un trazador
radiactivo. Se agrega a esta mezcla un anticuerpo especfico
para el compuesto bajo investigacin. Despus de la incubacin, el compuesto ligado al anticuerpo se separa del que no
est unido, generalmente por la adicin de carbn activado
y luego por una centrifugacin. Es posible cuantificar la radiactividad en el sedimento o en el sobrenadante libre. Debido a que el anticuerpo se liga en muestras radiomarcadas y no
radiomarcadas en igual cantidad, la proporcin de radiactividad ligada por el anticuerpo es inversamente proporcional
a la cantidad del compuesto en el plasma bajo investigacin.
El mtodo se cuantifica usando concentraciones conocidas de plasma control para construir un grfico y, entonces,
las lecturas para las muestras se miden a partir del grfico.
La quimioluminiscencia es otra tcnica usada en la
investigacin de la reaccin de liberacin de la plaqueta.
sta se basa en la misma reaccin qumica que ocurre en la
lucirnaga, donde el ATP y la luciferinasa reaccionan con
la luciferina para producir fotones de luz. La reaccin
depende de la cantidad de ATP que se produce. Para la reaccin plaquetaria, se agregan luciferinasa y luciferina a
un vial de la reaccin junto con compuestos que liberan
la plaqueta. La cantidad de ATP en el vial de la reaccin determina la cantidad de luz producida. Una produccin ms alta de luz resulta de una liberacin ms
elevada de ATP a partir de las plaquetas.
Citometra de flujo
La citometra de flujo se utiliza cada vez ms para investigar
la funcin plaquetaria en presencia de anticuerpos dirigidos contra antgenos especficos expresados en las plaquetas. La metodologa para la citometra de flujo se discute
en el captulo 32. Para las investigaciones de la plaqueta
hay dos protenas principales que pueden identificarse; las
requeridas para la unin de la plaqueta a la pared celular y
las protenas necesarias para formar agregados plaquetarios. La glucoprotena Ib es un antgeno de superficie que
se requiere para unir las plaquetas a la matriz subendotelial
va el factor de von Willebrand. La glucoprotena IIb/IIIa
es uno de los componentes principales requeridos para la
reaccin de agregacin plaquetaria. Un dficit de la funcin de la plaqueta se puede, por tanto, identificar usando
anticuerpos monoclonales dirigidos contra cualesquiera de
estas protenas.
Para investigar las alteraciones en glucoprotenas asociadas a la membrana plaquetaria, se prepara un plasma
TROMBOELASTOGRAMA
rico en plaquetas por centrifugacin lenta. El plasma entonces se diluye en fluido plasmtico pobre en plaquetas o en
albmina para obtener una cuenta plaquetaria aproximada a 1 109/L. Una alcuota de sta se mezcla con un
anticuerpo monoclonal marcado con fluorescencia especfico para la glucoprotena. Despus de la incubacin, la
cantidad completa se diluye otra vez para dar cerca de 0.5
ml. La muestra se analiza, en seguida, con un citmetro
de flujo. Para determinar que es positivo, el ndice de fluorescencia debe ser ms alto que el de la muestra control
con las mismas plaquetas del paciente, sin la presencia del
fluorocromo. Las plaquetas son el componente celular ms
pequeo de la sangre, y no es necesario lisar los eritrocitos
o eliminar algn detritus de la muestra, pues es simple el
acceso con respecto a las plaquetas que se analizan.
Est aumentando el inters sobre el papel de las plaquetas en los desrdenes trombticos. Esto ha conducido a la
investigacin de plaquetas para identificar poblaciones activas de plaquetas durante episodios trombticos, por ejemplo, despus de reemplazos de la prtesis de vlvula del
corazn. Se han identificado dos marcadores importantes
de la activacin. Uno se debe a los cambios en la conformacin de las glucoprotenas membranales, notablemente en
las protenas IIb/IIIa. Este cambio expone sitios al ambiente externo que, en la plaqueta inactiva, se ocultan dentro de
regiones enrolladas de las molculas. Muchos anticuerpos
se generan dirigidos contra estos eptopos de la activacin.
Estos antgenos de la activacin slo son demostrables en
las plaquetas que se han activado con las soluciones dbiles
de trombina y son negativos en las plaquetas sin tratar. Un
segundo tipo de protena de activacin se identifica cuando
las partes de los -grnulos se expresan sobre la membrana
superficial de las plaquetas. Esto sucede cuando los grnulos han pasado por el proceso secretorio y la membrana
de stos se ha incorporado a la membrana externa de la
plaqueta. Se les ha nombrado como componente granular
derivado de la activacin plaquetaria para la membrana
externa (PADGEM). Usando anticuerpos dirigidos contra
estos marcadores, solos o combinados, y un citmetro del
flujo con la tcnica discutida antes, es posible determinar la
proporcin de plaquetas activadas.
293
Tromboelastograma
Un acercamiento ms fisiolgico y global a la funcin plaquetaria se evala usando un tromboelastograma que mide
la coagulacin en funcin de la temperatura, los factores
fibrinolticos y la funcin de la plaqueta supervisando las
caractersticas fsicas del cogulo y su capacidad para realizar trabajo mecnico a travs de su desarrollo y degradacin. Se agrega CaCl2 a la sangre venosa tratada con citrato
dentro de una cubeta a temperatura regulada (37C) que
oscila en un ngulo de 4 45. Un pistn disponible se coloca dentro de la muestra inmediatamente despus de la
recalcificacin. El torque de la cubeta rotante se transmite
al pistn sumergido despus de que la relacin plaquetafibrina acopla a la cubeta y al pistn. La magnitud del movimiento del pistn depende de la fuerza del acoplamiento,
con cogulos fuertes que mueven el pistn directamente
dentro de la fase con el movimiento de la cubeta. Cuando
el cogulo se contrae o disuelve, las uniones se rompen y
disminuye la transferencia del movimiento de la cubeta. Se
proporciona informacin sobre el tiempo de formacin del
filamento de fibrina, la cintica de la formacin del cogulo
y la disolucin del cogulo. Este acercamiento se utiliza
cada vez ms en el cuidado intensivo que se establece para
vigilar el estado de coagulacin.
Ahn YS et al. Activated platelet aggregates in thrombotic thrombocytopenic purpura: decrease with plasma infusions and normalisation in remission. Br J Haematol 1996; 95: 408-415.
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White JG. Platelet ultrastructure. Haemostasis and Thrombosis,
2nd edn. 1987: Churchill Livingstone, London.
31
Servicio transfusional del hospital
Un servicio de transfusion sangunea del hospital emprende tres investigaciones serolgicas importantes: a) identificar el grupo sanguneo de un paciente; b) detectar e
identificar los anticuerpos irregulares, incluyendo aquellos
que inducen anemia hemoltica; c) proporcionar componentes sanguneos compatibles con los pacientes.
Identificacin del grupo sanguneo

Los mtodos de laboratorio aplicados a la serologa de la
transfusin estn cambiando muy rpido para satisfacer una
necesidad creciente de simplificar y automatizar muchos aspectos del servicio. Los principios de la serologa, sin embargo, siguen siendo los mismos. Hay aproximadamente
100 antgenos reconocidos en la membrana del eritrocito,
la presencia de los cuales pueden identificarse por la aglutinacin de los eritrocitos al exponerse con el anticuerpo o
el antisuero correspondiente. La mayor parte de los antgenos del grupo sanguneo surgen naturalmente, y la exposicin del antgeno puede estimular una respuesta primaria
con anticuerpos en una persona que carece del antgeno. El
aloanticuerpo resultante es especfico para ese antgeno, y la
exposicin adicional al antgeno estimula una respuesta rpida y prolongada del anticuerpo, con el potencial de inducir
una reaccin significativa de transfusin. Una hemlisis intravascular rpida se produce por la unin del anticuerpo (por
lo general, IgM) al antgeno y activacin de la cascada del
complemento. Esto resulta en incompatibilidad ABO cuando el anti-A o el anti-B, naturalmente presente en el suero
del receptor, se expone al antgeno apropiado. Es normal que
un individuo genere anticuerpos que surgen de modo natural
contra los antgenos AB ausentes en sus propios eritrocitos,
debido a la estimulacin del mismo antgeno encontrado en

otras sustancias biolgicas, tales como polen o bacterias. Un
grupo sanguneo individual puede determinarse agregando
directamente los antisueros especficos a los eritrocitos de
prueba y de manera indirecta con una adicin de eritrocitos
de especificidad antignica conocida a los sueros de prueba. Para determinar un grupo sanguneo de un paciente se
requiere la caracterizacin de los antgenos del eritrocito.
Para determinar el grupo sanguneo de forma rutinaria, es
necesario identificar los antgenos A, B y D. La gente que
expresa el antgeno A en las clulas no produce anti-A pero
puede producir el anti-B. La gente que expresa el antgeno
B no produce normalmente el anti-B pero puede producir el
anti-A, mientras que el grupo O no expresa el antgeno A o
el B. Histricamente, la identificacin del antgeno se realiz
usando anticuerpos purificados de pacientes previamente tipificados. Hoy en da, la mayor parte de los anticuerpos de
tipificacin son anticuerpos monoclonales modificados con
qumicos. Para su facilidad de empleo, los anticuerpos comerciales tienen un tinte coloreado especfico agregado a
los anticuerpos anti-A y anti-B. Un mtodo indirecto para
comprobar el grupo sanguneo de un paciente es hacer
reaccionar el suero de un paciente, que contiene los anticuerpos, con clulas de especificidad conocida ABO, lo cual da
un grupo contrario o inverso. As, el suero de un paciente del
grupo A reacciona con las clulas B, los pacientes del grupo
B reaccionan con las clulas A, y los pacientes del grupo O
reaccionan con las clulas A y B. Los escasos pacientes que
poseen los antgenos A ms B no reaccionan con ninguna
clula. Una revisin adicional y parte de la investigacin
para los anticuerpos irregulares es colocar el suero del paciente con las clulas del grupo O, que no deben reaccionar,
independientemente del grupo sanguneo del paciente.
296
CAP. 31
Cuadro 31-1
Grupo
Rh
A
A Rh
B Rh
B Rh
AB Rh
AB Rh
O Rh
O Rh
SERVICIO TRANSFUSIONAL DEL HOSPITAL
Resultados esperados de los grupos sanguneos comunes
Anti-A
Anti-B
Anti-AB
Clulas A
Clulas B
Clulas O
Anti-D1
Anti-D2
Es importante incluir controles negativos apropiados,

como clulas del propio paciente o clulas O. Las clulas
que se utilizan como control son necesarias para identificar las reacciones que producen los anticuerpos fros en la
muestra, excepto los anti-A y anti-B.
El sistema rhesus (Rh)
Es el segundo sistema ms importante de grupos sanguneos por identificar. Diferente a lo que ocurre en el sistema
ABO, los anticuerpos no estn presentes en forma natural
en ausencia del antgeno; sin embargo, los anticuerpos pueden formarse con facilidad despus de la exposicin de clulas rhesus positivas (Rh+) en un receptor husped rhesus
negativo (Rh). Los anticuerpos formados, por lo general
IgG, pueden cruzar la barrera placentaria, ocasionando que
en el segundo o subsecuentes embarazos, en los cuales la
madre es Rh y el feto Rh+, desarrolle la enfermedad hemoltica del recin nacido (HDN). Es, por tanto, importante
que se realicen todos los esfuerzos para evitar la sensibilizacin de las mujeres en edad de tener hijos al antgeno
D. Los exmenes de grupo sanguneo rhesus se realizan
por duplicado, empleando un anticuerpo IgM monoclonal
anti-D. Los controles positivos y negativos se incluyen en
cada lote de pruebas y los resultados deben evaluarse por
microscopia, despus de la centrifugacin de los tubos,
por 1 min a una velocidad baja. En el Reino Unido, las
directrices nacionales recomiendan el uso de dos reactivos
anti-D diferentes. El antgeno D es un antgeno complejo
compuesto de muchos subantgenos (eptopos) diferentes.
Los anticuerpos monoclonales tienen una especificidad
elevada y pueden reaccionar a eptopos simples; por tanto,
si el eptopo particular al cual el reactivo reacciona est
ausente se obtiene un resultado negativo falso.
Usando estos ocho reactivos (anti-A, anti-B, anti-AB,
anti-D, anti-D2, clulas A, clulas B y clulas O), es posible identificar a los grupos sanguneos comunes (cuadro
31-1).
Mtodos para identificar el grupo sanguneo

Hay muchos mtodos que usan estos reactivos bsicos para
conocer el grupo de los pacientes, los cuales pueden dividirse en cinco categoras amplias: a) mtodos basados en
tubos individuales, convencionales, que requieren cerca
de una hora de incubacin a una temperatura ptima de
16C; b) mtodos en tubos individuales mejorados (para
determinaciones de grupos sanguneos rpidamente), que
requieren siempre centrifugacin, se realizan slo para la
tipificacin de la clula; c) mtodos que usan placas de
microtitulacin; d) mtodos que usan una matriz de fase
slida; e) mtodos automticos basados en los principios
de flujo continuo. El mtodo elegido depende del volumen de trabajo que se emprenda y de su urgencia. Los mtodos rpidos empleados con regularidad comprueban slo
los antgenos del paciente sin un anlisis completo.
La visualizacin de los resultados vara dependiendo
del mtodo empleado. Para los mtodos de tubo y de microtitulacin es necesaria la aglutinacin de los eritrocitos,
que puede interpretarse micro o macroscpicamente. Las
metodologas de microtitulacin y de grupo rpido tienden
a utilizar la visualizacin macroscpica, mientras los mtodos no realzados se emplean para ser interpretados por
microscopia.
Mtodos de microtitulacin
Las metodologas de microtitulacin permiten que se hagan fcilmente grupos mltiples en lotes. Una placa de
microtitulacin estndar se forma de 96 celdillas en un
bloque plstico slido, alineado en 12 hileras de ocho.
Usando ocho reactivos para un grupo completo, la sangre
de 12 pacientes puede concentrarse en una placa. La visualizacin de todos los grupos sanguneos en la placa es
rpida, usando contraluz para ver los resultados positivos
y negativos. Hay sistemas disponibles con computadoras y
microrrobtica para automatizar o semiautomatizar los
TAMIZAJE DE ANTICUERPOS
297
Figura 31-1 Anlisis del grupo sanguneo ABO del sistema en gel con una muestra del grupo B Rh. Reproducida con permiso de
DiaMed-GB Ltd.
sistemas para conocer el grupo sanguneo por microtitulacin. Estos sistemas incorporan lectores de placas de microtitulacin que pueden programarse para identificar los
grupos sanguneos por patrn de reactividad de la placa de
microtitulacin.
el volumen de la carga de trabajo. Las tcnicas rpidas se

realizan para identificar el grupo sanguneo del paciente
en una urgencia cuando se requiere la sangre para la compatibilidad cruzada (cross-matching), permitiendo que la
sangre de un grupo sanguneo compatible se seleccione sin
demora.
Sistemas en gel
Tamizaje de anticuerpos
Los sistemas en fase de gel se basan en la captura de clulas
que reaccionan en una matriz slida o semislida, con los
resultados negativos que se movilizan a travs del gel. Esto
ocurre para colocar los anticuerpos monoclonales, que se
mencionan antes, qumicamente unidos a la matriz. As, las
clulas que contienen el antgeno correspondiente se unen
(atrapadas en la matriz) cuando son empujadas para movilizarse en el gel al utilizar centrifugacin (fig. 31-1). Este
mtodo es en particular til para conocer el grupo sanguneo de pacientes en riesgo elevado de portar en la sangre
microorganismos, como el de hepatitis o el VIH. El alto
costo de fabricar los geles que incorporan los anticuerpos
especficos necesita considerarse al incluir esta metodologa en la prctica de rutina del laboratorio.
Sistemas automatizados
Mtodos automticos que usan equipo que puede utilizar la identificacin positiva de la muestra y se requieren
en laboratorios con mucha carga de trabajo. Al utilizar un
equipo automtico reduce el tiempo de manipulacin de
la muestra, y los pacientes se benefician de la eliminacin
de errores administrativos, ya que los resultados pueden
reportarse directo desde la lectura sin transcripcin. El
gran desembolso de capital requerido encarece los sistemas automticos, es decir, son demasiado costosos para los
laboratorios con una carga de trabajo baja. La mayor parte
de los laboratorios utiliza dos tcnicas, un sistema rpido
para el anlisis urgente y un sistema rutinario de lote para
El tamizaje de los sueros del paciente para la presencia de

cualquier anticuerpo irregular ahora es una parte rutinaria
del banco de sangre de los hospitales. Es raro en la actualidad emprender una identificacin del grupo sanguneo sin el tamizaje del anticuerpo al mismo tiempo, con
la excepcin posible de las muestras neonatales, donde la
produccin del anticuerpo no ha comenzado y el tamao de
muestra es pequeo.
Para muchos pacientes que se someten a procedimientos quirrgicos de urgencia y electivos, la investigacin del
grupo sanguneo y el tamizaje del anticuerpo es todo lo que
se recomienda. Esta poltica ha reducido mucho el desperdicio de sangre, con la compatibilidad sangunea cruzada
reservada para los procedimientos con una probabilidad
mayor de 30% de requerimiento celular. Para los pacientes
en quienes un anticuerpo significativo clnico se identifica
con el procedimiento de la prueba de tamizaje, una compatibilidad cruzada completa es necesaria.
Existen diferentes propiedades fisicoqumicas exhibidas por diferentes anticuerpos que son importantes en su
identificacin. Primero, diversos anticuerpos del grupo sanguneo se distinguen uno de otro con base en que algunos
anticuerpos aglutinan eritrocitos mejor con bajas temperaturas (anticuerpos fros), mientras otros son activos a 37C.
Los anticuerpos fros con frecuencia son anticuerpos IgM,
y es posible que no sean detectables o clnicamente significativos a temperaturas ms altas. Algunos anticuerpos que
surgen en forma natural, como los anti-A y anti-B, aun reaccionan a 37C; sin embargo, el ttulo ser mucho ms alto de
298
CAP. 31
Figura 31-2 Ejemplo de clulas para el tamizaje de anticuerpos. Reproducida con permiso de DiaMed-GB Ltd.
0 a 4C. Los anticuerpos calientes son, por lo general, IgG

y aglutinan eritrocitos ms rpido a 37C. Histricamente,
los anticuerpos tambin se han clasificado como completos
o incompletos, dependiendo de la cantidad de aglutinacin
de eritrocitos suspendidos en una solucin salina normal.
Los anticuerpos incompletos no aglutinan eritrocitos bajo
tales circunstancias, y esto conduce a la bsqueda de otras
tcnicas para mejorar la sensibilidad. Los eritrocitos suspendidos en 20 a 30% de albmina bovina pueden ayudar a
identificar muchos anticuerpos incompletos. Otros mtodos
que emplean el polibreno o las clulas tratadas con enzimas
se emplean de rutina. Las enzimas como la tripsina, la papana, la bromelana o la ficina se utilizan para eliminar el cido
neuramnico de las superficies de los eritrocitos y reducir
la carga negativa, provocando que el anticuerpo incompleto
aglutine las clulas tratadas con enzimas. Las pruebas salinas a temperatura ambiente, los mtodos de la albmina
y de la enzima se han reemplazado por la prueba indirecta de antiglobina (IAT). La ltima prueba muestra una elevada eficacia en identificar clnicamente los anticuerpos
significativos, y sin la desventaja de identificar los anticuerpos irrelevantes que pueden dar lugar a un serio retraso en el
laboratorio, pues la evaluacin y la identificacin adicionales del anticuerpo son necesarias.
El tamizaje del anticuerpo se emprende al reaccionar
los eritrocitos que contienen la mayor parte de los antgenos comunes del grupo sanguneo con el suero del paciente. Es frecuente mantener una serie de tres muestras
celulares, y los antgenos conocidos en cada muestra celular se obtienen de una hoja de informacin (fig. 31-2).
El tamiz del anticuerpo puede realizarse usando cualesquiera de las tcnicas que se emplean en el laboratorio,
pero con mayor frecuencia la prueba indirecta de antiglobulina se utiliza como el tamiz inicial. Esto es, porque la
prueba IAT es la ms sensible para la mayor parte de los
anticuerpos. Usando los nuevos sistemas en gel, se propone
que un tamiz del anticuerpo basado en la IAT negativa y la
seleccin de la sangre ABO Rh compatible sean suficientes
para emplear la sangre en un paciente, y la compatibilidad
cruzada ya no se requiere tanto. En la mayor parte de los
casos esto es verdad, pero hay un riesgo de que la sangre

incompatible pueda usarse en un paciente con anticuerpos
a un antgeno raro.
Prueba indirecta de antiglobulina
La IAT que usa eritrocitos suspendidos en solucin salina
de baja fuerza inica (LISS) es el mtodo recomendado
para el tamizaje del anticuerpo. En solucin salina normal
los grupos ionizados tanto en el antgeno como en el anticuerpo se neutralizan parcialmente con iones opuestos
cargados en la solucin. El tiempo de incubacin mnimo
para las tcnicas de fuerza normal inica es de 45 min y no
es muy recomendado.
Si la LISS se utiliza como medio, las reacciones del antgeno y del anticuerpo son ms rpidas. La LISS es una
solucin de glicina ms sodio que contiene 0.03 M de cloruro de sodio. Es raro que los autoanticuerpos dependientes
de LISS puedan detectarse y, en estas circunstancias, las
tcnicas de fuerza inica normal son tiles.
Las clulas de tamizaje que se utilizan en la deteccin
del anticuerpo deben tener expresin homocigota de los
antgenos apropiados (Rh, Cc, Ee, Jka, Jkb, Fya, Fyb, Ss).
Se espera que el 99.9% de anticuerpos sea detectado, slo
con anticuerpos en los eritrocitos de muy de baja frecuencia que no es posible visualizar. Despus de la incubacin
del suero de prueba con los eritrocitos de tamizaje, las clulas se lavan para remover cualquier anticuerpo no unido.
Cualquier contaminacin por globulina libre neutraliza el
componente antiglobina en el reactivo antiglobulina, y por
tanto debe evitarse.
El anti-IgG monoespecfico puede utilizarse sustituyendo un reactivo poliespecfico antiglobulina que contenga
sueros anticomplemento, con el mtodo de LISS IAT. Esto
evita la susceptibilidad indeseable hacia la interfase de amplitud trmica baja y a los anticuerpos dependientes LISS
que estn ligados al complemento. Cuando se identifica un
anticuerpo irregular, es necesaria la investigacin adicional
para identificar la especificidad del anticuerpo.
Figura 31-3 Ejemplo de un antigrama mostrando un rango amplio de antgenos. Reproducida con permiso de DiaMed-GB Ltd.
300
CAP. 31
Identificacin del anticuerpo

Si un resultado positivo se obtiene en cualesquiera de las
clulas de tamizaje del anticuerpo es esencial identificar
la especificidad del anticuerpo. Esto requiere hacer reaccionar los sueros con un panel ms grande de clulas tipificadas. Es comn que los paneles comerciales contengan
11 tipos de clulas y se abastezcan con un antigrama de los antgenos correspondientes (fig. 31-3). La identificacin del
anticuerpo se produce comparando el patrn reactivo del anticuerpo con el patrn de los antgenos. Si la sangre se requiere para transfusin, slo las unidades negativas para
el antgeno correspondiente deben seleccionarse. Como
en el tamiz del anticuerpo cualquier mtodo puede utilizarse, pero es mejor comenzar con la misma tcnica con la
que se obtuvo la reaccin positiva en el tamiz del anticuerpo. Con frecuencia esta es la IAT. Si los resultados de este
panel son inconcluyentes pueden clarificarse con facilidad
repitiendo el panel con una tcnica mejorada enzimticamente. Incluso, si la identificacin es an inconcluyente,
debe utilizarse un panel diferente de clulas. Los resultados
no concluyentes pueden requerir la toma de una muestra
fresca para verificar que el anticuerpo es verdadero y no un
contaminante de la muestra. Si la identidad del anticuerpo
contina como desconocida, es posible que se necesite enviar la muestra al centro de referencia, donde permanece
disponible en un panel ms grande donador para ayudar a
la identificacin.
Compatibilidad cruzada
La compatibilidad cruzada es el procedimiento realizado para asegurarse que la sangre del donador potencial es
compatible con el receptor. Una vez que se obtienen los
grupos ABO Rh y el tamiz negativo del anticuerpo, las comparaciones de la sangre pueden hacerse de manera directa.
Las unidades donadoras deben, en lo posible, seleccionarse
del mismo grupo ABO y Rh. El tipo de producto del eritrocito necesita considerarse; por ejemplo, la sangre completa, el concentrado de eritrocitos, las clulas con suplemento
agregado, pobre o escaso en leucocitos. Esto depende de
la condicin clnica que se requiere para la transfusin y
de la edad del receptor. Adems, es necesario verificar que
las mujeres menores de 50 aos que donan estn dando
eritrocitos Kell negativos. Esto es necesario porque los anticuerpos producidos contra el antgeno Kell pueden cruzar
la barrera placentaria. Las mujeres estimuladas al producir
anti-Kell por la transfusin, que se embarazan, pueden tener un beb que desarrolle anemia hemoltica in utero.
Una vez que se selecciona el producto correcto, el procedimiento de compatibilidad cruzada es relativamente
directo, ya que las clulas del donador recolectadas se lavan

y se hacen reaccionar con el suero del receptor. La eleccin
de la tcnica es la misma que se emplea para el tamizaje del
anticuerpo, pero debe incluir un mtodo indirecto con antiglobulina. Cualquier unidad que da una reaccin positiva no
debe transfundirse. Son muy raros los casos donde es imposible obtener unidades compatibles, por ejemplo, en pacientes con autoanticuerpos fuertes en el suero. En estos
pacientes debe realizarse una autocompatibilidad cruzada
(las clulas del receptor contra el suero del receptor). Las
unidades que no exhiben mayor fuerza de reactividad que
en el autocruce autoautlogo pueden usarse.
Todos los autoanticuerpos deben investigarse ms a fondo para identificar especificidad y rango trmico del anticuerpo. Para esto es posible que se requieran tcnicas de
elucin.
Mtodos de elucin
Es posible remover los anticuerpos ligados a los antgenos
del eritrocito, sin alterar su especificidad antignica, por un
proceso que se denomina elucin; son tres procedimientos
principales para la elucin: temperatura, pH bajo y solventes orgnicos.
Temperatura
El sistema de temperatura de elucin utilizado con ms frecuencia consiste en calentar los eritrocitos lavados a 56C
por 5 min. Despus de la centrifugacin, el sobrenadante
contiene los anticuerpos. Con el congelamiento de las clulas lavadas suspendidas en albmina se obtiene el mismo
sobrenadante hemolizado, que despus de la centrifugacin est listo para la investigacin. Ambos mtodos son
rpidos y fciles de montar en cualquier laboratorio.
pH bajo
Si los eritrocitos lavados se resuspenden en amortiguadores
con un pH por abajo de 3.5, los anticuerpos IgG pueden
recuperarse de las membranas celulares sin lisis. Aunque
el pH bajo es la tcnica recomendada de elucin, un pH
sobre 10 parece dar mejores resultados para los anticuerpos
IgM.
Solventes orgnicos
Aunque los resultados de los eluidos usando ter o xileno
son muy buenos para los anticuerpos IgG, los riesgos para
PRCTICA DE LA TRANSFUSIN
los trabajadores por la exposicin a estos solventes restringen su uso a los laboratorios con campanas de extraccin.
Una vez que la elucin est preparada, se le sustituye por el
suero en un mtodo de identificacin del anticuerpo.
Prctica de la transfusin
La prctica actual de la transfusin hospitalaria debe incluir sistemas para minimizar el uso de los productos sanguneos en lo posible. La transmisin potencial de virus
patgenos de la hepatitis B, C, VIH y CMV en productos
sanguneos, junto con un riesgo potencial de la enfermedad
de Creutzfeldt Jakob (ECJ), ha promovido la creacin de
medidas para mejorar la seguridad de los productos sanguneos. stas incluyen sistemas mejorados para la seleccin
del donador, tamizaje viral de rutina, el uso de productos
inactivados del plasma y agotamiento de leucocitos de
los productos del eritrocito. Las medidas para minimizar
el uso de los productos de transfusin incluyen el uso de
esquemas de ordenamiento mximo de la sangre, el desarrollo de la prctica de transfusin autloga y la participacin en el sistema que reporta los Riesgos Serios de la
Transfusin (SHOT). El ltimo es un sistema de divulgacin voluntario del Reino Unido de diversos acontecimientos serios despus de la transfusin. Los acontecimientos
301
adversos agudos incluyen las reacciones hemolticas de la

transfusin, infusin de productos sanguneos contaminados por bacterias, lesin aguda del pulmn relacionada con
la transfusin, sobrecarga de fluido, reacciones alrgicas
graves o anafilaxis y prpura postransfusin. Las complicaciones potenciales a largo plazo ocurren por infeccin viral
(vase antes), injerto crnico vs. enfermedad del husped
grave en los inmunosuprimidos, y sobrecarga de hierro. En
todos los casos los riesgos de la transfusin necesitan un
balance contra los de no recibir los productos sanguneos.
Los pacientes deben, por tanto, tener acceso e informrseles apropiadamente sobre los riesgos.
Guidelines for Pretransfusion Compatibility Procedures in Blood
Transfusion Laboratories. Transfusion Med 1996; 6: 273-283.
Issitt PD. Applied Blood Group Serology, 3rd edn. 1985: Montgomery Scientific; Miami, FL.
Knight RC, DeSilva M. New technologies for red cell serology,
Blood Rev 1996; 10: 101-110.
Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M. Blood Transfusion
in Clinical Medicine, 9th edn. 1993: Blackwell Scientific,
Oxford.
32
Citometra de flujo y biologa molecular
en la hematologa
Ian Chant
Introduccin
La utilidad diagnstica de la citometra de flujo y de la biologa molecular contina extendindose dentro de diversas
reas de la hematologa clnica. La combinacin de una
aproximacin inmunobiolgica y molecular al diagnstico
y a la vigilancia del paciente ha demostrado ser ms til
respecto de las neoplasias sanguneas que en cualquier otra
rea de la biologa del cncer.
En la citometra de flujo, el desarrollo de nuevos analizadores automatizados, de mesa de trabajo y las combinaciones de anticuerpos monoclonales disponibles en el
comercio permite una aproximacin multiparamtrica al
diagnstico. Con ello se logra una definicin exacta de la
inmunofenotipificacin de clulas especficas. La acumulacin de datos de inmunofenotipificacin es importante, no
slo desde un punto de vista del diagnstico sino tambin
en trminos de la evaluacin pronstica. En diferentes neoplasias hematolgicas, la expresin o la ausencia de ciertos
antgenos muestra una importancia pronstica. Adems,
la citometra de flujo ahora se utiliza en la vigilancia del
tratamiento, en particular en trminos de la deteccin de
enfermedad residual mnima.
De manera similar, la biologa molecular se contina
extendiendo como herramienta indispensable en el diagnstico y vigilancia de la enfermedad. Las tecnologas
moleculares ms importantes de la hematologa de diagnstico son la hibridacin in situ fluorescente (FISH) y las
metodologas de la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR). Las estrategias moleculares son nicas en la deteccin de alteraciones genticas especficas que se observan
en las neoplasias sanguneas. Adems, la demostracin de
la clonalidad en los desrdenes linfoproliferativos se consigue con tcnicas moleculares.
La importancia de un estudio del fenotipo inmunolgico
y molecular combinado para el diagnstico de la leucemia y
del linfoma se demuestra en una publicacin reciente de la
Organizacin Mundial de la Salud (OMS), que las clasifica en neoplasias hematopoyticas y linfoides. Este sistema
relaciona clasificaciones anteriores con nuevos datos generados a partir de la citometra de flujo y de la biologa
molecular, al incorporarlos dentro de un sistema con importancia clnica. Esto se ejemplifica por el desarrollo de
las modalidades del tratamiento enfocadas a las alteraciones genticas especficas.
En otras reas de la hematologa, la citometra de flujo y la biologa molecular continan evolucionando como
herramientas indispensables para el diagnstico clnico.
La base gentica de las hemoglobinopatas se contina
esclareciendo, mientras que las tcnicas moleculares son
cada vez ms importantes en el diagnstico de las coagulopatas.
En este captulo se delinean los principales usos de estas dos tecnologas en el laboratorio de hematologa y se
ilustra cmo la combinacin de la informacin inmunobiolgica y molecular produce un profundo impacto sobre el
diagnstico y la comprensin de la biologa de las alteraciones hematolgicas.
304
CAP. 32
CITOMETRA DE FLUJO Y BIOLOGA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGA
Citometra de flujo e inmunofenotipificacin

El uso ms importante de la citometra de flujo en el laboratorio de hematologa diagnstica es la identificacin del
linaje celular en leucemias y linfomas. La expresin de antgenos de superficie celular que dependen del linaje y de la
diferenciacin permite el uso de anticuerpos monoclonales
especficos, marcados con fluorocromos, para detectar estos antgenos. Los anticuerpos monoclonales que reconocen eptopos especficos de antgenos son identificados por
el grupo de designacin numrica (CD). En el momento de
escribir este captulo, se han asignado cerca de 250 nmeros de CD y muchos de stos son en particular importantes
en la inmunofenotipificacin de clulas hematopoyticas.
La aproximacin al diagnstico de la leucemia y del
linfoma utiliza un panel de anticuerpos monoclonales que
identifica el linaje especfico de una poblacin celular, y
provee un fenotipo inmunolgico especfico para una supuesta poblacin de clulas malignas. Junto con la informacin morfolgica y molecular, este dato de la citometra
de flujo es una herramienta esencial en la clasificacin de la
clula maligna.
Inmunofenotipificacin de leucemias agudas

El objetivo de la fenotipificacin inmunolgica en una leucemia recin diagnosticada es sobre todo discriminar entre
la leucemia mieloide y la linfoide. Esto puede conseguirse usando un panel relativamente pequeo de anticuerpos
monoclonales, que detectan antgenos especficos del linaje expresados en clulas mieloides o linfoides inmaduras, discriminando leucemias mieloides agudas (AML) de
leucemias linfoblsticas (ALL). El panel inicial del linaje
primero debe diferenciar la clula B de la clula T en ALL
y permitir la definicin adicional del subtipo, por ejemplo,
de marcadores monocticos y megacariocticos en AML.
El cuadro 32-1 muestra un panel tpico de la primera lnea
del anticuerpo para el diagnstico de la leucemia aguda.
Este panel inicial incluye el linaje B (CD10, CD19, CD20,
CD22), el linaje T (CD2, CD3, CD7) y los marcadores
mieloides asociados (CD13, CD33, CD117), otros ms que
ofrecen la informacin sobre el grado de diferenciacin celular (TdT, CD34).
Leucemias mieloides agudas

Los marcadores mieloides especficos ms tiles usados
para discriminar las clulas mieloides de aquellas de origen
linfoide son CD13, CD33 y CD117. La expresin de antgenos linfoides est ausente en clulas AML, a excepcin
de CD7 y de Tdt, que pueden ser positivos en pocos casos.
Cuadro 32-1 Un panel de anticuerpos usados como primera lnea

para determinar el linaje y la diferenciacin en leucemias agudas
Linaje
linfoide
CD3
CD7
CD19
CD10
CD79
Linaje
mieloide
Linaje sin
restriccin
CD13
CD33
CD14
CD64
CD15
CD117
MPO
HLA-DR
CD34
Tdt
Pan-T (tambin CD3

citoplsmico)
Pan-T
Pan-B
Pre-B
Pan-B (expresin
citoplsmica)
Granulocitos, monocitos
Progenitor mieloide, monocitos
Monocitos
Monocitos
Granulocitos, monocitos
Progenitor mieloide
Mieloperoxidasa
Clula progenitora
Clula progenitora
(Expresin nuclear)
Cuadro 32-2 Clasificacin de leucemias mieloides agudas mediante el sistema Francs-Americano-Britnico (FAB)
AML M0
AML Ml
AML M2
AML M3
AML M4
AML M5a
AML M5b
AML M6
AML M7
AML con inmadurez

AML con maduracin mnima
AML con maduracin
Leucemia promieloctica aguda
Leucemia monoctica aguda
Monoblstica aguda sin diferenciacin
Monoblstica aguda con diferenciacin
Eritroleucemia aguda
Leucemia megacarioctica
Las AML son clasificadas por el sistema Francs-Americano-Britnico (FAB) sobre fundamentos morfolgicos
y citoqumicos (cuadro 32-2). En AML, aunque no hay
marcadores especficos que distingan los subtipos AML
M1-M5, la inmunofenotipificacin se correlaciona razonablemente bien con el subtipo FAB, algunos marcadores
son expresados preferentemente dentro de ciertos grupos.
stos incluyen los marcadores monocticos CD14 y CD64
en las categoras M4 y M5, mientras que los subtipos ms
raros M6 y M7 de AML pueden caracterizarse por su expresin de antgenos especficos para el eritrocito y para
la plaqueta, respectivamente. Las clulas AML M0 carecen de diferenciacin y expresan antgenos mieloides ms
CD34, el marcador hematopoytico de la clula embrionaria, mientras que en AML M1 hay generalmente slo
expresin de antgenos mieloides. El cuadro 32-3 enumera
los inmunofenotipos generales vistos en AML en relacin
con su clasificacin FAB.
305
CITOMETRA DE FLUJO E INMUNOFENOTIPIFICACIN
Cuadro 32-3
CD
Linaje mieloide
CD11b
CD13
CD14
CD15
CD33
Linaje T
CD2
CD3
CD5
CD7
Linaje B
CD10
CD19
CD20
Linaje eritroide
Glucoforina A
CD71
Linaje megacariocito
CD41
CD42
CD61
Clula embrionaria
CD34
CD38
No dependiente de linaje
HLA-DR
Inmunofenotipos tpicos en AML correlacionados con la clasificacin FAB
Anticuerpos
M1, M2
M3
M4, M5
M6
M7

T11, Leu-5b
T3, Leu-4
T1, Leu-1
3A1, Leu-9

CALLA, J5
B4, Leu-12
B1, Leu-16

D2.10
T9

gpIIb/IIIa
gpIb
gp/IIIa

MY10, HPCA-1
Leu-17

Mo1, Leu 15
MY7, Leu-M7
MY4, Mo2, Leu-M3
Leu-M1
MY9, Leu-M9
Ia, 13
La clasificacin reciente de la OMS de AML pone nfasis sobre las caractersticas morfolgicas, inmunofenotpicas
y moleculares, por lo que la AML se clasifica de acuerdo
con las alteraciones genticas recurrentes especficas, y
stas se relacionan a menudo con perfiles inmunofenotpicos especficos. En casos de AML, donde no son evidentes tales alteraciones genticas, stos se describen segn su
grado de diferenciacin y/o de diferenciacin a lo largo de
linajes monoctico, megacarioctico o eritroide. As que, el
inmunofenotipo es esencial en la caracterizacin de las clulas leucmicas de la misma forma que su utilizacin en el
sistema FAB.
de los primeros antgenos superficiales en el desarrollo de

la clula T es CD7, presente en todas las clulas T-ALL.
Las leucemias linfoblsticas de clula B pueden clasificarse dentro de tres grupos, de acuerdo a su grado de maduracin, que se relaciona con un fenotipo generalmente
caracterstico. ALL de clula nula, una leucemia inmadura,
tiene clulas que expresan marcadores de clula B (CD19,
CD22) ms TdT y CD34. La ALL comn se distingue por
la presencia de la expresin de CD10, junto con los antgenos de clula B y TdT. Las clulas B-ALL expresan todos
los antgenos de clula B comunes pero se distinguen por
la ausencia de TdT y de CD10.
Leucemias linfoblsticas agudas (ALL)
Desrdenes linfoproliferativos crnicos
Las leucemias agudas de origen linfoide se clasifican rutinariamente segn su origen, de clula B o de clula T. Las
clulas ALL de clula T expresan uno o ms de los antgenos de clula T (CD2, CD3, CD7) y Tdt. El antgeno CD3
se expresa en el citoplasma en los inicios de la maduracin
de la clula T y es el marcador ms til para T-ALL. Uno
La citometra de flujo es una herramienta esencial en el

diagnstico de desrdenes linfoproliferativos cronicos o
maduros. La inmunofenotipificacin se disea para demostrar la naturaleza de la clula B o T de la clula maligna, y para la clonalidad potencial de la expresin
superficial de la cadena ligera o sobre las clulas B. La
306
CAP. 32
aproximacin, es para usar un panel de primera lnea de anticuerpos especficos para un nmero de antgenos de clula
B y T, que identifican la clonalidad o la expresin del antgeno anormal. Un panel de segunda lnea puede aplicarse en
forma selectiva de acuerdo a estos resultados, ms algunas
indicaciones morfolgicas o clnicas pertinentes. El cuadro
32-4 ilustra paneles de primera y segunda lnea tpicos.
Las malignidades de la clula B representan la mayor
parte de los desrdenes linfoproliferativos maduros, y stos se relacionan por lo general con patrones particulares
de la expresin del antgeno de clula B. Adems de la
presencia o ausencia de ciertos antgenos, la interpretacin de datos inmunofenotpicos necesita considerar la
intensidad de la expresin del antgeno, demostrada por
citometra de flujo como intensidad de la fluorescencia.

Por ejemplo, en la leucemia linfoctica crnica (CLL), las
clulas B maduras coexpresan CD5 (un antgeno normalmente presente en las clulas B) ms CD23. En CLL, los
antgenos CD19 y CD20 de clula B estn subregulados,
al igual que la expresin de cadena ligera superficial. Por
el contrario, las clulas del linfoma de linaje B muestran
fuerte reactividad con CD19, CD20 y con cadenas ligeras superficiales o . En casos donde un diagnstico de
leucemia de clula pilosa se sospeche sobre bases morfolgicas o clnicas, se utilizan anticuerpos para CD11c,
CD25 y CD103, mientras en casos potenciales de posible
proliferacin celular linfoplasmactica o plasmtica, se
incluyen anticuerpos contra CD38 y CD138.
Los desrdenes linfoproliferativos de la clula T exhiben que un traslape de la expresin del antgeno CD y
las clulas malignas muestran a menudo prdida del antgeno o la expresin anormal de los marcadores de clula T. Ciertos marcadores son caractersticos, como la
expresin importante de CD25 en la leucemia de clula T
del adulto (ATLL), el incremento de reactividad con CD7
en la leucemia prolinfoctica de clula T del adulto, y la
expresin de CD56 en la leucemia del linfocito granular
grande (LGL).
En los desrdenes de las celulas B y T, el diagnstico
se basa no slo en el patrn inmunofenotpico revelado por
los paneles del anticuerpo, sino tambin refiere los niveles
de la expresin del antgeno, como se detecta por la intensidad de la fluorescencia durante el anlisis citomtrico de
flujo. Esto se ilustra en el cuadro 32-5, que muestra los
patrones inmunofenotpicos vistos en estos desrdenes.
Cuadro 32-4 Un panel de primera lnea para la investigacin

de una linfocitosis para establecer el linaje celular B y T
Linaje T
Linaje B
Anticuerpo
Linaje
CD2
CD3
CD4
CD8
CD7
CD19
CD20
CD22
CD23
CD103
SIg
SIg
Clulas T, clulas NK
Pan-T
Colaborador T
Supresor T
Pan-T
Pan-B
Pan-B
B madura
B inmadura, CLL
Clula pilosa
Cuadro 32-5 Patrones inmunofenotpicos en los desrdenes linfoproliferativos de clula B y T.

Desrdenes linfoproliferativos de clula B
Desrdenes linfoproliferativos
de clula B
CLL
PLL
NHL (difuso)
Linfoma de clula manto
Linfoma folicular
Leucemia de clula pilosa
Desrdenes linfoproliferativos
de clula T
T-PLL
L-GL
Clula de Szary
CD5
CD 10
CD19
CD20
CD23
CD25
FMC7
o

(w)
(s)
(s)
(s)

(s)

(w)
(s)
(s)
(s)
(s)
(vs)
CD2
CD3
CD4
CD5
CD8
CD16
CD25
CD56

Reactividad dbil (w); reactividad fuerte (s); reactividad muy fuerte (vs); leucemia linfoctica crnica (CLL); leucemia prolinfoctica (PLL); linfoma
no Hodgkin (NHL); leucemia linfoctica granular (L-GL).
307
BIOLOGA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGA
Valoracin de la funcin plaquetaria

por citometra de flujo
Biologa molecular en la hematologa
La disfuncin plaquetaria se observa en una variedad de

desrdenes sistmicos, incluyendo enfermedad renal, insuficiencia heptica, desrdenes del tejido conectivo, desrdenes mieloproliferativos y mielodisplsicos, malignidad y
enfermedad cardiovascular. La disponibilidad de anticuerpos monoclonales que reconocen antgenos especficos
tanto en la superficie de plaquetas inactivas como activas
proporciona los medios para la evaluacin de la funcin
plaquetaria. Esto incluye anticuerpos para P-selectina
(CD62P), una molcula de adherencia, que se desplaza a
la superficie de la plaqueta durante la activacin. Los anticuerpos dirigidos contra esta molcula slo se unen a plaquetas con degranulacin. Los anticuerpos tambin estn
disponibles para GPIIb/IIIa (CD41/CD61), un eptopo que
aparece cuando se activa la plaqueta. ste resulta de un
cambio conformacional que conduce a la unin del fibringeno con la superficie plaquetaria y posteriormente a la
agregacin plaquetaria.
Hasta hoy, el anlisis citomtrico de flujo de la funcin
plaquetaria no reemplaza a las pruebas clnicas estndares
para la funcin plaquetaria, como el tiempo de sangrado y
la agregometra plaquetaria. Esto se debe, en parte, al costo
de la prueba y a la destreza del operador, aunque la citometra ofrece varias ventajas como el anlisis de la sangre
completa, por lo que minimiza la activacin plaquetaria y se
requieren volmenes pequeos de sangre (20 l); por lo tanto, hacen posible los estudios neonatales. Las plaquetas de
pacientes con trombocitopenia profunda tambin pueden
analizarse con exactitud.
El impacto ms grande de las tcnicas de la biologa molecular en la hematologa ocurre en la identificacin de

alteraciones genticas relacionadas con leucemias y linfomas. La identificacin de la translocacin cromosmica,
que da lugar al cromosoma Filadelfia, caracterstica de la
leucemia mieloide crnica, fue el primer cncer humano
para el cual se estableci una base gentica. De hecho,
se entiende ms sobre la patogenia molecular de las malignidades hematolgicas que sobre cualquier otro grupo
de cnceres humanos. El cuadro 32-6 ilustra algunas alteraciones genticas selectas relacionadas con neoplasias
hematolgicas.
Las herramientas principales de la biologa molecular
que se emplean para detectar tales aberraciones genticas
son la hibridacin in situ, especialmente la FISH y la PCR.
Ambas tcnicas tienen una sensibilidad muy alta y son ms
rpidas que el anlisis citogentico convencional, el DNA o
RNA pueden extraerse a partir de sangre de mdula sea
o de una gran variedad de fluidos corporales para anlisis molecular. Estas dos tcnicas se usan para identificar
alteraciones cromosmicas y genes o mRNA anormales,
por ejemplo, la expresin de un oncogn. stas incluyen
rearreglos del gen inducidos por translocacin que involucran la activacin del oncogn, ms los rearreglos normales del gen que implican genes de cadena pesada y ligera
de inmunoglobulina que se utilizan para demostrar la clonalidad en neoplasias linfoides. Los ejemplos delineados
adelante ilustran cmo la FISH y la PCR se utilizan para
identificar estos rearreglos genticos en neoplasias hematolgicas.
Tabla 32-6 Algunas de las caractersticas citogenticas y moleculares frecuentes observadas en los neoplasmas hematolgicos
que son tiles en el diagnstico y como blancos para el monitoreo de la enfermedad
Enfermedad
Cariotipo
Gen anormal
Uso diagnstico
CML
AML
t(9;22)(q34;q11)
t(8;21)(q22;q22)
t(15;17)(q22;q21)
inv(16)(p13;q22)
t(12;21)(p13;q22)
t(4;11)(q21;q23)
t(8;14)(q24;q32)
t(1;14)(p32;q11)
t(7;9)(q34;q32)
t(14;18)(q32;q21)
t(11;14)(q13;q32)
BCR-ABL
AML 1-ETO
PML-RARA
CBF-MYH11
TEL-AML1
MLL-AF4
MYC desregulado
TAL1 desregulado
TAL2 desregulado
bcl-2 desregulado
bcl-1 desregulado
Diagnstico de CML
AML con maduracin
Promieloctico agudo
Mielomonoctico
Precursor B-ALL
Con frecuencia presentacin neonatal
Burkitt tipo ALL
T-ALL
T-ALL
Linfoma de centro folicular
Linfoma de clula manto
ALL
Linfomas
CML, leucemia mieloide crnica.

AML, leucemia mieloide aguda.
ALL, leucemia linfoblstica aguda.
308
CAP. 32
FISH para demostrar el cromosoma Filadelfia en CML

El cromosoma Filadelfia es el resultado de una translocacin recproca, t(9;22) (q34;q11), que causa un rearreglo
del gen que implica un oncogn celular, c-abl, y el gen
BCR (fig. 32-1). Esta reestructuracin se observa en 95%
de los pacientes con leucemia mieloide crnica (CML), generando un gen hbrido de la fusin BCR-ABL, que codifica para una protena con actividad creciente de la tirosina
cinasa. La activacin creciente de las protenas reguladoras
del crecimiento por bcr-abl incrementa el ndice mittico y
protege a las clulas contra la apoptosis.
Figura 32-2 Visualizacin de los genes bcr y abl usando FISH
para demostrar el gen bcr-abl fusionado sobre el cromosoma Filadelfia.
Demostracin de la clonalidad por estudios

de rearreglo del gen
El diagnstico de los desrdenes linfoproliferativos se basa
en mtodos inmunofenotpicos para demostrar clonalidad
y linaje celular. En las malignidades de clula B, la restriccin de la cadena ligera o puede evaluarse a menudo, pero para las de clula T la clonalidad es ms difcil
de determinar. Por tanto, el uso de tcnicas de la biologa
molecular para detectar clonalidad en clulas T o B es un
desarrollo diagnstico importante.
Figura 32-1 La translocacin recproca entre los cromosomas 9
y 22 produce un cromosoma 9 ms largo (der 9) y el cromosoma
Filadelfia Ph1, que contiene el gen fusionado bcr-abl.
Anlisis de la clonalidad de la clula B por PCR
La FISH puede usarse para visualizar los genes ABL y

BCR por medio de la hibridacin con sondas, de cidos nucleicos, complementarias a las secuencias de DNA en los
dos genes (fig. 32-2). Empleando una sonda marcada con
biotina para BCR, el gen BCR puede detectarse con avidina-FITC, que une la sonda marcada con biotina y puede
visualizarse como puntos verdes por medio de microscopia fluorescente. Una sonda para el gen ABL se marca con
digoxigenina y se detecta con antidigoxigenina-rodamina,
que emite una luz fluorescente como puntos rojos. La presencia del gen fusionado BCR-ABL sobre el cromosoma
Filadelfia, por tanto, se visualiza por los puntos rojos y verdes combinados.
Una gran cantidad de sondas marcadas estn disponibles
en el comercio y se utilizan con frecuencia en alteraciones
genticas observadas en leucemias y linfomas, lo anterior
permitir posiblemente la transferencia de las metodologas FISH dentro del laboratorio de diagnstico rutinario.
Durante el desarrollo de la clula B existen rearreglos de

la cadena pesada de inmunoglobulina (IgH), que involucra
regiones V (variable), D (diversidad) y J (acoplamiento),
que se fusionan para formar una unidad funcional. En una
poblacin normal de clula B, cada clula utiliza una combinacin diferente de segmentos V, D y J, aunado a que
existe insercin de pares de bases al azar en las uniones
V-D y D-J (fig. 32-3).
El mtodo de PCR utiliza dos iniciadores, uno que
corresponda a una secuencia consenso, encontrada en la
mayor parte de los segmentos V, y el otro a una secuencia consenso comn a la mayor parte de los segmentos J.
Cuando se amplifica el DNA, la longitud del producto de
PCR se determina por el nmero de nucletidos insertados
al azar durante la unin VDJ. En una poblacin normal de
clulas B, cada producto de PCR posee un tamao ligeramente diferente, de modo que cuando los productos de esta
amplificacin se separan por electroforesis, un barrido se
observa en el gel. En el caso de una poblacin neoplsica
de clulas B, todas con la misma reestructuracin VDJ, se
BIOLOGA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGA
309
Figura 32-3 Durante el desarrollo de la clula B, cada uno de los diversos segmentos V, D y J son ligados por rearreglo del gen. Usando
iniciadores V y J, el anlisis por PCR del DNA del gen de la inmunoglobulina se generan varios productos de PCR en clulas B normales.
En un desorden linfoproliferativo de la clula B, la clonalidad es demostrada por un solo producto o banda de PCR.
crea un producto de PCR de un solo tamao, que se visualiza por la predominancia de una banda discreta en la
electroforesis.
El anlisis de la clonalidad de la clula B por PCR tiene
diferentes ventajas. Puede realizarse en sangre perifrica,
mdula sea, tejido fresco o congelado y muestras incluidas en parafina. Se requieren muestras muy pequeas de
DNA y, como en la hibridacin in situ, los resultados estn
disponibles mucho ms rpido que con el anlisis citogentico convencional.
Estudios de los rearreglos del gen receptor de la clula T
El receptor para el antgeno en la mayor parte de las clulas
T maduras (TCR) comprende dos polipptidos, y , que
se ligan y relacionan con la molcula CD3. Una poblacin
ms pequea de clulas T tiene un heterodmero diferente, integrado por dos polipptidos diferentes, designados
y
, que tienen un grado de homologa con las cadenas y
, respectivamente. El desarrollo de la clula T normal implica la reestructuracin de estas cadenas para obtener una
poblacin heterognea de genes receptores de la clula T.
La clonalidad de las clulas T es una evaluacin comn
de PCR, usando el sitio TCR . sta es la cadena sencilla
ms apropiada para examinar, puesto que las extensiones
inmaduras de la clula T pudieron no experimentar la recombinacin , mientras el gen
se suprime durante una
recombinacin del gen. Por lo general, son tres grupos de
iniciadores de secuencia consenso para la cadena TCR

los que se usan, y de esta forma los productos amplificados
se separan por electroforesis. Una poblacin policlonal de
clula T da lugar a un barrido en el gel de los productos
de PCR, mientras que una poblacin monoclonal de clulas T malignas se demuestra por apenas una o dos bandas
distintas visibles en la electroforesis en gel.
Deteccin de la enfermedad residual mnima
La enfermedad residual mnima (ERM) se define como
aquellas clulas malignas que sobreviven despus de la
quimioterapia inicial de remisin-induccin. La deteccin de una poblacin potencial muy pequea de clulas
malignas, por ejemplo, en una de la mdula sea que est
morfolgicamente en remisin, puede tener implicaciones
pronsticas y teraputicas importantes. Las tcnicas de
citometra de flujo y biologa molecular se emplean para
vigilar la ERM.
Uno de los problemas principales con la citometra de
flujo es la identificacin de un inmunofenotipo especfico
de tumores. Sin embargo, algunos antgenos hematopoyticos se encuentran en las clulas malignas en combinaciones que no estn presentes en sangre normal o mdula
sea; por ejemplo, en la mayor parte de los casos de leucemia linfoblstica aguda de la clula T (T-ALL), las clulas malignas expresan TdT nuclear as como CD3, CD5 y
CD1. Este patrn no se observa normalmente en clulas T
310
CAP. 32
fuera del timo y puede utilizarse para demostrar clulas

T-ALL en sangre o en mdula sea. Otras combinaciones
inmunofenotpicas se utilizan en el anlisis de ERM para
ALL de clula B y leucemia mieloide aguda (AML), con
grados variables de xito. Un problema importante con las
tcnicas inmunolgicas son las limitaciones en la sensibilidad, y la citometra de flujo capaz de detectar una clula
blanco de entre 104 a 105 clulas. La mayor parte de los
estudios de la enfermedad residual, por tanto, utilizan la
sensibilidad extrema de la PCR para identificar las alteraciones genticas conocidas presentes en la malignidad
en cuestin. Por ejemplo, la deteccin de los genes resultantes de la fusin BCR-ABL se utiliza de manera extensa en el seguimiento de pacientes con CML, incluyendo
trasplantes de mdula sea posteriores. En desrdenes
linfoproliferativos, los rearreglos clonales nicos pueden
emplearse como blancos para los anlisis basados en la
PCR con sondas de cidos nucleicos especficas para las
clulas malignas de un paciente en particular. Tales aproximaciones requieren de mucho trabajo, pero cuanta ms
informacin llega a estar disponible desempea un papel
importante en la evaluacin del pronstico y de la elegibilidad para las diversas modalidades del tratamiento
especfico.
Diagnstico de hemoglobinopatas
La biologa molecular tiene ventajas profundas en la identificacin de mutaciones comunes especficas que dan
lugar a una sntesis alterada de la cadena globina. La PCR
se ha aplicado sobre todo a la deteccin de las mutaciones puntuales, deleciones y polimorfismos del DNA, para
proporcionar una prueba de tamizaje rpida que es en particular importante en el diagnstico prenatal. La opcin de
una tcnica especfica depende del grado de la enfermedad
definida a nivel gentico. Por ejemplo, en enfermedad de
clula falciforme el gen afectado se conoce por medio del
anlisis de la secuencia del DNA, y diferentes estrategias
pueden elegirse para amplificar y analizar un perfil del
DNA de un paciente por medio de la PCR. El conocimiento
de una mutacin puntual especfica permite el desarrollo de
tcnicas de amplificacin fluorescente para el tamizaje rpido. Estos mtodos utilizan iniciadores oligonucletidos
para las secuencias del DNA normales y mutantes, marcadas diferencialmente con molculas fluorescentes rojas
y verdes. Acoplando cada uno con un segundo iniciador
no marcado, los productos de PCR se pueden analizar por
fluorescencia diferencial roja y verde en un fluormetro,
obtenindose una tcnica de tamizaje rpida.
En enfermedades como las talasemias, los genes son
clonados y secuenciados, pero las mutaciones genticas
son heterogneas. El acercamiento a estudios de la herencia, por tanto, se basa en estudios de ligamiento, usando los
polimorfismos de longitud variable de los fragmentos de
restriccin (RFLP). stas son mutaciones del DNA, por lo
general en secuencias del DNA no codificantes, que se heredan ligadas con un gen y pueden por tanto convertirse en
marcadores tiles para la deteccin de un gen mutante en el
diagnstico prenatal.
Alteraciones genticas en las coagulopatas
En cuanto a las hemoglobinopatas, se ha identificado un
nmero creciente de mutaciones especficas de la enfermedad que conducen a alteraciones relacionadas con la coagulacin sangunea. La deteccin de mutaciones puntuales
en genes que codifican factores de coagulacin se utilizan
para estudios diagnsticos y de escrutinio familiar.
Una prueba muy usada es la deteccin basada en PCR
de la mutacin del factor V de Leiden. Se estima que 2 a
6% de la poblacin normal lleva esta mutacin, y la homocigosidad de los alelos informa que existe un riesgo
incrementado 80 veces de trombosis. La deteccin de la
mutacin utiliza iniciadores especficos de la secuencia, un
iniciador sentido, que es complementario a ambos factores normales V y FV de Leiden, y un segundo iniciador
antisentido complementario a ambos, el alelo FV normal
o el alelo FV de Leiden. La naturaleza del genotipo de FV
puede entonces determinarse por el anlisis de los productos de la amplificacin, puesto que ambos, el iniciador especfico normal o el especfico a FV de Leiden, amplifican
un producto.
Resumen
La citometra de flujo y la biologa molecular desempean
conjuntamente un papel fundamental en el diagnstico de
leucemias y de linfomas. El reconocimiento de los marcadores inmunofenotpicos y genticos anormales que se
relacionan con desrdenes hematolgicos particulares conducen a un anlisis replanteado del sistema de clasificacin
para las alteraciones hematolgicas. El sistema de clasificacin reciente publicado por la Organizacin Mundial
de la Salud (OMS) toma ms en cuenta estos desarrollos
y esfuerzos para utilizar las caractersticas inmunolgicas y
genticas junto con las observaciones morfolgicas. Esto
produce un sistema de clasificacin que tiene ms valor
clnico en trminos de modalidades del pronstico y del
tratamiento.
Los avances futuros en el tratamiento de estos desrdenes deben surgir de las modalidades que pueden apuntar
hacia las caractersticas inmunolgicas o genticas especficas de la enfermedad. Est claro que incluso dentro de
entidades distintas de la enfermedad, la perspectiva pronstica exacta para un paciente particular depende de una
variedad de factores, incluyendo la expresin de muchos
genes, algunos todava no identificados. Un desarrollo
inquietante implica la tcnica de los microarreglos de DNA,
que permiten la cuantificacin de miles de genes. Genes
distintos que son representados por fragmentos del cDNA
sobre un sustrato slido, miles de los cuales pueden acomodarse en un solo portaobjetos de vidrio. El cDNA o las
sondas de RNA marcados estn preparados a partir de clulas del paciente y se hibridan al microarreglo. La cantidad
de sonda que hibrida al DNA blanco del microarreglo es
proporcional a la expresin del mRNA del gen correspon-
311
diente en la clula del paciente. Este cuadro muy amplio,

de gran alcance de la expresin del gen, en el futuro, ciertamente nos dar un conocimiento de los factores implicados
en el proceso maligno y conducir a que se encuentre un
mejor tratamiento para los neoplasmas hematolgicos.
Jennings CD, Foon KA. Recent advances in flow cytometry:
application to the diagnosis hematologic malignancy. Blood
1997: 90: 2863-2892.
Provan D, Gribben J (eds). Molecular Haematology. 2000: Blackwell Science, Oxford.
Stamatoyannopoulous G (ed.). The Molecular Basis of Blood Diseases. 2001 W.B. Saunders, Philadelphia, PA.
33
Investigaciones hemticas
Frank Wells
La anemia puede ocurrir por prdida de sangre, destruccin

de eritrocitos o por una falla en la produccin de stos. El
fracaso para producir clulas sucede con ms frecuencia
por las deficiencias separadas o combinadas del hierro hematnico, de la vitamina B12 y del folato. La vitamina B12
se conoce ms por su nombre qumico apropiado, cobalamina, y es como se utiliza aqu.
El punto de partida para la investigacin de laboratorio de
la anemia es el conteo sanguneo. La macrocitosis y la pancitopenia son hallazgos caractersticos en las anemias megaloblsticas que producen la deficiencia de cobalamina y de folato, mientras la microcitosis y la hipocroma se caracterizan
por la deficiencia de hierro. El examen microscpico de sangre y de mdula produce los hallazgos caractersticos, pero en
el caso de la anemia megaloblstica no es posible distinguir la
deficiencia de folato y de cobalamina. La medicin de las vitaminas y de hierro en la sangre es de valor significativo, pero
los resultados requieren interpretacin cuidadosa, basada en
las interacciones posibles entre el folato y la cobalamina, otras
patologas coexistentes, efectos de las protenas de captacin y
la posible presencia de estados de deficiencia leve. En el caso
del hierro, una deficiencia funcional puede ocurrir en presencia de reservas adecuadas de este elemento. Todos estos factores se discuten de forma breve, junto con los mtodos para
esclarecer la causa de las deficiencias identificadas y la investigacin del exceso de hierro.
Cobalamina (vitamina B12) y folato

La cobalamina y el folato son esenciales para un nmero de
transferencias de carbn simple, y en el contexto presente la
ms importante de stas se relaciona con la sntesis de DNA.
En la figura 33-1 se muestran de forma simplificada las vas

metablicas que involucran las dos vitaminas. La forma activa del folato, el tetrahidrofolato (THF), transporta y utiliza la
unidad de carbn simple en diferentes estados de oxidacin
como 5-metil THF (>NCH3), 5,10-metileno THF (>N
CH2N<) o 10-formil THF (>NCHO). Se requiere insertar dos veces carbn simple (del formado por la va 10-formil
THF) en la sntesis de las purinas; el metileno THF se utiliza
en la conversin de uridina a timidina en la sntesis de pirimidina. El 5-metil THF y la cobalamina se deben agregar juntos
para la metilacin de la homocistena a metionina. La mayor parte de la metionina se convierte, adems, a S-adenosilmetionina, un donador universal de grupos metilo requeridos en
un amplio rango de reacciones de metilacin que involucran al
DNA, al RNA, a las hormonas, a los neurotransmisores, a los
lpidos de la membrana y a la protena bsica de la mielina. La
falla de esta ltima funcin provoca la degeneracin subaguda
de la mdula espinal relacionada con deficiencia grave de cobalamina. sta tambin es un cofactor esencial para la mutasa,
que convierte el cido metilmalnico a cido succnico.
Tanto la cobalamina como el folato se presentan en las
formas unidas a protenas en la sangre. La protena principal de unin para la cobalamina es la transcobalamina II.
En la leucemia mielgena crnica, la transcobalamina III,
que es producida en cantidades grandes por los granulocitos, puede generar falsas medidas de concentracion altas de
la cobalamina srica.
Anlisis de cobalamina y folato en sangre
Los mtodos de anlisis de laboratorio con frecuencia se
afectan por la necesidad de analizar grandes cantidades
314
CAP. 33
S-adenosil
metionina
como
donador Me
INVESTIGACIONES HEMTICAS
Homocistena
5-Me-THF
B12
Metionina
Lpidos de la membrana
Protena bsica
de la mielina
Neurotransmisores
THF
Formas
metiladas
Otras especies
de un carbono,
5,10metilenoTHF,
10-formilTHF
d-UMP
Precursores
de la purina
d-TMP
y
purinas
DNA
Figura 33-1 Transformaciones metablicas que implican cobalamina (vitamina B12) y folato. Reproducida con permiso de Klee
(2000).
de muestras. Esto acta en contra de los procedimientos

que requieren la intervencin manual o de los pasos que
no pueden incorporarse fcilmente en un proceso automtizado continuo. Los primeros mtodos para el anlisis de
ambas vitaminas dependan del crecimiento de organismos
que tienen un requerimiento absoluto por una de las vitaminas. Para la cobalamina se emple Euglena gracilis
o Lactobacillus leichmannii y para el folato Lactobacillus
casei, un organismo resistente al cloranfenicol. El crecimiento se mide por un aumento en la turbiedad del medio
de cultivo con todos los dems nutrientes requeridos en exceso. Aunque estos ensayos an tienen valor como una medicin de la vitamina biolgicamente activa, se sustituyen
en la prctica de rutina por los ensayos de unin proteica
competitiva.
Ensayos de unin proteica competitiva
El principio de estos anlisis puede resumirse respecto a la
cobalamina y se representa de manera esquemtica en la figura 33-2. Una protena debe ligarse a la cobalamina con
mucha fuerza y se agrega especficamente a una mezcla natural de esta ltima (la muestra) y a una forma marcada. La
protena de unin est presente en una concentracin significativamente menor que la de la vitamina y su anlogo
marcado. Las formas naturales y marcadas de la vitamina
compiten por el nmero limitado de sitios de enlace en la
protena durante un periodo de equilibrio. En equilibrio,
el cociente natural de la cobalamina marcada ligada a la
protena especfica se aproxima a la misma que el cociente
natural de la cobalamina marcada en la solucin original.
La cobalamina ligada entonces se separa de la solucin, y
la cantidad de cobalamina marcada unida a la protena de
enlace se mide. El marcador puede ser una especie fluorescente o una enzima, y pueden emplearse tcnicas sensibles
de medicin, como la quimioluminiscencia.
La comparacin del resultado con una curva estndar
permite la cuantificacin de la cantidad de cobalamina natural en la muestra original, y tiene en cuenta que la constante de enlace para la cobalamina natural y marcada puede
no ser exactamente la misma, y que el enlace no especfico
puede tambin ocurrir con otras protenas sricas. Los detalles de este proceso varan con diferentes analizadores,
pero el principio es comn en casi todos. Cuando la concentracin de cobalamina en la muestra es muy alta, la cantidad marcada ligada a la protena de enlace se aproxima a
cero, y cuando la concentracin de cobalamina en la muestra es cero, la unin de esta vitamina alcanza un mximo.
Los primeros ensayos competitivos de la protena de
enlace utilizaron radioistopos para el marcaje de la cobalamina, pero los riesgos implicados y las dificultades en
la automatizacin de tales tcnicas causaron que declinara
su uso.
Ensayo de cobalamina
La vitamina se separa de la protena ligante natural, transcobalamina II, por el hidrxido de sodio (pH 12.9). El cianuro
de potasio convierte la vitamina a su forma de cianocobalamina. Los mtodos anteriores utilizaban un pH ms bajo,
pero involucraban la ebullicin de la mezcla para liberar la
cobalamina de sus protenas naturales de unin. El factor
intrnseco porcino (HIF) se agrega como protena de unin
especfica. En una forma particular del ensayo, la cobalamina libre de la muestra compite con la cobalamina que
est marcada en virtud de ligarse a un soporte slido (una
315
COBALAMINA (VITAMINA B12) Y FOLATO
Marcado
Marcado
Marcado
Marcado
HIF
HIF
Marcado
Marcado
HIF
HIF
= cobalamina HIF = factor intrnseco porcino
HIF
Marcado
Marcado
HIF
El cuadro cortado identifica las especies

ligadas medidas
En equilibrio el cociente de cobalamina natural a cobalamina marcada ligada a la
protena especfica (factor intrnseco porcino) ser el mismo que el del cociente
de cobalamina natural a cobalamina marcada en la solucin original. Los conteos
ligados se comparan con los valores encontrados en una curva de calibracin
construida usando seis a ocho muestras de cobalamina de concentracin conocida.
Figura 33-2 Esquema del principio del ensayo de unin proteica competitiva.
perla de plstico). Estos componentes se incuban con un anticuerpo HIF conjugado con la fosfatasa alcalina (Falc-HIFAb). El Falc-HIFAb se inmoviliza slo en aquellas perlas
que tienen HIF ligado. Las perlas se lavan, con lo que se libran de excesos de reactivos, y la cantidad de HIF ligada se
determina por medio de la enzima fosfatasa alcalina ligada.
Si hay muy poca cobalamina en la muestra, mucho del HIF
ser ligado a la cobalamina en las perlas, e inversamente, si
la concentracin de cobalamina en la muestra es alta, habr
poco HIF, y as poca fosfatasa alcalina ligada a la perla.
Aunque la secuencia de eventos difiere levemente, el principio de este proceso puede verse idntico al del esquema
de la figura 33-2.
Ensayo de folato
El folato puede medirse en el suero o en los eritrocitos. El
folato eritroctico es, potencialmente, la medicin ms
significativa, ya que representa una visin promedio del tiempo de la disponibilidad de folato sobre el cual los eritrocitos
circulantes se formaron, mientras que el folato srico es muy
dependiente de la ingestin diettica reciente. El principio
de los ensayos de folato es muy similar al de la cobalamina,
descrito antes, aunque los detalles varan considerablemente
con los diferentes sistemas analticos. La protena de enlace
especfica usada en el anlisis competitivo es la -lactoglobulina (un ligando del folato en la leche).
La disociacin del folato de las protenas de enlace se
logra otra vez por alcalinizacin con hidrxido de sodio.
Si el folato se mide en el suero y en la sangre completa,
los dos resultados pueden utilizarse, junto con el hematcrito, para determinar el folato eritroctico. El mtodo
es ms impreciso que en la medicin del folato srico
por la naturaleza aditiva del error analtico. En general,
el coeficiente de variacin de un anlisis que implica tres
mediciones est dado por:
316
CAP. 33
CVt (CV21 + CV22 +CV23)

donde CVt es el coeficiente total de variacin del anlisis y CV1, CV2 y CV3 son los coeficientes de variacin de
los anlisis individuales implicados, en este caso del folato srico, del folato de la sangre entera y del hematcrito,
respectivamente. La matriz ms compleja del hemolizado
de la sangre entera puede tambin causar interferencia. Por
ello, los laboratorios pueden elegir medir el folato srico,
porque el anlisis es menos impreciso, o el folato eritroctico, porque el resultado es ms significativo, o ambos.
La interpretacin del ensayo se altera porque la cobalamina, como el folato, tiene poca precisin en el extremo
inferior del rango, y tambin porque los rangos de referencia del folato son a veces inadecuados, particularmente
en poblaciones con una ingesta suplementada con folato.
Diferentes mtodos analticos para el folato muestran un
sesgo que difiere, y los laboratorios deben determinar los
rangos de referencia locales.
Medidas alternativas del estado de la cobalamina
y del folato
Aunque los ensayos de estas vitaminas en la sangre dan
informacin valiosa, un nmero de factores puede causar
resultados engaosos. La cobalamina suele incrementarse, ya sea por desrdenes mieloproliferativos, o disminuir
por deficiencia de folato (ambas son medidas falsas), por
embarazo, carencias de protenas de enlace y mielomatosis. La deficiencia de cobalamina slo puede reducir las
concentraciones de folato intracelulares, y esto dar lugar
a folato srico normal relacionado con folato eritroctico
bajo y cobalamina srica baja. Hay tambin evidencia de
que secuelas clnicas significativas pueden seguir a la deficiencia leve de la vitamina con concentraciones sricas en
el rango normal bajo.
La figura 33-1 muestra el papel de la cobalamina y del folato en la conversin de la homocistena (HC) a metionina.
La cobalamina sola tambin est implicada en la conversin
importante del cido metilmalnico a cido succnico. La
deficiencia de cualesquiera de las dos vitaminas resulta de
este modo en el incremento de las concentraciones sricas
de homocistena, y la deficiencia aislada de cobalamina en
incremento de los niveles sricos y excrecin del cido metilmalnico (MMA). La medicin de estas dos sustancias,
HC del plasma y MMA de la orina o plasma, puede confirmar la deficiencia de las vitaminas, y la comparacin de
los dos, distinguir las deficiencias simples y combinadas y,
en general, mejorar la especificidad de la prueba de diagnstico, particularmente en los casos con cobalamina o
folato bajo en la lnea fronteriza. Hay evidencia de que las

concentraciones elevadas de estos dos metabolitos pueden
detectar clnicamente deficiencia significativa de la vitamina antes de que sta sea muy evidente desde la medicin de
las vitaminas mismas y de que haya evidencia de macrocitosis. Actualmente las dificultades analticas en la medicin
del MMA y de la HC impiden su uso extenso, pero ambos mantienen la posibilidad de una valoracin funcional
del estado de la cobalamina y del folato, que puede ser til
en una variedad amplia de situaciones, pero en particular en los ancianos, en quienes la deficiencia marginal de
cobalamina se piensa que es relativamente comn.
Investigacin de los factores que generan

la deficiencia de folato y cobalamina
La deficiencia de folato es normal que sea causada por
una malabsorcin o una ingestin diettica inadecuada
(o una combinacin de uno de stos con un mayor requerimiento, como en el embarazo). La suplementacin es franca, y en algunos pases los alimentos se fortifican de rutina
con folato adicionado, pero el cuidado es necesario debido
a que la administracin de folato a un paciente deficiente
en cobalamina puede causar la degeneracin combinada
subaguda de la mdula espinal. Una causa importante de
deficiencia de cobalamina es la anemia perniciosa (AP), en
la cual las clulas parietales gstricas no tienen la suficiente
capacidad para producir el factor intrnseco esencial para la
absorcin de cobalamina en el segmento ileal del intestino.
La investigacin preliminar puede implicar la valoracin de
los anticuerpos dirigidos en contra de la clula parietal gstrica y los del factor intrnseco. Los primeros son positivos
en 90% de los casos de AP, pero tienen especificidad escasa para la condicin, y estn presentes en 3 a 10% de los
sujetos normales. Los anticuerpos del factor intrnseco son
completamente especficos para la AP, pero su sensibilidad
es baja; hay dos tipos, los que bloquean la unin del FI a la
cobalamina y los que bloquean la captacin del complejo
IF-cobalamina por el leo terminal. El primer anticuerpo es
el nico que se mide de rutina y est presente en 50% de los
casos de AP. En el pasado, la prueba Schilling (que mide
la absorcin de cobalamina radiactiva en presencia y ausencia del factor intrnseco agregado) se utiliz para determinar la capacidad de absorber cobalamina administrada
e identificar si esto era debido a la deficiencia del factor
intrnseco (como en la AP) o por alguna otra causa, como
enfermedad ileal. La saturacin anterior con cobalamina
sin marcar, administrada por inyeccin intramuscular, asegura que toda la cobalamina marcada que se absorbe es
excretada. La prueba Schilling se utiliza menos en la actualidad que en el pasado debido a los problemas implicados
317
HIERRO
Cobalamina srica (vitamina B12)
150 a 300 ng/L

> 300 ng/L
(sin comprobacin adicional)
Ensayo del MMA srico
0.4 mol/L
> 0.4 mol/L
< 150 ng/L
Anticuerpo del factor intrnseco
Negativo
Ensayo de gastrina
> 200 ng/L*
200 ng/L
Positivo*
Figura 33-3 Un procedimiento de investigacin para la anemia perniciosa. *Indica que es consistente con anemia perniciosa.
en el uso de radioistopos, y la inconveniencia general de

la prueba.
Casi 80% de los casos de anemia perniciosa tiene incremento de la gastrina srica como resultado de la aclorhidria
debido a la falla de clulas parietales para producir cido
clorhdrico, de tal modo que la gastrina srica puede tener
valor en la investigacin de la AP. La ausencia del cido gstrico es significativa por s misma, ya que la falla para liberar la cobalamina diettica (y el folato) de las protenas
naturales de unin en la dieta puede deteriorar la absorcin.
Una prueba Schilling normal (que mide la absorcin de la
cobalamina libre) es posible que suceda en un paciente que
absorbe mal la cobalamina ligada a la protena de los alimentos naturales.
Un diagrama de laboratorio para la investigacin de la
anemia perniciosa se muestra en la figura 33-3. Esto evita el uso de la prueba Schilling pero implica mediciones
no disponibles de rutina en laboratorios del Reino Unido.
El cido metilmalnico es muy raro que est disponible, y
aunque no se carece de la gastrina, se utiliza poco en este
contexto. Debido a que la suplementacin oral de cobalamina es ineficaz en el tratamiento de la AP, un diagnstico
exacto es importante.
Hierro
El hierro es un elemento importante, involucrado no slo
en la sntesis de hemoglobina sino en muchas metaloprotenas, que contienen y no grupo hem, implicadas en la utilizacin del oxgeno molecular. El efecto ms obvio de su
deficiencia es anemia por deficiencia de hierro, pero puede
haber cambios ms sutiles que resultan de su implicacin
en otros procesos metablicos. La existencia del hierro en
dos estados principales de oxidacin, Fe(II) y Fe(III), y el

caso con el cual puede participar en la transferencia de un
electrn, resulta en una fuente potencial de radicales libres
del oxgeno, que tienen uso importante en la defensa del
husped contra las bacterias pero que, si no se confina a
su ubicacin apropiada, son demasiado perjudiciales a los
tejidos del husped. La absorcin y el transporte de hierro
estn as controlados en forma rigurosa para evitar la presencia de hierro libre, y las condiciones de la sobrecarga de
hierro tiene consecuencias clnicas serias.
Mediciones de laboratorio de la deficiencia
y sobrecarga de hierro
Aparte de la hemoglobina misma, las mediciones de laboratorio del estado de hierro con ms frecuencia utilizadas son
el hierro srico y la capacidad de unin al hierro, la ferritina
srica, la protoporfirina zinc de la clula y, recientemente, la
concentracin del receptor de transferrina srico (TfR).
Hierro srico y capacidad de unin del hierro
El hierro srico es la medida ms obvia del estado de hierro
en el organismo, su concentracin es afectada por diferentes factores, incluyendo la concentracin de su protena de
unin, la transferrina. Algunas mediciones de la transferrina son, de esta manera, esenciales en la interpretacin de
la concentracin del hierro srico, tanto por la medicin
directa de la protena como para valorar qumicamente la
capacidad de unin del hierro srico, que es equivalente a la
concentracin de transferrina.
318
CAP. 33
Ferritina
La ferritina se compone de 24 subunidades de protena
alrededor de un ncleo, que puede contener hasta 4 500
tomos de hierro y comprende la forma principal de almacenamiento de hierro disponible encontrada en la mayor
parte de los tejidos del cuerpo. En la forma desnaturalizada, la ferritina forma hemosiderina. La concentracin de
ferritina en el plasma se relaciona de manera directa con el
nivel de reserva de hierro, con cada g/L de ferritina srica
que equivale a casi 8 mg del hierro de reserva. Es tambin,
sin embargo, una protena de fase aguda, la concentracin
de la cual se eleva en respuesta a la infeccin, a la inflamacin y a la malignidad, y que pueden dar lugar a concentraciones normales de ferritina srica en un paciente con
deficiencia de hierro y enfermedad inflamatoria.
Protoporfirina zinc (ZPP)
En la sntesis de hemoglobina, la enzima ferroquelatasa inserta el hierro (II) dentro del sistema de anillo de la
protoporfirina para producir grupo hem. En ausencia del
hierro adecuado, el zinc se inserta (otra vez enzimticamente) y la protoporfirina zinc permanece en el eritrocito
durante toda su vida. La concentracin de ZPP aumenta
cuando el hierro es inasequible en la mdula sea, debido a
una deficiencia simple o a una deficiencia de tipo funcional
de hierro en presencia de reservas adecuadas de ste. Esta
ltima situacin corresponde a la anemia de la enfermedad
crnica. La medicin de ZPP tiene el mrito de identificar la disponibilidad disminuida de hierro en la mdula,
pero no siempre proporciona informacin directa sobre
las reservas de hierro. El aumento de ZPP tambin refleja
problemas antiguos en la sntesis del grupo hem (en el orden del periodo de vida de la clula) y puede ser normal en
la deficiencia de hierro de inicio rpido que causa la prdida gastrointestinal de sangre, por ejemplo. Aunque rara vez
es un problema interpretativo, la ZPP tambin aumenta en
la toxicidad por plomo.
Receptor de transferrina srico (TfR)
Los eritrocitos nucleados en la mdula sea transportan la
mayor parte de los receptores de transferrina, aunque tambin existen en otras clulas en cantidades que reflejan los
requerimientos de hierro de las mismas. Estos receptores,
situados en la membrana celular, internan la transferrina y,
despus de liberar su hierro regresan al fluido extracelular.
El receptor de transferrina (TfR) consiste en dos subunidades idnticas de protena de masa molecular de 95 kDa. La
sntesis del TfR es controlada por el suministro de hierro,
disminuyendo cuando la clula est repleta de ion. El TfR

est presente en el plasma, ligado a la transferrina, y su
concentracin en el plasma o suero refleja el nmero de receptores celulares de transferrina y, siempre que las reservas de hierro sean adecuadas, el TfR refleja el nmero de
eritrocitos en desarrollo en la mdula sea. La deficiencia
de hierro produce un incremento en el TfR srico en paralelo con un aumento en los receptores celulares. El TfR
srico elevado puede reflejar disponibilidad disminuida de
hierro, o eritropoyesis elevada, o ambos.
Investigacin por sospecha de deficiencia de hierro

El conteo sanguneo es la primera lnea de la investigacin.
ndices hematolgicos ms especficos, como el porcentaje de clulas hipocrmicas, son vistos por muchos autores
como de las mejores medidas de la deficiencia de hierro.
Medicin de la ferritina srica

El anlisis de la ferritina srica utiliza un ensayo de dos
sitios o inmunomtrico. En contraste con el ensayo de
competencia por las protenas de enlace descrito para la
cobalamina y el folato, la concentracin de los anticuerpos antiferritina utilizados para capturar ferritina es muy
superior a las concentraciones normales de sta. La que se
encuentra en la muestra del suero la capturan eficazmente
los anticuerpos antiferritina sobre un soporte slido (grano o celdilla). Un segundo anticuerpo antiferritina, que se
une a un eptopo diferente sobre la molcula de ferritina,
se agrega, tambin en exceso. Este segundo anticuerpo
forma un emparedado con la ferritina en el centro. El segundo anticuerpo lleva un marcador; originalmente un
radioistopo, pero ahora es ms comn que se sustituya
con una enzima o una especie fluorescente. Despus de
lavarlo para remover todos los reactivos no unidos al grano o la celdilla, se agrega el sustrato que reacciona qumicamente con el anticuerpo marcado para dar una seal
apreciable, que se compara con aquella que se produce
por una serie de estndares. Porque el mtodo confa en
un exceso de ambos anticuerpos, hay una posibilidad de
que las concentraciones excepcionalmente altas de ferritina puedan saturar los anticuerpos y dar valores bajos
(el efecto gancho a dosis-altas [high-dose hook]). Hay
medios de diseo de ensayo que minimizan este riesgo,
pero en caso de duda la muestra del suero se analiza en dilucin, y si el efecto gancho est presente, la muestra
diluida exhibe un valor aparente ms alto para la ferritina srica. El ensayo inmunomtrico se muestra de manera esquemtica en la figura 33-4.
319
HIERRO
Anticuerpo antiferritina (1)

Ferritina
Anticuerpo antiferritina marcado (2)
El cuadro cortado identifica las muestras marcadas medidas
Figura 33-4 Esquema del ensayo inmunomtrico de dos sitios para la ferritina.
Medicin de protoporfirina zinc

Alguna confusin existe con respecto a la relacin de la
ZPP y la protoporfirina libre, principalmente porque los
primeros mtodos de medicin de la ZPP implicaron la
extraccin cida, que remova el zinc para dar protoporfirina libre. Excepto en porfirinas raras, la protoporfirina
libre abarca 5% o menos de la porfirina que no es del
grupo hem total en el eritrocito, la mayor parte que existe como ZZP.
La protoporfirina zinc absorbe la luz de longitud de
onda de alrededor de los 425 nm (banda Soret) y fluoresce,
emitiendo luz a una longitud de onda de 595 nm. El mtodo
ms comn de medir la protoporfirina zinc implica emplear
la tcnica de la fluorimetra de cara frontal. Una gota de
sangre entera es pretratada con un reactivo que convierte
la hemoglobina a cianohemoglobina y elimina el efecto de
interferencia del contenido variable de la oxihemoglobina.
La sangre diluida se coloca en un portaobjetos y un haz de
luz incidente (415 nm) se dirige sobre el lado ms bajo del
portaobjetos. La capa de eritrocitos sobre la superficie de
cristal plana absorbe la luz incidente, y la ZPP emite luz
fluorescente a 595 nm que se dispersa en todas las direcciones. Aquella luz emitida hacia abajo, por detrs del
portaobjetos, sufre reabsorcin mnima por la hemoglobina

y se detecta con un tubo fotomultiplicador. La concentracin de ZPP se expresa como mol ZPP/mol del hem. La
interferencia surge de la hemlisis, de la bilirrubina srica
alta o de las concentraciones de riboflavina. Lavando los
eritrocitos se remueven estas interferencias, pero esto consume tiempo.
Medicin del receptor de transferrina srico
La medicin del TfR srico se realiza con un ensayo inmunomtrico de dos sitios, similar en principio al de la ferritina srica. El anlisis es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Desafortunadamente, las diferencias
en los procedimientos que se utilizan para purificar los receptores de transferrina ligada a la membrana que se usan
como estndares en el ensayo caen en rangos de referencia
que varan con el sistema de ensayo particular, aunque las
diferencias cualitativas entre los grupos de pacientes son
similares, independientemente de la formulacin del ensayo. Gran parte del rango de referencia no lo afecta la edad
y el sexo (a diferencia de, p. ej., la ferritina), aunque la
informacin en nios y bebs es escasa. La deficiencia de
320
CAP. 33
hierro resulta en un aumento triple a cudruple de la concentracin de TfR srico comparada con la normal.
Medicin del hierro srico y de la capacidad
de unin del hierro
El hierro en el suero est en la forma Fe(III) y ligado a la
transferrina. A un pH menor de 4.5 y en la presencia de cido
ascrbico como agente de reduccin, el hierro trivalente es
liberado de la transferrina y reducido a Fe(II). Entonces se
forma un complejo con un cromforo, por ejemplo, fereno
[3-(2-piridil)-5,6-bis-2-(cido 5-furil sulfnico)-1,2,4-triazina] o alternativamente ferrozina. Se mide la absorbancia del
complejo hierro-fereno a 700 nm. Este mtodo es homogneo (no implica precipitacin de protena), la mezcla de la
reaccin contiene detergente para mantener la protena en
solucin, y tiourea para minimizar la interferencia del cobre.
La capacidad de enlace del hierro puede medirse al adicionar exceso de solucin Fe(III) para saturar totalmente la
transferrina y dejar un poco de hierro libre. Despus de la reduccin con cido ascrbico, el hierro libre se mide como un
complejo fereno a un pH 8.6, pH al cual el hierro ligado a la
transferrina permanece inasequible. La solucin entonces se
acidifica y el ensayo del hierro se repite. El aumento en ste
debido a la acidificacin es la capacidad de enlace del hierro del suero, que es equivalente al ligado a la transferrina.
De manera alternativa, la transferrina puede medirse
directo por mtodos inmunolgicos. stos implican la formacin de los complejos antgeno-anticuerpo en solucin
entre la transferrina y los anticuerpos antitransferrina. La
concentracin de estos complejos se mide por su capacidad
para dispersar la luz. O la disminucin de la luz transmitida
se mide en un espectrofotmetro (turbidimetra) o la luz
dispersada real se evala con detectores a 90 de la trayectoria de la luz transmitida (nefelometra). La estandarizacin
del ensayo de la transferrina presenta algunos problemas,
y hay poco que elegir entre el ensayo de la transferrina y la
capacidad de unin del hierro como mtodos de medicin
de la concentracin de transferrina.
El lugar de las pruebas de laboratorio en la investigacin
de la deficiencia de hierro
En casos sencillos, ninguna otra investigacin de laboratorio puede ser necesaria cuando se identifica una anemia
microctica hipocrmica y el tratamiento con hierro oral
es acertado, aunque la recurrencia de la anemia en presencia de ingesta normal de hierro de la dieta requiere explicacin. Una posible malabsorcin o la prdida oculta de
sangre del aparato digestivo pueden requerir endoscopia u
otros modos de investigacin.
Un problema diagnstico importante ocurre durante

la diferenciacin de la anemia por deficiencia de hierro
(IDA) y la anemia por enfermedad crnica. Esta ltima
puede presentar un cuadro normoctico, normocrmico o
microctico, hipocrmico, y surgir en presencia o ausencia
de reservas adecuadas de hierro. Es posible definirla como
una anemia hipoproliferativa que ocurre en relacin con la
infeccin, la inflamacin o la enfermedad neoplsica. Se
caracteriza por valores bajos de hierro srico, transferrina srica y porcentaje de saturacin de la transferrina, incremento de la ferritina srica, aumento de las reservas de
hierro reticuloendotelial, incremento de la ZPP, elevacin
moderada del TfR y absorcin reducida de hierro. Ocurre
tambin un acortamiento moderado del periodo de vida
del eritrocito. El mecanismo exacto del proceso todava no
est totalmente aclarado y el metabolismo desordenado del
hierro no es el nico elemento, pues la entrega de ste a
la mdula eritroide se mantiene como una posibilidad y la
terapia con eritropoyetina puede corregir la condicin, pero
no la deficiencia de hierro. El efecto de las citocinas inflamatorias parece central. La anemia por enfermedad crnica
puede distinguirse de la anemia por deficiencia de hierro
examinando la mdula, con la presencia de hierro que se
puede teir en las clulas reticuloendoteliales, excluyendo
la ADH como una causa de anemia, pero esta prueba no es
conveniente para un uso extenso.
El hierro srico tiene defectos importantes como prueba
de deficiencia de hierro. Muestra variacin diurna significativa y tambin es afectado por la ingesta de comida reciente, lo que da por resultado alta variabilidad intraindividual.
En la anemia por enfermedad crnica, el hierro srico est
disminuido y es independiente de las reservas y, aunque el
uso de la saturacin de la transferrina supera parcialmente esto (como la transferrina o IBC est deprimido en la
misma situacin), su valor predictivo no es alto. La estrogenizacin (en embarazo, anticonceptivo oral o terapia de
reemplazo de estrgeno) puede confundir la situacin al
incrementarse la transferrina srica (e IBC).
La ferritina srica en una persona saludable indica un
buen ndice de reservas de hierro corporales, pero la inflamacin y la enfermedad del hgado causan su aumento,
independientemente del estado del hierro, lo cual perjudica su valor diagnstico. Aunque una ferritina srica menor
de 20 g/L es congruente con la ADH y una superior a
100 g/L torna improbable la ADH, incluso en presencia
de enfermedad inflamatoria, esto deja a un grupo grande de
pacientes con valores intermedios de ferritina en quienes el
diagnstico puede ser incierto.
La protoporfirina zinc, a diferencia de la ferritina srica,
no se ve afectada por enfermedad del hgado, ni directamente por la reaccin en fase aguda; que sea positiva en la
toxicidad por plomo es un problema raro. En la enferme-
321
HIERRO
dad reumatoide se correlaciona con el porcentaje de clulas

hipocrmicas, pero se incrementa con frecuencia cuando la
demora es normal y en la falla renal se eleva no especficamente cuando el porcentaje de las clulas hipocrmicas
es normal. Esta es una prueba de deficiencia funcional, la
cual se incrementa cuando el hierro es inasequible al momento de la eritropoyesis, y esto es cierto en la anemia por
enfermedad crnica. Aunque se dice que no es afectada
por el rasgo de talasemia, hay evidencia de que 50% de los
pacientes con esta condicin tiene ZPP elevada; pero no
es diagnstico de deficiencia de hierro, aunque proporciona informacin sobre la disponibilidad funcional de hierro
para el desarrollo del eritrocito, excepto posiblemente en el
rasgo de talasemia.
El receptor de la transferrina srica est relacionado con
las reservas de hierro en individuos saludables y aumenta
cuando existe deficiencia de hierro u ocurre incremento de
la eritropoyesis. Esta ltima situacin incluye eritropoyesis ineficaz. En la enfermedad crnica, las concentraciones
aumentan, incluso en presencia de reservas adecuadas de
hierro, relacionadas posiblemente a la incidencia de eritropoyesis ineficaz. Sin embargo, una relacin con las reservas de hierro an permanece. El cociente de TfR srico
a ferritina srica ha mostrado ser una medida excelente de
las reservas en el estado de salud, y un mejor indicador de la
deficiencia de hierro en la anemia por enfermedad crnica
que la ferritina srica sola. El TfR srico puede ser particularmente til en el embarazo. El embarazo puede causar
anemia por hemodilucin, la cual se relaciona con frecuencia con una ferritina disminuida, incluso en presencia de
reservas adecuadas de hierro, y con un aumento en IBC
causado por los estrgenos puede sugerir deficiencia de
hierro. El TfR srico parece, desde la evidencia preliminar,
ser relativamente afectado por el embarazo, permitiendo su
uso en la valoracin de la deficiencia de hierro.
Aunque su naturaleza manual la hace inadecuada en
algunos laboratorios, la ZPP es una prueba de primera lnea buena y econmica para medir la deficiencia de hierro,
apreciable en la muestra inicial del conteo sanguneo completo. La ferritina es una buena prueba de segunda lnea, si
se reconocen sus deficiencias. El receptor de transferrina
srica puede asumir una mayor importancia cuando est
disponible fcilmente en los analizadores principales y su
papel es definido con ms claridad, pero hay probablemente poco qu ganar en el presente al agregar la medicin del
TfR srico al rango existente de las pruebas disponibles
en los laboratorios. Es importante, cuando nuevas pruebas
de laboratorio se introducen, que los protocolos de investigacin sean revalorados, para evitar siempre paneles ms
amplios de las pruebas que se empleen sin la discriminacin correcta.
Investigacin sobre la sobrecarga de hierro

La sobrecarga adquirida de hierro ocurre conjuntamente
con las anemias hemolticas crnicas, sobrecarga parenteral de hierro, o enfermedad crnica del hgado, pero el
origen est establecido desde la historia del paciente, y la
investigacin y el manejo de esta condicin no se describen
aqu.
La susceptibilidad gentica a la hemocromatosis es comn en la poblacin general (1 en 100 a 300), aunque la
incidencia de la enfermedad sintomtica es probablemente
un vigsimo de la mutacin gentica, condicin importante que se debe excluir en cualquier incidencia con elevacin
inexplicada de las enzimas hepticas, porque su potencial
es fatal pero fcilmente tratable, y el descubrimiento de
los casos ndice permite la investigacin de los parientes
cercanos para establecer el riesgo futuro. La primera anormalidad que surge es un aumento en la saturacin de la
transferrina, y valores mayores de 55% en mujeres o 60%
en varones sugieren acumulacin de hierro. El efecto del
alimento y la variacin diurna se evitan mejor con el empleo de una muestra en ayuno temprano por la maana. La
ferritina srica aumenta en una etapa posterior de la acumulacin de hierro, cuando el hierro heptico se eleva. Los
valores superiores a 500 g/L son sospechosos de sobrecarga de hierro, pero otras condiciones que implican inflamacin deben eliminarse, y la saturacin de la transferrina
tambin es una prueba superior en este aspecto, ya que la
enfermedad inflamatoria produce una saturacin disminuida y menos incertidumbre del diagnstico.
Si la hemocromatosis gentica es sugerida por estas investigaciones preliminares, el anlisis de la mutacin del
gen de la hemocromatosis (HFE) debe realizarse, usando
una reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La forma
ms comn de la sobrecarga heredada de hierro (cerca de
90% de los casos) est relacionada con mutaciones en el
gen para la HFE, en particular con la mutacin C282Y, en
la cual la cistena (C) en la posicin 282 es sustituida por
un residuo de tirosina (Y). La otra mutacin es H63D, en
la cual la histidina (H) en la posicin 63 es reemplazada
por el cido asprtico (D). La homocigosidad para la mutacin C282Y est relacionada con la sobrecarga de hierro, y hasta 10% de los hombres y 5% de las mujeres con
el fenotipo HH/YY desarrollan sobrecarga sintomtica de
hierro. La situacin con los heterocigotos compuestos (p.
ej., HD/CY) no es del todo conocida y, del mismo modo,
los homocigotos para la mutacin H63D (DD/CC) son seriamente menos afectados.
La valoracin del hierro heptico no es una parte necesaria del proceso diagnstico, pero puede utilizarse para valorar la gravedad de la enfermedad en pacientes seleccionados.
322
CAP. 33
El tratamiento es por venodiseccin regular hasta donde la

lnea fronteriza de la deficiencia de hierro se alcanza.
Resumen
La investigacin de las deficiencias hematnicas siempre
comienza con el conteo sanguneo completo. La medicin
de la cobalamina srica, y del folato srico o del eritrocito, o ambos, puede contribuir en la identificacin de la
deficiencia especfica, aunque una comprensin de las
limitaciones de las pruebas es necesaria, y de otras pruebas no disponibles con facilidad en la actualidad, pueden
volverse ms importantes, en particular durante la investigacin de la deficiencia marginal. Hay diferentes medidas
de suficiencia de las reservas de hierro con ferritina que, a
pesar de sus imperfecciones, continan siendo las mejores
pruebas fcilmente accesibles; y aunque la protoporfirina
zinc tiene un papel importante, en el futuro el receptor de
transferrina srico puede ser la opcin. Si bien el hierro
srico, la capacidad de captacin del hierro y la saturacin
de la transferrina tienen una importancia menor en la valoracin de la deficiencia de hierro, son las pruebas ms
sensibles para la sobrecarga de hierro, y la presencia de
hemocromatosis gentica puede ser demostrada de manera
precisa determinando la mutacin del gen HFE por PCR.

La investigacin de la sobrecarga de hierro puede suscitarse por anormalidades inexplicables de las pruebas de
funcin heptica.
Siempre en las pruebas de laboratorio, la interpretacin
debe ser en el contexto de una valoracin clnica completa del paciente y con un conocimiento basado en la evidencia de las fortalezas y deficiencias de las pruebas de
laboratorio individuales.
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34
Investigacin de laboratorio de la hemlisis
Paul Revell
Introduccin
En la vida normal, los eritrocitos se reciclan cada 120 das.
Los desrdenes hemolticos son aquellos en que hay destruccin acelerada del eritrocito, acompaados por un aumento compensatorio en la produccin eritroctica. Si la
mdula no puede mantener la demanda creciente para las
nuevas clulas, se produce anemia. La destruccin acelerada ocurre porque el eritrocito es anormal. Las alteraciones
relacionadas detectables en el laboratorio se muestran en
la figura 34-1 y se resumen en el cuadro 34-1. Algunas de
stas se ilustran en la figura 34-2.
La manifestacin en el paciente es con frecuencia muy
inespecfica y depende de la velocidad de inicio tanto como
de la enfermedad en particular que causa la hemlisis. Las
caractersticas clnicas principales observadas en anemias
hemolticas se resumen en el cuadro 34-2.
En las condiciones iniciales muy rpidas (p. ej., transfusin sangunea incompatible) hay postracin, fiebre y dolor
de espalda con hemoglobinuria y malestar, en lugar de las
caractersticas descritas en el cuadro 34-2. Las condiciones
ms crnicas alcanzan, con frecuencia, un estado estable
con destruccin y produccin en equilibrio, aunque normalmente algunos resultados de la prueba siguen siendo
anormales. Este estado estable puede apreciarse por las
exacerbaciones de la enfermedad o crisis. Existen cuatro
tipos principales de crisis:
1. Una crisis hemoltica la ocasiona un aumento acelerado
en la hemlisis, originado a menudo por una enferme-
dad intercurrente, como una infeccin viral. Esto causa

un aumento en la ictericia y la anemia, y salida a la circulacin de reticulocitos (y a veces de eritrocitos nucleados) de la mdula. sta es una faceta de una crisis
falciforme.
2. En una crisis aplsica la mdula deja de trabajar durante algn tiempo, por ejemplo en la infeccin del parvovirus. En la mayora de las personas esto tiene poco
efecto, pero en condiciones hemolticas el paciente puede volverse con rapidez muy anmico y enfermo, puesto
que la mayor parte del tiempo cuenta con una mdula
muy activa para proseguir.
3. Una crisis de secuestracin ocurre en algunas condiciones, como en la enfermedad de la clula falciforme en
nios, cuando de repente el bazo se agranda y secuestra
las clulas. El paciente o est muy enfermo o muere al
llegar al hospital; este caso, afortunadamente, es raro.
4. Una crisis megaloblstica la causa la mdula, que funciona sin folato (normalmente) a partir de la produccin
excesiva de eritrocitos requeridos para proseguir, y
una franca anemia megaloblstica se produce. Megaloblstica se refiere a un aspecto caracterstico de la
mdula sea, donde los eritrocitos nucleados parecen
anormales porque la maduracin del ncleo y del citoplasma est asincrnica entre las clulas.
Control general del paciente
Cuando el paciente se presenta por primera vez, las prioridades del diagnstico son establecer que la hemlisis
est ocurriendo (figs. 34-1 y 34-2 y cuadros 34-1 y 34-2)
324
CAP. 34
INVESTIGACIN DE LABORATORIO DE LA HEMLISIS
Hemoglobina libre (y matanemalbmina)
Contiene suero intravascular
Bilirrubina sin conjugar

Vasos
sanguneos
Extravascular
Destruccin
prematura
en el bazo
Eritrocitos
anormales
Descenso en Hb
Bilirrubina sin conjugar
Rin
Hgado
Urobilongeno
Hemoglobiona
Hemosiderinuria
Urobilingeno
Mdula
sea
Hiperplasia
del eritrocito
Estercobilingeno
Intestino
Eritrocitos
incrementados
Utilizacin de
hierro y fosfato
Figura 34-1 Caractersticas fisiopatolgicas de la hemlisis. Si la destruccin ocurre dentro de los vasos sanguneos, entonces se libera la
hemoglobina, y aparece en la orina (vase tambin la fig. 34-2). Si la destruccin es extravascular (del bazo, a veces del hgado) entonces
esto se evita pero se libera excesiva bilirrubina sin conjugar, lo que puede ocasionar que el paciente presente ictericia (tonalidad amarilla; o
amarillo claro, si tambin es anmico, se identifica de manera temprana en la esclertica ocular) y el producto secundario, urobilingeno, se
detecta en la orina durante la prueba (no decolora la orina). El aumento en la produccin crea un cambio de eritrocitos a formas ms jvenes,
que genera policromasia, un matiz azul, sobre el frotis de la sangre perifrica, que se refleja en una cuenta aumentada de reticulocitos. Los
eritrocitos nucleados, por lo general presentes slo en la mdula, tambin pueden observarse en la sangre en la hemlisis activa.
e intentar determinar si el proceso es lento o rpido, intra

o extravascular. Las pruebas para encontrar la causa de la
hemlisis entonces continan de manera lgica. Los pacientes necesitan por lo general vitamina B12 y que se verifiquen los niveles de folato y despus se comience a aplicar
las dosis del tratamiento con cido flico por va oral. La
transfusin es necesaria en estados clnicos extremos. Si se
encuentra la causa, entonces el tratamiento especfico se
inicia, por ejemplo, con corticoesteroides por va oral para
hemlisis inmunitaria. Las complicaciones pueden necesitar tratamiento, como el retiro de los clculos biliares
formados por el pigmento, que son sintomticos en la esferocitosis hereditaria. La extirpacin del bazo (esplenectoma, para reducir la destruccin) tiene que considerarse
en algunos casos.
La hospitalizacin del paciente es necesaria en tiempos
de estrs (embarazo, ciruga, etc.), y siempre es necesario
apoyar y educar al paciente y a la familia en condiciones
CARACTERSTICAS CLNICAS
Cuadro 34-1
Anormalidades de laboratorio en la hemlisis
No todas se encuentran en cada paciente. La gravedad relativa

de cada anormalidad depende del estadio que se ha alcanzado
de la enfermedad. La vida del eritrocito reducida se mide poco
en forma directa (vase la fig. 34-5 como ejemplo). En general:
Hemoglobina baja si est descompensada
Cuenta del reticulocito incrementada
Bilirrubina incrementada (sin conjugar)
Urobilingeno en orina
Tiempo de vida reducido del eritrocito
Eritrocitos anormales (dependiendo de la causa)
Y si hay hemlisis intravascular:
Hemoglobinemia
Metahemalbuminemia
Hemoglobinuria
Hemosiderinuria
Haptoglobina srica baja
325
Cuadro 34-2 Caractersticas clnicas de la hemlisis

La informacin clnica proporcionada por el mdico puede
ayudar en la seleccin de investigaciones primarias y
secundarias cuando se sospecha hemlisis.
Historia de episodios anteriores
Asociacin de episodios con: infecciones
Anemia
frmacos
Ictericia
fro
Clculo biliar del pigmento alimentos
lceras en las piernas
Retraso en el crecimiento
Historia familiar de anemia/ictericia
Bazo alargado
Anormalidades del esqueleto
Figura 34-2 Algunos hallazgos de laboratorio en la hemlisis intravascular. a) La hemoglobina se libera dentro del suero, produciendo
un aspecto turbio-marrn. Un suero normal se muestra para la comparacin. b) Parte se aprecia directamente en la orina, causando una
decoloracin similar. Esto no debe confundirse con la incidencia, mucho ms comn, de la hematuria, donde eritrocitos enteros aparecen
en la orina. En la hemoglobinuria, por tanto, la prueba de la tira diagnstica para la sangre es positiva pero ningn eritrocito se muestra en la
microscopia de la orina. c) Las clulas del rin pasan a la orina (contratincin roja), toman hemoglobina y se presentan como grnulos
pequeos de hemosiderina (azules). Vase tambin el cuadro 34-7.
326
CAP. 34
crnicas. Los estudios de asesoramiento genticos y sobre

la familia pueden ser apropiados en ciertos casos.
tener 45% de HbS y el resto de HbA, pero cada clula ser

toda HbS o toda HbA.
Desrdenes hemolticos
Anemia de clula falciforme (SS)
Existen centenares de diversas condiciones y se han escrito

grandes tomos de ellas! El cuadro 34-3 muestra un panorama general de los amplios grupos y ejemplos comunes o
importantes. Una breve descripcin de cada uno de stos se
desarrolla para ilustrar dnde se sitan dentro de este esquema general; los captulos anteriores dan mayor detalle sobre
algunas de las condiciones individuales. Hay tambin una
lista de lecturas al final de este captulo.
La forma desoxigenada de la Hb anormal es menos soluble

que la HbA normal (en un amortiguador de fosfato sta
forma la base de la prueba de tamizaje para HbS). La HbS
produce eritrocitos deformes (clulas falciformes) debido
a la formacin tactoide, y stos son destruidos en el bazo
y perifricamente. Los pacientes tienen una hemoglobina
baja (5 a 10 g/dl) y con frecuencia tienen cuentas de neutrfilos y de plaquetas elevadas. Las clulas falciformes y
con forma de bote son visibles en el frotis sanguneo. El
diagnstico se realiza por electroforesis de Hb sobre gel de
agarosa a pH cido o alcalino. Los laboratorios que manejan una cantidad grande de muestras utilizan la cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC). Una Hb baja es
suficiente para daar el desarrollo en algunos nios. Los fenmenos trombticos se deben, sobre todo, a la morfologa
falciforme de los eritrocitos, que causa dolor en los miembros, y tambin afecta a pecho, abdomen y cerebro. El infarto (destruccin localizada por la carencia de oxgeno) del
bazo produce hipoesplenismo con cuerpos de Howell-Jolly
en eritrocitos sobre el frotis sanguneo. Un cuidado mdico
adecuado tiene un impacto significativo sobre la calidad de
vida y mortalidad de pacientes con esa condicin.
En el rasgo de la clula falciforme (AS) la morfologa
falciforme no ocurre (ya que hay menos HbS en cada clula) excepto bajo condiciones muy hipxicas (p. ej., en un
avin despresurizado, en anestesia general). Hay poco que
ver en el frotis.
Anemias de clulas falciformes y otras variantes

de la hemoglobina
El eritrocito contiene hemoglobina formada de cadenas de
globina alteradas. La hemoglobina A (HbA) es normal. La
HbF es una variante pero es normal en el feto. La hemoglobina S anormal se presenta por un defecto gentico que
causa la sustitucin de un aminocido en la cadena de
la hemoglobina. En estas condiciones el eritrocito contiene
hemoglobinas particulares segn los genes que se portan.
Por ejemplo, en la enfermedad falciforme homocigtica
con dos genes S, el eritrocito contiene principalmente HbS
y un poco de HbF pero ninguna HbA. En el rasgo (un gen
S) contiene 45% de HbS y el resto de HbA. Vale considerar
que estos son los porcentajes en cada clula; en contraste,
un paciente con anemia falciforme homocigtica, a quien
se transfunde con sangre normal (slo HbA) tambin puede
Cuadro 34-3 Desrdenes hemolticos

Esta manera de dividir las condiciones permite, con una cantidad limitada de informacin clnica, guiar la comprobacin subsiguiente.
HEREDADOS
Defecto de la sntesis de la hemoglobina, por ejemplo, enfermedad de la clula falciforme o talasemia

Anormalidad de la membrana, por ejemplo, esferocitosis hereditaria
Deficiencia enzimtica, por ejemplo, deficiencia de G6PD o PK
ADQUIRIDOS
INMUNITARIOS
Autoinmunitarios, por ejemplo, AIHA caliente o fra (CHAD)

Enfermedad hemoltica del recin nacido
Incompatibilidad de la transfusin
NO INMUNITARIOS
Fsico-mecnico, por ejemplo, vlvulas cardiacas

Microangiopatas
Hemoglobinuria paroxstica nocturna
DESRDENES HEMOLTICOS
Enfermedad de HbC (CC)

Produce hemlisis leve y esplenomegalia, adems de problemas adicionales en la deshidratacin y en el embarazo.
El rasgo (AC) no es significativo para el individuo, excepto
en trminos genticos.
Enfermedad HbSC (S/C)
Crea hemlisis leve pero los pacientes pueden tener problemas de morfologa de clula falciforme, especialmente en
el embarazo. En algunos, ocurren problemas de retinopata
(infartos en la parte posterior del ojo) y de destruccin sea
(p. ej., de la cabeza del fmur).
327
que se condensan como cuerpos de inclusin (cuerpos H,

vistos a la tincin con azul de cresilo).
Esferocitosis hereditaria
La esferocitosis hereditaria es autosmica dominante, es
decir, con un alelo del gen alterado una persona hereda la
condicin; se encuentra por lo general en caucsicos. Hay
alteracin de las protenas contrctiles de la membrana del
eritrocito que conduce a deformabilidad reducida. Las clulas anormales son secuestradas en el bazo y se destruyen
de manera prematura. Es normal que la anemia sea leve
y que los esferocitos se observen en el frotis sanguneo,
Enfermedad falciforme/tal (S/tal)

La gravedad depende de la cantidad de Hb normal que se
produce, que a su vez depende del gen de la talasemia especfica. Sin ninguna, entonces la enfermedad es en todo tan
grave como la forma SS homocigota.
Talasemias
En estas condiciones, existe produccin alterada, en cuanto
a nmero, de las cadenas de globina (en lugar de la produccin de tipos anormales de la cadena). stas comprenden
desde la 0-talasemia (ninguna cadena ) hasta las -talasemias leves, donde hay una reduccin mnima en la sntesis
de cadena y ningn problema clnico para expresarlas.
Los heterocigotos no se encuentran con el problema pero a
menudo muestran alteraciones visibles en el frotis sanguneo. La 0-talasemia homocigota es una alteracin seria que
requiere de transfusiones por toda la vida y se complica a
veces por hiperesplenismo (el bazo hiperactivo que destruye todas las clulas sanguneas). Los leucocitos presentan
caractersticas observables en el frotis. La falta de produccin es ms importante que la hemlisis de clulas anormales. La hiperplasia de la mdula produce las deformidades
seas tpicas de la niez. Los nios no crecen saludables y
mueren sin la transfusin. Los sobrevivientes de la transfusin sufren los efectos de la sobrecarga de hierro. Si la quelacin falla, usando cada noche un frmaco quelante oral o
desferrioxamina como infusin subcutnea para aumentar
la excrecin del hierro, entonces ocurren daos en la glndula endocrina (pituitaria, gonadal, pancretica), el hgado
e infiltracin cardiaca, con resultado fatal, frecuentemente
antes de los 25 aos. La enfermedad de la hemoglobina H
es una forma de -talasemia (no una variante anormal de la
Hb llamada H!). Aqu la ausencia de algunas cadenas produce exceso de cadenas para formar los tetrmeros (4),
Figura 34-3 Prueba de fragilidad osmtica. Alcuotas de sangre oxigenada bien mezclada se agregan a una serie de concentraciones salinas amortiguadas, por lo general NaCl en el rango
de 0.2 a 1.2%. Las diluciones se incuban a temperatura ambiente
por 30 min antes de que los tubos se centrifuguen y la cantidad de
hemlisis en el sobrenadante se lee espectrofotomtricamente. Los
esferocitos son anormalmente sensibles a las soluciones hipotnicas y se lisan en concentraciones ms altas que los eritrocitos normales. Una prueba de fragilidad osmtica inconclusa puede repetirse incubando la muestra sangunea por 24 h a 37C, antes de
la comprobacin. Esta modificacin es mucho ms sensible en la
deteccin de la esferocitosis leve que el mtodo original. El grfico
para los eritrocitos normales aparece por lo general en el rea gris;
tambin se muestra un grfico representativo para un paciente con
esferocitosis hereditaria. Algunos laboratorios utilizan una variacin, la prueba del tiempo de lisis en glicerol acidificado.
328
CAP. 34
(pero suelen ser fcilmente confundidos!). El diagnstico

se realiza por una fragilidad osmtica incrementada (fig.
34-3) y puede confirmarse por un anlisis electrofortico
de los componentes de la membrana del eritrocito usando
geles de poliacrilamida SDS.
Deficiencia de G6PD (glucosa 6-fosfato deshidrogenasa)
El eritrocito tiene una energa reductora que disminuye a
partir de una carencia de la primera enzima de la va de
desviacin, la pentosa fosfato del metabolismo de la glucosa. Es frecuente que sea una condicin recesiva ligada
al sexo: la enfermedad se expresa en varones con un alelo
del gen afectado en el cromosoma X, pero en las mujeres
se necesitan ambos alelos afectados. Las mujeres con un
alelo afectado mostrarn expresin variable, dependiendo
del cromosoma X inactivo y en qu clulas, segn la hiptesis de Lyon. Esto se observa sobre todo en poblaciones
negras y mediterrneas, y afecta a 3% de la poblacin mundial. La actividad de G6PD est presente en los reticulocitos pero cae rpido y prematuramente en estos individuos.
La integridad del eritrocito, por tanto, se reduce durante la
exposicin a qumicos oxidantes y frmacos (p. ej., antibiticos de sulfonamida). Los cuerpos de Heinz se observan en
los frotis sanguneos preparados de manera especial. El diagnstico se realiza mediante el anlisis de G6PD, pero slo en
el estado estable (no cuando hay una cantidad excesiva de
reticulocitos, p. ej., despus de una crisis hemoltica). Algunos de estos episodios son producidos por alimentos (clsicamente por habas: favismo) y tambin por frmacos.
Tamizaje para la deficiencia de 6GPD
Dentro de la va de la pentosa fosfato el NADP es reducido
por G6PD a NADPH. Este producto fluoresce bajo luz ultravioleta, lo que forma la base de la prueba de la mancha
fluorescente. La sangre completa se mezcla con:
de NADPH por G6PD se mide espectrofotomtricamente,

como un cambio en la densidad ptica a travs del tiempo.
Deficiencia de piruvato cinasa
La deficiencia de piruvato cinasa es una condicin autosmica recesiva (una persona manifiesta la condicin
cuando ambos alelos de un gen son anormales) y otro problema enzimtico, el ms comn de las enfermedades raras
sin G6PD. Las clulas llegan a tornarse deformes y lbiles. El frotis sanguneo muestra poiquilocitos (eritrocitos
anormales) que son hemolizados de forma espontnea sin
estmulo de algn frmaco. Las transfusiones pueden ser
necesarias.
Tamizaje para la deficiencia de piruvato cinasa
La piruvato cinasa es el catalizador para la reaccin:
ADP fosfoenolpiruvato S ATP piruvato
El producto de esta reaccin, piruvato, avanza dentro de la
siguiente reaccin, que es catalizada por lactato deshidrogenasa (LDH):
Piruvato NADH S lactato NAD
NADH despedir fluorescencia bajo luz UV de onda larga, mientras que NAD no. Por tanto, cuando la sangre completa es incubada con ADP, fosfoenolpiruvato y NADH,
en muestras normales, NADH se oxida a NAD, con una
prdida consecuente de fluorescencia. Las muestras deficientes despedirn luz fluorescente brillante. Una prueba
de tamizaje de PK anormal debe confirmarse por un ensayo
completo donde la oxidacin de NADH a NAD es medida
por un cambio en la absorbancia espectrofotomtricamente
en una cintica basada en el tiempo.
Glucosa 6-fosfato.
NADP.
Agente lisante (normalmente saponina).
Amortiguador.
Esto se incuba de 5 a 10 min antes de colocarse sobre el
papel filtro, secarse y examinarse bajo luz UV de onda larga. Las muestras normales despiden luz fluorescente brillante, las deficientes no, o slo una luz escasa fluorescente.
Cualquier prueba de tamizaje anormal debe confirmarse
por un ensayo funcional de la G6PD; aqu la produccin
Hemlisis inmunitaria
Diferentes patologas (como las que se listan en el cuadro
34-4) dan lugar a eritrocitos que son el blanco de anticuerpos en su superficie; por lo tanto, tienen un periodo de vida
corto. La hemlisis inmunitaria se divide en el laboratorio
en caliente y fra, dependiendo de la variacin de la
temperatura en la que existe actividad del anticuerpo (y de
la aglutinacin) en el laboratorio, clsicamente a 37C en
caliente y a 4C en fro, aunque existe, a veces, un pequeo traslape. As tambin como en una prueba de Coombs
(antiglobulina) directa de tamizaje amplio, que es positiva
329
Cuadro 34-4 Causas de la hemlisis inmunitaria
Hay muchas condiciones diferentes que pueden dar lugar a eritrocitos cubiertos con anticuerpos. Aqu se muestran amplios grupos.
La divisin bajo condiciones fras y calientes ayuda en la decisin del tratamiento.
Fra
Desrdenes linfoproliferativos, por ejemplo, linfoma no Hodgkin de grado bajo

Infecciones, por ejemplo, Mycoplasma pneumoniae
Enfermedad por hemaglutinina-fra (CHAD)
Caliente
Desrdenes linfoproliferativos, por ejemplo, leucemia linfoctica crnica

Enfermedades del tejido conectivo, por ejemplo, lupus eritematoso sistmico
Farmacos, por ejemplo -metildopa, usados para presin sangunea alta
Figura 34-4 Prueba de Coombs (o antiglobulina) directa. El DCT (o DAGT) detecta eritrocitos cubiertos de anticuerpos. a) A una
suspensin de eritrocitos del paciente (ya cubiertas con el anticuerpo) se agrega b) antiglobulina de espectro amplio (p. ej., antihumana
de conejo). c) La aglutinacin ocurre. El resultado se muestra en un mtodo tradicional con tubo (superior) o con la tecnologa de gel
(inferior)
330
CAP. 34
(DCT, fig. 34-4), los reactivos que dan un perfil ms especfico (IgG, complemento) pueden utilizarse en la hemlisis inmunitaria caliente. Es frecuente, cuando se sospecha
hemlisis inmunitaria fra, mantener el espcimen de la
sangre a una temperatura mayor a la ambiental hasta que el
suero se separe, despus se realiza la prueba contra clulas
del adulto (que contiene antgeno I) y del cordn umbilical
(que producen antgeno i). La DCT es, por lo general, slo
positiva con el reactivo complemento, y el frotis sanguneo muestra aglutinacin, a menos que se realice en condiciones calientes. La distincin entre condiciones calientes
y fras es importante para el tratamiento. En la hemlisis
inmunitaria caliente, los esteroides y otros tratamientos inmunosupresivos dirigidos a reprimir, o a interferir con el
efecto de la produccin del anticuerpo es con frecuencia
til. La esplenectoma a menudo funciona. En la hemlisis
inmunitaria fra, sin embargo, la quimioterapia citotxica
(a veces) y mantener caliente al paciente ayuda (casi siempre), pero no los esteroides o la esplenectoma. La transfusin por lo general se evita en la hemlisis inmunitaria,
pues la autoaglutinacin interfiere con la compatibilidad
cruzada. El estado clnico del paciente demanda, de cuando
en cuando, la transfusin y no puede permitirse ciertamente sucumbir por la carencia de eritrocitos, en este caso se
proporciona la sangre que es menos incompatible.
Enfermedad hemoltica del recin nacido (HDN)

Las clulas rhesus positivas del feto Rh+ pasan a la circulacin de una madre Rh, por ejemplo, en la hemorragia
durante el embarazo o por amenaza de aborto. Esto causa que la madre produzca anticuerpos anti-D (antirrhesus)
que ms tarde en este embarazo o en subsecuentes, pasan
al feto y se dirigen en contra de los eritrocitos, causando
hemlisis si el beb es Rh+. Las incompatibilidades del
grupo ABO pueden causar problemas similares pero de
menor gravedad. Altos niveles de bilirrubina sin conjugar
despus del nacimiento (debido a hemlisis) cruzan la barrera hematoenceflica y producen kerncterus, con dao
cerebral. El tratamiento, que puede incluir la transfusin de
intercambio, previene esto. Pueden verse esferocitos sobre
el frotis sanguneo y el DCT se torna positivo. En casos
graves el beb se vuelve hidrpico (anemia/ictericia/aumento de volumen con edema). En potenciales periodos
hemorrgicos feto-maternos, la produccin del anticuerpo
por la madre puede prevenirse con la administracin pasiva
de anti-D mediante inyeccin intramuscular para bloquear
clulas Rh+, antgeno que hace que ella produzca su propia
respuesta. El uso profilctico de anti-D de esta manera es
una de las historias exitosas de la medicina cientfica moderna, as los infantes afectados son ahora escasos; pueden
tratarse por transfusin intrauterina (una maniobra delicada) o en induccin temprana de la labor del parto, con
transfusin de intercambio en el recin nacido.
Transfusin incompatible
La transfusin incompatible crea una hemlisis inmunomediada. En la incompatibilidad de grupo ABO (que ocurra es
muy raro y se espera) las clulas del donador se destruyen
en el lecho intravascular debido a que los anticuerpos del
paciente anti-A o anti-B (o ambos) se producen de manera
natural. El paciente puede enfermarse muy rpido, como
se describe antes, y desarrollar hemoglobinuria. Si la transfusin no se detiene o el paciente est bajo anestesia, la
condicin puede ser fatal. Las reacciones de incompatibilidad a otros antgenos es normal que provoquen hemlisis
extravascular con anemia e ictericia. La recuperacin es la
norma, pero se presentan problemas de compatibilidad cruzada despus de esto, por causa de aloanticuerpos para los
antgenos del eritrocito.
Mecanismos no inmunitarios
stos pueden dar lugar a eritrocitos anormales (que, por
tanto, tienen una vida media corta). El traumatismo fsico y
mecnico para los eritrocitos normales, como atravesar una
vlvula mecnica del corazn que se fuga, puede conducir
a la fragmentacin y lisis intravascular o a su reciclaje precoz por el bazo.
La hemoglobinuria paroxstica nocturna (PNH) es una
enfermedad hematolgica adquirida rara. El paciente sufre una tpica hemlisis intravascular mediada por el complemento, que resulta en hemoglobinuria, deficiencia de
hierro, crisis aplsica y una predisposicin a la trombosis
venosa. ste es un desorden de la clula embrionaria que
produce clulas deficientes en protenas reguladoras del
complemento, ocasionando un incremento de la sensibilidad de la membrana del eritrocito a la lisis por el complejo del complemento. Por lo comn el diagnstico se hace
usando una variedad de pruebas. Las ms sensitivas son
las pruebas con suero acidificado (prueba de Hams) y la
prueba de la lisis de la sacarosa. stas ahora se sustituyeron en gran parte por la introduccin de la citometra de
flujo para la deteccin de las molculas superficiales CD55
(factor acelerador del deterioro-DAF) y CD59 (factor de
restriccin homocigoto-HRF/protena ligada a C8 [C8bp]).
Estos antgenos estn reducidos o ausentes en PNH y la
citometra de flujo es la herramienta ms sensible y especfica disponible para el diagnstico actual. La alteracin
puede detectarse en la superficie de los eritrocitos y leucocitos en esta condicin.
331
Cuadro 34-5
Causas de la microangiopata
Estos tres grupos amplios contienen todas las causas probables:

Coagulacin intravascular diseminada (DIC) (en problemas
obsttricos, septicemia, cncer, etctera)
Lupus eritematoso sistmico (SLE) y otros desrdenes renales y del tejido conjuntivo
Prpura trombocitopnica trombtica (TTP) y sndrome
urmico hemoltico (HUS)
Cuadro 34-7
Cuadro 34-6 Diagnstico de laboratorio de las condiciones

microangiopticas
La deteccin de la coagulacin, la bioqumica renal y la informacin clnica normalmente distinguen la causa.
Causa
Hb/
plaquetas
Coagulacin
Insuficiencia Contexto
renal
clnico
DIC
SLE
TTP
HUS
Baja
Baja
Baja
Baja
Anormal
N
N
N
Investigacin de laboratorio de la hemlisis intravascular
Durante la hemlisis, la hemoglobina se libera en el plasma. sta se liga rpido a la haptoglobina y a la hemopexina de las protenas del plasma antes de eliminarse de la circulacin por el hgado. Si la hemlisis es grave las concentraciones de haptoglobina y hemopexina se agotan muy rpido, y la hemoglobinuria/anemia y metahemalbuminemia se tornan detectables.
La metahemalbmina con su apariencia turbia-marrn, que puede medirse fotomtricamente, tiene un pico de absorcin caracterstico de 624 nm
Los niveles de haptoglobina y hemopexina sricas pueden medirse de varias maneras incluyendo la filtracin en gel y mtodos electroforticos, fotomtricos e inmunolgicos. Los ms comunes actualmente son los mtodos inmunolgicos, que utilizan antihaptoglobina o antihemopexina, que permiten la demostracin por inmunodifusin radial o tcnicas del cohete de Laurell.
La demostracin de la hemosiderina urinaria es por el mtodo de la tincin de hierro con azul Prusia de Perl. Una muestra de
orina se centrifuga y el sedimento se extiende a un portaobjetos de vidrio, se seca al aire antes de fijarse en metanol. El hierro
frrico presente en el sedimento reacciona con el ferrocianuro de potasio acidificado para producir ferrocianuro frrico que aparece como grnulos teidos de azul en la microscopia.
Figura 34-5 Marcado del eritrocito. La seora ID, de 76 aos, sufra

ataques recurrentes de anemia relacionados con palpitaciones, falta de
respiracin y agotamiento. La conocan por tener una enfermedad cardiaca valvular compleja, incluyendo un reemplazo de la vlvula artica,
que tena murmullos al escuchar el corazn, que podran indicar fuga. Se
le aplica warfarina y se le distingue por tener aloanticuerpos del eritrocito, haciendo la compatibilidad cruzada difcil. Un cuadro de deficiencia
del hierro indica la prdida de eritrocitos pero, con poca fragmentacin
sobre el frotis sanguneo, reducida haptoglobina pero ninguna hemosiderinuria, y confusin para determinar una destruccin intravascular significativa. Ella no tena algn sntoma intestinal y el examen completo
del aparato gastrointestinal no revel ninguna causa anatmica de la prdida sangunea. Sus eritrocitos, por tanto, fueron marcados con 5lCr y se
transfundieron nuevamente (da 0). Las muestras de sangre se tomaron
todos los das para la actividad isotpica y las heces recolectadas, como
se muestra en la grfica. El da 1 se toma como 100% para permitir prdidas tempranas inaplicables. Puede observarse que la vida media del cromo (T50Cr) se reduce a 15 das (lo normal es de 25 a 33 das),
aunque ella mantuvo su Hb durante el estudio. Esta modesta reduccin se explica por la prdida considerable advertida a partir del aparato
gastrointestinal, que se observa en las cuentas del istopo en las heces. La prdida es claramente variable y se asume que proviene de una
angiodisplasia en el intestino largo (stas no son demostrables anatmicamente). La paciente necesit varias transfusiones electivas y de
urgencia durante el primer ao, pero ninguna a partir de entonces. Pareca que la prdida de sangre haba cesado. La vlvula del corazn
no necesit reemplazarse.
332
CAP. 34
Microangiopatas
Segmento final
Las microangiopatas causan destruccin del eritrocito por

los filamentos de fibrina de vasos pequeos y se relacionan
con un cuadro sanguneo caracterstico, que contiene porciones de los fragmentos, algunos glbulos rojos alargados y pocos microesforocitos. La trombocitopenia y los
marcadores de la hemlisis (anemia, reticulocitos elevados y bilirrubina) estn con frecuencia presentes. Existen
varias causas de la microangiopata, las cuales se resumen
en el cuadro 34-5. Los indicadores del diagnstico que las
distingue se muestran en el cuadro 34-6. El diagnstico
debe hacerse de manera correcta porque todas estas condiciones son serias y pueden de otro modo causar la muerte
a pacientes sanos jvenes, aunque a menudo son tratables.
La distincin acertada entre ellas es importante porque
ciertos productos sanguneos son en potencia peligrosos
en algunas personas, y asimismo el manejo con esteroides
es provechoso slo en algunos individuos.
En el cuadro 34-7 se muestra evidencia adicional de hemlisis intravascular que puede obtenerse a partir de las
investigaciones que se ejemplifican aqu.
Siempre existen algunos casos difciles de aclarar y la medicin directa mediante el marcaje de eritrocitos con istopos puede ser necesaria (fig. 34-5). Por ltimo, es probable
que algunos pacientes presenten de forma clara la hemlisis, pero en quienes ninguna causa puede encontrarse. La
mayora de ellos presenta un desorden de la estructura o
fisiologa del eritrocito, hasta ahora no identificado.
Dacie JV. The Haemolytic Anaemias, 3rd edn, vols 1-5. 19881999: Churchill Livingstone, Edinburgh.
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Lewis SM, Brain BJ, Bates I, Dacie and Lewis. Practical Haematology. 9th edn. 2001: Churchill Livingstone, London.
35
Investigaciones de laboratorio de la hemostasis
Peter E Rose y Catherine Caveen
Introduccin
El flujo sanguneo en el compartimiento vascular depende
del equilibrio entre la actividad anticoagulante y la procoagulante. Bajo circunstancias normales la actividad anticoagulante es la que domina; sin embargo, con el dao a las
clulas endoteliales que revisten los vasos sanguneos, el
subendotelio puede ser expuesto, con el inicio de la formacin local del cogulo. La agregacin plaquetaria inicial
forma un tapn plaquetario, mientras la coagulacin local produce un cogulo firme de fibrina. Posteriormente, un
sistema de digestin del cogulo (fibrinlisis) previene la
extensin del cogulo y restaura la permeabilidad.
La investigacin de laboratorio se utiliza de rutina para
evaluar a los pacientes con elevado riesgo trombtico o
hemorrgico. En muchas condiciones mdicas agudas el
equilibrio normal de la hemostasis se altera y requiere
correccin. Adems, el monitoreo de los agentes teraputicos para promover la actividad anticoagulante o los agentes para restaurar la hemostasis normal forma parte de las
investigaciones de rutina emprendidas en el laboratorio de
hematologa. La coagulacin in vivo requiere superficies
de calcio y de fosfolpidos como un componente integral
para la formacin del cogulo. Los factores de coagulacin
circulan como precursores inactivos, que bajo estmulos
apropiados se convierten a enzimas y a cofactores activos, con la generacin de trombina y la conversin subsiguiente del fibringeno a fibrina. Los pasos iniciales en
la activacin de la coagulacin involucran el factor tisular,
expresado en las superficies no vasculares de la membrana
celular, actuando como un cofactor para la activacin
de los factores VII a VIIa, con la activacin subsiguiente de
los factores X y IX y la generacin eventual de trombina.
Hay, sin embargo, interacciones hemostticas numerosas

entre los factores de coagulacin, permitiendo a una diversidad de ellos actuar como anticoagulantes y, adems,
como procoagulantes en diferentes circunstancias.
Por tradicin, las pruebas de coagulacin in vitro se han
separado de forma conveniente en activacin de una va
intrnseca o una extrnseca. La activacin no fisiolgica de
la va intrnseca ocurre por el contacto con una superficie
ajena del factor XII, ciningeno de alto peso molecular y
por la activacin subsiguiente de los factores coagulantes a
travs de los factores XI, IX, X y la protrombina. In vivo,
sin embargo, las cantidades pequeas de generacin de
protrombina despus de la activacin de la va extrnseca
resulta en una amplificacin de la hemostasis va activacin del factor XI (fig. 35-1).
Tiempo de protrombina
El tiempo de protrombina se utiliza como medida de la actividad de la va extrnseca, en la cual la tromboplastina
(factor tisular) y el calcio se agregan al plasma, y el tiempo
requerido para la formacin del cogulo se mide (fig. 35-2).
Un tiempo de protrombina prolongado puede deberse a:
Anticoagulantes orales.
Deficiencia del factor I, II, V, VII o X, que puede heredarse o adquirirse, por ejemplo, en la enfermedad del
hgado o coagulacin intravascular diseminada.
Altos niveles de heparina.
Inhibidores de los factores de coagulacin especficos,
incluyendo el inhibidor del lupus. La investigacin adicional de un tiempo de protrombina prolongado puede
334
CAP. 35
INVESTIGACIONES DE LABORATORIO DE LA HEMOSTASIS
Figura 35-1 La va de la cascada de la coagulacin.
implicar estudios de correccin o ensayos de los factores coagulantes.

Un tiempo de protombina prolongado puede corregirse en presencia de plasma normal. El patrn de correccin
identifica el factor, o los factores, que son deficientes. Diferentes reactivos se utilizan en los estudios de correccin
(cuadro 35-1). Estas pruebas, sin embargo, se han sustituido en gran parte por los ensayos de los factores coagulantes
individuales.
Control anticoagulante oral
El cociente normalizado internacional (INR) es el mtodo
recomendado para informar los resultados del tiempo de
protrombina para el control anticoagulante. El sistema del

INR se ha desarrollado para compensar la fuente principal
de discrepancia en los ensayos del tiempo de protrombina,
a saber, la variabilidad en la respuesta a diferentes reactivos
de tromboplastina a los cambios en los factores coagulantes
dependientes de la vitamina K inducidos por la warfarina.
Como los nmeros de los pacientes que requieren terapia
oral anticoagulante van en aumento (1 de 80 personas en el
Reino Unido) y la necesidad de vigilancia regular del INR,
esto representa una carga de trabajo importante. El principio de la anticoagulacin oral es proporcionar un nivel de
anticoagulacin para prevenir problemas trombticos pero
tambin para evitar problemas de sangrado de la sobreanticoagulacin. Para la mayor parte de los problemas trombticos venosos un INR en el rango de 2 a 3 es satisfactorio.
335
TIEMPO PARCIAL DE TROMBOPLASTINA ACIVADA (TTPA)
Errores de la protrombina
Los errores con la estimacin del tiempo de protrombina pueden crearse por los problemas con la coleccin de la muestra, la concentracin del anticoagulante y el tipo de tubo de
coleccin utilizado. Adems, las diferencias entre los mtodos manuales y automticos son reconocidas; con los
ltimos se producen tiempos de protrombina ms cortos.
Mientras se requieren productos manufacturados para
producir un valor del ISI para cada lote del reactivo de
tromboplastina, la calibracin incorrecta de los reactivos
de tromboplastina por el laboratorio local o los fabricantes
es un problema. Para la calibracin de una tromboplastina, se recomienda un reservorio de muestras del plasma de
20 adultos normales y 60 pacientes en warfarina, adems,
diferentes preparaciones de referencia internacional de distintas especies producen diferencias en el ISI. La media
geomtrica del tiempo de protrombina normal debe derivarse de un reservorio de 20 muestras de plasma de adultos
normales y la media geomtrica calculada de ste.
Figura 35-2 Va extrnseca
Para los pacientes con vlvulas mecnicas del corazn, un

nivel ms alto de anticoagulacin INR en el rango de 2.5 a
3.5, es necesario para prevenir la formacin del cogulo en
la vlvula (cuadro 35-2).
El INR se expresa como:
INR =
PT
Tiempo parcial de tromboplastina

activada (APTT)
Esta prueba mide la va intrnseca de la coagulacin. Un activador, como el caoln, desencadena la va al activar los factores de contacto (fig. 35-3). En presencia de iones de calcio
y de fosfolpido, esto culmina en la generacin de trombina y en ltima instancia en la formacin del cogulo de
fibrina. El APTT tambin se utiliza en el monitoreo de la terapia de heparina. Un APTT prolongado en un paciente con
historia de una ditesis hemorrgica requiere investigacin
adicional, en particular para excluir la hemofilia A o B.
(ISI)
GMNPT
donde ISI es el ndice de sensibilidad internacional del
reactivo de tromboplastina y GMNPT es la media geomtrica del tiempo de protrombina normal.
Fuentes importantes de error permanecen en la medicin del INR y pueden surgir de problemas en la medicin
del tiempo de protrombina, ISI o GMNPT.
Cuadro 35-1
Plasma normal Suero envejecido
Estudios de correccin de un tiempo de protrombina prolongado

Plasma absorbido
Plasma oxalatado Deficiencia del factor
I
II
V
VII
X
Inhibidor
Pruebas adicionales
Ensayo de fibringeno
Ensayo del factor
Ensayo del factor
Ensayo del factor
Tiempo RVV
Tiempo de reptilasa
Neutralizacin por protamina
corregido; sin corregir; RVV prueba con veneno de la vbora de Russells (serpiente Vipera russelli).
Plasma normal citratado: ste proporciona todos los factores de coagulacin.
Suero envejecido: la sangre coagulada se incuba por 24 h a 37C; el suero contiene los factores VII, IX, X, XI y XII.
Plasma absorbido: el plasma normal se trata con el hidrxido de aluminio, que absorbe ciertos factores; el plasma resultante contiene los factores
I, V, VII, XI y XII.
Plasma oxalatado: plasma normal que se agrega a oxalato de sodio y se incuba por 72 h a 37C; contiene todos los factores excepto el V.
336
CAP. 35
Cuadro 35-2
Anticoagulantes orales para diversas condiciones clnicas
Condicin
Rango INR
Tromboembolismo venoso
Trombosis posoperatoria de la vena de la pantorrilla sin algunos factores de riesgo
Trombosis de la vena de la pantorrilla en pacientes no quirrgicos sin
algunos factores de riesgo
Trombosis de la vena de la pantorrilla en pacientes no quirrgicos con factores
de riesgo
mbolo pulmonar y trombosis de la vena proximal
DVT recurrente y/o PE
DVT recurrente y/o PE aunque sobre warfarina (INR rango 2 a 3)
Fibrilacin auricular
Fibrilacin auricular u otras arritmias de alto riesgo
Prtesis de la vlvula del corazn y otras indicaciones cardiacas
Vlvulas protsicas mecnicas
Vlvulas bioprotsicas del corazn (no articas)
Cardiomiopata, trombo mural o segmento acintico
Duracin recomendada
2a3
2a3
6 semanas
3 meses
2a3
2a3
2a3
3a4
Indefinida (mientras los

factores de riesgo persistan)
6 meses
Indefinida
Indefinida
2a3
Indefinida
2.5 a 3.5
2a3
2a3
Indefinida
3 meses
Indefinida
El cido acetilsaliclico es la terapia de primera lnea para las siguientes condiciones; si est contraindicado, se recomiendan los
siguientes rangos
del INR para la terapia de warfarina:
Ataque TIA/isqumico
3a4
Indefinida
Trombosis arterial perifrica e injertos
3a4
Indefinida
Trombosis de la arteria coronaria
3a4
Indefinida
Trombosis del injerto de la arteria coronaria
3a4
Indefinida
Angioplastia coronaria y stents coronarios
3a4
Indefinida
*Interrumpir la warfarina si no hay AF, trombo intracardiaco o embolismo sistmico. Los pacientes que no requieren warfarina deben considerarse
para la terapia antiplaquetaria (p. ej., con cido acetilsaliclico).
Figura 35-3 Va intrnseca.
TIEMPO DE TROMBINA
337
Investigacin de laboratorio de un APTT prolongado
Figura 35-4 Investigacin de laboratorio de un APTT prolongado.
Un APTT prolongado puede causarlo la deficiencia de

los factores I, II, V, VIII, IX, X, XI o XII, que se heredan
o adquieren debido a la enfermedad o a la consuncin heptica, como en la coagulacin intravascular diseminada.
La terapia de heparina, los inhibidores para los factores
de coagulacin especficos, la presencia del anticoagulante del lupus o los niveles altos de FDP (productos de la
degradacin del fibringeno) tambin es posible que produzcan un APTT prolongado. Los estudios de correccin
tambin suelen utilizarse para investigar, adems, la causa
de un APTT prolongado. Si los estudios mezclados muestran correccin del APTT, entonces los ensayos del factor
especfico se realizan para determinar el factor deficiente.
La falla que se pretende corregir requiere investigacin adicional para excluir un inhibidor adicional especfico o el
anticoagulante del lupus (fig. 35-4).
El APTT se usa con ms frecuencia para monitorear el
tratamiento de heparina y ajustar el programa de infusin,
segn se ilustra en el cuadro 35-3.
Tiempo de trombina
El tiempo de trombina se utiliza como un tamiz rpido para
las anormalidades del fibringeno y evaluar si la heparina es la causa de un APTT prolongado. La trombina se
agrega al plasma citratado y se mide el tiempo para la formacin de fibrina (fig. 35-5).
Un tiempo de trombina prolongado puede deberse a:
Disfibrinogenemias, heredadas o adquiridas, con una
molcula de fibringeno estructuralmente anormal con
las caractersticas funcionales alteradas.
Nivel bajo de fibringeno (< 1 g/L).
Niveles elevados de los productos de degradacin del
fibringeno.
Terapia con heparina.
338
CAP. 35
Cuadro 35-3 Rgimen de infusin de heparina, con monitoreo de laboratorio del tratamiento usando el APTT. El rango teraputico
debe determinarse del rango APTT equivalente a una concentracin de heparina del plasma de 0.2 a 0.4 UI/ml
Programa de infusin de heparina
Bolo IV
Infusin IV
5 000 unidades
15 000 unidades/12 h
Verificar el APTT despus de 2 a 6 h

Rango aceptable
1.5 a 2.5
En el embarazo
1.5 a 2.0
Ajustar la heparina como sigue:
> 5.0
4.1 a 5.0
3.1 a 4.0
2.6 a 3.0
1.5 a 2.5
1.2 a 1.4
< 1.2
Parar por una hora

Disminuir a 6 000 unidades/12 h
Disminuir a 600 unidades/12 h
Sin cambio
Aumentar a 2 400 unidades/12 h
Aumentar a 4 800 unidades/12 h
Verificar el APTT en 2 a 6 h
Verificar el APTT dentro de 24 h
Verificar el APTT 2 a 6 h despus de circular la heparina.

La heparina no debe represcribirse por ms de 24 h.
La verificacin del APTT sobre una base diaria es el mnimo obligatorio para todos los pacientes que reciben heparina intravenosa.
Vigilar las plaquetas despus de cuatro das del tratamiento con heparina.
heparina en la muestra. El tiempo de reptilasa se prolonga

en la disfibrinogenemia e hipofibrinogenemia.
Fibringeno
Figura 35-5 Tiempo de trombina.
La presencia de heparina en una muestra se confirma por la

correccin del tiempo de trombina con sulfato de protamina, que neutraliza la actividad anticoagulante.
Tiempo de reptilasa
La reptilasa es una enzima del veneno de la serpiente
Bothrops atrox (Per-de-lana), que coagula el fibringeno
humano al cortar el fibrinopptido A del fibringeno. La
reptilasa no es inhibida por la heparina o la antitrombina
III. Un tiempo de protrombina prolongado y tiempo de reptilasa normal est tambin de acuerdo con la presencia de
Si bien los desrdenes heredados del fibringeno son raros,

los desrdenes adquiridos son comunes en pacientes con
coagulopatas de consumo, enfermedad heptica y, despus
de una ciruga mayor, derivacin cardiopulmonar. Adems,
la asociacin de niveles altos de fibringeno y elevado riesgo del corazn isqumico y la enfermedad vascular perifrica estn bien reconocidos. El fibringeno es tambin
un reactor de fase aguda, con niveles elevados observados
con frecuencia en las enfermedades inflamatorias. La interpretacin de resultados es por tanto difcil, y el mtodo
ms apropiado depende del objetivo de la investigacin.
La confirmacin de los niveles bajos de fibringeno con
un mtodo Clauss manual es el ms recomendable. Hay
muchos mtodos que se emplean para medir el fibringeno, sobre todo con ms frecuencia los de coagulacin, que
miden el fibringeno funcional, basados en la formacin
de fibrina. En el mtodo del tiempo de trombina (Clauss),
el tiempo de trombina es proporcional a la concentracin
del fibringeno en la muestra de prueba. Una curva de calibracin se prepara de las concentraciones conocidas de fibringeno y se utiliza para convertir el tiempo de trombina
a una concentracin de fibringeno. Hay poca interferencia
ENSAYOS DEL FACTOR
de los FDP o de la heparina, a menos que estn presentes

en altas concentraciones.
Un ttulo del fibringeno puede obtenerse si se emplea
una serie de diluciones del plasma, seguidas por la adicin
de trombina. La dilucin en la cual el fibringeno se disuelve es una medida de la concentracin del fibringeno
presente. La prueba se efecta con frecuencia en paralelo
con sulfato de protamina y cido E-aminocaproico (EACA)
como indicadores de FDP y de fibrinlisis, respectivamente. Los mtodos fisicoqumicos que se usan con menos frecuencia miden el fibringeno total y pueden no reflejar la
actividad funcional, mientras los mtodos inmunolgicos
miden el antgeno relacionado con el factor presente tanto
en el fibringeno como en los FDP. El uso creciente de coagulmetros automticos condujo a la automatizacin de
los ensayos del fibringeno como parmetro derivado del
tiempo de protrombina, basados en un anlisis turbidimtrico con un espectrofotmetro.
Ensayos del D-dmero y de los FDP

Los ensayos del D-dmero se utilizan cada vez ms en el
diagnstico de la enfermedad tromboemblica venosa. Los
fragmentos D-dmero se producen durante la degradacin
de los cogulos de fibrina generados desde la trombina
por la plasmina. Los ensayos se basan en la deteccin que
hacen los anticuerpos especficos de los fragmentos de fibrina entrelazada sin actividad cruzada con fibringeno.
Estas pruebas se pueden, por tanto, realizar en muestras
de plasma. Hay actualmente tres mtodos principales para
la deteccin del D-dmero. Un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) tiene una sensibilidad muy
alta y proporciona resultados cuantitativos. La desventaja
principal es que la tcnica consume tiempo y, por tanto,
presenta problemas donde este anlisis se utiliza en el tamizaje rpido para la enfermedad tromboemblica venosa.
Los ensayos de aglutinacin de ltex son ms rpidos, pero
tienen una sensibilidad menor a 80%, requiriendo que se
utilicen conjuntamente con un tanteo de probabilidad clnica como parte de cualquier procedimiento de tamizaje.
Los ensayos de ltex automticos cuantitativos requieren
equipo especial para medir la disminucin de la transmisin de la luz a 405 nm; ste tiene la ventaja de ser sensible
y tambin rpido. Los ensayos de aglutinacin de sangre
entera ofrecen el ensayo ms rpido, basado en la aglutinacin cuantitativa del eritrocito, en la cual el anticuerpo
monoclonal para un D-dmero se liga al anticuerpo monoclonal que une a los eritrocitos. Estos ensayos son rpidos
pero dependen del operador, y no se obtiene un resultado
cuantitativo; asimismo tienen un alto valor predictivo negativo para la enfermedad tromboemblica venosa y, por
339
tanto, es frecuente que se combinen con una cuenta clnica

predictiva de probabilidad en el tamizaje de los pacientes
para excluir trombosis venosa. Los resultados elevados del
D-dmero no son especficos para la trombosis profunda de
la vena y, especialmente en los ensayos ms sensibles, los
niveles bajos de fibrina se detectan en una variedad de condiciones, como inflamacin, infeccin, vasculitis, embarazo y en particular durante tres semanas, despus de la ciruga. Los niveles elevados de los D-dmeros y de los FDP
se observan en la coagulacin intravascular diseminada,
la cual es un mtodo til en el monitoreo del progreso de la
enfermedad siguiendo la activacin in vivo de la plasmina.
El ensayo puede utilizarse tambin para valorar si una respuesta fibrinoltica a un agente fibrinoltico teraputico, tal
como estreptocinasa o urocinasa, se ha conseguido. Como
los ensayos del D-dmero son ms especficos y distinguen
entre la fibrinogenlisis y la fibrinlisis, han sustituido en
gran parte los ensayos para los FDP.
Los FDP se incrementan despus de la degradacin de
la plasmina del fibringeno y de la fibrina no entrelazada,
y ocasionan un tiempo de trombina prolongado o uno de
coagulacin por la reptilasa. Los ensayos del FDP que se
emplean con ms frecuencia utilizan una tcnica de aglutinacin de ltex, en la cual un anticuerpo que reconoce
los FDP es cubierto en la superficie de partculas de ltex.
Las partculas se aglutinan en presencia de los FDP, y la
concentracin se determina por la dilucin que sostiene
la aglutinacin. Como los anticuerpos utilizados en este ensayo pueden unirse al fibringeno, el ltimo debe eliminarse de la muestra del paciente. Esto se consigue al coagular
la muestra con trombina o veneno de serpiente en presencia
de un inhibidor de plasmina para prevenir la generacin in
vitro de productos de digestin. Estos reactivos se incorporan en tubos de coleccin especiales.
Ensayos del factor

Los ensayos especficos del factor de coagulacin se basan
en el tiempo de protrombina o el APTT. Un rango de diluciones del plasma estndar se agrega a un plasma deficiente
del factor especfico. Los tiempos de coagulacin que se
obtienen muestran una relacin lineal en la concentracin
del factor cuando se trazan en el papel de registro. La actividad del factor en el plasma de prueba puede entonces
determinarse desde el grfico. Estos ensayos son particularmente importantes en la identificacin de pacientes con
desrdenes heredados y tambin en la observacin de la
concentracin del factor en la terapia de reemplazo. Los
factores II, V, VII y X se ensayan con frecuencia usando
una fase del tiempo de protrombina, mientras que los factores VIII, IX, XI y XII se basan en un mtodo de APTT.
340
CAP. 35
La deficiencia del factor XIII no la detectan algunas pruebas de coagulacin de rutina, ya que ste no participa en la
reaccin que conduce a la formacin de fibrina. Una prueba de solubilidad de la urea es el mtodo ms utilizado para
tamizar la deficiencia del factor XIII. Un cogulo de fibrina
se forma, y se agrega acetona o urea a la muestra de plasma, a 37C. La fibrina unida por la accin del factor XIII
es insoluble en estas soluciones, pero en ausencia de la actividad del factor XIII un cogulo de fibrina se disuelve en
cerca de una hora.
Fibrinlisis
La fibrinlisis produce la rotura del cogulo de fibrina y
se inicia la liberacin desde el endotelio vascular del activador del plasmingeno tipo tisular (tPA) y del activador
del plasmingeno tipo urocinasa (uPA). Estos activadores
convierten el plasmingeno en la enzima activa plasmina,
la cual degrada la fibrina. Hay tambin un inhibidor natural
para la plasmina, II antiplasmina y el inhibidor del activador del plasmingeno tipo 1 (PAI-1) liberado por el endotelio, que se une al tPA y al uPA libres, y los inactiva.
Anticoagulantes naturales
In vivo hay activacin de grado bajo continua de la coagulacin e inhibidores naturales de los factores de coagulacin
activos. Una deficiencia de tales factores puede relacionarse
con una tendencia protrombtica.
Antitrombina III
La antitrombina III es un regulador principal de la trombina in vivo. Se prefieren los anlisis funcionales, pues se reconoce que una variedad de formas moleculares produce la
cuantificacin normal de acuerdo a lo medido por tcnicas
inmunolgicas. La mayor parte de los ensayos funcionales
miden la neutralizacin de la trombina del factor Xa en
presencia de heparina adicionada.
Protenas C y S
La protena C se activa despus de la generacin de trombina. sta se une a la trombomodulina sobre la superficie
de las clulas endoteliales, y liga y activa la protena C. La
trombina en esta situacin pierde su actividad procoagulante y es incapaz de convertir el fibringeno en fibrina.
La protena C activada acta como anticoagulante natural
degradando los factores V y VIII, limitando la generacin
adicional de trombina. La protena S sirve como un cofactor para la protena C activada. Un hallazgo adicional
importante es que la resistencia a la protena C activada
puede ocurrir por un defecto de la molcula del factor
V, la mutacin Leiden del factor V. sta se relaciona con
un riesgo aumentado de la trombosis venosa y es el factor
de riesgo protrombtico heredado conocido con ms frecuencia. El tamiz por PCR se recomienda para los pacientes con una historia protrombtica para excluir este factor.
El tamiz, que por PCR detecta la mutacin G2020 de la
protrombina, tambin se realiza de rutina como parte de un
tamiz de trombofilia.
Marcadores de la coagulacin activada

En los ltimos aos ha aumentado el inters en la hipercoagulabilidad y las pruebas disponibles para su deteccin.
Los ensayos para los marcadores de la activacin de la coagulacin tienen varias aplicaciones potenciales, incluyendo
la caracterizacin de los pacientes con condiciones clnicas
que predisponen a la trombosis, ayudando al diagnstico
de casos trombticos agudos y al monitoreo de la terapia
anticoagulante. Esto puede lograrse midiendo las formas
enzimticas de los cimgenos de la coagulacin generadas
durante la activacin de la coagulacin, o de forma indirecta, midiendo los pptidos de la activacin que se generan
cuando se activan los cimgenos. Adems, midiendo los
complejos que resultan de la inactivacin enzimtica por
los inhibidores naturales del plasma, un planteamiento adicional est disponible; tambin un nmero de inmunoensayos para medir los fragmentos que se crean de la activacin
de factores coagulantes como los pptidos de activacin de
los factores IX y X. El fragmento 1 + 2 de la protrombina,
que resulta de la activacin mediada por la trombina de
la protrombina y fibrinopptido A, cortado a partir de la
cadena del fibringeno por la trombina, son ndices de
la generacin y de la actividad de la trombina, respectivamente. Los inmunoensayos para cuantificar la protena C
activada o el pptido de activacin de la protena C pueden
considerarse como ndices de la funcin de la trombina y
de la trombomodulina. Los inmunoensayos estn tambin
disponibles para la medicin de los complejos inhibidos
enzimticamente, como la trombina, la antitrombina, y
otros complejos que resultan de la inhibicin de la protena C activada por el inhibidor de la protena C y la antitripsina. Actualmente, la utilidad de los marcadores de la
activacin de la coagulacin mejor la evaluacin de la hipercoagulabilidad en el diagnstico de los acontecimientos
trombticos agudos. Para el ltimo propsito es ms eficaz
medir los marcadores de activacin de la fibrinlisis, tales
como el D-dmero.
EVALUACIN AUTOMATIZADA DE LA COAGULACIN
Evaluacin automatizada de la coagulacin

Los avances recientes en tecnologa han anunciado la introduccin de instrumentos automticos para el tamizaje de la coagulacin. Un aumento en la carga de trabajo, la
demanda de mayor especificidad y la reduccin en trabajo manual garantizan que casi todos los laboratorios ahora
tengan automatizacin parcial o total. La mayor parte de
los mtodos manuales pueden modificarse para la instrumentacin, aunque los resultados varan mucho segn los
instrumentos. Todas las pruebas de rutina de tamizaje de
la coagulacin, incluyendo los ensayos del factor, pueden
analizarse en instrumentos automatizados. Instrumentos
ms avanzados permiten los ensayos cromognicos para
las pruebas especializadas de la coagulacin. Los primeros
instrumentos permitieron la deteccin del cogulo de fibrina a travs de electrodos. Un electrodo se mueve dentro y
fuera del reactante/plasma. Se agrega calcio y, tan pronto
como se forme el primer cogulo de fibrina, el circuito elctrico se completa y se detiene el temporizador. La mayor
341
parte de los instrumentos modernos implican la deteccin

fotoptica de la terminacin. Ya que tiene lugar el proceso
coagulante, la luz dispersada de un haz fijo se aumenta.
El tiempo de coagulacin se obtiene a partir de la curva
de coagulacin as como el tiempo requerido para que la
muestra alcance el porcentaje preestablecido de la intensidad de la luz dispersada. La instrumentacin completa incluye muestreo robtico, lectura por cdigo de barra de las
muestras, dispensadores automticos del reactante y un sistema de manejo de datos. Sin embargo, como los tiempos
de coagulacin varan entre los diferentes instrumentos, dependiendo del mtodo de deteccin de la terminacin, los
resultados de la automatizacin no son estrictamente comparables. Por tanto, las tcnicas manuales an se utilizan
como mtodos de referencia.
Lectura adicional
Lugassy G, Shulman S. Thrombosis and Anti-thrombotic Therapy. 2001: Hartin Dunitz, London.
SECCIN 6
CITOGENTICA
36
Bandeo y anlisis cromosmico
Mervyn Humphreys
Introduccin
La citogentica implica el estudio de los cromosomas humanos en la salud y en la enfermedad. En el ncleo humano el material gentico (DNA) est qumicamente ligado
a las protenas y empaquetado en las distintas estructuras
llamadas cromosomas. En general las clulas humanas poseen un total de 46 cromosomas, o 23 pares, un miembro
de cada par de cromosomas se hereda del padre y el otro lo
hereda la madre. El DNA de cada clula se empaqueta dentro de los cromosomas para facilitar la separacin correcta
del material gentico a ambas clulas hijas en cada divisin
celular. Cuando clulas, espermatozoides y huevos del gameto humano se producen, el nmero de cromosomas se
divide en dos hasta formar 23 pares va divisin celular
meitica, de tal manera que cuando un nuevo cigoto sea
formado, por la fusin de un espermatozoide con un vulo,
las clulas tengan el nmero correcto de cromosomas, 46;
1956 es considerado el ao en que da principio la citogentica humana moderna, ya que antes de ese ao se pensaba
que el nmero de cromosomas en la clula humana normal
era de 48.
El anlisis citogentico permite la deteccin de alteraciones cromosmicas, que pueden ser numricas (cromosomas
adicionales o faltantes) o estructurales (deleciones, duplicaciones, translocaciones, etc.). Las preparaciones cromosmicas o cariotipos pueden elaborarse y analizarse a partir
de diferentes tejidos del organismo, incluyendo sangre perifrica, lquido amnitico, piel o mdula sea. Los estudios
cromosmicos son un procedimiento diagnstico de laboratorio importante en numerosas situaciones clnicas. Por
ejemplo, los pacientes con defectos de nacimiento mltiples
o retraso mental, o ambos, desarrollo sexual anormal o esterilidad y numerosos tipos de neoplasias que pueden resguardar alteraciones citogenticas. Es, por tanto, muy importante
que los estudios cromosmicos se realicen como parte de
las investigaciones rutinarias en tales pacientes.
Hasta inicios de la dcada de 1970 el anlisis citogentico slo se realiz sobre preparaciones cromosmicas sin
bandeo, con tincin slida. Los cromosomas slo podran
identificarse y clasificarse con base en la forma y el tamao
y, por tanto nicamente las alteraciones numricas o los arreglos estructurales grandes podan detectarse. Algunas alteraciones numricas claras no pueden caracterizarse de manera
definitiva usando slo la tincin como tal (fig. 36-1); ste es,
sin embargo, an el mtodo de eleccin para las investigaciones de inestabilidad cromosmica, posterior a la exposicin de los pacientes o de clulas a agentes clastognicos.
A principios de la dcada de 1970 se introducen las primeras tcnicas de bandeo cromosmico permitiendo una
identificacin mucho ms exacta de cada par cromosmico. Esto, a su vez, permiti la deteccin de alteraciones
estructurales ms sutiles relacionadas con condiciones patolgicas especficas. Este captulo describe y explica los
principios fundamentales de las diversas tcnicas de bandeo cromosmico que estn disponibles y destaca sus principales aplicaciones en el laboratorio. Tambin se describe
el procedimiento del anlisis citogentico.
Bandeo cromosmico
Desde que se describieron las primeras preparaciones cromosmicas con bandeo a principios de la dcada de 1970,
346
CAP. 36
BANDEO Y ANLISIS CROMOSMICO
utilizan la tincin de Leishmann en lugar de la de Giemsa.

Algunos mtodos implican el tratamiento previo de los portaobjetos con solucin salina (2 SSC). Cada cromosoma
exhibe un patrn caracterstico y constante con bandeo G,
permitiendo la identificacin exacta de cada par cromosmico y la deteccin de alteraciones estructurales cromosmicas, como deleciones, inversiones y translocaciones.
Es esencial que los portaobjetos sean expuestos a diferentes tratamientos antes del bandeo G o dejarlos a temperatura ambiente 3 a 4 das, calentarlos durante la noche a
60C o tratarlos previamente con perxido de hidrgeno.
El almacenar de manera previa las preparaciones cromosmicas refuerza la integridad de los cromosomas, al hacerlos menos vulnerables a la sobredigestin por la tripsina
(fig. 36-2).
Figura 36-1 Metafase cromosmica con tincin slida de una

paciente con el sndrome de Down (trisoma 21). Aunque el cromosoma 21 no puede distinguirse del 22 en las preparaciones con
tincin slida, los cinco cromosomas del grupo G presentes (21s y
22s) estn sealados.
ha ocurrido una proliferacin rpida de tcnicas de tincin

cromosmica permitiendo la caracterizacin precisa del
cariotipo humano normal. El mtodo de bandeo con Giemsa, desarrollado a mediados de la dcada de 1970, es la tcnica ms utilizada para el anlisis cromosmico rutinario.
Muchos otros mtodos de bandeo por lo general se utilizan
slo para ayudar en la identificacin de las alteraciones especficas de un cromosoma, cuya naturaleza exacta es incierta, despus del anlisis de bandeo G.
Aunque se conoce muy poco acerca de la base bioqumica del bandeo cromosmico, los diversos patrones que se
obtienen parecen reflejar la mejor manera en que se organiza, por la cual la enorme longitud del DNA humano es
empaquetada dentro de los cromosomas. Las tcnicas de
bandeo cromosmico pueden dividirse en dos grupos: a)
aquellas que dan lugar a bandas distribuidas a lo largo de
todo el cromosoma, como los bandeos G, Q y R; y b) las
que tien un nmero restringido de regiones especficas del
cromosoma, como el bandeo C, tinciones NOR y DAPI.
Bandeo Giemsa (bandeo G)
El bandeo G de los cromosomas puede hacerse con diferentes qumicos que producen bandas alternas de intensidad
oscura y clara a lo largo de los cromosomas. El mtodo ms
utilizado implica la digestin de preparaciones cromosmicas con la tripsina, una enzima proteoltica, seguida por una
tincin con Giemsa. Muchos mtodos de bandeo G ahora
Figura 36-2 Proliferacin en la metafase femenina normal teida

por bandeo G.
Mecanismo
Aunque ninguna hiptesis satisfactoria explica el mecanismo del bandeo G, parece estar relacionado con la composicin del DNA e implica probablemente la eliminacin
selectiva de protenas de diversas regiones del cromosoma.
Se cree que los cromosomas contienen una estructura bsica que se evidencia por medio del procedimiento de bandeo G. Un nmero aproximado a los 146 pares de bases de
la cadena de DNA humano est enrollada alrededor de un
centro que consiste en ocho molculas de la protena histona, para producir las rplicas de unidades llamadas nucleosomas o crommeros. Los nucleosomas sucesivos se
ordenan como cuentas sobre un collar. Esta fibra elemental
de nucleosomas ligados se enrolla sobre s misma como un
solenoide para formar la fibra de cromatina. Las fibras de
BANDEO CROMOSMICO
cromatina se unen y se enrollan ms dentro de los paquetes

finales del cromosoma. Se cree que las bandas G oscuras
pueden correlacionarse simplemente con estos crommeros que parecen cuentas, y el patrn de bandeo G, por tanto,
refleja la organizacin estructural de la cromatina a lo largo
del cromosoma.
Se ha sugerido, como alternativa, que las bandas G oscuras y claras se correlacionan con el contenido funcional que
difiere del DNA en esas regiones del cromosoma. Los estudios de replicacin exhiben que las regiones del DNA con
tiempos de replicacin similares se agrupan con el DNA en
las bandas G oscuras y se replican de manera tarda en la
fase S, en comparacin con el DNA de la banda G clara. Los
estudios de hibridacin in situ muestran una correlacin entre el patrn de bandeo G y la localizacin de las secuencias
repetitivas del DNA. Se ha demostrado que las bandas G
oscuras son ricas en secuencias repetitivas del DNA tipo L1,
las cuales son relativamente ricas en AT y codifican muy
pocos genes expresados. Tambin se ha verificado que las
bandas G claras son ricas en secuencias repetitivas del DNA
tipo Alu, que son relativamente ricas en GC y codifican para
muchos genes que se expresan.
Aplicacin
El bandeo G es en gran medida el mtodo ms utilizado
para el anlisis citogentico rutinario en investigaciones
clnicas. Este mtodo permite la identificacin de cada par
cromosmico y la deteccin de la mayor parte de las alteraciones cromosmicas numricas y estructurales. Los
laboratorios citogenticos que no emplean como rutina el
bandeo G usan por lo general el bandeo R. Los otros mtodos de bandeo cromosmico se utilizan slo cuando un
anlisis de bandeo G inicial detecta una alteracin cromosmica que requiere investigacin adicional para su caracterizacin exacta. El patrn de bandeo G es, a grosso modo,
similar al patrn de bandeo Q.
Bandeo con quinicrina (bandeo Q)
El bandeo Q, la primera tcnica de bandeo cromosmico,
se introdujo en 1968, cuando las preparaciones cromosmicas eran teidas con la mostaza de quinicrina. El bandeo Q en la actualidad se produce por lo general usando
el dihidrocloruro de quinicrina, que es menos txico. Una
serie de regiones brillantes y opacas que despiden luz fluorescente se revelan a lo largo de los cromosomas cuando se
observan con microscopia fluorescente (de 450 a 500 nm).
El patrn de bandeo Q se asemeja enormemente al patrn
de bandeo G, con bandas Q que despiden luz fluorescente
brillante que corresponden con las bandas G que se tien de
347
Figura 36-3 Bandeo Q. La proliferacin en la metafase de un

paciente con un cromosoma X anormal, derivado de una reestructuracin t(X;Y). La flecha pequea indica el cromosoma Y normal; la flecha grande indica X anormal con heterocromatina Yq
ligada a Xp.
oscuro. Excepciones notables incluyen la porcin distal del

brazo largo del cromosoma Y, que muestra fluorescencia
muy brillante. Las regiones satlites de los cromosomas
acrocntricos (13 a 15 y 21 a 22) tambin muestran los
patrones caractersticos del bandeo Q (fig. 36-3).
Mecanismo
Debido a que los patrones del bandeo Q y del bandeo G
muestran tales semejanzas, los mecanismos tienen influencias claras por los mismos parmetros de la composicin
del cromosoma (vase bandeo G). El patrn del bandeo
Q se explica por la especificidad de las mostazas de nitrgeno por la guanina. La fluorescencia de la quinicrina
se realza en las regiones de DNA ricas en secuencias AT
y se opaca en las regiones ricas en GC, lo que produce el
patrn del bandeo Q. El contenido de DNA en AT/GC variante de las bandas cromosmicas explica, por tanto, las
diferencias en la intensidad de la tincin cuando se tratan
con quinicrina.
Aplicaciones
El bandeo Q requiere un microscopio de fluorescencia para
el anlisis. El bandeo Q en preparaciones cromosmicas no
es conveniente para las investigaciones citogenticas rutinarias, pues la fluorescencia se pierde muy rpido durante
el anlisis. Este mtodo de bandeo, sin embargo, es til
para el examen especfico de los heteromorfismos relacio-
348
CAP. 36
nados con el cromosoma Y y las regiones satlites de los

cromosomas acrocntricos. Los patrones del bandeo Q del
brazo corto y de los heteromorfismos satlites pueden, por
ejemplo, usarse a veces para determinar el origen parental,
y la etapa sin separacin meitica en las trisomas que involucran cromosomas acrocntricos.
Bandeo reverso (bandeo R)
El bandeo R cromosmico es complementario de las bandas Q y G, y su primera aparicin se reporta en 1971. Las
laminillas se incuban en un amortiguador de fosfato a 85 a
89C, despus se tien con Giemsa o con naranja de acridina, lo que produce un patrn de bandas, que es el contrario
de los bandeos G o Q. Cuando se tien con Giemsa, las
bandas son plidas y requieren contraste de fases para el
anlisis. sta fue la primera tcnica de bandeo no fluorescente en desarrollarse. Usando la tincin con naranja de
acridina, las bandas R positivas despiden luz fluorescente
verde/amarilla, mientras las bandas R negativas emiten una
luz fluorescente naranja/roja. El bandeo R es muy exitoso
si las laminillas se han envejecido a temperatura ambiente
por varios das o a 60C durante la noche. Las laminillas
recin hechas requieren tiempos de incubacin ms cortos,
dentro de un amortiguador (fig. 36-4).
en AT, se replican de manera tarda y no contienen genes

housekeeping. El patrn de bandeo R se produce por la
desnaturalizacin diferencial de las regiones cromosmicas ricas en GC y ricas en AT. Las regiones ricas en AT se
desnaturalizan a una temperatura ms baja y despiden luz
fluorescente roja con el naranja de acridina. Este ltimo
cuando se intercala entre los pares de bases de las regiones
ricas en GC de doble hebra despide luz fluorescente amarilla. No est muy claro, en su totalidad, por qu los tratamientos con Giemsa tambin producen bandeo R. Puede ser
debido a la interaccin diferencial de las protenas con las
regiones cromosmicas ricas en AT y en GC. Que las laminillas envejecidas requieran tiempos ms cortos de incubacin y produzcan un mejor bandeo R sugiere, otra vez, que,
como las laminillas estn envejecidas, su estructura general
llega a ser ms estable y menos vulnerable a la degradacin
mediante diferentes agentes (vase bandeo G).
Aplicacin
Aunque los laboratorios citogenticos utiliza el bandeo
G para investigaciones de rutina, el bandeo R es el mtodo empleado para el anlisis rutinario del cromosoma en
muchos laboratorios franceses. Esta tcnica de bandeo en
general no revela ninguna nueva informacin que no est
disponible siguiendo el bandeo G, pero en ocasiones se emplea para determinar con ms exactitud los puntos de rotura
de las alteraciones estructurales, sobre todo si existen puntos de rotura cromosmicos en las porciones terminales.
Bandeo de heterocromatina constitutiva (bandeo C)
El procedimiento del bandeo C implica tratar los cromosomas con cido clorhdrico (HCl), lcali (BaOH2) y solucin
salina caliente (2SSC). Las preparaciones cromosmicas
del bandeo C por lo general se tien ligeramente, excepto
las del teido oscuro de las regiones de heterocromatina
constitutiva. stas se sitan en los centrmeros de todos los
cromosomas, lo cual no ocurre en el cromosoma Y, que se
localizan en la regin distal del brazo largo (fig. 36-5).
Figura 36-4 Bandeo R usando naranja de acridina.
Mecanismo
Igual que en los bandeos G y Q, el patrn del bandeo R
parece reflejar la composicin estructural y funcional de
los cromosomas. Las bandas R positivas son ricas en bases GC, se replican en forma temprana, y contienen genes
housekeeping, mientras las bandas R negativas son ricas
Mecanismo
Se piensa que los tratamientos astringentes para la tcnica de bandeo C facilitan la prdida preferencial de DNA
y de protena de las regiones cromosmicas sin banda C.
La depuracin y la desnaturalizacin sucesivas de DNA
cromosmico ocurren durante los tratamientos con cido
clorhdrico y lcali. Adems, los fragmentos pequeos de
DNA se pierden durante el tratamiento con sal, dejando
BANDEO CROMOSMICO
349
Tincin de la regin organizadora nucleolar

(tincin NOR)
Los genes ribosmicos que codifican para el RNA, forman
y mantienen el nucleolo en ncleos interfsicos, estn situados en los brazos cortos de los cromosomas acrocntricos
satlites (13, 14, 15, 21 y 22). Cuando las preparaciones del
cromosoma se incuban durante toda la noche con solucin
de nitrato de plata, estas regiones organizadoras nucleolares (NOR) se tien de oscuro (fig. 36-6). Los satlites
Figura 36-5 El bandeo C de una proliferacin en la metafase de

un paciente con una inversin del cromosoma 4. El cromosoma
4 invertido (flecha grande) tiene la posicin del centrmero desplazada hacia el extremo del telmero del brazo corto (punta de
flecha). Los cromosomas normales del grupo B (4 y 5) no pueden
distinguirse usando slo bandeo C (flechas pequeas).
slo la heterocromatina centromrica muy compactada.

Las protenas no histnicas ligadas a las regiones con banda C pueden prevenir la desnaturalizacin de DNA que se
produce en esos sitios.
Aplicaciones
Las bandas C de todos los cromosomas, especialmente
de los cromosomas 1, 9, 16 y Y, varan de tamao entre homlogos as como entre individuos. La variacin extrema
del tamao de las bandas C no tiene ningn efecto fenotpico, pues estas regiones contienen slo heterocromatina constitutiva y ningn gen importante. Si es confuso que
una banda adicional o un segmento anormal del cromosoma, detectado por bandeo G, represente una variacin
normal de una regin heterocromtica o una alteracin cromosmica dicromtica de posible importancia clnica, el
anlisis de bandeo C puede proveer informacin concluyente. El bandeo C puede, en ocasiones, permitir la determinacin del origen de la no disyuncin en pacientes
con trisomas. Cuando el cromosoma implicado tiene una
variante heterocromtica notable, entonces la comparacin
de las preparaciones para bandeo C del caso ndice y de
ambos padres puede indicar en cul de los padres, y posiblemente en qu etapa de la meiosis, ocurre el error de la
no disyuncin que causa la trisoma.
Figura 36-6 Metafase teida con NOR de un paciente con una

translocacin recproca entre los cromosomas 7 y 14. La flecha
indica el cromosoma 14 anormal con el material del cromosoma 7 translocado sobre la NOR.
de los cromosomas acrocntricos se ven con frecuencia en

grupo dentro de las clulas. Este fenmeno, llamado relacin basada en los satlites, refleja una funcin comn,
probablemente, de las diversas NOR en la organizacin del
nucleolo celular.
Mecanismo
El teido de NOR implica la extraccin de DNA, RNA e
histonas a partir de los cromosomas. Realmente son protenas residuales adyacentes a las NOR, ms que NOR sin
histona, las que se tien selectivamente con este mtodo.
Los estudios han demostrado que este mtodo tie slo las
NOR activas que participaron en la formacin del nucleolo
en la interfase precedente del ciclo de la clula.
350
CAP. 36
Aplicacin
Mecanismo
El nmero de las NOR que se detectan por proliferacin

en la metafase vara en los individuos porque slo se tien las NOR activas que participan en la formacin del
nucleolo durante la etapa interfase precedente. El patrn
de la tincin de la NOR de cromosomas acrocntricos es
consistente dentro de un individuo y es hereditario. Los
patrones de las NOR y el aspecto por el bandeo Q de los
satlites acrocntricos son, por tanto, tiles para determinar el origen parental y/o la etapa sin disyuncin meitica
implicada en las trisomas que involucra a estos cromosomas. La tincin de las NOR es til para la caracterizacin
de cromosomas marcadores pequeos, para confirmar si
poseen o no regiones satlite y, por tanto, se derivan a partir
de un cromosoma acrocntrico.
DAPI, que une al DNA, tiene una afinidad por los pares de
bases AT. La unin de DAPI, en consecuencia, slo produce un patrn de bandeo Q dbil. Aunque la fluorescencia
de DAPI es realzada por ambos pares de bases AT y GC,
existe un realce significativo de la fluorescencia en regiones de DNA ricas en AT. Existe tambin cierta evidencia
de que DAPI se une a grupos AT en el surco menor de la
hlice doble del DNA. Tambin DA muestra afinidad por
la unin al DNA especfica de AT. Aunque los dos colorantes usados tienen preferencia de apareamiento con bases
similares, poseen diferentes afinidades de unin y estructuras diferentes. La fluorescencia diferencial que se obtiene
puede deberse a la unin competitiva entre los dos colorantes, que se unen en sitios similares pero no idnticos. Alternativamente, DA es probable que bloquee el enlazamiento
de DAPI en regiones eucromticas, mientras los sitios de
enlazamiento de DAPI permanecen disponibles en regiones heterocromticas.
Bandeo DA-DAPI
Cuando los cromosomas se tien con el colorante fluorescente 4,6-diamino-2-fenil-indol (DAPI) y se tratan con
distamicina (DA) en una contratincin no fluorescente, un
subconjunto de bandas C fluorescentes se revela. Las regiones heterocromticas de los cromosomas 1, 9, 16 y Y,
adems de la proximal del brazo corto del cromosoma 15
despiden luz fluorescente muy brillante. Usando slo DAPI
se produce un patrn de bandeo similar al bandeo Q (fig.
36-7).
Aplicaciones
El bandeo DA/DAPI es predominante cuando se le utiliza
para la interpretacin de ciertas alteraciones del cromosoma detectadas al usar los mtodos ms rutinarios de bandeo
(bandeo G o R), por ejemplo, el bandeo DA/DAPI puede
usarse donde un cromosoma modificado en su estructura
tiene un punto de rotura cercano a una regin teida selectivamente con bandeo DA/DAPI. Este bandeo es til, en
particular, para estudiar cromosomas marcadores satlites
pequeos. Esta tcnica puede identificar aquellos cromosomas marcadores que involucran la regin proximal del
extremo del cromosoma 15. La tincin DAPI es tambin
la contratincin normal usada para la hibridizacin in situ
fluorescente de rutina en preparaciones cromosmicas.
Bandeo de replicacin
Figura 36-7 Metafase masculina teida usando bandeo DA/

DAPI. Las flechas indican el cromosoma 15s con brazos cortos
que despiden luz fluorescente brillante.
Un patrn del bandeo G o R puede producirse sobre preparaciones cromosmicas si se desarrollan en presencia de
5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU), anlogo de la timidina, y
se tien con el colorante fluorescente Hoechst 33258. Este
mtodo utiliza el hecho de que diversas regiones del complemento del cromosoma se replican en diferentes etapas
durante la fase S; tambin confa en la incorporacin de la
marca dentro del DNA, as que BrdU se agrega a clulas
vivas en un cultivo tisular. Controlando la sincronizacin
cuando el pulso de BrdU se administra a los cultivos celulares relativa al tiempo de recoleccin, un patrn de bandeo
que se replica temprano o tardamente puede producirse. Si
BANDEO CROMOSMICO
351
Figura 36-8 Metafase prolongada despus del bandeo de replicacin. Esta preparacin se obtuvo a partir de cultivos sanguneos
a los cuales se agreg BrdU seis horas antes de la recoleccin.
Los cromosomas muestran un patrn de bandeo R. Este paciente
porta una translocacin t(X;11). En este caso, X normal es replicado tardamente. Con cultivos con pulsos tardos de BrdU, el X
que se replica tarde se tie ligeramente (flechas).
la BrdU se agrega al iniciar el cultivo, pero se elimina alrededor de 6 h antes de la recoleccin a las 48 h, se obtiene
un patrn de bandeo G. Si la BrdU se agrega slo cerca de
6 h antes de que los cultivos sean recolectados, se producen
bandas R (fig. 36-8).
Si las clulas experimentan dos ciclos completos de replicacin en presencia de BrdU, las cromtides hermanas de
cada cromosoma se tien diferencialmente. El patrn de la
coloracin doble que se obtiene permite la deteccin de los
intercambios de cromtides hermanas (ICH), que son puntos a lo largo de los cromosomas donde el material de la
cromtide se intercambia entre cromtides hermanas. Las
preparaciones de ICH se tien con el fluorocromo Hoechst
33258. Entonces o son vistos por microscopia de fluorescencia (360 a 400 nm) o, si primero se exponen a la luz
UV y en seguida se tien con el colorante Giemsa (fluorescencia ms tincin Giemsa [FPG]), pueden analizarse por
medio de la microscopia de luz (fig. 36-9).
Mecanismo
El BrdU es un anlogo de la timidina que se incorpora muy
rpido dentro de los cromosomas. Cuando los cromosomas
se tien con el fluorocromo Hoechst 33258 (que se une a
Figura 36-9 Prolongaciones de la metafase teidas para los

intercambios de cromtides hermanas (ICH). a) Metafase de
cultivos sanguneos con slo tres ICH espontneos sealados. b)
Metafase de cultivos sanguneos del mismo individuo, incubados
con el agente intercalante (alquilante) mitomicina C, mostrando
un aumento muy significativo en el nivel de ICH (> 100/clula).
pares de bases ricas en AT), las regiones del cromosoma

que se replican en presencia de BrdU contienen DNA sustituido con BrdU. Cuando BrdU est presente al inicio del
cultivo, slo se observa durante la parte temprana de un
ciclo de la replicacin del DNA, y por tanto las regiones
cromosmicas que se replican temprano en la fase S (bandas R) llegan a sustituirse con BrdU, y por tanto despiden
luz fluorescente dbil o se tien ligeramente con Giemsa.
Las bandas G que se replican tarde en la fase S, despus de
que BrdU se ha eliminado de los cultivos, y se incorpora la
timidina, despiden luz fluorescente brillante, o se tien de
oscuro con Giemsa (bandeo G). De manera alterna, si slo
se aade BrdU a los cultivos alrededor de 6 horas antes de
la recoleccin, slo est presente en la ltima parte de un
ciclo de la rplica del DNA y a las regiones que se replican
temprano (bandas R) se les incorpora timidina, y despiden
luz fluorescente brillante o se tie oscuro con Giemsa. Slo
352
CAP. 36
las regiones que se replican tarde (bandas G) llegan a sustituirse con BrdU y, por tanto, despiden luz fluorescente
dbil o se tien ligeramente con Giemsa (bandeo R).
Aunque los cromosomas homlogos muestran patrones
similares de replicacin, en mujeres pueden distinguirse
los cromosomas X que se replican temprana y tardamente.
El cromosoma X que se replica tarde se tie ms oscuro
con bandeo de replicacin BrdU de pulso temprano y se
tie levemente con bandeo de replicacin BrdU de pulso
tardo (fig. 36-8).
El patrn de tincin de dos colores que se obtiene cuando BrdU est presente en los cultivos celulares durante dos
ciclos de replicacin refleja la incorporacin asimtrica de
BrdU dentro del DNA cromosmico. Mediante replicacin
semiconservadora, cada hebra nueva de DNA consiste de
una original de DNA y una nueva construida. Despus de dos
ciclos de replicacin en presencia de BrdU, una cromtide
contiene DNA con BrdU sustituido dentro de una hebra
de DNA, mientras que su cromtide hermana contiene dos
hebras de DNA sustituidas con BrdU. Esta diferencia qumica entre las cromtides hermanas explica la que existe
en la intensidad de teido que se obtiene. La intensidad es
proporcional a la cantidad de DNA que contiene timidina
presente en cada cromtide. Cuando las preparaciones cromosmicas se tien usando la fluorescencia y el mtodo de
Giemsa, ms DNA se pierde a partir de la cromtide hermana sustituida con BrdU que su contraparte, por eso produce
el patrn de teido oscuro y claro caracterstico.
Aplicacin
Adems de aportar mtodos alternativos para los bandeos
G y R, los patrones de teido que se obtienen despus de
administrar un pulso de BrdU temprano o tardo en el ciclo
celular se utilizan sobre todo para los estudios de replicacin. En mujeres normales un cromosoma X se inactiva
en cada clula por un proceso aleatorio, y este X inactivo
siempre es el ltimo cromosoma en completar su replicacin en cada ciclo celular. El bandeo de replicacin es til
para investigar el patrn de la inactivacin X en las mujeres que portan alteraciones estructurales que involucran el
cromosoma X, donde el patrn de la inactivacin del X por
lo general es un evento no aleatorio. El ejemplo ilustrado
en la figura 36-8 muestra una paciente que porta una translocacin equilibrada t(X;11). La tincin de replicacin
muestra que el cromosoma X normal se replica tarde en
todas las clulas. Este sesgo del patrn de la inactivacin
X aleatorio normalmente asegura que los segmentos autosmicos implicados en tales translocaciones autosoma-X
no estn tambin inactivados, lo que tendra un impacto
clnico deletreo.
La produccin de patrones de teido cromosmico de doble color permite la deteccin de los intercambios de cromtides hermanas. stos son puntos a lo largo de las cromosomas
donde hay intercambio de material entre las dos cromtides
hermanas de cromosomas individuales, creando un aspecto
de tablero de damas. Las clulas humanas normales muestran una frecuencia media de 5 a 8 ICH/clula, pero se observa que los niveles de ICH aumentan con la exposicin a
muchos mutgenos. El uso principal de esta tcnica es, por
tanto, un mtodo para el monitoreo de dao cromosmico
inducido por mutgenos, en pacientes o clulas. En muchos
casos, ICH es ms sensible para la deteccin del dao cromosmico que para la medicin de las aberraciones cromosmicas (fig. 36-9). Sin embargo, no todos los mutgenos de la
prueba muestran una correlacin positiva entre la rotura cromosmica inducida y los ICH inducidos, indicando por ello
que estos dos parmetros reflejan expresiones diferentes e independientes del dao inducido por mutgenos. Este mtodo
tambin se utiliza como prueba diagnstica para el desorden
de la inestabilidad cromosmica, el sndrome de Bloom, en
el cual las clulas muestran un aumento significativo del nivel basal normal de los ICH espontneos. Los ICH tambin
pueden utilizarse para estudiar la cintica celular indicando la
duracin de las diversas etapas del ciclo celular.
Anlisis cromosmico
La mayor parte de los anlisis citogenticos rutinarios se
realiza examinando las preparaciones en metafase bandeadas (principalmente por bandeo G o R). El anlisis citogentico es una disciplina muy especializada del laboratorio
y se requiere un entrenamiento de varios aos antes de que
un citogenetista llegue a ser competente en el reconocimiento del cariotipo normal y en la deteccin de la variedad de alteraciones cariotpicas que puedan encontrarse.
Clasificacin de cromosomas bandeados y nomenclatura

Los cromosomas se identifican, se clasifica su cariotipo y
describen usando las pautas propuestas por el Sistema Internacional de Nomenclatura Cromosmica (ISCN). ste
es el informe publicado por el Comit Permanente sobre
Nomenclatura Citogentica Humana. La terminologa
bsica para describir el cariotipo humano lo propuso este
grupo en 1971 (nomenclatura de Pars). Las caractersticas
principales que distinguen los cromosomas son longitud,
posicin del centrmero, presencia de las constricciones
secundarias (satlites) y patrn de bandeo. El centrmero es la constriccin primaria que divide cada cromosoma
en un brazo corto (brazo p) y en uno largo (brazo q). Los
ANLISIS CROMOSMICO
satlites son constricciones secundarias situadas en los extremos de los cromosomas 13 a 15, 21 y 22. Los autosomas
son numerados en pares por tamao decreciente a partir
de 1 a 22, dejando aparte los cromosomas del sexo (X y
Y). De acuerdo con la longitud, la posicin del centrmero
y los satlites, los cromosomas del cariotipo humano slo
pueden clasificarse en siete grupos, A-G (cromosoma X incluido en el grupo C/cromosoma Y incluido en el grupo G)
(fig. 36-10).
353
una regin tambin se numera en secuencia, iniciando con

la banda 1, la ms cercana al centrmero. Por tanto, 1p31
indica el cromosoma 1, brazo corto, regin 3, banda 1. La
calidad de las preparaciones cromosmicas ha mejorado a
travs de los aos, con la produccin de cromosomas ms
alargados. Con esta mejora, se muestra que ciertas bandas,
vistas en preparaciones cromosmicas como ms cortas, actualmente se resuelven en diferentes bandas ms finas. Por
esta razn, el ISCN produce actualizaciones de los ideogramas cromosmicos que corresponden a cromosomas
con extensiones mejoradas ms largas. Donde se encuentra
que bandas cromosmicas se subdividen en ms bandas, se
asignan nmeros a las sub-bandas. Por convenio, un punto
decimal se coloca antes de cualquier sub-banda y hasta dos
nuevos nmeros se aaden despus de esto para describir
las nuevas sub-bandas. Por tanto, 1p31.2 describe el cromosoma 1, brazo corto, regin 3, banda 1, sub-banda 2 (fig.
36-11).
Figura 36-10 Cariotipo con bandeo G de un paciente con una

translocacin recproca equilibrada, que involucra el brazo corto del
cromosoma 5 y el brazo largo del cromosoma 14. Los cromosomas
anormales estn sealados.
De acuerdo con la posicin del centrmero, hay tres

tipos de cromosoma: metacntrico (centrmero en el centro), acrocntrico (centrmero en un extremo) y submetacntrico (centrmero excntrico). Los pares cromosmicos
individuales pueden, sin embargo, slo identificarse y clasificarse exactamente a partir de sus patrones de bandeo. El
ISCN incluye un sistema completo de mapas cromosmicos diagramticos (ideogramas). Estos ideogramas ilustran
cada cromosoma, dividindolos en segmentos convenientes
(regiones) de longitud casi igual definiendo varios puntos
establecidos (marcas). Estas marcas incluyen los extremos
del cromosoma (telmeros), los centrmeros y otras bandas prominentes. Cada regin se numera secuencialmente, movindose hacia afuera, en cualquier direccin de los
centrmeros. Por ejemplo, 1p3 representa el cromosoma
1, brazo corto, regin 3. Cada banda importante dentro de
Figura 36-11 Ideograma del cromosoma 1, destacando los brazos

p y q, las regiones cromosmicas sobre el brazo p y las marcas sobre
el brazo q.
El sistema ISCN permite la descripcin exacta de

los puntos de rotura en todas las reestructuraciones cromosmicas. Al usar ISCN para describir alteraciones cariotpicas, el citogenetista debe utilizar el ideograma ms
apropiado que muestre la resolucin de bandeo equivalente
al cromosoma que se analiza.
354
CAP. 36
Variacin cromosmica
Para reconocer alguna alteracin cromosmica presente en
cualquier preparacin de los cromosomas humanos, el citogenetista debe estar muy familiarizado con el aspecto del
cariotipo humano normal. Esto es complicado por la ocurrencia de variacin considerable en ciertas regiones heterocromticas, incluyendo polimorfismos centromricos
y satlites. Es importante que estas regiones de variacin
cromosmica normal se reconozcan y distingan de otras
alteraciones cromosmicas clnicas significativas.
Anlisis cromosmico
La mayor parte de los anlisis rutinarios del cromosoma
se ejecuta examinando microscpicamente preparaciones
en metafase bandeadas. Las metafases convenientes se localizan primero tamizando las laminillas bandeadas, con
microscopia de bajo aumento (magnificacin 100). Las
metafases convenientes entonces se examinan con una
magnificacin ms alta (generalmente 1 000). Para el
anlisis de la constitucin del cariotipo, slo cinco o seis
metafases de calidad conveniente necesitan examinarse,
excepto donde un posible mosaicismo del cromosoma
puede esperarse, y ms clulas deben analizarse. La calidad de las metafases seleccionadas para el anlisis depende
en gran parte del objetivo de la investigacin citogentica.
Si se verifica una alteracin numrica obvia (p. ej., trisoma
21) entonces no se requieren metafases de alta calidad. Sin
embargo, si una alteracin sutil puede estar presente (como
una delecin o reestructuracin pequea que involucre segmentos mnimos), entonces deben examinarse ms preparaciones cromosmicas alargadas.
Si el citogenetista est satisfecho porque todos los pares
cromosmicos muestran el patrn de bandeo normal reconocido, puede informarse un cariotipo normal. Los cariotipos se describen usando la nomenclatura ISCN. En general,
sta tiene el orden siguiente: nmero total de cromosomas,
constitucin del cromosoma del sexo, descripcin de la alteracin (si est presente), y cada uno de stos es separado
por una coma. As, la frmula del cariotipo femenino normal es 46,XX y el cariotipo masculino normal es 46,XY.
Donde se reconoce una alteracin del cromosoma, se asigna la frmula apropiada del cariotipo. Cada tipo de alteracin estructural tiene una abreviatura ISCN asociada, por
ejemplo, t para la translocacin, i para la inversin, etc.
Los cromosomas implicados y cualquier punto de rotura se
incluyen en la frmula del cariotipo asignada, por ejemplo, el cariotipo anormal ilustrado en la figura 36-10 tiene la frmula 46,XY,t(5;14)(p15.2;q24.1). Esto indica que
el cromosoma 5 est fracturado en el brazo p en la banda
15.2, mientras que el cromosoma 14 presenta una rotura
en el brazo q en la banda 24.1. Si la alteracin es indistinta

o los puntos de rotura son confusos en el examen microscpico, la preparacin de cariotipos puede ayudar a caracterizar la naturaleza exacta de la alteracin. Esto habra
implicado anteriormente fotografiar las clulas anormales
usando la fotomicroscopia, desarrollar e imprimir la pelcula, cortando y recambiando los cromosomas en el orden
del cariotipo estndar. En la actualidad, la produccin de
cariotipos en los laboratorios citogenticos de diagnstico
se hace ms fcil usando sistemas de anlisis de imagen
especializados. Estos sistemas acoplan al microscopio con
una cmara fotogrfica digital que se usa para capturar una
imagen digital de la preparacin metafsica que se pretende analizar. El software citogentico especializado entonces permite el arreglo de los cromosomas en la pantalla de
la computadora para generar un cariotipo final, que puede imprimirse o almacenar, o ambos, electrnicamente.
Anlisis cromosmico para las alteraciones
adquiridas del cromosoma
El anlisis citogentico de alteraciones malignas (leucemias y tumores slidos) se realiza de rutina para detectar
cualquier alteracin cromosmica adquirida asociada. La
deteccin de tales alteraciones proporciona la informacin
vital del diagnstico de la enfermedad, el pronstico del paciente y para monitorear la respuesta a la terapia. El anlisis
cromosmico para las alteraciones cromosmicas adquiridas produce algunas diferencias importantes del anlisis
de constitucin. Las alteraciones cromosmicas adquiridas
son clonales, confinadas slo a las clulas malignas. Adems, las metafases que se obtienen de las clulas malignas
muestran tpicamente morfologa inferior (bandas cortas y
pobres) comparadas con las clulas benignas. Es importante, primero, que el citogenetista analice un nmero ms
grande de clulas para permitir la deteccin de alteraciones clonales pequeas (es decir, no todas las clulas que se
detectan pueden pertenecer al clon anormal), y segundo,
que una seleccin representativa de todas las metafases sea
examinada para evitar la seleccin inadvertida de la mejor
calidad, pero posiblemente de las clulas benignas.
Citogentica molecular
El desarrollo significativo ms reciente en el campo de la
citogentica de diagnstico rutinario ha sido la introduccin de tcnicas citogenticas moleculares en la dcada
de 1980. Existe una amplia gama de sondas, disponibles
en el comercio, las cuales pueden utilizarse para resaltar
regiones especficas del cariotipo humano por la tcnica
de hibridacin in situ fluorescente (FISH). sta permite la
deteccin de algunas alteraciones muy sutiles que estn

ms all de los lmites de cualquier tcnica de bandeo. Las
sondas FISH pueden utilizarse para caracterizar rpido y
con exactitud las alteraciones complejas o no identificadas
del cromosoma, que se detectan usando tcnicas de bandeo.
Adems, las sondas FISH permiten que sean tamizados especmenes para alteraciones citogenticas importantes, an
cuando extensiones de la metafase dividindose no estn
disponibles. Esto permite el diagnstico prenatal rpido, ya
que las muestras del lquido amnitico pueden tamizarse
para alteraciones especficas por FISH despus de 24 horas, en lugar de esperar dos semanas para que suficientes
clulas crezcan en cultivo para producir preparaciones cromosmicas. La FISH tambin es particularmente til en los
estudios de malignidad donde las clulas mitticas pueden
ser difciles de obtener.
Todos los laboratorios citogenticos de diagnstico rutinario ahora confan mucho en estas pruebas FISH, las cuales complementan los mtodos rutinarios de bandeo. En
muchos casos las pruebas FISH son realmente ms apropiadas que el anlisis alternativo del cariotipo completo.
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37
Hibridacin in situ fluorescente
Ivor Hickey
La hibridacin in situ fluorescente (FISH) es una tcnica

poderosa que desempea una parte significativa en varias
reas actuales de la investigacin gentica. Se refiere a una
serie de procedimientos relacionados, en los cuales molculas de cido nucleico de cadena sencilla (sondas) marcadas con qumicos que por s mismos son fluorescentes o
pueden detectarse por microscopia de inmunofluorescencia, son tiles para identificar secuencias especficas del
cido nucleico objetivo en preparaciones citolgicas.
Esta tcnica se deriva directamente de los primeros experimentos originales de hibridacin del cido nucleico iniciados por Speigleman en la dcada de 1960, que adaptaron
varios grupos, usando sondas marcadas con radiactividad
para identificar secuencias de cidos nucleicos en material
fijado sobre el portaobjetos que se observa al microscopio.
Los ejemplos iniciales incluyeron la identificacin de los genes del RNA ribosmico en los nucleolos de los oocitos de
Xenopus y del DNA satlite centromrico en los cromosomas en metafase del ratn. Aunque los protocolos avanzaron mucho desde entonces, los pasos bsicos permanecen
en gran parte inalterados. Todas las variaciones de la tcnica
incluyen una sonda de cido nucleico, una preparacin citolgica y un sistema de deteccin. Los pasos principales en
el sistema se describen en este punto; antes, las variaciones
y las aplicaciones de la tcnica se comparan.
Eleccin de la sonda
En muchos casos un clon de DNA genmico puede utilizarse, aunque, como se ver ms adelante, otras fuentes de
DNA tambin pueden utilizarse para el teido de cromosomas. En algunas aplicaciones se usan las molculas de
RNA, aunque es muy raro en la actualidad. La sonda debe

marcarse antes de usarse, por orden de deteccin, el material se hibrida al final del procedimiento. Es importante
tomar en cuenta que un factor en la deteccin de sonda
es la longitud de la misma. Bajo los mismos sistemas de
marcado y de deteccin, una sonda ms pequea proyecta
siempre una seal ms dbil que una ms larga. Aunque
las sondas tan pequeas como de 500 bases es posible detectarlas en ciertas circunstancias, los csmidos, vectores
derivados del bacterifago , que contienen casi 40 kb del
DNA clonado, son las fuentes ms utilizadas de la sonda.
El DNA clonado en vectores que transportan insertos ms
grandes, como los cromosomas artificiales bacterianos
(BAC), los cromosomas artificiales P1 (PAC) o los cromosomas artificiales de levadura (YACS), trabaja bien en
todos los casos.
Marcacin de las sondas

Los marcadores que se utilizan con ms frecuencia en los
experimentos de FISH son los trifosfatos deoxiuridina modificados. Las modificaciones implican la adicin de haptenos,
grupos inmunorreactivos tales como digoxigenina o biotina,
los cuales se enlazan a la posicin 5 del anillo de pirimidina
por un brazo largo espaciador. stos pueden detectarse por
tcnicas de inmunofluorescencia indirecta. Alternativamente, las sondas se pueden marcar con nuclesidos trifosfatos
que contienen un fluorocromo tal como la fluorescena y detectarse directamente por su propia fluorescencia. Es posible marcar las sondas usando algunos de los sistemas que se
emplean con frecuencia en otra parte en biologa molecular.
stos incluyen la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR),
358
CAP. 37
HIBRIDACIN IN SITU FLUORESCENTE
nick translation y el marcado por medio de iniciadores de

secuencia aleatoria (random primer). De stos, el nick translation es, probablemente, el ms popular puesto que produce
fragmentos de DNA pequeos y marcados. El tamao de la
sonda es importante, ya que las molculas de sondas grandes
tienen dificultad para difundirse a travs del material citolgico para alcanzar su DNA objetivo, y su uso resulta a menudo
en mucha fluorescencia del fondo. El tamao ptimo de la
sonda est entre 200 y 500 bases. Las sondas que se producen
por PCR son cada vez ms importantes en las tcnicas de pintado del cromosoma y de la FISH de fibra que se describen
con detalle ms adelante.
Hibridacin
Aqu los procedimientos siguen ampliamente los de otros
protocolos moleculares de hibridacin de cidos nucleicos.
Las diferencias se relacionan con las tentativas de mantener
la morfologa de la preparacin citolgica en buenas condiciones, y para prevenir la unin de la sonda a las secuencias
repetidas distribuidas por todo el genoma. Para mantener
la integridad de la preparacin citolgica, la hibridacin se
lleva a cabo normalmente a temperaturas reducidas tpicas
de 35 a 42C, en formamida a 50%. La mayor parte de los
genomas eucariotas contienen abundantes secuencias de
DNA repetidas y dispersas. Por esta razn, si el material
genmico se utiliza como sonda, es probable que contenga secuencias de DNA que se repiten en otra parte en el
genoma. Esto resulta en un nivel de fluorescencia a travs
de todas las regiones de los cromosomas, lo que reduce la
especificidad de la sonda. Para prevenir esto y mejorar la calidad y la sensibilidad de la imagen final, el DNA sin marcar
de la fraccin repetitiva del genoma (Cot 1 DNA) se agrega
a la sonda durante la hibridacin.
Deteccin de la sonda hibridada

Cuando las sondas se marcan directamente con los nucletidos fluorescentes, la deteccin requiere slo una sencilla
observacin del material usando un microscopio de fluorescencia con los filtros apropiados. Puesto que la seal no
se amplifica, este mtodo detecta una fluorescencia menos
intensa, pero el nivel fluorescente del fondo es bajo. El uso
de cmaras con dispositivo acoplado de cargas (CCD) para
detectar fluorescencia de nivel bajo puede hacer este mtodo
bastante sensible para emplearse con pequeos DNA objetivos. Cuando las sondas se marcan con haptenos, su presencia
se detecta con los anticuerpos conjugados con fluorocromos.
Las sondas marcadas de biotina y digoxigenina pueden
detectarse de esta manera, pero la biotina tiene la ventaja
agregada de tener una afinidad en extremo alta por la prote-
na de la clara de huevo, la avidina. Esto permite el uso de la

avidina conjugada con los fluorocromos para utilizarse en
la deteccin. El nico defecto de esta tcnica se localiza en el
tejido a analizar que contiene mucha biotina para dar origen a
la fluorescencia del fondo. En el caso de la citogentica esto
no es un problema importante. Con frecuencia la seal fluorescente de un objetivo se amplifica usando ms de una capa
del anticuerpo en el proceso de deteccin.
Una de las ventajas principales de la tecnologa de FISH
est en que diferentes fluorocromos pueden utilizarse simultneamente junto con una serie de sondas marcadas
con diferentes haptenos. El resultado es una imagen de
FISH en dos colores. Por ejemplo, dos sondas pueden hibridarse para la misma preparacin del cromosoma. Si una
est marcada con biotina y se detecta con los anticuerpos
conjugados con fluorescena, y la otra se marca con la
digoxigenina y se detecta usando el rojo Texas, despus
ambos loci se detectan de manera simultnea como reas
de fluorescencia verde o roja. Este acercamiento puede
extenderse tambin cuando se usan sondas directamente marcadas en el mismo experimento, o cuando las sondas
marcadas con una mezcla de dos haptenos se utilizan. Si tales sondas se detectan con los anticuerpos conjugados de dos
diferentes fluorocromos, el resultado es una seal de color
intermedio; la fluorescencia roja por el rojo Texas y la fluorescencia verde de la fluorescena emiten una seal anaranjada. Una serie de sondas se pueden marcar con diferentes
cocientes de los mismos dos haptenos. La fluorescencia
resultante se convierte en una seal digital en una cmara CCD y el software reconoce las diferencias sutiles en
la fluorescencia. stas entonces sern colores falsos asignados. Este acercamiento condujo al desarrollo del cariotipo espectral, que se describe ms adelante.
Despus de la deteccin de las sondas, es necesario
seguir localizando las reas restantes de los cromosomas
o de los ncleos a los cuales la sonda no ha hibridado. Esto
se hace usando los fluorocromos 4,6-diamino-2-fenil-indol
(DAPI), Hoechst 33258 o yoduro de propidio. La combinacin del yoduro de propidio y del DAPI produce un patrn
de bandas que puede ser til en la identificacin del cromosoma. Sin embargo, debido a que el yoduro de propidio es
excitado por ms de una longitud de onda y fluorescencias
de varias longitudes de onda diferentes, puede producir
problemas donde las imgenes se capturan usando cmaras
CCD monocromticas.
Aplicaciones en la investigacin bsica

Aunque esta tecnologa puede utilizarse potencialmente
con todas las especies de eucariotas, este captulo se concentra en los usos en la gentica humana. La FISH puede
utilizarse para detectar genes u otras secuencias de DNA
APLICACIONES EN LA INVESTIGACIN BSICA
de regiones cromosmicas especficas. La precisin requerida por el experimento determina el acercamiento que se
utiliza. En el nivel ms simple, el proceso es posible emplearlo para identificar cromosomas enteros, una tcnica
conocida como pintado cromosmico. En este caso es
necesario aislar el DNA de un solo cromosoma humano
para hacer una sonda. Esto se realiza por dos mtodos. Por
principio, los hbridos celulares somticos humanos ms
roedor se utilizaron como una fuente de DNA. En estos
hbridos celulares es posible aislar clones que contienen un
solo cromosoma humano. El DNA se asla de tales clones
y el DNA humano se amplifica usando iniciadores complementarios a las secuencias alu. stas representan una
secuencia muy repetida que se encuentra en el ser humano
pero est ausente en el DNA del roedor.
Ahora es posible aislar cromosomas humanos especficos en metafase directamente, usando la seleccin celular
activada por fluorescencia (FACS). El DNA del sedimento de los cromosomas purificados es amplificado por PCR
usando los iniciadores degenerados; es ahora el mtodo de
opcin para los proveedores comerciales del pintado cromosmico. El pintado cromosmico es en particular til
para el estudio de las translocaciones; se ilustra en la figura
37-1. Aqu pintado de cromosoma se utiliza para identificar
los cromosomas implicados en una translocacin que se ha
presentado en un tumor humano. Los fragmentos translocados pequeos de cromosomas son, con frecuencia, slo
perceptibles con este acercamiento.
El refinamiento del principio del pintado de cromosomas condujo a protocolos en los cuales cada par de cromo-
359
somas en una clula puede identificarse de manera simultnea. Esto se conoce como cariotipo espectral. En esta
tcnica, los tintes para cada par de cromosomas se hibridan
a los cromosomas en la misma reaccin. Cada tinte del cromosoma es una mezcla de varios fluorocromos diferentes,
combinados en diversos cocientes. Esto significa que la
fluorescencia emitida por cada cromosoma tiene un espectro especfico, el cual lo detecta el sensor, y el software
atribuye un color falso diferente a cada espectro. El resultado es una imagen por computadora en la cual todos los
cromosomas pueden detectarse con un color especfico.
Un uso ms sofisticado de la FISH se requiere para mapear la ubicacin cromosmica de una secuencia especfica
de un gen. Para esta tarea, el DNA clonado en YAC, BAC
o csmidos se utiliza normalmente como sonda. Esto emite
suficiente fluorescencia fcilmente perceptible. Los ejemplos se muestran en la figura 37-1. Los procedimientos implicados son similares a los que se emplean para el teido
de cromosoma, pero suele requerirse una amplificacin
ms grande de la seal. La FISH es mucho ms fructfera
para esta tarea que las sondas marcadas con radiactividad
previamente utilizadas, debido al fondo reducido y al corto
tiempo que se requiere para completar el experimento (dos
das, comparado con las varias semanas necesarias para la
exposicin de autorradiografas). Segn lo descrito antes,
ms de una sonda puede utilizarse simultneamente. Este
acercamiento se emplea de diferentes maneras. Cuando se
intenta localizar una sonda en un cromosoma, es a menudo
necesario identificar el cromosoma con mucha claridad, al
mismo tiempo. Esto se logra usando una sonda para una
Figura 37-1 a) Parte de una metafase de una clula tumoral humana teida con DAPI. Un cromosoma morfolgicamente atpico es indicado por la flecha blanca.
b) El mismo cromosoma de una metafase hibridado
con tincin del cromosoma 2. Sin duda, la regin distal del cromosoma (flecha) est compuesta del material
derivado del cromosoma 2. La tincin cromosmica
marrn es yoduro de propidio y el tinte est marcado
con FITC. Una copia normal del cromosoma 2 est tambin presente en la estructura. Un acercamiento similar
mostr que el resto del cromosoma est compuesto del
cromosoma 17. c, d) Cmo la FISH puede utilizarse
para mapear el punto de la translocacin. Un BAC que
mapea la regin distal del cromosoma 17, 17q25.3
como se muestra en (c), fue hibridado al cromosoma
de translocacin en la clula tumoral. El hecho es que
se ha visto en (d) mapas la translocacin al telmero
extremo distal del cromosoma 17. c) y d) Son imgenes
digitales que se obtienen usando una cmara CCD.
360
CAP. 37
secuencia de repeticin de DNA centromrico especfico

del cromosoma en cuestin. Para determinar el orden de
los genes estrechamente ligados a lo largo del cromosoma,
la FISH de doble o triple color puede utilizarse. Debido
a los colores que se emplean, este proceso se conoce con
frecuencia como iluminacin de semforo. La posicin
de la sonda en un cromosoma puede algunas veces identificarse por el patrn de bandas, pero a menudo se expresa
simplemente como unidades F/pter. stas representan la
distancia mnima del telmero del brazo p del cromosoma,
en comparacin con la extensin del cromosoma entero.
Una limitacin importante para mapear los genes por
medio de la FISH la produce el estado relativamente condensado de los cromosomas mitticos en metafase. Esto
significa que las seales de los genes falsean en cerca de 1
a 2 Mb, una seal de otra, y ocurre un traslape que impide
distinguir las dos seales. Para superar este problema se
usan diferentes estrategias. La cromatina est mucho menos condensada durante la interfase, y las secuencias que no
es posible separar en los cromosomas en metafase se resuelven con frecuencia por hibridacin de las sondas en
los ncleos de las clulas que no se estn dividiendo. Una
desventaja en este sistema es que no es posible orientar
los genes en relacin con el centrmero. Un proceso alternativo que permite esto es el uso de las preparaciones
meiticas del cromosoma. stas son ms alargadas que las
mitticas. Sin embargo, tiene inconvenientes al prepararse. Un acercamiento exitoso para producir los cromosomas
mitticos alargados consiste en utilizar las preparaciones
de citocentrifugacin de metafases sin fijar. Una citocentrfuga es un dispositivo que se emplea frecuentemente en
hematologa para preparar portaobjetos con clulas sanguneas. Este dispositivo usa una centrifugadora modificada en la cual las clulas se hacen girar de manera directa
sobre el portaobjetos. Cuando las metafases sin fijar que se
hinchan en solucin salina hipotnica se tratan de esta manera, las fuerzas de corte producidas durante la centrifugacin estiran los cromosomas hasta veinte veces su longitud
normal. Aunque esto causa que muchas de las metafases se
interrumpan y que los cromosomas se deformen, tiene una
ventaja sobre el anlisis de la interfase, en que los cromosomas individuales pueden ser identificados, y la orientacin de las seales de la FISH hacia los centrmeros y los
telmeros es posible observarlos.
El ltimo grado de resolucin que se obtiene con el anlisis de FISH se encuentra en la tcnica de FISH de fibra.
Aqu la sonda se hibrida al DNA, que es extendido en un
portaobjetos despus de la eliminacin de la mayor parte
o de la totalidad de su cromatina empaquetada. Ninguna
informacin en lo absoluto se obtiene sobre la orientacin
de la seal en el cromosoma, pero la tcnica es muy poderosa para el anlisis a escala fina de las regiones pequeas
del genoma. La dispersin y elongacin del DNA se puede

conseguir de muchas maneras. Las fibras extendidas de cromatina se pueden obtener de los ncleos de las clulas en
interfase sin fijar tratadas sobre portaobjetos con detergente
y sal concentrada para quitar las histonas. Esto causa que
la estructura de la cromatina se desenrolle y se extienda el
DNA en una longitud comparable con la del DNA puro.
Tales tcnicas se conocen como produccin del halo o
DIRVISH (hibridizacin visual directa). stas permiten el
ordenamiento de la sonda a un lmite de resolucin ms bajo,
de 3 a 5 kb. El DNA purificado tambin puede extenderse sobre el portaobjetos del microscopio para usarse en el anlisis
de estructura fina. El DNA se entrampa en bloques de agarosa, como los que se usan en la electroforesis en gel de campo pulsado, que se funden y se extienden suavemente en el
portaobjetos, o el DNA en solucin puede permitir que se
extienda en portaobjetos silanizados. En este caso, el extremo de la molcula se une al vidrio y el resto del DNA se
rastrea fuera, en un patrn que es ms o menos lineal en el
menisco de la solucin que se evapora.
Ambos protocolos facilitan el estudio a escala fina. Los
ejemplos tpicos incluyen la ordenacin de las sondas producidas por PCR a lo largo del DNA clonado en los YAC
o los csmidos. Esto puede ser muy til en circunstancias
donde un contiguo (un grupo de fragmentos de DNA clonados ordenados que se traslapan) est incompleto y el tamao de los espacios necesita estimarse.
Aplicaciones en la gentica mdica

Como se seala antes, el pintado del cromosoma es particularmente til para detectar las translocaciones demasiado pequeas para resolverse con claridad por el bandeo G
convencional. Otros usos de la FISH incluyen la deteccin
de aneuploides, particularmente en la amniocentesis. Aqu
el anlisis de los ncleos en interfase puede emprenderse de
nuevo. En lugar de usar el teido de cromosoma completo
para detectar los nmeros de los homlogos, se utilizan las
sondas especficas para las secuencias de DNA repetidas encontradas en los centrmeros de diferentes cromosomas. Esto
puede detectar la presencia de copias adicionales de los cromosomas implicados en los sndromes aneuploides comunes,
como los sndromes de Down, Edward y Pateau. El sexo de
un embrin puede determinarse tambin en las clulas amniticas usando las sondas de dos colores para los cromosomas
X y Y. En estos procedimientos la FISH permite que un resultado se obtenga en un tiempo mucho ms corto que el anlisis convencional del cromosoma, donde las clulas deben
cultivarse, y tiene la ventaja agregada que, como slo las clulas en interfase son necesarias, el nmero de las clulas
registradas puede ser muy alto. No obstante, es ms costoso
APLICACIONES EN EL DIAGNSTICO E INVESTIGACIN DEL CNCER
y no aporta tanta informacin sobre la naturaleza de alguna

anormalidad citogentica como el bandeo G; por ejemplo,
no distingue entre la presencia de un cromosoma adicional
intacto y un fragmento del que contiene el centrmero.
Aplicaciones en el diagnstico
e investigacin del cncer
La FISH realiza su mayor contribucin a la medicina en
el estudio y el diagnstico exacto de los diferentes tipos
de cncer y la leucemia. En la mayor parte de los casos, el
tejido maligno muestra al menos algunas aberraciones citogenticas. La citogentica convencional puede aplicarse
slo con dificultad en estas situaciones, pero la FISH, particularmente sobre los ncleos en interfase, puede producir
resultados exactos y en un periodo corto, dos criterios que
son de importancia evidente en el cuidado del paciente.
Aunque las translocaciones aleatorias son comunes en
las clulas tumorales, muchos tipos de cncer, en particular
leucemias y linfomas, portan translocaciones especficas
que pueden utilizarse para hacer un diagnstico exacto.
stas son a menudo de la fusin de copias de dos genes
diferentes, creando un gen original. Un ejemplo clsico
es el cromosoma Filadelfia, que se detecta en la leucemia
mieloide crnica. Aqu, las translocaciones especficas altas entre los cromosomas 9 y 22 ocasionan la fusin de
los oncogenes abl y BCR para producir una tirosina cinasa
original. Aqu el bandeo G convencional es problemtico.
Esto ocurre porque las clulas malignas pueden no aportar
nmeros significativos de metafases in vitro y la calidad de
las extensiones del cromosoma es frecuente que est muy
por debajo de la obtenida de los linfocitos normales. El
teido de cromosoma puede aplicarse incluso donde la calidad de las preparaciones del cromosoma es deficiente, ya
que los cromosomas blanco se identifican por la fluorescencia, aun cuando ellos no puedan detectarse claramente por
el bandeo G. La ventaja principal de la tecnologa de FISH,
en este caso, es otra vez la capacidad para obtener informacin citogentica de las clulas que no se estn dividiendo.
El uso de las sondas fluorescentes, con frecuencia csmidos, para las regiones en cada lado de la translocacin especfica del tumor permite un diagnstico exacto. Las dos
sondas se marcan con haptenos diferentes, de modo que
se detecten con dos colores distintos: rojo y verde. En las
clulas normales, donde no est presente la translocacin,
dos sitios rojos y dos verdes fluorescentes aparecen en el
ncleo. Los puntos se distribuyen aleatoriamente a travs
del ncleo. En presencia de una translocacin, un punto
rojo y uno verde se localizan muy cerca uno del otro en
cada clula tumoral. El traslape ocurre con frecuencia y
una regin amarilla de la seal mezclada se observa. Este
361
acercamiento permite una deteccin neta de la translocacin

en una gran cantidad de clulas, y es posible distinguir las
clulas normales y las leucmicas en la muestra. Adems del
trabajo de diagnstico, este sistema se emplea tambin para
buscar clulas leucmicas residuales en los pacientes despus
de la terapia. Los aneuploides especficos pueden detectarse en el tejido leucmico con los mismos mtodos descritos
antes para las clulas amniticas.
El anlisis citogentico de los tumores slidos siempre
se ha quedado atrs de los cnceres de la sangre. Esto es en
parte una consecuencia de la mayor dificultad para obtener
preparaciones aprovechables del cromosoma. A pesar de
esto, muchos tumores slidos se han encontrado que portan aberraciones cromosmicas especficas. stas pueden
buscarse por FISH en la interfase, o bien en preparaciones de contacto, donde el material extirpado del tumor es
contactado sobre los portaobjetos para dejar un frotis de
clulas, o bien por el uso de frotis citolgicos de una pequea cantidad de clulas que se obtienen en aspirados con
aguja fina.
Adems de las translocaciones y de los cambios en el
nmero de cromosomas, los tumores contienen con frecuencia copias mltiples de oncogenes o de genes que confieren resistencia a frmacos quimioteraputicos. stos se
presentan, o bien como regiones alargadas de los cromosomas donde el gen es amplificado in situ, conocidas como
regiones homogneas teidas (HSR), o bien como elementos extracromosmicos pequeos, llamados diminutos
dobles (DM). La amplificacin del oncogn es un factor
importante en el pronstico. La FISH tiene en cuenta la
deteccin de la amplificacin en los ncleos de interfase de
las muestras del tumor. Un ejemplo de esto es el tamizaje
de las biopsias de cncer de mama para la amplificacin del
oncogn erbB-2 en el cromosoma 17. Las clulas normales en la biopsia aportan un control, mostrando dos puntos
fluorescentes pequeos que corresponden a las dos copias
sin amplificar del presente gen, mientras el rea de fluorescencia es mucho mayor donde se amplifica. Los ejemplos
de esto se muestran en la figura 37-2.
Una aplicacin algo diferente de la FISH, en la investigacin y el tratamiento de cncer, es el desarrollo de una
tcnica que aporta una estimacin total de ganancias y de
prdidas especficas de cromosomas, o regiones del cromosoma de un tumor particular; se conoce como hibridacin
comparativa del genoma. Aqu el DNA se extrae del tumor
despus de la remocin del paciente. Este DNA se marca
con un fluorocromo (verde); se mezcla con el DNA extrado de las clulas normales, las cuales se marcan con rojo, y
con la mezcla hibridizada sobre los cromosomas normales
en metafase. Las sondas diferentemente marcadas compiten para situar los cromosomas. Si el tumor no muestra ganancia o prdida de material cromosmico, la hibridacin
362
CAP. 37
Figura 37-2 a) Clulas en interfase de un aspirado de aguja fina de un tumor de pecho que se ha hibridado con una sonda para el oncogn erbB-2. En este caso las clulas muestran amplificacin del oncogn, mientras en (b) el aspirado contiene clulas en las cuales el
oncogn no se ha amplificado, y cada clula muestra uno o dos puntos, que corresponden a los genes normales. En las preparaciones
de frotis hechas de los aspirados por aguja fina las clulas no se dispersan, lo que se explica porque la seal erbB-2 no est en el mismo
plano focal en cada clula. En estos ejemplos la sonda fue directamente marcada con FITC y los ncleos contrateidos con DAPI. Cortesa del Dr. Damien McManus, Royal Victoria Hospital, Belfast.
in situ resultante contiene 46 cromosomas, la totalidad de los

cuales con una fluorescencia amarilla uniforme. Sin embargo, las regiones del tumor que experimentan amplificacin
estn sobrerrepresentadas en el DNA extrado y superan al
DNA que emite fluorescencia roja. Tales regiones, por tanto, aparecen verdes. Inversamente, las regiones perdidas del
tumor, que es probable que contengan genes supresores,
aparecen en rojo fluorescente. El anlisis de esta hibridacin
competitiva a dos colores requiere software del computador
sofisticado, pero puede convertirse en una herramienta importante que aporte un anlisis molecular de amplio espectro
de los tumores individuales.
La FISH parece tener un papel establecido en la biologa
molecular. Cmo se desarrolle en el futuro la tcnica depende de la comprensin creciente de los procesos genticos
en esta enfermedad. En algunas de las aplicaciones en las
cuales se sita puede reemplazarse por tcnicas no citogenticas, tales como la PCR. reas donde esto puede suceder
incluye la deteccin de las translocaciones especficas del
cncer, o la determinacin del sexo en las clulas amniticas. Sin embargo, una de las ventajas ms importantes de la
FISH es que no destruye las clulas en las cuales se lleva a
cabo. En muchas reas esta capacidad para obtenerse infor-
macin gentica molecular mientras an puede identificarse

la estructura celular y tisular es esencial, por ejemplo, en la
patologa molecular del cncer. Adems, el acoplamiento de
tcnicas moleculares y citolgicas agrega un control valioso
contra los resultados errneos que se presenten de la contaminacin de las muestras. Por estas razones, la tcnica es
probable que mantenga su importancia en la investigacin y
las biociencias aplicadas por un tiempo considerable.
Haaf T, Ward D C. Structural analysis of a-satellite DNA and centromere proteins using extended chromatin and chromosomes.
Hum Mol Genet 1994; 3: 697-709.
Heiskanen M, Hellsten E, Kallioniemi O-P et al. Visual maping
by fibre-FISH. Genomics 1995; 30: 31-36.
Kallioniemi A, Kaltioniemi O-P, Sudar D et al. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid turnouts. Science 1992; 258: 818-821.
Pardue M L, Gall J G. Chromosomal localization of mouse satellite DNA. Science 1970; 168: 1356-1358.
Schrock E, duManoir S, Veldman T et al. Multicolor spectral
karyotyping of human chromosomes. Science 1996; 273: 494497.
SECCIN 7
QUMICA CLNICA
38
Adquisicin, aplicaciones e interpretacin
de los datos bioqumicos clnicos
William J Marshall
Introduccin
Las investigaciones en bioqumica clnica se utilizan ampliamente en la medicina con gran variedad de propsitos
(cuadro 38-1). La mayor parte de las investigaciones ms
familiares implica la medicin de un componente de algn
fluido corporal, suero (o plasma) u orina. Los ensayos pueden tambin hacerse en otros fluidos, por ejemplo, el espinal, el obtenido por paracentesis, secreciones intestinales y
heces, y sobre muestras de biopsia de tejidos corporales.
Los resultados de la mayor parte de las investigaciones
bioqumicas clnicas se expresan cuantitativamente como
una concentracin o con frecuencia, en el caso de mediciones enzimticas, como una actividad. El anlisis gentico
molecular, aunque aumenta en el repertorio de los laboratorios bioqumicos clnicos, no se discute en este captulo.
El hecho de que los resultados se expresen en forma numrica permite el lujo de una simplicidad evidente: parecen fciles de evaluar y comparar con rangos de referencia
(normales) o con resultados que se obtienen previamente
en el mismo paciente. Mientras, por ejemplo, un signo sutil
sobre una radiografa puede estar abierto a una variedad
de interpretaciones (o puede ser ignorado por un observador inexperto), una concentracin de sodio srico de 143
mmol/L parece inequvocamente normal (el rango de
referencia es 135 a 145 mmol/L) y es sin duda su valor
diferente a 147 mmol/L, que es por definicin anormal.
Pero, en realidad lo es? Examinemos estas afirmaciones
con cierto detalle. Una concentracin de sodio srico puede
estar dentro del rango normal, pero eso no excluye la posibilidad de que una anormalidad sutil de la homeostasis del
sodio o del agua est presente, tampoco significa que el individuo sea sano. Inversamente, encontrar que un individuo
tiene una concentracin de sodio srico de 147 mmol/L no
significa que un desorden homeosttico del sodio o del agua
est presente; de hecho, el individuo puede estar perfectamente sano. Estas afirmaciones provienen de que, como se
discute ms adelante en este captulo, se esperara que 5%
de los individuos normales tuviera valores fuera del rango de referencia, aunque es evidente que en cuanto un valor
medido est ms alejado de los lmites del rango de referencia, es ms probable que tenga una importancia patolgica.
La comparacin de un resultado con un rango de referencia puede tener valor cuando la medicin se hace en un
individuo por primera vez. En la prctica, las mediciones
se realizan con frecuencia, por ejemplo, para determinar el
progreso de una condicin o de una respuesta al tratamiento. Un valor medido establecido puede entonces compararse con uno anterior para considerar si ha ocurrido un cambio significativo. Pero si, por ejemplo, una concentracin
de sodio srico de 145 mmol/L en un da es significativamente diferente (es decir representa un cambio fisiolgico
o patolgico verdico) a partir de una de 147 mmol/L del
da anterior se requiere un conocimiento de la confiabilidad de los datos, no slo en trminos de calidad analtica,
sino tambin de cualquier variacin biolgica que afecte
la concentracin del sodio in vivo. Por ltimo, cualquier
conclusin que se arrastre no es confiable si la muestra que
The Science of Laboratory Diagnosis, second edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
366
Cuadro 38-1
Usos
CAP. 38
ADQUISICIN, APLICACIONES E INTERPRETACIN DE LOS DATOS BIOQUMICOS CLNICOS
Usos de las pruebas bioqumicas en la medicina

Ejemplo
Concentracin de la glucosa
sangunea (diabetes)
Valoracin de la
Concentracin de la creatinina
gravedad
srica (insuficiencia renal)
Pronstico
Tiempo de protrombina, gravedad
de la acidosis, etc. (insuficiencia
heptica aguda)
Monitoreo de la
Hemoglobina glucosilada
enfermedad/tratamiento
(diabetes)
Seguimiento a largo
Algunos marcadores tumorales
plazo
(cncer)
Tamizaje
TSH sanguneo neonatal
(hipotiroidismo congnito)
Deteccin de la
Pruebas de la funcin tiroidea
toxicidad del frmaco
(para pacientes tratados con litio)
Estratificacin para
Concentracin del colesterol en
los ensayos clnicos
plasma (para ensayos de frmacos que disminuyen el colesterol)
analticos y posanalticos, es decir, se presentan en este orden antes de que la muestra se analice, durante el anlisis,
y una vez que se han generado los resultados.
Diagnstico
se analiza no se recolecta y maneja antes del anlisis de una

manera que no afecte la concentracin de sodio.
A fin de que los lectores dejen de preocuparse porque
ninguna conclusin categrica pueden sacarse de los datos
bioqumicos clnicos (o, peor, pensar que estas cuestiones
son triviales y sin ninguna consecuencia), debe enfatizarse que el personal de laboratorio emprende esfuerzos
considerables para asegurarse de que los datos que aporta
sean confiables (una medicin verdadera de la variable en
cuestin) y precisos (reproducibles). Tambin es importante que el analito (componente de inters analtico) pueda
medirse sobre un rango de concentracin clnica til, y que
los resultados estn disponibles lo suficientemente rpido
para informar a la gerencia clnica. Alcanzar esto requiere
de metodologa e instrumentacin apropiadas, y el apego a
procedimientos diseados para maximizar la calidad.
Sin embargo, sigue siendo importante que los usuarios
de datos del laboratorio bioqumico clnico estn conscientes de las fuentes de error (no todas se encuentran en el
laboratorio), y de trampas en la interpretacin de los resultados, si se esfuerzan para obtener el mximo de informacin clnicamente til. La mayor parte del resto de este
captulo est dividida en dos secciones: la primera se ocupa
de la recoleccin y anlisis de la muestra; la segunda, de las
aplicaciones e interpretacin de los datos bioqumicos.
Recoleccin y anlisis de la muestra

Los factores que pueden perjudicar la calidad de los resultados se dividen de manera convencional en preanalticos,
Factores preanalticos
Las variables bioqumicas son afectadas por muchas de las
fisiolgicas (cuadro 38-2). Adems, todas las variables bioqumicas estn sujetas a una variacin biolgica aleatoria.
Cuadro 38-2 Ejemplos de factores fisiolgicos que afectan los
resultados de pruebas bioqumicas
Factor
Prueba (todas en suero o en plasma)
Edad
Sexo
Colesterol, urato, fosfatasa alcalina

Esteroides gonadales, gonadotropinas,
colesterol HDL
Triglicridos
Cortisol (variacin diurna)
Gonadotropinas (variacin del
catamenial en mujeres)
25-Hidroxicolecalciferol (variacin
estacional)
Cortisol, prolactina, hormona del
crecimiento, catecolaminas, glucosa
Renina, aldosterona, protenas del
plasma
Glucosa, triglicridos, fosfato
Masa corporal
Tiempo
Estrs
Postura
Ingesta de alimentos
Para algunos, particularmente aquellos que estn sujetos al

control rgido de la retroalimentacin, la concentracin de
calcio plasmtico puede ser pequea, pero para otros es un
factor significativo que debe considerarse cuando se interpretan los resultados.
El efecto de los frmacos sobre las variables bioqumicas in vivo es un problema potencial enorme, aunque en la
prctica el nmero de ejemplos importantes es relativamente pequeo. La hipocalcemia, que ocurre con frecuencia en
pacientes tratados con diurticos, es uno de ellos. Las mediciones bioqumicas tambin se realizan con frecuencia para
evaluar el efecto de los frmacos, por ejemplo, medicin
de la glucosa y de la hemoglobina glucosilada en pacientes
con diabetes tratados con agentes hipoglucemiantes. Los
frmacos tambin pueden convertirse en una fuente potencial del error analtico; por ejemplo, la reaccin cruzada de
prednisolona con el cortisol en muchos inmunoensayos.
Los errores preanalticos, al final, suelen ocurrir por una
recoleccin incorrecta de la muestra, por ejemplo, al medir
la glucosa en una muestra sangunea que no es recolectada
en un envase con fluoruro para inhibir la gluclisis; o por el
INTERPRETACIN DE LOS DATOS DE LABORATORIO
manejo, por ejemplo, causando hemlisis o la evaporacin

del agua. Todos los laboratorios publican manuales que deben incluir la informacin sobre el tipo de muestra que
colecta y cualquier condicin especial que deba observar.
Los errores pueden presentarse, excepcionalmente, por
una identificacin errnea de las muestras. La vigilancia
extrema es necesaria para prevenir el error en la identificacin. Las formas de solicitud deben llenarse con los datos
correctos adecuados y cotejarse directo con el paciente, y
que las muestras se identifiquen positivamente en todas las
etapas de la manipulacin, por ejemplo, si el suero tiene
que transferirse del envase inicial (primario) a uno secundario para el anlisis. En muchos hospitales y clnicas, la
sangre y otras muestras las recolectan las enfermeras o los
flebotomistas entrenados. Muchos laboratorios encuentran
que es ms probable que ocurran los errores si las muestras las recolectan los mdicos. En medicina de laboratorio,
como en la clnica, es buena prctica tener mucho cuidado con procedimientos en apariencia simples, es decir,
igual al que se tiene con los complicados.
367
aporten un diagnstico completo. Ms bien con frecuencia

reflejan procesos patolgicos que enfermedades especficas, y pueden incluso no ser determinantes para un proceso, aunque en una situacin clnica particular o tomando
en cuenta otras investigaciones, es probable que una puede
ser mejor que la otra. Por ejemplo, una concentracin baja
de albmina srica tiene muchas causas potenciales, que
incluyen disminucin de la sntesis, incremento en el volumen de distribucin o aumento en la prdida o catabolismo
y cada uno de stos por s mismo tiene varias causas potenciales. En un paciente conocido por tener enfermedad
heptica crnica, la disminucin en la sntesis es probable
que sea la causa ms importante.
Los resultados bioqumicos pueden evaluarse en relacin con varios criterios, de acuerdo con las razones de
realizar la prueba: el rango de referencia comparable para
personas sanas; el rango de valores esperados en condiciones particulares; valores de corte o lmites de accin, o resultados obtenidos previamente en el mismo individuo.
Rangos normales e intervalos de referencia
Factores analticos
Una discusin detallada de los procedimientos de laboratorio est ms all del alcance de este captulo. Es una
condicin de acreditacin por CPA (UK) Ltd (Acreditacin
del Laboratorio Clnico) que los laboratorios usen procedimientos aceptables para el control de calidad interno y
el aseguramiento de calidad externa. Los problemas que
pueden afectar la calidad de los resultados se discuten en
los captulos sobre tcnicas analticas individuales.
Factores posanalticos
Una vez que se han generado y validado los resultados,
los errores todava pueden presentarse antes de que lleguen las anotaciones de los pacientes. Con el uso creciente
de la transmisin electrnica de los resultados desde el laboratorio a la sala o clnica, el riesgo de tales errores disminuye considerablemente, pero nunca puede eliminarse del
todo. Tambin, es un riesgo particular si los resultados se
comunican por telfono al mdico, debido a una urgencia.
Es irnico que justo durante el manejo de los resultados
es cuando un error podra tener consecuencias especficas
perjudiciales.
Interpretacin de los datos de laboratorio

Aunque los datos bioqumicos se utilizan de manera extensa en el diagnstico y control de pacientes, es raro que
El trmino normal tiene varios significados. Una distribucin normal (gaussiana) describe una distribucin simtrica de datos alrededor de una media que puede detallarse
con una funcin matemtica especfica. Estadsticamente
el rango normal es el rango de los valores para tales datos
a partir de la media menos dos desviaciones estndar para
la media ms dos desviaciones estndar, y abarca cerca de
95% de los valores. Para mucha gente, sin embargo, normal significa conforme al tipo o, implcitamente, sano,
puesto que rangos normales para variables biolgicas humanas estn con frecuencia basados sobre mediciones hechas
en una muestra de individuos de una poblacin normal
(en el sentido de saludable).
Hay muchas trampas en el uso de rangos normales.
Dentro de las disciplinas de la medicina de laboratorio, se
discute en forma extensa que el trmino no debe usarse.
En vez de poblacin normal se prefiere el trmino poblacin de referencia, puesto que ste no implica ninguna
caracterstica especfica (p. ej., salud) en la poblacin. (De
hecho, no existe razn por la que no deba procurarse definir los rangos caractersticos de los resultados de la prueba
de una poblacin de referencia integrada de pacientes con
enfermedades particulares.) Los valores superiores e inferiores de la distribucin se llaman lmites de referencia
y el rango entre ellos, intervalo de referencia. Pero aunque sea loable este esfuerzo para dirigir un anlisis ms
objetivo de los datos, los trminos no se usan de forma
amplia fuera de los laboratorios y, en la prctica, muchos
los continan refiriendo como rangos normales. Adems, los intervalos de referencia se basan con frecuencia
CAP. 38
en los mismos datos que se utilizan para calcular rangos

normales y son idnticos a ellos.
Por definicin, puesto que el rango normal abarca slo
95% de los valores de la poblacin que se estudia, 5% de
los valores caen fuera de este rango, 2.5% arriba y 2.5%
abajo. Asimismo, algunos valores de la gente sana caen
inevitablemente fuera del rango normal para la poblacin,
aunque el sentido comn nos dice que cuanto ms lejos
est un resultado de los lmites del rango, es ms probable
que sea anormal en el sentido patolgico significativo.
Cuanto ms variables se midan, es ms probable que por lo
menos una caiga fuera del rango normal importante. Si 20
analitos independientes fueran medidos, la probabilidad de
que uno sea anormal es 0.64, es decir, mejor que constante.
Puesto que los analizadores automatizados miden en forma
rutinaria este nmero de analitos, resultados falsos, anormales, son una ocurrencia inevitable.
Otro problema en la interpretacin proviene de que el
rango de variacin de un resultado de la prueba en un individuo es probable que sea menor al rango observado en la
poblacin, ya que la poblacin, aun cuando es comparable
en trminos, por ejemplo, de edad, sexo y origen tnico, se
compone de individuos genticamente distintos. El rango
normal para la concentracin de creatinina plasmtica en varones adultos es aproximado a 60 a 120 mol/L, pero el rango de valores que se observa con mediciones repetidas en un
solo individuo es mucho menor que se. Un individuo puede
aportar un resultado dentro del rango normal cuando se define para la poblacin que es realmente anormal para l.
En seguida se presentan algunos ejemplos especficos,
donde los rangos normales no son estndares apropiados
contra los cuales juzgar los resultados de los pacientes.
Concentracin de
creatinina srica (mol/L)
368
Eliminacin de la creatinina (ml/min)
Figura 38-1 Concentracin de la creatinina srica y eliminacin

de la creatinina. Debido a que la eliminacin (una medida de la tasa
glomerular de filtracin, GFR) se relaciona de manera inversa con
la concentracin de la creatinina srica, la eliminacin puede descender a la mitad de su valor normal (casi 120 ml/min) antes de
que la concentracin de la creatinina srica llegue a ser anormal.
El rea sombreada muestra el rango de referencia normal para las
concentraciones de creatinina srica.
normal, pero est bien establecido que el incremento en las

concentraciones del colesterol est ligado a un incremento
en el riesgo de la enfermedad cardiaca coronaria, incluso
dentro de este rango (fig. 38-2). Para el colesterol, por consiguiente, el concepto de un rango normal es engaoso.
Ms bien, definimos las concentraciones ideales (las cuales
hasta cierto punto ellas mismas dependen de la presencia
de otros factores de riesgo para la enfermedad coronaria)
y valores de umbral para los valores de intervencin y del
Ejemplo 1: un resultado dentro del rango normal puede

sugerir falsamente una funcin normal
Nmero de sujetos
La creatinina se mide en suero como ndice de la funcin

renal, especficamente de la tasa de filtracin glomerular
(GFR). La concentracin de creatinina es inversamente
proporcional a la GFR (fig. 38-1) y en la prctica, la GFR
puede caer hacia la media normal (equivalente a la prdida
de un rin funcionando) antes de que la concentracin de
la creatinina srica exceda el lmite superior de la normal.
La concentracin de la creatinina srica es entonces un ndice insensible de la prdida temprana de la funcin renal.
Riesgo de enfermedad
cardiaca coronaria
Colesterol srico (mmol/L)
Ejemplo 2: un resultado dentro del rango normal puede

sugerir falsamente ningn riesgo de enfermedad
Si las concentraciones del colesterol plasmtico se miden
sobre un grupo de gente sana, es posible derivar un rango
Figura 38-2 Distribucin de las concentraciones del colesterol

srico en adultos saludables y el riesgo de enfermedad cardiaca
coronaria. Cerca de un tercio de los valores excede la concentracin ideal recomendada (5.0 mmol/L) y estn relacionados con un
riesgo significativo incrementado de la enfermedad coronaria.
INTERPRETACIN DE LOS DATOS DE LABORATORIO
blanco para el tratamiento. El valor del blanco para la prevencin secundaria de la enfermedad coronaria en el Reino
Unido es en la actualidad una concentracin de colesterol
total de menos de 5.0 mmol/L (LDL menor de 3.0), aunque
hay evidencia de que incluso blancos ms bajos pueden ser
ms apropiados.
Ejemplo 3: cualquier concentracin es anormal
Puesto que los frmacos no son componentes fisiolgicos del
cuerpo, las concentraciones de stos medidas en pacientes no
pueden compararse con rangos normales. En el contexto del
monitoreo teraputico del frmaco, rangos teraputicos y
txicos son ms apropiados (aunque incluso estos trminos
deben interpretarse con cautela), mientras en el contexto del
envenenamiento, niveles de accin se utiliza para ayudar a
determinar el control apropiado.
Diferencias crticas
La discusin precedente se relaciona con la comparacin
de datos medidos con valores esperados basados sobre observaciones en otras personas. Cuando se repite una medicin, es ms pertinente considerarla en relacin con el
valor anterior. La pregunta adecuada es si los dos valores
difieren significativamente.
Esto depende de dos factores: la variabilidad innata del
parmetro que se mide, aun cuando las condiciones de
muestreo sean idnticas (variacin biolgica), y la variacin analtica, es decir, el error concomitante inevitable en
cualquier medicin (no obstante, debe esperarse que sea
muy pequeo). Ambos pueden determinarse a partir de los
resultados de mediciones repetidas del mismo y de una
serie de muestras similares, y con una funcin conocida
como la diferencia crtica (CD) calculada con la ecuacin:
CD = 2.8 (SDA2 + SDB2 ), donde SDA y SDB son las
desviaciones estndares analticas y biolgicas, respectivas. La CD indica la diferencia mnima entre dos valores,
que es improbable que ocurran como resultado de la variacin biolgica y analtica en una probabilidad de 0.95 (p =
0.05). Si cualquier cambio es clnicamente significativo es
otro asunto, pero sin duda que un cambio no puede considerarse que es de importancia clnica potencial si es menor
que la CD.
El concepto de diferencia crtica no es ampliamente entendido fuera de los laboratorios, aunque es fundamental
para el uso de los datos de laboratorio en el monitoreo de
la historia natural de la enfermedad y de la respuesta al
tratamiento. Los valores para algunas CD deben estar disponibles a partir del laboratorio local. Las diferencias crticas son independientes de rangos normales. De hecho, dos
369
resultados pueden ser extremadamente diferentes aunque

ambos estn dentro del rango normal. Si se considera, por
ejemplo, un incremento en la concentracin de la creatinina srica desde 80 a 100 mol/L entonces la CD para
la creatinina en este rango de concentraciones es cerca de
17 mol/L. As, un aumento de 20 mol/L es de importancia clnica potencial (implicando una disminucin en la
funcin renal), aun cuando ambos valores estn dentro del
rango normal. Esta discusin acenta el hecho de que las
mediciones seriales en individuos pueden (y en la prctica
frecuentemente lo son) ser ms informativas que las mediciones nicas.
Lmites de accin, valores del blanco, puntos
de corte y valores predictivos
Para algunas investigaciones de laboratorio, es apropiado
considerar los resultados contra los lmites de accin, es
decir, valores usados para determinar si una accin especfica debe tomarse. Ejemplos obvios incluyen lmites de
accin de concentraciones de venenos para tratamiento directo, como la concentracin de paracetamol srico para
indicar si el tratamiento con N-acetilcistena debe iniciarse
(o continuarse) para prevenir dao heptico. Muchos laboratorios tienen lmites de accin para determinar cmo
responden a un resultado; por lo comn, cuando un valor
anormal debe telefonearse al mdico que lo requiere, o
cuando una investigacin adicional se debe realizar para
obtener ms informacin, por ejemplo, accionar electroforesis de protenas del suero para buscar una paraprotena
cuando la concentracin de globulina total de un paciente
es inesperadamente alta.
Debido a que para la mayor parte de los datos de laboratorio existe un traslape entre el rango de los valores
que normalmente se observan en la gente sana y los que se
producen en la enfermedad (sobre todo en las etapas iniciales de esta ltima, o cuando es relativamente leve), la
seleccin de los puntos de accin es en particular crtica
cuando las pruebas se utilizan para el tamizaje (que detecta
la enfermedad subclnica). Fijando el lmite de accin (con
ms frecuencia llamado valor de corte en este contexto)
demasiado bajo significa que, mientras a todos los pacientes con esta condicin se les diagnostica correctamente
usando la prueba, se mantiene, a expensas de una mala categorizacin de un nmero significativo de personas sanas,
a otros como posibles poseedores de la enfermedad (falsos
positivos). Fijando el valor de corte demasiado alto excluye
a todos los individuos sanos, pero algunos con la enfermedad no sern detectados (los falsos negativos; fig. 38-3).
En el tamizaje para una condicin seria, pero en potencia
tratable, es deseable no tener ningn falso negativo (casos
errados). Un ejemplo clsico es el extenso programa de
370
CAP. 38
Cuadro 38-3 Sensibilidad, especificidad y el valor predictivo

(b)
de las pruebas
Resultado de la prueba
Positivo
Negativo
Estado de la
enfermedad
Positivo
Negativo
Verdadero
positivo (TP)
Falso
positivo (FP)
Falso
negativo (FN)
Verdadero
negativo (TN)
Sensibilidad (positividad en la enfermedad) TP/(TP FN)

Especificidad (negatividad en la salud) TN/(TN FP)
Valor predictivo positivo (PV) TP/(TP FP)
Valor predictivo negativo (PV) TN(TN FN)
Figura 38-3 Efecto del movimiento del punto de corte que determina la positividad/negatividad de un resultado de la prueba.
Se muestran las distribuciones hipotticas para la concentracin
de un analito en pacientes con y sin enfermedad. Debido a que
stos se traslapan, si el corte se selecciona para disminuir la cantidad de resultados falsos positivos (y por tanto aumentar la especificidad) (a), hay cantidades significativas de resultados falsos
negativos (sensibilidad disminuida). Si el corte se fija ms abajo
(b), los falsos negativos se eliminan (maximizando la sensibilidad) pero a expensas de aumentar el nmero de los falsos positivos (disminuyendo as la especificidad). Las distribuciones de los
valores para individuos con enfermedad se muestran por debajo
del eje horizontal, para mayor especificidad
tamizaje neonatal para la fenilcetonuria y el hipotiroidismo

congnito. Debe enfatizarse que las pruebas de tamizaje
no son diagnsticas. Adems, en definitiva, las investigaciones se requieren para establecer el diagnstico, y, en los
falsos positivos, para excluirlo.
El desempeo de las pruebas de tamizaje puede medirse calculando funciones que se conocen (en este contexto) como la sensibilidad (una medida de la capacidad de
la prueba de detectar a la gente que tiene la enfermedad)
y especificidad (una medida de su capacidad de identificar
a la gente que no la tiene) (cuadro 38-3). Tales clculos
requieren la identificacin confiable de verdaderos y falsos
positivos y negativos, que a su vez necesitan un estndar
de oro o prueba de diagnstico definitiva que identifique,
inequvocamente, la presencia o la ausencia de la enfermedad. El examen histolgico del tejido o el anlisis gentico molecular pueden proporcionar el estndar de oro,
pero algunas veces la positividad o negatividad verdaderas
pueden determinarse slo en retrospeccin, observando el
resultado.
Las cantidades de resultados positivos y negativos verdaderos y falsos pueden tambin utilizarse para calcular
el valor predictivo (PV) de un resultado positivo o negativo, es decir, la probabilidad de que una prueba positiva
(o negativa) clasifique correctamente a la persona que se
examina.
Los conceptos de sensibilidad, de especificidad y de valores predictivos pueden tambin utilizarse para describir el
desempeo de las pruebas hechas para propsitos de diagnstico, pero en este caso y en el tamizaje son importantes
para apreciar que slo pueden aplicarse con confianza en pacientes similares a aquellos sobre quienes los datos fueron
derivados. Una prueba, por ejemplo para la artritis reumatoide puede parecer tener sensibilidad y especificidad altas
cuando se aplica a un grupo de pacientes con la enfermedad
establecida. Sin embargo, es probable que la sensibilidad
sea mucho ms baja en un grupo de personas en quienes la
enfermedad tuvo un predominio muy bajo, o en quienes tuvieron la enfermedad en un periodo ms temprano. Esto es
un inconveniente (y fuente frecuente de error) para el uso de
estos conceptos.
Cocientes de probabilidad
Estas funciones expresan la probabilidad de que un hallazgo, por ejemplo un resultado de la prueba, ocurrira en
una persona con cierta condicin, en comparacin de sin
sta. El cociente de probabilidad (LR) para un resultado
positivo es LRpos = sensibilidad/(1especificidad). La probabilidad que un resultado negativo ocurriera en una persona con una condicin particular (LRneg), en comparacin
BIOQUMICA CLNICA BASADA EN EVIDENCIA
en una sin sta, est dada por LRneg = (1sensibilidad)/

especificidad). Los cocientes de probabilidad pueden utilizarse para convertir la probabilidad de la preprueba (en
una prueba de tamizaje, sta ser el predominio de la condicin en la poblacin que es tamizada) en la probabilidad
de posprueba de la condicin que est presente. Tales datos
es posible utilizarlos para el control directo y son de gran
valor en la auditora clnica.
Bioqumica clnica basada en evidencia

Los resultados bioqumicos y otros de prueba de laboratorio deben interpretarse con cuidado. Muchas pruebas en
la actualidad disponibles proporcionan menos informacin confiable que es a menudo apreciada o asumida, no
usualmente debido a problemas analticos sino, ms bien,
a sensibilidad y especificidad escasas. Las nuevas pruebas
de diagnstico se desarrollan e introducen todo el tiempo, y por lo regular las promueven con mucho entusiasmo
los fabricantes de kits de prueba, con el apoyo de mdicos que buscan un desempeo diagnstico mejorado. Su
evaluacin, sin embargo, es a menudo pobre. Lo ideal es
que todas las pruebas de laboratorio deben evaluarse con
un rigor similar al requerido antes de la introduccin de
nuevos tratamientos, de tal manera que puedan utilizarse
de forma racional, sobre la base de evidencia bien fundada
cientficamente.
Conclusin
Las pruebas bioqumicas se han vuelto una parte esencial de
la prctica mdica moderna. Tienen diversas aplicaciones po-
371
tenciales pero, en muchas, la facilidad con que ellas pueden

solicitarse y realizarse contradice su complejidad. Deben realizarse con cuidado e interpretarse a travs de una apreciacin
de los principios fisiolgicos y patolgicos fundamentales,
cualquiera que sea el propsito para el cual deben usarse.
Fraser CG, Fogarty Y. Interpreting laboratory results. Br Med J
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39
Inmunoensayo en bioqumica clnica
Joan Butler y Susan M Chambers
Introduccin
El inmunoensayo utiliza la reaccin antgeno-anticuerpo
como un medio de cuantificacin del antgeno o del anticuerpo. La mayor parte de las aplicaciones en bioqumica clnica
utiliza la tcnica para cuantificar el antgeno, mientras en inmunologa y microbiologa tambin se emplea para cuantificar (o detectar) el anticuerpo circulante. Los anticuerpos se
incrementan frente a una amplia variedad de sustancias. Las
molculas pequeas pueden hacerse inmunognicas por el
acoplamiento qumico a una molcula grande, como albmina o polilisina, y son entonces conocidas como haptenos.
Diseo del ensayo

A pesar de la complejidad aparente de los mtodos que se
publican, hay dos diseos bsicos del ensayo: los mtodos
competitivos o limitados del anticuerpo, que usan el marcado del antgeno con una molcula trazadora o reportera
y teniendo el inmunoensayo de titulacin genrica; y los
mtodos no competitivos o de exceso del anticuerpo, que
emplean anticuerpo marcado y teniendo el ensayo inmunomtrico de titulacin genrica.
En un ensayo competitivo, el antgeno en la muestra (o
el estndar) compite con el marcado por los sitios de unin
en una cantidad limitada de anticuerpo. Es esencial que la
cantidad de anticuerpo sea insuficiente para ligar todo el
antgeno marcado, de modo que la competicin por los sitios de unin ocurra. En equilibrio la cantidad del antgeno
marcado ligado al anticuerpo est inversamente relacionado con la cantidad del antgeno sin marcar en la muestra o
el control estndar. La determinacin del marcador en la
fraccin ligada aporta una medida de la cantidad de antgeno, en la comparacin de una curva de calibracin:
Ag Ag* Ab
estado inicial
AgAb Ag*Ab Ag*

estado final
Para determinar la cantidad de antgeno marcado en la

fraccin ligada (o libre), estas fracciones deben separarse,
excepto en los casos raros donde la seal del marcador es
modificada por la unin del antgeno marcado al anticuerpo.
En un ensayo inmunomtrico o no competitivo, las condiciones son tales que el antgeno puede reaccionar con un
exceso del anticuerpo marcado. El anticuerpo sin reaccionar entonces se separa, y la cantidad del anticuerpo marcado ligado al antgeno se mide:
Ag Ab*
estado inicial
AgAb* Ab*
estado final
Este diseo simple es la base para un nmero de formatos ms complejos. Los antgenos que son molculas grandes pueden reaccionar con otro anticuerpo, denominado el
anticuerpo de captura, dirigido contra un eptopo diferente
y espacialmente distinto sobre la molcula del antgeno, y
usualmente enlazado a una fase slida:
Ab1 Ag Ab*2
estado inicial
Ab1AgAb*2 Ab1 Ab*2

estado final
donde Ab1 anticuerpo de captura, Ab*2 anticuerpo

marcado.
Este diseo del ensayo es el llamado ensayo inmunomtrico sndwich, o ensayo inmunoenzimtico de dos sitios,
y es el ms utilizado en la actualidad para el ensayo de
374
CAP. 39
INMUNOENSAYO EN BIOQUMICA CLNICA
polipptidos. El antgeno debe ser bastante grande para la

unin simultnea de dos anticuerpos. La adicin del anticuerpo a la muestra puede ser simultnea (formato de un
paso) o secuencial (con la eliminacin de la muestra antes
de la adicin del anticuerpo marcado, un formato de dos
pasos). Es posible utilizar ms de un anticuerpo de captura
o marcado, dando un ensayo de varios sitios.
Al requerir dos eptopos distintos pero conectados, el
diseo del ensayo con dos sitios ofrece una especificidad
considerable mayor que un diseo competitivo de un solo
anticuerpo. Aunque los antisueros policlonales pueden utilizarse en ensayos sndwich, este diseo entr en uso general slo cuando los anticuerpos monoclonales llegaron a
estar disponibles.
En los ensayos inmunomtricos para los antgenos pequeos, el anticuerpo marcado sin reaccionar es frecuente que sea eliminado por la adicin del antgeno acoplado
a una fase slida. La unin a una fase slida deteriora la
reactividad y el antgeno acoplado, por tanto, no competir
con el antgeno libre de la muestra. De forma alternativa,
puede utilizarse el anticuerpo especfico para el complejo
del hapteno y el anticuerpo antiantgeno, y no reactivo a
cualesquiera de estos componentes por separado (complejo
antiinmunitario o anticuerpo antimetatipo):
Ag Ab1
AgAb1 Ab1
estado inicial
Ab*2
AgAb1Ab*2
Ab1 Ab*2
estado final
donde Ab1 anti-Ag, Ab2 anti-(AgAb1).

Con este formato se muestra la diferencia fundamental
entre los inmunoensayos competitivos y el de exceso de
anticuerpos; el primero mide la seal a partir del anticuerpo no ligado al antgeno y el ltimo, la seal del anticuerpo
ligado al antgeno u ocupacin del anticuerpo; por lo tanto
es ms sensible, puesto que es ms fcil distinguir un nmero pequeo desde cero que uno grande de un nmero
levemente ms elevado. Por otra parte, los mtodos de exceso de anticuerpos son ms rpidos, se afectan menos por
las variaciones en calidad y cantidad del reactivo y pueden
tener un rango de funcionamiento ms amplio. La figura
39-1 muestra las curvas de calibracin comunes para un inmunoensayo competitivo y uno inmunomtrico con dos sitios.
Condiciones del ensayo y calibradores

La concentracin del anticuerpo o de los anticuerpos que
se elige para optimizar el rango de funcionamiento del
ensayo para su propsito clnico, en general, iguales concentraciones, ms bajas, del anticuerpo y del antgeno. La
parte inclinada de la curva estndar y el rango de precisin
ms alto deben corresponder al rango de la concentracin so-
Figura 39-1 Curvas estndar tpicas para a) un inmunoensayo

competitivo, b) un ensayo inmunomtrico con dos sitios.
bre el que los valores son requeridos clnicamente. Se deduce que el rango de funcionamiento tiene limitaciones, por
ejemplo, en el ensayo de gonadotropina corinica humana,
que se disea para la oncologa, no es til en la determinacin de concentraciones en el embarazo.
Muchos factores, adems de las cantidades de los reactivos deben controlarse dentro de y entre los lotes para mantener la optimizacin de un ensayo. La cintica de la reaccin
y la posicin de equilibrio dependen de la temperatura, pH y
fuerza inica. La reactividad cruzada de molculas que tiene
una relacin estructural tambin ser afectada por los cambios en estas variables. En la medida de lo posible, estos factores, en especial la matriz de la muestra, deben mantenerse
constantes. Si a una reaccin no se le permite alcanzar el
equilibrio, la falta de constancia de la sincronizacin puede
conducir a una desviacin, es decir, a un error sistemtico en
el resultado, de acuerdo con la posicin de la muestra en el
lote. En analizadores automticos estos factores pueden controlarse de manera precisa, conduciendo a la consistencia de
resultados en y entre laboratorios.
Los reactivos para calibrar o los estndares pueden plantear una dificultad especial en el inmunoensayo, puesto
que para muchas sustancias no hay un sistema de ensayo
alternativo practicable. En el caso del polipptido de las
MARCADORES
hormonas, hasta el advenimiento de la tecnologa del DNA

recombinante no era posible preparar suficiente material
purificado para la medicin por mtodos fisicoqumicos y
de esta forma obtener calibradores para el inmunoensayo.
Por esta razn, se adoptaron los estndares internacionales
preparados para los bioensayos en los inmunoensayos, con
el valor asignado como el consenso de estudios de colaboracin que usan diferentes sistemas de bioensayos. Estos
estndares contienen algunos microgramos de antgeno o
problema con miligramos de albmina transportadora y de
excipientes; y los mtodos absolutos de anlisis, como el
del aminocido, no pueden utilizarse. Los ensayos de la hormona del crecimiento y de la prolactina en Estados Unidos
estn calibrados inadecuadamente en trminos de masa.
La heterogeneidad inherente de la glucoprotena de las
hormonas es una barrera importante para la estandarizacin, y condujo a diferir los cocientes de bioactividad/inmunoactividad en los estndares internacionales sucesivos.
El uso de estndares internacionales tiende a minimizar,
pero no elimina, las diferencias entre los ensayos. Los
materiales de referencia, estndares basados en el suero,
o los certificados, no se utilizan como calibrantes primarios, puesto que los inmunoensayos estn sujetos a efectos
de la matriz. El ltimo objetivo es calibrar los ensayos de
protena en trminos de masa o molaridad, un desafo para
muchos antgenos. Para una discusin de las dificultades de
la calibracin, vase Bristow, 1998; Stenman, 2001.
Marcadores
Muchos diferentes tipos de molculas tipo marcador o reportera se usan en la actualidad. Los procedimientos de marcaje se disean para no deteriorar la unin de la molcula
marcada a su anticuerpo o antgeno apropiado. La medicin
(deteccin) del marcador puede requerir otros reactivos o
un equipo muy especializado, o ambos. Los tipos de marcador que ms se emplean se listan en el cuadro 39-1.
Cuadro 39-1
Tipos de marcador de uso corriente
Radioistopos
Quimioluminiscencia
Quimioluminiscencia incrementada
Electroquimioluminiscencia
Fluorescencia
Fluorescencia de tiempo resuelto
Enzimas
Colorimetra, colorimetra cintica
Fluorescencia
Quimioluminiscencia
Amplificacin (cascadas)
375
Los radioistopos son fcilmente detectables, pero el

peligro que representan es una desventaja, adems se requiere de procedimientos especficos de manipulacin y de
eliminacin. Tambin tienen una vida til corta, ya que la
molcula marcada se daa por decaimiento radiactivo. Con
el advenimiento de la automatizacin, han llegado a restringirse a ensayos ms especializados y de bajo volumen.
La polarizacin de la fluorescencia slo es conveniente
para valorar haptenos pequeos y de frmacos, pero otros
mtodos fluorescentes se aplican a un amplio rango de antgenos. Los fluorforos utilizados con ms frecuencia incluyen la fluorescena, la umbeliferona, el luminol y los metales
raros. Las tcnicas de fluorescencia de tiempo resuelto usan
quelatos de lantnido, que producen una fluorescencia relativa duradera; la sensibilidad se mejora tomando las lecturas
despus que la fluorescencia de fondo de corta duracin producida por los componentes endgenos de la muestra ha decado. La sensibilidad tambin se incrementa por el cambio
de Stokes amplio de los quelatos de lantnido (es decir, la diferencia en la longitud de onda entre los picos de excitacin
y de emisin) y sus mximos de emisin muy estrechos, que
reducen la fluorescencia del fondo. El marcado mltiple,
empleando diferentes lantnidos, es tambin posible, y ofrece gran potencial para el anlisis multiplexado y miniaturizado. Los iones del lantnido son tambin un componente
de los marcadores de criptato; los iones se incluyen dentro de
una molcula orgnica grande como jaula, un criptando, y
el criptato que resulta es muy estable e inerte. La tcnica de
emisin amplificada de tiempo resuelto del criptato se basa en
la transferencia no radiactiva amplificada de la energa desde
un donante fluorescente (el criptato) a una molcula aceptora espacialmente prxima. As, el marcador ligado y libre
puede distinguirse por sus espectros de emisin, permitiendo un sistema de ensayo homogneo aplicable a molculas
grandes y pequeas.
En la quimioluminiscencia, la molcula excitada se produce por una reaccin qumica; los sustratos quimioluminiscentes producen fotones (luz), por lo general con una
reaccin oxidativa. En la electroquimioluminiscencia, la
emisin de luz se inicia electrnicamente al aplicar un voltaje a la solucin de la reaccin, eliminando los problemas
relacionados con la adicin y mezcla del reactivo.
El marcaje con enzimas y la deteccin con sustratos que
dan puntos finales colorimtricos, ndices colorimtricos,
fluorimtricos o quimioluminimtricos aportan mayor sensibilidad y un rango ms amplio de funcionamiento. Esta
tcnica, cuando se aplica con fluorescencia o quimioluminiscencia, se describe como enzima realzada o enzima
amplificada. Una forma de ensayo de fase slida heterognea que ha conseguido aplicacin extensa en muchos sistemas antgeno-anticuerpo es el ensayo de inmunoabsorcin
ligado a enzimas, o ELISA. La muestra primero se incuba
376
CAP. 39
con un anticuerpo que est unido a una fase slida (por lo comn sobre una placa de microtitulacin), entonces cualquier
antgeno no ligado se elimina por lavado, despus, se agrega
un segundo anticuerpo acoplado a una enzima. La actividad
de la enzima unida a la fase slida es proporcional a la concentracin del antgeno capturado (es decir, el antgeno).
La bsqueda para el marcador ideal contina (vase
Kricka, 1994); los estudios de desarrollo biotecnolgico
recientes incluyen marcadores particulares con tamaos
submicromtricos acoplados a los agentes de unin especfica, que ofrecen mayor sensibilidad.
Ensayos homogneos
El trmino homogneo se utiliza para los inmunoensayos
en los cuales no se requiere la separacin del marcador ligado
o libre. En tales sistemas la seal es modificada por la unin
del anticuerpo, con lo que resulta que el marcador ligado o
libre puede distinguirse en la mezcla de reaccin, por ejemplo, la unin del antgeno marcado con enzima al anticuerpo
puede inhibir la actividad de la enzima, por impedimento estrico o induciendo cambio de conformacin del sitio activo.
Este sistema (EMIT, tcnica de inmunoensayo multiplicado
por enzimas, Syva) puede utilizarse en analizadores de qumica; en la prctica se emplea ampliamente para la medicin
de frmacos. La polarizacin de la fluorescencia tambin se
usa para los ensayos de frmacos. Otro ejemplo es el inmunoensayo turbidimtrico para las molculas pequeas, en los
cuales la unin del anticuerpo cruzada con las partculas de
ltex revestidas con el antgeno es inhibida por el antgeno
libre de la muestra, causando una disminucin en la turbiedad. Si el antgeno es una molcula grande y en la concentracin es suficientemente alta, la formacin de los complejos
antgeno-anticuerpo puede medirse por nefelometra y no
es necesario el marcador. Los ensayos homogneos para los
antgenos grandes y pequeos son factibles con los criptatos
recin desarrollados (vase la seccin sobre Marcadores). Algunos tipos de ensayo homogneo disponibles se describen
en el cuadro 39-2. Sin embargo, la mayora de estas tcnicas
casi no se aplican, y gran parte de los inmunoensayos son del
Cuadro 39-2
Inmunoensayos homogneos
Inhibicin o activacin enzimtica (EMIT)

Polarizacin de la fluorescencia
Transferencia de energa no radiactiva (+ fluorescencia de
tiempo resuelto)
Nefelometra
Turbidimetra
tipo heterogneo, en el cual se requiere de la separacin del

marcador ligado y libre.
Mtodos de separacin
Cualquier tcnica para separar el antgeno ligado del libre o
del anticuerpo no debe perturbar la reaccin primaria.
La diferencia en el tamao molecular entre el antgeno
libre y el ligado al anticuerpo se aprovecha en los primeros
sistemas, como en la precipitacin de la protena con sulfato de amonio o polietilenglicol y la adsorcin del antgeno libre con carbn vegetal. La separacin inmunolgica a
travs del uso de un anticuerpo antiespecie result mucho
ms confiable. Por ejemplo, ya que los anticuerpos son bio multivalentes, si el anticuerpo primario fue elevado en
un conejo, los anticuerpos para las inmunoglobulinas del
conejo elevados en un burro producirn complejos con
las inmunoglobulinas del conejo que son suficientemente
grandes e insolubles para formar un precipitado. Algn
suero o inmunoglobulinas de un conejo no inmunizado
(suero portador) se agrega regularmente para asegurar la
precipitacin. Tales reactivos son de aplicabilidad general.
Este sistema de separacin (en el ejemplo del anticonejo
del burro) se llama un anticuerpo secundario, y los ensayos que lo usan, mtodos de doble anticuerpo, aunque este
nombre en ocasiones tambin se utiliza para describir un
ensayo con dos sitios. La formacin del precipitado del anticuerpo secundario es lenta, por tanto, en estos ensayos es
frecuente que se deje que ocurra el precipitado toda la noche, pero esta etapa puede acortarse en forma considerable
agregando polietilenglicol. Despus de la centrifugacin, el
sobrenadante es removido por aspiracin o decantacin,
procedimientos que requieren habilidad y experiencia con
los precipitados muy pequeos que se producen.
Mtodos de separacin en fase slida
Estas tcnicas, que han reemplazado en gran parte al resto de los mtodos, implican ligar los reactivos a las fases
slidas por unin covalente o por adsorcin. La fase slida
puede ser la pared de un tubo plstico, la celdilla de una
placa de microtitulacin o la superficie de perlas grandes o
de partculas pequeas. Las partculas con una base magnetizable ofrecen separacin excepcionalmente rpida y
eficiente. La separacin es por decantacin simple y conveniente o aspiracin de la fase lquida, seguida normalmente
por el lavado de la fase slida con amortiguador para asegurar la terminacin de la separacin y reducir la unin no
especfica (la unin evidente en ausencia del anticuerpo).
El ensayo simultneo de dos o ms antgenos es factible
ahora con la instrumentacin capaz de separar las mezclas
CLCULO DE LOS RESULTADOS
de perlas revestidas de anticuerpos dentro de grupos codificados con una tincin especfica para el antgeno en la
etapa final del ensayo de medicin separada. Tal sistema
permite, por ejemplo, el inmunoensayo de mltiples antgenos en un solo punto Guthrie para el tamizaje neonatal.
La fase slida puede ser un reactivo multipropsito,
realizado al cubrir con el segundo anticuerpo o con estreptavidina, un reactivo especfico que se acopla con biotina,
la cual tiene una afinidad muy alta con la estreptavidina. Otros pares incluyen fluorescena con antifluorescena.
Esta tcnica tiene la ventaja adicional de que las reacciones
especficas ocurren en la fase lquida. El acoplamiento a una
fase slida disminuye la afinidad de un anticuerpo y la velocidad de reaccin, y puede alterar otras caractersticas. Las
tcnicas en fase slida tambin permiten variaciones del
protocolo del ensayo de la forma bsica de la adicin simultnea de todos los reactivos a la muestra. Tales variaciones
pueden resultar en el incremento de la especificidad y otras
mejoras. Los reactivos inmovilizados sobre tiras de papel
forman la base de las pruebas con tira reactiva, por ejemplo,
para la prueba del embarazo. Otros dispositivos tambin
disponibles para inmunoensayo en el lugar de atencin incluyen pruebas para los marcadores cardiacos y frmacos.
Automatizacin
La automatizacin de los inmunoensayos requiere la aplicacin de una tcnica muy exigente debido a la necesidad
de la separacin de los marcadores ligado y libre en la mayor parte de los mtodos. Los primeros instrumentos eran
analizadores de lote que usaban un solo formato del ensayo
homogneo, para un nmero limitado de antgenos. Los sistemas actuales de alto rendimiento, totalmente automticos,
disponibles a finales de la dcada de 1980, pueden ser analizadores de lote u ofrecer el acceso aleatorio con calibracin
poco frecuente (con intervalos de semanas o de meses) derivada de un nivel alto de estabilidad del instrumento y de los
reactivos. El acceso aleatorio evita la necesidad del muestreo
por lotes incluso para las pruebas solicitadas con poca frecuencia y da tiempos de espera cortos. Formatos de ensayos
diferentes, pero con un sistema comn de medicin, pueden
incluirse en un solo instrumento. La sincronizacin exacta
permite tiempos de reaccin cortos sin la incubacin para
el equilibrio. La precisin debe ser siempre superior que
la de los ensayos manuales, pero difiere considerablemente
entre los diferentes tipos de instrumento. Las desventajas
inherentes son la complejidad y la inflexibilidad.
Miniaturizacin
Los desarrollos en otras disciplinas han permitido la miniaturizacin de los dispositivos del inmunoensayo. A la placa de
377
microtitulacin de 96 celdillas pueden sucederle placas de

alta densidad con muchos mltiplos de este nmero, requiriendo sistemas especializados de manipulacin del lquido
para los volmenes muy pequeos de muestra y de reactivos.
De inters particular en reas de la medicina, donde una gran
cantidad de pacientes requiere series idnticas de pruebas,
como en el tamizaje de frmacos o del marcador tumoral,
es el desarrollo de sistemas que usen microarreglos de reactivos. Tal microarreglo consiste en microgotas discretas
mltiples del reactivo impresas o formadas de otra manera
en un soporte inerte (p. ej., un arreglo de puntos de 5 5
sobre un sustrato o chip de 1 1 cm, o un arreglo de 8 8 en
cada celdilla de una placa estndar de microtitulacin). Para
el inmunoensayo el reactivo inmovilizado es normalmente
un anticuerpo especfico, y cada microgota puede ser un anticuerpo diferente, permitiendo la estimacin simultnea de
antgenos. La incubacin con la muestra y una mezcla de los
otros reactivos especficos y el resto del procedimiento del
inmunoensayo, se lleva a cabo de manera normal, y la seal
(con frecuencia fluorescencia o quimioluminiscencia) es detectada o registrada con un dispositivo de cmara fotogrfica
digital. Algunas microgotas en el arreglo pueden disearse
para detectar interferencias en la muestra, por ejemplo, anticuerpos heteroflicos, y para garantizar el control de calidad
de los reactivos, un nivel de inspeccin de calidad no se logra fcilmente en sistemas ms simples. Estos dispositivos
ofrecen ahorros sustanciales de la muestra, de los reactivos
y del tiempo comparados con los sistemas automticos convencionales.
En el futuro, los microchips completamente integrados
al inmunoensayo pueden llegar a estar disponibles, conteniendo estructuras microfabricadas capaces de llevar a cabo
todos los pasos de la preparacin de la muestra para la deteccin de la seal. Para una descripcin de los logros en el inmunoensayo con microchip, vase Kricka y Wilding (1998),
y para un estudio de la literatura sobre el desarrollo de la
miniaturizacin en general, vase Kricka y Fortina (2001).
Clculo de los resultados

Ya que la curva de calibracin para el inmunoensayo (una
representacin del marcador ligado contra la concentracin
del antgeno) no es una lnea recta, ajustar una curva a los
datos, con su imprecisin concomitante, es una cuestin de
juicio. Varias manipulaciones empricas se han empleado
para hacer parte o la totalidad del grfico lineal. El marcador ligado (o el porcentaje ligado si la cantidad total del
marcador adicionado es conocida) en comparacin con la
concentracin o log de concentracin; el log del marcador ligado contra el log de concentracin, y las grficas
logit-log se utilizan normalmente ([logit = log{(B/B0)/L
(B/B0)}], donde B0 = marcador ligado en el calibrador
378
CAP. 39
cero). Los papeles graficados lin-log, log-log y logit-log se

encuentran disponibles. Los instrumentos modernos diseados para el inmunoensayo tienen programas de computadora para ajustar la curva, incluyendo mtodos complejos
como ajustes de la curva por Spline cbico o por log-logstico de cuatro parmetros.
Exactitud y precisin
La exactitud del resultado de un ensayo es la proximidad
a la concentracin verdadera del antgeno; para muchas
sustancias an es tema de investigacin y discusin. La
precisin es la variabilidad del resultado que se obtiene, y
la imprecisin se puede minimizar por el uso de reactivos
apropiados, por ejemplo, un marcador con detectabilidad
superior, con la reduccin del nmero de pasos y con el
control estrecho de la tcnica. El control de calidad interno proporciona informacin slo sobre la imprecisin. Los
ensayos manuales se realizan por duplicado. La imprecisin vara con la concentracin del antgeno. Un ejemplo
tpico se muestra en la figura 39-2.
Figura 39-2 Un perfil de precisin tpico.
El rango de concentracin de imprecisin baja debe, idealmente, igualar el rango sobre el cual los resultados clnicos
se obtienen, y la imprecisin ser apropiada para una utilidad
clnica de los resultados. Algunos trabajadores definen el rango de funcionamiento de un ensayo como aquel sobre el cual
el coeficiente de variacin (CV) es menor de 10%.
La sensibilidad o la concentracin mnima perceptible
puede definirse de varias maneras, por ejemplo, como la
concentracin que corresponde a 2, 2.5 o 3 desviaciones
estndar (SD) de la seal del calibrador cero arriba de (para
los ensayos inmunomtricos) o debajo (para los ensayos
competitivos) del valor medio para el calibrador cero, la
SD que se obtiene de, digamos, 20 rplicas del calibrador
cero en un solo lote. Esto a veces se denomina sensibilidad

analtica. Ms realista pueden ser el uso de SD entre lote,
y el suero antgeno libre, dando el lmite biolgico de deteccin. Otros utilizan la concentracin en la cual el CV
entre lote es de 20% en las muestras biolgicas, para un
valor denominado sensibilidad funcional.
Cuando el trmino sensible se utiliza en la descripcin de un ensayo, implica no slo que las concentraciones bajas del antgeno pueden distinguirse desde cero, o
la ausencia del antgeno, sino tambin que la precisin a
niveles bajos es bastante buena para los cambios pequeos
en concentraciones bajas del antgeno para medirse confiablemente. Esto es en particular importante en el campo de
los marcadores tumorales.
Ntese que sensibilidad tiene significados alternativos;
es tambin la pendiente de la curva estndar en cualquier
concentracin, y la sensibilidad clnica es una medida de la
capacidad de una prueba para detectar la presencia de una
enfermedad.
Control de calidad
El control de calidad interno (CCI) proporciona informacin
sobre la precisin dentro de y entre los ensayos, y sobre la
variabilidad de la calidad del reactivo, pero no de la exactitud
ni validez, o errores con, o interferencia en, las muestras individuales. El CCI requiere materiales de composicin similar
(antgeno y matriz) para las muestras clnicas en suficiente
cantidad para el uso repetido dentro de y entre los lotes de
un ensayo, o para el uso a largo plazo en un analizador automatizado. Los materiales lquidos por lo comn se almacenan congelados. Los materiales comerciales de control de
calidad se suministran liofilizados. Durante la liofilizacin (y
el almacenaje subsiguiente) algunos componentes se pueden
daar, por ejemplo, los antgenos inestables o las protenas de
unin para los esteroides. Las concentraciones del antgeno
elegido para los materiales del control de calidad (con valores
bajos, medios y altos) deben corresponder a los puntos significativos del ensayo, como en los puntos de decisin clnicos,
pero evitarse las reas de alta imprecisin, que hagan la interpretacin difcil. Con los materiales comerciales del control
de calidad se consiguen los valores requeridos por el uso de
suero tratado y la adicin del antgeno, que pueden limitar la
similitud con las muestras clnicas. Los materiales de origen
humano deben utilizarse.
El registro continuo de los resultados del CCI es esencial; la demostracin del desempeo aceptable se requiere para la acreditacin del laboratorio, y los registros pueden
tambin ser invaluables en la localizacin y resolucin de
problemas (en el local o por el fabricante). El software del
ICC se suministra en los instrumentos automatizados pero
puede no ser ideal, haciendo necesaria la transferencia de
ESPECIFICIDAD, REACTIVIDAD CRUZADA E INTERFERENCIA
datos a un sistema o programa alternativo. Para las normas

sobre el uso de los resultados del control de calidad, vase
Westgard (2005) y Price & Newman (1997).
Los esquemas externos de la garanta de calidad (EEGC)
intentan aportar informacin sobre la comparabilidad de mtodos e investigar la validez, va recuperacin del estndar
agregado, linearidad en la dilucin, especificidad, rendimiento con el suero bajo antgeno, interferencia y otros factores.
Tales esquemas estn disponibles slo para los ensayos establecidos, y es comn en los laboratorios que ensayan compuestos esotricos, posiblemente con poca frecuencia, para
cambiar muestras para la comparacin y el reaseguramiento.
Especificidad, reactividad cruzada

e interferencia
La alta especificidad del sitio de unin de un anticuerpo
para su antgeno es una ventaja principal de los inmunoensayos. Un solo eptopo en una molcula compleja puede
involucrar aminocidos espacialmente prximos slo en
la estructura terciaria o cuaternaria de la molcula, y un
anticuerpo para tal eptopo, por tanto, no reacciona con las
formas o los fragmentos desnaturalizados. Sin embargo, un
antisuero policlonal contiene anticuerpos de afinidades y
de especificidades que difieren. Si la preparacin del antgeno que se utiliza para la inmunizacin es impura, entonces el antisuero contiene anticuerpos para las impurezas, y
la falta resultante de especificidad compromete la validez
del ensayo, sobre todo si el calibrante y el marcador son
tambin impuros. La seleccin de los anticuerpos monoclonales puede minimizar la reactividad cruzada, pero las
molculas que se relacionan de manera estrecha pueden aun
ser reconocidas por el anticuerpo, en especial en el caso de
molculas pequeas, tales como esteroides y frmacos.
La hiperespecificidad de un ensayo puede ocurrir si un
anticuerpo monoclonal se dirige a un eptopo, que ocurre
en algunas formas biolgicamente activas de un antgeno
heterogneo.
La reactividad cruzada en un ensayo competitivo se define de manera arbitraria como aquella concentracin del
reactivo cruzado que emite 50% de la seal encontrada en
ausencia del antgeno, que se expresa como porcentaje de
la concentracin del antgeno que emite la misma seal. La
reactividad cruzada medida vara en diferentes puntos de
la curva dosis-respuesta, y tambin con la presencia o la
ausencia del antgeno, y con el formato del ensayo y las condiciones de la reaccin, como temperatura y tiempo de incubacin. Es, por tanto, imposible calcular la concentracin
verdadera del antgeno en presencia de una reaccin cruzada, aun si la reactividad cruzada se conoce. La interferencia
negativa en ciertos diseos del ensayo de reactivos cruzados
en los que se incluyen varios frmacos de uso corrien-
379
te se reconocen hoy como un problema potencial serio en

la vigilancia de la digoxina (Valdes y Jortani, 2002).
En ensayos inmunomtricos con dos sitios es importante
probar los reactivos cruzados potenciales en ausencia y en
presencia del antgeno, puesto que el reactivo cruzado puede
reaccionar con cualquiera de los dos o con ambos anticuerpos. La reaccin de stos dar un aumento en la seal, mientras la reaccin con uno puede producir una disminucin en
la seal con altas concentraciones del reactivo cruzado, que
se pueden detectar slo en presencia del antgeno.
La reactividad cruzada de compuestos conjugados o metabolitos con estructuras relacionadas es un problema especfico con los ensayos de esteroides. En algunos casos, por
ejemplo, el cortisol y la testosterona en plasma, un mtodo
directo se utiliza de rutina (aunque las limitaciones deben
considerarse). En otros, con el cortisol en la orina, se requiere un paso preanaltico de extraccin en algunos ensayos,
pero hay casos en los cuales esto es esencial, por ejemplo,
para eliminar los reactivos cruzados potenciales cuando se
ensaya la 17-hidroxiprogesterona en los infantes que se sospecha un diagnstico de hiperplasia suprarrenal congnita.
La interferencia de sustancias aparentemente sin relacin
en muestras clnicas puede ocurrir de distintas maneras. La
sustancia, mal caracterizada, denominada inmunorreactiva parecida a la digoxina, que se administra en el suero
de pacientes en ciertas condiciones, sin tomar en cuenta la
terapia con digoxina, da resultados falsamente altos en los
ensayos con digoxina, y parece ser una reactividad cruzada
fortuita. Los autoanticuerpos pueden interferir al contribuir
con el antgeno del ensayo el cual in vivo es secuestrado
por el autoanticuerpo y, por tanto, es biolgicamente inactivo, como en el caso de la macroprolactina. De manera alterna, los autoanticuerpos pueden participar en la reaccin
del ensayo; el efecto sobre el resultado depende del diseo del ensayo (p. ej., antitriyodotironina y antitiroxina en
los ensayos para las hormonas tiroideas libres). Para algunos antgenos, la aparicin de la interferencia de los autoanticuerpos es muy frecuente para requerir el tamizaje de
las muestras, por ejemplo, para el ensayo de tiroglobulina,
o el reensayo despus de la eliminacin del autoanticuerpo,
por ejemplo, la prolactina.
La unin del complemento puede conducir a la destruccin del complejo antgeno-anticuerpo. Este efecto puede
prevenirse con la adicin de EDTA para quelar los iones
del calcio. Los anticuerpos antianimal, los de suero humano para inmunoglobulinas de otras especies, por ejemplo,
anticuerpos humanos antirratn (HAMA) y los heteroflicos, ahora se conoce que ocurren en una proporcin alta
de pacientes; los HAMA que estn presentes en cantidades
grandes en los pacientes proporcionan anticuerpos monoclonales para estudios por imgenes y propsitos teraputicos. Los anticuerpos antianimal y probablemente tambin
380
CAP. 39
el factor reumatoide pueden ligar un solo anticuerpo, reduciendo su afinidad para su antgeno, o lograr el enlace
cruzado de dos anticuerpos, de tal modo se imita al antgeno. Las concentraciones muy altas pueden producir interferencia negativa de una manera anloga al efecto de
gancho por dosis alta. Estos efectos pueden bloquearse
por la adicin de inmunoglobulinas de la misma especie
animal que los anticuerpos reactivos. Los fabricantes de
equipo ahora incluyen de rutina inmunoglobulinas de ratn
y de otra especie y anticuerpos bloqueadores especficos en
formulaciones del reactivo con el anticuerpo.
Una prueba simple para detectar la presencia de un interferente se realiza examinando la linealidad en la dilucin con un diluyente de matriz similar. La falta de linealidad sugiere un problema, aunque la buena linealidad no
excluye alguno.
Para una revisin de todos los tipos de interferencia,
vase Selby (1999).
Efecto de gancho por dosis alta

En un ensayo inmunomtrico de dos sitios con la adicin
simultnea de dos anticuerpos a la muestra (un ensayo de
un solo paso), cuando la concentracin del antgeno es muy
alta y los anticuerpos no son muy superiores, la unin cruzada de los anticuerpos de captura y marcados por el antgeno decrecen, con los sitios de unin en cada anticuerpo
ocupados por las molculas separadas del antgeno. La seal que se observa, por tanto, es dbil. En concentraciones
extremas altas de antgeno, la seal puede caer por debajo
de la del calibrador superior y un resultado falso bajo se
lee (fig. 39-3). Este fenmeno se conoce como efecto de
gancho por dosis alta, o respuesta bifsica, y es importante slo para aquellos antgenos que ocurren clnicamente
Figura 39-3 El efecto de gancho por dosis alta, x = concentracin del calibrador ms alto; y = concentracin arriba de la cual
valores falsos bajos se obtienen en muestras sin diluir.
en un rango de concentracin de varios rdenes de magnitud, como se observa para los marcadores tumorales como
la gonadotropina corinica humana, la -fetoprotena y la
prolactina. La posicin de gancho depende de las concentraciones de los anticuerpos.
Es difcil mantener la vigilancia constante para la presencia posible de este efecto, pero como un incorrecto
(quizs en apariencia normal) resultado puede conducir
a que se tome la accin inadecuada y posiblemente perjudicial, cada esfuerzo prctico debe realizarse. La dilucin de
rutina de las muestras con valores en la parte superior de la
curva estndar, o aquellas con la informacin clnica apropiada, por ejemplo, tumor hipofisario grande, se utiliza a
veces. Los dispositivos individuales, como aquellos para la
prueba de embarazo, son tambin vulnerables. El efecto
de gancho puede evitarse usando un formato de dos pasos,
en el cual la muestra se incuba con el anticuerpo de captura en fase slida, el exceso del antgeno se elimina con
lavado y el anticuerpo marcado se adiciona despus. En
este formato, las concentraciones muy altas se leen como
ms grande que el calibrador superior, sin la indicacin
de cunto ms grande. Sin embargo, el paso adicional aumenta la imprecisin total del ensayo, un factor de cierta
importancia para los marcadores tumorales. Los sistemas
que pueden emplear una lectura cintica muy temprana en
el tiempo de reaccin permiten una estimacin del resultado final, la dilucin automtica y el reensayo, con lo que
se elimina prcticamente este problema.
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40
Electrodos ion-selectivos
Alan D Hirst
Introduccin
La mayor parte de las formas convencionales de medicin
de la bioqumica clnica se basan en la produccin de un
compuesto coloreado. La electroqumica difiere en que la
medicin est fundamentada en la generacin de un voltaje
(potencial) o corriente, y el sistema que la mide es un voltmetro o un ampermetro en lugar de un fotmetro.
Un detector electroqumico, que responde especficamente a un analito, se llama electrodo ion-selectivo (ISE).
Los primeros electrodos reaccionaron a los iones, de ah el
nombre, pero en los ltimos adelantos, stos se han desarrollado para responder a metabolitos como glucosa y urea
aunque se incluyen normalmente en la misma categora
porque comparten una tecnologa comn. Los sensores de
glucosa que se usan en reas clnicas son con frecuencia
dispositivos de ISE, y todos los analizadores de cuidado
crtico se basan en la tecnologa de ISE.
El fundamento de funcin de los ISE es que ellos producen una respuesta potenciomtrica (cambio de voltaje)
o amperimtrica (cambio de corriente) a los cambios en el
analito, es decir, existen dos tipos de electrodos primarios.
Los electrodos secundarios utilizan otras caractersticas,
como las enzimticas, para alcanzar especificidad y liberar
un producto que pueda detectarse con un ISE.
Los electrodos se emplean en varias aplicaciones clnicas. Los que se usan con ms frecuencia son para:
Iones: por ejemplo, hidrgeno (pH), sodio, potasio, cloruro, fluoruro, calcio, magnesio, litio, amonio (NH+4).
Gases: por ejemplo, oxgeno, dixido de carbono, amoniaco (NH3).
Electrodos secundarios o complejos: por ejemplo, glucosa, urea, lactato, creatinina.

Las ventajas de los dispositivos ISE en aplicaciones clnicas consisten en que:
No son fotomtricos, lo que significa que una solucin
ptica transparente no es necesaria, es decir la sangre
completa puede usarse.
Son rpidos y directos, permitiendo la medicin de la
concentracin verdadera o de la actividad biolgica.
Teora
Una celda potenciomtrica y fuentes de potenciales
Cuatro elementos son requeridos para realizar una medicin con un ISE potenciomtrico:
Una media celda para la medicin.
Una media celda de referencia.
Un puente salino o una conexin elctrica equivalente.
Un dispositivo de medicin.
Una vista esquemtica de este arreglo se muestra en la figura 40-1.
Un electrodo funcional (celda) se compone de dos medias celdas, un electrodo medidor y un electrodo de referencia. Cada media celda produce un potencial, pero un
potencial como tal no puede medirse de manera directa. Es la diferencia de potencial (es decir voltaje) entre las
382
CAP. 40
ELECTRODOS ION-SELECTIVOS
Milivoltmetro
Electrodo medidor
Electrodo de referencia
Puente salino
Solucin
de referencia
Figura 40-1 Un electrodo simple consistente en una

media celda para la medicin y una media celda de referencia conectadas por un puente salino.
Solucin para
la medicin
Media celda
de referencia
Media celda para

la medicin
dos medias celdas lo que produce una seal mensurable.

La media celda de referencia debe disearse para tener un
potencial constante, mientras el electrodo medidor tiene
un potencial, el cual vara con la concentracin de la sustancia que es medida, y as la diferencia de potencial, o el
voltaje, vara en una forma reproducible con la concentracin de la sustancia.
Medicin y medias celdas de referencia
(que dan lugar a potenciales del electrodo)
El potencial de cada media celda se produce a partir de una
separacin de la carga creada por la migracin de iones
como sigue. En la superficie del electrodo, o en cualquier
unin, lquido o slido, habr una tendencia para que los
iones pasen de una fase a otra, por ejemplo, esto es, en la
superficie del electrodo los iones viajan desde el electrodo, dentro de la solucin. Si stos son iones de hidrgeno, por ejemplo, para un electrodo de pH, y entran en la
solucin sin un ion con la carga negativa correspondiente,
una separacin de la carga se crea, con una solucin ms
cargada positivamente (con iones hidrgeno) y un electrodo con ms carga negativa (con electrones). A medida que
este proceso contina, el incremento de la separacin de la
carga produce un aumento en el potencial entre el electrodo
y la solucin, el cual se opone a la migracin inica adicional, hasta que se alcance un equilibrio, en el cual no hay
otro movimiento neto de iones. Este proceso se ilustra con
un electrodo de zinc en la figura 40-2.
Figura 40-2 Una media celda de zinc que consiste en un electrodo del metal zinc en contacto con una solucin de sulfato de zinc;
los iones zinc emigran desde el electrodo dentro de la solucin,
dejan una pequea carga negativa sobre el electrodo y producen
una solucin con carga ms positiva.
Si el electrodo permanece en contacto con una solucin

de concentracin inica baja, se crea una salida grande de
iones desde el electrodo, antes que se alcance el equilibrio,
y un potencial grande se establece. De manera inversa,
una solucin concentrada tiende a oponerse a la migracin
inica desde el electrodo y produce un potencial ms bajo.
En otras palabras, el potencial que se produce vara inversamente con la concentracin de iones en la solucin.
383
TEORA
El electrodo de referencia trabaja de la misma forma

que el electrodo medidor, pero est en contacto con una
solucin de concentracin constante y debe tener un potencial constante.
Puente salino (dando lugar a un potencial de unin)
Para poder medir la diferencia de potencial entre dos medias celdas all debe existir un circuito elctrico, y un contacto elctrico entre la solucin del electrodo de referencia
y la del electrodo medidor. Esto es normal que ocurra por
contacto directo o con un puente salino, como se muestra
en la figura 40-1.
Existe migracin inica entre las soluciones en contacto,
similar a la migracin inica entre electrodos y soluciones.
Si los aniones y cationes en una de las soluciones son de
diferentes tamaos, emigrarn a diferentes tasas, como se
muestra en la figura 40-3, y esto tambin produce una se-
Los electrodos descritos hasta ahora son sistemas simples, sin el elemento de selectividad, y de resistencia baja,
y son la base de la batera comn. Para los propsitos de
medicin, una membrana selectiva necesita introducirse.
Un sistema de trabajo tpico se muestra en la figura 40-4.
Cuando el electrodo est rodeado por una membrana selectiva cristal en este ejemplo existe una separacin de
carga adicional en la superficie de la membrana. Este es el
potencial de membrana que se describe con ms detalle
en la siguiente seccin.
Potenciales circulantes
El movimiento en una de las soluciones, por ejemplo, que
se inicia con un mezclador mecnico o con un analizador
de flujo continuo, puede tambin producir un potencial circulante. La mayor parte de los instrumentos toma lecturas
estticas para evitar esta fuente de error.
Sistema medidor
Figura 40-3 Ilustracin del potencial de unin. La solucin 1

es una sal que consiste de un ion de metal relativamente pequeo
(M) y un anin grande (X). En la unin lquida, el ion de metal
ms pequeo se difunde dentro de la otra solucin (NY) a una
tasa mayor que el anin, causando una separacin de la carga, el
potencial de unin.
paracin de la carga, que crea un potencial que se opondr

a la separacin adicional de la carga. Todos los sistemas
del electrodo tienen uniones lquidas y, por tanto, potenciales de unin. Una de las caractersticas principales del
diseo de un electrodo de referencia es reducir al mnimo
el tamao y la variabilidad del potencial de unin. Por esta
razn, el electrodo de referencia de calomel es el ms
comn (cloruro mercrico). ste utiliza cloruro de potasio
saturado como solucin del electrodo de referencia, porque los iones de potasio y los de cloruro tienen un tamao
inico similar y emigran a una tasa similar. Sin embargo,
esto no elimina por completo el potencial de unin, porque
la solucin desconocida que est en contacto contiene una
composicin variable.
La diferencia de potencial se mide con un milivoltmetro,

como se muestra en la figura 40-4. Los voltajes tpicos medidos son de 59 mV para cada cambio de decena (diez veces)
en la concentracin para un ion monovalente como hidrgeno y sodio, y 29.5 mV para un ion bivalente como calcio. Un
error de medicin de 1 mV, a partir de cualquier fuente (p.
ej., potencial de unin), produce un error de lectura de 4%
para un ion monovalente y de 8% para uno bivalente. Esto
significa que se requieren milivoltmetros sensibles estables
para la medicin.
El circuito debe permitir una corriente mnima, porque
una corriente grande perturba el equilibrio inico en las superficies del electrodo. Las membranas del electrodo deben
ser tericamente capaces de conductancia elctrica, pero
en la prctica tienen una resistencia muy alta, del orden
de 109 ohmios. De manera similar, el milivoltmetro debe
derivar una corriente mnima a partir del circuito que tiene
una resistencia de entrada muy alta. Esto requiere el diseo
especial del voltmetro, y uno estndar no es el adecuado.
Es innecesario mencionar que en un sistema tal, el cual
requiere resistencia elctrica alta y una corriente insignificante para funcionar, la limpieza es muy importante, y
necesitan sellarse y aislarse cuidadosamente para dar resultados reproducibles.
Calibracin
Para realizar mediciones tiles con un sistema de funcionamiento del electrodo, como se muestra en la figura 40-4,
ste debe calibrarse primero. La respuesta de un sistema
384
CAP. 40
V
Electrodo
de referencia
Calomel
(Hg2Cl2)
Electrodo
medidor (pH)
Platino
cido
clorhdrico
Figura 40-4 Tpico sistema de funcionamiento del

electrodo, consiste de un electrodo de pH de vidrio y
de uno de referencia de calomel (cloruro mercurioso), ambos sumergidos en una solucin cuyo pH es
medido. El tapn de cermica poroso forma el puente
salino y controla la prdida de la solucin interna del
electrodo de referencia.
Cloruro
de potasio
saturado
(KCl)
Membrana
de vidrio
Tapn
de cermica
poroso
Solucin
desconocida
del electrodo es una respuesta logartmica inversa definida

por la ecuacin de Nernst:
EMF (voltaje) = Ereferencia Edesconocido
(Areferencia)
= RT loge
(A
nF
desconocida)
donde A = actividad, R = la constante del gas, T = temperatura absoluta, n = carga de la valencia y F = constante
de Faraday. Puede verse, a partir de sta, que hay una relacin logartmica inversa compleja entre la concentracin
(estrictamente, la actividad) de un ion y el voltaje que
produce un electrodo. Esto significa que la calibracin del
sistema y la produccin de una lectura no es algo fcil,
como lo es, por ejemplo, para un sistema colorimtrico de
glucosa sangunea.
La aproximacin por lo general es medir la pendiente
logartmica del electrodo, y tambin el voltaje a dos concentraciones. Idealmente ste debe ser de 59 mV para un
cambio de diez veces en la concentracin. Sin embargo, es
raro que los electrodos sean ideales, y la seal se deteriora
con el tiempo, as que la pendiente necesita comprobarse
regularmente.
Especificidad: cmo los electrodos

se hacen selectivos
Formas de lograr especificidad (cmo mide
lo que se necesita?)
En los electrodos simples, la especificidad para un ion
particular es determinada por una membrana selectiva que
rodea al electrodo, la que acta por intercambio inico selectivo, por ejemplo, el electrodo de pH tiene una membrana de cristal, que acta como intercambiador de ion
hidrgeno. El cristal es un enrejado cristalino de silicona
complejo, que contiene los iones cargados (sodio para el
cristal de sosa). En la superficie hay una capa hidratada
muy delgada donde estos iones pueden intercambiarse por
los iones en el lquido en contacto (fig. 40-5). El intercambio inico entre la membrana y el lquido slo ocurre con
la condicin de que el tamao fsico del ion y su carga electrosttica sean compatibles con la estructura del enrejado
cristalino, pero cuando las membranas llegan a ser ms
complejas otros factores tienen una parte ms importante.
Con el cristal estndar de silicato de sodio, se favorece el
intercambio del ion hidrgeno, pero un error alcalino ocurre debido a interferencia de los iones de sodio en pH alcalino.
En las condiciones de pH alcalino, cuando la concentracin
del ion hidrgeno llega a ser muy baja, la contribucin relativa a la respuesta del electrodo a partir de los iones sodio llega
a ser ms significativa hasta que excede la respuesta del ion
hidrgeno. Esto se conoce como el error lcali. Al variar
la composicin del cristal se pueden exagerar estos efectos,
de modo que el cristal se convierta en un electrodo diferente.
Las variaciones comunes en la estructura del cristal se muestran en la figura 40-6.
En la prctica, ningn electrodo es absolutamente especfico para un solo ion, y la preferencia que demuestra
por un ion en particular se llama selectividad. En este
ejemplo, en el pH neutral/cido el electrodo de cristal es un
electrodo de ion hidrgeno con una alta selectividad para
los iones hidrgeno sobre los de sodio, pero en un pH alcalino tiene caractersticas inversas. El primer objetivo del
ESPECIFICIDAD: CMO LOS ELECTRODOS SE HACEN SELECTIVOS
385
Figura 40-5 Un electrodo de pH opera sobre

el principio del intercambio del ion hidrgeno en
ambos lados de la membrana. No hay transferencia de iones hidrgeno a travs de la membrana
se establece un equilibrio aunque en teora
debe existir conduccin electrnica para que el
electrodo forme parte de un circuito de medicin.
La membrana tiene en la prctica una resistencia
de 109 ohmios y una corriente insignificante.
a) Slice puro
Si(iv)
b) Slice
+ metal
lcali
Si(iv)
c) Slice
+ almina
R(III)
Si(iv)
Selectivo pa
otros catione
Zr (iv)
Si(iv)
Selectivo pa
iones divalen
d) Slice
+ tierra rara
Si(iv)
Selectivo
para H+
Figura 40-6 Diferentes tipos de vidrio que se usan para los electrodos.
diseo de la membrana es maximizar la selectividad para

evitar interferencia de otros iones similares. En el caso de
haluros, por ejemplo en el cloruro, esto puede alcanzarse
fcilmente si se usa una membrana cristalina de cloruro
de plata, en la cual slo un ion cloruro puede alojarse con
facilidad en el enrejado cristalino. Problemas ms difciles se presentan al intentar medir el calcio en presencia de
magnesio y viceversa (ambos estn presentes en concentraciones sanguneas similares), ya que los dos tienen un
tamao similar. An ms difcil es el diseo de un electrodo para detectar el litio sanguneo en una concentracin de
1 mmol/L contra un fondo de 140 mmol/L del sodio.
Alterando la composicin del cristal, se producen electrodos para que respondan al sodio y al potasio. El mejor
electrodo de sodio tiene una selectividad para sodio sobre
potasio de 100:1, y esto es clnicamente til para los fluidos
biolgicos con concentraciones de sodio altas y de potasio bajas. Sin embargo, el electrodo de cristal de potasio
tiene una mejor selectividad para el potasio sobre el sodio de 20:1, que no es ideal para uso en sangre, donde la
concentracin normal de sodio es alrededor de 30 veces
la concentracin de potasio. Para estos usos, se necesitan
membranas ms selectivas.
Membranas selectivas a los iones
La paradoja al desarrollar membranas selectivas a los iones
ocurre porque la membrana debe ser impermeable al agua,
de modo que haya una conduccin elctrica insignificante,
lo cual evita el corto circuito en el electrodo, pero los iones
por su naturaleza tienen una preferencia por las soluciones en agua. La membrana necesita tener un componente
por el cual el ion tenga una preferencia equivalente, o por
atraccin electrosttica, como en el caso del intercambio
inico, o por sustitucin de la capa de hidratacin (aportada por el solvente agua), como en el caso de portadores
neutros. Las clulas vivas utilizan con frecuencia tales
portadores para transportar iones y nutrientes flotantes a
travs de las membranas celulares, que por lo general son
barreras hidrofbicas, y esto ha generado los modelos para
el diseo de las membranas ISE.
Para tener una membrana funcional que utilice un intercambiador inico o un portador neutro, sta necesita un
apoyo inerte, que debe ser capaz de contener y retener al
386
CAP. 40
Ionforo
O
Alquil
P
Alquil
O Alquil
P
Ca
O Alquil
Alquil fosfato
Mediador
C8 H17 O
O
P
C8 H17
C6 H5
di-n-octilfenil fosfonato
Figura 40-7 Portador de calcio.
portador inico; esto normalmente significa atrapar el solvente en el cual el portador se disuelve.
En el caso de los sensores de calcio se ha encontrado
que los materiales de intercambio inico se unen al calcio
con una alta selectividad (fig. 40-7). El electrodo consiste
de una sal de calcio de un alquil fosfato disuelto en di-noctofenil fosfonato, un solvente que no es voltil e insoluble en agua. Esto se mezcla con PVC disuelto en un
solvente voltil, y se vierte sobre una superficie plana, lo
que permite al solvente voltil evaporarse. Esto deja una
capa fina de PVC en el intercambiador de calcio atrapado
dentro de l.
En un electrodo ideal, el portador es en su totalidad insoluble en agua, pero en la prctica es lixiviado a distancia
de manera gradual, conduciendo a una prdida gradual de
la respuesta del electrodo, porque las membranas del electrodo tienen que cambiarse con regularidad.
Los portadores neutros son una alternativa al intercambio inico, y el ms utilizado es la valinomicina para los
electrodos de potasio. Los compuestos teres corona son estructuras anilladas que contienen varios tomos de oxgeno
que pueden imitar la capa de hidratacin de un tomo, como
se muestra en la figura 40-8. La valinomicina (fig. 40-9) es
un compuesto similar a un anillo grande complejo que contiene seis tomos de oxgeno dentro de su estructura; puede
tambin acomplejar al potasio, es decir, el ion intercambia
su capa de hidratacin acuosa por la valinomicina y emigra
de una solucin acuosa a una membrana hidrofbica.
Una de las ventajas de los portadores neutros es que
tienden a ser menos solubles en agua que los intercambiadores inicos, que deben tener necesariamente solubilidad
leve. Producen membranas, las cuales tienen una vida ms
larga. Se han desarrollado portadores neutros para varios
iones, incluso de sodio, cloruro, calcio, magnesio, litio,
amoniaco (fig. 40-10) y carbonato (fig. 40-11).
La explicacin precedente est relacionada con los electrodos potenciomtricos, los cuales se utilizan en la ilustracin porque incluyen todos los problemas relacionados con
la electroqumica.
Reacciones electroqumicas
La descripcin de potencial del electrodo mencionada antes es una simplificacin de la situacin real para ayudar
Capa
Ion potasio
de hidratacin
interna
H
H
O
H
H O
H
O
O
O
K+
H
O
O
O
O
O
Capa
de hidratacin
externa
Figura 40-8 a) Un ejemplo de un compuesto ter corona (diciclohexil-18-corona-6) que acta como capa sustituta de hidratacin para
un ion como el de potasio, y es capaz de transportarlo a travs de una membrana hidrofbica. b) Un ion potasio en la solucin rodeado por
una capa de hidratacin interna, una de hidratacin externa y una de hidratacin externa de molculas de agua.
387
REACCIONES ELECTROQUMICAS
H3
C
0
H
N
H
C
3)
2
CH
)2
(CH
(C
CH
)2
H3
(C H
C
(
CH
)2
0
NH
(CH3)2 HC
CH (CH3)2
(C CH
H
3)
2
C
H
N
H
N
H
CH
(CH3)2
C
H3
N
H
0
CH
)2
H3
(C
Figura 40-9 Estructura de la valinomicina.
Figura 40-10 Un grupo de compuestos ETH usados como ionforos sobre ISE.
388
CAP. 40
OH
R
CF3
..
..
CF3
OH
p-Decil-,,-trifluoroacetofenona
Electrodos amperomtricos
OH
CF3
C=O
OH
H
R
cas puede ampliarse para incluir otras reacciones qumicas,

que no ocurren de repente pero se originan por un potencial
aplicado. Esto abre la posibilidad del anlisis de sustancias que no existen necesariamente como iones en solucin
sino que dan lugar a una reaccin electroqumica en circunstancias convenientes.
CF3
C=O
Hay otra clase de electrodos, llamados amperomtricos

porque producen una corriente en lugar de un voltaje. Este
tipo de electrodo se disea para medir una reaccin electroqumica una reaccin qumica que produce o consume electrones midiendo una corriente elctrica en vez
de medir el voltaje producido por una separacin de carga.
El ms comn de stos, en uso clnico, es el electrodo de
oxgeno (pO2). En el caso del electrodo de oxgeno la reaccin es:
O2 2H2O 2e
H2O2 2OH
Para el electrodo de perxido relacionado, la reaccin es:

H2O2
Figura 40-11 Ionforos usados en un electrodo de carbonato.
a ilustrar cmo funciona el electrodo. Lo que en realidad

sucede en la superficie del electrodo es una reaccin electroqumica que produce una especie cargada antes de la
separacin de la carga, por ejemplo:
Zn
0.7 V
Zn 2e
En un material que conduce como un electrodo de metal, la estructura del electrn es similar a un mar en el
cual los electrones estn libres para moverse a travs del
slido. Las energas de los electrones se llenan a un nivel, llamado de Fermi. En la solucin existe una situacin
diferente. Los iones estn rodeados por una capa de hidratacin (fig. 40-8), que los separa con eficacia de otros
iones, y los electrones se restringen a diferentes bandas de
energa (ms bajas). Al instante el electrodo entra en contacto con la solucin, la diferencia en niveles de energa
favorece un flujo de electrones para igualar la energa y
un equilibrio se alcanza rpidamente al estado de energa
libre ms bajo (conocido como el nivel de energa libre de
Gibbs). sta es la base del potencial del electrodo.
Esta reaccin electroqumica ocurre de manera espontnea debido a la propiedad del material del electrodo, que
es capaz de perder un electrn y formar un ion, as que el
uso principal de estos electrodos (potenciomtricos) es la
medicin inica. El concepto de reacciones electroqumi-
0.7 V
2H O2 2e
La primera reaccin se utiliza en el electrodo estndar de

oxgeno (pO2) (electrodo de Clarke), mientras el segundo
se emplea en algunos electrodos de glucosa, como se describe ms adelante, para medir el perxido producido por
la enzima glucosa oxidasa.
Puede observarse a partir de estas reacciones electroqumicas que las reacciones son facilitadas por un voltaje
aplicado (0.7 V) y ste puede adicionarse a la especificidad
de la respuesta del electrodo. La caracterstica principal de
estos electrodos es que un voltaje constante se aplica a los
electrodos medidores, y la corriente resultante (en microamperios) es proporcional a la cintica de la reaccin. Esta
es una relacin lineal directa, en contraste con la respuesta
logartmica inversa compleja de los electrodos potenciomtricos. Ya que se est midiendo la corriente, estos electrodos
(p. ej., un electrodo pO2) no necesitan uno de referencia.
Sin embargo, la reaccin y la corriente tambin se relacionan con el rea superficial del electrodo.
Polarografa
Es una aplicacin de la electroqumica. El voltaje aplicado
es polarizante, y la celda electroqumica una celda polarogrfica.
Para conseguir una medicin del analito involucrado o,
por ejemplo, del pO2 (la presin parcial del oxgeno no es
en sentido estricto concentracin, pero es equivalente en
ELECTRODOS DE GLUCOSA
389
trminos gaseosos), la cintica de reaccin debe ser constante y, por tanto, el pO2 tambin. Un requerimiento clave
de este tipo de sistema es que el electrodo no debe consumir el oxgeno en su superficie a una tasa ms rpida de
lo que el oxgeno puede difundirse a travs de la solucin
del electrodo hacia la superficie de ste, de otra forma la
corriente declina cuando el pO2 en contacto con sta falla.
Para mantener un estado constante que permita la medicin, las celdas que se miden deben disearse de modo que
el electrodo en el cual la reaccin ocurre sea muy pequeo
(p. ej., la punta de una aguja), para consumir una cantidad
mnima del analito en la medicin. Esto significa que un
sistema tpico producir slo una corriente de proporciones
en microamperios, que requiere un ampermetro diseado
especficamente para tal medicin.
Electrodo de oxgeno
Para tener un electrodo funcional, los electrodos en los
cuales la reaccin electroqumica tiene lugar deben estar
en contacto con una solucin constante con una resistencia constante de modo que no ocurra ninguna variacin
en la resistencia, lo cual afecta el voltaje aplicado y entonces la corriente producida. El electrodo de oxgeno de
Clarke consiste de electrodos en contacto con una solucin
electroltica, la cual est contenida por una membrana de
caucho de silicona. El oxgeno gaseoso puede pasar libremente a travs de la membrana, pero sta es hidrfoba y
no permite que el agua o electrlitos disueltos pasen de
un lado a otro y cambien la composicin y resistencia de la
solucin electroltica. Esto se muestra en la figura 40-12.
Electrodos de glucosa
Los electrodos de glucosa emplean una combinacin de
una enzima y de un voltaje de polarizacin especficos para
generar una respuesta especfica para la glucosa. En la actualidad existen dos diferentes enzimas y tres reacciones de
transferencia electrnica distintas en uso comn.
La forma ms simple de formar un electrodo de glucosa
es utilizar la enzima glucosa oxidasa junto con un electrodo de oxgeno. La glucosa oxidasa cataliza la reaccin:
glucosa O2 2H2O
cido glucnico H2O2
El electrodo de oxgeno puede medir la cada dentro del

pO2 como una medicin de la glucosa consumida en la
reaccin. Desafortunadamente, si la celda est abierta a
la atmsfera, se llena de oxgeno atmosfrico, y tambin
hay problemas si se utiliza sangre entera, por los efectos
que se crean por la unin del oxgeno con la hemoglobina.
Figura 40-12 Un electrodo de oxgeno de Clarke. ste consiste

en un ctodo de platino de rea muy pequea rodeado por un nodo anular de plata. Ambos estn en contacto con un amortiguador
interno incluido dentro de una membrana hidrofbica de caucho
de silicona. El oxgeno puede difundirse libremente a travs de
la membrana y disolverse en el amortiguador interno. Se mide la
reaccin electroqumica resultante en el ctodo de platino.
Debido a estos problemas, se han desarrollado mejores

aplicaciones:
El electrodo glucosa oxidasa/perxido. ste se utiliza
para detectar el perxido producido por la reaccin, con
un potencial aplicado de +0.7 V.
El electrodo glucosa oxidasa/ferroceno. Este electrodo
utiliza ferroceno como agente de transferencia electrnica en la reaccin electroqumica siguiente:
Glucosa
gluconolactona
glucosa oxidasa

ferricinio
ferroceno (Fe2)
80 mv e

ferricinio (Fe3)
sta es la base del ensayo de la cinta de glucosa de Medisense, y se ilustra en la figura 40-13.
El electrodo de glucosa deshidrogenasa/ferricianuro.
Este electrodo funciona de una manera similar, pero con
una enzima diferente y un agente de transferencia electrnica:
Glucosa glucosa deshidrogenasa cido glucurnico
+
+
Fe(CN)46
Fe(CN) 36
80 mv e
+
Fe(CN)36
Esta es la base del ensayo de la cinta de glucosa de Boehringer Mannheim Corporation (BMC) Advantage.
390
CAP. 40
Figura 40-13 Ejemplo de un electrodo de glucosa en estado lquido, sistema Medisense. Este sistema tiene tres contactos: un electrodo comn central, uno en contacto con el ferroceno solamente (para las reacciones no especficas) y otro en contacto con la glucosa
oxidasa ms ferroceno. La diferencia en las dos seales proporciona una medicin de la concentracin de glucosa.
Interferencia del frmaco

Los tres tipos de electrodo de glucosa descritos antes son
de uso comn y, en general, aparatos de medicin eficaces,
pero varias sustancias, incluyendo medicamentos comunes
como el paracetamol, pueden interferir y dar una seal con
estos sistemas. Esto ocurre porque casi todos los compuestos pueden producir una reaccin electroqumica, dando un
voltaje polarizante bastante elevado, y esta reaccin involucra la mayor parte de los frmacos. Con base en esto los
frmacos teraputicos y muchos otros compuestos biolgicos pueden medirse con cromatografa usando una celda
polarogrfica como detector electroqumico.
Detectores electroqumicos
Estos detectores son el resultado de un desarrollo del electrodo polarogrfico, para empleo como detectores en cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). Una aplicacin tpica de estos detectores en el laboratorio mide las
catecolaminas (adrenalina, noradrenalina) para la deteccin del feocromocitoma. La reaccin electroqumica se
muestra en la figura 40-14.
Los electrodos descritos funcionan en condiciones estables, por ejemplo, estn en contacto con una solucin
constante. En un sistema cromatogrfico, la selectividad se
obtiene con la separacin cromatogrfica (es decir, fsica)
HO
R
+ 0.5 V
HO
R
+ 2H+ + 2e
Adrenalina
Figura 40-14 Reaccin electroqumica por catecolaminas.
de compuestos similares, por ejemplo, adrenalina y noradrenalina (en comparacin con el uso de una membrana
selectiva), pero los sistemas solventes que se emplean para
la separacin son variables, as que la resistencia de la solucin en la celda de medicin es variable, y eso afecta el
voltaje aplicado. Para superar este problema, se utiliza un
tercer electrodo en la celda de medicin HPLC, que tiene
la funcin de supervisar el voltaje aplicado y mantenerlo
en un valor constante a travs de un circuito de retroalimentacin.
Electrodos complejos
stos consisten de un electrodo dentro de otro, el ejemplo
ms comn es el electrodo pCO2 (dixido de carbono) encontrado en todos los analizadores de gases sanguneos.
391
OTROS ELECTRODOS COMPLEJOS MEDIADOS POR LAS ENZIMAS
Electrodo pCO2
Otros electrodos complejos mediados

por las enzimas
Este electrodo consiste de un electrodo de pH estndar en

contacto con un amortiguador dbil de bicarbonato y encajonado en una membrana de cloruro de polivinilo (PVC);
se muestra en la figura 40-15.
Electrodo de lactato
ste es de uso general en unidades de cuidado crtico, y por
atletas para comprobar el estado anaerbico despus del
ejercicio. Funciona de la misma forma que uno de glucosa
(por lo comn es un electrodo de glucosa modificado) empleando un enzima lactato oxidasa diferente:
Lactato + O2 + H2O
piruvato + H2O2
El perxido formado es medido con un electrodo de perxido.

Electrodo de urea (Roche Diagnostics)
ste es ms complejo y utiliza la enzima ureasa; descompone la urea para formar dixido de carbono y amoniaco;
el ltimo se convierte en iones amonio, que entonces se
detectan con un electrodo de amonio:
Urea H2O
Figura 40-15 Un electrodo pCO2 que consiste en uno de pH y
uno de referencia plata/cloruro de plata interno. El CO2 se difunde
a travs del PVC y cambia el pH del amortiguador interno.
La membrana de PVC es permeable a los gases, por

ejemplo, dixido de carbono, pero impermeable al agua. El
dixido de carbono se difunde a travs de la membrana y
se disuelve en el amortiguador cambiando el equilibrio del
amortiguador de bicarbonato.
CO2 H2O
H2CO3
CO2 H2O

2NH3 H2O
H HCO3

NH
4 OH
Al contrario del electrodo de amoniaco, el de amonio

tiene escasa selectividad, pero se utiliza porque la enzima
ureasa puede trabajar slo a un pH bajo, en el cual el amoniaco se convierte en iones amonio. El electrodo de amonio
sufre la interferencia del potasio, as que se emplea en serie
con uno de potasio compensador. Esto se muestra en la figura 40-16.
HCO3 H
Al efectuarse lo anterior el pH del amortiguador cambia, y

se mide con el electrodo de pH.
Los electrodos de amoniaco se hacen de la misma manera, con un electrodo de pH sumergido en un amortiguador. Las diferencias consisten en que el amortiguador que
se crea es diferente:
NH3 H2O
Ureasa

NH
4 OH
y la membrana contiene el portador neutro nonactina (vase

fig. 40-10f) para ayudar en la transferencia del amoniaco.
Seal
amplificada
Muestra
Electrodo
de referencia
Urea
NH4
Electrodos
K
Figura 40-16 Diagrama esquemtico de los principios analticos de un sensor potenciomtrico para la medicin de la urea.
392
CAP. 40
Electrodo de creatinina (Nova Biomedical, UK)

ste usa una serie compleja de enzimas:
Creatinina + H2O
Creatina + H2O
creatinina amidohidrolasa
creatinina amidohidrolasa
sarcosina + O2 + H2O
sarcosina oxidasa
creatina
sarcosina
+ urea
formaldehdo
+ glicina + H2O2
El perxido se mide con un electrodo de perxido.
Comprobacin en los puntos de cuidado

(POCT)
Los electrodos selectivos a los iones (ISE) son muy utilizados en instrumentos POCT, sobre todo porque emplean
sangre completa, en lugar de suero, y pueden producir un
resultado en menos de un minuto.
Figura 40-17 Un glucmetro Roche Advantage.
Analizadores de cuidado crtico

Glucmetros
stos son empleados por enfermeras y mdicos y por muchos pacientes. Son baratos (~ 20 dlares) y fciles de utilizar. Los principios de los componentes del ISE de tales
sensores son descritos en la pgina 389. La figura 40-17
muestra un glucmetro tpico (Roche Instruments plc) y la
cinta de medicin. La ltima est disponible.
stos son instrumentos ms complejos, usados en casi todas las unidades de cuidados criticos, por ejemplo, salas de
traumatismos y urgencias, unidades de cuidado intensivo/
terapia, de cuidado especial del beb, de cuidado coronario, y reas de recepcin. Contienen una serie de electrodos y de otros sensores, normalmente en grupos, como se
Amplificador
Electrlito
de referencia (KCl)
Indicador
Electrodo
de referencia
Na, pH, K , Ca,
Li , Mg , CI-
Electrodo de Calomel
Electrodos
Unin lquida
Muestra
Figura 40-18 Una serie de electrodos como se

utiliza en un analizador tpico para el cuidado
crtico.
Capilar
selectivo de cristal
de sodio/H
Membrana
ion selectiva
Tierra (GND) de
la cmara
de medicin
393
RESPALDO
Gases sanguneos: pH, pO2, pa CO2. Este grupo mide el

estado cido-base de la sangre como un ndice de funcin renal y respiratoria.
mittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) como

estndar NCCLS-POCT-IA.
Iones: sodio, potasio, cloruro, calcio y magnesio. Este

grupo se usa en las unidades de cuidado crtico para la
valoracin de condiciones como volumen del fluido corporal y la funcin renal y cardiaca.
Poltica
Metabolitos: glucosa, urea, creatinina, lactato. Este grupo se usa para la valoracin de condiciones como funcin renal y heptica.
Co-oximetra: hemoglobina, oxihemoglobina, carboxihemoglobina. Estos componentes se miden usando espectrofotometra en lugar de los ISE. Se combina con
otras pruebas porque proporcionan informacin adicional, en particular sobre la respiracin.
Respaldo
Conexin de la red
Los instrumentos en el lugar de cuidado producen resultados que afectan de manera directa el tratamiento del paciente. Los primeros instrumentos eran independientes, y
todo el mantenimiento de registros, manual e inconsistente.
Esto se identific como un problema de control de riesgo
mayor, y condujo a una nueva generacin de instrumentos,
que pueden conectarse va una red a un controlador central
de los datos. Esto tiene varias ventajas:
Los datos se recolectan y almacenan centralmente. Esto
incluye los resultados de la prueba, la identificacin del
paciente y del operador, y la fecha/hora, es decir un rastreo completo de auditora.
La identificacin del operador puede controlarse de
modo que slo los entrenados utilicen los instrumentos.
El funcionamiento del instrumento puede supervisarse
centralmente.
Es importante que los instrumentos de cuidado crtico sean
siempre operacionales. El control de la red permite aportar
a los laboratorios apoyos las 24 h para estos analizadores.
Uno de los primeros problemas con el control de la red
fue que las compaas estaban utilizando diferentes sistemas de comunicacin, los cuales eran incompatibles. Este
problema fue resuelto cuando las compaas de diagnstico formaron CIC (Communications Industry Consortium)
para resolver el problema. El CIC produjo un grupo de estndares de comunicaciones, que adopt el National Com-
Una de las principales aplicaciones de ISE es la comprobacin en los puntos de cuidado (POCT), donde las pruebas sern hechas por enfermeras y mdicos sin el entrenamiento de
laboratorio formal. Como existen numerosos problemas que
pueden ocurrir con las mediciones ISE, debe haber respaldos
incorporados en todo el proceso (no slo en el sistema de medicin) para que esta aplicacin sea aceptable, y deben elaborarse por completo dentro de una poltica del hospital sobre
POCT. Sin este respaldo, se coloca en riesgo a los pacientes y
la institucin tiene un problema de control de riesgos.
La entrada de datos principal del laboratorio es la produccin de la especificacin que el instrumento debe satisfacer
(es decir, el desempeo del instrumento). La especificacin
debe tratar problemas como selectividad de los electrodos.
Por fortuna, la tecnologa moderna permite elaborar resguardos convenientes, como se perfila ms adelante.
Verificacin del instrumento
Los instrumentos modernos son operados por computadoras, que verifican el desempeo del electrodo sobre funciones como seal del electrodo (p. ej., pendiente: mV/
decada) y el tiempo de reaccin, y otras verificaciones
como temperatura, burbujas de aire, fugas de la membrana,
etc. Para un laboratorio apoyado en instrumentos, donde el
personal debe entender las caractersticas del electrodo, es
aceptable tener un alto nivel de facilidad en su manejo para
producir mediciones en una situacin de urgencia. Para las
aplicaciones de POCT, si una respuesta del electrodo cae
fuera de los lmites especificados, la prueba debe desactivarse hasta que el problema est resuelto.
Existen otras funciones tiles, que estn permitidas con
un instrumento controlado por computadora:
Identificacin del operador. El entrenamiento es una
caracterstica importante de POCT, y una funcin operatoria slo debe ejecutarse por el personal entrenado y
autorizado para operar el instrumento.
Interrupcin remota. Esta es una instalacin en la que
el instrumento est conectado con la computadora del
laboratorio, que monitorea el requerimiento del control
de calidad del instrumento, y lo bloquea si el CC no
cumple los lmites predefinidos. La computadora del
laboratorio entonces alerta al personal del laboratorio
sobre el problema.
394
CAP. 40
Control de calidad (CC) y aseguramiento de la calidad

(AC). El control de calidad es la verificacin, en tiempo
real, del instrumento. Esto implica analizar el material
de composicin conocido y verificar que los resultados
que se obtienen estn dentro de los lmites clnicos significativos, segn lo definan los organismos profesionales (como los organismos nacionales del aseguramiento
de la calidad). El control de calidad lo deben realizar
regularmente los operadores (p. ej., enfermeras y mdicos) que efectan las pruebas, y una parte esencial de
su entrenamiento se centra en la importancia de realizar
el control de calidad, registrando los resultados, y qu
accin tomar si la verificacin de control de calidad falla. Este entrenamiento deben ensearlo profesionales
laboratoristas experimentados.
Para asegurar la calidad se realiza un examen retrospectivo del desempeo del instrumento, el cual se hace con
frecuencia como parte de un esquema externo del AC. La
agencia britnica de acreditacin del laboratorio, CPA(UK)
Ltd, requiere que los laboratorios participen en un esquema
reconocido de CC y mantengan un funcionamiento adecuado. Si los instrumentos de POCT estn bajo el control
del laboratorio principal, la acreditacin del laboratorio se
aplica al servicio de POCT, a condicin de que se opere
en un estndar aceptable. Este acercamiento se recomienda
como la mejor manera de aportar calidad al cuidado del
paciente con un riesgo mnimo.
Mantenimiento. Las verificaciones de mantenimiento estn normalmente planeadas como mantenimiento
preventivo, por ejemplo, el reemplazo de la tubera, sello, electrodos, etc. Estas pruebas las realizan mejor los
profesionales laboratoristas experimentados, pero si las
hace personal no laboratorista, el entrenamiento riguroso sobre la importancia de las verificaciones es vital.
Entrenamiento. El entrenamiento de todos los usuarios
es una caracterstica esencial de una poltica POCT del
hospital. Para los instrumentos modernos, el entrenamiento no requiere ser de gran profundidad o consumi-
dor de tiempo, con la condicin de que los resguardos

adecuados se hayan realizado sobre el instrumento. El
entrenamiento debe incluir no slo la operacin del instrumento, sino una comprensin de todas las seales de
error, la importancia de los resultados, y la importancia
de registrar resultados y los procedimientos del CC.
Reconocimientos
Quiero agradecer a Roche Diagnostics por su ayuda con el
suministro de un nmero de diagramas, y en particular a
Christoph Ritter, de Nova Biomedical UK, por la informacin sobre los electrodos, y a Andrew St John por permitirme el uso de varios diagramas. Muchas gracias tambin a
Janet Gourlay por toda la mecanografa y la preparacin.
Hirst AD, Stevens JF. Electrodes in clinical chemistry. Ann Clin
Biochem 1985; 22: 460-488.
Crompton RG, Sanders GHW. Electrode Potentials. Oxford University Press, Oxford.
Ed Van Ysek P. Modern Techniques in Electroanalysis. 1996:
Wiley, Chichester.
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Burnett 2000; 37: 241-243.
Price CP, Hick JM (eds.). Point of care testing. 1999: AACC
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Kost GJ (ed.). Principles and Practice of Point of Care Testing.
2002; Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelpphia, PA.
Management and use of IVD point of care test devices. MDA Device Bull 2002; 3. (www.medical-devices.gov.UK).
Annexe D of ISO 15189Medical Laboratories. Particular requirements for quality and competence. ISO (International
Standards Organization), Geneva (Annexe D, wich relates to
quality management of point of care testing, is under discussion at the time of going to press, but should be agreed by the
time of publication).
Structures of ionophores. Fluka catalogue. 2003: Sigma- Aldrich
Company Ltd (www.sigmaaldrich.com).
41
Absorcin de la luz, dispersin y tcnicas
de luminiscencia en bioqumica clnica rutinaria
Bernard F Rocks
Introduccin
Algunos de los constituyentes qumicos de la sangre, plasma u orina pueden medirse en forma directa. Los qumicos
analticos, sin embargo, han desarrollado medios indirectos para detectar y medir de manera cuantitativa muchos
de los componentes de inters clnico. El mtodo implica
con frecuencia aadir a la muestra diluida una sustancia (el
reactivo) que qumicamente reaccione en forma especfica
con el componente particular que se quiere cuantificar (el
analito), para formar un producto que pueda medirse con
relativa facilidad. Siempre que sea posible, las condiciones
del ensayo producen un producto cuya cantidad es proporcional a la concentracin original del analito.
Cuando la luz incide en la materia de cualquier tipo,
la interaccin puede cambiar la intensidad, direccin, longitud de onda o la fase de la luz incidente. La absorcin,
dispersin y luminiscencia de la luz son tres de los muchos
efectos pticos que se han explotado con ms frecuencia
con propsitos analticos. La mayor parte de las mediciones cuantitativas hechas en laboratorios de bioqumica
clnica se fundamentan en la elaboracin de productos de
reaccin teidos, as que es muy frecuente que se utilicen
dispositivos fotoelctricos de absorbancia como colormetros o espectrofotmetros. Otros mtodos de amplio uso
basados en la medicin de la luz incluyen la turbidimetra,
nefelometra, fluorimetra y la medicin de la quimioluminiscencia. Las caractersticas esenciales de estas tcnicas
se discuten en este captulo.
Tcnicas de absorcin de la luz

La fotometra de absorcin es la base de la mayor parte
de los anlisis cuantitativos realizados en laboratorios de
bioqumica clnica. Las razones primarias para emplear
esta tcnica son la facilidad de la medicin, la exactitud y
la precisin satisfactorias, y la instrumentacin, la cual es
estable, confiable y relativamente econmica.
Fotmetros y espectrofotmetros
Los absorcimetros pueden dividirse en dos tipos bsicos:
instrumento de haz sencillo y de haz doble. En cada tipo,
aunque las trayectorias de la luz son diferentes, muchos de
los componentes bsicos son similares. Un fotmetro simple de una viga se ilustra en la figura 41-1. Los bioqumicos
clnicos se refieren con frecuencia a este tipo de fotmetro
como colormetro.
La fuente de luz provee energa radiante sobre las longitudes de onda de inters. Para trabajar en el rango visible,
ahora es comn utilizar las lmparas de tungsteno-cuarzohalgeno. Estas lmparas tambin se utilizan para las mediciones cercanas del infrarrojo y ultravioleta (340 a 800 nm).
Para el trabajo en longitudes de onda UV ms cortas, es
comn que se utilice una lmpara de descarga de deuterio.
Por abajo de 360 nm estas fuentes aportan una continuidad
intensa que, junto con las cubetas de slice fundido, satisface casi todas las necesidades en la regin UV. El suministro
de energa a la lmpara debe ser de alta estabilidad.
396
CAP. 41
ABSORCIN DE LA LUZ, DISPERSIN Y TCNICAS DE LUMINISCENCIA EN BIOQUMICA CLNICA RUTINARIA
Figura 41-1 Componentes bsicos de un fotmetro.
La longitud de onda apropiada para el ensayo particular se

selecciona con filtros de interferencia de amplitud de banda
estrecha y de alta transmitancia. Los filtros de interferencia
son costosos y algunos colormetros econmicos utilizan filtros de cristal coloreado o gelatina teida (intercalada entre
las capas del cristal). Los espectrofotmetros generan luz
monocromtica por medio de un prisma o de un monocromador de rejilla, ms bien que por medio de filtros.
La cubeta es un recipiente transparente que contiene la
solucin que se prev medir. El diseo de la cubeta y los medios de administrar la muestra y posteriormente eliminarla
varan con el tipo de instrumento y de analizador. La solucin
de la muestra, que contiene la cubeta, absorbe una cantidad
proporcional de la radiacin incidente; el resto se transmite a
un detector de luz, donde se genera una seal elctrica.
Muchos tipos de fotodetectores diferentes se emplean en
la actualidad. Ahora, con frecuencia se utilizan varios fotodiodos en estado slido y series de diodos en instrumentos
de luz visible y cerca del infrarrojo. Estos detectores son resistentes, baratos y tienen una respuesta lineal sobre varias
decenas de intensidad de luz. Sin embargo, dan una respuesta inferior a la luz UV. Donde se requiere sensibilidad
alta, y para trabajar con UV, se utilizan tubos fotomultiplicadores de vaco. La salida del detector puede necesitar
amplificarse y que se exprese como su logaritmo para que
sea relacionada linealmente con la concentracin. Ambas
operaciones se realizan por medio de un amplificador logartmico. La seal, despus de algunas transformaciones
necesarias (a menudo de analgicas a digitales), puede exhibirse en el aparato, imprimirse o almacenarse.
Instrumentos de haz sencillo
En los instrumentos de haz sencillo un blanco (p. ej., una
cubeta que contiene agua) se utiliza para fijar a cero, entonces los estndares y las muestras son ledas. Interferencias
por variaciones en la turbiedad de la muestra y los cambios
de intensidad de la fuente y otras fluctuaciones del instrumento no se compensan de manera automtica. En algunos
diseos modernos, un segundo detector se emplea para monitorear la intensidad de la fuente de luz y compensar electrnicamente la desviacin de la lmpara. Los instrumentos
de haz sencillo estn bien adaptados para las mediciones
cuantitativas de absorcin en una sola longitud de onda. El
fcil mantenimiento y bajo costo son ventajas distintivas de
este tipo de fotmetro, que se encuentra en la mayor parte
de los analizadores automticos de la qumica clnica.
Espectrofotmetros de haz doble
Un instrumento de haz doble tiene dos trayectorias de luz,
ambas se originan a partir de la misma fuente. Un haz pasa
a travs de la cubeta de la muestra y el otro por la cubeta
del blanco o de referencia. Esto normalmente se consigue
dirigiendo el haz de luz desde el monocromador hacia un
espejo que rota muy rpido o hacia un interruptor que dirige la luz de manera alterna hacia la cubeta de referencia y a
la cubeta de la muestra. La luz que emerge de cada cubeta
se refleja hacia el detector. La salida del detector es, por
tanto, una seal que se alterna con una amplitud proporcional al cociente de las intensidades del haz de la muestra y
del haz de referencia. Las seales elctricas que se producen se procesan electrnicamente para dar la absorbancia
en un dispositivo de lectura. Sistemas de haz doble automticos corrigen los cambios en la intensidad de la luz a
partir de la fuente lumnica, fluctuaciones electrnicas en
el instrumento y absorcin por el blanco. Un instrumento
de esta clase se consigue con frecuencia con un monocromador impulsado por motor, de modo que la exploracin
y la grabacin automticas de un espectro completo sean
posibles. Esto permite su uso para el anlisis cualitativo (p.
ej., identificacin del frmaco) y el cuantitativo.
Ley de Beer
La base matemtica para las mediciones cuantitativas se
basa en la derivacin experimental de la relacin Beer-
TURBIDIMETRA Y NEFELOMETRA
Lambert. La ley de Lambert indica que la proporcin de

energa radiante absorbida por una sustancia es independiente de la intensidad de la radiacin incidente. La ley de
Beer indica que la absorcin de energa radiante es proporcional al nmero de molculas en la trayectoria de la
luz. No es posible medir de forma directa la cantidad de
radiacin absorbida por una sustancia y es normal que se
determine midiendo el cociente de radiacin incidente que
cae sobre la muestra, I0, y la radiacin transmitida, que al
final emerge de la muestra, I. Usando estas mediciones, la
ley de Beer-Lambert se puede expresar como:
Log10(I0/I ) ecI
donde c es la concentracin de la sustancia en moles/litro,
I es la longitud de la trayectoria ptica en centmetros y e
es el coeficiente de absorcin molar para la sustancia, expresado en litros/mol/centmetro. Los valores para I y I0 no
pueden medirse en trminos absolutos y las mediciones se
hacen de una forma ms conveniente expresando I como un
porcentaje de I0. Este valor se conoce como transmitancia
porcentual T, y da una relacin lineal con la concentracin
si el logaritmo de su recproco se utiliza. Esta funcin logartmica recproca de I y de I0, se conoce como absorbancia
(A):
%T (I/I0) 100
A log10(100/T) log10 (I0/I)
La absorbancia es un parmetro ms conveniente puesto
que, a partir de la ley de Beer, es directamente proporcional
a la concentracin de las especies absorbentes.
Los espectrofotmetros son por lo comn lineales sobre
el rango 0 a 2 , y los cromforos pueden medirse en concentraciones tan bajas como 10-6 mol/L. Los valores de la
prueba se calculan comparando las lecturas de absorbancia
de las muestras de la prueba con las que se obtienen ensayando una serie de estndares o calibradores de valores
conocidos.
Aplicaciones
En la mayor parte de las determinaciones realizadas en
laboratorios de bioqumica clnica se confa en mtodos fotomtricos. Un laboratorio tpico de hospital provee informacin de casi 5 000 anlisis fotomtricos/da y puede incluir
la medicin de algunos de los analitos siguientes: albmina,
bilirrubina, calcio, colesterol, creatinina, glucosa, hierro,
fosfato, protena total, urea, cido rico y muchas enzimas,
por ejemplo, fosfatasa cida, fosfatasa alcalina, alanina transaminasa, creatina cinasa y lactato deshidrogenasa.
397
Estas tcnicas relacionadas se emplean mucho en los laboratorios clnicos como los medios de conducir ciertos
inmunoensayos. Ambas se basan sobre la medicin de la
dispersin de la luz inducida por partculas. Cuando la luz
se dirige a travs de una solucin que contiene partculas
suspendidas, parte de la luz se dispersa, otra se absorbe y
el resto se transmite a travs del lquido. Esta interaccin
puede utilizarse para medir la concentracin de partculas
en la suspensin por la medicin de la luz transmitida (turbidimetra) o midiendo la luz dispersada (nefelometra).
La dispersin de la luz implica una interaccin directa
entre la luz y la partcula que golpea. Cuando un haz de luz
golpea una partcula, su campo elctrico mueve los electrones de la partcula en una direccin prxima al ncleo. Los
electrones se mueven hacia adelante y en reversa en fase con
la frecuencia de la onda de la luz incidente. Esto produce
un dipolo oscilante, cuyo tamao depende de la fuerza del
campo elctrico (relacionado con la frecuencia) y de la polaridad de los electrones de la partcula. El dipolo oscilante
se convierte en una fuente de radiacin electromagntica e
irradia luz, de la misma frecuencia que la luz incidente pero
en todas direcciones. La cantidad y distribucin de la luz
dispersada tambin depende del tamao y de la concentracin de la partcula, y de la polarizacin del haz de luz.
Para las partculas ms pequeas que un dcimo de la
longitud de onda de la luz incidente, las ondas de luz reirradiadas estn en fase y se refuerzan una con otra, produciendo un simtrico, aunque no esfrico, patrn de luz
dispersa. Esto se llama dispersin de Rayleigh. Partculas
ms grandes (p. ej., complejos inmunoglobulina-antgeno)
actan como fuentes del punto aleatoriamente espaciadas,
y la interferencia destructiva entre la luz que emerge de
diversos sitios dentro de la partcula ocurre, creando un
patrn mximo y mnimo de la luz reirradiada. Se conoce
como la dispersin de Rayleigh-Debye y, junto con la dispersin de Rayleigh, se ilustra en la figura 41-2. Entre ms
luz se dispersa hacia adelante el tamao de la partcula se
incrementa, y la medicin de la dispersin de luz asimtrica se puede utilizar para medir el tamao de la partcula. La
luz de longitud de onda corta (azul) se esparce mucho ms
que la luz de longitud de onda ms grande (rojo).
Aplicaciones
Los inmunoensayos que implican sistemas de deteccin
nefelomtricos o turbidimtricos, o ambos, se utilizan para
medir ciertos analitos para los cuales ningn reactivo colorimtrico especfico est disponible, por ejemplo, protena
C reactiva (CRP), componentes C3 y C4 del complemento,
398
CAP. 41
e inmunoglobulinas individuales. Se mezclan la solucin

de la protena y el anticuerpo apropiado y se dejan que reaccionen para formar complejos grandes que dispersan ms
luz que un anticuerpo o la protena. La sensibilidad est por
lo comn dentro del rango bajo mg/L. La dispersin grande
de luz que se produce cuando el cloruro de cetilpiridinio
se agrega a la orina que contiene mucopolisacridos es un
ejemplo de un uso no inmunolgico de la turbidimetra.
Turbidmetros
Figura 41-2 Patrones de la distribucin angular bidimensionales para: a) Dispersin de luz Rayleigh a partir de una partcula
pequea. b) Dispersin de luz Rayleigh-Debye a partir de una
partcula ms grande, inmunoglobulina-antgeno.
En teora, la turbidimetra puede medirse por cualquier

fotmetro o espectrofotmetro estndar. Debido a que un
pequeo cambio en la luz transmitida se mide en presencia
de una seal grande del fondo, los instrumentos con un cociente seal:ruido alto son deseables. Un turbidmetro especializado simple consiste en una fuente de luz halgena
de cuarzo, un filtro de interferencia de banda estrecha, una
pinza de sujecin para la cubeta de la muestra y un fotodiodo o un fotomultiplicador (fig. 41-3) de la cubeta de la
muestra. El uso de la luz de longitud de onda corta ofrece
la ventaja del incremento de la dispersin y por tanto de
una seal ms grande, pero en soluciones biolgicas la absorcin de luz tambin aumentar. Consecuentemente la
formacin del complejo antgeno-anticuerpo por lo general
se mide en el rango 340 a 400 nm. Para una buena medicin
es necesario una sincronizacin, la adicin, el mezclado y
Figura 41-3 Componentes bsicos de un turbidmetro, que mide la luz transmitida, y un nefelmetro que mide la dispersin de luz.
LUMINISCENCIA
la lectura del reactivo. Cuando el tamao de la partcula

aumenta de manera lenta con el tiempo, la tasa de disminucin en la luz transmitida se calcula de mejor manera a
partir de mediciones multipuntuales. Los analizadores fotomtricos discrecionales automatizados son utilizados de
manera extensa por inmunoensayos turbidimtricos.
Nefelmetros
Los nefelmetros comprenden una fuente de luz, un filtro
de la luz incidente, un dispositivo de sujecin de la muestra
y un detector en ngulo fijo, para evitar la transmisin directa de la luz. Con tal de que los filtros (o los monocromadores) para las luces incidente y emitida se fijen a la misma
longitud de onda, pueden usarse fluormetros en los cuales
la luz dispersa se mide a 90, aunque con sensibilidad limitada. La dispersin de luz medida a 90 es ms dbil
que la dispersin de luz hacia adelante. En teora, la mejor
sensibilidad se obtiene colocando el ngulo del detector tan
cerca a 180 como sea posible. Esto requiere un haz de luz
incidente enfocado firmemente y una ptica excelente. En
la prctica, los nefelmetros clnicos emplean ngulos del
detector entre 90 y 170 al eje de la luz del incidente (vase fig. 41-3). Las mediciones nefelomtricas en ngulos,
excepto el de 90 para la luz incidente se mejoran a partir
de cubetas de perfil redondo que sustituyen a las de perfil
cuadrado. A estos ngulos del detector, las cubetas redondas reducen al mnimo la reflexin de la luz medida por las
paredes de la cubeta. Los nefelmetros con frecuencia se
ajustan con un filtro de corte para evitar que la luz fluorescente alcance el detector.
Un bulbo de halgeno-cuarzo-tungsteno, se utiliza con
frecuencia. Las fuentes alternativas incluyen lmparas de
xenn y de arco de mercurio, diodos que emiten luz y lseres. El lser de helio-nen es en especial til para la nefelometra porque tiene un haz estrecho de alta intensidad, que
no requiere enfocarse o una ptica para enfocar. Desafortunadamente, la luz roja de longitud de onda larga (632.8
nm), no se dispersa tanto como la luz de longitud de onda
corta. El detector debe blindarse de forma correcta para reducir al mnimo la interferencia a partir de la desviacin
de la luz. Para la sensibilidad mxima, los nefelmetros
especializados emplean detectores fotomultiplicadores de
bajo ruido.
La longitud de onda para la dispersin ptima por complejos anticuerpo-antgeno en su totalidad formados se
acerca a 460 nm. Sin embargo, en inmunoensayos cinticos
se ha demostrado que la longitud de onda ptima cambia
mientras los complejos inmunitarios se elevan. Para estos
ensayos, muy utilizados, la luz monocromtica es indeseable y la luz incidente sobre una banda amplia (entre 450 y
550 nm) aporta tasas mximas ms reproducibles.
399
El equipo Beckman Immage es un ejemplo bien establecido de un nefelmetro del laboratorio clnico. La dilucin automtica de la muestra, la adicin del antisuero y
la verificacin del exceso de antgeno son algunas de las
caractersticas de este tipo de analizador especializado. La
diferenciacin electrnica de la seal de luz se utiliza para
identificar y registrar la tasa mxima de reaccin y, a travs
de una curva de calibracin almacenada, para relacionarla
con la concentracin.
Nefelometra o turbidimetra?
En general, la nefelometra tiene el potencial para ser ligeramente ms sensible y proporciona resultados ms rpidos
que la turbidimetra. sta, por otra parte, no requiere un
detector especial y puede realizarse en muchos de los analizadores clnicos automticos disponibles en la actualidad
que emplean la medicin fotomtrica.
Luminiscencia
La luminiscencia es la emisin de luz o energa radiante que
surge cuando un electrn vuelve desde un nivel de energa
excitado o ms alto a un nivel de energa ms bajo. Existen varios tipos de fenmenos luminiscentes, que incluyen
la fluorescencia, la fosforescencia y la quimioluminiscencia. Aunque los fenmenos luminiscentes se diferencian
en cmo un electrn es activado al estado excitado, producen emisiones similares de energa radiante.
Fluorescencia
Cuando la luz choca con una sustancia molecular, bastante
energa a una longitud de onda especfica puede absorberse
y ocasionar que la sustancia altere su configuracin electrnica colocando algunos de los electrones en un estado
excitado. Esta condicin es de breve duracin y los electrones excitados vuelven rpido al estado fundamental.
Si la sustancia es de una estructura qumica particular, la
transicin puede ser un proceso multietapa, en cuya etapa
principal libera luz emitida con una energa ms baja que
la luz de excitacin. Los otros pasos en la transicin al
estado fundamental son sobre todo la prdida de energa
vibratoria, debido a las colisiones del electrn. La luz emitida que se produce cuando la sustancia pasa de un estado excitado al estado fundamental se llama fluorescencia.
Muchas molculas muestran fluorescencia (fluorforos)
que proporciona la base de un mtodo sensible de cuantificacin. La mayor parte de los compuestos que exhiben
fluorescencia contienen por lo general sistemas de unin
400
CAP. 41
mltiple conjugado con electrones sin localizacin relacionados. Casi todos los fluorforos que despiden luz
fluorescente intensa tienen estructuras planares rgidas y
grupos donadores de electrones. Para soluciones diluidas,
la intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional a la concentracin del fluorforo. Los mximos de
longitud de onda de la absorcin y de la emisin son tambin tiles en la identificacin de sustancias. La diferencia
entre los mximos de la longitud de onda de excitacin y
de la emisin es conocida como el cambio de Stokes, y la
eficiencia del quanto es una medida de la cantidad de
luz emitida. Si el cambio de Stokes es grande, es ms fcil
medir la luz emitida sin interferencia de la luz incidente.
Tambin, si la eficiencia del quanto es alta, la seal es ms
fuerte y el ensayo ms sensible. El anlisis sanguneo y de
orina para porfirinas es un buen ejemplo del uso cualitativo
y cuantitativo de la fluorescencia.
Fluorescencia en comparacin con fotometra
Las mediciones de la fluorescencia son ms sensibles que las
mediciones de la absorbancia y de la dispersin de la luz. La
magnitud de la absorbancia de un cromforo en la solucin es
determinada por su concentracin y la longitud de la trayectoria de la cubeta. La magnitud de intensidad de la fluorescencia de un fluorforo es determinada por su concentracin,
la longitud de la trayectoria y la intensidad de la fuente de luz.

Para las soluciones diluidas, la intensidad de la fluorescencia
es directamente proporcional a la concentracin del fluorforo. Con el uso de fuentes de luz ms intensas, de tcnicas
de filtracin de la seal digital y de fotmetros de emisin
sensible, la sensibilidad de las mediciones de la fluorescencia
puede ser 100 a 1 000 veces ms grande que la sensibilidad
de las mediciones de la absorbancia.
Aplicaciones de fluorescencia
Los ensayos que emplean tcnicas de medicin fluorescente
se utilizan de rutina en el laboratorio clnico para determinar porfirinas, frmacos, hormonas, protenas especficas y
anticuerpos, y para la fenotipificacin celular. Los mtodos
usados incluyen la medicin directa de la luz emitida y una
variedad de inmunoensayos que usan tcnicas como polarizacin fluorescente, fluorescencia de tiempo resuelto,
fluorescencia/citometra de flujo inducida por lser y, en
los laboratorios de serologa, la microscopia fluorescente.
Fluormetros
La figura 41-4 ilustra el arreglo ptico en un fluormetro
simple. La longitud de onda de excitacin apropiada se fil-
Figura 41-4 Componentes bsicos de un fluormetro
LUMINISCENCIA
tra desde la fuente y se dirige dentro de la solucin contenida en la cubeta. La luz fluorescente resultante se emite
en todas las direcciones, pero es importante monitorear la
luz que emerge perpendicular al haz incidente, la parte sin
absorber que pasa a travs de la cubeta y entra a una trampa de luz. La emisin de la longitud de onda se selecciona
a partir de luz emitida o secundaria y el haz se dirige hacia el detector, por lo comn un fotomultiplicador. La salida de ste se amplifica y procesa tanto como se necesite. Si
el aumento del amplificador y la fuente de excitacin son
constantes, la lectura de la seal fluorescente se relaciona
de manera lineal con la concentracin. Un espectrofluormetro emplea monocromadores en vez de filtros para la
seleccin de la longitud de onda.
Los fluormetros de primera generacin empleaban
con frecuencia lmparas de vapor de mercurio. Estas lmparas tienen su salida concentrada dentro de una cantidad
relativamente pequea de bandas finas muy definidas que
limitan la seleccin de la longitud de onda de excitacin.
Una fuente de alta intensidad con un espectro casi continuo es el arco de xenn. Sin embargo, esta fuente genera ozono y funciona con una temperatura muy elevada.
La mayor parte de los fluormetros dirigidos al mercado
clnico usan una lmpara de halgeno-tungsteno o, para
mayor sensibilidad, un tubo de destello de xenn que proyecta rpidamente.
Espectrofluormetros de doble haz. En estos instrumentos, el haz de luz de la fuente se divide y se reparte entre
la cubeta de la muestra y una de referencia. La fluorescencia que se produce en cada cubeta es monitoreada por un
tubo fotomultiplicador simple colocado elctricamente en
fase con el interruptor. La seal de la diferencia permite la
sustraccin de la fluorescencia producida en la cubeta de
referencia y tambin compensa la desviacin y el parpadeo
de la lmpara.
Analizadores de polarizacin fluorescente. Estos instrumentos son bsicamente fluormetros de filtro a los cuales se ha incorporado un grupo de polarizadores de luz de
excitacin y de emisin. La intensidad de la fluorescencia
se mide tanto en paralelo como perpendicular al plano del
haz de excitacin. El grado de despolarizacin fluorescente depende de la rotacin molecular, que se relaciona
con el tamao molecular. Esta tcnica se ha aplicado a los
inmunoensayos homogneos (sin separacin). En estas
aplicaciones, por lo comn se realiza un inmunoensayo de
unin competitiva en el cual un antgeno y uno marcado
con fluorescena compiten por los sitios de unin sobre
un anticuerpo. El acoplamiento del marcador fluorescente al anticuerpo grande, que rota de manera lenta, ocasiona
que la luz fluorescente siga con una polarizacin muy alta. Y
401
en sentido inverso, el antgeno no unido marcado con fluorescena est libre para rotar ms rpido y producir fluorescencia despolarizada.
Algunos fluormetros clnicos de este tipo estn especializados para medir slo una especie fluorescente. Por
ejemplo, el sistema del analizador Abbott TDx usa reactivos de inmunoensayo marcados con fluorescena de manera exclusiva. Debido a que la fluorescena se absorbe en
la regin visible, una fuente de luz halgena de tungsteno
puede usarse. Comparado con otras tcnicas fluorimtricas, la sensibilidad es baja y es aplicable slo al ensayo de
molculas pequeas. El analizador de polarizacin TDx
es relativamente simple de operar y es muy til para el monitoreo del frmaco teraputico.
Fluormetros de tiempo resuelto. Un problema encontrado con frecuencia en los inmunoensayos fundamentados en
la fluorescencia (en particular en los ensayos homogneos)
es la alta fluorescencia de fondo causada por algunos de los
componentes en las muestras sanguneas (p. ej., protenas,
bilirrubina y NADH del suero). El uso de mediciones de
tiempo resuelto y marcadores con tiempos largos de decaimiento de la fluorescencia (> 500 ns) han mejorado esta
limitacin. Cuando se emplea esta tcnica, la fluorescencia del analito se monitorea slo despus que la de fondo
ha declinado. Los sistemas automatizados que usan quelatos de lantnido con una muy elevada fluorescencia estn
disponibles en el comercio para una amplia gama de inmunoensayos. En el sistema Perkin-Elmer AutoDELFIA, la
medicin se realiza con un fluormetro de tiempo resuelto
que, por los quelatos de europio, suministra 1 000 pulsos
de luz/segundo. El detector se enciende por 400 microsegundos (s) despus de cada emisin de pulso y recolecta
la luz emitida, a 613 nm, por 400 s (fig. 41-5). Son posibles lmites de deteccin tan bajos como 10-14 mol/L de
quelatos de lantnido.
Quimioluminiscencia
La quimioluminiscencia difiere de la fluorescencia en que
la excitacin es causada por una reaccin qumica o electroqumica y no por fotoiluminacin. El evento fsico de la
emisin de luz es similar a la fluorescencia, en que ocurre
de un estado singlete excitado, y la luz se emite cuando el
electrn vuelve al estado fundamental. La quimioluminiscencia implica normalmente la oxidacin de un compuesto
orgnico, como luminol, steres de acridinio o luciferina,
por un oxidante (p. ej., perxido de hidrgeno, hipoclorito u oxgeno); la luz la emite el producto excitado que
se forma en la reaccin de oxidacin. Estas reacciones se
realizan por lo regular en presencia de catalizadores como
402
CAP. 41
en inmunoensayos ahora domina este sector importante

del mercado de diagnstico global. Los ejemplos de las
tcnicas quimioluminiscentes especficas disponibles en
el comercio se describen en seguida. Los inmunoensayos
quimioluminiscentes son muy utilizados para medir hormonas, protenas especficas y ciertos frmacos. Para una
explicacin de inmunoensayos, vase el captulo 39.
Quimioluminiscencia directa. Los steres de acridinio
son marcadores quimioluminiscentes que pueden unirse de
forma directa a los antgenos o a los anticuerpos e incorporarse en diversas estrategias con inmunoensayos. En la
etapa de generacin de la seal del ensayo, el enlace del
ster se rompe bajo condiciones alcalinas para liberar la
N-metilacridona, compuesto inestable, que se descompone
con la emisin de un flash de la luz. La intensidad mxima
ocurre 0.4 seg despus de la iniciacin, y el periodo del
decaimiento a 0.9 seg. ste es el principio que se emplea
en los sistemas Bayer ACS180 y Centaur.
Figura 41-5 Principio de la fluorometra de tiempo resuelto. El

tiempo de declinacin largo del marcador es medido despus de
que la fluorescencia de fondo se extingue.
enzimas (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rbano),

iones metlicos o complejos metlicos.
Luminmetros
Ya que los inmunoensayos quimioluminiscentes dependen
del uso de compuestos luminiscentes que emiten la luz durante el curso de una reaccin qumica, no hay necesidad
de una fuente de luz incidente. La nica seal que emana de las molculas luminiscentes y, por tanto, debido a
la proporcin alta de seal de ruido, estos ensayos son en
potencia muy sensibles. En principio, la instrumentacin
es relativamente simple, consistiendo en una cubeta para la
reaccin y un dispositivo sensible que mide la luz contenida en un compartimiento hermtico a la luz.
Aplicacin de la quimioluminiscencia
La naturaleza de la emisin de luz de ensayos quimioluminiscentes exige adiciones del reactivo exactas y sincronizadas y procedimientos de mezclado muy reproducibles.
Por tanto, su uso, por lo menos en el laboratorio rutinario,
se confina para utilizarlo en analizadores de inmunoensayos automticos especializados. Su uso como marcadores
Quimioluminiscencia realzada. La adicin de ciertos productos qumicos puede aumentar mucho la salida de la luz,
por ejemplo, la peroxidasa de rbano, en presencia del perxido de hidrgeno, causa la oxidacin del luminol con la
emisin de luz. La salida de la luz se aumenta ms de 1 000
veces en presencia de fenoles y de naftoles sustituidos. La
luminiscencia realzada es un resplandor ms bien que un
flash de la luz y persiste por horas, aunque la lectura de la
seal ocurre despus de algunos minutos. Este tipo de generacin de seal se explota en el sistema de inmunodiagnstico Vitros ECi (Ortho-Clinical Diagnostics).
Inmunoensayos enzimticos quimioluminiscentes. Existen sustratos que dan lugar a lmites luminiscentes para
todos los marcadores enzimticos de uso general, por
ejemplo, el adamantil 1,2-dioxetano arilfosfato se utiliza
con la fosfatasa alcalina como marcador. La separacin del
enlace del grupo fosfato produce un anin inestable que se
descompone con la emisin de luz, por ejemplo, como
se utiliza en el analizador DPC Immulite.
Electroquimioluminiscencia. La electroquimioluminiscencia difiere de la quimioluminiscencia convencional en que
las especies reactivas que producen las reacciones quimioluminiscentes se generan de manera electroqumica a partir
de precursores estables en la superficie de un electrodo. Los
procesos electroquimioluminiscentes se han demostrado
en muchas molculas diferentes por diversos mecanismos,
incluyendo una reaccin tipo oxidorreduccin con rutenio
(Ru2+), tris(bipiridil) y tripropilamina. Este principio se emplea en los analizadores Roche Elecsys y E-170.
Cuando se aplica un potencial elctrico, el marcador de
rutenio se oxida y de forma simultnea la tripropilamina
es tambin oxidada a un catin inestable que pierde de
manera espontnea un protn. El radical de tripropilamina

resultante reacciona con el rutenio oxidado, produciendo
un marcador de rutenio excitado que declina con la emisin
de un fotn. La emisin de luz subsiguiente se mide entonces con un fotomultiplicador y se procesa como apropiado
para la cuantificacin.
403
Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA. Principles of Instrumental
Analysis. 1997: Thomson Learning, Philadelphia, PA.
Wild DG (ed.). The Immunoassay Handbook, 2nd edn. 2001:
Stockton Press, New York.
42
Espectrometra atmica analtica
Andrew Taylor
Introduccin
La espectrometra atmica analtica es el trmino que se
emplea para incluir un nmero de tcnicas que se aplican
de manera extensa para la determinacin de elementos individuales en los lquidos y tejidos corporales. Las ms importantes son la espectrometra de absorcin atmica y la
de masas por plasma inductivamente acoplado, que con
la de emisin atmica, la de fluorescencia atmica y la de
fluorescencia de rayos X tambin tienen papeles tiles. Se
aplican sobre todo en la medicin de minerales esenciales
y oligoelementos, por ejemplo, sodio, magnesio, zinc y cobre, y en sustancias txicas como aluminio y plomo. Estas
tcnicas consideran las mediciones exactas de concentraciones muy bajas en muestras biolgicas complejas.
Principios
La espectroscopia es el estudio de las interacciones entre
la radiacin de la materia y la electromagntica; cuando se
aplica al anlisis cuantitativo, se utiliza el trmino espectrometra. Diferentes tipos de espectrometra conciernen a
varias regiones del espectro electromagntico (p. ej., rayos
X, luz UV, radiacin infrarroja), las propiedades de la materia con las cuales las interacciones suceden (vibracin
molecular, transiciones del electrn) y las interacciones fsicas implicadas (es decir, dispersin, absorcin o emisin
de radiacin).
Las tcnicas espectromtricas atmicas analticas cuantitativas incluyen la espectrometra de absorcin atmica
(AAS), de emisin atmica (AES), de fluorescencia atmica (AFS), de masas inorgnicas y la fluorescencia de rayos
X (XRF). Las AAS, AES y AFS explotan las interacciones

entre la luz UV y la visible y los electrones de la capa exterior de tomos libres, gaseosos y no cargados. En la XRF,
partculas de alta energa colisionan con los electrones de
la capa exterior de los tomos para iniciar las transiciones
que culminan en la emisin de los fotones de rayos X. En la
espectrometra de masa (MS) inorgnica, un campo magntico separa los tomos ionizados del analito de acuerdo a
su masa: proporcin de la carga.
Emisin, absorcin y fluorescencia atmica
Cada elemento tiene una estructura atmica caracterstica,
con un ncleo con carga positiva rodeado por el nmero
de electrones necesario para mantener una neutralidad. Estos electrones ocupan niveles de energa discreta, pero es
posible para un electrn moverse de un nivel a otro, dentro
del tomo, por la introduccin de energa (figs. 42-1, 42-2 y
42-3). Esta energa puede suministrarse durante colisiones
con otros tomos o con electrones libres, o como fotones a
partir de la luz. Tales transiciones ocurren slo si la energa disponible es igual a la diferencia entre los dos niveles
(E). Los tomos no cargados pueden existir en el nivel de
energa ms bajo, o estado basal, o en cualquiera de una
serie de estados excitados dependiendo de cuntos electrones se mueven a niveles de energa ms altos, aunque es
normal considerar slo la primera transicin. Los niveles
de energa y las E relacionadas con las transiciones del
electrn son nicas en cada elemento.
La E para los movimientos de los electrones de la capa
exterior en la mayor parte de los elementos corresponde a
la energa equivalente a la radiacin UV visible y son es-
406
CAP. 42
ESPECTROMETRA ATMICA ANALTICA
tas transiciones las que se utilizan en la espectrometra de

AA, AE, y AF. La energa (E) de un fotn se caracteriza
por:
E = hv
(1)
donde h = constante de Planck y v = frecuencia de la forma

de onda correspondiente a ese fotn (el concepto dual de
la luz como la forma de onda y partculas discretas no se
considera ms aqu). Adems, la frecuencia y la longitud
de onda estn relacionadas, ya que:
v = c
(2)
donde c = velocidad de la luz y = longitud de onda. Por

tanto:
E = hc /
(3)
donde se deduce que una transicin especfica, E, se relaciona con una longitud de onda nica.
Bajo las condiciones apropiadas, los electrones de la
capa exterior de los tomos del estado basal, vaporizados
dentro del sistema analtico pueden excitarse por energa
trmica (es decir, colisiones con otros tomos). Como estos
tomos regresan al estado basal ms estable, la energa se
pierde, parte de ella en forma de luz emitida, la cual puede
medirse con un detector (fig. 42-1). La intensidad de esta
Figura 42-1 Diagrama parcial del nivel de energa mostrando la

emisin de energa como luz cuando los tomos descienden desde
un nivel excitado hacia el estado basal.
luz es proporcional al nmero de tomos presentes, y el

proceso es una espectrometra de emisin atmica (AES).
Cuando la luz (energa radiante) de una longitud de
onda caracterstica entra en un sistema analtico, los electrones de la capa exterior de los tomos que estn dentro
de la trayectoria de la luz se excitan cuando la energa se
absorbe (fig. 42-2). Por consecuencia, la cantidad de luz
transmitida por el sistema desde una fuente hacia el detec-
Figura 42-2 Diagrama parcial del nivel de energa mostrando

la absorcin de la energa de luz cuando los tomos se mueven
desde el estado basal hacia un nivel excitado. La luz transmitida
hacia el detector se ha atenuado.
tor se atena. La prdida de luz es proporcional al nmero

de tomos y se entiende como espectrometra de absorcin
atmica (AAS).
Parte de la energa radiante que absorben los tomos
del estado basal puede emitirse como luz cuando los tomos retornan al estado basal. Esta emisin se describe
como fluorescencia de resonancia y, de nuevo, su intensidad es proporcional al nmero de tomos que estn en la
trayectoria de la luz. La tcnica se conoce como espectrometra de fluorescencia atmica (fig. 42-3).
Figura 42-3 Diagrama parcial del nivel de energa mostrando

la absorcin de la energa de luz cuando los tomos se mueven
desde el estado basal hacia un estado excitado, seguido por la
emisin de energa (luz) cuando los tomos vuelven a descender
al estado basal.
De las ecuaciones (1) y (2) se deduce que las longitudes

de onda de la luz absorbida y emitida son las mismas, y
nicas, para un elemento dado. Esto es lo que hace a las
AAS, AES y AFS especficas, de modo que un elemento
puede medirse aun con la presencia de un exceso enorme
de un elemento qumicamente similar.
La ecuacin de Boltzmann (Haswell, 1991) relaciona
las energas con estados diferentes a la estructura atmi-
407
INSTRUMENTACIN
ca y, desde la ecuacin, la proporcin de una poblacin

atmica presente, como tomos excitados, comparada con
los tomos del estado basal puede calcularse. La proporcin est influida por dos caractersticas, la temperatura y
el elemento. En las temperaturas operativas tpicas, la proporcin es al menos de 10 6:1 para la mayor parte de los
elementos, y las AAS y AFS proporcionan sensibilidad superior a la AES. Con los sistemas que proveen temperaturas ms altas (vase Instrumentacin) la proporcin cambia
y la AES puede ser favorecida. Las estructuras atmicas de
los metales alcalinos (p. ej., sodio, potasio, litio) son tales
que las E son relativamente pequeas, correspondiendo
a longitudes de onda ms largas, y aunque a unos 2 000C
la proporcin de tomos excitados no es alta (de 104 a
106:1), las concentraciones de sodio y potasio en las muestras biolgicas son suficientes para que la AES de flama
(tambin denominada fotometra de flama) sea una tcnica
conveniente y bien establecida para medir estos metales en
los laboratorios clnicos.
La espectrometra de absorcin atmica puede utilizarse para determinar ms de 60 elementos con instrumentos
que son relativamente econmicos y simples de manejar,
y la cual provee suficiente sensibilidad para medir muchos
de estos elementos en las concentraciones presentes en las
muestras clnicas (Haswell, 1991). Un rango similar de elementos puede medirse con la espectrometra de emisin
atmica. La fotometra de flama es conveniente para los
metales alcalinos en concentraciones altas, pero la AES es
ms til con fuentes de energa de alta temperatura (vase Instrumentacin) cuando el anlisis multielemento puede emprenderse. La fluorescencia atmica efectiva requiere
fuentes de luz intensa, estable y stas son difciles de construir fiablemente. El mayor xito se obtiene con lmparas
de descarga sin electrodos para los elementos metaloides de
los grupos 4 a 6 de la tabla peridica. Lmites de deteccin
muy bajos se alcanzan para estos elementos con la AFS.
Fluorescencia de rayos X
Cuando los fotones, electrones o protones de alta energa golpean una muestra slida, un electrn de las capas
interiores (K, L o M) de un tomo constitutivo puede ser
desplazado. La vacante orbital que surge la ocupa un electrn de la capa exterior; con la emisin acompaante de
un fotn de rayos X, esta energa es igual a la diferencia
entre los niveles de energa implicados. Esta emisin se conoce como fluorescencia de rayos X (XRF). La energa de
emisin, es decir, la longitud de onda, es una caracterstica
del tomo (elemento) a partir del cual se origina, mientras
la intensidad de la emisin se relaciona con la concentracin de los tomos en la muestra. Dependiendo del tipo
de espectrmetro que se emplee para medir la emisin, la
XRF se caracteriza como de longitud de onda dispersiva

(WDXRF) o de energa dispersiva (EDXRF). La XRF por
reflexin total (TXRF) se describe como una tcnica, aunque es una variacin de EDXRF.
Espectrometra de masas inorgnica
Puesto que las muestras se toman a altas temperaturas, los
componentes orgnicos se destruyen, algunos o la totalidad de los elementos inorgnicos se ionizan. Cuando estos
iones se controlan con un espectrmetro de masas, pueden
separarse al pasar por un campo magntico establecido por
un cuadrupolo o algn otro filtro de masa. Estos iones separados de acuerdo a la masa, cociente (m/z) de carga, se
detectan y contabilizan usando un multiplicador de electrones. Este proceso por lo general se describe como espectrometra de masas inorgnica o atmica.
Se han empleado varias fuentes de iones, pero para el
manejo ms reciente del anlisis clnico se usa un plasma
inductivamente acoplado (ICP-MS). La tcnica es un verdadero multielemento y provee lmites de deteccin que
estn en el rango de g/L o, en especial para los elementos
con nmero de masa atmica alto, todava ms bajos. Los
elementos que hasta la fecha se han determinado pueden
ahora ser cuantificados con confianza. La otra caracterstica principal de la espectrometra de masas es la capacidad
para medir istopos diferentes del mismo elemento.
Instrumentacin
Absorcin atmica
Un espectrmetro de absorcin atmica consiste de los siguientes mdulos:
Fuente
de luz
Atomizador
Monocromador
Detector
Lectura/
visualizador
donde el monocromador, el detector y el visualizador son

similares a los de otros espectrmetros. La caracterstica
esencial de una fuente de luz ptima para la AAS se consigue
suministrando una potencia monocromtica de alta intensidad, con lmparas de ctodo hueco, las cuales se construyen con el elemento a medirse como un componente principal del ctodo, de modo que la luz emitida es de la misma
longitud de onda que se requiere para la absorcin atmica
por la muestra. Por consiguiente, se requiere una lmpara
diferente para cada elemento que se mide, y por los costos
implicados, un rango comprensivo de lmparas se mantiene por lo general en pocos laboratorios especializados.
408
CAP. 42
El atomizador es cualquier dispositivo que genera tomos del estado basal como un vapor dentro de la trayectoria de la luz instrumental. Si se considera el calcio en una
muestra de suero, el elemento est presente en la solucin,
ligado a la protena, junto con el fosfato y parte del Ca2
inorgnico. La formacin del vapor atmico (atomizacin)
requiere de los siguientes pasos:
Eliminacin del solvente (secado).
Separacin del anin u otros componentes de la matriz
Ca2.
Reduccin: Ca2 2e
Ca.
La energa necesaria para realizar estos pasos se suministra

como calor, ya sea de una flama o de un horno elctrico.
Al final, dentro del atomizador hay absorcin de la energa
radiante.
Atomizadores de flama
La disposicin tpica de este atomizador implica un nebulizador neumtico, cmara de premezclado y una flama de
acetileno laminar con una longitud de la trayectoria de 10 cm
(fig. 42-4). El flujo de aire de alta velocidad auxiliar causa
la dilucin de la muestra al aspirarse de forma continua por

capilaridad, debido al efecto Venturi. La muestra emerge
del nebulizador, como un aerosol con un amplio rango de
tamaos de gotitas, que se mezcla con los gases de la flama
y se transporta a la flama para la atomizacin. Sin embargo,
slo las gotitas menores de 10 m en realidad entran a la
flama, porque aquellas de tamao ms grande caen hacia los
lados de la cmara de premezclado y se desperdician. Por
consiguiente, menos de 15% de la muestra entra a la flama.
As, con el nebulizador neumtico, la muestra original experimenta dilucin con los gases de la flama, prdidas en la
cmara de premezclado y considerable expansin trmica
(es decir, dilucin adicional) dentro de la flama. Adems de
la dispersin de la muestra a travs de la flama, hay prdidas
de tomos debido a la formacin de xidos u otras especies
en los mrgenes de la flama. La tasa normal de captacin de
la muestra del nebulizador es de casi 5 ml/min y se necesita
una aspiracin por varios segundos para lograr una seal
constante.
Las ventajas y desventajas del sistema de atomizacin
con nebulizador neumtico de flama se muestran en el
cuadro 42-1. Por su sencillez, velocidad y libertad de interferencias, este planteamiento se prefiere donde la concentracin del analito es apropiada. Las concentraciones
tpicas ms bajas que pueden determinarse se aproximan a
1 g/ml. El aire acetileno se quema a casi 2 000C, en tanto que la flama de xido nitroso acetileno es ms caliente,
Flama
Mechero
Mezclado del
aerosol y los
gases de la flama
Combustible y
oxidante auxiliar
Nebulizador
Cmara de
premezclado
Muestra
Desechos
Ampliacin de A
Muestra
Aerosol
Gas de soporte
Figura 42-4 Diagrama de un nebulizador neumtico, cmara de premezclado y mechero; la imagen inferior muestra el nebulizador con
ms detalle.
409
INSTRUMENTACIN
Trayectoria
de la luz
Tubo de slice
calentado
Cuadro 42-1 Caractersticas de la nebulizacin neumtica con

atomizacin por flama
Rpida
Reproducible
Poca interferencia
Seal constante
Slo 15% de la muestra entra en la

flama
Amplio rango del tamao de las gotitas
Densidad atmica baja de la muestra
en la flama
Las condiciones del mechero imponen
limitaciones sobre el nebulizador
N2
Hidruro, por
ejemplo, AsH3
tiene una temperatura cercana a 3 000C y se utiliza en los

elementos que forman xidos refractarios y no tienen una
atomizacin eficaz en la flama de aire acetileno.
Una mejora en la sensibilidad se obtiene con dispositivos que superan las limitaciones de los nebulizadores
neumticos listados antes. Estos: a) atrapan tomos para
dar una densidad ms grande dentro de la trayectoria de la
luz, b) circunvalan el nebulizador, de modo que 100% de
la muestra se atomiza, y c) introducen la muestra como un
impulso simple, rpido, ms bien que como un flujo continuo. Algunos emplean una combinacin de estas caractersticas. Los dispositivos que se utilizan en una flama, por
ejemplo, el tubo ranurado de cuarzo y la cubeta de Delves,
son ms eficaces con los elementos ms voltiles, como el
zinc, el cadmio y el plomo. Estos tres planteamientos para
mejorar la sensibilidad tambin figuran en otros atomizadores utilizados en las AAS, AES, AFS, ICP-MS.
Generacin de hidruros
Ciertos elementos, como arsnico, selenio y bismuto forman con facilidad hidruros gaseosos, por ejemplo, la arsina (AsH3). Usando instrumentacin adicional simple,
un reductor, como el borohidruro de sodio, se agrega al
matraz de reaccin que contiene la muestra acidificada. El
hidrgeno se forma y ste reacciona con el analito, se desarrolla el hidruro gaseoso y se transfiere por un flujo de
gas inerte hacia un tubo de slice calentado ubicado en la
trayectoria de la luz. El tubo se calienta con una flama de
aire acetileno o una corriente elctrica y la temperatura es
suficiente para causar la disociacin del hidruro y la atomizacin del analito (fig. 42-5). As, no hay prdida de la
muestra, todos los tomos entran a la trayectoria de la luz
en unos pocos segundos, y son atrapados dentro del tubo de
slice, que retarda su dispersin. La generacin de hidruros por AAS permite la deteccin de unos cuantos nanogramos de analito a partir de cualquier volumen de muestra
que se coloca en el matraz de reaccin. Las variaciones de
la instrumentacin son posibles para procurar una disposicin de flujo continuo, que es ms sencillo de automatizar.
Matraz de reaccin
NaBH4
Muestra acidificada
Figura 42-5 Diagrama de un sistema para la generacin del hidruro y atomizacin.
Generacin de vapor de mercurio

El mercurio forma un vapor a la temperatura ambiente y esta
caracterstica es la base para la generacin de vapor fro. Un
agente de reduccin se agrega a la solucin de la muestra
para convertir el Hg2+ a mercurio elemental. La agitacin o
el burbujeo del gas a travs de la solucin producen la vaporizacin rpida del mercurio atmico, que entonces se transfiere a una celda, a travs del flujo, puesta en la trayectoria de
la luz (fig. 42-6). Como ocurre en la generacin del hidruro,
el lmite de deteccin es de unos pocos nanogramos y la instrumentacin comn para lograr ambos procedimientos la
han desarrollado algunos fabricantes.
Trayectoria de la luz
Desechos
Aire empujado a
travs del sistema
Trampa fra para

colectar el vapor
de agua
Muestra + agente de reduccin

Hg2+ + 2e S Hg
Figura 42-6 Diagrama de un sistema para la generacin de vapor de mercurio.
410
CAP. 42
Atomizacin electrotrmica
La mayor parte de los sistemas utiliza un tubo de grafito
calentado elctricamente; esta tcnica a menudo se denomina atomizacin con horno de grafito, aunque se emplean
a veces diversos materiales. El contacto elctrico se hace
con el horno y se aplica un voltaje. La resistencia al flujo de corriente provoca el aumento de la temperatura del
horno (como con el elemento de una estufa elctrica). Una
secuencia programada de la temperatura (fig. 42-7) puede
flama, el anlisis puede ser automatizado, y los instrumentos modernos se suspenden al final de una corrida, de modo
que la operacin de toda la noche sin vigilancia es posible. La atomizacin electrotrmica de la AAS (ETAAS)
est sujeta a mayores interferencias que la AAS de flama
y se requieren varios procedimientos para eliminarlas o
compensarlas. De la misma manera, se utilizan formas
diferentes de materiales de grafito (electrografito, grafito
pirolticamente recubierto y grafito piroltico total), y el diseo del horno y el calentamiento pueden optimizarse para
promover la atomizacin y reducir las interferencias. El
establecimiento del detalle metodolgico y de la atencin
cuidadosa cuando el instrumento se suspende cada da es
necesario para obtener resultados correctos y precisos. Los
estudios de funcionamiento del laboratorio demuestran que
tal destreza se encuentra en centros donde el anlisis del
oligoelemento es una actividad principal.
Interferencias
Figura 42-7 Un ejemplo de un programa de calentamiento simple para la atomizacin electrotrmica.
establecerse de modo que la solucin puesta dentro del horno se seque cuidadosamente; el material orgnico entonces
se destruye y los iones del analito se disocian de los aniones. Con un aumento rpido en la temperatura, los iones se
reducen a tomos del estado basal por la absorcin de luz.
Un aumento pequeo adicional de la temperatura asegura
que el tubo de grafito est limpio para la muestra siguiente.
Las temperaturas de atomizacin que pueden alcanzarse
por esta tcnica, hasta 3 000C, permite que los elementos refractarios como el aluminio y el cromo sean posible
medirlos. Por lo comn, slo 10 a 50 l de la muestra se
inyecta en el horno, as las muestras muy pequeas pueden
acomodarse, y porque toda la muestra se atomiza dentro
de un volumen pequeo, una poblacin densa del tomo se
produce en la trayectoria de la luz. La tcnica es, por tanto,
muy sensible, lo que permite la medicin de las concentraciones en g/L. Aunque es lento comparado con la AAS de
La mayor parte de las tcnicas pueden considerarse razonablemente maduras; en ellas las interferencias se subentienden y hay procedimientos para superarlas. Los dispositivos
que implican el flujo de soluciones, como en los nebulizadores o los sistemas de inyeccin de flujo, proveen resultados
errneos si las muestras y los elementos de calibracin tienen viscosidades desiguales, causando diferentes ritmos de
introduccin en el analizador. Donde ocurre esto, estrategias como la estandarizacin interna, la incorporacin de
estndares o la adicin de reactivos para igualar los ritmos
de flujo proporcionan determinaciones exactas. Las interferencias qumicas influyen en el ritmo de la atomizacin.
El calcio ligado al fosfato en el suero no se separa por completo a 2 000C y enva una seal ms baja que una concentracin equivalente de un calibrante acuoso. La adicin de
un agente de emisin, como el La3+, que se liga al fosfato,
evita esta interferencia. Las interferencias qumicas tambin ocurren dentro del horno de grafito, como la matriz de
la muestra que causa que los tomos del analito se volatilicen y se pierdan durante la fase de incineracin. Los modificantes qumicos se agregan para estabilizar los tomos o
para facilitar la eliminacin de la matriz, o ambas, en una
etapa temprana del ciclo de calentamiento. Las interferencias ms difciles son aquellas que causan la absorcin no
atmica del haz de luz y son por lo comn un resultado de
la naturaleza compleja de los fluidos biolgicos. La compensacin para la absorcin no atmica se logra usando
modificantes qumicos para promover la destruccin de la
matriz orgnica, con dispositivos para establecer las condiciones de la atomizacin isotrmica y con las tcnicas de
correccin del fondo (cuadro 42-2).
411
INSTRUMENTACIN
Cuadro 42-2
Planteamientos para eliminar la absorcin no atmica
Tcnica
Motivo
Ejemplos
Modificantes qumicos
Promover la destruccin de la matriz de la muestra

Retrasar la atomizacin del analito
Reducir las interacciones de la fase de vapor retrasando
la atomizacin hasta que el horno alcance
temperatura constante
Medir por separado la absorcin total y la no atmica;
la diferencia = absorcin atmica
O2, Mg(NO3)2, (NH4)2HPO4

Pd2+, Ru2+
Plataforma LVov, sonda de grafito,
hornos originales
Atomizacin isotrmica
Correccin del fondo
Emisin atmica
La instrumentacin para la emisin atmica incluye:
Atomizador/
fuente de excitacin
Monocromador
Detector
Lectura/
visualizador
Como se indica antes, la fuente de calor para la atomizacin

y la excitacin a un nivel de energa ms alto puede ser una
flama. Las alternativas histricas incluyen arcos y chispas,
pero los instrumentos modernos utilizan el argn o algn
otro gas en un estado ionizado, que se llama plasma.
BC de deuterio, BC efecto de Zeeman,

BC Smith-Heijfte
Las lecturas simultneas es posible hacerlas con el segundo

arreglo, como cuando en cada uno de los monocromadores se coloca para transmitir la luz de longitudes de onda
predeterminadas. Un instrumento de lectura secuencial es
menos costoso que un instrumento de lectura simultnea,
pero ms muestras se requieren para tomar una serie de lecturas. Para la mayor parte de los elementos, la sensibilidad
analtica del ICP-AES es similar a la que se obtiene con la
AAS de flama.
Plasmas acoplados inductivamente

El plasma se inicia por el sembrado de una chispa de alto
voltaje para ionizar los tomos:
Ar e
Ar 2e
y se sostiene con la energa de una bobina de induccin conectada a un generador de radiofrecuencia. Esto se conoce
como plasma inductivamente acoplado (ICP).
Los plasmas persisten a temperaturas de hasta 10 000C
y en el instrumento tienen el aspecto de una antorcha (fig.
42-8). Las muestras pueden introducirse va nebulizador
o, en cuanto a la AAS, por la generacin de hidruro, la
generacin de vapor fro o la vaporizacin electrotrmica
desde un atomizador de grafito. La caracterstica principal
de la AES es que permite el anlisis multielemento. Los
sistemas pticos dirigen la luz emitida ya sea va monocromador hacia un solo detector o un conjunto de monocromadores y detectores colocados alrededor del plasma. Con el
primer arreglo, una serie secuencial de lecturas puede hacerse con los monocromadores guiados para proporcionar,
a su vez, cada una de las longitudes de onda de inters.
Figura 42-8 Unidad de la linterna para el plasma inductivamente acoplado.
412
CAP. 42
Interferencias
En las altas temperaturas operativas del ICP, ocurren muchas transiciones de energa, dando lugar al potencial para
las interferencias espectrales, donde la emisin de luz de
elementos diferentes ocurre en longitudes de onda que estn tan juntas que no es fcil que se logre separarlas por
el ancho de banda del espectrmetro. La mayor parte de
stas se documentan, de modo que donde se sospecha una
interferencia puede utilizarse una lnea alternativa de resonancia para la medicin.
Fluorescencia atmica
Pocos instrumentos comerciales para AFS estn disponibles,
y stos se confinan a la medicin de elementos que forman
hidruros y mercurio. Los componentes son similares a los
de la AAS. Las lmparas de descarga sin electrodos se utilizan para la fuente de luz y la trayectoria ptica se modifica de modo que slo la luz emitida fluorescente alcanza
el detector. Ciertas interferencias son comunes a la generacin del hidruro, cualquiera que sea el detector utilizado. Si
un elemento que forma hidruros est presente en la muestra
en cantidades grandes, consumir el agente de reduccin de
manera que otros elementos no se detecten. Las altas concentraciones de los elementos de transicin tambin inhiben
la formacin del hidruro. Donde esto puede ser un problema
el analito puede separarse de la matriz, por ejemplo, por quelacin y la extraccin del solvente o por cromatografa.
Fluorescencia de rayos X
Las muestras son irradiadas por fotones de alta energa,
casi siempre el haz policromtico primario de los tubos de
rayos X. Sin embargo, el uso de istopos radiactivos como
244Cm, 241Am, 55Fe y 109Cd son las fuentes de inters en las
aplicaciones clnicas. El ltimo es en particular importante
como fuente en los instrumentos porttiles desarrollados
para la XRF in vivo (vase adelante, Aplicaciones).
Mientras la matriz de la muestra contribuye de manera
considerable a la intensidad de la seal, la calibracin puede ser difcil, requiriendo por lo general el uso de diferentes materiales de referencia o de estandarizacin interna,
o ambos. Pocos problemas se encuentran si las muestras
son preparadas como frotis muy finos y en la TXRF. Junto
con el efecto de la matriz, la sensibilidad tambin est influida por la longitud de onda, de modo que los elementos
ms ligeros presentan un desafo analtico difcil.
En WDXRF, los rayos X de alta intensidad se utilizan
para inducir la emisin de fluorescencia, que es dispersada
en lneas espectrales individuales por la reflexin en un
cristal del analizador. Los rayos difractados se enfocan y se
dirigen sobre un detector del fotn. Como con el ICP-AES,

los espectrmetros pueden funcionar en secuencia con un
nmero de cristales intercambiables para permitir la medicin del rango completo de elementos, o en un modo multicanal (simultneo), normalmente preestablecidos para
los analitos especficos. Los lmites de deteccin para los
elementos ligeros son 10 a 100 veces ms bajos que con la
EDXRF. La resolucin es buena, aunque menor a tales longitudes de onda ms cortas. Los instrumentos secuenciales
requieren tiempos de anlisis largos para medir varios elementos, comparados con los instrumentos simultneos o la
tecnologa de la EDXRF.
Para EDXRF, los rayos X emitidos de la muestra se dirigen juntos en un detector de cristal. Un pulso de la corriente se genera con una altura que es proporcional a la energa
del fotn de rayos X. Las diferentes energas relacionadas
entre varios tomos (elementos) en la muestra se clasifican
electrnicamente; se utilizan fuentes de energa ms bajas
(un tubo de rayos X de bajo poder o una fuente isotpica).
El detector tiene que mantenerse a una temperatura muy
baja y en un vaco limpio. Los tiempos del anlisis son 10
a 30 veces ms largos que con la WDXRF pero, con una
tcnica verdadera multielemento, el tiempo total no es necesario que sea mayor.
Cuando un haz enfocante de rayos X se dirige contra una
superficie ptica plana en un ngulo de alrededor de 5 (5/60
de un grado), la reflexin total ocurrir. ste es el principio de la TXRF, en la cual la muestra se expone a los rayos
primarios y reflejados totales y se excita para fluorescencia.
La radiacin emitida se resuelve y se mide como un espectro
ED. Puesto que de hecho no hay absorcin por la matriz, la
medicin y la calibracin son mucho ms simples y las sensibilidades son mayores que con otras tcnicas de rayos X.
Espectrometra de masas inorgnica
Los mdulos requeridos para la espectrometra de masas
inorgnica incluyen:
Introduccin
de la muestra/generacin del ion
Enfocamiento
del ion
Separacin
del ion
Detector
Lectura y
visualizacin
Fuentes del ion

Segn se menciona antes, hay un nmero de dispositivos
de generacin de ion, pero el ms utilizado es el ICP. Las
muestras se introducen por lo comn al plasma va nebulizador o por vaporizacin qumica (generacin del hidruro
y del vapor fro de mercurio). A veces se utilizan la vaporizacin electrotrmica y la vaporizacin causada por la
ablacin lser de una muestra slida .
APLICACIONES
Analizadores de masa
La antorcha del plasma inductivamente acoplado es interconectada al analizador de masas va dos conos metlicos
(colector de la muestra y muestreador), a travs de los
cuales los iones se extraen dentro de la unidad de focalizacin del ion, donde un sistema de lentes del ion dirige los
iones al analizador de masas. Varias configuraciones del
analizador estn disponibles en el comercio. Aquellos con
un sistema de cuadrupolo tienen un poder de resolucin
limitado, permitiendo la separacin de la especie sobre una
base de la unidad m/z. Para explotar la capacidad mxima
de la tcnica, la fuente del ICP tiene que ser acoplada a un
analizador de masas de sector del campo de alta resolucin,
que puede alcanzar una resolucin mucho mayor y con una
sensibilidad ms alta que con ICP-MS de cuadrupolo. Los
espectrmetros de masas por tiempo de vuelo son en particular tiles para el anlisis de seales rpidas, transitorias,
como las generadas por la vaporizacin electrotrmica.
Interferencias
El ICP-MS est sujeto a muchas interferencias espectrales
causadas por el traslape de los istopos, o de diferentes
elementos o iones formados de los componentes de la matriz y del gas del plasma. Ejemplos importantes para los
anlisis clnicos incluyen 40Ar+ sobre 40Ca, 31P16O2+ sobre
63Cu, 40Ar+35Cl+ sobre 75As y 40Ar + sobre 80Se. El ICP-MS
2
del sector de campo no est sujeto a la mayor parte de estas
interferencias, aunque la prdida de sensibilidad se observa
cuando se emplea alta resolucin. Esto puede conducir a
problemas con algunas aplicaciones. Un desarrollo relativamente nuevo de instrumentos cuadrupolo se est usando
en las celdas de colisin, donde una celda llena de gas se
incluye en la unidad de focalizacin. Las colisiones entre
los iones poliatmicos y el gas llenador causa que los primeros se disocien y las interferencias espectrales se reduzcan mucho. Otro acercamiento implica la separacin de los
iones del analito de aquellos implicados en la formacin
de las especies poliatmicas. La separacin puede lograrse con la vaporizacin de la muestra, por ejemplo, con la
generacin del hidruro o la vaporizacin electrotrmica, o
preanalticamente con cromatografa o alguna tcnica similar. La adicin de nitrgeno, de helio o de metano al gas
portador o al solvente orgnico del diluyente reduce algunas de las interferencias basadas en el argn.
Las interferencias no espectrales, relacionadas con la introduccin de la muestra, con las fluctuaciones del plasma,
etc., se eliminan de forma eficaz usando un estndar interno. ste debe ser un elemento no presente en la muestra
original, ni sujeto a las interferencias espectrales, y con una
413
masa y energa de ionizacin prxima a la de los analitos.

Tambin se usa con frecuencia para las muestras biolgicas
en el escandio, para las masas de hasta 80 unidades atmicas (amu); en el indio, de 80 a 150 amu; e iridio, en las
masas arriba de 150 amu.
Aplicaciones
Se requieren mediciones de minerales y de oligoelementos para investigaciones clnicas diferentes (Taylor, 1996).
Ciertos grupos pueden tener ingestas nutricionales deficientes de los elementos esenciales, por ejemplo, los ancianos,
los nios desfavorecidos y las mujeres durante el embarazo,
y las deficiencias de hierro, zinc y de selenio son frecuentes en estos grupos. La deficiencia de los oligoelementos
esenciales tambin puede ocurrir durante la alimentacin
parenteral total, por lo que los protocolos para la monitorizacin regular de pacientes por lo general se recomiendan. En otras situaciones, el envenenamiento yatrognico
puede ocurrir. Las concentraciones sricas de aluminio se
miden de manera regular en pacientes con falla renal crnica, debido al uso de agentes orales ligadores de fosfato que
contienen aluminio y tambin por posible contaminacin de
los fluidos de la dilisis. Los fluidos de la dilisis pueden
llegar a contaminarse con otros elementos; en este sentido
se han reportado casos txicos relacionados con el cobre
y el zinc. El diagnstico y el monitoreo de errores innatos
del metabolismo del oligoelemento requiere por lo comn
mediciones del elemento implicado.
La exposicin aumentada a los minerales y oligoelementos puede causar morbilidad; algunos son carcinognicos
(Baldwin y Marshall, 1999). Mientras que las funciones
de muchos rganos se pueden perturbar por la acumulacin de metales; los sistemas del rin, del hgado, nerviosos, intestinales y hematopoyticos es ms probable que
estn implicados. Las exposiciones accidentales (incluso
suicidas u homicidas deliberadas) a los oligoelementos se
consideran en el diagnstico diferencial al considerar los
signos y sntomas que implican estos sitios. La exposicin
indebida puede ser resultado de las fuentes dentro del ambiente, o en la casa, relacionado con los pasatiempos, o los
cosmticos y los remedios poco comunes.
En el escenario ocupacional, puede haber exposicin
aumentada a los materiales con potencial txico reconocido. La determinacin de las concentraciones en las muestras adecuadas es un requisito estatutario para el plomo,
y la monitorizacin biolgica es tambin importante en la
implementacin de regulaciones del UK Control of Substances Hazardous to Health (COSHH).
Las muestras habituales para el anlisis son los fluidos
corporales, sangre, suero y orina (Walker, 1998; www.
414
CAP. 42
sas-centre.org). El pelo y las uas se toman de cuando en

cuando para investigar situaciones de sobreexposicin.
Las condiciones clnicas en las cuales los tejidos es ms
probable que se analicen son la enfermedad de Wilson y la
hemocromatosis, las concentraciones de cobre y hierro,
respectivamente, en el hgado son tales que aun las muestras de biopsia pueden investigarse. Las muestras ms
grandes de tejidos removidos durante la ciruga o post mortem pueden analizarse para investigaciones especiales.
Muchas investigaciones clnicas se relacionan con las
mediciones de apenas uno o dos elementos en una muestra:
o los sntomas son sugestivos de, o hay perturbacin conocida de la exposicin a ese elemento. En estas situaciones
las AAS y AFS son tcnicas ideales sensibles y exactas. Los
panoramas donde los anlisis multielemento son tiles estn
llegando a ser ms comunes hoy. La AES no es a menudo
apropiada para el anlisis de los fluidos biolgicos pero s
para el anlisis multielemento en las muestras de tejidos y
alimentos, donde las concentraciones son ms altas. Para los
estudios que requieren el anlisis multielemento de la sangre
u orina, o ambas, por ejemplo, posible insuficiencia nutricional, lanzamiento de implantes prostticos y envenenamientos no identificados, el ICP-MS aporta la tcnica ms simple,
rentable y, con frecuencia, la ms sensible.
Los resultados pueden ser ms informativos cuando se
presentan como concentraciones del elemento en protenas
especficas o algn otro complejo o molcula, ms bien que
como la concentracin total en la muestra. Se han descrito
varias tcnicas para el muestreo; algunas de ellas pueden acoplarse de manera directa al espectrmetro en un arreglo tndem para el anlisis. La fluorescencia atmica, el ICP-AES y
el ICP-MS se utilizan por lo general para la deteccin.
La facilidad adicional del ICP-MS, para determinar los
istopos estables individuales, se explota en los estudios
metablicos y en las mediciones de la absorcin intestinal.
Las dosis del trazador con un contenido enriquecido de un
istopo pueden administrarse sin exponer a los sujetos a la
radiactividad en potencia daina, como ocurre cuando los radioistopos se emplean para tal trabajo. En los elementos,
como plomo y estroncio, los istopos se generan de forma
parcial por el decaimiento radiactivo de otros elementos; los
cocientes entre los istopos son caractersticos en diferentes
localizaciones geogrficas. A partir de la medicin de los
cocientes del istopo en los materiales biolgicos y ambientales, las fuentes de la exposicin pueden identificarse.
La XRF no desempea un papel importante en las
mediciones de los oligoelementos en las investigaciones
clnicas, pero los desarrollos recientes abren algunas posibilidades interesantes. Instrumentos convenientes se
disean para utilizarse al analizar tejidos prximos a las
superficies ms externas del cuerpo, tales como los huesos
en la rodilla, los dedos y el crneo. Las mediciones in vivo
del plomo se han emprendido para determinar las exposiciones acumulativas en los trabajadores del plomo, y para
investigar la remocin desde las reservas del hueso dentro
de la circulacin durante el embarazo.
Aparte del anlisis real, la contaminacin adventicia es el
factor que tiene el impacto ms grande en la calidad de
resultados. La contaminacin puede ocurrir durante la colecta y el almacenaje de las muestras del procedimiento
preparatorio y de la medicin espectromtrica. La atencin escrupulosa en la limpieza y el detalle metodolgico
son esenciales para obtener resultados significativos. Los
datos de los esquemas de valoracin de la calidad indican
que, mientras algunos laboratorios generales del hospital
obtienen buenos resultados, son los centros especialistas en
oligoelementos los que tienden a mantener los estndares
ms altos de funcionamiento. Esta observacin refleja la
aplicacin continua de prcticas para reducir al mnimo
la contaminacin, y su destreza y experiencia en asegurar
el funcionamiento ptimo del equipo. Tales centros tambin acumulan experiencia con los casos clnicos raros y
estn bien posicionados para proporcionar la asesora y la
interpretacin.
Debido a la estabilidad de los analitos inorgnicos y la pureza con la cual los materiales estndares pueden prepararse,
hay una cantidad razonable de materiales de referencia disponibles para emplear en la validacin de los mtodos y para el
control de calidad interno y externo. A diferencia de muchos
otros procedimientos clnicos de laboratorio, y en parte como
una consecuencia del uso amplio de los materiales de referencia certificados, la exactitud es un concepto directo y no se
define en el contexto de metodologas particulares.
Conclusiones
Con las mejoras recientes en la confiabilidad del equipo y
su desarrollo para reducir las interferencias, la ETAAS y el
ICP-MS son las tcnicas ms convenientes para la medicin
de los minerales y de los oligoelementos en las muestras
clnicas. Para ciertas aplicaciones especficas las AES, AFS
y XRF son en particular adecuadas. La importancia clnica
de la fotometra de flama disminuye con la introduccin de
los electrodos selectivos de ion sodio y potasio.
La descripcin de los principios de las tcnicas espectromtricas atmicas y los considerables detalles de la instrumentacin y las aplicaciones se encuentran en muchos
libros de texto (p. ej., Haswell, 1991; Sneddon, 2002). Una
fuente de informacin valiosa que describe los desarrollos
REFERENCIAS
actuales en la espectrometra atmica analtica para los materiales biolgicos y clnicos, los alimentos y las bebidas se
da en una revisin anual, por parte del Atomic Spectrometry Update (Taylor et al., 2003).
Referencias
Baldwin DR, Marshall WJ. Heavy metal poisoning and its laboratory investigation. Ann Clin Biochem, 1999; 36: 401-407
Haswell S (ed.). Atomic Absorption Spectrometry. Theory, Design
and Applications 1991: Elsevier, Amsterdam.
415
Sneddon J (ed.). Advances in Atomic Spectroscopy, vol. 7, 2002;

Elsevier, Amsterdam.
Taylor A. Detection and monitoring of disorders of essential trace
elements. Ann Clin Biochem 1996; 33: 486-510.
Taylor A, Branch S, Halls DJ, Patriarca M, White M. ASU: clinical and biological materials, foods and beverages. J Anal Atom
Spectrom 2004; 19, 505-556.
Walker AW (ed.). SAS trace element laboratories. In Clinical and
Analytical Handbook, 3rd edn. 1997: Royal Surrey County
Hospital, Guildford, UK.
43
Tcnicas qumicas de reactivo seco
JA Schroeder, JC Osypiw y GS Challand
Introduccin
Qumica del reactivo seco, qumica de la capa fina, qumica
de la tira reactiva y qumica analtica de soporte slido son
sinnimos. Describen tcnicas basadas sobre la incorporacin de uno o ms reactivo qumicos en una unidad porttil
conveniente, que se puede entonces utilizar para realizar
anlisis qumicos sin la necesidad de preparar y transportar reactivos en forma lquida. El ejemplo probablemente
ms antiguo y familiar es el papel tornasol, que todava se
emplea en las aulas de qumica de la escuela, laboratorios
analticos y en el campo para comprobar el pH del suelo.
Se elabora incorporando un pigmento vegetal derivado del
musgo (descrito primero en ingls en 1502) en los intersticios entre las fibras de celulosa del papel; fue utilizado por
Peacham para colorear el papel azul en 1606 (OED, 1989)
y es probable que se haya usado como indicador (la prueba cida) por lo menos durante 300 aos.
Un estmulo profundo al desarrollo de las tcnicas qumicas de la capa fina fue la invencin de la fotografa. La
propiedad de los haluros de plata para cambiar de color al
exponerse a la luz, la observa por primera vez Fabricius en
1556, y las fotografas en su fase temprana pudo haberlas
producido Schultze en 1727 (Stenger, 1939). Las primeras
pelculas y papeles fotogrficos prcticos se desarrollaron
en el siglo xix, y hoy una pelcula instantnea moderna
de impresin a color puede tener hasta 15 capas discretas,
cada una incluyendo una reaccin qumica o una funcin
fsica distintas, incorporadas en una sola unidad, estable y
porttil.
La primera aplicacin de estas tcnicas en la bioqumica
clnica aparece a mediados de la dcada de 1950, con el de-
sarrollo de las tiras reactivas para medir la glucosa en orina

(Adams y cols., 1957). Un analista, enfermera o paciente
comparativamente inexpertos podran sumergir la tira reactiva dentro de una muestra de orina, y dentro de un par de
minutos podran obtener una medicin semicuantitativa
de la concentracin de glucosa comparando el color desarrollado por la tira con un patrn de color impreso. Esto,
junto con la aplicacin subsiguiente de tecnologa similar al anlisis de la glucosa sangunea (Marks y Dawson,
1965), revoluciona la vigilancia en pacientes diabticos.
La cuantificacin exacta se mejora con el desarrollo de
fotmetros simples al medir la luz reflejada mediante la
lectura de tiras reactivas para la glucosa sangunea (Mazzaferri y cols. 1970), llamadas medidores de glucosa, y con
otros progresos importantes que ocurrieron en la dcada de
1970, cuando la tecnologa de la fabricacin de la pelcula
fotogrfica se aplica a los anlisis de la qumica clnica.
Hoy, centenares de anlisis estn disponibles en formato
de pelcula fina, y se han desarrollado mquinas capaces de
medir colores u otras seales de una amplia gama de tiras
reactivas y de producir un resultado exacto y preciso en
segundos.
La tecnologa tiene el potencial para revolucionar la
prctica de la qumica clnica, tanto en la reduccin del
requerimiento para las habilidades analticas tradicionales
en anlisis comunes, como en la capacidad para que stos se realicen simple y rpidamente fuera de un laboratorio analtico, por ejemplo, en consultorios o clnicas, en
las oficinas del mdico de cabecera y en el propio hogar
del paciente. Walter y Boguslawski (1988) han revisado el
campo de estudio y han descrito la gama y la tecnologa de
los anlisis disponibles.
418
CAP. 43
TCNICAS QUMICAS DE REACTIVO SECO
Principios de la metodologa
En su forma ms simple, los anlisis qumicos de capa fina
consisten de pigmento u otro reactivo atrapado dentro de
las fibras de celulosa de una tira de papel. stos producen
una reaccin visible cuando un analito se difunde dentro
de la matriz, o en forma lquida, por ejemplo, papel tornasol y otros papeles indicadores para la valoracin del pH
de un lquido, o en la forma gaseosa, por ejemplo, papel de
hidrxido ferroso para la deteccin del cianuro de hidrgeno; papel de bromuro mercrico para la deteccin de arsina
(Curry, 1988).
Sistemas ms complejos se forman con una serie de capas (vanse los ejemplos especficos, ms adelante), cada
una de las cuales contiene una o ms funciones. Bsicamente, stas son:
1. Una capa de soporte. sta sostiene los elementos del
reactivo seco. Es por lo general plstico delgado, que
puede transmitir o reflejar la luz.
2. Una capa reflexiva. Su propsito es reflejar de nuevo al
ojo o al detector mecnico tanto cuanto sea posible la
luz emitida por el qumico de las capas reactivas. Puede
incluirse con la capa de soporte usando un plstico reflexivo. Como una alternativa, puede colocarse una capa
de un pigmento, como el dixido de titanio, o un material reflexivo, como una lmina de metal.
3. Una o ms capas analticas. stas por lo general consisten de pelculas delgadas porosas de gelatina en las
cuales uno o ms reactivos se han incluido durante la
fabricacin de la pelcula. Los reactivos deben permanecer estables una vez que la capa de la gelatina se haya
secado. Una sola capa es adecuada cuando los reactivos
incorporados no interactan uno con otro en ausencia de
un analito. Las capas mltiples (cada una de las cuales
se seca antes que se aplique la siguiente) son necesarias
para separar los reactivos que interactan recprocamente en ausencia de un analito. As es como la gelatina, o
materiales fibrosos como celulosa, pueden emplearse.
stos suelen funcionar como filtros (p. ej., separar los
eritrocitos del plasma) o como tamices moleculares,
al separar un producto de reaccin de otro. De manera
alterna, los reactivos pueden introducirse sumergiendo
el material fibroso dentro de una solucin apropiada, y
secarlos de inmediato.
4. Una capa extendida. sta consiste de un material fibroso o una membrana. Cuando una gota de la muestra se
aplica, separa muy rpido la muestra hacia fuera, de forma lateral, y permite una difusin uniforme en las capas
analticas.
Las tiras reactivas complejas requieren de una fabricacin muy exacta, en particular cuando son para las capas
analticas, en las cuales la concentracin de reactivo en la
gelatina, el tamao del poro de la gelatina, el grueso de cada
capa, y el grado de secado de cada capa deben ser cuidadosamente controlados (Bevan, 1996). Sin embargo, una vez que
est fabricada, cada tira contiene todos los pasos analticos
requeridos para realizar un ensayo. Ninguna reconstitucin
previa de los reactivos se necesita, la tira es porttil y puede
permanecer estable durante semanas o meses, y el analista
slo necesita aplicar la muestra para comenzar el anlisis.
Resultados semicuantitativos pueden obtenerse igualando el color desarrollado, despus de un tiempo fijo, con los
patrones de color impresos. Con la luz del da o buena luz
artificial, un analista experimentado con visin normal del
color debe generar resultados dentro de 25% del valor verdadero. Para reacciones evaluadas por UV o por deteccin
de fluorescencia, y donde es necesaria una cuantificacin
ms exacta, se requiere un medidor para evaluar el color
u otra seal. La mayor parte de los qumicos del reactivo
seco son vigilados y supervisados por la fotometra reflectante difusa (Kortum, 1969); la fluorescencia frontal (Pesce
y cols., 1971) tambin puede usarse.
Vigilancia de las reacciones
Puede no ser obvio, con excepcin para un artista, fotgrafo
o fsico, que las propiedades de la luz reflejada son diferentes
a las de la luz transmitida y absorbida que es muy conocida
por los analistas. Pero los supuestos colores primarios de las
pinturas y de otros pigmentos (rojo, amarillo y azul) no son
iguales que los de la luz transmitida (rojo, amarillo y verde).
En una galera de arte, se mira una pintura de frente, con la
iluminacin desde arriba. Si una pintura se ilumina en forma
directa de frente, el colorante y el detalle se pierden al observador debido a la luz reflejada no coloreada y dispersada de
su superficie. Estas son las leyes de la fotometra reflectante.
Algo de la luz que cae sobre una tira reactiva simplemente se refleja en su superficie (reflexin especular).
Puesto que sta no ha interactuado con cromforos dentro
de las capas analticas, tiene las mismas propiedades que la
luz de origen, y no puede usarse para vigilar una reaccin.
Parte de luz se incorpora en las capas analticas e interacta
con cromforos antes de regresarse debido a la capa reflectante en la tira. La dispersin y la reflexin de la luz sin la
interaccin con cromforos ocurren tambin dentro de las
capas analticas. La luz que regresa despus de la transmisin a travs de las capas analticas (reflexin difusa), que
contiene una mezcla de luz interactuada y dispersada, se
utiliza para vigilar una reaccin. sta se detecta midiendo
la luz que regresa en un ngulo lejos del haz de reflexin
especular principal.
EJEMPLOS ESPECFICOS
419
Despus de la reaccin, la concentracin del analito en

una muestra puede calcularse comparando la cantidad de
luz difusa reflejada con una estndar. La relacin se rige
por la ecuacin:
Ru Rs Iu /Is
donde Ru es la reflectividad porcentual de la muestra, Rs es
la reflectividad porcentual del estndar, Iu es la intensidad
de la luz reflejada por la muestra, e Is es la intensidad de la
luz reflejada por el estndar. Las mediciones de la reflectividad porcentual, como la transmitancia, no son lineales
con respecto a la concentracin, y en la prctica los algoritmos linearizantes, como los de Williams y de Clapper
(1953), se emplean para convertir una medicin de reflectividad porcentual a concentracin.
Los productos fluorescentes de una reaccin pueden
vigilarse usando la fluorimetra frontal. Los monocromadores se utilizan para separar la luz fluorescente emitida
por las capas analticas de luz reflejada. Si la extincin
dentro de la tira reactiva es despreciable, la medicin de
la fluorescencia es lineal con respecto a la concentracin
del fluorforo.
Ejemplos especficos
La qumica del reactivo seco puede utilizarse para medir
muchos centenares de analitos urinarios, metabolitos y protenas sanguneos. Algunas mediciones se realizan usando
una capa analtica, otras requieren capas mltiples o incorporacin de estructuras fsicas, o ambas, dentro de las capas analticas. Incluso cantidades traza de analitos, como
hormonas y frmacos, pueden medirse utilizando tcnicas
de inmunoensayo dentro de las capas analticas. Los desarrollos ms recientes que usan anticuerpos monoclonales y
sistemas de ensayo inmunomtricos son de uso rutinario en
la actualidad. La mayor parte de estos ensayos los han desarrollado las compaas comerciales, y las consideraciones de
la patente han forzado el desarrollo de diversas soluciones
para los mismos problemas: por lo comn en las uniones de
anticuerpos acoplados a soportes slidos; y la eleccin del
reactivo para desarrollar una seal de color final. Una seleccin de ejemplos especficos se describe ms adelante.
Figura 43-1 Estructura de una tira reactiva para glucosa Dextrostix (adaptada de Walter y Boguslaski, 1988).
pacientes con diabetes mellitus. Los mtodos modernos de

glucosa confan en los anlisis enzimticos que utilizan por
lo general la enzima glucosa oxidasa. Un ejemplo tpico
es la tira reactiva Dextrostix de tres capas, ilustrada en
la figura 43-1. Una muestra sangunea se aplica a la capa
superficial, la cual acta como una capa difusora y membrana semipermeable que separa las clulas sanguneas del
plasma. El plasma de la muestra se difunde en la capa analtica del papel, que contiene el sistema amortiguador de
la reaccin enzimtica, activada por el agua del plasma.
Dentro de la capa analtica, la glucosa y el oxgeno atmosfrico reaccionan con la glucosa oxidasa para producir perxido de hidrgeno y cido glucnico. En presencia de la
peroxidasa, tambin contenida dentro de la capa analtica,
el perxido de hidrgeno oxida a un indicador redox para
producir un cambio de color visible. La capa de soporte
plstico tambin acta en forma reflexiva, y despus de que
las clulas sanguneas se retiran de la superficie, el color
desarrollado puede leerse en la parte superior, en forma visual (comparando con un patrn de color impreso) o usando un medidor de glucosa.
Se han desarrollado muchas alternativas de esta tira
reactiva simple para la glucosa, por ejemplo, la tira de
Fuji (Kobyashi y cols., 1982) incorpora una capa enmascaradora y reflexiva que contiene el pigmento blanco dixido de titanio entre las capas dispersora y analtica. La capa
de soporte es transparente, en lugar de plstico reflexivo, y
el cambio del color se lee de la parte inferior. Esto elimina
la necesidad de retirar las clulas sanguneas de la tira.
Alanina aminotransferasa
Glucosa
La glucosa fue el primer analito biolgico en ser medido
usando las tcnicas del reactivo seco (Adams y cols., 1957;
Marks y Dawson, 1965) debido a su presencia en una concentracin comparativamente alta, la simplicidad relativa
de la reaccin usada y su importancia en la vigilancia de
Muchas enzimas plasmticas pueden medirse usando

tcnicas de reactivo seco, aunque los sistemas analticos
son ms sofisticados, porque las enzimas son molculas
grandes que no se difunden fcilmente a travs de matrices. Tambin, en la medicin enzimtica se confa con frecuencia en reacciones multietapas que son en s mismas
enzimticas. El control de fabricacin cuidadoso tanto de
420
CAP. 43
Figura 43-2 Estructura de una tira reactiva de creatinina Vitros.
los reactivos enzimticos como de otros reactivos participantes, como los cofactores, es por consiguiente necesario.
Algunas capas del reactivo seco para el anlisis enzimtico
tienen entretejidos abiertos que permiten que las enzimas
del suero se incorporen en las capas de una tira reactiva,
por ejemplo, Walter y cols. (1983a, 1983b), mientras que
otros han cerrado los entretejidos que retienen las enzimas
sobre la capa superficial de una laminilla.
Un ejemplo tpico de un sistema de entretejido cerrado es
el mtodo de Vitros (antes Ektachem) (Eastman Kodak Co.,
1992) para la alanina aminotransferasa (ALT). La capa dispersante, que es semipermeable y conserva la enzima srica,
tambin contiene sustratos de ALT de L-alanina y -oxoglutarato de sodio. La ALT cataliza la transferencia de un grupo
amino desde la L-alanina a la -oxoglutarato para producir
piruvato y glutamato. Los reactivos sin cambio y los productos de reaccin se difunden dentro de la capa analtica,
que contiene la lactato deshidrogenasa (LDH) y NADH. El
piruvato que produce la ALT en la muestra reacciona con la
LDH para producir lactato, mientras la NADH se convierte
a NAD. El cambio de absorbancia a 340 nm se mide desde
la parte inferior usando la fotometra reflectante.
En este sistema, la capa dispersante tambin se utiliza para
iniciar la reaccin, y la actividad de la ALT puede medirse
sin la misma enzima incorporando la capa analtica tradicional. Aunque el piruvato en la muestra puede participar por s
mismo en la reaccin, la concentracin normal en el suero es
demasiado baja para causar interferencia significativa.
Creatinina
La creatinina del suero se mide usando una laminilla de
varias capas que tenga un dispersante interno (Sunberg y
cols., 1983). La estructura de una tpica tira reactiva se

Para esta tira, la capa dispersante contiene dixido de titanio, que permite que tambin sirva como capa reflectante.
Cuando se aplica el suero, la creatinina se incorpora a la primera capa analtica. Aqu, el amoniaco se produce a partir
de la creatinina por la enzima especfica creatinina iminohidrolasa, la cual est incorporada dentro de la capa. La
membrana permeable al gas en la parte inferior de la primera capa analtica permite que el amoniaco se difunda
en la segunda capa analtica, pero los componentes como
amortiguadores y iones hidroxilo, que podran interferir
con la reaccin subsiguiente, no pueden atravesar la membrana y son atrapados en la primera capa analtica. La segunda capa contiene un indicador, el azul de bromofenol,
que cambia de color en respuesta al amoniaco. Visto desde
la parte inferior, el cambio de color del azul de bromofenol
puede relacionarse con la concentracin de la creatinina. El
amoniaco puede interferir, pero la concentracin en suero
es, por lo general, demasiado baja para aportar resultados
errneos.
Potasio
Los electrlitos pueden medirse usando electrodos ion-selectivos (cap. 40) elaborados como tira reactiva. En un tpico electrodo ion-selectivo, una membrana elctricamente
conductora separa la muestra de una solucin interna de
composicin constante. Una diferencia en la concentracin
produce un gradiente electroqumico a travs de la membrana, que produce una diferencia potenciomtrica. Un
electrodo de referencia interno, normalmente plata/cloruro
de plata, tambin se sumerge en la solucin llenadora. El
EJEMPLOS ESPECFICOS
421
Figura 43-3 Estructura de una tira de electrodo selectivo a iones de potasio Vitros
cambio en el potencial en el electrodo de referencia interno

se mide comparndolo con un electrodo de referencia externo (Russell y Buckley, 1988).
La figura 43-3 muestra la estructura de una tira reactiva
del electrodo ion selectivo Vitros. Como en un electrodo
ion selectivo convencional, la concentracin de un ion se
mide por la diferencia potenciomtrica entre dos electrodos; el puente forma una unin lquida estable que conecta
dos electrodos. Al contrario de un electrodo ion selectivo
convencional, una solucin de composicin conocida se
aplica al segundo electrodo (de referencia externa), as que
la muestra se refiere directamente a una solucin estndar.
Diversos iones se miden empleando diferentes membranas
selectivas a los iones. Para la medicin del potasio, cada
electrodo incluye una pelcula hidrofbica que contiene
una alta concentracin de valinomicina. sta permite el
paso de los iones del potasio pero excluye otros cationes y
aniones. Una diferencia potenciomtrica, entonces, refleja
cualquier diferencia en la concentracin de potasio entre la
muestra y la solucin estndar.
Los iones potasio tambin pueden medirse usando una
qumica del reactivo seco ms convencional. La capa analtica contiene una fase orgnica hidrofbica, que excluye
todos los iones excepto aquellos cuyo pasaje es mediado
por un ionforo, como la valinomicina para el potasio. El
ionforo media el intercambio de catin H+ entre las fases
acuosa (muestra) y orgnica. El cambio resultante en el pH
dentro de la fase orgnica modifica el color de un colorante redox incorporado dentro de la capa analtica (Charlton
y cols., 1982). Un acercamiento similar tambin se utiliza
para la medicin de la gravedad especfica en tiras reactivas para el anlisis de la orina, en la actualidad una medicin de la actividad inica total.
Gonadotropina corinica humana

Es probable que las tiras de la qumica del reactivo seco
ms usadas sean aquellas que miden la gonadotropina corinica humana (HCG). Diseadas para la lectura visual
y disponibles para venta al pblico, pueden ser bastante
sensibles para permitir el diagnstico del embarazo unos
das despus de la concepcin.
Las tcnicas clsicas para la medicin de las cantidades
traza de hormonas como la HCG confiaron en las tcnicas
de inmunoensayo que se desarrollaron en la dcada de 1960.
Tales tcnicas, que confiaban en cantidades limitadas de un
anticuerpo y en una diferenciacin posterior entre antgenos
ligados y libres, se adaptaron para la metodologa de capa
fina. La estructura de un formato tpico para la medicin hormonal, el ensayo de la tiroxina srica total, se muestra en la
figura 43-4 (Nagatoma y cols., 1981). La primera capa analtica incorpora la tiroxina marcada con peroxidasa, la cual
se transporta con la tiroxina srica dentro de la segunda capa
analtica. Esta ltima consiste de un anticuerpo para la tiroxina, covalentemente unido a la matriz. La difusin de la
muestra, a travs de esta capa, proporciona la reparticin
entre la tiroxina en la muestra y la tiroxina marcada con peroxidasa: cuanto mayor es la concentracin de la tiroxina en
la anterior, ms baja resulta la concentracin de la tiroxina
marcada con peroxidasa que est unida, y ms grande es
la concentracin de la tiroxina marcada con peroxidasa libre
que est disponible para difundir a travs de la tercera capa
analtica (que contiene la glucosa) y dentro de la cuarta, que
incorpora la glucosa oxidasa para generar perxido de hidrgeno a partir de la glucosa y del oxgeno atmosfrico.
La peroxidasa de la tiroxina marcada con peroxidasa libre
entonces cataliza la oxidacin de un colorante redox, que
422
CAP. 43
Figura 43-4 Estructura de una tira reactiva de tiroxina Fuji.
produce un cambio de color proporcional a la cantidad del

marcador libre, que a su vez se relaciona con la cantidad de
tiroxina en la muestra original.
Tales tiras reactivas son complejas para fabricar, y porque
las tcnicas de inmunoensayo clsicas requieren tiempos de
incubacin largos, la sensibilidad de estos mtodos en formatos de reactivo seco (quizs 10 mol/L) es inadecuada
para detectar cantidades traza de hormonas, como la HCG
en los inicios del embarazo. La mayor parte de los equipos
modernos para prueba del embarazo analizan la orina utilizando tcnicas inmunomtricas, en las cuales un exceso de
anticuerpo est presente y donde los tiempos cortos de incubacin son posibles. Las primeras versiones emplearon una
mezcla de tcnicas con reactivos hmedos y secos. Aqu un
anticuerpo monoclonal para la subunidad de HCG estaba
covalentemente unido a una matriz. La muestra se agregaba primero; cualquier HCG se presentaba vinculada a la
matriz unida al anticuerpo. Una solucin que contena un
anticuerpo marcado enzimticamente para la subunidad
de HCG se aada e incubaba durante un tiempo corto, permitiendo la interaccin en la cual la HCG intacta se intercalaba entre el anticuerpo ligado a la matriz y el marcado.
Despus de adicionar una solucin amortiguadora para lavar
la muestra sobrante y el anticuerpo marcado enzimticamente libre de la tira, una tercera solucin se aada, conteniendo
un sustrato del colorante para el marcador enzimtico que
generaba un producto coloreado. En ausencia de HCG en
la muestra para formar el emparedado, no se desarrollaba
ningn producto coloreado unido a la matriz. Un control
positivo conveniente para la reaccin podra incorporarse
uniendo a un rea de la tira el primer anticuerpo que ya haba
reaccionado con la HCG intacta. Esta rea de la tira entonces

daba una reaccin positiva, incluso en ausencia de HCG en
la muestra original.
Versiones ms recientes de la tecnologa del ensayo inmunomtrico incluyen todos los componentes de las reacciones del anticuerpo monoclonal en un formato de reactivo seco. Algunas han utilizado tcnicas de aglutinacin
de partculas, confiando en la capacidad de las partculas,
como aquellas que contienen un solenoide de oro, para
el cambio de color cuando se combinan en presencia de
la HCG. Otras han confiado en una regin del anticuerpo
inmovilizado de la HCG unido covalentemente a una tira
reactiva. La orina (que viaja a lo largo de la tira y no a travs de ella) moviliza las partculas teidas amortiguadas y
ligadas a un anticuerpo diferente de la HCG. En presencia
de la HCG en la muestra de orina, stas forman un emparedado y producen una regin coloreada discreta sobre el
anticuerpo inmovilizado. Una vez ms, un control positivo
puede incorporarse dentro de la tira incluyendo una regin
del anticuerpo inmovilizado todava unido a la HCG.
Troponina T cardiaca
La troponina T, llamada marcador cardiaco, es muy empleada en la actualidad para confirmar o descartar el infarto
del miocardio en pacientes que presentan dolor de pecho
(Collinson y cols., 2001). Debido a la velocidad con la cual
se obtienen los resultados y la facilidad para usar en el lugar
de atencin, las tcnicas qumicas de capa fina se han adoptado ampliamente para su medicin. Un ejemplo tpico es
el inmunoensayo GLORIATM desarrollado por Roche, que
utiliza sangre entera. En este inmunoensayo la capa que se
separa de la fibra de vidrio atrapa las clulas sanguneas.
Dos anticuerpos monoclonales para diferentes sitios de la
troponina T se incluyen en la primera capa analtica. Uno
de estos anticuerpos se conjuga con la biotina, el otro, con
las partculas de oro. Los anticuerpos forman un complejo
en presencia de la troponina T. La segunda capa analtica
contiene estreptavidina ligada al soporte, que se une con
la biotina y entonces inmoviliza cualquier complejo de la
troponina T. La acumulacin de las partculas del oro en el
complejo de la troponina T causa la formacin de un color
prpura, que puede evaluarse visualmente o usando un medidor de la reflexin (Wilding y Ciaverelli, 1999).
Abuso de frmacos
El urinlisis, el uso de una sola tira reactiva para medir
diferentes componentes urinarios, se ha usado por varias
dcadas. La seleccin de diversas qumicas para usar en
tales tiras reactivas se ha regido ms por realizacin tcnica
CONTROL DE CALIDAD DE LA QUMICA DE REACTIVO SECO
que por utilidad clnica: un buen ejemplo es la incorporacin de un soporte de la reaccin sensible a la bilirrubina
dentro de tales multitiras. Aunque todava se utilizan mucho, su utilidad clnica dentro de un ambiente hospitalario
es polmica (NICE, 2003).
Una aplicacin moderna de tal tecnologa multitira ocurre en el desarrollo de sistemas para la deteccin de frmacos adictivos en la orina. Una fuerza impulsora importante
en la deteccin son los requerimientos para evaluar asuntos de preempleo o durante el empleo en un rango muy
amplio de situaciones. Tales sistemas tambin se usan en
departamentos de accidentes y de urgencia hospitalarios,
sobre todo en evaluar la presencia de frmacos adictivos, que contribuyen a una conciencia mental alterada. Muchas variantes de la tecnologa existen, pero todas utilizan
dos anticuerpos monoclonales, como base, para cada frmaco o grupo de frmacos; uno de ellos es capaz de unirse
a un soporte slido, y el otro, de generar una seal coloreada (Wilding y Ciaverelli, 1999). Un panel tpico de frmacos incorporado en una multitira incluye pruebas para los
grupos de frmacos, como barbitricos, benzodiazepinas,
narcticos; aminas simpatomimticas, como anfetaminas y
antidepresivos tricclicos; y frmacos o metabolitos especficos, como cocana, metadona y tetrahidrocanabinol.
Tcnicamente, el desarrollo de esas tiras plantea grandes
problemas. stos incluyen minimizacin de interferencia
por frmacos muy relacionados; asegurar un lmite apropiado de la sensibilidad aun cuando se enfrente con uno de un
grupo de frmacos, los cuales pueden tener reactividad cruzada diferente con el anticuerpo incorporado (el grupo de
la benzodiazepina es un ejemplo obvio); y la diferenciacin
entre frmacos recetados o prescritos y frmacos adictivos
(p. ej., seudoefedrina y anfetamina). Incluso con controles
positivos y negativos incorporados, tales tiras pueden ser
ledas en forma errnea, en particular cuando son utilizadas
por personal inexperto o sin experiencia en instalaciones
alejadas de un laboratorio analtico. Despus de encontrar
un resultado positivo por este procedimiento de tamizaje
debe continuarse con la verificacin mediante otro mtodo
independiente (Wilding y Ciaverelli, 1999).
Control de calidad de la qumica

de reactivo seco
El control de calidad de los resultados dados por las tiras
reactivas plantea problemas diferentes a aquellos del anlisis de la qumica hmeda tradicionales. Para la ltima,
pueden elaborarse reactivos nuevos, y las concentraciones
del reactivo usadas en el anlisis puede modificarlas el analista. Es, por tanto, fcil cambiar los ingredientes del
anlisis en respuesta al desempeo inaceptable. Pero las
tiras reactivas secas no puede modificarlas el analista, y
423
rara vez es obvio a partir de la inspeccin de la propia tira,

que el desempeo analtico sea inaceptable. Un problema
importante para el control de calidad, por tanto, es la identificacin del desempeo pobre y la determinacin de su
causa. En la prctica, la causa rara vez es la propia tira
reactiva.
Para el fabricante y el analista, las qumicas del reactivo
seco plantean otro problema, porque la estabilidad a largo
plazo de cada lote de tiras puede predecirse slo a partir de
la estabilidad de lotes anteriores. En la prctica, existe cierta variacin de lote a lote en la estabilidad, aun cuando tiras
reactivas se almacenan en condiciones ideales. Como parte
de un programa para el control de calidad es necesario, por
tanto, supervisar tendencias a largo plazo en el desempeo,
para poder tomar la accin apropiada antes de que el control de calidad llegue a ser inaceptable.
Identificacin del desempeo inaceptable:

ensayos semi-cuantitativos adicionales de laboratorio
En la actualidad, el rea principal del uso clnico para la
utilizacin del reactivo seco semicuantitativo es la comprobacin de la orina. Una amplia gama de tiras reactivas
est disponible; en ellas pueden incluirse simplemente un
analito (p. ej., para glucosa o protena), o una diversidad
de analitos, los colores de cada soporte del reactivo que tienen que igualarse visualmente dentro de una secuencia de
tiempo estricta con un patrn de color impresa (fig. 43-5).
Aunque los ensayos semicuantitativos para la glucosa sangunea se han reemplazado en gran parte por el uso de tiras
reactivas ledas en los medidores de glucosa sangunea, estos ensayos plantean problemas similares para el control de
calidad. Adems, se han introducido muchas pruebas nuevas de las tiras reactivas de laboratorio adicionales, desde
la medicin de fracciones de lpidos de sangre entera hasta la deteccin de frmacos adictivos en orina o saliva. Estos ensayos semicuantitativos pueden realizarse en diversos
sitios: consultorios, clnicas, prcticas clnicas primarias,
escuelas y el hogar. Poca atencin se presta al desempeo,
debido a que existe una creencia extendida que tales ensayos son seguros, y en una instalacin hospitalaria estn
delegados con frecuencia al miembro ms subordinado del
personal del consultorio, que puede carecer de experiencia
en la qumica analtica y sin ningn entrenamiento.
La primera inspeccin del desempeo de los anlisis
de orina en las salas hospitalarias (Challand, 1987) mostr
que el resultado correcto (es decir igualando el soporte del
color correcto) slo se obtuvo en casi 50% de los anlisis.
Alrededor de 5% de todas las mediciones dieron valores
absurdos incorrectos. Hallazgos similares se han obtenido
en estudios posteriores a partir de diferentes situaciones.
424
CAP. 43
Figura 43-5 Patrn de color impreso para una tira reactiva de anlisis urinario de Bayer Multistix 8SG. Reproducida con el permiso
de Bayer Health Care, LLC.
CONTROL DE CALIDAD DE LA QUMICA DE REACTIVO SECO
425
Cuadro 43-1 Algunas causas identificadas del pobre desempeo en la realizacin de ensayos manuales con tira reactiva
Figura 43-6 Sesgo en ensayos de la tira reactiva de protena en

orina. Seis muestras de orina prepreparadas con concentraciones
proteicas correspondientes a un bloque de color diferente fueron
distribuidas a ciegas a 11 enfermeras analistas. La figura compara concentraciones proteicas con el nmero de analistas que
reportan cada bloque de color. As como en la dispersin prevista
de los resultados existe un sesgo sistemtico, los analistas tienden
a subestimar la concentracin verdadera de la protena con un
bloque de color.
Con ensayos cuantitativos, es comparativamente fcil

definir el desempeo numrico aceptable, o en trminos de
realizacin analtica [la aproximacin de la mayor parte de
los esquemas del aseguramiento de la calidad (QA) externo] o en trminos de utilidad clnica (Fraser y cols., 1993,
1997). Los ensayos semicuantitativos no se prestan a un
acercamiento numrico fcil. No es posible utilizar el valor
medio obtenido de las distribuciones de QA como la mejor
estimacin del valor verdadero porque ste tiene con frecuencia un sesgo introducido por la aproximacin a igualar
el color ms cercano o por deficiencias en la tcnica (fig.
43-6). Las muestras distribuidas como parte de una inspeccin o de un programa de QA son, por tanto, en general
sintticas, con componentes ponderados que definen el valor verdadero (aunque esto es difcil para algunos analitos,
como bilirrubina o eritrocitos). Cuando el valor ponderado corresponde a la concentracin requerida para igualar
exactamente un bloque de color impreso para cada analito,
en la prctica slo cerca de la mitad de quienes realizan el
anlisis logra la igualacin correcta; casi 95% alcanza una
igualacin dentro de un bloque de color en forma correcta.
Los resultados fuera de este rango se consideran un desempeo inaceptable. Un acercamiento alternativo es pon-
Uso de tiras reactivas caducas

Almacenamiento de tiras reactivas en condiciones que
acortan la vida media
Retiro de la tapa del envase de la tira, o eliminacin del
desecante
Cortar la tira por la mitad para ahorrar dinero
Usar un recipiente inadecuado para la muestra (p. ej., un
recipiente blanqueado para una muestra urinaria)
Error al sumergir la tira completa reactiva para orina en la
muestra
Muestra insuficiente aplicada a la tira reactiva para sangre
Realizar la prueba a una temperatura incorrecta
Lectura del soporte de color demasiado pronto, o demasiado
tarde
Lectura del soporte de color equivocado sobre una tira
reactiva multianalito
Condiciones insuficientes de iluminacin
Visin defectuosa del analista sobre el color
Transcripcin errnea de un resultado en la forma del
informe
Uso de unidades incorrectas al informar
derar cantidades de componentes que produzcan un color

intermedio entre dos bloques del color. Los resultados que
correspondan a cualquiera de los dos bloques adyacentes del color se consideran aceptables; en encuestas en el
consultorio, 10 a 20% de las entregas son inaceptables por
un criterio muy escaso (Tighe P, comunicacin personal).
Cuando se identifica el desempeo inaceptable, se requiere
encontrar la causa; algunas de las posibles causas se enumeran en el cuadro 43-1. Casi todas se deben a deficiencias en la comprensin, en el entrenamiento, o en la tcnica
(las cuales pueden remediarse de manera local). Es raro
que la causa se deba a deficiencias en la fabricacin de la
tira reactiva, aunque debe mencionarse que las demandas
exageradas para la exactitud probable de estas tiras en la
comprobacin en el lugar de atencin son hechas a veces
por los fabricantes.
Valoracin de las tendencias a largo plazo,
ensayos cuantitativos
Los instrumentos automticos que usan el anlisis qumico de reactivo seco han estado disponibles por varios
aos. stos pueden realizar muchos anlisis diferentes sobre cantidades pequeas de suero, con una productividad
y precisin de estudio que igualan a los analizadores ms
tradicionales de qumica hmeda. Las laminillas reactivas
426
CAP. 43
se compran en suficientes lotes nicos para seis meses.

Si se almacenan en condiciones ideales, cada lote puede
necesitar de una simple calibracin antes de usarse; la estabilidad, que es bastante buena, mantiene la calidad durante la vida media del lote. Sin embargo, en la prctica,
las condiciones de almacenaje pueden no ser las ideales
(la diferencia de temperatura entre el piso y el techo de
una cmara fra, en ocasiones es suficiente para cambiar la
estabilidad) y el deterioro muy lento de las tiras reactivas
no es idntico de lote a lote. El control de calidad, por tanto, est dirigido a asegurar que la calibracin inicial sea la
adecuada, y vigilar el desvo lento para identificar el punto
en el cual se requiere una segunda calibracin, o qu laminillas sin usar deben desecharse.
Los sueros convencionales para el control de calidad
(QC) pueden utilizarse para ambos propsitos, pero sobrellevan desventajas. Son costosos los efectos de la matriz,
en particular los relacionados con la viscosidad y con la
difusin siguiente a travs de las capas de una laminilla;
pueden provocar que su comportamiento sea diferente en
las muestras de los pacientes, y los resultados para algunos analitos cambiar de manera notable en las primeras
horas posteriores a la reconstitucin. Los resultados que
se obtienen de muestras de pacientes pueden proporcionar
informacin QC ms confiable. Aunque dichos resultados
estn obviamente ms dispersos que los de un suero QC
convencional, ms datos estn disponibles para el anlisis
estadstico. Para la mayor parte de los analitos, los parmetros como el resultado del paciente medio (despus de la
exclusin de valores extremos) y el nmero de resultados
que caen fuera de un lmite preestablecido (como un lmite telfonico automtico para la concentracin del sodio
srico) son suficientemente sensibles y proporcionan casi
toda la informacin QC necesaria. La calibracin inicial
puede calificarse con la comparabilidad de un promedio
diario del paciente posterior a las calibraciones previas. Un
desvo en el promedio diario puede utilizarse para calificar
el punto en el cual la recalibracin o las nuevas laminillas
son necesarias. La figura 43-7 muestra una grfica del promedio diario del paciente para los anlisis del sodio srico,
mostrando la recalibracin antes y despus del periodo.
La estadstica para el control de calidad con base en
muestras de pacientes puede emplearse para asegurar la
comparabilidad a largo plazo de los resultados dentro de
un laboratorio, pero no se asegura que los resultados sean
comparables con aquellos producidos por otros laboratorios. La participacin en esquemas externos del aseguramiento de la calidad puede aportar esta informacin, y dar
informacin ms confiable que, por ejemplo, los resultados
que se obtienen analizando una muestra por control de calidad de composicin conocida. Los esquemas externos del
aseguramiento de la calidad estn disponibles ahora para
Figura 43-7 Promedios diarios de pacientes, anlisis de sodio.

La grafica muestra valores promedio diarios sucesivos para los
anlisis de sodio srico realizados empleando un analizador Vitros despus de la calibracin. Una cada en los resultados es
evidente, la cual promedia casi 0.04 mmol/L cada da. La recalibracin se realiza despus del da 34.
los anlisis de la qumica de capa fina realizados en el lugar de atencin (Bullock, 1999), y son, es probable, los
ms utilizados para los anlisis de glucosa sangunea en
el consultorio; la participacin en tales esquemas ahora se
requiere para la acreditacin del laboratorio en el Reino
Unido (Burnett, 2000).
Las temperaturas de la tira reactiva seca y de la muestra
afectan la velocidad de difusin de la muestra y la velocidad de reaccin dentro de la tira, por ello el buen control de
la temperatura es esencial. El funcionamiento global, segn
lo calificado por datos QA externos, de dos analizadores de
la tira reactiva en un periodo de dos aos se muestra en la
figura 43-8. El control de temperatura en el laboratorio en
el cual estaban situados fue menor que el ideal, y su deterioro en los meses clidos del verano es obvio.
Los analizadores automticos, usando la qumica del
reactivo seco y del hmedo, en ocasiones producen resultados aparentemente correctos pero absurdos. Quiz el predominio de stos sea < 0.2%. Analizando todas las muestras
por duplicado, es mnimo; y tales errores pueden detectarse
slo comparando los resultados con los previos del mismo
paciente o estando alertas para detectar discrepancias entre
los resultados y la informacin clnica provista.
427
RESUMEN
Figura 43-8 Resultados QA externos globales: tendencias estacionales. Puntaje del ndice de variacin del funcionamiento promedio
global (OMRVIS, un ndice de imprecisin) para dos analizadores Vitros idnticos ubicados en el mismo laboratorio sobre un periodo de
dos aos. La precisin en los meses de verano es deficiente en comparacin con los meses de invierno, debido tal vez al control inadecuado de la temperatura en el laboratorio.
Resumen
La tecnologa de la qumica del reactivo seco en la actualidad ha avanzado al punto en el cual casi todos los anlisis
convencionales de la qumica clnica con reactivos lquidos
se pueden reproducir en formato del reactivo seco. Aunque los costos del reactivo son por lo general ms altos
para el ltimo, ofrece ventajas importantes. Los volmenes
de muestra son bajos, las sensibilidades comparables con
las tcnicas convencionales, la precisin puede ser por lo
menos buena, las tcnicas son rpidas y confiables, y realizarlas requiere poca destreza analtica especfica; por tanto,
son apropiadas en un laboratorio de qumica clnica, donde su uso libera los recursos tcnicos y cientficos escasos
para el desarrollo de nuevos ensayos y de nuevas tcnicas.
Tambin se adaptan con facilidad a un ambiente cercano al
paciente, por ejemplo, dentro de las aulas, en clnicas, en
asistencia primaria y para que los usen los pacientes.
A pesar de su evidente simplicidad, esta tecnologa no es
segura. Sin una atencin cuidadosa que asegure la identidad
del paciente, la conveniencia de la muestra, el procedimiento correcto del anlisis, incluyendo coordinacin, temperatura y control de calidad, y el registro exacto y apropiado
de la reaccin, los anlisis pueden proporcionar resultados
engaosos. Con una utilizacin cada vez ms amplia de la
tecnologa, existen beneficios importantes para el paciente
y para el mdico en la velocidad con que los resultados pueden obtenerse. El desafo para el fabricante es el desarrollo
continuo, no slo en introducir nuevos anlisis sino tambin
en la simplificacin de los actuales al verificar que son tan
exactos y tan libres de interferencias como sea posible. El
desafo para el laboratorio analtico consiste en asegurar
que dondequiera que esta tecnologa se utilice, el analista
est entrenado en los procedimientos analticos apropiados
y educado para estar consciente tanto de las fortalezas como
de las limitaciones de la tcnica.
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44
Tcnicas de separacin
Roy Sherwood
Por qu separar?
La mayor parte de los anlisis que se realizan en laboratorios clnicos implican la deteccin y cuantificacin de
los compuestos individuales en fluidos corporales, por lo
comn en sangre u orina. Para este propsito, se utilizan
mtodos qumicos o inmunolgicos especficos en el compuesto de inters. Si bien tales ensayos explican la mayor
parte de los anlisis en el laboratorio clnico, a veces una
familia de compuestos muy relacionados requiere una medicin. Aunque ensayos especficos podran desarrollarse
para cada compuesto del grupo familiar, este acercamiento
no es con frecuencia econmico o en la prctica es menos
viable que usar una tcnica que pueda separar y cuantificar
todos los compuestos de manera simultnea. Una variedad
amplia de tcnicas de separacin se utiliza en los laboratorios clnicos, pero casi siempre se basa en el principio de
la separacin cromatogrfica o electrofortica. La cromatografa en todas sus variantes, por ejemplo, de capa fina
(TLC), de alto rendimiento (HPLC) o la gaseosa (GC),
puede utilizarse para separar muchos tipos diferentes de
compuestos desde molculas pequeas, como aminocidos
y frmacos hasta protenas como la hemoglobina glucosilada. La electroforesis, por otra parte, se emplea para la
separacin de protenas, casi cualquier protena (p. ej., protenas sricas), o para identificar variantes de una en particular (p. ej., variantes heredadas de hemoglobina).
Cromatografa
La cromatografa cumpli 100 aos en 2003. M.S. Tswett
de la Universidad de Varsovia describi primero el uso de la
adsorcin para separar los pigmentos de una hoja de planta

en marzo de 1903. El principio de los diferentes tipos de
cromatografa es la interaccin de las molculas de inters
entre una fase mvil (lquida o gaseosa) y una estacionaria
(slida). Esas molculas que interactan con la fase estacionaria se mueven ms lento a travs de una placa, o de
una columna, que las que no interactan y, por consiguiente, se produce una separacin de molculas desde el interior de una mezcla. El control de estas interacciones, y por
tanto de la separacin, se alcanza explotando las diferencias sutiles de ciertas propiedades fsicas de las diferentes
molculas en las muestras, por ejemplo, su solubilidad en
agua o en solventes orgnicos, la carga neta y el tamao. El
cuadro 44-1 detalla las propiedades moleculares que rigen
la separacin en las diversas formas cromatogrficas.
Cromatografa de capa fina (TLC)

Principios
La TLC reemplaz a la cromatografa de papel en la dcada de 1960 y en la actualidad se le est sustituyendo en una
gran parte por la HPLC. En la TLC la fase estacionaria (por
lo comn almina, gel de slice o celulosa) se fija sobre una
placa de cristal, plstico o metal. Una mezcla solvente (fase
mvil) aplicada a un extremo de la placa viaja a lo largo de
ella por atraccin capilar y produce la separacin cromatogrfica de los solutos en una muestra aplicada a la placa. A
menos que sean fluorescentes, la mayor parte de los compuestos requieren la derivacin (modificacin qumica)
para que puedan ser visualizados; esto se logra rociando
con, o sumergiendo la placa en, reactivos cromognicos.
430
CAP. 44
TCNICAS DE SEPARACIN
Cuadro 44-1 Propiedades moleculares que gobiernan

la separacin dentro de las varias formas cromatogrficas
Propiedad
Tipo de cromatografa
Propiedades de adsorcin
Particin
Interacciones antgenoanticuerpo o enzima-sustrato
Tamao y forma molecular
Carga inica
TLC, HPLC
GC, HPLC
Afinidad
Filtracin en gel
Intercambio inico
La informacin cualitativa puede obtenerse observando

simplemente la placa y la identificacin de las manchas
individuales con mediciones del factor de retencin (Rf,
distancia recorrida por la muestra dividida por la distancia
total recorrida por el frente del solvente). La mayor resolucin se obtiene corriendo la placa una segunda vez, pero en
la direccin del solvente a 90 de aquella primera corrida
(TLC bidimensional [TLC 2-D]). La desventaja de la TLC
2-D es que slo una muestra se aplica a cada placa. La
cuantificacin requiere el uso de un densitmetro que pueda examinar la placa, o la elucin de la mancha a partir de
la fase estacionaria seguida por una medicin colorimtrica. La TLC 2-D experimenta, sin embargo, un interesante
resurgimiento por los progresos en el campo de los protemicos. Despus de la TLC 2-D, el patrn de las manchas
correspondientes a las protenas individuales se compara
entre los individuos con una enfermedad particular y con
los controles, y las manchas que difieran en intensidad entre los grupos son eluidas de la placa para identificar la
protena especfica implicada.
Aplicaciones
La TLC se utiliza ahora ms como una tcnica de tamizaje,
ya que es relativamente rpida, econmica y fcil respecto a otros mtodos cromatogrficos. Las aplicaciones para
TLC en un laboratorio clnico incluyen ensayos de aminocidos, frmacos y carbohidratos.
Aminocidos
Los programas de tamizaje neonatal existen en muchos
pases para la deteccin temprana de nios con fenilcetonuria. Aunque los mtodos espectrofotomtricos o HPLC
especficos existen para la fenilalanina, muchos laboratorios de tamizaje prefieren utilizar un mtodo TLC 1-D que
separe los aminocidos bsicos, neutros y cidos, debido
a que este mtodo tiene el potencial para la identificacin
de otros desrdenes del aminocido, por ejemplo, tirosi-
nemia, enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce,

etc. La confirmacin de la identidad de un aminocido
incrementado anormalmente puede conseguirse por TLC
2-D o HPLC, por ejemplo, el patrn caracterstico de los
aminocidos con cadena ramificada incrementados de forma anormal (leucina, isoleucina y valina) en la enfermedad
de la orina con olor a jarabe de arce. Avances recientes en
la tecnologa relacionados con la cromatografa lquida,
en particular en combinacin con espectrometra de masa
(LC-MS; vase ms adelante), condujeron a una reduccin
en el uso de TLC en los programas de tamizaje neonatal.
Frmacos
El tamizaje de frmacos urinarios es complicado por la diversidad de frmacos disponibles para uso recreacional
o tomados de manera deliberada o accidental en sobredosis, incluyendo compuestos bsicos, neutros y cidos. En
el paciente inconsciente o no cooperativo, poca informacin puede estar disponible sobre el consumo de frmacos
especficos. La TLC es con frecuencia la tcnica elegida
para el tamizaje inicial, y sistemas comerciales, por ejemplo, Toxilab, estn disponibles. stos tienden a tener placas separadas y sistemas de solventes para frmacos cidos
y bsicos, incluidos los neutros en cualesquiera de los sistemas. La nebulizacin secuencial de diversos reactivos
cromognicos produce colores diferentes que tien a los
diferentes frmacos, permitiendo as una identificacin
ms sencilla. En aos recientes, sin embargo, surge un
movimiento significativo que se dirige a emplear inmunoensayos enzimticos en analizadores automticos para
el tamizaje de primera lnea de frmacos adictivos.
Carbohidratos
La TLC es la tcnica elegida para el tamizaje inicial de
muestras de orina o fecales de infantes sintomticos con
desrdenes metablicos de carbohidratos, por ejemplo,
fructosuria, etc. Slo se requieren resultados cualitativos
para esta aplicacin, pero el desarrollo de pruebas para la
funcin y la integridad del tracto gastrointestinal que usan
azcares administrados por va oral crea la necesidad de
una TLC cuantitativa de los azcares. Ocurre, por ejemplo,
cuando se emplea una mezcla de mono y disacridos (xilosa, ramnosa, 3-o-metilglucosa y lactulosa), que cruzan la
pared del tracto gastrointestinal va diversos mecanismos,
para evaluar la permeabilidad del intestino por el diagnstico diferencial de la enfermedad del tracto gastrointestinal.
La reduccin de la superficie intestinal disponible para la
absorcin (p. ej., enfermedad celiaca) conduce a una reduccin progresiva en la absorcin intestinal de monosac-
CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)
ridos, mientras el dao a la integridad de la pared intestinal

(p. ej., enfermedad de Crohn) se perfila como un aumento
en la absorcin de disacridos.
Cromatografa lquida de alta

resolucin (HPLC)
Principios
La HPLC es la forma ms comn de cromatografa que se
emplea en el laboratorio clnico. Un mejor funcionamiento
se logra al contener la fase slida en columnas estrechas
(de 150 5 mm) y bombeando la fase mvil a travs de la
columna bajo presin (de 1.5 a 2.0 presin atmosfrica).
Aunque los mecanismos de intercambio inico o de exclusin por tamao de separacin se utilizan de cuando en
cuando en la HPLC, la mayor parte de los mtodos se basa
en la adsorcin de las molculas en la fase slida. En la
HPLC, en fase normal, los grupos de enlace hidrfilos sobre
la superficie de un material de embalaje de silicona atraen
molculas hidroflicas pero no hidrofbicas, lo contrario es
verdad para HPLC en fase inversa. As, en la HPLC en fase
normal una fase mvil de polaridad incrementada remueve
con ms eficacia molculas polares de la fase slida, mientras en la HPLC en fase inversa las fases mviles (orgnicas) remueven ms rpido molculas no polares de la fase
slida. La HPLC en fase inversa, por tanto, favorece la separacin de las molculas neutras, que predominan en los
fluidos biolgicos.
Equipo para HPLC
Los componentes de un sistema de HPLC comprenden una
bomba o bombas, sistema de introduccin de la muestra (inyector de jeringuilla o automuestrador), columna, detector y
un sistema de recoleccin de datos (registrador de grficas
o computadora). Para la mayor parte de las aplicaciones,
una sola fase lquida puede utilizarse todo el tiempo a una
tasa de flujo constante (1 a 2 ml/min), es decir una elucin
isocrtica. Sin embargo, en algunas aplicaciones complejas
donde compuestos que se separan son similares en estructura, es necesario variar la composicin de la fase lquida
durante el anlisis, es decir, la elucin por gradiente. Un
ejemplo donde ocurre sta es en la separacin de aminocidos en sangre u orina.
La seleccin del mtodo de deteccin para HPLC es
dependiente del tipo de analito con deteccin ultravioleta
(UV), fluorescente y electroqumica (EC), la que se utiliza
de rutina. La deteccin UV predomina en la HPLC en fase
inversa pero es raro que se emplee en mtodos de fase normal, ya que la concentracin alta del solvente orgnico en
431
la fase mvil produce una absorcin de fondo grande entre

190 y 230 nm. La deteccin fluorescente tiene sensibilidad
alta, pero requiere compuestos que tengan fluorescencia
natural o que qumicamente se modifiquen para inducir
fluorescencia. La deteccin electroqumica se basa en la
oxidacin de los compuestos en un electrodo de carbn o
metlico; puede ofrecer sensibilidad y especificidad excelentes para compuestos particulares.
La espectrometra de masa (MS) se utiliza como un
modo de deteccin en combinacin con la cromatografa
gaseosa desde hace muchos aos. Los grandes volmenes
de lquido fluyendo a travs de un sistema de cromatografa
lquida (LC) tpico con una velocidad de flujo de 1 ml/min
evitaron la combinacin de LC y de MS al inicio. La introduccin de LC microporo (dimetro interno < 1) y los
avances en la produccin de los aerosoles lquidos muy finos (electronebulizacin) han impulsado para que LC-MS
se torne una tcnica viable. La LC-MS o MS en tndem
(MS-MS) es probable que sean las tcnicas de separacin
que crecen ms rpido en el laboratorio clnico.
Preparacin de la muestra para muestras biolgicas
Una complicacin que surge en el anlisis de las muestras
biolgicas usando la HPLC se debe al alto contenido proteico
en muchos fluidos corporales (cerca de 70 g/L en plasma y
suero); que puede producir interferencia de fondo y conducir a la obstruccin de la columna, as que alguna forma de
preparacin de la muestra se requiere, por lo regular, antes
del anlisis. La forma exacta de preparacin de la muestra
vara con el uso especfico, pero por lo comn, se realiza la
desproteinizacin o la extraccin del compuesto de inters,
o ambas. Las extracciones lquido-lquido y en fase slida se utilizan para los mtodos de HPLC que involucran
muestras sanguneas. Cuando se utiliza orina, la interferencia en los mtodos de deteccin UV o fluorescentes suele
ocurrir si pigmentos coloreados o fluorescentes estn presentes, y alguna forma de extraccin es a menudo necesaria,
ya sea lquido-lquido o en fase slida.
Aplicaciones
La mayor parte de las aplicaciones de la HPLC en la medicina de laboratorio cae dentro del campo de la bioqumica
clnica, aunque los hematlogos tambin utilizan la tcnica. Los grupos de compuestos que por lo regular se analizan por la HPLC en el laboratorio clnico incluyen aminas
biognicas, aminocidos, porfirinas, frmacos, vitaminas,
hemoglobina y carbohidratos. Se han descrito muchas otras
aplicaciones especficas para propsitos de investigacin,
incluyendo los nuclesidos, productos de degradacin del
432
CAP. 44
colgeno y esteroides, pero stos no se convierten con frecuencia en parte del repertorio de rutina de las pruebas.
Aminas biognicas
Las catecolaminas, adrenalina, noradrenalina y dopamina,
y sus metabolitos, se miden en muestras plasmticas y urinarias para la deteccin de tumores. Los feocromocitomas
secretan cantidades grandes de adrenalina o noradrenalina,
o ambas, que se metabolizan con cido 4-hidroxi-3-metilmandlico (HMMA). El incremento en las concentraciones
de catecolaminas y HMMA puede detectarse en la orina de
pacientes con feocromocitoma empleando la HPLC en fase
inversa con deteccin electroqumica. Esta tcnica se utiliza tambin para detectar cantidades anormalmente altas de
dopamina y de su metabolito el cido homovanlico (HVA),
producido por los neuroblastomas en nios.
La serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) se sintetiza a
partir del triptfano y se metaboliza a cido actico 5-hidroxiindol (5-HIAA) por monoaminooxidasas. Los tumores carcinoides secretan cantidades anormales de 5-HT y
la medicin de las concentraciones de serotonina sangunea/urinaria o de la excrecin urinaria de 5-HIAA es til
en la deteccin de tumores y en la vigilancia de la terapia.
Los mtodos para la determinacin simultnea de HMMA,
HVA y 5-HIAA por la HPLC en fase inversa estn dentro
de los mtodos de rutina en los laboratorios clnicos.
redados (porfirias) con deficiencias especficas enzimticas que conducen a la acumulacin de precursores. La
presentacin clnica de las porfirias es diversa, desde fotosensibilidad crnica a dolor abdominal agudo, y aunque
cierta idea del diagnstico exacto puede conocerse por los
sntomas, la caracterizacin del tipo de porfiria requiere la
identificacin de su patrn en sangre, orina y heces. sta
es posible lograrla por la extraccin lquido-lquido de las
porfirinas, seguida por la HPLC en fase inversa con deteccin UV o fluorescente, puesto que las porfirinas tienen
fluorescencia natural. Un ejemplo de separacin de porfirinas por la HPLC se muestra en la figura 44-1.
Mezcla estndar de porfirianas
HPCL sobre Hipersil SAS con deteccin fluorimtricas
Aminocidos
El uso de la TLC para la identificacin cualitativa de anormalidades en el metabolismo de los aminocidos se describi antes. La cuantificacin de aminocidos especficos es
con frecuencia necesaria, en particular para la vigilancia
teraputica en desrdenes como fenilcetonuria, tirosinemia
o enfermedad de la orina de jarabe de arce. El primer sistema HPLC especializado que se crea es el analizador de
aminocidos, que se fundamenta en la deteccin espectrofotomtrica despus de la reaccin poscolumna con ninhidrina para producir derivados a color. En la actualidad se
han creado muchos mtodos alternativos de la derivacin
para separar aminocidos por la HPLC en fase inversa con
deteccin UV, fluorescente o electroqumica (vanse Lecturas adicionales).
Porfirinas
Los porfirinas son tetrapirroles cclicos que se forman por
oxidacin de los porfiringenos, intermediarios de la va
biosinttica del hem. Existe una clase de desrdenes he-
Figura 44-1 HPLC de una mezcla estndar usada para el anlisis de porfirina urinaria. Los picos corresponden a uroporfirina
(8COOH), heptaporfirina (7COOH), hexaporfirina (6COOH),
pentaporfirina (5COOH), coproporfirina (4COOH) y mesoporfirina (2COOH). Columna, 0.8 15 cm Hipersil SAS (5 m).
Elucin por gradiente y deteccin UV (400 nm).
Frmacos
Las tcnicas de inmunoensayo sustituyen en la actualidad
a la HPLC como mtodo de rutina para muchos de los anticonvulsivos establecidos, por ejemplo, fenitona, fenobarbital, valproato y carbamazepina. Sin embargo, la ms
nueva generacin de anticonvulsivos, incluyendo lamotrigina, vigabatrina, gabapentina, topiramato, leviteracetam
y oxacarbazepina, se mide por la HPLC en fase inversa
con deteccin UV. La vigilancia teraputica del frmaco,
sin embargo, se considera que es menos importante para
CROMATOGRAFA DE GASES (GC)
muchos de los anticonvulsivos ms nuevos respecto de los

ms antiguos, pues tienen amplias vistas teraputicas (lamotrigina, topiramato y leviteracetam) o su concentracin
plasmtica se correlaciona de manera escasa con la eficacia clnica (gabapentina, vigabatrina). La vigilancia, por lo
tanto, se realiza sobre todo si se sospecha inconformidad
con la terapia.
Otros frmacos
Se han desarrollado ensayos para miles de otros frmacos
en fluidos biolgicos. Los lectores que buscan informacin adicional deben consultar la seccin Lecturas complementarias al final de este captulo. El uso de tcnicas
de separacin, que incluyen la LC, tiene una importancia
particular cuando un frmaco contiene un metabolito activo que necesite medirse junto al frmaco de origen, por
ejemplo, amiodarona, dotiepina, etctera.
Vitaminas
Las vitaminas son un grupo diverso de compuestos, pero
casi todas se han medido en sangre u orina por la HPLC
(vanse Lecturas adicionales para consultar detalles).
Hemoglobinas incluyendo la hemoglobina glucosilada
Ms de 400 variantes estructurales de la hemoglobina se
conocen, la mayor parte de las cuales no tiene ninguna
secuela clnica para el individuo. Sin embargo, algunas
variantes se relacionan con patologas, por ejemplo, HbS
(hemoglobina de la enfermedad de la clula falciforme).
Un diagnstico definitivo requiere la identificacin de la
variante presente. Recientemente, la separacin de hemoglobinas se logr por electroforesis, pero han aparecido
varios sistemas comerciales de HPLC especializados con
base en la cromatografa de intercambio inico. stos tienen una ejecucin ms rpida de la muestra y son tiles en
el tamizaje poblacional para hemoglobinopatas. Las modificaciones a estos sistemas permiten que se les emplee
para cuantificar la fraccin glucosilada de la hemoglobina,
HbA1c, con un tiempo analtico cclico de 4 a 8 minutos.
Una versin de la HPLC del mtodo cromatogrfico de afinidad al gel boronato, tambin disponible, tiene la ventaja de que no lo afecta la presencia de variantes heredadas
de la hemoglobina. Un mtodo de referencia establecido
para la medicin de HbA1c implica la descomposicin de
la hemoglobina en pptidos que realiza la endoproteinasa
Glu-C, seguida por la separacin y cuantificacin de los
hexapptidos por HPLC-ionizacin por electronebuliza-
433
cin y anlisis de espectrometra de masas (ESI-MS) o

electroforesis por HPLC capilar.
Carbohidratos
La tamizacin de desrdenes heredados del metabolismo de
los carbohidratos se realiza por lo general por TLC, como
se describe antes. La cuantificacin de carbohidratos especficos no es con frecuencia necesaria, pero el desarrollo de
estudios de absorcin/permeabilidad intestinal de azcares
hace necesaria la medicin exacta de azcares especficos
en orina, por ejemplo, lactulosa, ramnosa, xilosa, cuando
se requiere la cuantificacin. La separacin puede alcanzarse usando la cromatografa de intercambio inico pero
la deteccin es difcil, pues los carbohidratos no tienen propiedades UV ni fluorescencias utilizables. La aparicin de
la deteccin electroqumica amperimtrica pulsada mejora
mucho la situacin, aunque el progreso es lento.
Cromatografa de gases (GC)

Principios
En la GC, los compuestos de inters se separan por la particin entre el soluto en una corriente de un gas transportador
inerte (nitrgeno, argn o helio) y un lquido de volatilidad
baja sujeto a un soporte inerte (de ah su nombre anterior,
cromatografa gas-lquido, o GLC). El soporte inerte es,
por lo general, de microperlas de cristal o polmeros halogenados sintticos y un polialcohol derivado o silicona. Por
convencin las columnas de GC son de 1 a 3 m de largo con
un dimetro interno de 2 a 6 mm, pero en la mayor parte
de las aplicaciones clnicas se emplean columnas capilares,
que pueden ser de hasta 40 m de longitud con un dimetro
interno de 0.2 a 0.5 mm. Las ventajas de la GC capilar son
por lo general una resolucin mejorada y tiempos de corrida ms cortos. Los sistemas de deteccin disponibles para
GC son ionizacin a la flama (FID), captura de electrones
(ECD) y espectrometra de masas (GC-MS). Una comparacin de GC normal contra GC capilar y de los detalles de
la forma de accin de los tipos de detectores se presenta la
en revisin de Lewis y Sampson (1994).
Aplicaciones
Los compuestos que pueden separarse por GC deben ser
voltiles o capaces de convertirse a un estado voltil por
derivacin. stos incluyen alcoholes, esteroides, frmacos,
cidos orgnicos y cidos biliares.
434
CAP. 44
Alcoholes
El etanol y el metanol son compuestos voltiles que se miden muy rpido por GC con FID. Una columna de GC normal puede utilizarse, pues la resolucin adicional de la GC
capilar es innecesaria. Las mediciones del glicol de etileno
en toxicidad sospechada son tambin factibles.
Esteroides
El perfil esteroideo urinario proporciona informacin sobre
la produccin y metabolismo de esteroides a partir de la
glndula suprarrenal, testculos y ovarios. Es en particular
importante en la evaluacin de nios de gnero incierto o
con desarrollo sexual precoz. Tambin existe considerable
inters en esta medicin para detectar el abuso de esteroides anablicos en los atletas. Usando la GC capilar con
FID despus de la derivacin de los esteroides, hasta 25
esteroides y metabolitos pueden detectarse y cuantificar en
una corrida (fig. 44-2). La disponibilidad y la reduccin
ms amplias, por el costo de instrumentos GC-MS condu-
cen hacia el reemplazo de la GC capilar convencional de

esteroides por GC-MS.
Frmacos
Los frmacos que no se miden fcil por HPLC, por ejemplo, valproato, antidepresivos tricclicos, etc., su ensayo
se practica con frecuencia por GC, o para la vigilancia de
frmacos teraputicos o para propsitos toxicolgicos. La
mayor parte de los sistemas utiliza columnas normales de
la GC con FID, pero GC-MS tiene un papel particular en la
confirmacin de exmenes positivos de frmacos adictivos
que se obtienen por TLC, EMIT u otros inmunoensayos.
Los mtodos especficos para varios frmacos se pueden
encontrar en el texto de Ghosh (1992).
cidos orgnicos
Las enfermedades heredadas que producen cambios en la
excrecin cida orgnica incluyen enfermedades especficas, por ejemplo, acidemia propinica, y a las relacionadas
con anormalidades del ciclo de la urea. Las mediciones de
cido orgnico urinario se realizan por lo comn usando
GC-MS capilar. La ventaja adicional de MS como detector
es la identificacin positiva de cualquier compuesto poco
comn.
Electroforesis
Principios
Figura 44-2 Cromatograma tpico a partir de un anlisis por

GC capilar de derivados del ter metil oxima-trimetilsilil (MOTMS) de esteroides en la orina de una mujer adulta normal. Los
picos mximos son como sigue: A, B, C, estndares internos;
1, androsterona; 2, etiocolanolona; 3, dehidroepiandrosterona;
4, 11-oxo-etiocolanolona; 5, 11-OH androsterona; 6, 11-OH
etiocolanolona; 7, 16-OH dehidroepiandrosterona; 8, pregnanediol; 9, pregnanetriol; 10, androstenetriol; 11, tetrahidrocortisona;
12, tetrahidro-11-dehidrocorticosterona; 13, allo-tetrahidrocorticosterona; 14, tetrahidrocortisol; 15, allo-tetrahidrocortisol; 16,
-cortolona; 17, -cortolona; 18,-cortol.
La separacin electrofortica se basa en la migracin diferenciada de molculas cargadas bajo influencia de un

potencial elctrico aplicado. Las molculas que pueden
separarse por electroforesis deben llevar una carga neta
positiva o negativa en su estado natural, por ejemplo, muchas protenas y aminocidos, o deben aceptar una carga,
por ejemplo, carbohidratos acomplejados con iones borato.
El ambiente qumico alrededor de la molcula, la solucin
electroltica, debe ser capaz de conducir una corriente elctrica, pero tambin tiene un papel crtico en la determinacin del estado de ionizacin y, por tanto, en la carga de
cualquier molcula en contacto con l. La opcin del electrlito y de su pH es crtica para alcanzar movilidad y separacin ptimas. El movimiento de la partcula cargada es
causado por la accin de la fuerza elctrica. La velocidad
de la migracin depende de la relacin entre el potencial
aplicado y la distancia entre los electrodos, la migracin
ms grande puede obtenerse al aumentar el voltaje aplicado o al disminuir la distancia entre los electrodos. El paso
ELECTROFORESIS
de una corriente elctrica genera calor, y las condiciones

ptimas tienen que equilibrarse con la maximizacin de la
separacin. Una fuerza que retarda, la cual est en funcin
del tamao molecular y de la viscosidad de la solucin,
neutraliza la migracin hacia adelante inducida por el campo elctrico. La velocidad de la migracin es, por tanto, directamente proporcional a la fuerza del campo y a la carga
neta de la molcula e inversamente proporcional al tamao
de la partcula y a la viscosidad de la solucin.
La separacin electrofortica se puede llevar a cabo en
solucin libre pero por lo general se utiliza alguna forma
de medio de soporte slido, por ejemplo papel, acetato de
celulosa, gel de agar o gel de poliacrilamida. En los ltimos
10 aos, el inters se ha centrado en realizar la electroforesis en tubos capilares estrechos a voltaje alto, es decir,
electroforesis capilar.
Aplicaciones
La electroforesis se emple por primera vez en el laboratorio clnico en la dcada de 1950 para la separacin de protenas sricas. Desde entonces, se desarrollan aplicaciones
para separar protenas del suero, isoenzimas (p. ej., creatina
cinasa, fosfatasa alcalina, etc.), variantes de la hemoglobina
y fragmentos de DNA resultado de la reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR). En cuanto a la cromatografa, existen muchas otras aplicaciones, por ejemplo la separacin de
435
lipoprotenas, pero stas permanecen en el dominio de la

investigacin y no se emplean como pruebas de rutina.
Electroforesis de protenas sricas
El uso principal de la separacin electrofortica de las protenas sricas es para la identificacin de gammopatas monoclonales, aunque se contina utilizando para demostrar
los cambios relacionados (no especficos) con una variedad
de condiciones, por ejemplo, el sndrome nefrtico. Los
mtodos iniciales para la electroforesis de protenas sricas
utilizaron acetato de celulosa como medio de soporte, pero
ste produjo resolucin limitada de las protenas sricas y se
han reemplazado en gran parte por la electroforesis en gel
de agarosa. Las protenas sricas se separan en las bandas
principales correspondientes a la albmina, 1-globulinas,
2-globulinas, -globulinas (1 y 2) y -globulinas. Si se
utiliza plasma en lugar de suero, una banda adicional de fibringeno est presente, por lo comn entre las regiones y -globulina (fig. 44-3). La visualizacin despus de teir
con rojo de Ponceau o azul brillante de Coomassie es por lo
general adecuada para detectar alteraciones a grosso modo,
pero la exploracin densitomtrica puede emplearse si se
requieren datos cuantitativos sobre las fracciones individuales, es decir, si una paraprotena est presente. Incluso la
mayor resolucin se puede obtener usando los geles de poliacrilamida, pero este valor es raro en el uso clnico de ru-
Albmina
Figura 44-3 Electroforesis de protenas sricas en gel de agar: a) patrn normal; b) aumento monoclonal en -globulinas debido a cirrosis heptica; c) gammapatas monoclonales (IgG) con paresia inmunitaria.
436
CAP. 44
tina. Los sistemas automatizados para la electroforesis de

protenas sricas estn disponibles en la actualidad.
Isoenzimas
Muchas de las enzimas que se miden de rutina en suero
existen como mezclas de isoenzimas, cada una de las cuales
puede producirse por un sistema orgnico diferente en el
cuerpo, por ejemplo, la creatina cinasa (CK) srica es una
mezcla de CK-MM (del msculo esqueltico), de CK-MB
(predominante del corazn) y de CK-BB (del cerebro). Con
la electroforesis puede distinguirse si la causa de una CK
total elevada es un dao del msculo cardiaco o el esqueltico. La separacin se consigue usando geles de agar recubiertos con un sustrato sinttico para la enzima que produce
un compuesto fluorescente visible bajo luz UV cuando es
activado por la CK. Aunque la medicin de las troponinas
especficas del corazn ha sustituido en gran parte las mediciones CK-MB en muchos laboratorios, la electroforesis
sigue como el nico mtodo capaz de detectar la presencia
de los complejos macro-CK. La electroforesis tambin se
utiliza para separar la fosfatasa alcalina en formas heptica,
sea, placentaria e intestinal, y para determinar el patrn de
isoenzimas de la lactato deshidrogenasa.
Hemoglobina
Hasta la reciente introduccin de los mtodos de HPLC
para la identificacin de las variantes de la hemoglobina,
los mtodos electroforticos se emplearon con mucha frecuencia, fundamentados sobre la carga global diferente
en la molcula de la hemoglobina causada por las sustituciones del aminocido. El acetato de celulosa se mantuvo como el medio de soporte normal para los mtodos
de tamizaje, con la electroforesis del gel de agar citrato
usada para la identificacin positiva de cualquier variante
anormal vista en el tamizaje. La separacin de las variantes de la hemoglobina por electroforesis con gel de citrato
confa en las interacciones de los aminocidos sustituidos
con agaropectina. Las hemoglobinas variables con sustituciones cerca de la superficie, por ejemplo, HbS y HbC, se
retienen, mientras que en las sustituciones ms profundas
no ocurre, como HbD y HbG. Combinaciones complejas de electroforesis o el enfoque isoelctrico se requieren
para identificar hemoglobinopatas raras.
Fragmentos de DNA obtenidos por PCR
Aunque fuera del alcance de esta seccin, merece la pena
recordar que muchas de las tcnicas moleculares actuales
introducidas en el laboratorio clnico incluyen la separacin electrofortica de fragmentos de la restriccin del

DNA, despus de amplificacin por PCR. El gel de agar es
el medio usado en la mayor parte de las aplicaciones en la
biologa molecular, con la visualizacin por radiomarcaje o
por tincin con bromuro de etidio. Un ejemplo del empleo
de tales tcnicas es la deteccin de las dos mutaciones en
el gen HFE relacionado con hemocromatosis gentica: los
cambios aminoacdicos C282Y y H63D.
Electroforesis capilar (EC)
Aunque la electroforesis en un capilar estrecho se describi
primero en 1937, es desde 1985 que la tcnica se emplea
de manera independiente. Se utilizan capilares de 25 a 100
m de dimetro y de 25 a 100 cm de longitud; sus extremos se colocan en viales con amortiguador, que tambin
contienen los electrodos. Voltajes muy altos (10 a 30 kV)
se aplican para producir el flujo electroendosmtico dentro
del capilar. El tipo pH y la fuerza inica del amortiguador
que llena el tubo capilar son crticos para lograr la separacin deseada.
Existen cuatro formas importantes de separacin por
electroforesis capilar: electroforesis capilar de zona (CZE)
o separacin en solucin libre; cromatografa capilar electrocintica micelar (MECC); enfoque isoelctrico capilar
(CIEF) e isotacoforesis capilar.
Los principios de estas formas diferentes de separacin
y los usos potenciales en la medicina de laboratorio fueron
revisados hace poco. Se ha desarrollado un instrumento
comercial que usa CE para la electroforesis de protenas
sricas (Beckman Instruments). ste utiliza varios tubos
capilares en paralelo para alcanzar un alto rendimiento e
incluye la identificacin de paraprotenas usando la tcnica
de inmunosustraccin. La CE se convirti en la metodologa dominante en el Proyecto del Genoma Humano, y es
la base para la generacin actual de los secuenciadores de
DNA del banco principal.
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SECCIN 8
INMUNOLOGA
45
Ensayos proteicos
David Burnett
Introduccin
narios, como los descritos en este captulo, existen, sin embargo, realmente slo dos propiedades bsicas utilizadas:
Las tcnicas cualitativas y cuantitativas para el anlisis proteico son herramientas esenciales en el laboratorio rutinario de inmunologa, cuya remisin incluye el anlisis de
algunas protenas en sangre y en otros fluidos corporales.
Entre las protenas de mayor inters especfico para el inmunlogo se incluyen las inmunoglobulinas (anticuerpos),
las protenas del sistema del complemento y, ms recientemente, las citocinas, que tienen una funcin en el sistema
inmunitario. El propsito de este captulo es aportar una
descripcin breve de los principios de los mtodos que se
usan para el anlisis proteico rutinario. Aunque algunos de
los mtodos descritos se utilizan para el estudio de las protenas del sistema del complemento, la naturaleza de este
sistema exige consideraciones especiales para la interpretacin exacta. Por tanto, los ensayos para las protenas del
complemento se describen con detalle en el captulo 46.
De manera similar, los ensayos para los anticuerpos autoinmunitarios se tratan en el captulo sobre enfermedades del
complejo inmunitario y crioglobulinas (cap. 48).
El propsito principal de los anlisis rutinarios de laboratorio en inmunologa es detectar, caracterizar y medir la
cantidad de:
1. Las protenas individuales tienen una carga elctrica

caracterstica, lo que significa que diferentes protenas
especficas pueden separarse por electroforesis.
1. Deficiencias de protenas especficas, como en la deficiencia de inmunoglobulinas.

2. Expresin anormal o inadecuada de protenas, por ejemplo, en gammapatas monoclonales, enfermedad autoinmunitaria o atopa.
Los mtodos para el anlisis de protenas confan en una
variedad de principios. Para la mayora de los ensayos ruti-
2. Cada protena humana especfica tiene una estructura

nica, que puede emplearse para generar anticuerpos
contra esa protena, del tipo de los anticuerpos policlonales al inmunizar animales con la protena en cuestin,
o anticuerpos del tipo monoclonal mediante la tecnologa del hibridoma. Los anticuerpos especficos para una
protena son la base de los ensayos inmunitarios.
La seleccin de un mtodo de ensayo apropiado depende del requerimiento de un resultado cualitativo o cuantitativo. Adems, la concentracin de la protena de inters
es crucial para la eleccin de la prueba, por ejemplo, la
deteccin o medicin de inmunoglobulinas monoclonales
y oligoclonales en lquido cefalorraqudeo (LCR) y orina
puede requerir la concentracin de la muestra o la seleccin de un mtodo ms sensible que el elegido para especmenes del suero.
Una breve perspectiva histrica

Los principios de la electroforesis, el mtodo de separacin
molecular en una carga elctrica, slo se conocieron por algn tiempo cuando el sueco Arne Tiselius, en 1930, sospechando la naturaleza compleja de las protenas sanguneas,
comenz a experimentar con la electroforesis del suero
en un medio lquido con amortiguador. En 1937 identifi-
440
CAP. 45
ENSAYOS PROTEICOS
c varias zonas discretas de la protena, que podran verse

despus de la electroforesis del suero; las llam albmina,
-globulina, -globulina y -globulina, teniendo la primera la movilidad ms rpida hacia el nodo y la -globulina
la ms lenta. Esta nomenclatura bsica sigue vigente (vase
adelante). En la dcada de 1950 desempe un importante
papel como medio de soporte; posteriormente se introdujo
el uso del acetato de celulosa y de los geles como el agar,
la agarosa y la poliacrilamida. En la actualidad, la electroforesis, en fase lquida, se reintrodujo para las pruebas
rutinarias (vase adelante).
Bechhold, en 1905, demostr que un antgeno proteico y
un anticuerpo para ese antgeno pueden formar un precipitado. Sin embargo, Oudin, en 1946 describi un desarrollo til
de este principio y en 1948 Elek y Ouchterlony introdujeron
la difusin doble en un gel independiente. Este mtodo
simple, que todava se utiliza (se describe ms adelante),
se contina llamando mtodo de Ouchterlony. Grabar y
Williams, en 1953, combinaron la separacin electrofortica
de las protenas sricas con la inmunoprecipitacin (inmunoelectroforesis cualitativa), usando anticuerpos policlonales
para suero completo, y lograron que la naturaleza verdadera
de la heterogeneidad de las protenas del suero fuese reconocida. Cuando las protenas especficas comenzaron a purificarse y los anticuerpos para ellas se crearon en animales, se
logr realizar anlisis inmunitarios cuantitativos especficos.
La inmunodifusin radial (tcnica de Mancini) se introdujo
en 1965 y sta todava se emplea de rutina (vase adelante).
La sensibilidad del ensayo cuantitativo de la protena mejor
desde entonces, con radioinmunoensayos e inmunoensayos
enzimticos que permiten mediciones realistas bajo el orden
de varios ng/ml.
Tcnicas cualitativas
Electroforesis
La electroforesis de la protena del suero, aunque presenta una resolucin limitada, es un mtodo fundamental para
analizar muestras para anormalidades de la protena a grosso modo. El medio de soporte para la electroforesis en gel
es, por lo general, una membrana de acetato de celulosa o
gel de agarosa. Los amortiguadores varan pero se basan
en barbitona, con un pH cercano a 8.5. Geles o membranas para la electroforesis rutinaria estn disponibles en
el comercio y se utilizan con frecuencia para minimizar el
tiempo de preparacin y asegurar resultados constantes. La
membrana de soporte se coloca sobre un tanque de electroforesis, conectada en cada extremo a la solucin amortiguadora. La muestra que se quiere analizar se carga en el extremo del ctodo y se aplica una corriente elctrica de 30 min a
una hora. Las protenas en la muestra migran en la corriente
con velocidades proporcionales a su carga. Al trmino de la
separacin electrofortica, se retira el gel o la membrana y
las protenas se insolubilizan por fijacin, por lo general en
una solucin con cido actico, y se visualizan si se tien con
un colorante proteico apropiado (fig. 45-1). El gel puede
semicuantificarse por densitometra; es decir, el gel se examina usando un densitmetro, que mide la densidad del teido (fig. 45-1).
Slo las protenas con una concentracin de 0.1 a 0.5
g/L, o mayor, contribuyen a constituir las bandas de las
protenas sricas observadas, de las cuales regularmente se
representan seis. stas se sealan, en orden de movilidad
electrofortica, como:
THE BINDING SITE

(gel de electroforesis
de protenas del suero)
Figura 45-1 a) Electroforesis en agarosa de muestras sricas, teidas para protena. Las muestras fueron cargadas en el ctodo (base).
La banda en el extremo superior de cada carril representa la albmina. Las bandas con teido denso en el extremo del ctodo representan
paraprotenas. b) Escaneo por densitometra de la electroforesis en agarosa del suero de un sujeto sano. El pico alto a la derecha representa la albmina.
441
TCNICAS CUALITATIVAS
1. Banda de albmina (representada por la albmina del

suero).
THE BINDING SITE

(gel de electroforesis de protenas del suero)
2. Banda 1 (se representa por 1-antitripsina, orosomucoide y -lipoprotena).

3. Banda 2 (representada por la haptoglobina y 2-macroglobulina).
4. Banda 1 (se representa por la transferrina).
5. Banda 2 (representada por protenas y -lipoprotena
del complemento).
6. Banda (se representa por las inmunoglobulinas IgG,
IgM e IgA).
La mayor parte de las protenas del suero, cuando estn presentes en la sangre en concentraciones inferiores
al umbral para este mtodo, no contribuyen a las bandas
observadas. Sin embargo, para el inmunlogo quizs la informacin ms relevante que se obtiene de la electroforesis
es la deteccin de la deficiencia de inmunoglobulinas o de
gammapatas monoclonales. Debido a que las inmunoglobulinas representan diversas molculas del anticuerpo
son, por naturaleza, heterogneas y no estn representadas
por una banda discreta. Ms bien, esta banda se observa
como una banda amplia a menos que exista una banda monoclonal (o M). En casos de gammapata monoclonal,
hay una produccin predominante por un clon expandido
de clulas que producen inmunoglobulinas, de inmunoglobulina de un isotipo (IgG, IgM o IgA) con especificidad
discreta. Estas molculas de inmunoglobulina son idnticas y producen una banda o M discreta (fig. 45-1). La
identificacin de la naturaleza de la protena M monoclonal
en el suero y las cadenas ligeras libres (protenas de Bence-Jones) en orina puede realizarse usando inmunofijacin
precipitando la protena en el medio de soporte, despus
de la electroforesis, con un anticuerpo especfico para cada
isotipo. Las protenas no precipitadas se eliminan con un
lavado y el precipitado restante se visualiza tiendo con
un colorante proteico (fig. 45-2). La protena M tambin se
puede caracterizar por inmunodifusin o inmunoelectroforesis y la concentracin medirse por inmunoensayo cuantitativo (estos mtodos se describen ms adelante). Por el
contrario, una banda reducida sugiere una deficiencia de
la inmunoglobulina y esto debe investigarse ms a fondo
por ensayo cuantitativo (vase adelante).
Exactamente como la secuenciacin de DNA en geles
se ha sustituido en gran parte por los sistemas capilares,
la electroforesis proteica puede realizarse ahora en tubos
capilares que contienen una fase lquida. El modelo CZE
2000 de Beckman-Coulter es un ejemplo. Se le disea para
permitir el anlisis rpido de muchos especmenes: 70 mues-
Figura 45-2 Inmunofijacin y tincin de protenas del suero

despus de la electroforesis. El carril marcado con TSP muestra el
patrn de tincin para todas las protenas. La banda en el extremo
superior es albmina. La banda ms cercana al extremo inferior
es una paraprotena. La inmunofijacin con anticuerpos para IgM,
IgA e IgM humanos revela que la paraprotena es IgM. La fijacin
con anticuerpos para las cadenas ligeras y muestra que la
paraprotena es IgMk.
tras en 90 min. La resolucin es similar a la de los geles.

En realidad, el resultado, que tiene el formato equivalente a
un escaneo por densitometra del gel, puede ser invertido
para dar la imagen simulada de un gel teido.
Inmunodifusin de Ouchterlony
La inmunodifusin se realiza en geles de agar o de agarosa.
Por lo comn, una roseta de pozos se corta en el gel con
un pozo tambin cortado al centro de la roseta (fig. 45-3).
El pozo central se llena con el espcimen de prueba y los
circundantes en la roseta con un antisuero de especificidad
diferente. El gel se incuba en una atmsfera hmeda por
varias horas. Las protenas en el pozo central y aquellas de
la roseta se difunden en el gel. Si el espcimen contiene una
protena para la cual se obtiene uno de los antisueros,
un precipitado comienza a formarse; este precipitado es insoluble a concentraciones de equivalencia. Los geles se
pueden lavar, secar y teir para que se archiven. Usando
este mtodo, la presencia de varias protenas puede detectarse simultneamente en el espcimen de prueba. Como otra
alternativa, varias muestras de la prueba se analizan para
detectar la presencia de una protena especfica colocando
un antisuero especfico en el pozo central y una muestra
diferente de la prueba en cada uno de los circundantes. Las
placas de Ouchterlony estn disponibles en el comercio,
por ejemplo, para identificar el isotipo y la subclase que
representa una paraprotena en una muestra srica.
442
CAP. 45
ENSAYOS PROTEICOS
Figura 45-3 Inmunodifusin de Ouchterlony mostrando el patrn clsico de la roseta de pozos cortados en el gel de agarosa.
Un anticuerpo (generado en un animal como el conejo o la oveja)
fue puesto en el pozo central y las muestras del suero en los pozos satlites circundantes. El suero en el pozo superior contuvo
bien la protena de inters. Las molculas del anticuerpo se han
difundido radialmente a travs del gel y donde encontraron a la
protena que difunda desde el pozo inferior. Las molculas proteicas (antgeno) han sido unidas por molculas del anticuerpo,
produciendo un precipitado visible e insoluble.
Inmunoelectroforesis de contracorriente
La electroforesis de contracorriente es similar, en principio, a la inmunodifusin, pero el antgeno y el anticuerpo
son electroforizados uno hacia el otro en el gel (fig. 45-4).
El uso de la electroforesis en lugar de la difusin asegura
que los resultados se obtengan ms rpido. Se recomienda utilizar la inmunoelectroforesis a contracorriente como
un mtodo de tamizaje inicial rpido (p. ej., para detectar
anticuerpos para antgenos nucleares extrables) y los resultados positivos se confirman por otros mtodos, como la
inmunodifusin de Ouchterlony.
Inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis cualitativa (descrita originalmente por Grabar y Williams) comienza con la electroforesis en
acetato de celulosa, agar o agarosa. Un canal se corta en la
membrana o en el gel, adyacente al paso de la electroforesis. Despus de la electroforesis, el antisuero se coloca en
el canal y la membrana/gel se incuba en una atmsfera hmeda por varias horas. Durante este tiempo, las protenas
Figura 45-4 Electroforesis a contracorriente. Este ejemplo es un

equipo comercial diseado para detectar autoanticuerpos. El antgeno blanco est en las secciones cuadradas a la izquierda
(ctodo) y el suero del paciente se aplica en el nodo (lado derecho de la figura). Bajo influencia de una corriente elctrica, el antgeno y las molculas de inmunoglobulina del paciente emigran
uno hacia el otro. Un inmunoprecipitado, teido con un colorante
proteico, indica la presencia de autoanticuerpos para el antgeno.
separadas por electroforesis y las molculas del anticuerpo

a partir del canal difunden a travs del medio de soporte. Si
los anticuerpos para las protenas separadas estn presentes, se forma un inmunoprecipitado en el gel, que es insoluble a un punto de concentraciones equivalentes. Estos
precipitados son con frecuencia visibles en el gel hidratado, sin teir, slo que la sensibilidad puede incrementarse
despus de que el gel se lava, se fija y se tie (fig. 45-5).
Un antisuero que se obtiene para emplearse como suero
completo revela arcos precipitados que representan todas
las protenas presentes para las cuales hay anticuerpos en el
antisuero. La ausencia de un arco de precipitacin (cuando
se compara a un espcimen de referencia) indica una carencia de protenas. La paraprotena monoclonal tambin
es evidente debido a los precipitados anormales formados
o pronunciados. La presencia o la identidad de una protena
especfica, como una paraprotena, puede confirmarse co-
MTODOS CUANTITATIVOS
Figura 45-5 a) Diagrama que muestra el principio de la inmunoelectroforesis cualitativa. La muestra del paciente se coloca en un
pozo cortado en el gel y las protenas se separan por electroforesis. Despus de la electroforesis, el antisuero se pone en un canal
que corre paralelo a las protenas separadas. El gel se deja en
una atmsfera hmeda para permitir que las protenas separadas
y las molculas del antisuero difundan una a otra. La presencia
de protenas hacia las molculas del anticuerpo son resultado de
un precipitado en forma de arco. b) Inmunoelectroforesis de dos
muestras de suero. Los dos pozos con aplicacin de la muestra
estn en el centro del gel; separados por un canal que contuvo el
antisuero de la oveja se incrementan contra las protenas humanas del suero. La electroforesis fue realizada con el ctodo a la
derecha. Los arcos de inmunoprecipitado en el suero de la parte
inferior muestran un patrn normal; aquellos para IgG, IgA e IgM
se marcan. Obsrvese la ausencia de estos inmunoprecipitados en
la muestra superior, esto indica que este paciente era deficiente
en las tres inmunoglobulinas.
locando un antisuero especfico (p. ej., antisuero especfico

para cadenas pesadas IgG, IgA o IgM humanas o para cadenas ligeras y ) en el canal.
Mtodos cuantitativos
Inmunodifusin radial (fig. 45-6)
Este mtodo tambin se conoce como inmunodifusin
radial nica o mtodo de Mancini. El agar o agarosa,
fundido en un amortiguador conveniente, se deja enfriar alrededor de 55C y el antisuero precipitante especfico para
la protena que se va a medir se aade en la concentracin
apropiada. El gel que contiene antisuero se vierte sobre una
443
Figura 45-6 Inmunodifusin radial sencilla. Este ejemplo muestra un gel de agarosa en el cual se disuelva un antisuero para IgG2
humana. Las muestras de suero humano fueron puestas en pozos que se cortaron en el gel. La placa fue incubada para permitir que las protenas en las muestras difundieran a travs del gel.
Las molculas IgG2 fueron ligadas por anticuerpos para IgG2,
que produjo anillos visibles del precipitado insoluble. El rea
de un anillo del precipitado es proporcional a la concentracin de
IgG2 en la muestra. Obsrvese la ausencia de anillos en algunas
muestras, demostrando la deficiencia en IgG2.
placa o plato de cristal o plstico y se deja enfriar, despus

de lo cual solidifica el gel. Los pozos se cortan en el gel y
cada uno de stos se llena con varios microlitros de suero
de prueba. Una serie de pozos, cada uno lleno con suero de
referencia (o solucin de referencia) contiene concentraciones conocidas de la protena con la que se va ensayar. La
placa se deja en una atmsfera hmeda para permitir que
las protenas dentro de las muestras y de las soluciones de
la referencia difundan en el gel, que contiene antisuero circundante. Cuando las molculas proteicas que estn en el
ensayo difunden en el gel forman precipitados con las molculas del antisuero. Estos precipitados son parcialmente
solubles siempre que la concentracin del antgeno (protena) sea superior a la del antisuero. As, algunas molculas
proteicas continan difundiendo radialmente desde el pozo
hasta que la concentracin del antgeno es equivalente a
la de los anticuerpos. En este punto un anillo de precipitado
insoluble se forma alrededor del pozo de la muestra. El rea
(y por tanto el dimetro) del anillo es directamente proporcional a la concentracin de la protena en la muestra de la
prueba. Por supuesto, siempre que la concentracin del antisuero en el gel y las concentraciones de la protena en la
muestra estn dentro de los lmites apropiados y el proceso
de la difusin se ha dejado correr hasta la terminacin, el
rea del anillo inmunoprecipitado es linealmente proporcional a la concentracin de la protena. sta requiere que
el sistema de la prueba sea titulado por experimentacin.
Tambin significa que es posible que las placas necesiten un
444
CAP. 45
ENSAYOS PROTEICOS
tiempo considerable (quizs varios das) para la difusin y la

formacin del precipitado al dejar que la corrida se complete. Estos contratiempos pueden ser inoportunos y demasiado
lentos para algunos laboratorios con trabajo de grandes volmenes de muestras, pero las placas de inmunodifusin radial
estn ahora disponibles en sus formas comerciales para la
medicin de protenas clnicamente importantes, incluyendo
isotipos, subclases y cadenas ligeras de inmunoglobulinas.
Estas placas comerciales se producen dentro de tales tolerancias para obtener resultados exactos y precisos antes de
que la difusin haya corrido completa (mtodo de Fahey y
McKelvey), aportando resultados en slo algunas horas. De
hecho, las concentraciones del antisuero se incorporan con
tanta exactitud que, con una prdida pequea y normalmente
irrelevante de exactitud, las concentraciones de la protena
pueden ser interpoladas, a partir de los dimetros del anillo,
a las curvas estndares de referencia suministradas con el
equipo, sin usar soluciones estndares de referencia. El lmite de la sensibilidad de un ensayo por difusin radial depende en gran parte de la calidad del antisuero pero est por lo
general en el orden de alrededor de 5 mg/L. Algunas placas
desarrolladas para el comercio pueden medir protenas tan
bajas como 0.2 mg/L.
Los mtodos cuantitativos descritos antes confan en la formacin de complejos insolubles protena-anticuerpo que
pueden visualizarse por el ojo en medios con soporte de gel.
Si el precipitado se forma con una protena y un anticuerpo
a concentraciones bajas en un medio lquido, un precipitado ms fino se forma en la suspensin. Esta propiedad
puede utilizarse para medir la concentracin de la protena.
La presencia de un precipitado impedir que un haz de luz
atraviese la suspensin (turbidimetra). De manera alterna,
la luz dispersada por la suspensin puede detectarse en un
ngulo hacia la luz incidente (fig. 45-7). Este mtodo se
llama nefelometra. La cantidad del inmunoprecipitado, a
una concentracin constante del anticuerpo, aumentar en
proporcin con la concentracin de la protena, hasta que
todo el anticuerpo se ha ligado al antgeno. La medicin
de la dispersin de la luz debe, por consiguiente, hacerse
en condiciones de exceso del anticuerpo; se hace como un
punto final o por un analizador de la velocidad que mida
el aumento en la dispersin como las formas del precipitado. Es claro que este acercamiento, a diferencia incluso de
mtodos ms sencillos como la inmunodifusin radial,
requiere aparatos especializados pero ofrece un grado de
automatizacin y un procesamiento alto de los especmenes. Algunos laboratorios usan analizadores centrfugos en
los cuales los reactivos son mezclados durante la centrifugacin, reduciendo el tiempo del ensayo. El lmite de sen-
Fuente de luz
Partculas
dispersas
Detector de
turbidez
Cubeta
Nefelmetro
Principio de la nefelometra/turbidimetra
Figura 45-7 Esquema simplificado que muestra los principios

de la turbidimetra y de la nefelometra (vase el texto para una
explicacin).
sibilidad de esta metodologa, como en la mayor parte de

los inmunoensayos, depende del sistema especfico y, sobre
todo, de la calidad de antisuero, que debe ser policlonal. En
un buen sistema, el lmite es alrededor de 10 mg/L, pero
puede mejorarse a casi dos rdenes de magnitud usando
nefelometra reforzada con partculas, cuando los anticuerpos se ligan a las perlas diminutas del poliestireno. Los
reactivos para la turbidimetra y la nefelometra de protenas clnicamente importantes, como isotipos y subclases de
inmunoglobulina, estn disponibles en el comercio.
Ensayos de inmunoabsorbencia ligados a enzimas
Los ensayos de inmunoabsorbencia ligados a enzimas
(ELISA), tambin llamados inmunoensayos enzimticos
(EIA), representan un principio verstil y sensible para la
medicin de la protena, que ha reemplazado en gran parte a los radioinmunoensayos. Pueden medir protenas por
debajo de concentraciones cercanas a 1 g/L. Son ensayos convenientes que se emplean si la protena de inters
est presente en una concentracin baja. Estos ensayos se
realizan en placas de plstico con 96 pozos y el manejo
del reactivo se hace normalmente por medio de pipetas de
multicanal. ELISA es conveniente para la automatizacin
o semiautomatizacin y, por tanto, incluso para la protena
que se mide en una concentracin alta, haciendo necesaria
la dilucin de la muestra; si una gran cantidad de muestras
est procesando esta tcnica puede ser ms conveniente
que otros mtodos ms simples, como la inmunodifusin
radial. Muchos laboratorios construyen sus propios sistemas internos de ELISA, pero los equipos en el comercio
estn disponibles para una amplia gama de aplicaciones,
445
MTODOS CUANTITATIVOS
(a )
(b )
Conjugado
enzima-anticuerpo
Conjugado
enzima-anticuerpo
Antgeno blanco
Anticuerpo blanco
Anticuerpo inmovilizado
Antgeno
(c )
(d )
Anticuerpo
animal conjugado
enzimticamente
IgG de oveja
anticonejo conjugado
enzimticamente
Anticuerpo humano
contra el antgeno
El anticuerpo de conejo
ligado a protena
no puede hacerlo a la
protena sobre la placa
Muestra de
suero que
contiene la
protena de
inters incubada
con anticuerpo
de conejo
para la protena
Anticuerpo de conejo
gado al antgeno sobre
la placa
Antgeno
Antgeno
Figura 45-8 a) ELISA indirecto. La figura muestra el principio de esta tcnica para la deteccin de anticuerpos especficos. b) ELISA
directo de emparedado para detectar un antgeno especfico en una muestra. c) ELISA competitivo para detectar o medir un anticuerpo
especfico para un antgeno conocido. El mtodo confa en un anticuerpo (conjugado enzimticamente), que se obtiene de un animal como
el conejo o la oveja, que reconoce el mismo antgeno como el anticuerpo blanco que se est midiendo. El espcimen se mezcla con el
anticuerpo conjugado que compite para ligar al antgeno utilizado sobre la placa de ELISA. d) ELISA competitivo para detectar o para
medir una protena (antgeno). La muestra que se prueba se incuba con un anticuerpo producido para el antgeno de inters (en este caso
un anticuerpo de conejo). El anticuerpo de conejo se liga al antgeno blanco en la muestra, que evita a aquellas molculas del anticuerpo
al unirse posteriormente al pozo con ELISA cubierto con el antgeno. Cualquier anticuerpo de conejo que no se una al antgeno en la
preincubacin es capaz de unirse al pozo ELISA y se le detecta con la adicin de un anticuerpo conjugado enzimticamente para IgG
de conejo (en este caso, IgG de oveja anticonejo). La cantidad de producto enzima-sustrato medido ser inversamente proporcional a la
cantidad de protena blanco en la muestra original.
incluyendo ensayos para medir protenas sricas importantes, citocinas, antgenos microbianos (p. ej., Chlamydia
trachomatis, antgenos del virus de hepatitis B), anticuerpos de IgE para alergenos y anticuerpos para patgenos.
Los diferentes sistemas de ensayo varan en detalles
pero los principios esenciales siguen siendo similares. Las
formas ms simples son ELISA indirectos para detectar
anticuerpos especficos y ELISA directos de emparedado para detectar los antgenos.
ELISA indirecto para la deteccin del anticuerpo (fig.
45-8a) se basa en la microtitulacin de pozos de la placa
cubiertos con un antgeno blanco apropiado (p. ej., protena de un patgeno). Las muestras que se prueban se aplican
a los pozos, seguidas por un anticuerpo conjugado enzimticamente para la inmunoglobulina humana. La enzima es
por lo comn la peroxidasa de rbano (HRP) o la fosfatasa
alcalina. La eleccin de la inmunoglobulina antihumana
permitir la deteccin de todos los isotipos (usando antisuero que se obtiene contra las inmunoglobulinas humanas
IgG, IgA e IgM), o de un isotipo especfico (p. ej., anticuerpos IgE para alergenos). Despus de un lavado adicional
para eliminar el anticuerpo conjugado no ligado, un sustrato conveniente se agrega a los pozos. Un producto coloreado se detecta usando un lector de ELISA que recolecta
a la longitud de onda apropiada (450 nm para HRP; 492
nm para la fosfatasa alcalina), la muestra del anticuerpo
blanco en el espcimen original. Estos ensayos pueden ser
cuantitativos.
Para ELISA directo de emparedado para detectar antgenos (fig. 45-8b), los pozos de microplacas de 96 pozos
(tambin se pueden conseguir como tiras de ocho pozos)
se cubren con un anticuerpo para la protena que se detecta o mide. ste no necesita ser un anticuerpo precipitante, por lo tanto, los anticuerpos monoclonales se usan
con frecuencia. Cada pozo se llena con una muestra de la
prueba o bien con una gama de soluciones de referencia
de concentracin conocida. Los pozos se incuban por un
tiempo apropiado (cerca de una hora), despus de lo cual
446
CAP. 45
ENSAYOS PROTEICOS
se lavan para retirar el material que no es capturado por el

anticuerpo en la superficie del pozo. Los pozos entonces
se llenan de una solucin de otro anticuerpo para la protena que se mide. Es claro que si el anticuerpo primario fue
monoclonal, el mismo anticuerpo monoclonal no puede
ser eficaz en este paso porque la protena blanco podra
tener un antgeno determinante (epitopo) reconocido por
el anticuerpo. Es aqu donde es necesaria una cierta experimentacin, para identificar un segundo anticuerpo que
reconozca a la protena despus de que la haya capturado el antgeno primario inmovilizado sobre los pozos de
la placa. Este segundo anticuerpo est conjugado con la
enzima. La placa se incuba otra vez para permitir que el
segundo anticuerpo conjugado enzimticamente se una con
la protena capturada. La placa se lava de nuevo y el sustrato para la enzima conjugante se agrega a los pozos. El
sustrato produce un producto de reaccin soluble y coloreado. Puesto que la cantidad de anticuerpo conjugado de
forma enzimtica que se une es proporcional a la cantidad
de protena capturada por el anticuerpo primario, resulta
que la cantidad del producto de la reaccin enzimtica es
proporcional a la concentracin de la protena en la muestra original. La cantidad del producto de reaccin se mide
usando un lector de placas ELISA, el cual pasa la luz a
travs de cada pozo a una longitud de onda que absorbe el
producto de reaccin y, para la cuantificacin, los resultados se interpolan a partir de aquellos que se obtienen con
las soluciones de referencia.
Otro tipo de ELISA es competitivo. Un ejemplo se
muestra en la figura 45-8c. Esta muestra ELISA de competicin se emplea para la deteccin de anticuerpos especficos. Los pozos se cubren con el antgeno que se reconoce
con la molcula del anticuerpo de inters. Las muestras del
paciente se agregan a los pozos junto con las molculas del
anticuerpo generado en animales experimentales, con especificidad para el mismo antgeno, como aquella reconocida por el anticuerpo que es ensayado. Habr competencia
para unir al antgeno. Entre ms molculas del anticuerpo
estn en la muestra del paciente, menor es la unin de los
anticuerpos conjugados. La figura 45-8d muestra el razonamiento para un ELISA competitivo para la deteccin o la
medicin de un antgeno. En este caso, los pozos estn cubiertos con el antgeno de inters. La muestra del paciente
se preincuba con, o se aade, junto con un anticuerpo conjugado enzimticamente al antgeno. Cualquier antgeno
en la muestra ocupa sitios de unin con el antgeno sobre
el anticuerpo disminuyendo su unin con el antgeno que
cubre el pozo.
Existen muchas permutaciones sobre estos estilos bsicos de ELISA y algunas se describen en la lista de Lecturas complementarias, al final de este captulo.
Conclusin
Los laboratorios que trabajan de manera rutinaria grandes
volmenes de muestras para inmunologa tienen a su disposicin una gama de mtodos para el anlisis de la protena
de dnde elegir. Los mtodos empleados se determinan a
travs de consideraciones incluyendo la naturaleza de los
especmenes, las identidades de las protenas que son medidas y sus concentraciones en los especmenes. Tambin, la
cantidad de especmenes procesados de rutina determinan
si los sistemas automatizados necesitan emplearse. Muchos
de los mtodos usados en la actualidad han cambiado slo
en detalles desde que las protenas especficas comenzaron
a identificarse y medirse, y algunos de ellos es probable que
sigan emplendose por mucho tiempo ms. Otros, como
ELISA, representan tecnologas ms nuevas que desplazan
a aquellas con desventajas tcnicas o prcticas, como los
radioinmunoensayos. Hay muchos progresos en la caracterizacin de la protena, en especial en el campo del anlisis
de datos, como para los protemicos. Cmo y cundo, los
laboratorios que trabajan grandes volmenes de muestras
de protenas lleguen a adoptar mtodos nuevos se tendr
que esperar para descubrirlo.
Reconocimientos
Debo agradecer a Roger Drew de la Binding Site Ltd., por algunas de las figuras aqu publicadas.
Chapel H, Haeney M. Essentials of Clinical Immunology, 3rd
edn. 1993: Blackwell Scientific, Oxford.
Crowther JR. The ELISA Guidebook. Methods in Molecular Biology Series, vol 149. 2002: Humana, Totowa, NJ.
Rose NR, Hamilton RG, Detrick B. Manual of Clinical Laboratory
Immunology, 6th edn. 2002: ASM Press, Washington, DC.
Sheehan C. Clinical Immunology. Principles and Laboratory
Diagnosis, 2nd edn. 1997: Lippincott, Philadelphia, PA.
46
Ensayos del complemento
J. North y K Whaley
Introduccin
El complemento es un sistema de las protenas del suero
y de los receptores celulares que tiene varias funciones, la
mayor parte de las cuales ayuda al husped a prevenir o luchar contra la infeccin. Descrito originalmente como una
sustancia sensible al calor que podra, junto con el anticuerpo especfico, lisar ciertas bacterias, ahora se sabe que
las protenas del complemento actan por medio de dos
rutas principales. La activacin de estas rutas conduce a la
deposicin de una opsonina potente en la superficie de los
microorganismos, adems de producir una respuesta inflamatoria que libera factores vasoactivos y quimiotcticos.
Otros componentes pueden daar las superficies celulares,
pero aun otro grupo controla la activacin espontnea y potencialmente daina de estas rutas.
Los niveles de las protenas del complemento pueden
ensayarse por varios mtodos, y es tambin posible determinar la actividad funcional de la mayor parte de los componentes. Para apreciar de modo completo las condiciones
requeridas para estos ensayos, es importante entender el
proceso que ocurre. Por consiguiente, una vista general
breve del complemento se describe en la seccin siguiente,
con muchos detalles que se encuentran en las secciones individuales del ensayo.
a la secuencia de activacin). La ruta clsica puede activarse

por IgG o IgM que se han ligado al antgeno. El C1q se liga
a ese anticuerpo y, una vez que est unido, se activa el C1r,
que a su vez activa el C1s. El C1s activado es una proteasa
cuyo sustrato es C4, que es cortada. El C4 cortado (C4b) liga
el C2 y el C1s entonces activa el C2 (para formar C2a) por
protelisis limitada. El complejo activo C4b2a (ruta clsica
C3 convertasa) activa el C3, otra vez por protelisis limitada.
Los iones calcio y magnesio se requieren para la activacin
de la ruta clsica. El C3 activado (C3b) liga covalentemente
a las superficies y acta como ligando de alta afinidad para
los receptores de C3b en los fagocitos.
Esta ruta se puede tambin activar con el C1q unido a
la protena C-reactiva, una protena de fase aguda, similar
en forma a la IgM, que se liga al carbohidrato en algunas
bacterias. La lecitina unida al carbohidrato manano (MBL)
es una protena funcionalmente similar que se parece a C1q
por s misma; y la MBL forma un complejo macromolecular con las proteasas serinas 1 y 2 relacionadas con MBL
(MASP1 y MASP2), que tiene muchas de las mismas propiedades que C1r y C1s. El complejo MBL-MASP puede,
por tanto, activar la ruta clsica a travs de C4 cuando se
liga a un carbohidrato conveniente, como la manosa, la Nacetilglucosamina, la glucosa o la fucosa.
La ruta alterna
La ruta clsica
La primera ruta que se describe aqu se denomina la ruta
clsica, y los componentes en este sistema se prefijan con
C y lo comprenden C1q, C1r, C1s, C4 y C2 (los nmeros
son atribuidos al tiempo de definicin de los componentes, no
C3, el factor B, el factor D y la properdina son los componentes de la ruta alterna de activacin del complemento. La
activacin de esta ruta no descansa en alguno de los factores especficos desencadenantes sino en un nivel constante
bajo de activacin espontnea. Una proporcin pequea de
448
CAP. 46
ENSAYOS DEL COMPLEMENTO
Ruta alterna
Ruta clsica
Patgeno + anticuerpo
Carbohidrato manano en la
superficie bacteriana
Activador de superficie
Ruta clsica
Convertasa C4
Ruta alterna
Convertasa C5
Ruta clsica
Convertasa C5
Autoensamblaje
C5b C6 C7 C8 C9n
Complejo de ataque a membrana
Figura 46-1 La ruta clsica y la ruta alterna de la activacin del complemento. Los componentes con actividad de proteasa se muestran
en verde, las colectinas en azul y las anafilotoxinas en rojo.
C3 circulante se hidroliza, y esta forma de C3 puede ligar

el factor B en presencia de los iones de magnesio. El factor
B ligado es cortado por el factor D para formar Ba y C3Bb;
ste puede activar ms C3 para formar C3a y C3b. C3b
puede ligarse a las superficies y, una vez unido, liga ms
factor B. El C3b ligado a la superficie de los microorganismos es resistente a la actividad reguladora de los factores
H e I, de modo que se favorece la activacin. Del mismo
modo que el factor B ligado al C3 circulante es cortado, el
factor B ligado a C3b sobre las superficies es cortado por el
factor D para dar C3bBb. Este complejo es estabilizado por
la properdina y tanto C3Bb como C3bBbP pueden cortar
ms molculas C3, amplificando as el proceso. Otra funcin del complejo C3dBbP es que puede ligar y activar el
C5 (vase adelante).
Las dos rutas se muestran en la figura 46-1.
El complejo de ataque de membrana

Los componentes C5, C6, C7, C8 y C9 del complemento
forman la ruta terminal. C5 puede activarse con las enzimas
convertasas de la ruta clsica o de la ruta alterna (C4b2a y
C3bBbP, respectivamente). El C5 activado se liga a C6 y a
ENSAYOS DE LOS NIVELES SRICOS DEL COMPLEMENTO
los componentes restantes; C7, C8 y C9, se ligan a su vez.

Seis molculas de C9 ligan a este complejo y forman un
poro en la membrana de una clula en la que est presente.
Esto puede conducir a la lisis de la clula y es una propiedad que se emplea en los ensayos hemolticos descritos
ms adelante.
Productos biolgicamente activos de activacin
del complemento
Una de las funciones principales del sistema del complemento es depositar C3b en la superficie de los microorganismos y, como se describe antes, esto puede ocurrir por
la ruta clsica o por la ruta alterna. El C3b presente en la
superficie de los microorganismos aumenta su captacin de
fagocitos, como los neutrfilos, va receptores para C3b, y
tambin estimula las clulas. La activacin de la ruta clsica por los complejos inmunitarios de anticuerpo y antgeno aumenta la solubilidad de tales complejos y ayuda
a su eliminacin de la circulacin por los receptores del
complemento en los eritrocitos.
Segn se mencion antes, los complejos de C5b-C9
pueden causar la lisis de los microorganismos por la insercin de los polmeros de C9 en la membrana celular.
La lisis de las clulas presentes puede ocurrir a menos que
sean protegidas por el receptor CR1 de C3, el factor acelerador de la degradacin (DAF), la protena del cofactor
de la membrana (MCP) y el CD59, los cuales previenen la
polimerizacin de C9. La activacin de C4, de C2, de C3,
del factor B y de C5 crea fragmentos relativamente pequeos que son liberados. Los dos ms importantes son las
anafilotoxinas C3a y C5a, que son vasoactivas y liberan
la histamina de los mastocitos. C5a es tambin un agente
quimiotctico poderoso que activa los neutrfilos y monocitos.
Control de la activacin del complemento
La activacin espontnea del complemento necesita controlarse para prevenir una respuesta inflamatoria innecesaria. La ruta clsica se regula por el inhibidor de las
protenas C1 del suero (C1-inh), C4bp y el factor I y por
la protena del cofactor de la membrana de las molculas
de la superficie celular (MCP), el factor acelerador de la
degradacin (DAF, CD55) y CR1. La ruta alterna se regula
por los factores H e I y la MCP, el DAF y el CR1. Todos
estos factores aceleran la degradacin de una o ms de las
protenas o de los complejos activados del complemento, y
por tanto la activacin del complemento ocurre slo si los
estmulos activadores pueden generar bastantes productos
activos para superar los mecanismos inhibidores.
449
Ensayos de los niveles sricos del complemento

Preparacin y almacenaje de la muestra
El almacenaje incorrecto de las muestras para el ensayo
del complemento produce niveles disminuidos, ya que algunos componentes son extremadamente lbiles. Para los
ensayos de los componentes individuales en el suero, las
muestras de sangre deben llegar al laboratorio tan pronto
como sea posible despus de la venopuncin. Debe permitir que la sangre se coagule a la temperatura ambiente
por 30 min, despus se coloca la muestra sobre hielo por
una hora para que la retraccin del cogulo ocurra antes de
separar el suero a una temperatura de 2 a 4C. Las muestras
se alcuotan y almacenan a 70C tan rpido como sea
viable. Para su uso, las muestras se descongelan a 37C,
despus se colocan de inmediato en el hielo: al congelar
y deshielar repetidamente disminuyen la actividad hemoltica de los componentes. La sangre colectada en EDTA
(que previene la activacin adicional del complemento al
quelar el calcio y el magnesio y, por tanto, hace que las
muestras sean convenientes para los ensayos del producto
de activacin) se guarda en hielo el tiempo ms corto posible antes de centrifugarse para producir el plasma escaso
de plaquetas que se almacena, en lo que se refiere al suero.
Las muestras del cultivo tisular se benefician de la adicin
de los inhibidores de la proteinasa, como PMSF.
Ensayos inmunoqumicos
Estos ensayos utilizan anticuerpos especficos para los componentes individuales del complemento, estn disponibles en
formas comerciales y pueden utilizarse en los ensayos nefelomtricos, ELISA o de inmunodifusin. La eleccin del
anticuerpo es crtica, ya que los anticuerpos policlonales pueden reconocer los productos de desintegracin del componente bajo investigacin y el valor resultante que se obtiene
puede no reflejar el nivel de la protena funcional presente.
El tipo de sistema del ensayo que se emplee depende
del nmero por realizar, del nivel de sensibilidad requerido,
del nivel del analito y de la calidad del anticuerpo disponible.
Por ejemplo, la nefelometra se utiliza en los laboratorios
clnicos rutinarios de inmunologa para medir C3, C4, C1inh y C1q en las muestras de pacientes donde los niveles
son de 50 g/ml o ms. Para los estudios del cultivo celular,
sin embargo, los niveles pueden ser tan bajos como 1 ng/ml
y el ELISA, aunque es ms laborioso y requiere ms tiempo, es ms prctico. Las tcnicas de inmunodifusin radial
y gel rocket, aunque consumen tiempo y no son especialmente sensibles, son relativamente simples y pueden emplearse para identificar los productos de degradacin, por
ejemplo, la inmunoelectroforesis rocket de doble difusin
450
CAP. 46
para la deteccin de C3d, y para las formas anormales de

los componentes del complemento, por ejemplo, la inmunodifusin Ouchterlony del suero humano normal (NHS) y
del suero deficiente de C8 frente al anti-C8 pueden revelar
las lneas de identidad parcial que sugieren la deficiencia
de la cadena C8. Los amortiguadores intermediarios empleados, que se utilizan por lo general en estos tipos de
ensayo, son los ptimos para el anticuerpo de unin y solucin salina amortiguada con fosfato (PBS).
Ensayos hemolticos del complemento
Ensayos CH5O
La lisis de los eritrocitos de la sangre por el complemento
ocurrir si el MAC est montado en la membrana celular y
se insertan los polmeros de C9. Los ensayos dependen de
la presencia de todos los componentes necesarios y de las
condiciones apropiadas para la activacin del complemento. El ms simple de estos ensayos es el CH50 (fig. 46-2),
un procedimiento cuantitativo que depende de una muestra
Volumen srico (l).
Figura 46-2 Trazo log-log de y/1 y frente al volumen del

suero diluido en un ensayo CH50. En el punto de 50% de hemlisis, y(1 y) 1 y el volumen del suero diluido resultante se
muestra en la lnea vertical. y proporcin de las clulas lisadas.
Redibujada de Whaley (1985), con permiso de Elsevier.
que contiene todos los componentes clsicos y terminales

del complemento, y de los componentes que son funcionalmente activos.
El ensayo se realiza en presencia de los iones calcio y
magnesio (requeridos para la activacin de la ruta clsica)
e iniciando la ruta con la presencia de la IgM sobre la superficie de los eritrocitos de la sangre de ovejas (EA).
Un ensayo similar para la ruta alterna, el APH50, utiliza

los eritrocitos del conejo, que proporcionan una superficie para la unin del C3bBb. La adicin de EDTA, para la
quelacin de los iones de calcio pero no los de magnesio,
previene cualquier activacin concomitante de la ruta clsica mientras permite la activacin de la ruta clsica.
Estos ensayos necesitan controlarse con muestras conocidas que contienen todos los componentes, por ejemplo,
el NHS fresco (control positivo), y por el amortiguador
solo (control negativo) para medir la lisis espontnea de los
eritrocitos. La cuantificacin del ensayo puede realizarse
comparando la cantidad de hemlisis (medida por la densidad ptica del sobrenadante celular, que es proporcional a
la cantidad de hemoglobina liberada) con un NHS normal
conocido en un mtodo de un tubo, o diluyendo toda la
muestra de prueba para obtener un rango del porcentaje de
hemlisis. Usando la ecuacin de von Krogh, que describe
la curva que se obtiene trazando el porcentaje de lisis contra la dilucin de la muestra, se calcula la dilucin de la
muestra requerida para obtener el 50% de hemlisis y, despus de tomar en cuenta la dilucin inicial de la muestra,
este valor se traduce a unidades/ml de CH50. La unidad de
CH50 que se obtiene depende de la cantidad y la naturaleza del anticuerpo utilizado para sensibilizar las clulas, la
concentracin y fragilidad del eritrocito, la fuerza inica,
la concentracin del catin divalente y el pH del amortiguador, el tiempo de reaccin y la temperatura.
Los ensayos CH50 y APH50 se utilizan para determinar si un paciente es o no genticamente deficiente en un
componente del complemento. Un valor cero en un ensayo
CH50, pero no en APH50, indica una falta del C1, C4 o de
C2, mientras que para un resultado normal de CH50 y un
APH50 de cero, una deficiencia de properdina o el factor
D pueden estar presentes (la deficiencia del factor B no se
ha descrito). La ausencia de lisis en ambos ensayos indica la carencia de C3, C5, C6, C7 o C8. Los niveles bajos
de lisis pueden ocurrir por la deficiencia de C9. Los valores bajos cerca de cero sugieren que el nivel de uno o ms
componentes del complemento est disminuido, debido a
la consuncin en un proceso de enfermedad, como el lupus
eritematoso sistmico, o pueden indicar un estado de deficiencia heterocigota (aunque los niveles del complemento
pueden ser variables en estos individuos, ya que muchos
componentes son protenas de fase aguda).
Ensayos hemolticos para los componentes individuales

usando sueros deficientes del complemento
Los ensayos por la presencia y la actividad funcional de los
componentes individuales se pueden realizar usando el eritrocito sensibilizado y un suero deficiente en el componente
451
ENSAYOS DE LOS NIVELES SRICOS DEL COMPLEMENTO
elegido. Las diluciones seriales de una muestra de prueba

se agregan y la lisis del eritrocito sensibilizado ocurre slo
si el componente que se pretende verificar est presente y es
funcional. Otros componentes estn presentes en exceso,
as que la lisis es proporcional a la cantidad del componente de prueba. Los sueros deficientes pueden obtenerse
en presentaciones comerciales y tambin prepararse en el
laboratorio, si los ensayos se realizan regularmente. Tales
ensayos son de sensibilidad ms baja que los descritos ms
adelante y no son convenientes para los componentes reguladores (C1-inh, factores H e I, properdina).
1:160104 1:40104 1:20x104
Ensayos hemolticos para los componentes individuales

usando el eritrocito presensibilizado
Los eritrocitos pueden presensibilizarse con los primeros
componentes de la ruta hasta llegar al que est bajo prueba. Agregando una muestra que contiene un componente de
investigacin, este componente pueden activarlo o ligarlo a
aquellos componentes ya presentes. La adicin de los componentes restantes da lugar a la lisis si el componente de
prueba est presente y es funcional. Si se asegura que el
resto de los componentes est en exceso, el grado de lisis
es proporcional a la cantidad del componente de prueba.
Los componentes funcionalmente puros pueden prepararse en el laboratorio, pero la mayor parte estn disponibles
en presentacin comercial. Los eritrocitos sensibilizados y
presensibilizados que se emplean con ms frecuencia son
EAC1, EAC4 y EAC14. Los EAC1 se preparan agregando
C1 (p. ej., a partir de suero del cerdo de Guinea precipitado
con 5 mM de CaCl) al eritrocito sensibilizado en un amortiguador de fuerza inica baja que contenga calcio y magnesio. La adicin de suero humano en presencia de EDTA
produce la unin de C4 y C2, y la incubacin subsiguiente
a 37C causa la degradacin de C1 y C2 desde las clulas,
dejando EAC4. Las clulas EAC14 se preparan agregando
ms C1, otra vez en presencia de calcio y magnesio.
Las clulas EAC4 se utilizan para ensayar la actividad de
C1 agregando diluciones de la muestra de prueba seguida
por C2 del conejillo de Indias. La hemlisis se logra agregando los componentes restantes, en forma de suero de rata
que contiene EDTA (Crat-EDTA). La concentracin de las
molculas eficaces del componente bajo prueba se mide trazando el valor Z [ln(1 % de lisis)] contra la dilucin del
componente bajo prueba (fig. 46-3). El trazo de lnea recta
que se obtiene resulta de la Teora de un golpe, en que una
sola molcula eficaz del complemento (C1-C9) resulta en
la lisis celular. Una unidad de complemento se toma como
aquella que proporciona 63% de lisis en un ensayo para
aquel componente. Si un trazo de lnea recta no se obtiene,
entonces la concentracin de uno o ms componentes bajo
prueba es limitada.
1:10104
1:5104
Dilucin del suero
Figura 46-3 El nmero de molculas funcionales por clula (Z)

se traza contra la dilucin del suero en una titulacin hemoltica
tpica de un componente individual del complemento. La concentracin del componente en este caso est dada por y/x 50 000.
Redibujada de Whaley (1985), con permiso de Elsevier.
C4 se ensaya usando EAC1 agregando diluciones de la

muestra de prueba, C2 del conejillo de Indias y Crat-EDTA
en lo que se refiere a C1, mientras se mide la actividad C2
usando EAC14. En este caso, el Tmx para las clulas (tiempo para la formacin mxima de C4b2a) debe conocerse.
El Tmx vara de lote a lote del EAC14 porque depende de
la cantidad de C4b presente en las clulas. Para ensayar la
actividad de C3, es necesario formar EAC142. El complejo
C4b2a en estas clulas es ms inestable que la mayor parte,
por tanto, los EAC14oxy 2 son preparados para proporcionar
la actividad hemoltica incrementada del C2 (fig. 46-4).
EAC14 forma el punto de arranque de los ensayos funmx
Tiempo de incubacin (min)
Figura 46-4 Trazo del nmero de sitios hemolticos (Z) contra

el tiempo de incubacin a 30C en un ensayo de Tmx. Tmx est
indicado por la flecha. Redibujada de Whaley (1985), con el permiso de Elsevier.
452
CAP. 46
cionales de los componentes de la ruta alterna. El C2 y

C3 son agregados a la forma EAC1423, con la eliminacin
subsiguiente de C1 y C2 con la incubacin en el amortiguador EDTA. El EAC43b resultante forma una ruta alterna,
la C3 convertasa, si se agrega el factor B, el factor D y la
properdina. La hemlisis se logra agregando Crat-EDTA.
La actividad del factor B, del D o de la properdina se mide
omitiendo el componente puro respectivo y sustituyndolo
con las diluciones de la muestra de prueba aunque este mtodo no es conveniente para ensayar el factor D srico, slo
las preparaciones puras. Los componentes terminales se
ensayan agregando C3 y los componentes terminales elevados para llegar al que est bajo prueba para el EAC14oxy
2. El EAC1-8, utilizado para medir la actividad de C9, sin
embargo, experimenta lisis espontnea, as que debe emplearse tan pronto como est preparado.
Otros ensayos de la funcin del complemento
La medicin de la actividad de la ruta clsica es posible con
equipos comerciales. Algunos de stos se basan en ELISA,
y el complemento srico es activado por los complejos inmunitarios presentes en la celdilla. Midiendo la cantidad
de un neoantgeno del componente terminal, normalmente
C9 generado, se valora la actividad. Un sistema automtico emplea liposomas que contienen una enzima (G6PDH),
que se libera cuando el anticuerpo reacciona con el antgeno en el liposoma, slo cuando la ruta clsica entera est
presente. La reaccin de la enzima con un sustrato en la
mezcla del reactivo produce un cambio del color proporcional a la actividad de la ruta clsica. Los autores no son
conscientes de cualquier mtodo automtico para APH50.
La MBL puede ensayarse funcionalmente cubriendo los
eritrocitos de ovejas con carbohidratos manano y realizando el resto del ensayo en lo que respecta a un CH50. Se ha
descrito un ensayo funcional alternativo que mide la capacidad de la lectina de unin a mananos (MBL) para activar
el C4. El manano es cubierto en una placa de ELISA y
se mide la cantidad de C4c generada del suero agregado,
una alta concentracin de sal en el amortiguador previene
la activacin de la ruta clsica.
Ensayos funcionales de las protenas de control
del complemento
La actividad del inhibidor C1 puede ensayarse con los
equipos comerciales que utilizan la capacidad del inhibidor C1 para inhibir un C1s anlogo en una reaccin colorimtrica. La actividad del inhibidor C1 puede tambin
medirse examinando la capacidad de la muestra de prueba
para inhibir un nivel dado de C1 exgeno adicionado al eri-
trocito sensibilizado. Si al suero se le examina entonces C1

primero tiene que ser eliminado, por ejemplo, precipitando
todo el C1 usando el amortiguador de fosfato. El inhibidor
C1 puede permitirse ligar a C1, o en la fase fluida antes de
agregar a EAC4 con C2 o en EAC14, antes de la adicin
del C2. Para los ensayos hemolticos del componente inhibidor, una reaccin solitaria que no contiene inhibidor se
corre en paralelo. La actividad inhibidora de la muestra de
prueba se expresa en unidades Z y se asume que la inhibicin de la lisis sigue la misma teora de un golpe, como
la lisis. Se toma I como la proporcin de la lisis de C1 que
z
se inhibe y, por tanto, I 1 e . Por lo tanto Z ln(1
I) o:
Z ln
y en la muestra de prueba
y en solitario
Cuando Z en el tubo solitario est entre 0.5 y 1.5, Z vara

de forma lineal con la dilucin del inhibidor C1. En cuanto
al clculo de Z, Z se calcula de la grfica de la dilucin del
suero contra Z, tomando en cuenta la dilucin inicial.
Los niveles del factor H pueden ensayarse midiendo la
capacidad del suero para acelerar la degradacin de la C3
convertasa. EAC4b3bBbP son preparados agregando properdina, factor B y factor D a EAC4b3b; la cantidad de actividad hemoltica que permanece despus de degradarse la
C3 convertasa se compara con un tubo solitario. La actividad
del factor I puede ensayarse incubando la muestra de prueba
con el factor H agregado a EAC43 y adicionando los factores
B y D, y examinar para la actividad hemoltica residual.
Deteccin de los productos de activacin del complemento
Varias protenas del complemento srico son de fase aguda, por lo que durante la consuncin del complemento,
que puede ocurrir en algunos tipos de infeccin bacteriana o enfermedades del complejo inmunitario, los niveles
sricos pueden permanecer normales. El volumen incrementado del complemento puede determinarse al medir
los productos de activacin del complemento, usando los
anticuerpos que distinguen los productos de activacin a
partir de la molcula nativa. Los equipos comerciales estn
disponibles pero los ensayos en el local para los productos
de activacin se establecen de forma fcil, con la condicin
de que los anticuerpos apropiados se utilicen. Las pruebas
ELISA para C3a, C4a y C5a se establecen, a condicin de
que los estndares puedan obtenerse, pero la utilidad clnica de estos ensayos es limitada. De ms ayuda para los
clnicos son los ensayos para C1s-C1-inh, C3bBbP o C5bC9, incrementados, niveles que indican la activacin de la
ruta clsica, alterna o terminal, respectivamente.
Los ltimos ensayos utilizan un anticuerpo contra un
componente, por ejemplo, C1s, para ligar el complejo a

una placa de ELISA y a un anticuerpo contra otro componente del complejo, por ejemplo, C1-inh, para detectar el
complejo.
Deteccin de los receptores del complemento
Los anticuerpos para los receptores del complemento estn
disponibles en formas comerciales y se utilizan en la citometra de flujo para detectar la presencia de los receptores
en suspensiones celulares. Algunos anticuerpos son tambin adecuados para la inmunohistoqumica de los cortes
de tejido o para la preparacin del centrifugado de clulas
si se requiere la morfologa celular.
453
Whaley K (ed.). Methods in Complement for Clinical Immunologists. 1985: Churchill Livingstone, Edinburgh. This text book
provides a comprehensive, detailed account of the majority
of complement assays, including the preparation of purified
components.
Dodds A, Sims R (eds). Complement. A Practical Approach.
1997: Oxford University Press, Oxford. This is an up to date
laboratory manual for all aspects of laboratory complement
work.
Phimster GM, Whaley K. Measurement of complement. In Clinical Immunology. A Practical Approach, Gooi HG, Chapel H
(eds) (1990). Oxford University Press, Oxford. This chapter
provides guidance as to clinical indications for complement
assays as well as methodologies.
47
Inmunologa celular
Aarnoud Huissoon
Introduccin
La inmunologa celular es el estudio de las clulas del sistema inmunitario. Estas pruebas normalmente se realizan en el
contexto de la investigacin de posibles defectos del sistema
inmunitario, por ejemplo, en pacientes con infecciones recurrentes o en infantes con insuficiencia en el crecimiento, en
quienes pueden sospecharse inmunodeficiencias innatas raras.
Por conveniencia, los leucocitos de la sangre perifrica
se evalan con regularidad, pero tambin pueden usarse clulas de otras fuentes, como ganglios linfticos y biopsias
tisulares (por lo general en el marco de la investigacin).
Linfocitos y neutrfilos se estudian con ms frecuencia,
pero otros tipos de clulas, como los basfilos, tambin suelen analizarse en algunas circunstancias.
Para evaluar las clulas del sistema inmunitario, puede
requerirse la informacin con respecto a las cantidades de
clulas presentes, su fenotipo y sus funciones. Una amplia
gama de herramientas est disponible para estos anlisis, y
muchas tcnicas estn surgiendo en el campo clnico rutinario de las aplicaciones de la investigacin. La inmunologa celular es, por tanto, una ciencia en plena evolucin.
Inversamente, varias pruebas en uso permanecen en gran
parte sin cambios por dcadas. stas han demostrado ser
robustas y confiables en la aplicacin clnica, y las tcnicas
ms nuevas son lentas para reemplazarlas.
Pruebas cuantitativas y cualitativas

En el nivel ms simple, la cantidad real de linfocitos y neutrfilos circulantes proporciona informacin til sobre el
sistema inmunitario. stos se encuentran fcilmente dispo-
nibles a partir de la cuenta diferencial automatizada de las

clulas blancas. La poblacin linfoctica se divide en clulas T, B y clulas asesinas naturales (NK), las cuales a su
vez se dividen en subgrupos. Se han descrito alteraciones
y deficiencias que afectaban prcticamente a todas estas
poblaciones, y el anlisis del subconjunto y del fenotipo de
linfocito es una herramienta valiosa del diagnstico.
Los subgrupos de linfocitos se miden marcndolos con
anticuerpos monoclonales. Se ha desarrollado una amplia
variedad de anticuerpos que identifica una gama creciente de
subpoblaciones de linfocitos. Algunos de los anticuerpos
ms comunes que se emplean para disecar a esas subpoblaciones se listan en el cuadro 47-1.
Antes, los subgrupos de linfocitos se enumeraban manualmente contando las clulas marcadas con anticuerpos fluorescentes bajo el microscopio. Ahora el citmetro de
flujo proporciona una herramienta ms precisa para examinar una gran cantidad de marcadores linfocticos con gran
detalle.
Citometra de flujo
En un citmetro de flujo, las clulas individuales se conducen en una corriente fina de paso fluido rpido a travs de
un rayo lser. Los fotomultiplicadores detectan la dispersin de la luz lser por la clula y miden la luz emitida por
cualquier marcador fluorescente que se haya agregado a la
clula (fig. 47-1). A partir de esta informacin, el tamao y
la granularidad de la clula, as como el nivel de expresin
de la superficie celular o de los antgenos citoplsmicos
que se han marcado con anticuerpos fluorescentes, pueden
medirse. Millares de clulas por minuto se analizan de esta
456
CAP. 47
Cuadro 47-1
INMUNOLOGA CELULAR
Marcadores para el subgrupo de linfocito ms usados
Subgrupos principales
Clulas T
Linfocitos CD45+
CD3
Clulas NK
CD16/CD56
(CD3)
Clulas B
CD19 o
CD2
Otros subgrupos
Clulas T auxiliares
CD4
Clulas T citotxicas
CD8
Clula T virgen
CD45RA
Clulas T efectoras/
memoria CD45RO
Antgenos de activacin
HLA-DR, CD69,CD25
Molculas
coestimuladoras
CD28, CD134 (OX40)
Clula B virgen
IgD/CD27
Clulas B de memoria
IgD /CD27
Clulas B-1
CD5
Clulas B-2
CD5
Subgrupos y linfoma de la
clula B
IgM, IgG, /
cadenas ligeras Ig, CD23
Clulas en fluido
envolvente
Fuente de
luz lser
PMT 2
PMT 1
Dispersin
lateral de luz (SS)
Otros marcadores
Dispersin frontal
de luz (FS)
Figura 47-1 Presentacin simplificada de un citmetro de flujo. Las clulas pasan individualmente a travs de un rayo lser.
Para cada clula, la luz dispersada se mide con sensores de luz
delanteros y laterales. Los anticuerpos fluorescentes en la clula
son excitados por la luz lser y emiten luz a longitudes de onda
diferentes, la cual se mide con los fotomultiplicadores (PMT). En
citmetros de flujo ms grandes, dos lseres y varios fotomultiplicadores, cada uno midiendo la luz emitida de una longitud de
onda diferente, permiten examinar numerosas molculas celulares
diferentes u otras propiedades simultneamente.
manera, para que una cantidad grande de datos con respecto a las poblaciones celulares pueda recopilarse muy
rpido.
Linfocitos, monocitos y granulocitos se distinguen por
sus propiedades de la dispersin de la luz, solos o en combinacin con la expresin de CD45 (fig. 47-2a). Los anticuerpos fluorescentes pueden entonces diferenciarse entre
las diversas poblaciones de linfocitos (fig. 47-2b).
Es necesario conocer no slo las proporciones de los
subgrupos de linfocitos presentes, sino tambin las cantidades absolutas de cada subgrupo en la muestra original.
Adecuados rangos de referencia, relativos a la edad, estn
disponibles para los subgrupos principales. Este resultado
cuantitativo puede derivarse a partir de mtodos de plataforma, ya sea dual o bien simple. En el primer mtodo la
cuenta absoluta del linfocito se obtiene de una cuenta diferencial del leucocito por citometra de flujo y de la cuenta
total del leucocito a partir de un analizador estndar de hematologa. Un mtodo de plataforma simple puede ser ms
exacto, en especial cuando hay una proporcin muy baja
de la poblacin de inters (p. ej., clulas T CD4+ en el sndrome de inmunodeficiencia adquirida, SIDA). La cuantificacin por plataforma simple se logra agregando una
cantidad conocida de perlas a un volumen determinado de
sangre al principio de la prueba. Las perlas y los linfocitos
marcados con anticuerpo se analizan simultneamente con
el citmetro de flujo, y las cuentas absolutas del subgrupo
de linfocitos pueden calcularse. Un acercamiento alternativo se obtiene contando los linfocitos en un volumen fijo
de sangre pasado a travs del analizador, pero ste es dependiente de la confiabilidad de los fludicos del citmetro
de flujo. Los mtodos de tincin y lisis del anticuerpo en
sangre entera (en lugar de la tincin de los leucocitos separados) deben utilizarse para los anlisis cuantitativos del
linfocito.
Aplicaciones del anlisis del subgrupo de linfocitos

Monitoreo de la infeccin por VIH/SIDA
sta es la indicacin ms comn para el requerimiento de
los subgrupos de linfocitos. Los resultados cuantitativos
exactos son esenciales. Tpicamente, las cantidades de la
clula auxiliar T CD4+ son bajas, y el cociente de clulas
T CD4+ a las CD8+ se invierte (est sobre 1.5:1 en adultos
sanos). Sin embargo, no pueden utilizarse para diagnosticar la infeccin por VIH, puesto que los subgrupos de la
PRUEBAS CUANTITATIVAS Y CUALITATIVAS
457
Granulocitos
Monocitos
Linfocitos
Nm de clulas
DISPERSIN FRONTAL
Figura 47-2 a) Identificacin de poblaciones de leucocitos a travs de la dispersin de la luz y de la expresin de CD45. Cada punto
representa los datos recolectados de una clula. Los linfocitos tienen dispersin frontal moderada (un ndice del tamao), la dispersin lateral baja (SS, un ndice de la complejidad o granularidad celular) y expresin CD45 alta. b) Expresin de CD3 y CD4 sobre la
poblacin de linfocitos. Las clulas se han marcado con anticuerpos CD3 conjugados con fluorescena, detectados sobre PMT1, y anticuerpos CD4 conjugados con ficoeritrina, detectados sobre PMT2. Despus de seleccionar la poblacin del linfocito, la expresin de CD3
y CD4 puede verse sola o como histogramas, o bien combinada en un grfico de punto. El grfico de punto aporta informacin adicional,
demostrando que las clulas CD4 son un subgrupo de clulas CD3.
clula T son normales en un individuo infectado por VIH,

y existen tambin muchas otras causas de perturbaciones
de los subgrupos de linfocitos, por ejemplo, estrs, tratamiento con esteroides, infeccin intercurrente o variacin
diurna normal. Una vez que la infeccin por VIH se diagnostique con pruebas serolgicas o de la biologa molecular, las cuentas CD4 (conjuntamente con las mediciones de
la carga vrica medidas con PCR) son esenciales en el monitoreo de la enfermedad. Se utilizan para indicar el nivel
de supresin inmunitario, y es cuando el tratamiento con
agentes antirretrovricos y antimicrobianos profilcticos
debe iniciarse. El desempeo del monitoreo de la clula T
CD4+ para el VIH en el Reino Unido est sujeto al control

de calidad externo por NEQAS.
Investigacin de inmunodeficiencia
Muchas enfermedades primarias de inmunodeficiencia estn asociadas con anormalidades de los subgrupos de linfocitos. Algunos ejemplos se listan en el cuadro 47-2. Mientras una cuenta total baja del linfocito es con frecuencia la
primera pista para el diagnstico de inmunodeficiencia grave, la deteccin del patrn de la deficiencia puede ayudar
458
Cuadro 47-2
CAP. 47
INMUNOLOGA CELULAR
Ejemplos de algunos sndromes primarios de inmunodeficiencia con hallazgos caractersticos del laboratorio
Diagnstico
Infecciones
Inmunoglobulinas
Cantidades de
linfocitos
Anlisis de subgrupo
de linfocito tpico
Agammaglobulinemia unida
a X (de Bruton)
SCID unida a X
Bacterianas
Bajas/ ausentes
Normales
Clulas B ausentes
Proliferacin normal
para mitgenos
Ausentes
Bajas
Deficiencia HLA
clase II
Vrica, mictica
y bacteriana
Vrica, mictica
y bacteriana
Normales/bajas
Normales
Sndrome hiperIgM unido a X
Bacteriana /
protozoaria
IgM incrementada/
normal; IgG, IgA
baja/ausente
Normales
Clulas T y NK
ausentes
Clulas CD4 T
reducidas
Expresin HLA-DR
ausente sobre
clulas B
CD154 ausente
sobre clulas T
activadas
Proliferacin ausente
para mitgenos
Proliferacin normal
para mitgenos,
pero respuestas
antgeno-especficas
reducidas
Proliferacin normal
para mitgenos pero
respuestas antgenoespecfica reducida
al diagnstico, por ejemplo, la ausencia de clulas T y B

con clulas NK preservadas puede sugerir una deficiencia
de RAG-1 o de RAG-2 (genes que estn implicados en la
generacin de los receptores del antgeno de las clulas T y
B). Normalmente se requieren estudios funcionales adems
del anlisis del subgrupo de linfocito en la investigacin de
inmunodeficiencias congnitas graves (vase adelante).
En algunas enfermedades de inmunodeficiencia, los nmeros absolutos de poblaciones linfocticas son normales,
pero anormalidades sutiles pueden detectarse con anlisis
ms detallados, por ejemplo, muchos pacientes con deficiencia primaria de anticuerpos (deficiencia inmunitaria
variable comn) tienen nmeros completos normales de
clulas T, B y NK. Sin embargo, sus clulas B muestran
proporciones anormales de poblaciones vrgenes y de memoria, sugiriendo un defecto en la maduracin de la clula
B perifrica u homeostasis como la causa para que su falta
produzca un repertorio normal de anticuerpos. Las clulas
T de pacientes con sndrome hiper-IgM no pueden expresar
CD154 (antes llamado ligando CD40). CD154 no se expresa normalmente en la inactividad de clulas T de sangre
perifrica, y es necesario estimular primero las clulas T
in vitro y despus medir la expresin de la molcula por
citometra de flujo.
El defecto en la adhesin leucocitaria (LAD) es causado
por la falla de los neutrfilos (y de otros leucocitos) para
expresar integrinas 2 (heterodmeros CD11-CD18). En
consecuencia, los neutrfilos del paciente no emigran de la
corriente sangunea al sitio de infeccin, y las infecciones
graves recurrentes (con poco o nada de pus) se producen.
La curacin de la herida tambin se deteriora. Esta condicin puede diagnosticarse simplemente midiendo la expre-
sin neutroflica de CD18 y CD11a, b y c por citometra

de flujo.
Diagnstico de malignidades linfoides
La cuantificacin y el anlisis del fenotipo de los linfocitos
de la sangre perifrica (o mdula) son esenciales en el diagnstico de las enfermedades linfoproliferativas de las clulas
B y T. La clonalidad de la clula B en estas condiciones se
detecta con frecuencia por la expresin anormal de la cadena
ligera de la inmunoglobulina sobre la superficie de la clula B. Las clulas T no expresan marcadores clnicos sobre la
superficie celular, de modo que las malignidades se detecten
por la expresin anormal (prdida o expresin aberrante) de
otros marcadores superficiales (p. ej., CD7, CD5, CD25).
Mientras que muchas de estas condiciones se caracterizan
por aumentos marcados en las cantidades linfocticas de la
sangre perifrica, algunas (en particular neoplasmas de la clula T) pueden ser clnicamente sutiles en su manifestacin
y mantener una cuenta normal de linfocitos. En todos los
casos, el inmunofenotipo del linfocito tiene que interpretarse
dentro del contexto de otros hallazgos clnicos del paciente
y del fenotipo de las clulas por microscopia.
Otras condiciones inflamatorias e infecciones
Anormalidades de subgrupos y fenotipos del linfocito en
sangre perifrica se han descrito en una gama amplia de
enfermedades infecciosas e inflamatorias. Sin embargo, estas anormalidades es raro que tengan un diagnstico til, y
nunca especfico.
459
ESTUDIOS FUNCIONALES
Linfocitos a partir de sitios salvo de sangre

y de mdula sea
100 000
Incorporacin de timidina
De cuando en cuando es til analizar linfocitos de otros

sitios, como del lquido cefalorraqudeo y del lquido de
lavado broncoalveolar. En el ltimo caso, las poblaciones
linfocticas predominantes pueden ayudar a distinguir diversas enfermedades intersticiales del pulmn. En el primero, el propsito principal consiste en excluir el linfoma
que involucra al sistema nervioso central.
(a )
10 000
1 000
100
Blanco 1:80 1:40
Linfocitos T
Proliferacin
La medicin de la proliferacin del linfocito T es un mtodo bien establecido que evala su competencia inmunitaria.
Antes, se usaron los cambios en la apariencia de las clulas
en la microscopia para evaluar la activacin y respuesta de
la proliferacin a varios estmulos, de ah el trmino transformacin linfoctica que se aplica con frecuencia a esta
prueba. Durante varias dcadas este proceso se ha cuantificado con ms exactitud midiendo la incorporacin de
la timidina 3H radiomarcada en el DNA de clulas proliferantes. La timidina titulada se agrega al cultivo celular
durante las ltimas 16 h de un cultivo de 2 a 7 das, y las
clulas, entonces, se recolectan en un filtro del papel. La
cantidad de radiactividad incorporada, cuando se detecta
mediante conteo por centelleo, es proporcional a la replicacin del DNA que ocurre en las clulas proliferantes (fig.
47-3a). Ambos, la radiactividad incorporada absoluta (en
desintegraciones o cuentas por minuto, despus de la correccin de las cuentas originales) y el ndice de estimulacin (cuentas de clulas estimuladas divididas entre cuentas
de clulas sin estimulacin), deben reportarse.
Tambin se han desarrollado mtodos alternativos que
miden la proliferacin del linfocito, aunque ninguno de stos ha desplazado hasta ahora la incorporacin de timidina
como la tcnica estndar en los laboratorios clnicos. stos
incluyen la deteccin por flujo citomtrico de la expresin
del antgeno de activacin (p. ej., CD25, CD69, Ki67), la
incorporacin de bromodeoxiuridina, o la dilucin del colorante intracelular, carboxifluorescena diacetato succini-
1:10
(b)
Nmero de clulas
En el curso de una inmunorrespuesta, las clulas T normales exhiben varias funciones que pueden evaluarse in vitro.
stas incluyen la proliferacin, la sobrerregulacin de antgenos de la superficie celular, la produccin de citocina y
la apoptosis.
1:20
Dilucin del mitgeno
Intensidad de CFSE
Figura 47-3 a) Proliferacin linfoctica en respuesta a los mitgenos PHA 250 g/ml (), PWM 100 g/ml (), y OKT3
1 g/ml (). La incorporacin de la timidina 3H se indica en las
desintegraciones/minuto. Reproducida de Huissoon et al. (2002),
con el permiso de Blackwell Publishing Ltd. b) Histograma que
representa el principio de la dilucin de CFSE para medir la proliferacin celular. Las clulas se cargan con CFSE al inicio del
procedimiento. ste es un colorante citoplsmico que no interfiere
con la funcin celular. Las clulas se incuban con el mitgeno o
el antgeno por un nmero de das y la intensidad CFSE se analiza con citometra de flujo. En la representacin anterior, el pico
derecho describe las clulas que no han experimentado divisin
celular, y por tanto contiene la cantidad inicial completa de CFSE.
Con cada divisin celular la intensidad del colorante se reparte en
dos, de tal forma que cada ciclo de la divisin puede identificarse
como un nuevo pico a la izquierda de las clulas no proliferativas. El bimarcaje de las clulas con los anticuerpos especficos
del linaje puede identificar qu tipos celulares ya respondieron al
estmulo y cules no.
CAP. 47
INMUNOLOGA CELULAR
midil ster (CFSE), por clulas T activadas y proliferantes

(fig. 47-3b). Estos mtodos tienen la ventaja de no requerir
el uso y la medicin de radioistopos.
Las clulas T pueden estimularse para que proliferen en
respuesta a una variedad de estmulos, y stos normalmente
se utilizan en una gama de concentraciones para mostrar una
dosis-respuesta (fig. 47-3a). La induccin del flujo de calcio
por ionomicina y un ionforo del calcio estimula muchos
tipos de clula, y esta activacin es totalmente independiente
de la clula normal que seala trayectorias. La fitohemaglutinina, una lectina de la planta identificada primero por su
capacidad para aglutinar eritrocitos, y la concavalina A, estimula todas las clulas T a travs de varios receptores superficiales. Infantes con inmunodeficiencia combinada grave
heredada (SCID) fallan en producir una respuesta para estos
mitgenos. El mitgeno de la fitolaca (pokeweed) estimula
ambas clulas T y B. Un acercamiento ms fisiolgico se
consigue imitando la ruta normal de la estimulacin de la
clula T a travs del receptor de la clula T. Esto puede lograrse por el entrecruzamiento del receptor con los anticuerpos anti-CD3 (que activa todas las clulas T) o aadiendo
el antgeno al cultivo. Los antgenos son tomados por los
monocitos sanguneos y los pptidos que estimulan la clula
T que se presentan a las clulas T en el contexto de las molculas MHC clase II. Tal proliferacin antgeno-especfica
activa slo una proporcin pequea de clulas T de la sangre
perifrica total (alrededor de 1 en 104), y de acuerdo con la
estimulacin del mitgeno. Extraordinariamente, los pacientes se detectan con la funcin de la clula T normal a grosso
modo pero con defectos sutiles en una comprobacin ms
detallada, por ejemplo, en candidiasis mucocutnea crnica,
las clulas T del paciente responden bien a todos los estmulos mitognicos y antignicos, excepto Candida. Este agujero notable en el repertorio inmunitario es inexplicable.
cina secretada por las clulas T est ligada por el anticuerpo

en el pozo. Despus de un periodo de incubacin, las clulas se lavan y la citocina ligada se detecta por un segundo
anticuerpo contra esa citocina. sta es visualizada por una
reaccin enzima-sustrato cromognica, y cada mancha en
el pozo representa una clula T secretora de citocina. La
deteccin intracelular de citocinas por citometra de flujo
es menos sensible que el mtodo Elispot, pero permite la
caracterizacin adicional de clulas productoras individuales usando marcadores superficiales. Las clulas T son estimuladas por el antgeno o el mitgeno, y hacia el final
de la incubacin, brefeldina A o monensina se agrega para
bloquear el transporte de citocina desde el retculo endoplsmico. Esto produce la acumulacin de citocina intracelular suficiente para ser detectada por marcaje directo del
anticuerpo. Las clulas entonces se marcan con anticuerpos
fluorescentes contra antgenos de superficie apropiados, por
ejemplo, CD3 y CD69, y la membrana celular se fija e impermeabiliza. Esto permite que la citocina intracelular sea
marcada con el anticuerpo especfico (fig. 47-4).
CD69 PE
460
IFN-FITC
Produccin de citocina
La produccin de citocina en respuesta a estmulos mitognicos y antignicos tambin puede medirse. Debido a que
la produccin de citocina es una funcin importante de las
clulas T, la deteccin de la produccin defectuosa de la citocina por ciertos estmulos suele tener importancia clnica.
Las enfermedades causadas por la produccin defectuosa
de citocina estn ahora comenzando a ser descritas (p. ej.,
deficiencia de IL-12). La produccin de citocina por la clula T se mide en el sobrenadante del cultivo por ELISA,
por la tcnica de Elispot o por deteccin directa de citocinas
intracelulares en clulas T individuales con la tincin del
anticuerpo fluorescente. En el ensayo de Elispot, las clulas
T estimuladas se colocan en pozos para cultivo de plstico
de base plana que se han cubierto con anticuerpos contra
una citocina especfica (p. ej., interfern-). Cualquier cito-
Figura 47-4 Expresin del interfern gamma (IFN-) en clulas

T estimuladas con enterotoxina estafiloccica B. CD69 (sobre el
eje vertical) identifica clulas T activadas, y cerca de 10% de stas
se observa que expresan IFN-. Reproducida de Huissoon et al.
(2002), con el permiso de Blackwell Publishing Ltd.
Apoptosis
La apoptosis (muerte celular programada) es una funcin importante de las clulas T, en la ontogenia del linfocito y como
parte de la involucin de una inmunorrespuesta normal. Se
ha descrito el sndrome linfoproliferativo autoinmunitario
(ALPS) donde la capacidad de los linfocitos de experimentar apoptosis est daada. Con cada inmunorrespuesta la
proliferacin de linfocitos no es equilibrada por una muerte
correspondiente de linfocitos cuando el estmulo contagioso
desaparece. Tales pacientes tienen inmunoglobulinas sri-
ESTUDIOS FUNCIONALES
461
cas incrementadas, enfermedades autoinmunitarias con autoanticuerpos demostrables, ganglios linfticos agrandados
y una cuenta alta de linfocito de sangre perifrica con una
acumulacin anormal de las clulas T CD4/CD8. Existen varias causas para este cuadro clnico, todas relacionadas
con defectos en la superficie celular o con mediadores intracelulares indicadores de apoptosis. El tipo ms comn de
ALPS es causado por mutaciones en la protena Fas (CD95).
Para detectar defectos en apoptosis mediada por Fas, las
clulas T del paciente primero se estimulan in vitro para
hacerlas susceptibles a la apoptosis mediada por Fas. Un
anticuerpo contra la molcula Fas se agrega al cultivo. En
individuos normales una proporcin alta de clulas T sufre
apoptosis en respuesta a la unin de Fas en este ensayo. En
pacientes con ALPS esto est marcadamente daado. La
apoptosis as inducida puede medirse por varias tcnicas,
pero la ms conveniente es la citometra de flujo. Las caractersticas de las clulas apoptticas, que pueden ser medidas,
incluyen la condensacin nuclear (detectada por tincin con
yoduro de propidio), la unin de la anexina V a la fosfaditil
serina externalizada, fragmentacin nucleosmica del DNA
(detectada por marcacin fluorescente del extremo del nucletido terminal), o la activacin de la caspasa usando PhiPhi Lux como sustrato fluorescente de la caspasa.
es antgeno especfica y no se mide en la prctica clnica

rutinaria. La citotoxicidad de la clula NK puede determinarse midiendo la lisis de la lnea celular K562. Las clulas
K562 carecen de expresin HLA clase I, de tal forma que
son un blanco natural para las clulas NK. Las clulas se
cargan con 51cromo intracelular radiomarcado y se coincuban con los linfocitos del paciente (que contienen clulas
NK efectoras). La lisis citotxica de las clulas blanco es
identificada por la liberacin del cromo en el medio de cultivo. Es tambin posible evaluar la muerte de las clulas
K562 por citometra de flujo. Las clulas blanco tienen que
ser marcadas con un colorante lipoflico fluorescente antes
de la incubacin con leucocitos del paciente, de modo que
puedan distinguirse de los linfocitos del paciente. La muerte citotxica es identificada por su permeabilidad al yoduro
de propidio, que es excluido por las clulas viables. Con
cualquier mtodo, la muerte debe determinarse sobre un
rango de proporciones blanco: clula efectora. Los defectos de la muerte de NK se observan en inmunodeficiencias
raras asociadas con albinismo parcial (p. ej., sndromes de
Chdiak-Higashi y de Griscelli) y en sndromes hemofagocticos familiares.
Pruebas in vivo
La funcin de la clula B es determinada con ms facilidad

midiendo las inmunoglobulinas y anticuerpos sricos del
paciente contra agentes infecciosos especficos o vacunas,
o ambas. Si se encuentran niveles bajos del anticuerpo, la
respuesta a la vacunacin puede aprobarse, lo cual es un
indicador global excelente de la funcin de la clula B. La
proliferacin de la clula B (y T) se estimula con el mitgeno de fitolaca pokeweed, pero esto no da informacin
sobre la produccin de inmunoglobulinas. Esto puede ser
probado con un ensayo de la placa inversa, donde las clulas B estimulantes se cubren con agarosa que contiene eritrocitos que se unen con la inmunoglobulina. Se adiciona el
complemento y las inmunoglobulinas unidas a eritrocitos
fijan el complemento e inducen hemlisis. As, cada clula
productora de inmunoglobulinas puede identificarse por la
placa circundante de hemlisis. Este ensayo consume tiempo y ahora es raro que se realice, puesto que aporta poca
informacin adicional que no se obtiene a partir de pruebas
con anticuerpos sricos.
Las pruebas in vivo de la funcin clular T tambin son

posibles. La hipersensibilidad retardada (tipo IV de Gell y
Coombs) para recordar los antgenos es un buen indicador
de la competencia inmunitaria de la clula T. Estas pruebas
son baratas y rpidas, pero inconvenientes para usarse en
nios pequeos. Una cantidad pequea del antgeno se inyecta en la dermis, y la reaccin de enrojecimiento y de hinchazn despus de 2 a 5 das indica una inmunorrespuesta
positiva a ese antgeno. Esta respuesta es mediada principalmente por las clulas T y por macrfagos. Se suprime en la
desnutricin, infeccin por VIH y sarcoidosis, y por corticoesteroides u otra terapia inmunosupresiva. Sin embargo, se
realiza rutinariamente slo mediante comprobacin por contacto e inmunidad para la tuberculosis (prueba de Heaf o de
Mantoux). La interpretacin de una prueba negativa es difcil
si la exposicin anterior o estado de la vacunacin BCG no se
conoce. Otros antgenos ubicuos, como de paperas, Candida
y toxoide de ttanos, tambin pueden obtener tales respuestas, pero no se emplean en la prctica clnica rutinaria.
Clulas asesinas naturales
La citotoxicidad es una funcin de las clulas T CD8+ y
de las clulas NK. La citotoxicidad de la clula T CD8+
Linfocitos B
Neutrfilos
Los neutrfilos son clulas de breve duracin que engullen
y destruyen activamente organismos. El defecto ms comn del neutrfilo es la reducida cantidad de estas clulas.
Esto puede ser congnito (p. ej., sndrome de Swachmann
462
CAP. 47
INMUNOLOGA CELULAR
o el de Kostmann), pero con frecuencia se adquiere despus de la insuficiencia de la mdula (p. ej., causada por
las drogas o neoplasmas). Los defectos funcionales de los
neutrfilos son relativamente raros, pero pueden investigarse rpido in vitro.
Para eliminar un organismo invasor, los neutrfilos deben
emigrar primero desde la circulacin al tejido. Esto implica
la capacidad de responder a los estmulos quimiotcticos
y de adherirse al endotelio vascular. Pruebas de adhesin
neutroflica y de migracin quimiotctica estn disponibles. La adhesin a materiales como lana de vidrio, placas
de cultivo de plstico y clulas endoteliales cultivadas es
posible medirlas. Sin embargo, los defectos detectados por
tales pruebas se deben a sndromes por defecto en la adhesin leucocitaria y son diagnosticados con ms facilidad
midiendo la expresin de la integrina leucoctica por citometra de flujo (vase antes). La quimiotaxis de neutrfilos
se mide por la observacin microscpica del movimiento
del neutrfilo hacia estimuladores como casena y el pptido F-met-leu-phe. Esto se realiza empleando una cmara de
Boyden, donde los neutrfilos son separados del estmulo
quimiotctico por un filtro microporo, y el frente principal
de los neutrfilos que migran a travs del filtro se mide.
Alternativamente, una suspensin del neutrfilo y los estimuladores quimiotcticos se colocan en pozos adyacentes
cortados en gel de agarosa, y el movimiento de neutrfilos en la agarosa hacia el estimulador tambin se mide. Los
desrdenes de la migracin del neutrfilo se han descrito
en estados de deficiencia inmunitaria primaria, incluyendo
el sndrome hiper-IgE y el sndrome de Chdiak-Higashi,
as como en algunas otras enfermedades. Sin embargo, las
anormalidades no son diagnsticas o consistentes.
Despus de emigrar al sitio de infeccin, los neutrfilos
eliminan sus organismos blanco por fagocitosis y destruccin intracelular. Ambas funciones pueden probarse usando
Candida como el organismo blanco. Las esporas cultivadas
de Candida se incuban con neutrfilos aislados y el suero
donador normal (el cual opsoniza a Candida). Se agrega al
cultivo uridina marcada, y sta se incorpora slo por Candida extracelular viable. Los cultivos neutrfilo/Candida se
recolectan de los filtros y la uridina 3H incorporada se mide
con un contador beta. Cuentas altas (comparadas con los
neutrfilos del control normal) indican fagocitosis neutroflica daada. Si se asume que la fagocitosis es normal, la
destruccin intracelular de Candida puede medirse lisando
los neutrfilos y evaluando la viabilidad de Candida por incorporacin de 3H-uridina o por la exclusin del azul de
metileno. Staphylococcus aureus es un blanco alternativo
para los ensayos de la destruccin neutroflica. En este caso,
la destruccin se mide por chapado del sobrenadante de
neutrfilos lisados en el medio de crecimiento y contando
las colonias bacterianas producidas. Un ensayo por flujo ci-
tomtrico que mide la fagocitosis de Escherichia coli marcada con fluorescena opsonizada tambin se ha descrito.
En gran medida, la causa ms comn del defecto en
la destruccin intracelular neutroflica es la enfermedad
granulomatosa crnica. A pesar de su nombre algo intil,
es un desorden de inmunodeficiencia primaria causado por
la deficiencia de una de las enzimas de la cadena NADPH
oxidasa, responsable de la generacin de superxidos y
perxidos microbicidas. Estos productos de la explosin
respiratoria se liberan dentro del fagolisosoma neutroflico y destruyen organismos fagocitados. La prueba clsica para la detencin de la integridad de esta funcin es
la prueba de reduccin del nitroazul de tetrazolio (NBT).
El NBT es un colorante amarillo soluble que se adiciona a
la sangre entera. Los neutrfilos se estimulan con acetato
forbol miristato (PMA), y la reduccin resultante del NBT
por un producto azul insoluble puede observarse microscpicamente; los neutrfilos normales contienen grnulos
azules. La incapacidad de los neutrfilos para reducir el
NBT (por tanto, aparecen amarillos) indica un diagnstico
de la enfermedad granulomatosa crnica. Existen otras tcnicas para medir la explosin respiratoria neutroflica. La
emisin de luz por sustratos quimioluminognicos, como
luminol y lucigenina, activados por la explosin respiratoria neutroflica, puede medirse con un luminmetro. Un
mtodo de flujo citomtrico simple basado en la oxidacin
de la dihidrorrodamina est ganando amplia aceptacin,
pues es muy elevada su sensibilidad y detecta con facilidad
portadores de genes defectuosos (fig. 47-5).
Basfilos
Los basfilos ligan anticuerpos IgE va sus receptores FcRI.
El entrecruzamiento de este IgE ligado por alergenos produce la activacin del basfilo, con la induccin de la expresin
de CD63 y la liberacin de la histamina y de otros productos.
Esto forma la base de novedosos medios de diagnstico de
la alergia. Para muchos alergenos, la prueba de piel punzada
y la determinacin de IgE alergnico especfico en suero son
apoyos tiles para el diagnstico de la alergia. Sin embargo,
la comprobacin por puncin de la piel y la determinacin
de IgE alergnico especfico en suero son tiles para el diagnstico de la alergia. Sin embargo, las pruebas en piel no
siempre son posibles, y los ensayos in vitro para IgE especfico no estn disponibles para todos los posibles alergenos
(en especial cuando el alergeno sospechoso es un frmaco).
Por tanto, un medio alternativo para detectar una respuesta
alrgica in vitro es agregar el alergeno sospechoso a la sangre del paciente, y medir tanto la liberacin de la histamina
en el supernadante como la expresin de CD63 en basfilos
activados. Estos ensayos estn disponibles en el comercio,
EL FUTURO DE LA INMUNOLOGA CELULAR
463
Fluorescencia FL1
Figura 47-5 Medicin de la explosin respiratoria por la oxidacin de la dihidrorrodamina. Los neutrfilos en sangre entera son estimulados por E. coli (B) o por PMA (C), y se agrega dihidrorrodamina (DHR). La explosin oxidativa convierte DHR a rodamina, con
un aumento resultante en la fluorescencia medida en FL1 comparado con los neutrfilos sin estimular (A). Los neutrfilos de pacientes
con enfermedad granulomatosa crnica no oxidan la DHR, y el cambio en la fluorescencia de la poblacin no se observa. Los portadores
sanos de genes defectuosos de la ruta NADPH oxidasa muestran generalmente neutrfilos normales y anormales, produciendo dos picos
de fluorescencia.
pero todava no se han validado con amplitud en la prctica

clnica.
y eficiencia en el trabajo para asegurar calidad. El enlace

cercano con el personal clnico es tambin esencial para entender la importancia de las anormalidades observadas.
El futuro de la inmunologa celular

ste es un campo que contina amplindose indudablemente. Un nmero creciente de tcnicas aparecen a travs de
las aplicaciones de la investigacin al laboratorio clnico
rutinario. Las aplicaciones del citmetro de flujo continan
aumentando, por ejemplo, los mtodos estn ahora disponibles para combinar las mediciones mediante flujo citomtrico convencional con la biologa molecular in situ, y los
nuevos reactivos sin anticuerpos aumentan el alcance de las
propiedades celulares que pueden evaluarse por este mtodo eficaz. Los ensayos celulares funcionales derivan en
particular de los recientes avances de los procesos bsicos
de la inmunologa y de la enfermedad. Como en todos los
mtodos de diagnstico de laboratorio, estas pruebas deben
evaluarse cuidadosamente y controlarse de forma apropiada,
pero la naturaleza de los ensayos funcionales los hace difciles de estandarizar. La interpretacin de los ensayos funcionales tambin est saturada de dificultades, y los laboratorios
que ofrecen tales ensayos deben tener suficiente experiencia
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48
Enfermedades del complejo inmunitario
y crioglobulinas
Siraj A Misbah
Introduccin
Los complejos inmunitarios (CI) se forman cada vez que el
anticuerpo encuentra el antgeno. ste es un proceso fisiolgico dinmico que permite que los antgenos exgenos
potencialmente dainos sean depurados por el sistema fagoctico mononuclear del husped (MPS). La falla para depurar los complejos con xito puede conducir al depsito del
complejo inmunitario en las membranas basales del capilar
del plexo glomerular, drmico, sinovial y coroideo, donde
desencadenan una respuesta inflamatoria. La inflamacin inducida por los complejos inmunitarios depende de la capacidad de los complejos para activar el complemento (determinada por el isotipo de inmunoglobulina), con la generacin
consiguiente de los mediadores proinflamatorios potentes
(C5a). El C5a es un quimiotctico poderoso que atrae los
leucocitos y monocitos polimorfonucleares circulantes hacia
el sitio de depsito del complejo inmunitario, sirviendo para
amplificar el dao tisular. El sitio de depsito del complejo
inmunitario depende en parte de su tamao, como se ejemplifica en el rin, donde los complejos inmunitarios pequeos logran pasar a travs de la membrana basal glomerular
pero los complejos grandes son incapaces de hacerlo y se
acumulan entre el endotelio y la membrana basal.
Varios mecanismos aseguran que el depsito del complejo
inmunitario no incida en la salud. stos incluyen: a) fagocitosis del CI por el MPS, el tamao del complejo inmunitario
es un factor crtico en este sentido, puesto que el MPS slo es
capaz de depurar los complejos pequeos; b) integridad de
la ruta del complemento, las protenas del sistema del complemento juegan un papel vital porque mantienen el IC en la
solucin cubriendo los complejos con C3b (opsonizacin).
Esto previene la formacin de enrejados del complejo inmunitario grande y de la precipitacin inmunitaria; adems, el
CI cubierto con C3b interacta con el receptor de C3b (CR1,
CD35) en las clulas rojas circulantes, que actan como un
transportador eficiente de los complejos inmunitarios hacia
el MPS en el hgado y el bazo (fig. 48-1). Dado el papel vital
de las protenas del complemento en la depuracin del CI,
no es sorprendente que los pacientes con deficiencia primaria
del complemento (en especial de los primeros componentes del complemento C1, C4, C2) tengan una incidencia alta
de la enfermedad del complejo inmunitario.
Otros factores que influyen en el depsito del complejo
inmunitario incluyen a las propiedades fisicoqumicas del
antgeno y del anticuerpo, como carga elctrica, valencia,
avidez de la interaccin antgeno-anticuerpo y el isotipo
de inmunoglobulina, por ejemplo, el CI que contiene antgenos catinicos se liga ligeramente a la membrana basal
glomerular aninica, causando lesin tisular.
Aunque los complejos inmunitarios circulantes ocurren
en una gran cantidad de enfermedades (cuadro 48-1), en
la mayora de los casos estos complejos son un hallazgo
tipo epifenmeno o incidental. Este captulo se limita a
aquellas enfermedades donde hay suficiente evidencia para
apoyar un papel patognico de los complejos inmunitarios:
enfermedad del suero, lupus eritematoso sistmico (SLE) y
crioglobulinemia mixta.
466
CAP. 48
ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS
Receptor Fc
Figura 48-1 Transporte de los complejos inmunitarios por los eritrocitos hacia los fagocitos mononucleares en el hgado y bazo.
Cuadro 48-1 Desrdenes relacionados con los complejos

inmunitarios circulantes
Inmunolgicos
Infecciones
Bacterianas
Micobacterianas
Parasitarias
Malignidad
Fisiolgicos

Artritis reumatoide
Crioglobulinemia mixta
Sndrome de Felty
Espondilitis anquilosante
Esclerodermia
Enfermedad del suero
Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa,
Streptococcus sp.
M. tuberculosis
Tripanosomiasis, oncocercosis
Todas las formas
Individuos normales saludables
Embarazo
Independientemente de la causa subyacente, las enfermedades del complejo inmunitario comparten varias caractersticas comunes de importancia clnica: a) participacin
multisistema debido al depsito de los complejos en los capilares del plexo del rin, de la piel, sinovial y coroideo;
b) hipocomplementemia durante los periodos de la enfermedad activa; c) la reduccin en los niveles del complejo
inmunitario circulante por terapia (drogas, plasmafresis)
conduce a la mejora en la actividad de la enfermedad.
Ensayos para los complejos inmunitarios

circulantes
Cerca de 30 ensayos para la deteccin de los complejos
inmunitarios circulantes fueron descritos en la dcada de
1970 con la expectativa (posteriormente insatisfecha) de
que podran ser tiles en el diagnstico clnico y el manejo de la
enfermedad del complejo inmunitario. Estos ensayos fueron divididos ampliamente en mtodos fsicos diseados
para distinguir entre la inmunoglobulina monomrica y los
complejos inmunitarios, y los mtodos biolgicos dependientes de la interaccin de los receptores celulares de la
superficie o del complemento con los complejos inmunitarios (cuadro 48-2).
Los problemas inherentes con los mtodos fsicos fueron ejemplificados con el ensayo de precipitacin con polietileno-glicol (PEG). Adems de precipitar los complejos
inmunitarios, el PEG, incluso en concentraciones bajas,
tambin precipita una variedad de protenas sricas, incluyendo IgG, que causa dificultades importantes en la interpretacin de los resultados. Los mtodos biolgicos para
la deteccin de los complejos inmunitarios basados en el
reconocimiento de los complejos en los sistemas humoral
o del receptor celular tambin probaron ser poco fiables. El
ensayo en clulas Raji, que utiliza una lnea celular linfoblastoide derivada de un paciente con linfoma de Burkitt,
se emple de manera extensa en la dcada de 1970. Puesto
que el ensayo se basa en la capacidad de las clulas linfoblastoides (que poseen receptores superficiales para C1q,
C3b, C3d, pero ninguna inmunoglobulina superficial) de
ligar los complejos inmunitarios sricos que tambin han
ENFERMEDAD SRICA
467
Cuadro 48-2 Ensayos del complejo inmunitario

Mtodos fsicos (ensayos que dependen de las
propiedades fsico-qumicas del complejo)
Mtodos biolgicos (ensayos que dependen de)

i) Reaccin con las antiglobulinas (sujeta a la
interferencia por los factores reumatoides endgenos)
ii) Interacciones complemento-protena
iii) Receptores celulares de superficie
Precipitacin con polietilen-glicol

Crioprecipitacin
Ultracentrifugacin analtica
Ensayo policlonal del factor reumatoide
Ensayo monoclonal del factor reumatoide*
125C1q fijador*
Ensayo dependiente de la conglutinina (una protena bovina que
liga los complejos inmunitarios)*
Radioinmunoensayo en clulas Raji*
*Ensayos que se han encontrado analticamente aceptables por el grupo de trabajo de WHO/IUS.
ligado el complemento, un ndice inaceptablemente alto de

positivos falsos se encontr en los pacientes con anticuerpos
antilinfocitos, como en el SLE. Aunque un grupo de trabajo
conjunto de la Organizacin Mundial de la Salud y la Unin
Internacional de Sociedades Inmunolgicas (IUIS) en 1981
encontr cuatro ensayos analticamente aceptables, ninguno ha soportado la evaluacin crtica de su utilidad clnica
por su sensibilidad muy variable, especificidad y valor predictivo escaso. Adems, la incapacidad de la mayor parte
de los ensayos para detectar el antgeno especfico dentro de los complejos inmunitarios es una desventaja significativa. El grupo de trabajo conjunto WHO/IUIS concluy
que la deteccin de los complejos inmunitarios circulantes no es esencial en ninguna enfermedad humana y, ms
importante, que la demostracin de los complejos inmunitarios circulantes no es especfica para la enfermedad del
complejo inmunitario. En consecuencia, la mayor parte
de los laboratorios clnicos de inmunologa han abandonado
los ensayos del complejo inmunitario y hasta la fecha no
hay evidencia que sugiera que los ensayos del complejo inmunitario deban reintroducirse en la prctica clnica de
rutina. En aquellos casos donde se sospecha la enfermedad
del complejo inmunitario, la demostracin de depsitos de
inmunoglobulina y del complemento en una biopsia de los
rganos afectados (p. ej., piel, rin) se toma como evidencia
implcita de la presencia de depsitos del complejo inmunitario. Los ensayos de los complejos inmunitarios circulantes
son un sustituto pobre para el examen inmunohistolgico
directo y la enfermedad del complejo inmunitario no debe,
bajo ninguna circunstancia, diagnosticarse principalmente
sobre la demostracin de complejos en el suero.
Enfermedad srica
La enfermedad del suero es un buen modelo para explicar
las enfermedades del complejo inmunitario. Von Pirquet en
1908 deline la enfermedad del suero como una entidad

distinta en los nios con inmunizaciones repetidas con el
suero antidiftrico derivado de caballos. La enfermedad
del suero se manifest de manera clnica como urticaria,
fiebre, linfadenopata, artralgia y proteinuria 8 a 12 das
despus de la inyeccin del suero del caballo. El periodo
latente de 8 a 12 das reflej el tiempo necesario para los
pacientes para producir los anticuerpos contra las protenas
del caballo. En una concentracin suficiente de los complejos del anticuerpo con el antgeno circulante, la carga resultante del complejo inmunitario abruma los mecanismos de
control del cuerpo, conduciendo al depsito del complejo
inmunitario y a hipocomplementemia. La mejora clnica
depende de la depuracin de los complejos circulantes, que
ocurre de manera espontnea en muchos pacientes despus
de dos a tres semanas; una minora puede requerir tratamiento con esteroides para acelerar la recuperacin.
Ms recientemente, la enfermedad del suero se ha estudiado de forma extensa en pacientes con anemia aplsica
que reciben globulina antitimocito de caballo (ATG). El
sndrome clnico descrito en estos pacientes es casi idntico a aquel descrito por von Pirquet, con altos niveles de
complejos inmunitarios circulantes e hipocomplementemia que coinciden con la incidencia de erupcin en la
piel y de artralgia. Los estudios inmunofluorescentes de la piel
de una biopsia revelan depsitos abundantes de inmunoglobulina y de C3 en las paredes de los vasos sanguneos
pequeos.
Con la declinacin en el uso de la ATG, las reacciones
de hipersensibilidad al frmaco son en la actualidad la causa
ms comn de la enfermedad del suero. Un amplio rango de
frmacos puede actuar como haptenos y ligar a las protenas
del plasma con el subsiguiente complejo frmaco-protena
que desencadena una respuesta inmunitaria, por ejemplo,
penicilina, sulfamidas y tiouracilos. La enfermedad del suero inducida por frmacos es normalmente autolimitante,
condicionada a que el agente causante se retire.
468
CAP. 48
Figura 48-2 Inmunofluorescencia de biopsias renales y de la

piel en un paciente con SLE. a) Depsitos glomerulares de IgA
en una distribucin membranosa. b) Depsitos glomerulares de
C1q en una distribucin membranosa. c) Depsitos granulares
de IgG en la unin dermoepidrmica (banda de lupus). Cortesa del Dr. W. Merchant, Leeds General Infirmary. a) y b), cortesa del Dr. P. Harnden, Leeds General Infirmary.
Investigacin
El diagnstico de la enfermedad del suero es evidente por
la caracterstica presentacin clnica en un paciente con el
antecedente de ingestin del frmaco. Los desafos del frmaco no se requieren de manera normal y no deben realizarse de rutina. El papel de la investigacin del laboratorio
es limitado; si bien las mediciones del complejo inmunitario es probable que muestren altos niveles en la circulacin,
esto se realiza o se requiere raras veces. Durante la etapa
aguda de la enfermedad, la hipocomplementemia marcada
(C3, C4 reducidos) es una caracterstica y proporciona un
indicador til del depsito sistmico del complejo inmunitario. Las biopsias del tejido pueden requerirse en los casos
de incertidumbre diagnstica y muestran el depsito de inmunoglobulina y de C3 en la inmunofluorescencia directa
del tejido cutneo y renal.
pacientes pueden tener slo un rgano implicado al principio de la presentacin. Los pacientes que se presentan con
enfermedad neurolgica predominante plantean problemas
de diagnstico difciles, los cuales se tratan despus en este
captulo. Mucho del dao que causa el lupus en el rgano
se liga directamente al depsito extenso de los complejos
inmunitarios que ocurre en la piel, los riones y el plexo
coroideo. Como en la enfermedad del suero, la inmunofluorescencia de las biopsias de piel y renales muestra depsitos
de inmunoglobulina y de complemento (fig. 48-2), mientras
los complejos inmunitarios circulantes se encuentran en una
proporcin elevada de pacientes con enfermedad activa. De
acuerdo con el papel clave del sistema del complemento en
el procesamiento de los complejos inmunitarios, un rango
de alteraciones del complemento se observa en los pacientes con SLE (se resume en el cuadro 48-3).
Investigacin de los pacientes con sospecha

de lupus eritematoso sistmico
El lupus eritematoso sistmico (SLE) es un desorden humano comn del complejo inmunitario con una prevalencia
de 200 casos por cada 100 000 en el Reino Unido. En su
forma ms florida, el SLE afecta la piel, los riones, las articulaciones y el sistema nervioso central, aunque muchos
El SLE se relaciona con una multitud de anormalidades

de laboratorio, incluyendo hipergammaglobulinemia policlonal, leucopenia, hipocomplementemia y una pltora
de autoanticuerpos en la sangre. Mientras el aumento policlonal en las inmunoglobulinas del suero es un marcador
LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO
Cuadro 48-3
en el SLE
Primarias
Secundarias
Alteraciones del sistema del complemento
La deficiencia total de los primeros componentes del complemento C1q, C1r-1s, C4, C2
relacionada con la alta incidencia del SLE
La deficiencia parcial de C4 con uno a dos
alelos nulos de C4 se observa en cerca de
15% de los pacientes con SLE
La expresin reducida de CR1 es una caracterstica del SLE avanzado
La actividad incrementada de la ruta clsica y
alternativa se refleja como
hipocomplementemia (TC3, TC4)
Los anticuerpos para C1q se relacionan con
enfermedad grave, en particular
glomerulonefritis
no especfico de la activacin del sistema inmunitario, se

produce una velocidad de sedimentacin globular (ESR)
elevada que acta como una pista de diagnstico til cuando se combina con una protena C-reactiva (CRP) normal.
Aunque la incapacidad para montar una respuesta de la
protena de fase aguda ante la enfermedad activa se le reconoce de manera extensa como una caracterstica del SLE,
sta no es invariable. Los pacientes con serositis activa,
sinovitis crnica e infeccin bacteriana concomitante son
una excepcin en este dictamen.
Autoanticuerpos como marcadores de enfermedad
La presencia de anticuerpos circulantes para los antgenos nucleares es el sello caracterstico del lupus activo. Los prrafos
subsiguientes resumen los principios y la utilidad clnica de
los ensayos que se emplean para detectar estos anticuerpos.
Anticuerpos antinucleares (ANA)
En la prctica clnica, la deteccin de anticuerpos antinucleares (ANA), segn lo demostrado por inmunofluorescencia indirecta, es el nico signo ms til para el diagnstico
del SLE. Los ANA son detectados al sobreponer clulas del
tejido de roedor o del cultivo tisular derivado de una lnea
celular epitelial humana (HEp-2) con el suero de prueba,
seguido por un segundo anticuerpo, IgG antihumano conjugado con fluorescena. Usando el tejido del roedor, cerca
de 95% de los pacientes con enfermedad activa sin tratar
tienen un alto ttulo de ANA (> 1 en 80). Las clulas HEp-2
exhiben un grado incluso ms alto de sensibilidad, con un
aproximado de 98 a 99% de positividad en los pacientes con
enfermedad sin tratar. Las recientes directrices autorizadas
469
Cuadro 48-4 Causas de ANA positiva
Enfermedad del tejido conectivo

SLE
Sndrome de Sjgren
Polimiositis
Artritis reumatoide
Vasculitis
Enfermedades del hgado
Hepatitis activa crnica autoinmunitaria
Cirrosis biliar primaria
Enfermedad del hgado alcohlica
Frmacos
Infeccin
Malignidad
Individuos sanos
del Colegio Americano de Reumatologa, el Colegio de Patlogos Americanos, la Sociedad de Inmunologa Clnica y
los Institutos Nacionales de Salud recomiendan el uso de las
clulas HEp-2 como el mejor sustrato para el tamizaje de
ANA (Kavanaugh y cols.). Con el uso generalizado de las
clulas HEp-2, la existencia del lupus ANA negativo como
una entidad de diagnstico se ha puesto en duda (Cross y
cols.). Contrariamente, la probabilidad del SLE sin tratar en
un paciente con ANA negativo en clulas HEp-2 es del orden <1%. Un resultado positivo de ANA, sin embargo, no es
especfico para el SLE, puesto que ocurre en una variedad
de otras enfermedades (cuadro 48-4).
Varios patrones distintivos de ANA se reconocen en las
clulas HEp-2: homogneo, nucleolar, moteado, perifrico y centromrico (fig. 48-3). Excepto el anticuerpo del
centrmero, que es un marcador especfico del sndrome
CREST (calcinosis, fenmeno de Raynaud, disfuncin
esofgica, esclerodactilia, telangiectasia) y de la esclerodermia, ninguno de los otros patrones de ANA es un indicador confiable de la especificidad antignica. En vista
de esto y a la incidencia de ANA en muchos otros estados
de enfermedad, es esencial caracterizar un ANA positivo
adicional en trminos de su especificidad antignica. En el
SLE, un ANA positivo por inmunofluorescencia indirecta
refleja la presencia de anticuerpos para los antgenos nucleares como DNA, histonas y un grupo de antgenos nucleares
extractables (ENA), conocidos individualmente como Ro,
La, Sm y U1-RNP (uridina protena ribonuclear).
Anticuerpos para los antgenos nucleares extractables (ENA)
Ro, La y Sm fueron nombrados as despus de los pacientes en quienes stos fueron primero caracterizados: Robert,
470
CAP. 48
Figura 48-3 Patrones de tincin de los anticuerpos antinucleares (ANA) en las clulas HEp-2. a) Homogneo. b) Moteado. c) Nucleolar. d) Perifrico. e) Centromrico (ntese el
aspecto de puntos finos mltiples, representando la tincin de
los cinetocoros de 23 pares de cromosomas). Cortesa del seor
K. Taylor, Leeds General Infirmary.
Lane y Smith. Junto con U1-RNP (uridina protena ribonuclear), estas protenas son responsables de empalmar y procesar el mRNA. En contraste con los ANA, los anticuerpos
para los ENA son especficos para el lupus y los desrdenes relacionados y son, por tanto, tiles en el diagnstico.
Adems, los anticuerpos individuales tienden a correlacionarse con ciertas manifestaciones clnicas; el anti-Ro ocurre en el lupus y el sndrome de Sjgren y se correlaciona
con enfermedad cutnea. Es importante reconocer que los
anticuerpos anti-Ro pueden surgir en ausencia de ANA. El
perfil ANA negativo, Ro positivo ocurre en una minora de
pacientes con lupus (<1% en las clulas HEp-2 como sustrato); en sustrato de tejido del roedor, sin embargo, esta
figura se eleva hasta 5%, puesto que el antgeno Ro tiene
una representacin pobre en el tejido del roedor. En 5 a

25% de embarazadas con lupus, los anticuerpos anti-Ro
cruzan la placenta para causar lupus cutneo transitorio en
el recin nacido; ms grave resulta que uno a tres bebs
nacidos de madres anti-Ro positivas desarrollan el bloqueo
cardiaco congnito permanente, requiriendo la insercin de
marcapasos. Mientras los anticuerpos anti-Ro ocurren en
aislamiento en cerca de 30% de los pacientes con lupus,
son acompaados por los anticuerpos anti-La en 15% de
los casos. En la ltima situacin los pacientes tienen menores probabilidades de padecer enfermedad renal.
Adems de las correlaciones clnicas discutidas antes, el
perfil ANA negativo anti-Ro positivo tambin acta como
un marcador para la deficiencia primaria del complemento
471
subyacente que afecta los primeros componentes del complemento. Los estudios de los pacientes con deficiencias homocigotas de C4 y C2 revelan positividad anti-Ro en cerca
de 50 a 70% de los casos. Aunque el mecanismo exacto responsable de la asociacin del SLE con la deficiencia primaria del complemento no se ha establecido, la existencia de
una jerarqua de la gravedad de la enfermedad, en cuanto al
componente faltante del complemento, est bien documentada; la gravedad de la enfermedad es mayor en pacientes
con deficiencia de C1q, seguida de cerca por la deficiencia
total de C4. La gravedad de la enfermedad en pacientes con
deficiencia de C2 es comparable a la observada en pacientes
con las rutas del complemento intactas.
Los anticuerpos anti-Sm tienen una especificidad alta
para el lupus, pero su prevalencia vara con el origen tnico
del paciente; 30% de pacientes afrocaribeos son anti-Sm
positivo, en contraste con el 10% de caucsicos. En vista de
las secuencias compartidas de pptidos entre Sm y U1-RNP,
los anticuerpos para Sm y U1-RNP tienden a surgir juntos.
La presencia de anticuerpos anti-U1-RNP en aislamiento
se pens para identificar a un grupo de pacientes con sndromes de traslape del lupus, con caractersticas adicionales de polimiositis y esclerodermia. Colegas y estudiosos
introdujeron el trmino enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD) para caracterizar a estos pacientes, a quienes
se consider tenan un pronstico mejor en vista del riesgo
ms bajo de enfermedad renal y neurolgica. El seguimiento
a largo plazo de la cohorte original ha cuestionado la exis-
tencia de la MCTD como una entidad benigna distinta, puesto que muchos de los pacientes han desarrollado, despus,
enfermedad renal y neurolgica.
nodo
Ctodo
Mtodos de deteccin
Ensayos de inmunoprecipitacin Los anticuerpos para
los ENA se pueden detectar por varios mtodos. Inicialmente, muchos laboratorios utilizan la inmunoelectroforesis de contracorriente (CIE) o el mtodo de doble difusin
de Ouchterlony para demostrar la presencia de los anticuerpos. La CIE se realiza en geles de agar, permitiendo que el
anticuerpo y el antgeno emigren en direcciones opuestas
para encontrarse en el centro del portaobjetos, donde la
inmunoprecipitacin ocurre al pH apropiado (fig. 48-4).
La tcnica de doble difusin de Ouchterlony tambin se
basa en la inmunoprecipitacin; el antgeno se coloca en
la celdilla del centro de un portaobjetos de agar, mientras
que los sueros de control y del paciente se colocan en los
pozos que rodean el pozo central. Despus de 24 a 48 h
de incubacin, las lneas de precipitacin se forman, denotando la presencia de una reaccin antgeno-anticuerpo. La
identidad del precipitado se establece por la comparacin
de las lneas de precipitacin producidas por el suero de
referencia previamente caracterizado. Tanto la CIE como
la difusin doble son tcnicas cualitativas adecuadas para
detectar altas concentraciones de anticuerpos especficos
Direccin del movimiento

de los anticuerpos
Suero positivo de los

pacientes
Suero negativo de los

pacientes
Direccin del movimiento

de los antgenos
Antgeno
Antgeno
Lnea de precipitacin del complejo
inmunitario especfico
Figura 48-4
Scientific.
Inmunoelectroforesis de contracorriente. Reproducida de Chapel y cols. (1999) con el consentimiento de Blackwell
472
CAP. 48
(0.1 a 1.0 g/ml). De vez en cuando, los resultados de las

pruebas de doble difusin pueden ser difciles de interpretar. Los resultados negativos falsos pueden ocurrir si la
concentracin del antgeno no se ajusta para producir una
zona de equivalencia con la concentracin del anticuerpo
en el suero del paciente, y las lneas mltiples de precipitacin de especificidad desconocida pueden interferir con la
identificacin de los anticuerpos clnicos significativos. En
contraste con la difusin doble, la CIE exhibe relativamente mayor sensibilidad, velocidad y capacidad de manejar
ms muestras. Sin embargo, es tcnicamente demandante
y los resultados son menos equvocos.
Inmunoensayos enzimticos En los ltimos aos, los inmunoensayos en emparedado se han desarrollado para detectar los anticuerpos para los ENA. El mtodo implica la
adicin del suero del paciente que contiene el anticuerpo a
los pozos de la placa de microtitulacin cubiertos con ENA
purificado o recombinante individual. Los anticuerpos ligados al antgeno se detectan por la adicin de un anticuerpo
policlonal o monoclonal de inmunoglobulina antihumana
conjugado con una enzima o una molcula luminiscente. La
concentracin del anticuerpo en el suero del paciente est
directamente relacionada con la intensidad del producto coloreado o fluorescente. Los inmunoensayos enzimticos son
ms sensibles (sensibilidad analtica de 1 a 10 ng/ml) que la
CIE o la difusin doble. Por tanto, los resultados positivos
falsos pueden ocurrir en sueros hipergammaglobulinmicos
como resultado de la unin no especfica incrementada.
Inmunotransferencia Un mtodo adicional para la deteccin de los anticuerpos para los ENA es la tcnica cualitativa de inmunotransferencia (Western blot) (fig. 48-5). Los
antgenos de un extracto nuclear son separados de acuerdo
al peso molecular por electroforesis con dodecil sulfato de
sodio (SDS-PAGE). Los antgenos separados entonces se
transfieren (blotting) al papel de nitrocelulosa, que se corta
en tiras simples y se incuba con el suero del paciente (las
tiras comerciales precubiertas con antgenos individuales
estn tambin disponibles en presentacin comercial). Los
anticuerpos ligados se detectan incubando las tiras con una
inmunoglobulina antihumana marcada enzimticamente.
En un ejercicio reciente de control de calidad realizado por
la Fundacin de la Artritis y los Centros para el Control de
Enfermedades, de Estados Unidos, la inmunotransferencia
se emple para reanalizar las especificidades anti-ENA en
los sueros de referencia caracterizados previamente por inmunofluorescencia y difusin doble (Smolen y cols.). Los
resultados de la inmunotransferencia estaban en gran medida de acuerdo con la difusin doble, aunque las diferencias
en laboratorios individuales se observaron en referencia al
reporte de las bandas sin especificar adicionales. Esto es un
fenmeno reconocido con la inmunotransferencia debido a
Marcadores
(MW en kDa)
Tincin
frontal
Figura 48-5 Perfiles clsicos de los anticuerpos para los antgenos nucleares extractables en la inmunotransferencia. Modificada
con permiso de Biodiagnostics Ltd. SS-A y SS-B son trminos
alternativos para los anticuerpos anti-Ro, La, respectivamente.
P1 y P2 se refieren a las subunidades individuales de Ro. Los
anticuerpos adicionales incluidos son anti-Scl 70 (marcador para
la esclerodermia), anti-Jo1 (marcador de polimiositis con el antiPCNA de la enfermedad intersticial del pulmn (antgeno nuclear
celular proliferante; visto en 2 a 10% de los casos de SLE).
las diferencias menores en las tcnicas empleadas por los

laboratorios individuales. La inmunotransferencia no se
emplea en la actualidad de rutina en los laboratorios clnicos de inmunologa. En vista de su especificidad, tiende
a reservarse para la investigacin de muestras de pacientes
que producen resultados discrepantes por los ensayos estndares. En aquellos pacientes raros con convincente evidencia clnica de lupus o de desrdenes de traslape de lupus, en
quienes los ensayos convencionales no pueden detectar los
anticuerpos para el DNA y los ENA, la inmunotransferencia
ofrece el potencial de detectar los anticuerpos para los antgenos previamente no caracterizados.
Anticuerpos para el DNA de doble cadena (anti-dsDNA)
Los anticuerpos dirigidos contra el DNA de doble cadena
(anti-dsDNA) juegan un papel importante en la patogenia
del dao al rgano en el SLE, en particular en el rin.
Los complejos de los anticuerpos dsDNA e IgG anti-DNA
se han demostrado en los eluidos de biopsias renales. De
acuerdo con este hallazgo, los niveles de anticuerpos antidsDNA tienden a correlacionarse bien con la actividad total
de la enfermedad en el SLE. En la mayora de los pacientes, un aumento en los niveles de anti-dsDNA en el suero
es predictivo de un recrudecimiento de la enfermedad. Una
cada ocasional en los niveles previamente elevados de los
anti-dsDNA puede presagiar nefritis del lupus, un probable
reflejo del depsito del complejo inmunitario en el rin.
Mientras los anticuerpos para dsDNA tienen una especificidad alta para el SLE, y ocurren en 75 a 95% de los pacientes con enfermedad sin tratar, los anticuerpos para el DNA
de una sola cadena (ssDNA) no especficos surgen en una
variedad de otros desrdenes (artritis reumatoide, hepatitis
activa crnica, ancianos sanos) adems del lupus.
Mtodos de deteccin
De los muchos mtodos disponibles para detectar los antidsDNA, la mayor parte de los laboratorios clnicos de inmunologa utiliza uno de los siguientes tres ensayos.
Ensayo de Farr El ensayo emplea dsDNA radiomarcado
(125I es el radioistopo ms utilizado) como antgeno. Incubando el suero de prueba que contiene el anti-dsDNA con
125I-dsDNA se conduce a la formacin de los complejos inmunitarios, que se precipitan usando una solucin saturada
de sulfato de amonio. La cantidad de anti-dsDNA es directamente proporcional a la cantidad de radiactividad en el precipitado. La concentracin de anti-dsDNA en las muestras
de prueba se deriva midiendo la cantidad de DNA marcado
con 125I en la presencia de un suero estndar de referencia
que contiene cantidades conocidas de anticuerpo. Un suero
estndar de la WHO designado Wo/80 est disponible para
la estandarizacin del ensayo. Puesto que el sulfato de amonio interrumpe los complejos inmunitarios que contienen anticuerpos de avidez ms baja, el ensayo de Farr detecta los
anticuerpos de avidez alta que se correlacionan bien con la
473
presencia de lupus grave relacionado con enfermedad renal.

El ensayo de Farr, sin embargo, no detecta los anticuerpos
anti-dsDNA de baja avidez, que existen en pacientes con lupus relativamente ligero.
ELISA
Un nmero de ensayos comerciales ELISA
que utilizan dsDNA purificado (recombinante o a partir de
extracto del timo de becerro) est disponible para la deteccin de los anticuerpos DNA. Puesto que el dsDNA no se
liga directamente a los pozos plsticos, la mayor parte de
los ensayos utilizan DNA acomplejado para poli-l-lisina
o protamina para cubrir las placas de microtitulacin. En
contraste con el anlisis de Farr, los ensayos ELISA detectan los anticuerpos DNA de avidez baja y alta. Por tanto,
el ensayo ELISA exhibe un grado ms alto de sensibilidad
para los propsitos de diagnstico que el ensayo de Farr;
sin embargo, su especificidad relativamente ms baja genera un nmero significativo de resultados falsos positivos
del anticuerpo del DNA en pacientes sin lupus, por ejemplo, infecciones, enfermedad crnica del hgado.
Inmunofluorescencia indirecta utilizando Crithidia luciliae Puesto que la mitocondria grande (cinetoplasto)
del hemoflagelado Crithidia luciliae se compone casi por
completo de DNA de doble cadena, los estudios de inmunofluorescencia indirecta utilizan Crithidia como el antgeno que exhibe un alto grado de sensibilidad y especificidad
para la deteccin de los anticuerpos anti-DNA en el lupus.
Los portaobjetos comerciales que contienen C. luciliae fija
se incuban con el suero de prueba apropiadamente, seguido
por la adicin del anticuerpo inmunoglobulina antihumano
conjugado con fluorescena. Las muestras que producen la
fluorescencia confinada al cinetoplasto se consideran positivas (fig. 48-6). Las muestras ocasionales pueden producir
fluorescencia nuclear tambin, pero esto se debe pasar por
alto, puesto que el ncleo contiene muchos otros antgenos
adems del DNA. Aunque algunos laboratoristas han expresado preocupacin, pues el cinetoplasto puede contener histonas (las protenas bsicas que ligan DNA) que conduzcan
a resultados positivos falsos en el suero positivo del anticuerpo antihistona, esto no se ha confirmado. En la mayor parte
de los casos donde es una preocupacin la contaminacin
con histonas, es posible realizar inmunofluorescencia en los
portaobjetos con Crithidia pretratada con cido clorhdrico,
un procedimiento que elimina las histonas. En vista de las
dificultades relacionadas con la estandarizacin de los ensayos inmunofluorescentes, el ensayo con Crithidia es poco
fiable para el anlisis serial de los niveles del anticuerpo.
Cul ensayo anti-DNA elegir?
El ensayo ideal debe ser lo suficiente sensible y especfico
para el diagnstico del lupus y reflejar, adems, la actividad
474
CAP. 48
facilidad de la automatizacin, capacidad para cuantificar resultados de manera confiable (til para la monitorizacin en
serie) y ausencia de radioistopos en el ensayo.
El ensayo de Farr es adecuado para la monitorizacin
de la enfermedad y puede, en la prctica, superar al ELISA en predecir el desarrollo de la enfermedad recrudecida,
implicando particularmente al rin. En un estudio holands aleatorio reciente, los pacientes con un incremento de
25% en los niveles de anti-dsDNA que reciben aumentos
preventivos en el tratamiento inmunosupresivo tenan una
disminucin significativa en las recadas comparada con el
grupo control, a quienes se trataron en forma convencional
(Bootsma y cols.). Una proporcin pequea de pacientes
con lupus puede recaer sin acompaarse de un incremento
en los anticuerpos del DNA; del mismo modo, una minora
de pacientes puede ser clnicamente estable o asintomtico
a pesar de la presencia de niveles persistentemente elevados del anticuerpo por los tres ensayos.
Ncleo
Flagelo
Los anticuerpos para los fosfolpidos (APA) actan como

marcadores de trombosis (en un tercio de los pacientes con
Cinetoplasto
Figura 48-6 a) Fluorescencia confinada al cinetoplasto de C. luciliae usando suero que contiene niveles altos de anticuerpos antiDNA de un paciente con SLE activo. b) Representacin diagramtica de la anatoma de C. luciliae. Reproducido de Rose y cols.
(1992) con permiso de la American Society for Microbiology.
de la enfermedad confiablemente. Los tres ensayos descritos

(cuadro 48-5) satisfacen el primer criterio, con sensibilidades
>90% en pacientes con enfermedad activa. Con respecto a especificidad, los ensayos con Crithidia y el de Farr (especificidad >90%) son superiores a ELISA. Los ensayos ELISA, en
virtud de su propensin para detectar anticuerpos de avidez
baja, producen resultados falsos positivos del anticuerpo del
DNA en una minora significativa de pacientes sin lupus. A
pesar de esta desventaja, los ensayos ELISA se utilizan cada
vez ms en prctica clnica en vista de su alta sensibilidad,
Cuadro 48-5
Lupus y el sndrome antifosfolpido
Cuadro 48-6 Criterios para el diagnstico del sndrome

del anticuerpo antifosfolpido*
Clnicos
Laboratorio
Trombosis venosa o arterial, o ambas

Prdida fetal recurrente
Trombocitopenia persistente
Elevacin persistente del anticuerpo IgG o
IgM, o ambos, de la cardiolipina (2GPIdependiente)
Anticoagulante del lupus
*Al menos un criterio de laboratorio y uno clnico deben estar presentes; las pruebas de laboratorio deben ser positivas en al menos dos ocasiones en un lapso de ms de tres meses separados.
La medicin del anticuerpo de la cardiolipina puede sustituirse pronto
por la medicin directa de los anticuerpos para 2GPI.
Comparacin de los tres ensayos anti-dsDNA muy utilizados en el SLE
Sensibilidad
Especificidad
Deteccin de los anticuerpos de avidez alta
Deteccin de los anticuerpos de avidez baja
Capacidad para identificar los isotipos del anticuerpo individuales (IgG, IgA, IgM)
Conveniencia para la monitorizacin de la enfermedad activa
Farr
Crithidia
ELISA
Alta
Alta
+++
+
No
S
Alta
Alta
++
++
S
No
Alta
Moderada
++
+++
S
S
Figura 48-7 a) Oclusin de la rama arterial retiniana en un paciente con SLE y con el sndrome antifosfolpidos; el defecto es ms
pronunciado en el angiograma de sustraccin mostrado en (b).
lupus). El trmino sndrome antifosfolpido (APS) fue forjado para delinear a aquellos pacientes con trombosis y niveles elevados de los anticuerpos del fosfolpido (cuadro 48-6).
En contraste con otros estados tromboflicos, que resultan en
trombosis venosa predominante, los pacientes con el APS
pueden desarrollar trombosis tanto en los vasos arteriales
como en los venosos. Las manifestaciones clnicas dependen de qu rgano se vuelve isqumico (fig. 48-7). Los APA
pueden detectarse por ELISA o por la prolongacin de los
ensayos de coagulacin dependientes de fosfolpidos (tiempo de tromboplastina parcial activado, APTT). Los APA detectados por ELISA utilizando cardiolipina, un fosfolpido
cido, como antgeno pueden no actuar siempre como un
marcador verdadero de trombosis, puesto que muchos po-
475
sitivos falsos se han detectado en pacientes con infeccin

(bacteriana, viral, protozoaria), terapia con frmacos y otras
enfermedades del tejido conectivo. El positivo falso histrico VDRL se debe a la presencia de APA dirigida contra la
cardiolipina presente en el reactivo de VDRL. La incapacidad de los ensayos actuales de ELISA para distinguir entre
la trombosis relacionada y la que no lo est con los APA
condujo a dificultades para interpretar el significado clnico
de los niveles elevados de APA. La distincin es importante,
puesto que los pacientes con trombosis relacionada con APA
requieren terapia intensiva anticoagulante a largo plazo, tal
vez de por vida. La evidencia reciente sugiere que la trombosis relacionada con APA est dirigida, en gran parte, contra
la 2 glucoprotena I (2GPI, un cofactor de protena srico
que liga fosfolpidos) ms bien que los fosfolpidos per se.
Dos fuentes de 2GPI se encuentran en los ensayos actuales:
las muestras de prueba de suero humano y suero bovino utilizadas para bloquear las placas de ELISA. Se piensa que la
interaccin de la cardiolipina inmovilizada con 2GPI altera
su conformacin, volvindola inmunognica. En vista de
la incapacidad de los ensayos ELISA convencionales para
distinguir entre la trombosis relacionada y la que no lo est
con los APA, hay mucho inters en los ensayos que utilizan
2GPI purificada como antgeno. Aunque su presencia no
se incluye en la actualidad en los criterios de diagnstico
para el sndrome antifosfolpido, los anticuerpos anti-2GPI
son predictores ms fuertes de trombosis que los anticuerpos
para la cardiolipina convencionales detectados por ELISA.
Los APA que interfieren con los ensayos de coagulacin dependientes de fosfolpidos reconocen un complejo
fosfolpido-protrombina (se les denomina anticoagulantes
del lupus [LAC], en reconocimiento de su incidencia en pacientes con lupus). El trmino LAC es una denominacin
impropia, puesto que se relaciona con la trombosis in vivo
ms bien que con la hemorragia. La presencia de los LAC
se sospecha en un APTT prolongado que no se corrige con
la adicin de plasma normal, sugiriendo as la presencia
de un inhibidor. Puesto que la demostracin de los anticuerpos para los LAC indica el desarreglo funcional de la
coagulacin, estos anticuerpos se correlacionan ms estrechamente con la trombosis que los APA demostrados por
ELISA. La mayora de los pacientes con lupus es seguro
que tengan LAC, adems de anticuerpos de la cardiolipina
(70%), aunque en una minora se encuentren anticuerpos
de la cardiolipina o de los LAC (15% en cada categora).
Lupus eritematoso sistmico neuropsiquitrico (NPSLE)
El papel de la investigacin de laboratorio
La implicacin neurolgica en el SLE es un problema importante que afecta hasta dos tercios de pacientes en algn
476
CAP. 48
punto de su enfermedad. Mientras cerca de 20% de estos

pacientes contina en esta condicin sobre un segundo plano de la enfermedad sistmica activa, en la mayor parte de
los casos es pasiva o slo ligeramente activa. El mdico
enfrentado con un paciente con SLE y caractersticas neurolgicas tiene que realizar la distincin importante entre
la enfermedad neurolgica debida al lupus (primario), la infeccin oportunista como una causa secundaria y la psicosis
esteroide, puesto que la mayora estn en terapia inmunosupresiva en el momento de la presentacin. Un rango diverso
de presentaciones clnicas se observa (cuadro 48-7), reflejando mecanismos patognicos subyacentes mltiples. Por
Cuadro 48-7
Manifestaciones neuropsiquitricas del SLE
Sndrome cerebral orgnico (deterioro cognitivo, psicosis*)

Ataques
Neuropata craneal
Neuropata perifrica
Orden decreciente
Accidente cerebrovascular
de frecuencia
Desorden en el movimiento
Mielitis transversal
*Puede ser inducida por esteroides.
lo menos tres hiptesis se han propuesto para explicar las

diversas presentaciones clnicas: anticuerpos antineuronales, trombosis relacionada con anticuerpos de fosfolpidos,
enfermedad conducida por la citocina.
Es lamentable que ninguno de los marcadores actuales
disponibles de laboratorio del SLE sea suficientemente especfico para el diagnstico del lupus neurolgico primario. Varios estudios han mostrado que las anormalidades en
los niveles de anti-DNA y del complemento (C3, C4) en el
suero o en el lquido cefalorraqudeo (LCR) no discriminan entre la enfermedad neurolgica y la no neurolgica en
el SLE. El entusiasmo inicial por los anticuerpos dirigidos
contra las neuronas (anticuerpos linfocitotxicos, que reaccionan con el tejido cerebral y los anticuerpos directamente
sealados contra los antgenos neuronales) como los marcadores especficos para el lupus neurolgico fue abatido
por los estudios que demostraban su presencia en los pacientes con lupus sin implicacin neurolgica. Las recientes pretensiones de que los anticuerpos dirigidos contra las
protenas ribosmicas P son marcadores especficos de la
psicosis del lupus han sido refutadas por su demostracin
en 50% de los pacientes con SLE sin psicosis.
El examen del LCR es obligatorio en todos los pacientes
con SLE neuropsiquitrico para permitir que los casos de
infeccin que se hacen pasar por NPSLE se diagnostiquen.
En un estudio prospectivo reciente de la implicacin neurolgica en el SLE, la infeccin (criptoccica, tuberculosis
y meningitis pigena) era la causa subyacente en cerca de

50% de los casos. La presencia de bandas oligoclonales exclusivamente en el LCR favorece al NPSLE pero puede tambin ocurrir con la infeccin. En la ausencia de un marcador
especfico de laboratorio, el diagnstico del NPSLE sigue
dependiendo mucho de la perspicacia clnica tradicional.
Valoracin de actividad de la enfermedad en el SLE
La medicin exacta de la actividad de la enfermedad es crucial para el manejo correcto del SLE. Varios ndices de la
actividad de la enfermedad se han ideado para simplificar
esta tarea y asegurar uniformidad en los estudios clnicos.
Cuatro sistemas bien validados y en uso en la actualidad son
el ndice de actividad de la enfermedad del SLE (SLEDAI),
medicin de la actividad del lupus sistmico (SLAM), la
escala del Grupo de Actividad del Lupus de las Islas Britnicas (BILAG) y el ndice de actividad del lupus (LAI).
Junto con la valoracin clnica, los marcadores serolgicos
de la actividad de la enfermedad son una ayuda importante
para el mdico al determinar la necesidad de terapia inmunosupresiva en el SLE.
La enfermedad activa se acompaa en la mayora de los
pacientes por un incremento en los niveles sricos de antiDNA y una cada en los niveles del complemento (C3, C4).
En algunos pacientes, sin embargo, las mediciones del complemento no reflejan la actividad de la enfermedad. Puesto
que C3 acta como reactivo de fase aguda, un incremento en
la concentracin secundaria a la inflamacin o a la infeccin
enmascara la consuncin debida al SLE activo. Los niveles
sricos del C3 son normales en cerca de 50% de los pacientes con enfermedad activa, mientras las mediciones de C4
son de valor limitado en pacientes con alelos nulos de C4.
En consecuencia, varios estudios han valorado el papel de
los productos de degradacin del complemento (C3d, C4d,
C5b-9) como marcadores de la actividad de la enfermedad.
En general, los productos de degradacin del complemento son marcadores ms sensibles de la enfermedad activa (60
a 80% de sensibilidad) que las mediciones convencionales de
C3 y C4. Su carencia relativa de especificidad (45 a 80%
de especificidad), sin embargo, ha impedido su adopcin extensa en la prctica clnica. En ausencia del marcador serolgico ideal de la actividad de la enfermedad en el SLE, el uso
de los niveles del anticuerpo anti-DNA en serie junto con el
complemento (C3 o C4, y/o los productos de degradacin) y
CRP representan el perfil ms til de laboratorio para valorar
la actividad de la enfermedad (cuadro 48-8).
El lugar de los ensayos de adhesin de la molcula en la
valoracin de rutina de la actividad de la enfermedad en el
lupus est en la actualidad bajo investigacin. Los estudios
preliminares sugieren que los niveles sricos de VCAM-1
477
CRIOGLOBULINEMIA
Cuadro 48-8
Cambios en los anticuerpos anti-DNA, C3, C4 y CRP en relacin con la actividad de la enfermedad en el SLE
Enfermedad activa
Enfermedad inactiva
Infeccin bacteriana concomitante
anti-DNA
C3
C4
CRP
c
N o sl c
N o sl c
T
N
N, c o T
T
N
N, c o T
N o sl c
N
c
N = normal; sl = ligero.
(molcula de adhesin de la clula vascular) estn marcados con niveles elevados en la nefritis del lupus y parecen
relacionarse con la actividad de la enfermedad; los niveles
de E-selectina y de ICAM-I (molcula de adhesin intercelular) son intiles. Si la medicin de VCAM-1 es superior
a los marcadores serolgicos existentes de la actividad, depende de los mritos de los estudios prospectivos futuros.
III se componen de una mezcla de IgG e IgM policlonales y

constituyen el 50% restante. Mientras la mayor parte de las
crioglobulinas tienden a precipitarse a temperaturas debajo
de 10C, en ocasiones una crioglobulina termolbil puede
precipitarse en la jeringuilla utilizada para la venopuncin
si no se ha precalentado a 37C. Las razones exactas de la
crioprecipitacin de las inmunoglobulinas no se conoce.
Crioglobulinemia
Etiologa
Introduccin
La crioglobulinemia se relaciona en la mayor parte de los

casos con un desorden subyacente bajo la forma de paraproteinemia maligna, linfoma, enfermedad autoinmunitaria o infeccin. La crioglobulinemia tipo I se asocia con
paraproteinemia, slo en una minora de pacientes que no
pueden mostrar evidencia de enfermedad linfoproliferativa subyacente en la presentacin. En la crioglobulinemia
mixta (tipos II y III), la investigacin clnica detallada no
puede descubrir la enfermedad autoinmunitaria o la infeccin relacionada en hasta un tercio de pacientes. Estos pacientes fueron catalogados originalmente como poseedores
de crioglobulinemia esencial idioptica o mixta. Desde
1992, los estudios de Italia, EUA, Francia y Suiza han proporcionado evidencia convincente de que 60 a 80% de los
El trmino crioglobulinemia se utiliza para denotar la

presencia de crioglobulinas en la sangre. Las crioglobulinas son inmunoglobulinas que se precipitan de manera
reversible en el fro (4C), y se redisuelven a temperaturas
ms altas (37C). Tres tipos de crioglobulinas se reconocen
segn su inmunoglobulina de composicin y enfermedades relacionadas (cuadro 48-9). Las crioglobulinas tipo I
se componen de inmunoglobulina monoclonal (IgG o IgM)
y constituyen cerca de 25% de todas las crioglobulinas. Las
crioglobulinas tipo II, que se componen de una mezcla de
IgG monoclonal con actividad de factor reumatoide e IgM
policlonal, constituyen otro 25%. Las crioglobulinas tipo
Cuadro 48-9 Clasificacin de las crioglobulinas

Composicin
Enfermedades relacionadas
Tipo I
Inmunoglobulina monoclonal, normalmente IgM o IgG
Macroglobulinemia de Waldenstrm
Mieloma, enfermedad linfoproliferativa
Tipo II
IgM monoclonal factor reumatoide ms IgG policlonal
Infecciones
Virales (hepatitis C, hepatitis B, VIH, Epstein-Barr)
Bacterianas (endocarditis)
Espiroquetales (sfilis, enfermedad de Lyme)
Parasitarias (paludismo)
Fngicas (coccidioidomicosis)
Idiopticas (crioglobulinemia mixta esencial)
Tipo III
Factor IgM policlonal reumatoide ms IgG policlonal*
Autoinmunitario
SLE, artritis reumatoide, sndrome de Sjgren idioptico
Crioglobulinemia mixta esencial
*Las cantidades traza de las crioglobulinas tipo III pueden encontrarse en algunos individuos normales.
478
CAP. 48
pacientes con crioglobulinemia tipos II y III tiene infeccin

subyacente de hepatitis C. Aunque algunos pacientes con
crioglobulinemia mixta exhiben caractersticas de la enfermedad linfoproliferativa, como poblaciones monoclonales
de la clula B en la mdula sea y rearreglo del gen de la
inmunoglobulina en clones de los linfocitos de la sangre
perifrica, el linfoma ostensible es raro.
La inmunopatogenia de la crioglobulinemia est mal entendida. Un amplio rango de complejos primarios antgeno-anticuerpo se ha detectado en los crioprecipitados de las
crioglobulinas tipos II y III, adems del complejo del factor
reumatoide y de la IgG. Esto llev a la visin de que la
formacin de crioglobulinas mixtas es el resultado final de
una secuencia de eventos conducida por una respuesta del
anticuerpo a los agentes infecciosos o a los antgenos endgenos, como en el SLE.
Las manifestaciones clnicas de la crioglobulinemia se deben a una combinacin de la obstruccin vascular y del
depsito del complejo inmunitario. Las crioglobulinas del tipo I pueden ocurrir en cualquier sexo y causar principalmente hiperviscosidad y obstruccin vascular. En contraste,
las crioglobulinas mixtas (tipos II y III) afectan a las mujeres en particular y se presentan con caractersticas clnicas diversas, por el depsito de complejos inmunitarios
crioprecipitables en los vasos sanguneos, causando vasculitis sistmica que afecta la piel, el rin y articulaciones.
Las biopsias de piel de la erupcin purprica caracterstica
observadas en tales pacientes muestran vasculitis leucocitoclstica con depsito de inmunoglobulina y del complemento. La implicacin renal debido a la glomerulonefritis
Figura 48-8 Manifestaciones clnicas y de laboratorio de la crioglobulinemia mixta en un paciente con hepatitis C. a) La erupcin prpura
caracterstica en miembros ms bajos; la flecha indica un rea prpura palpable. Reproducida de Shakil y Bisceglie (1994), con permiso. b)
Suero almacenado mostrando el crioprecipitado despus de 24 h de incubacin a 4C (derecha), redisolucin por el calentamiento a 37C
(izquierda). c) Electroforesis de la zona del suero colectado a 37C que muestra el crioprecipitado redisuelto como una banda discreta en
la regin gamma, que en la inmunofijacin muestra estar compuesta de IgM monoclonal e IgG policlonal. Observe la ausencia de la banda
gamma en la electroforesis de la zona de la muestra colectada a temperatura ambiente (TA) del mismo paciente. d) Biopsia renal mostrando
depsitos glomerulares eosinfilos de crioglobulina (seudotrombina) en el examen de H&E de rutina (izquierda) que corresponde a los depsitos gruesos (derecha) de IgG sobre inmunofluorescencia. Reproducida de Graham (Arthrit Rehum 1992;35:1107), con permiso.
CRIOGLOBULINEMIA
membranoproliferativa con depsito de la inmunoglobulina

y del complemento ocurre en 50% de todos los pacientes
con crioglobulinemia mixta. Las caractersticas histolgicas distintivas de la glomerulonefritis crioglobulinmica
incluyen la infiltracin monoctica glomerular marcada,
los depsitos eosinfilos rojo Congo negativos amorfos
en los capilares y una membrana basal glomerular doble
contorneada ocurren por una interposicin de los monocitos. La presencia de estas caractersticas en la biopsia
renal en un paciente con la, as llamada, glomerulonefritis
idioptica debe estimular una investigacin para las crioglobulinas. La funcin heptica deteriorada con un amplio
espectro de anormalidad histolgica, que comprende desde
la hepatitis persistente crnica hasta la cirrosis, ocurre en
70% de pacientes y es de inters en vista de la asociacin
fuerte de la infeccin de hepatitis C y de la crioglobulinemia mixta (fig. 48-8).
Investigacin de laboratorio de la supuesta
crioglobulinemia
Procesamiento de la muestra
La razn ms comn del fracaso para demostrar la existencia de crioglobulinas circulantes es la coleccin y el procesamiento incorrectos de la muestra. La atencin meticulosa
479
en la coleccin de las muestras sanguneas es esencial. La

sangre debe colectarse en un tubo sencillo sin anticoagulante y sumergirse en un frasco que contenga agua a 37C,
seguido por el traslado inmediato al laboratorio. El fallo
para colectar las muestras a 37C permite a las crioglobulinas precipitarse con el cogulo de sangre y, por tanto, que
escape a la deteccin. La figura 48-9 ilustra los pasos en la
deteccin de las crioglobulinas en el laboratorio.
Otras caractersticas del laboratorio que sugieren
la presencia de crioglobulinas
Los indicadores tiles de la presencia de crioglobulinas
mixtas son la deplecin marcada de los primeros componentes del complemento del suero (C4, C1q) por la activacin de la ruta clsica de los complejos inmunitarios. La
combinacin de un suero bajo de C4 y del factor reumatoide IgG es un rasgo caracterstico de la crioglobulinemia
mixta, que ocurre en ms de 90% de los pacientes. Es una
regla general til que los pacientes con un inexplicable C4
bajo del suero y enfermedad renal o de la piel deben ser
investigados para la crioglobulinemia.
Las crioglobulinas interfieren con las mediciones inmunoqumicas de rutina de las inmunoglobulinas sricas y
llevan a niveles artificiales bajos; pueden tambin interferir
con los anlisis de rutina del conteo sanguneo total por los
Figura 48-9 Pasos en la deteccin de las crioglobulinas en el laboratorio.
480
CAP. 48
contadores automatizados celulares y conducir a leucocitosis y trombocitosis falsas. La coleccin y el anlisis de las
muestras a 37C evitan estos problemas.
Adems de caracterizar la crioglobulina, todos los pacientes se investigan para un desencadenante subyacente.
En el caso de la crioglobulinemia tipo I, las investigaciones
apropiadas para la enfermedad linfoproliferativa deben instituirse. A los pacientes con crioglobulinemia mixta se les
practica serologa de la hepatitis, incluyendo la PCR para
evaluar el RNA de la hepatitis C, para seleccionar aquellos
que se benefician de terapia con interfern alfa. La investigacin de rutina para otros desencadenantes infecciosos (endocarditis, sfilis, enfermedad de Lyme, paludismo, VIH), segn se informa, relacionados con la crioglobulinemia mixta
no se justifica en ausencia de evidencias para lo contrario.
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49
Tipificacin de HLA
Mark Hathaway
Introduccin
El trasplante ahora es una terapia mdica aceptada para reemplazar rganos enfermos. Sin embargo, la respuesta del
sistema inmunitario del husped al rgano trasplantado es
un obstculo permanente importante para obtener un resultado exitoso. Los trasplantes de rgano son destruidos
por una inmunorrespuesta adaptable, principalmente por
linfocitos T hacia los antgenos ajenos presentes sobre la
superficie del tejido injertado. De los diversos antgenos
donadores presentes en un tejido aloinjertado que pueden
potencialmente obtener una inmunorrespuesta, los antgenos que activan el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) son los ms importantes.
Cuando el donador y el receptor son dispares de MHC,
una respuesta inmunitaria se inicia y se dirige contra una
molcula o molculas MHC no propias en el tejido injertado. Aunque otros sistemas del antgeno pueden invocar
una inmunorrespuesta dirigida al aloinjerto, los antgenos
MHC conocidos como antgenos leucocitarios humanos, o
HLA para abreviar, son los ms inmungenos. Esto sucede por la habilidad que poseen para unirse directamente al
receptor del antgeno de la clula T, ligando el proceso del
antgeno normal que se requiere para estimular respuestas
de la clula T; y a la frecuencia alta de clulas T circulantes
en poblaciones perifricas con la especificidad del receptor
para MHC ajenos.
Puesto que las diferencias en antgenos MHC provocan
tal rechazo vigoroso de aloinjertos, una cantidad considerable de trabajo se dirige hacia la compatibilidad MHC
donador:receptor. Definiendo la especificidad HLA, en un
esfuerzo por minimizar el rechazo, a travs de la compa-
tibilidad MHC donante:receptor es un proceso conocido

como tipificacin HLA.
Estructura y funcin de HLA

Los genes HLA del MHC humano consisten de mltiples
sitios clases I, II y III presentes en el brazo corto del cromosoma 6. Ellos comprenden cerca de 4 106 pares bsicos, que contienen por lo menos 50 genes.
Las protenas HLA clase I consisten en una cadena alfa
() que tiene tres subunidades, cada una se asemeja a un
dominio tipo inmunoglobulina (Ig). Cuando se expresan
sobre la superficie de la clula, las molculas HLA clase
I estn unidas en forma no covalente al pptido -2-microglobulina (-2M), que se codifica en un cromosoma
separado. Existen actualmente tres genes de cadena bien
definidos, designados HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLAA y HLA-B representan los productos principales de la
clase I y sirven como blancos para las inmunorrespuestas
mediadas por anticuerpos o por clulas contra tejido trasplantado. Su expresin es diferencial, dependiendo del tipo
de clula, con clulas de linaje linfoide con la expresin
ms alta y los hepatocitos y los eritrocitos con el contenido ms bajo. La expresin puede alterarse por mediadores
inflamatorios como citocinas y esto es en particular importante en el trasplante, puesto que la sobrerregulacin puede
promover inmunogenicidad del aloinjerto, o aumentar su
susceptibilidad a una inmunorrespuesta preexistente.
Las protenas HLA clase II difieren de las de la regin
clase I en trminos de estructura, funcin y distribucin.
Consisten de dos cadenas, y , y se expresan sobre la
482
CAP. 49
TIPIFICACIN DE HLA
superficie celular como heterodmeros . Los genes HLA

clase II con cadenas y se designan HLA-DP, HLA-DQ
y HLA-DR, ambas cadenas se codifican dentro la regin
clase-II y con dos subunidades que parecen dominios de
Ig. Los grupos del gen HLA-DR contienen uno extra con
cadena , cuyo producto puede aparearse con cualquier cadena DR. Por consiguiente, tres grupos de genes clase II
pueden dar lugar a cuatro tipos de molculas clase II. La
distribucin de protenas clase II est restringida de manera principal a los linfocitos B y las clulas profesionales
presentadoras de antgenos (APC), aunque la expresin en
otras clulas es inducible despus de la activacin. La funcin de las molculas clase II se considera tradicionalmente en trminos de su habilidad para estimular las respuestas
de la clula T auxiliadora o helper; sin embargo, la ms reciente evidencia muestra respuestas citotxicas importantes de anticuerpos y de la clula T efectora dirigidas contra
determinantes de la clase II.
Tambin se codifican dentro del MHC dos genes TAP.
stos se encuentran en la regin clase II, estrechamente
asociados con dos genes que codifican las protenas de bajo
peso molecular del proteosoma. Los genes de la regin clase
III codifican, entre otras cosas, los componentes C4 (C4a y
C4b), C2 y el factor B, del complemento junto con aquellos
para la citocina que son factor de necrosis tumoral (TNF y
), la enzima 21-hidroxilasa, que sintetiza esteroides, y dos
protenas de choque trmico, Hsp 70 1 y Hsp 70 2.
Gentica del complejo principal

de histocompatibilidad (MHC)
Los genes codificantes para HLA cadenas clase I y cadenas y clase II se unen dentro del MHC. Aunque los
genes que codifican para cada cadena se encuentran en regiones separadas, varios genes que codificaban por cada
cadena se han identificado dentro de cada regin. Porque
los genes HLA estn en proximidad estrecha uno al otro, la
recombinacin gentica es rara. Por lo tanto, la mayora de
los descendientes hereda un grupo intacto de los alelos parentales, uno de cada padre. Tales grupos de genes unidos
se conocen como haplotipos. Ciertos alelos, en particular
los haplotipos, se forman con mayor o menor frecuencia, lo
que podra esperarse si los alelos estn en equilibrio gentico. Tal fenmeno se conoce como desequilibrio de ligamiento y puede reflejar el origen reciente de algunos alelos,
orgenes geogrficos y patrones de crianza raciales.
Los productos de los genes HLA clase I y clase II son
codominantes expresados y, por tanto, los individuos heterocigotos deben expresar dos especificidades distintas de
HLA para cada sitio (uno materno, otro paterno). Adems,
debido a que hay tres genes para HLA clase I y cuatro posibles grupos para la clase II, se esperara que cada individuo
exprese tres diferentes MHC clase I y cuatro protenas diferentes clase II. El nmero expresado es de hecho mucho ms
alto, debido a la naturaleza polimrfica extrema de los genes
clases I y II; incluso, ms de 70 alelos en el mismo sitio
gentico se han identificado para algunas protenas clase I.
Por esta razn, la probabilidad de genes HLA en dos individuos diferentes que codifican el mismo alelo es demasiado
pequea. Porque las protenas HLA son muy inmungenas,
es necesario conseguir en el trasplante la compatibilidad ms
estrecha posible entre el aloinjerto y el receptor, reduciendo
al mnimo el riesgo de prdida del injerto por rechazo. El
proceso tcnico de la identificacin de la protena HLA en
un individuo se conoce como tipificacin HLA.
La mecnica de tipificacin HLA

Tipificacin serolgica
A travs del tiempo, la reaccin mixta del linfocito (MLR)
se utiliz para detectar la variabilidad de HLA. En esta tcnica, las clulas de un receptor potencial se cocultivan con
las clulas estimuladoras de origen donante que se han
irradiado de modo que no puedan responder. Las clulas T
del receptor se estimulan para que proliferen y se diferencien en respuesta a los antgenos HLA dispares, generalmente como un resultado del reconocimiento de la clula T
CD4+ de los antgenos HLA clase II y de reconocimiento
de los antgenos clase I por clulas T CD8+. As, los receptores compatibles pueden identificarse rpido con base
en su insensibilidad. Aunque esta tcnica se correlaciona
bien con el rechazo, es demasiado sensible y refleja de manera cercana la propia respuesta de rechazo; su aplicacin
en el escenario clnico es limitada o de ningn valor, puesto
que requiere 5 a 10 das para obtener resultados y es incmoda, costosa y tcnicamente difcil de realizar.
Hasta hace poco, el mtodo tradicional que se usaba
para distinguir individuos HLA no idnticos emple anticuerpos. Los antgenos de los sitios HLA-A y B fueron los
primeros que se definieron de este modo, usando aloantisueros que se obtienen de los sujetos inmunizados por
transfusiones sanguneas, embarazo o rechazo del aloinjerto renal. Usando esta tcnica, llamada ensayo de microcitotoxicidad, linfocitos T de la sangre perifrica (antgenos
HLA clase I) y linfocitos B (HLA-DR, -DQ) de receptores
potenciales del injerto de tipo HLA desconocido se incuban
con el antisuero que contiene el anticuerpo HLA de especificidad caracterizada. Estas clulas entonces se exponen
al complemento. Si el anticuerpo reacciona con protenas
HLA expresadas en la superficie celular, el complemento
es activado y las clulas son destruidas, lisis mediada por
el complemento. En ausencia de la reaccin, ninguna lisis
TIPIFICACIN MOLECULAR
ocurre. La destruccin se visualiza en general usando un

combinado de bromuro de etidio/naranja de acridina que
colorea las clulas viables de verde y las clulas muertas de
rojo. La destruccin se analiza semicuantitativamente determinando el porcentaje de clulas muertas en cada pozo.
As, donde la lisis ocurre, la especificidad del anticuerpo
identifica qu protenas HLA se expresan.
Diferentes tipos de error son posibles con la tipificacin
serolgica. La falla para identificar un antgeno raro o de
reaccin cruzada es un problema frecuente. Esto sucede
principalmente porque el antisuero pertinente no se utiliza
o no est disponible. El desequilibrio de ligamiento, los
orgenes geogrficos y los patrones de casamiento raciales tambin son factores que contribuyen. Por otra parte,
algunos antgenos se expresan en una frecuencia ms baja
o nula en ciertas poblaciones. Tales errores ocurren con
ms probabilidad en laboratorios que usan cantidades limitadas de antisuero. Adems, la mala interpretacin de
las reacciones del antisuero produce errores. El antisuero
puede contener ms de un anticuerpo, cada uno con especificidades de HLA que difieren, e incluso los anticuerpos
HLA monoespecficos con frecuencia reaccionan en forma
cruzada con otros antgenos HLA. Adems, la tipificacin
HLA de antgenos DR que usa la serologa es, en particular, susceptible a la mala interpretacin, puesto que los
linfocitos B presentan ms reacciones cruzadas con una
amplia gama de antgenos DR y son ms susceptibles a la
lisis no especfica mediada por el complemento y producen
resultados falsos positivos. Las variaciones tcnicas tambin explican un 15 a 30% del error entre los laboratorios
en la tipificacin serolgica. La variacin en la actividad
del complemento entre los lotes y la calidad del antisuero
son los factores contribuyentes principales.
La serologa es un mtodo rpido para la tipificacin
HLA; sin embargo, los reactivos que se emplean no son
bastante especficos para determinar la identidad estructural precisa de las molculas MHC en individuos genticamente no idnticos. Esto puede alcanzarse slo por el
anlisis directo de los genes MHC.
Tipificacin molecular
Polimorfismo de la longitud de los fragmentos
de restriccin (RFLP)
La clonacin y el mapeo moleculares intensos de la regin
clase II del MHC recientemente se consiguieron. El anlisis extenso de la organizacin de las secuencias especficas
del gen, usando una tcnica que se conoce como Southern
blotting, revela la existencia de polimorfismos en los sitios de reconocimiento de un grupo de enzimas llamadas
endonucleasas de restriccin. Estos polimorfismos en si-
483
tios de restriccin o corte son, en la mayor parte de los

casos, especficos de cada alelo. Por tanto, el mapeo y la
aclaracin de los patrones del polimorfismo en la longitud
del fragmento de restriccin (RFLP) asociados con alelos
HLA deben facilitar la identificacin del alelo en cualquier
individuo. La viabilidad de la tipificacin HLA mediante
deteccin de RFLP usando sondas de DNA la sugirieron
primero Wake y cols. (1982), quienes reportaron polimorfismos en la regin HLA-DR usando la longitud completa de un cDNA de DR1. La tipificacin RFLP de alelos
HLA-DR y HLA-DQ usando sondas de cDNA de longitud
completa para DR, DQ y DQ se utilizan mucho desde
entonces en un esfuerzo por definir con exactitud la relacin entre RFLP y las especificidades HLA clase II definidas serolgica o celularmente.
El anlisis RFLP se realiza sobre muestras de DNA genmico que por lo comn se obtienen de leucocitos con
cubierta brillante. El DNA de longitud completa se extrae va digestin de los leucocitos con dodecil sulfato de
sodio (SDS)/proteinasa K y se sujeta a la digestin por restriccin usando una endonucleasa de restriccin Taq-1 o
MSP-1. El resultado de la restriccin entonces se separa
por electroforesis en gel de agarosa al 2% y se transfiere a
una membrana de nitrocelulosa, usando Southern blotting.
Los patrones del fragmento de restriccin se visualizan por
hibridacin de la banda con sondas de cDNA radiomarcadas en forma correcta, que entonces se exponen a una placa
de rayos-X. Los patrones de la seal de hibridacin que se
generan son entonces comparados con tablas de tamao de
referencia para permitir la identificacin de especificidades
HLA-DR y HLA-DQ que difieren.
Las cualidades de esta tcnica son que las muestras mltiples (>30) pueden procesarse en forma simultnea. Tambin,
las especificidades allicas DR, DQ y DQ es posible
identificarlas a partir de una sola muestra, puesto que los resultados de la restriccin pueden transferirse e hibridarse con
un cDNA especfico del gen HLA (p. ej., DR) y la copia
se despega por medio de lavados y se hibrida con un cDNA
de la especificidad HLA diferente (p. ej., DQ o DQ).
Sus desventajas son que RFLP requiere el manejo muy cuidadoso de la muestra y de la extraccin del DNA. El DNA debe
ser de longitud completa, sin degradacin parcial, puesto que
sta puede alterar radicalmente el patrn de restriccin, creando un bandeo incorrecto. Adems, no puede utilizarse en circunstancias de un trasplante clnico de donadores cadavricos
tipo HLA por los contratiempos inherentes, ya que es posible
que se requieran hasta tres semanas para obtener los resultados. Por otra parte, los patrones del bandeo del fragmento de
restriccin son de una complejidad elevada y la hibridacin
cruzada de secuencias compartidas de las sondas de cDNA
significa que esta tcnica requiere experiencia considerable
en la interpretacin. Sin embargo, el ltimo problema puede
484
CAP. 49
TIPIFICACIN DE HLA
evitarse usando sondas de cDNA de regin corta, o especficas

del exn. En trminos tcnicos, el anlisis RFLP no identifica
directamente las secuencias del DNA polimrfico en la regin codificante para antgenos HLA, sino en sitios de restriccin relacionados de manera importante con ellas. Adems,
confa en el desequilibrio de ligamiento entre los alelos HLADR y HLA-DQ para diferenciar entre ciertos alelos HLA-DR
que muestren patrones RFLP similares, por ejemplo, DR3
(DQ2) de DR6 (DQ6) y DR7 (DQ2) de DR9 (DQ9). Tal
ejercicio necesita gran precaucin al analizar poblaciones no
caucsicas, puesto que las asociaciones particulares de HLADR-DQ no son siempre iguales. Una evidencia ms reciente
muestra, desde entonces, que tales asociaciones no son siempre verdades en algunas poblaciones caucsicas.
En la actualidad, el mtodo ms conveniente para identificar los alelos MHC emplea una tcnica conocida como
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). ste es un mtodo rpido de secuencias particulares del DNA genmico que se amplifican de manera selectiva. Para amplificar
regiones especficas de DNA, como un exn polimrfico
de un gen MHC particular, cebadores oligonucletidos
sintticos, complementarios a la secuencia de DNA que
flanquean la regin de inters, tienen que sintetizarse. El
DNA genmico, que se extrae en un procedimiento idntico a aquel para el anlisis RFLP, entonces se desnaturaliza
a temperatura alta en presencia de concentraciones excesivas de dos oligonucletidos sintticos. El enfriamiento
permite que las hebras de DNA se unan nuevamente formando la cadena doble, de tal manera que ambos cebadores se unan a su secuencia complementaria sobre el DNA
genmico. La enzima DNA polimerasa termoestable (Taq
polimerasa), que se obtiene de la bacteria Thermus aquaticus, agregada a la reaccin, ahora alarga al cebador, usando
DNA genmico entre los dos cebadores como su plantilla.
El DNA replicado es entonces desnaturalizado en hebras
simples por la temperatura alta y la mezcla se enfra para
facilitar nuevos ciclos de templado y replicacin. El primer
producto de la extensin es incierto en longitud, pero todos
los ciclos subsecuentes crean productos de la longitud definida porque la plantilla termina en el primer cebador. Los
ciclos entonces se repiten hasta que suficiente DNA est
disponible para la secuenciacin.
Una vez asociado el DNA con un alelo particular definido por la secuencia, se pueden construir sondas del
oligonucletido a partir de regiones donde se presentan
diferencias. Este oligonucletido especfico de la secuencia (SSO) o sondas de oligonucletido especfico de alelo
(ASO) pueden entonces hibridizarse para el DNA blanco
especfico amplificado por PCR Southern blotting, usando una tcnica llamada PCR-SSO/PCR-ASO. Tales tcnicas son rpidas, econmicas y una manera sensible de
definir la estructura del gen MHC. Sin embargo, las tcnicas
de tipificacin PCR-SSO/ASO requieren la preparacin de
transferencias mltiples y de sondas marcadas, por lo menos una sonda para cada alelo en cada sitio. La tipificacin
RFLP, en cambio, requiere a lo sumo dos transferencias y
tres sondas. Los contratiempos al emplear PCR-SSO/ASO
son similares a DNA-RFLP pero la preparacin del DNA
blanco es ms rpida (5 a 6 h comparadas con las 24 h); la
transferencia y el sondeo requieren un tiempo similar. As,
como en RFLP, esta tcnica slo se emplea en aplicaciones
clnicas no urgentes y, por tanto, no pueden usarse en donantes cadavricos tipo HLA.
La tipificacin HLA por tcnicas moleculares ha revolucionado por la introduccin reciente de un mtodo mltiple
del cebador especfico de secuencia basado en la PCR (PCRSSP). La clonacin molecular intensiva de los genes HLA
clases I y II facilita la construccin de una serie completa de
SSP. PCR-SSP mantiene la especificidad allica de cada par
de cebadores, tanto por el rigor de las condiciones de la reaccin PCR como por el diseo de los cebadores del oligonucletido, que explotan la capacidad de la Taq polimerasa
de amplificar secuencias del DNA blanco que son desiguales
a la secuencia del cebador. En reacciones donde la complementariedad entre el DNA y el cebador est completa, la
eficiencia de la amplificacin es 100% y el DNA blanco se
replica. Cuando hay uno o ms pares de bases desiguales entre el DNA blanco y el extremo 3 del cebador, la eficiencia
de la amplificacin es 0% y no hay productos sintetizados.
Este sistema para la tipificacin HLA clase I y clase II utiliza
192 reacciones de PCR para definir genes HLA-A, HLA-B,
HLA-C, DR1, DR3, DR4, DR5 y DQ1. Los productos de reaccin se separan electroforticamente, usando gel
de agarosa al 1% que contiene bromuro de etidio, y se visualizan sobre un transiluminador de luz UV.
Completos, los tipos HLA pueden identificarse en una
fotografa polaroid, por tanto, a este proceso se le ha llamado fototipificacin. Esta tcnica tiene sensibilidad mayor
o igual que la serologa, sin problemas de reaccin cruzada,
y con ella puede distinguirse la mayor parte de las combinaciones allicas heterocigotas. Tiene la ventaja sobre DNARFLP y tcnicas de tipificacin basadas sobre PCR-SSO/
ASO en que no se requiere transferencia y sondeo y es por
tanto ms barata y ms rpida de realizar. Por otra parte, la
tipificacin HLA, de sangre completa a los resultados, puede
obtenerse en 3 horas, haciendo esta tcnica comparable a la
serologa y conveniente para la tipificacin HLA de donantes
cadavricos. De hecho, PCR-SSP ahora reemplaza a tcnicas serolgicas en muchos laboratorios de comprobacin de
la histocompatibilidad. Otra ventaja de DNA-RFLP es que
TIPIFICACIN MOLECULAR
la PCR-SSP no confa en el DNA de longitud completa para

producir resultados, por tanto, las muestras parcialmente degradadas pueden utilizarse.
La tipificacin con base en el DNA va amplificacin por
PCR ahora es un procedimiento comn de laboratorio. La
tipificacin HLA requiere un segundo anlisis para identificar los alelos amplificados. Segn lo detallado antes, varios
tipos de ensayos pueden utilizarse para efectuar esto, pero
recientemente se desarrollaron nuevos equipos de tipificacin SSO que utilizan un sistema multiplex homogneo,
de modo que todos los SSO se analizan simultneamente
y por tanto el ensayo completo se realiza en un tubo con
la adicin de un reactivo. PCR-SSP utiliza concentraciones
equimolares de cebadores directos e inversos, as se producen productos de doble hebra. Sin embargo, si un cebador
est en exceso, productos de una hebra (as como de doble
hebra) surgen en el agotamiento del cebador limitante. Una
vez desnaturalizados, ambos pueden hibridizar sondas SSO.
El desarrollo ms reciente une sondas SSO biotiniladas a
microesferas que pueden entonces analizarse usando un
fluoroanalizador. Cada microesfera tiene una marca nica
que puede distinguirse con el analizador, y cada una lleva un
diferente SSO biotinilado, por tanto una mezcla de la sonda
se distingue en virtud de su asociacin con una microesfera
particular. La unin de la sonda se visualiza usando estreptavidina-PE. La seal relativa de cada sonda se utiliza para
asignar positividad y negatividad con DNA amplificado.
Esto provea la informacin requerida para asignar un fenotipo HLA y tena la ventaja de no requerir productos qumicos peligrosos. Sin embargo, sta y otras tcnicas basadas
en PCR no estn desprovistas de problemas. La desviacin
de los protocolos definidos de PCR, DNA de mala calidad
(en trminos de pureza) y las mquinas inadecuadas de PCR
pueden producir fallas individuales de PCR que dan lugar
a la asignacin incorrecta o errnea del antgeno. Adems,
la experiencia molecular de alto nivel de estas tcnicas, no
menos exigente que en la serologa, requiere entrenamiento
y experiencia considerables para realizarse correctamente.
Tipificacin basada en la secuenciacin

Las tcnicas de secuenciacin del DNA se desarrollaron
originalmente en la dcada de 1970, pero ahora han avanzado lo suficiente para considerarse mtodos rpidos, econmicos y sencillos para la tipificacin HLA. Dos tcnicas
bsicas han surgido: la tcnica de degradacin qumica
desarrollada por Maxim y Gilbert (1977), y el mtodo enzimtico, por Sanger y cols. (1977). Varios informes que
detallaban datos de la secuencia HLA clase I y los de la
clase II se publicaron a mediados de la dcada de 1980.
Sin embargo, en aquel momento, el grado del polimorfis-
485
mo de HLA, junto con las tcnicas laboriosas requeridas

para amplificar regiones del DNA, signific que la secuenciacin no podra considerarse realista para la tipificacin
del tejido. Esta consideracin se invierte rpido despus de
la introduccin de mtodos basados en la PCR de amplificacin del DNA. Los acercamientos iniciales utilizaron el
RNA con xito para secuenciar los alelos clases 1 y 2, que
son simples y rpidos de aislar, y simplificaron la amplificacin de las regiones cortas del exn requeridas. Su desventaja al principio era el requerimiento de material viable
para el aislamiento del RNA. Adems, el RNA es inestable,
haciendo la extraccin, en particular del material de archivo, notoriamente difcil. Al mismo tiempo, las tcnicas de
tipificacin por secuenciacin basadas en el DNA tambin
se desarrollaron (stas se emplean en la actualidad en la
mayor parte de los laboratorios que tipifican tejido).
El mtodo ms popular para la secuenciacin del DNA
es la tcnica de la terminacin de cadena mediada por dideoxi, la cual a su vez se desarrolla a partir de una tcnica
original desarrollada en 1975. De manera breve, esta tcnica implica la amplificacin de la regin que se secuencia,
que entonces se desnaturaliza para producir DNA de cadena sencilla (ssDNA). Un cebador que secuencia es entonces
templado para el ssDNA y la cadena del DNA se extiende
en direccin 5 a 3. La extensin termina si un dideoxinucletido 23 se incorpora en lugar de uno convencional. Se
establecen cuatro reacciones, cada una con uno de cuatro
nucletidos dideoxi as como los cuatro deoxinucletidos.
Asimismo, cuatro grupos separados de fragmentos de cadena terminada se producen. Estos fragmentos permanecen
complementarios al ssDNA que ha actuado como plantilla y, calentando o usando un agente desnaturalizante, los
fragmentos de cadena terminada se pueden liberar de la
plantilla y separarse empleando electroforesis de alta resolucin en gel desnaturalizante. La secuencia del DNA original entonces se deduce comparando la posicin relativa
de los productos en los cuatro carriles del gel.
Aunque el mtodo bsico permanece inalterado, se han
hecho varias mejoras que elevan la velocidad, simplicidad y
confiabilidad de secuenciacin del DNA. stas incluyen el
uso de fragmentos de PCR, como plantillas, que contribuyen con un mtodo rpido para obtener cantidades grandes
de material de la plantilla y el uso de un cebador biotinilado,
lo cual significa que el producto PCR marcado con biotina puede extraerse rpidamente usando perlas magnticas
marcadas con estreptavidina. Las mejoras en enzimas que
se emplean para la secuenciacin tambin contribuyen. La
enzima T7 DNA polimerasa se prefiere ahora sobre la polimerasa del fragmento Klenow porque incorpora bases de
DNA en la cadena que se extiende a una tasa ms uniforme.
La DNA polimerasa derivada de Thermus aquaticus se le
disea para que sea ms termoestable, que a su vez crea ms
486
CAP. 49
TIPIFICACIN DE HLA
productos. Los nucletidos radiomarcados se reemplazan

cada vez ms por mtodos de marcaje fluorescente como un
medio de detectar productos secuenciales. Adems, el uso
de colorantes de cuatro colores significa que los productos
pueden correrse en un solo carril del gel. Uniendo cada colorante para separar ddNTPS significa tambin que las reacciones pueden llevarse a cabo en un solo tubo. Tambin est
disponible una gama amplia de secuenciadores automticos
que detectan productos marcados con fluorescencia despus
de electroforesis con gel en lmina o capilar vertical. Es
ms, todas estas mquinas transfieren datos directos a una
computadora desviando la necesidad de un anlisis manual
de datos brutos, ya que los datos se convierten de manera
automtica en informacin de la secuencia.
Como con la mayor parte de las tcnicas, la secuenciacin
no est libre de problemas. Las combinaciones ambiguas del
alelo son el problema ms grande. Esto sucede en todos los
sitios y ocurre cuando dos alelos producen una secuencia heterocigota que es idntica a la secuencia de par de alelos diferente. Pueden existir tambin problemas con PCR y el diseo
del cebador secuenciador. Se pensaba que la secuenciacin
sostena una ventaja sobre la otra tipificacin de DNA, en tanto que detecta los alelos previamente no identificados. Esto es
verdad a menos que el nuevo alelo contenga polimorfismos
en las posiciones correspondientes al extremo 3 de la PCR o
cebadores secuenciadores. Adems, la tipificacin basada en
la secuencia debe secuenciar el gen completo bajo estudio,
ya que con secuencias ms cortas, mayores son las oportunidades de que los nuevos polimorfismos sean errados. El uso
de cebadores mltiples para PCR y para la secuenciacin
puede dar lugar a una amplificacin o secuenciacin preferencial de un alelo particular. Esto conduce a una asignacin
incorrecta de homocigosidad. Las tcnicas de tipificacin con
base en la secuenciacin requieren an intenso trabajo y equipo y reactivos costosos. Este es probablemente el obstculo
ms grande para su adopcin como tcnica de lnea primaria
para los laboratorios de HLA. Por otra parte, aunque la tipificacin con base en la secuenciacin aporta una tipificacin de
resolucin muy alta, no hay hasta ahora evidencia que sugiera
que el tal emparejamiento HLA de alta resolucin sea importante en el trasplante del rgano slido. Para el trasplante de
mdula sea, sin embargo, el cuadro es diferente, con evidencia clara que el emparejamiento afecta el resultado.
Resumen
Las glucoprotenas de la superficie celular del MHC juegan
un papel central en la inmunologa del trasplante. El MHC
se determina originalmente como la barrera principal para
el trasplante debido a la fuerte respuesta de rechazo de los
linfocitos T hacia los antgenos MHC presentes sobre el tejido injertado. Las protenas HLA del MHC humano estn
entre las ms polimrficas conocidas, por consiguiente la
probabilidad de dos individuos sin relacin que expresen
los mismos alelos HLA es muy pequea. Puesto que el
reconocimiento del antgeno de la clula T est profundamente influido por polimorfismo MHC, las protenas HLA
de donadores del trasplante y los receptores potenciales deben identificarse y la posible compatibilidad ms estrecha
se localiza para minimizar el riesgo de prdida del injerto
por rechazo. La tcnica de identificacin del HLA, llamada
tipificacin de tejido, se usa en medicina clnica para la
compatibilidad del donador con el receptor en programas de
trasplante cadavrico, pero tambin es posible usarla para
estudiar el papel del MHC en la determinacin de la susceptibilidad hacia condiciones alrgicas y autoinmunitarias.
La genotipificacin del MHC en humanos se realiz
originalmente por la reaccin linfoctica mixta y despus
por la serologa. Debido a contratiempos metodolgicos
inherentes, esos mtodos se reemplazaron por tcnicas que
analizan el nivel de la expresin gentica. Los genes -DR
y -DQ de la regin MHC clase II son los primeros en tipificarse para HLA por DNA-RFLP. Esta tcnica se reemplaz, en gran parte, por mtodos con base en la PCR ms
rpidos. La clonacin y el mapeo moleculares del MHC
condujeron al desarrollo reciente de una nueva tcnica basada en la PCR que tipifica los antgenos de las regiones
clases I y II. Al emplear esta tcnica, la genotipificacin
del HLA puede realizarse en una sola muestra usando PCR
mltiple y un solo gel, con resultados que se obtienen a
partir de una fotografa polaroid. Este sistema sustituye,
o est sustituyendo, a todos los anteriores procedimientos
serolgicos/moleculares con base en la tipificacin HLA,
en la mayor parte de laboratorios de pruebas de histocompatibilidad. Las tcnicas con base en la secuencia del DNA
aportan un mtodo de tipificacin de alta resolucin muy
empleado en situaciones de trasplante de mdula sea.
SECCIN 9
PATOLOGA MOLECULAR
50
Microdiseccin por lser y captura de tejido
Orla Sheils, Paul Smyth, Esther ORegan, Stephen Finn,
Richard Flavin y John OLeary
Los recientes avances en tecnologas moleculares han revolucionado los estudios genmicos, transcriptmicos y
protemicos. Sin embargo, un inconveniente potencial
serio en la aplicacin de estas tecnologas es la heterogeneidad inherente de tejidos resecados quirrgicamente.
Resultados errneos pueden generarse, causando distorsin en los anlisis subsiguientes a menos que el material
de entrada est libre de poblaciones celulares excedentes
para los requerimientos. La microdiseccin por lser de los
cortes de tejido y de las preparaciones citolgicas es un
valioso recurso en sentido ascendente para facilitar la obtencin de poblaciones celulares y superar la barrera de la
complejidad del tejido. Puede acoplarse con una variedad
de tecnologas moleculares en sentido descendente para
generar resultados vlidos y significativos.
La microdiseccin por lser y captura de tejido (LCM)
es una tcnica que se desarroll originalmente en el Instituto Nacional de Cncer. Desde sus inicios sufri varias
modificaciones, en la actualidad se dispone de una gama de
instrumentos, los cuales se clasifican en dos categoras,
dependiendo del tipo de lser empleado (infrarrojo [IR] o
ultravioleta [UV]).
La LCM puede aplicarse a una variedad de preparaciones tisulares, desde secciones congeladas hasta secciones
fijadas e incluidas en parafina o preparaciones citolgicas.
La tincin de rutina usando hematoxilina y eosina o azul
de toluidina se utiliza, por lo general, para ayudar en la
identificacin morfolgica del tipo celular de inters y para
facilitar el recorrido alrededor de una seccin tisular. Sin
embargo, las tinciones histoqumicas, inmunohistoqumicas o inmunofluorescentes pueden utilizarse tambin para
permitir la seleccin de clulas, segn las caractersticas
fenotpicas y funcionales. Dependiendo del material de inicio y de los requerimientos de los protocolos en sentido
descendente seleccionados, el DNA, mRNA o la protena
pueden extraerse y analizarse con xito. De esta manera
la identificacin de los biomarcadores celulares especficos
de la enfermedad o de blancos teraputicos potenciales se
logra con exactitud.
Esta tecnologa es til en la investigacin de cncer. Una
barrera importante para los investigadores de cncer yace
en la dificultad de caracterizar los cambios moleculares que
se producen durante la progresin del cncer, donde las clulas premalignas progresan para formar un tumor maligno.
La identificacin de protenas de expresin baja o de sobreexpresin durante la progresin del tumor que pueden ayudar en la deteccin temprana del cncer es obstaculizada
por la subpoblacin celular pequea en la cual estas protenas existen. La microdiseccin por captura lser permite a
los investigadores comparar clulas normales con clulas
enfermas aislando subpoblaciones distintas a partir de secciones de tejido teidos.
LCM-PixCell y AutoPix de Arcturus

La LCM facilita el incremento de la sensibilidad y de la
exactitud de los ensayos moleculares iniciando con mues-
490
CAP. 50
MICRODISECCIN POR LSER Y CAPTURA DE TEJIDO
tras de tipo celular homogneo y de estructuras multicelulares aisladas a partir de muestras tisulares o citolgicas
completas. Este acercamiento nico a la microdiseccin,
desarrollado en 1996 en los Institutos Nacionales de Salud
(EUA) y disponible exclusivamente de la compaa Arcturus, asegura que las molculas biolgicas, como RNA y
DNA, permanezcan indemnes durante el proceso de microdiseccin. El anlisis molecular en sentido descendente de
estas molculas produjo resultados exactos y seguros que
condujeron a ms de 300 publicaciones revisadas a fondo
por investigadores independientes.
La LCM tiene gran flexibilidad respecto a preparaciones
tisulares y con fijacin celular. Extrae clulas con eficacia a
partir de secciones tisulares incluidas en parafina, congeladas y preparadas usando una amplia variedad de colorantes
diferentes, de superficies de laminilla y de protocolos.
Con base en la adhesin de las clulas seleccionadas a
una membrana termoplstica, la LCM utiliza un lser infrarrojo de baja potencia para fundir la membrana sobre las
clulas de inters. La parte microscpica del instrumento
PixCell II LCM utiliza una palanca de control para dirigir
su mecanismo. Los conos especiales (fig. 50-1) se car-
de milisegundos y forma un compuesto con el tejido. Los

impulsos del lser, por lo general 0.5 a 5.0 ms de duracin,
pueden repetirse mltiples veces a travs de la superficie
entera del capuchn, que permite el aislamiento rpido de
una gran cantidad de clulas. Los fragmentos tisulares seleccionados se recoleccionan por la elevacin simple del
capuchn, el cual entonces se transfiere a un tubo para microcentrifugado que contiene soluciones amortiguadoras
requeridas para el aislamiento de las molculas de inters.
El dimetro mnimo del rayo lser del microscopio LCM
es actualmente de 7.5 m, el mximo de 30 m. Despus de
este procedimiento, las biomolculas se extraen de las clulas usando cido nucleico propietario o genrico o equipo de extraccin de la protena.
El proceso de captura celular es directo y fcil de realizar
y existe una gama de productos optimizados para las aplicaciones especficas en sentido descendente. El Sistema PixCell
II LCM (fig. 50-2) no utiliza radiacin UV pulsada u otras
tcnicas indirectas de captura, una caracterstica que, los fa-
Figura 50-2 Instrumento PixCell II de Arcturus.

Figura 50-1 Fotomicrografa electrnica de barrido de un cono
de CapSure LCM con una sola clula capturada con lser sobre el
frotis termoplstico. Cortesa de Arcturus.
gan dentro del montaje, a travs del cual el lser se enfoca

sobre las clulas de inters. Estos conos, cubiertos con una
pelcula termoplstica, son colocados sobre el corte del tejido o sobre la muestra citolgica. El cono se suspende en
un brazo de transporte mecnico y se coloca sobre el rea
deseada de la seccin deshidratada del tejido bajo presin
estndar. Despus de la seleccin visual de las clulas deseadas, guiada por un haz de posicionamiento, la activacin del lser conduce a la fusin focal de la membrana de
etileno acetato de vinilo (EVA). La formacin de una protuberancia fina del plstico fundido, que tiende un puente
sobre el hueco entre el capuchn y el tejido y se adhiere a
la clula blanco, significa que cuando el capuchn se levanta, las clulas seleccionadas siguen unidas y se capturan por anlisis adicional. El polmero resolidifica dentro
bricantes afirman, reduce la prdida potencial de la muestra o

la introduccin de cargas electrostticas que hacen la muestra
difcil de manejar. La energa baja del lser IR tambin evita
efectos fotoqumicos potencialmente perjudiciales.
Existe un sitio de trabajo que archiva la imagen opcional
disponible con el Sistema de PixCell II LCM. Este dispositivo provee una interfase de uso fcil para la grabacin y
almacenaje, tanto de las imgenes pre como de las posmicrodiseccionadas con anotaciones opcionales del usuario.
Un avance reciente en el repertorio de Arcturus, dentro
de la tecnologa LCM, es el sistema automtico AutoPix
LCM. La ventaja principal de este instrumento (fig. 50-3)
sobre el PixCell II es que toda la parte y los mecanismos
pticos, cmaras fotogrficas, filtros y objetivos estn totalmente controlados por computadora. Esto permite que reas
dentro de numerosos campos del panorama sean visualizadas, seleccionadas, y capturadas en forma simultnea. Adems, la clula y los algoritmos del reconocimiento de la
LCM-PIXCELL Y AUTOPIX DE ARCTURUS
491
Figura 50-3 Instrumento AutoPix de Arcturus.
Figura 50-4 Pasos involucrados en LCM.
Figura 50-5 Principio bsico de LCM de Arcturus.
492
CAP. 50
MICRODISECCIN POR LSER Y CAPTURA DE TEJIDO
Figura 50-6 Dibujo animado que representa cmo un rayo lser se

enfoca a travs de una pelcula para disecar clulas individuales.
caracterstica incorporados permiten al usuario programar

el software para localizar y enfocar clulas o regiones especficas de inters en varias muestras. El sistema (figs. 50-4,
50-5 y 50-6) tambin tiene la capacidad de agrupar clulas
o regiones microdiseccionadas, a partir de muestras mltiples, en una sesin facilitando la recoleccin de material
microdiseccionado.
Microdiseccin con microrrayo lser

Otra tecnologa avanzada disponible en el comercio de la
microdiseccin lser est disponible bajo la forma de microdiseccin con microrrayo lser (LMM; PALM-Mikrolaser
Technologic, Bernried, Alemania). El principio primordial
que distingue entre LCM y LMM es la eleccin del lser. El
sistema PALM utiliza un lser UV con un enfoque muy alto
para cortar o eliminar clulas seleccionadas por ablacin de
estructuras circundantes.
El micro-rayo PALM (fig. 50-7) es un microscopio
innovador diseado para el aislamiento y recoleccin de
tejido, clulas u organelos biolgicos no contaminados,
que se cortan directamente de secciones histolgicas o de
cultivos celulares para el anlisis en sentido descendente,
tpicamente para RNA o contenido protenico (fig. 50-8).
Un lser UV-A pulsado de nitrgeno a 337 nm se acopla a
Figura 50-7
PALM.
Instrumento para microdiseccin con microrrayo
la trayectoria epifluorescente o de campo brillante del microscopio y se programa para trazar cualquier patrn cortante deseado antes de transferir especmenes, ya sea como
fragmentos a partir de portaobjetos histolgicos normales,
clulas intactas en portaobjetos revestidos con membranas
especiales, o como clulas vivas en placas de cultivo revestidas con membranas, directamente dentro de un tubo
Eppendorf para el anlisis adicional.
Varias aplicaciones adicionales estn disponibles con el
sistema PALM. ste utiliza un lser UV pulsado con calidad de un haz alto, que se interconecta dentro del microscopio y se enfoca a travs de un objetivo a un tamao del
punto del haz <1 m de dimetro. Puede usarse la densidad
del fotn muy alta en el enfoque del lser estrecho para
separar o para eliminar estructuras biolgicas por ablacin,
permitiendo realizar microciruga sobre clulas y molculas o para el micropreparado de clulas nicas y de partculas
subcelulares. El microrrayo es capaz de disecar filamentos
citoplasmticos, flagelos o colas del espermatozoide. Adems, puede realizarse microinyeccin inducida por lser,
por ejemplo, en el rea nuclear de clulas vivas, causando
transporte de material dentro de la clula sin herramientas
mecnicas o vectores virales.
Figura 50-8 Fotografas que muestran cmo la LPC se logra a partir de clulas en un filtro hasta cuando las clulas son recoleccionadas.
LEICA AS LMD
Los lseres de los sistemas MicroLaser de PALM se interconectan dentro de un microscopio de investigacin va
trayectoria epifluorescente. Un objetivo de abertura numrica alta enfoca los lseres sobre el plano del objeto, lo que
produce tamaos del punto <1 m de dimetro. El sistema
est equipado de una parte motorizada del microscopio,
controlada por computadora o de un micromanipulador, o
ambos (PALM RoboStage y PALM CapMover). Los sistemas se enfran con aire, la base se opera con interruptor y
se controlan por el ratn de la computadora. Todos los sistemas pueden equiparse con fluorescencia y con el software
avanzado de Metafer P para el reconocimiento del patrn.
Leica AS LMD
El Leica AS LMD (fig. 50-9) es otro sistema que ofrece
microdiseccin exacta por lser de clulas o de grupos de
Figura 50-9 Instrumento Leica AS para microdiseccin por lser.
clulas dentro de preparaciones para PCR, RT-PCR y protemicos. Este sistema es una plataforma de microdiseccin
de tercera generacin. Fue desarrollado combinando la
arquitectura del microscopio vertical automtico, el control ptico tridimensional del rayo lser para diseccin y
del rea disecada, el muestreo sin contacto del tejido y el
manejo motorizado posdiseccin.
La LCM contina en desarrollo y se extiende como una
tcnica con avances en la instrumentacin y en el control
computarizado de la funcin bsica. Tcnicas unicelulares
ms precisas crean y se acoplan con protocolos o equipo de
extraccin por proveedores de aplicaciones en sentido descendente. En un tiempo relativamente corto, la LCM se ha
afianzado como una herramienta inestimable para la obtencin de poblaciones celulares puras a partir de material
493
biolgico, y es un componente invaluable de protocolos

basados en el tejido dentro de las reas genmicas funcionales, protemicas y genmicas.
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(b)
51
Anlisis del gen por reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR) en tiempo real
Cara M Martin, Orla Sheils y John OLeary
Introduccin
El anlisis cuantitativo de la reaccin en cadena de la polimerasa en tiempo real es una modificacin de la tcnica
original de PCR, que implica la deteccin y la medicin
confiables de los productos generados durante cada ciclo
de la reaccin en cadena de la polimerasa. La tcnica confa en la deteccin de productos especficos de PCR, con
base en el uso de una sonda marcada con fluorescencia y
diseada para hibridar dentro de la secuencia blanco del
producto de PCR. Durante el ciclo de PCR, la deteccin
de la seal fluorescente, que se incrementa, es proporcional
a la acumulacin de los productos de la amplificacin. Por
tanto, la medicin de la fluorescencia en una muestra particular emite una seal que se asocia especficamente con el
blanco amplificado y se relaciona en forma cuantitativa con
la cantidad de producto de PCR.
La PCR en tiempo real se puede realizar usando una
variedad de tecnologas, incluyendo los ensayos con la 5
nucleasa, iniciadores de horquilla, sondas Scorpion, colorantes intercalantes, por ejemplo, verde SYBR y FRET
(tecnologa de la transferencia de energa por resonancia libre), y empleando sistemas de hibridacin por doble sonda
(faro molecular). En este captulo, se discuten los ensayos
de la 5 nucleasa conocida como TaqMan de reaccin en
cadena de la polimerasa, y sus aplicaciones para el uso en laboratorios de patologa.
Qumica de la reaccin en cadena

de la polimerasa en tiempo real
Colorantes de unin a DNA, SYBR green (verde)
La base de los mtodos de deteccin de secuencia no especfica es el uso de colorantes intercalantes, como el verde
SYBR o el bromuro de etidio (fig. 51-1a). El colorante libre exhibe poca fluorescencia en solucin, pero durante la
etapa de extensin de PCR las cantidades crecientes del
colorante intercalado se unen al DNA naciente de doble
hebra. La incorporacin del verde SYBR dentro de una
reaccin de PCR permite la deteccin de la acumulacin
del producto monitoreando el aumento en la emisin de
fluorescencia en tiempo real. ste proporciona mayor
flexibilidad eliminando la necesidad de sondas fluorescentes especficas del blanco; sin embargo, es importante
observar que los iniciadores que se emplean determinan
la especificidad total de la reaccin. Adems, debido a la
presencia de cualquier DNA de doble hebra es capaz de generar fluorescencia, la especificidad del ensayo es similar a
la PCR convencional, y los problemas pueden encontrarse
con la unin del colorante a la amplificacin no especfica
y a dmeros del cebador. La especificidad se mejora generando una curva de disociacin para detectar la amplificacin no especfica (Ririe y cols., 1997). El anlisis de la
curva de disociacin se realiza despus de una PCR ter-
496
CAP. 51
ANLISIS DEL GEN POR REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL
Figura 51-1 a) El colorante intercalante verde SYBR se une al DNA de doble cadena. b) Disociacin (curva del punto de fusin),
mostrando dmeros del iniciador y el amplicn de PCR en un ensayo con verde SYBR.
minada. Esto se logra elevando lentamente la temperatura

de la reaccin de PCR de 65 a 95C (sobre la temperatura de fusin del fragmento amplificado) mientras que
continuamente se recolectan los datos de la fluorescencia.
Cuando la temperatura aumenta, el producto de PCR se
desnaturaliza, creando un pico de fusin caracterstico a
temperatura de fusin del amplicn, que es distinguible de
artefactos de la amplificacin que se funden a temperaturas
ms bajas (fig. 51-1b).
Faros moleculares y sondas de hibridacin
En este sistema, se emplean dos sondas de hibridacin. Una
sonda lleva una molcula donadora de fluorescena en su extremo 3, cuyo espectro de emisin se traslapa con una sonda receptora sobre el extremo 5 de una segunda sonda. En
solucin, los dos colorantes estn separados. Sin embargo,
despus de la etapa de desnaturalizacin ellos se hibridan
con la secuencia del blanco durante la complementariedad,
y adoptan una configuracin cabeza-cola. Esto conduce a
las dos molculas fluorescentes a una proximidad estrecha,
y el fragmento de la fluorescena puede transferir su energa
a la segunda. La energa de la luz emitida por la segunda
molcula se evala y registra, y el aumento en los niveles
de fluorescencia corresponde con la cantidad de DNA sintetizada durante la reaccin de PCR. Una ventaja adicional de este sistema lo aportan las sondas no hidrolizadas,
permitiendo la posibilidad de generar curvas de los puntos
de fusin. stas pueden utilizarse para vigilar la eficiencia de
la amplificacin.
Sondas de hidrlisis
El ensayo TaqMan utiliza la actividad de la exonucleasa 53 de Taq o de la rTth DNA polimerasa para hidrolizar una
sonda de hibridacin unida al fragmento amplificado blanco

(Lyamichev y cols., 1993; Holland y cols., 1991; Lawyer y
cols., 1989). En este sistema, tres oligonucletidos se requieren para unirse al blanco. Dos iniciadores especficos
de la plantilla definen los puntos finales del amplicn y se
emplean como primer nivel de la especificidad. Otro nivel
de la especificidad se alcanza con la inclusin de una sonda
especfica, que une internamente a los puntos definidos por
los iniciadores. Las caractersticas de la sonda TaqMan incluyen una molcula reportera fluorescente en el extremo 5,
cuya emisin es extinguida por una segunda molcula en el
extremo 3. La proximidad espacial de la sonda reportera a
la sonda extintora en una sonda intacta asegura que ninguna
fluorescencia neta se detecte. La liberacin de fluorescencia
ocurre slo si la amplificacin especfica del blanco ocurre,
evitando la necesidad de confirmar el fragmento amplificado o amplicn despus de la amplificacin.
Qumica de la TaqMan de PCR (ensayo

de la 5 nucleasa)
La tecnologa TaqMan es una tcnica cuantitativa de PCR
en tiempo real, basada en el ensayo de la 5 nucleasa descrita primero por Holland y cols. (1991). La tcnica emplea
sondas fluorescentes diseadas para hibridar dentro de la
secuencia del blanco y, en la fase de templado/extensin de
PCR, para generar una seal que se acumule durante PCR
al completarse un ciclo en proporcin con la cantidad de la
plantilla, antes de la iniciacin de PCR (Orlando y cols.,
1998; Gibson y cols., 1996).
La base para este sistema consiste en medir continuamente los productos de PCR cuando se acumulan, usando una
sonda oligonucletida fluorognica especfica doblemente
marcada llamada sonda TaqMan (Livak y cols., 1995; Lee
QUMICA DE LA TAQMAN DE PCR (ENSAYO DE LA 5 NUCLEASA)
y cols., 1993). La sonda TaqMan se compone de un oligonucletido corto (~ 20 a 25 bases) marcada con dos colorantes diferentes, un colorante extintor o quencher en 3,
un colorante reportero en 5, y un fosfato bloqueador en 3
para prevenir la extensin de la sonda durante la PCR (Livak y cols., 1995). El colorante reportero fluorescente, por
ejemplo, FAM (6-carboxifluorescena), VIC o JOE (2,7dimetil-4,5,-dicloro-6-carboxifluorescena) est covalentemente ligado al extremo 5 de la sonda oligonucletida.
TET (tetracloro-6-carboxifluorescena) y HEX (hexacloro-6-carboxifluorescena) pueden tambin utilizarse como
colorantes reporteros fluorescentes en este sistema. Cada
uno de estos reporteros se extingue por TAMRA (6-carboxi-tetrametil-rodamina) (el colorante extintor), un extintor o quencher no fluorescente que est unido por un LAN
(nucletido modificado del brazo ligador) al extremo 3 de
la sonda. La sonda est qumicamente fosforilada en su extremo 3, lo cual previene la extensin de la sonda durante
las aplicaciones de PCR. La secuencia de la sonda oligonucletida es homloga a una regin interna presente en el
producto de PCR. Cuando la sonda est intacta (alineada),
la transferencia de energa del tipo Frster ocurre entre los
497
dos fluorforos y ocasiona la supresin de la fluorescencia

del reportero (Gibson y cols., 1996; Livak y cols., 1995).
El ensayo TaqMan utiliza tanto la Taq como la Tth polimerasa, aisladas a partir de Thermus aquaticus y Thermus thermophilus, respectivamente, pero cualquier enzima
con actividad 5 nucleasa puede utilizarse. Durante la amplificacin, la sonda no extensible es incidida por la actividad de la 5 exonucleasa de la Taq o Tth DNA polimerasa,
de tal modo que libera al reportero a partir del extintor o
quencher oligonucletido y produce un aumento en la intensidad fluorescente de la emisin del reportero. Esto se
monitorea en tiempo real durante la fase exponencial de la
amplificacin de PCR, usando el Sistema Detector de Secuencias 7 700 (Applied Biosystems, Lincoln Centre Drive,
Foster City, CA 94404, USA). La incisin elimina la sonda
de la hebra blanco, permitiendo que la extensin del iniciador contine hasta el extremo de la hebra plantilla. Una
apreciacin global del proceso se ilustra en la figura 51-2.
Las molculas adicionales del colorante reportero son incididas desde sus sondas respectivas con cada ciclo, lo que
conduce a un aumento en la intensidad de la fluorescencia
proporcional a la cantidad de amplicn que se produce. La
Figura 51-2 Esquema de TaqMan PCR usando una sonda

interna marcada con un reportero y una secuencia del extintor.
Los iniciadores y la sonda de TaqMan templan al DNA desnaturalizado. Durante la polimerizacin la sonda es incidida,
liberando el colorante reportero del colorante extintor, produciendo un aumento en la seal fluorescente que es proporcional a la cantidad de producto de PCR que se ha acumulado.
498
CAP. 51
actividad exonucleasa de la Taq polimerasa acta slo si

la sonda fluorognica es templada al blanco, puesto que la
actividad es especfica de la doble hebra, por tanto la enzima
no puede hidrolizar la sonda cuando est libre en la solucin
y ninguna fluorescencia del reportero se detecta.
Puesto que la polimerasa slo incide en la sonda mientras sta permanece hibridada a su hebra complementaria,
las condiciones de temperatura de la extensin de PCR
deben ajustarse para asegurar la unin de la sonda. El sistema de TaqMan utiliza un paso combinado de templado y
de polimerizacin de 60 a 62C para asegurar que la sonda
permanezca hibridada durante la amplificacin. La mayor
parte de las sondas tienen una temperatura de fusin (Tm) de
alrededor de 10C, o por lo menos de 5C ms arriba que la
de los iniciadores de PCR (Livak y cols., 1995), ya que la
unin de la sonda TaqMan con los iniciadores es crucial para
el xito del proceso. Sin ella, se forman productos de PCR
sin la generacin de fluorescencia y, por tanto, no es posible
una deteccin. Esto asegura que la sonda permanezca unida a su blanco durante la etapa de la extensin del iniciador
y tambin garantiza la mxima actividad 5-3 exonucleasa
de las Taq y Tth DNA polimerasas.
base con apareamientos bien hechos y la de oligonucletidos con apareamientos mal hechos, por tanto, aumenta el
poder discriminatorio de los ensayos por hibridacin.
Otra caracterstica de las sondas MGB es la fluorescencia baja del fondo y, por consiguiente, un cociente con mayor seal:ruido. La fluorescencia del fondo de las sondas
intactas MGB aumenta levemente con la longitud de la sonda, pero permanece varias veces ms baja en comparacin
con las sondas sin MGB. Las sondas MGB estabilizan enlaces A-T ms que los enlaces G-C en un DNA dplex. Esto
reduce la influencia de la secuencia del blanco sobre Tm
(Kutyavin y cols., 2000). Se ha encontrado tambin que esa
discriminacin del apareamiento mal hecho se mejora cuando se coloca bajo MGB. Tpicamente, un conjugado oligonucletido-MGB se disea de tal forma que MGB reside en
el extremo 3 de un oligonucletido que contiene una regin
rica en A-T con cerca de 6 a 7 bases. Se observ que los
apareamientos mal hechos posicionados dentro de la regin
vinculada a MGB se diferencian mejor, mostrando una diferencia incrementada de la energa libre entre apareamientos
correctos y apareamientos mal hechos para los diversos pares apareados incorrectamente bajo MGB (Kutyavin y cols.,
2000; Orlando y cols., 1998; Gibson y cols., 1996).
Sondas TaqMan de unin al surco

menor del DNA
Iniciador TaqMan y diseo de la sonda
Recientemente, se han desarrollado sondas fluorognicas

TaqMan de unin al surco menor (MGB) que mejoran la
sensibilidad de un ensayo TaqMan. MGB (antibiticos naturales y molculas sintticas) pueden entrar en el surco
menor de la hlice que forma el DNA de doble hebra y
estabilizar los DNA dplex, aumentando la discriminacin
del apareamiento mal hecho cuando se une a una sonda
oligonucletida. Las sondas fluorognicas TaqMan MGB
tienen varias caractersticas que las hacen superiores a las
sondas fluorognicas tradicionales. Una MGB se une a los
extremos 3, 5 o a un nucletido interno del oligonucletido. Las sondas MGB se unen con ms firmeza a su complemento, lo que eleva la temperatura de fusin (Tm) de
las sondas y permite un diseo ms flexible del anlisis.
Los estudios demuestran que la introduccin de una MGB
sobre una sonda 12-mer con una Tm de 20C aumenta su
Tm a 65C. Esta Tm es equivalente a la Tm de una sonda
27-mer sin una MGB (Kutyavin y cols., 2000). Se recomienda que la Tm de la sonda sea >10C ms alta que la Tm
del cebador, de manera que la introduccin de una MGB
contribuya significativamente al diseo del ensayo, permitiendo el uso de una gama ms amplia de iniciadores. El
uso de una MGB permite que sondas ms cortas se empleen y se mejore la discriminacin del apareamiento mal
hecho. Los oligonucletidos MGB muestran una diferencia
incrementada entre la Tm de oligonucletidos de una sola
La especificidad y la sensibilidad de un ensayo TaqMan

PCR se determinan con la eleccin del iniciador y de las
secuencias de la sonda. Los biosistemas aplicados desarrollan un programa software especfico conocido como Primer Express, el cual puede utilizarse para disear ensayos
ptimos TaqMan PCR. La longitud ptima para los iniciadores TaqMan PCR es de 15 a 20 bases con un contenido
G/C del 30 al 80%, donde los ltimos cinco nucletidos en
el extremo 3 contienen no ms de dos residuos de G y C.
La Tm de los iniciadores directos e inversos debe ser de 58
a 60C y no diferir en ms de 1 a 2C. Los amplicones PCR
ms cortos tienden a amplificar con ms eficiencia que los
amplicones ms largos y aumentan la sensibilidad del ensayo. En general, la longitud ptima para los amplicones
TaqMan PCR es de 50 a 150 bp, aunque amplicones ms
grandes se han amplificado con xito.
Las sondas TaqMan se disean normalmente con una
Tm por lo menos 10C ms alta que la de los iniciadores
PCR. Esto asegura que la sonda se hibridiza antes que los
iniciadores y sigue hibridndose durante la etapa de templado. Las sondas TaqMan pueden tener 13 a 30 bases
de longitud, con un contenido G/C del 50%. Las sondas
TaqMan deben disearse tan cerca como sea posible, sin
el traslape o conteniendo complementariedad con cualquiera de los iniciadores. Adems, las sondas TaqMan no
deben contener una G en el extremo 5, pues una G adya-
499
DETECCIN DEL AMPLICN
1.3
1.25
1.2
Delta Rn
1.15
1.1
1.05
1
0.95
0.9
900
0.85
0.8
300
900
[inverso], nM
300
[directo], nM
0.8-0.85
Figura 51-3
disminuidas.
0.85-0.9
0.9-0.95
50
0.95-1
1-1.05
1.05-1.1
1.1-1.15
1.15-1.2
1.2-1.25
1.25-1.3
Optimizacin del iniciador TaqMan PCR. Los valores Rn se reducen cuando las concentraciones del iniciador estn
cente al colorante reportero extingue la fluorescencia incluso despus de la incisin. El uso de las sondas MGB
TaqMan, como se discute antes, reduce mucho la longitud
de la sonda mientras mantienen la Tm requerida.
Idealmente, la optimizacin del iniciador y de la sonda
deben realizarse para determinar dnde ocurre la fase exponencial, y de la meseta de PCR en cualquier ensayo particular (fig. 51-3). Los iniciadores se utilizan en el rango de 50 a
200 nM, mientras la sonda est en el rango de 100 nM.
Para los blancos del gen del RNA, los ensayos TaqMan RT PCR deben disearse idealmente a travs del lmite intrn-exn para reducir al mnimo resultados falsos
positivos que se presentan a partir de la amplificacin de
DNA genmico contaminante. Adems, la amplificacin
de RNA/cDNA en presencia de Mn2+ minimiza problemas
que pueden causarse por la amplificacin de fragmentos de
DNA unido nuevamente (Bauer y cols., 1997).
Deteccin del amplicn

El procedimiento TaqMan es aplicable a la medicin del
punto final y a la deteccin de la amplificacin por PCR
en tiempo real. El aumento en fluorescencia puede detec-
tarse si se emplea un espectrofotmetro de luminescencia,

como los termocicladores de la compaa Applied Biosystems 7900 y 7000, que utilizan una lmpara de halgeno de
tungsteno y un sistema de cmara fotogrfica CCD, o los
7700, que usan un formato de escaneo por lser para detectar incrementos en la fluorescencia en puntos definidos del
tiempo dentro del protocolo para los ciclos. Estos detectores de la secuencia del DNA se pueden tambin utilizar
para tecnologas con el verde SYBR, con sondas Scorpion
y faros moleculares con pocas modificaciones.
Deteccin del punto final TaqMan
La deteccin del punto final se realiza despus de que
TaqMan PCR se ha completado y los datos son recolectados (es decir en el ciclo 35, 40, etc.). Para la deteccin del
punto final, el incremento en la fluorescencia se compara
a la fluorescencia de un control sin plantilla de DNA y
las fluctuaciones de la fluorescencia interferentes son normalizadas. Esto se consigue dividiendo la intensidad de
la emisin del colorante reportero entre la intensidad de la
emisin del colorante extintor o quencher para definir un
cociente conocido como RQ (reportero: extintor o quen-
500
CAP. 51
cher) para cada reaccin. La diferencia entre el RQ de la

muestra (RQ+) y el RQ del control sin plantilla (RQ) es
definido como el RQ e indica la magnitud confiable de la
seal generada durante la PCR.
Deteccin por TaqMan en tiempo real

Durante TaqMan PCR en tiempo real, el valor de la fluorescencia que se mide durante cada ciclo de PCR representa la
cantidad de producto amplificado en ese ciclo. El sistema
de deteccin de la secuencia ABI 7700 recopila la emisin
fluorescente a 500 a 600 nm en cada uno de los 96 pozos
del termociclador, una vez cada pocos segundos. Un lser
dirigido a travs de los cables de fibra ptica excita los colorantes fluorescentes adentro del tubo. Estos cables entonces
llevan las emisiones fluorescentes de nuevo a una cmara
fotogrfica CCD, donde se detectan de acuerdo a sus longitudes de onda individuales. Un valor llamado Rn se calcula para cada muestra restando la seal del reportero, antes
de PCR, de la seal normalizada del reportero. El software
tambin calcula un ciclo umbral (Ct), un ciclo en el cual un
aumento estadstico significativo en el producto de PCR se
detecta primero. El Ct es la base de todos los anlisis cuantitativos en tiempo real (Higuchi y cols., 1993).
Cuantificacin absoluta
La cuantificacin absoluta de TaqMan PCR se realiza empleando estndares de concentracin conocida y de composicin similar al amplicn blanco. El DNA plsmido y el
RNA transcrito in vitro por lo general se usan como estndares absolutos para los ensayos TaqMan. Para la medicin
de los niveles de la expresin del mRNA, un estndar del
DNA no es la opcin ptima; el cRNA (RNA copia) o el
RNA de concentracin conocida es preferible, pues explica la eficacia de la reaccin de transcripcin inversa. Los
estndares del RNA copia pueden generarse amplificando
una secuencia levemente ms grande que el amplicn por
TaqMan PCR, usando un grupo de iniciadores externos.
El amplicn puede despus clonarse dentro de un vector
conveniente y transcribirse dentro del cRNA. Las curvas
estndares se generan amplificando las diluciones seriales
del estndar en el ensayo TaqMan PCR. Las muestras de
la prueba entonces se trazan a lo largo de la curva estndar
para determinar la cantidad de blanco en la muestra.
blanco entre diversas muestras. El objetivo de un experimento cuantitativo relativo de TaqMan es determinar el cociente
de una molcula de mRNA o de DNA del blanco a una molcula diferente del blanco o a s mismo bajo condiciones
diferentes. El resultado puede entonces divulgarse como diferencia doblada, relativa a una muestra del calibrador. Hay
dos mtodos para calcular la cuantificacin relativa de la expresin del gen blanco: el mtodo de la curva estndar, y el
mtodo Ct comparativo (Applied Biosystems, 1997).
Mtodo de la curva estndar
Para el mtodo de la curva estndar, se generan curvas estndares para los ensayos del blanco y del control endgeno.
Para cada muestra de la prueba, la cantidad del blanco y la
cantidad del control se determinan a partir de la curva estndar apropiada. Entonces la cantidad del blanco es dividida
entre la cantidad del control endgeno para obtener un valor
normalizado del blanco. Para calcular los niveles relativos de
la expresin, los valores normalizados del blanco se dividen
entre los valores del blanco normalizados por calibrador.
Mtodo Ct comparativo
Para el mtodo Ct comparativo, los valores relativos de la
cuantificacin se calculan a partir de los valores del ciclo
umbral (Ct) generados durante la PCR. El valor Ct es el
ciclo al cual un aumento estadstico significativo en el producto de PCR se detecta primero. El mtodo Ct comparativo para la cuantificacin relativa calcula la expresin
relativa del gen usando la siguiente ecuacin:
Cantidad relativa 2Ct
La Ct se calcula normalizando el Ct de la muestra del
blanco con el Ct del control endgeno (Ct blancoCt control endgeno). La Ct, entonces se calcula restando la
Ct media de la muestra del calibrador menos la Ct media
correspondiente, para la muestra del blanco. Los niveles
relativos de la expresin del gen blanco entonces se expresan como un cambio doblado relativo a la muestra del
calibrador (Livak y cols., 2001). La cuantificacin relativa
usando el mtodo Ct comparativo depende de las eficiencias similares de la amplificacin PCR para el blanco y
para los genes del control endgeno (Livak y cols., 2001;
Giulietti y cols., 2001).
Cuantificacin relativa
Genes housekeeping
La cuantificacin relativa se emplea por lo general para evaluar cuantitativamente las diferencias en las secuencias del
Un aspecto importante del diseo experimental cuantitativo

de PCR es la eleccin de un gen de referencia o housekeep-
APLICACIONES DE TAQMAN PCR EN PATOLOGA
ing apropiado. Los genes del control endgeno pueden ensayarse por separado o junto con el blanco desconocido y
calcularse su cociente final. La amplificacin simultnea
del blanco y del gen del control endgeno reduce al mnimo los errores que se presentan debido a la estimacin
inexacta de la concentracin total del cido nucleico y de
la calidad en muestras individuales.
Un control endgeno ideal del gen de referencia debe expresarse a un nivel constante entre diferentes tipos de tejido
e individuos y no ser afectado por el tratamiento experimental. Adems, la expresin del gen housekeeping puede ser
muy alta comparada con aquella del blanco desconocido y,
en tal situacin, la eficacia de la amplificacin entre los dos
blancos puede diferir en forma considerable. Para la cuantificacin exacta en las reacciones que amplifican ms de un
blanco en el mismo tubo, es importante que no compitan las
dos reacciones. Esto puede evitarse limitando la concentracin de los iniciadores usados en PCR, que es dependiente
de la abundancia relativa de los diversos blancos.
Normalmente se usan tres genes como controles endgenos para los estudios de la expresin del mRNA.
stos incluyen los mRNA especficos para genes housekeeping -actina, gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa
(GAPDH), y RNA ribosmico (rRNA). El mRNA de actina se expresa abundantemente en la mayor parte de los
tipos de clula y codifica una protena ubicua del citoesqueleto. Sin embargo, es importante observar que la presencia de seudogenes puede interferir con los resultados
cuantitativos (Mutimer y cols., 1998).
El RNA ribosmico (rRNA) constituye 85 a 90% del
RNA celular total y se expresa en todos los tejidos. El
gen housekeeping del rRNA 18S ha demostrado ser relativamente estable en tejidos humanos bajo condiciones
experimentales variables (Schmittgen y cols., 2000). Sin
embargo, el rRNA no puede utilizarse como gen de referencia al cuantificar blancos que se han enriquecido para
el mRNA, pues el rRNA se pierde durante la purificacin
del mRNA.
El mRNA de la GAPDH (gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa) tambin se expresa en todos los tejidos y se
usa como control endgeno para los ensayos cuantitativos
de PCR. Sin embargo, existe cierta evidencia que los niveles de la expresin de GAPDH varan durante el cultivo
celular in vitro (Hamalainen y cols., 2001) y entre individuos (Bustin y cols., 1999), acentuando la importancia de
la validacin cuidadosa de los genes del control endgeno
para la cuantificacin comparativa.
Aplicaciones de TaqMan PCR en patologa

Las potenciales de aplicacin para la tecnologa TaqMan
en el diagnstico mdico son enormes. El ensayo Taq-
501
Man se ha utilizado con xito para detectar y cuantificar

varios patgenos y el anlisis transcripcional de varios
blancos del mRNA. Se ha detectado y cuantificado previamente RNA del virus del sarampin en biopsias intestinales frescas congeladas e incluidas en parafina del tejido
de nios con una nueva variante de la enfermedad intestinal inflamatoria, usando la tecnologa TaqMan RT PCR
(Uhlmann y cols., 2002; Martin y cols., 2002). El grupo
del autor tambin ha utilizado con xito la tecnologa de
TaqMan para detectar y tipificar subtipos del virus del papiloma humano (HPV) en biopsias del tejido cervicales
y preparaciones citolgicas basadas en ThinPrep lquida
(Murphy y cols., 2003). Similarmente, el grupo ha utilizado esta tecnologa para estudiar clulas fetales en la circulacin materna en embarazos normales y complicados
(Turner y cols., 2003; Byrne y cols., 2003).
Discriminacin allica y ensayos TaqMan
para el genotipo de SNP
Aparte de la deteccin y cuantificacin de los blancos especficos del DNA y del RNA, la tecnologa TaqMan PCR
que usa sondas MGB y el ensayo 5 nucleasa pueden utilizarse para los ensayos de discriminacin genotipificante
y allica de SNP (polimorfismo de un solo nucletido). En
un sistema de dos alelos, la tecnologa utiliza una aproximacin de sonda dual con dos diferentes colorantes reporteros fluorescentes, a saber FAM y VIC (Livak, 1999; Lee y
cols., 1993), con los que se disean dos sondas, una especfica para cada alelo o polimorfismo. Los ensayos de discriminacin allica se realizan bajo condiciones competitivas,
con la competicin entre las sondas especficas silvestres y
mutantes que se producen en cada ciclo de PCR, pero en
particular ms en las primeras rondas de PCR. Las seales fluorescentes a partir de sondas FAM y VIC se generan slo en presencia de la secuencia complementaria del
blanco (fig. 51-4). La fluorescencia del punto final se mide
sobre los detectores de secuencia ABI (7900 HT, 7000, y
los 7700). Los datos entonces se analizan usando el paquete del software integrado, suministrado por Applied
Biosystems, que permite la discriminacin entre genotipos
homocigotos y heterocigotos (fig. 51-5).
Assays on demand (banco de secuencias
para ensayos TaqMan)
Applied Biosystems coloc un nuevo servicio, que permite el acceso de usuarios de TaqMan PCR a una base de
datos del genoma, recientemente publicada, y de Celera
Corporation. Los Assays on demand estn disponibles
para ensayos del DNA y del RNA y consisten de grupos
502
CAP. 51
Figura 51-4
colores.
Representacin esquemtica de la discriminacin allica TaqMan PCR que usa el sistema de sondas TaqMan de dos
Figura 51-5 El ensayo de la discriminacin allica se realiza sobre el detector de secuencia ABI 7000. El software integrado permite
la discriminacin de alelos diferentes y se basa en el nivel de fluorescencia detectado.
503
APLICACIONES DE TAQMAN PCR EN PATOLOGA
Figura 51-6 Placa TaqMan de microvolumen de 384 pozos de

alto rendimiento. Esta placa puede cargarse de forma usual con
productos para la expresin del gen Assays on Demand (Bancos
de secuencia) validados.
de iniciadores y sondas TaqMan diseados para todos

los genes de secuencia conocida. Ms de 19 000 ensayos
en humanos especficos del gen y ms de 9 500 ensayos
en ratones especficos del gen estn disponibles para que
los seleccionen los clientes; pueden obtenerse del sitio Web
de Applied Biosystems.
Placas TaqMan de volmenes pequeos
Los avances recientes en la qumica de TaqMan incluyen el
lanzamiento de una versin de 384 pozos de la plataforma
para el anlisis de la expresin del gen de alto rendimien-
1000
1000
100
10
1
0.1
0.01
0.001
0.0001
IL-12p40
Muestra 2
Muestra 1
Calibrador
IL-2
Muestra
IL-1
Alfa
IL-4
IL-5
IL-8
IL-10
IL-15
IFNg
TNFALFA
IL-12p35
Blanco, expresin de citocinas
IL-1
Beta
Figura 51-7 Anlisis de la expresin del gen de citocina.
Cuantificacin relativa de la muestra

a caibrar
to. La placa de volumen pequeo de 384 pozos (fig. 51-6)

se disea con la configuracin habitual en serie, usando
productos de expresin del gen Assays on demand (banco de secuencias) validados y el sistema del detector de
secuencia 7900 HT. Estas placas son capaces de evaluar la
expresin del gen de 12 a 384 blancos en hasta ocho muestras de cDNA en una sola corrida de PCR, dependiendo de
la configuracin de la placa.
Otra aplicacin de esta tecnologa es la placa TaqMan
de volumen pequeo con citocina humana para perfilar la
expresin del gen de sta, usando el mtodo Ct comparativo de cuantificacin relativa. La placa TaqMan con citocina humana (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)
consiste de un consumible de 96 pozos divididos en 24 grupos de copias, un grupo para cada anlisis de la citocina. La
placa evala una sola muestra del cDNA generada del RNA
total humano en un experimento RT-PCR de dos etapas.
Este ensayo mide las siguientes 24 citocinas: TNF-,
TNF-, IFN-, TGF-, LT-, IL-1, IL-1, IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12p35, IL-12p40,
IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, G-CSF, GM-CSF y M-CSF.
Cada pozo contiene sondas e iniciadores TaqMan MGB
marcados con FAM liofilizadas para un mRNA de la citocina humana. Un grupo de iniciadores y sondas TaqMan
MGB marcados con VIC para el control endgeno del RNA
ribosmico 18S fue utilizado para los ensayos mltiples.
Los ensayos para la cuantificacin del RNA sobre la placa con citocina se realizan dentro una reaccin en cadena
504
CAP. 51
con la polimerasa de la transcriptasa inversa (RT-PCR). En

el primer paso, el cDNA es transcrito inversamente del RNA
total, usando hexmeros al azar y la transcriptasa inversa
MultiScribe. El segundo paso incluye la amplificacin del
producto de cDNA, usando la polimerasa TaqMan Universal
mastermix y AmpliTaq Gold DNA. Los 96 pozos de la placa
se llenan simultneamente con una mezcla de cDNA y del
TaqMan Universal mastermix, a travs de un puerto va de
un sistema de canal. El volumen de la reaccin de cada pozo
es 1 l y el volumen total requerido para llenar la placa es
250 l. La cantidad relativa de citocinas especficas en una
muestra individual se compara despus con una muestra
apropiada del calibrador y se calcula usando el mtodo comparativo o para la cuantificacin relativa (fig. 51-7).
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52
Reaccin en cadena de la polimerasa en la clula
John OLeary, Cara M Martin y Orla Sheils
Introduccin
En aos recientes numerosos estudios han descrito tcnicas
hbridas que acoplan la PCR con la hibridacin in situ
(Herrington y cols., 1992; Haase y cols., 1990; Bagasra y
cols., 1992, 1993, 1994; Boshoff y cols., 1995; OLeary
y cols., 1994a, 1994b, 1995, 1996, 1998). Las tcnicas no
fueron aceptadas al principio por problemas tecnolgicos
encontrados durante la amplificacin de la secuencia deseada del cido nucleico.
Las tecnologas de amplificacin in situ se han extendido para incluir un nmero de modificaciones de la tcnica inicialmente descrita de la PCR in situ, para incluir
PRINS (marcaje cebado in situ), PRINS cclico, PCR
del PNA in situ (PCR del cido pptido nucleico), PCR del
PNA in situ, inmuno-PCR in situ, PCR TaqMan in situ y
la amplificacin especfica de alelo. Otras tecnologas de
amplificacin en la clula, como la amplificacin base del
cido nucleico (NASBA), pueden tambin utilizarse. stas
emplean tecnologa de RNA polimerasas T3 y T7 y son
metodologas isotrmicas de replicacin para la amplificacin del RNA en las clulas y cortes del tejido.
Visin general de la metodologa

Todas las tcnicas de PCR en la clula intentan crear amplicones de DNA/cDNA de doble cadena o de una cadena dentro
de la clula, que se pueden detectar directamente o despus de
un paso de hibridacin in situ (IS). Debe alcanzarse un equilibrio fino entre la digestin adecuada de las protenas celulares
(que permite el acceso de los reactivos de amplificacin) y
el mantenimiento de la localizacin del producto amplifica-
do dentro del compartimiento celular y la preservacin de la

morfologa tisular/celular.
Los cambios trmicos cclicos especficos suceden en el
nivel individual celular, parecido a lo que ocurre en la fase
de solucin de la PCR. El primer paso implica la desnaturalizacin del DNA de doble cadena (dsDNA) a la forma de
una sola cadena (ssDNA), si se est amplificando un DNA
definido. Para la amplificacin especfica de RNA, la plantilla del RNA ya es de una sola cadena y la transcripcin
reversa se lleva a cabo para crear una plantilla del cDNA.
Segundo, los iniciadores se unen flanqueando los extremos de la secuencia objetivo deseada y una enzima termoestable (DNA polimerasa Taq o fragmento Klenow) se
utiliza para extender o para ligar, usando la DNA ligasa,
una reaccin en cadena in situ de la ligasa (IS-LCR), los
iniciadores correctamente colocados. Las Taq polimerasas especficas ahora se disean para el uso en los anlisis
de la PCR en la clula, incluyendo la polimerasa IS-Taq,
que tiene una concentracin ms alta y una mayor unidad
de actividad de polimerasa. Las rondas subsecuentes del
termociclado aumentan el nmero de copias de la secuencia blanco, en una reaccin de amplificacin de cido nucleico. Un aumento exponencial en la cantidad de producto
amplificado nunca se logra en las reacciones de amplificacin en la clula, por la amplificacin lineal que ocurre en la mayor parte de las situaciones. Esto ocurre por
la ineficacia relativa de las tcnicas, debido a los problemas de accesibilidad de los reactivos de amplificacin para
la secuencia deseada del cido nucleico y a lo compacto
del compartimiento nuclear celular (conteniendo dsDNA
ssDNA pre-mRNA y las protenas histonas).
Una vez que se crea el amplicn (conjunto de fragmentos amplificados), la deteccin debe llevarse a cabo. Si se
506
CAP. 52
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN LA CLULA
utiliza un iniciador o nucletido marcado, entonces el amplicn es marcado y puede demostrarse directamente por
tcnicas inmunocitoqumicas. Por lo general, sin embargo,
el nucletido marcado y el iniciador marcado directamente
se han abandonado en gran parte, debido a la generacin no
especfica de la seal y a la incorporacin no especfica del
marcador dentro del amplicn de la PCR.
Una alternativa es un paso de hibridacin IS (usando
una oligosonda de cadena sencilla o una sonda genmica
de doble cadena) que se lleva a cabo despus de la amplificacin, apegndose a las reglas generales de la hibridacin
IS estndar y aplicando las condiciones de lavado astringente despus de la hibridacin.
PCR in situ del DNA (IS-PCR). Amplificacin por PCR

de las secuencias del DNA celular en las muestras de
tejido usando un nucletido marcado (p. ej., dUTP)
dentro de la mezcla de la reaccin de PCR. El producto
marcado se identifica, usando tcnicas estndar de deteccin tal y como en la hibridacin in situ convencional
o en la inmunocitoqumica. No se recomienda el uso de
esta tecnologa.
Tecnologas de PCR celular: definiciones
Hibridacin in situ PCR (PCR-IS). Amplificacin por

PCR de las secuencias celulares del DNA en las muestras de tejido, seguida por la deteccin con hibridacin
in situ del producto amplificado, usando una sonda in-
Varias tcnicas (figs. 52-1 y 52-2) se han descrito en la literatura, incluyendo las siguientes:
Iniciador marcado manejado en la amplificacin in situ

(LPDISA). Amplificacin de las secuencias de DNA
usando un iniciador marcado dentro de la mezcla de la
reaccin PCR. El producto marcado entonces se detecta
tal y como en la IS-PCR del DNA. No se recomienda el
uso de esta tecnologa.
Figura 52-1 Representacin esquemtica de la PCR

en clula, indicando los pasos crticos implicados en
el proceso desde la adhesin de la clula/tejido al
permeabilizado y fijacin para la amplificacin PCR
hasta la deteccin del amplicn.
Figura 52-2 Hibridacin in situ y deteccin PCR-IS del HPV

en una biopsia cervical. a) IS, deteccin inmunocitoqumica de
un solo paso, sensibilidad 20 a 30 genomas/clulas. b) IS,
deteccin de tres pasos, sensibilidad 10 a 20 genomas/clula.
c) PCR-IS con la deteccin de tres pasos, sensibilidad 1 genoma/clula.
TECNOLOGAS DE PCR CELULAR: DEFINICIONES
terna marcada o genmica. Los marcadores utilizados

pueden ser isotpicos (p. ej., 32P, 35S) o no isotpicos (p.
ej., biotina, digoxigenina, fluorescena).
PCR transcriptasa reversa in situ (RT in situ PCR). Es la
amplificacin de las secuencias del mRNA en las muestras de clulas y tejidos, creando primero una plantilla de
DNA copia (cDNA) usando la transcriptasa reversa (RT)
y entonces se amplifica la plantilla de DNA recin creada
tal y como en la IS-PCR del DNA. Esta tcnica de nuevo
tiene problemas inherentes con la incorporacin no especfica del marcador, y no debera utilizarse para el anlisis
de las plantillas de RNA en las clulas y cortes de tejido.
PCR transcriptasa reversa hibridacin in situ (RT PCRIS): Es la amplificacin de las secuencias del RNA en
las muestra de clulas y tejidos creando una plantilla de
cDNA con la transcriptasa reversa (RT). El cDNA, creado entonces se amplifica y el amplicn se hibrida con un
oligonucletido interno, como en la PCR-IS (fig. 52-3).
PRINS (amplificacin in situ) y PRINS cclica. Es la
amplificacin de secuencias genticas especficas en extensiones del cromosoma en metafase o ncleos interfsicos, usando un iniciador para generar un producto de
una sola cadena de la PCR. Si muchos ciclos de amplificacin se utilizan, entonces la tcnica se llama PRINS
cclica (Gosden y cols., 1991).
PCR del PNA in situ (IS-PNA-PCR) y PCR-PNA-IS. ISPNA-PCR se refiere a la amplificacin de los DNA blanco
507
usando una molcula imitadora del DNA, el cido pptido

nucleico (PNA). El PNA es una molcula simple, compuesta de unidades repetidas de N-(2-aminoetil)-glicina ligadas
por enlaces amida. Las bases purinas (A y G) y pirimidinas (C y T) se unen a la columna vertebral por enlaces
carbonil metileno. El PNA cuando se utiliza como un iniciador no es alargado por la DNA polimerasa Taq y, por tanto,
puede utilizarse en los ensayos de exclusin del iniciador,
que permite la discriminacin de las mutaciones puntuales
y el haplotipo directo de la clula individual. La segunda
reaccin, que emplea el PNA, es la PCR-PNA-IS; aqu,
una sonda de 15 a 20 nucletidos de PNA se utiliza para el
paso de hibridacin in situ despus de la amplificacin. Los
PNA tienen Tm ms altas (temperaturas de fusin o melting) que las sondas oligo de DNA y las mutaciones puntuales simples en un dplex PNA-DNA bajan la Tm cerca de
15C con respecto al dplex correspondiente DNA-DNA
mal complementado (De-Mesmaeker y cols., 1995).
PCR IS-TaqMan. Es la amplificacin de las secuencias
de DNA usando un par de iniciadores convencionales
como en la PCR estndar. Sin embargo, una sonda Taq
Man interna se agrega a la mezcla de amplificacin. Se
coloca una molcula fluorescente reportera (FAM, HEX,
etc.) en el extremo 5 de la sonda y otra en el extremo 3,
una molcula extintor o quencher (otra vez fluorescente,
normalmente TAMRA). Una vez que la sonda est en
lnea e intacta, la proximidad de la molcula extintor
a la molcula reportera no permite ninguna fluorescencia de la molcula reportera. Las DNA polimerasas Taq
poseen dos caractersticas importantes para la reaccin:
a) desplazamiento de una hebra de la horquilla Y, que
permite que la DNA polimerasa Taq despegue una sola
hebra en la configuracin Y; y b) actividad endonucleasa
5-3, que causa el corte del brazo de unin que une la
molcula reportera al extremo 5 de la sonda TaqMan
(fig. 52-4), de tal modo que produce fluorescencia slo
si ha ocurrido la amplificacin especfica (fig. 52-5)
(Lawyer y cols., 1989; Holland y cols., 1991).
Amplificacin especfica del alelo in situ (IS-ASA). Esta
tcnica utiliza el sistema de amplificacin refractaria de
la mutacin (ARMS) de PCR, que tiene la capacidad
de detectar polimorfismos puntuales en las secuencias
del DNA humano, usando pares de bases artificialmente
creadas y mal apareadas en el extremo 3 de los iniciadores de la PCR. Si el polimorfismo se acopla al de la
secuencia del iniciador, la amplificacin de esa secuencia ocurrir preferentemente.
Figura 52-3 Deteccin por PCR-IS RT del receptor 2 de la dopamina (DRD 2) en las clulas epiteliales ovricas del hmster (transfectantes) y anlisis en gel y Southern blot del amplicn creado.
Inmuno-PCR in situ. Los inmunoensayos in situ no

permiten la deteccin de pocas molculas blanco accesibles con la PCR in situ. La inmuno-PCR in situ es
una reaccin en la cual el marcador de DNA se liga a
508
CAP. 52
Figura 52-4 Anlisis de la PCR TaqMan de tiempo casi real del

HHV 8 en una efusin de la lnea celular BC-3 del linfoma. Observe la disminucin de la fluorescencia despus de 25 ciclos, debido a la liberacin de las sondas extintor y del reportero en el espacio del volumen limitado del ncleo en la lnea celular BC-3.
modificaciones), de hornos termocclicos y termocicladores especficamente diseados (Applied Biosystems Gene

Amp in situ PCR system 1000; Hybaid Omnigene/Omnislide y el termociclador MJB para portaobjetos) pueden
usarse en la amplificacin del DNA y RNA en la clula.
Si se emplea un termociclador estndar, entonces debe
crearse una cmara de amplificacin para el portaobjetos.
sta puede hacerse de aluminio (un recipiente de papel
de aluminio). Este recipiente que contiene el portaobjetos
se coloca en el termociclador, se cubre con aceite mineral
y despus se envuelve totalmente. Sin embargo, la optimizacin de la conduccin trmica nunca se alcanza en su
totalidad. El lapso trmico, es decir, las diferencias en
temperatura entre la cara del bloque, el portaobjetos de
cristal y la mezcla de reaccin de la PCR en cada paso
de temperatura del ciclo de la reaccin son frecuentes
(OLeary y cols., 1994b). Este problema se supera con
el uso de mquinas de amplificacin in situ con diseos
especficos que ofrecen curvas de calibracin incorpora-
Figura 52-5 Anlisis de la PCR RT del RET/PTC-1 en una lnea celular inmortalizada humana de la tiroides. La transcripcin quimrica
RET/PTC-1 se ve al mximo en la frontera luminal de la clula. a) Canal FITC que muestra transcritos; b) contratincin DAPI.
las molculas blanco a travs de un puente anticuerpobiotina-avidina y es amplificado por PCR in situ. Las
secuencias amplificadas de DNA se detectan in situ
por hibridacin. Los autores afirman que la tcnica
puede ser la nica disponible para detectar cantidades
diminutas de macromolculas biolgicas tales como
protenas, carbohidratos y lpidos en las clulas intactas o en los cortes del tejido (Cao y cols., 2000).
Amplificacin del DNA en la clula

Equipo
Existen varios instrumentos para realizar PCR en la clula,
comprendiendo desde un termociclador estndar (usando
das de la temperatura del portaobjetos con mayor control

termodinmico.
Material inicial
En 1990, Haase y cols., describieron la PCR in situ en clulas sencillas fijas intactas, suspendidas en el amortiguador
de la reaccin de la PCR. Despus de la amplificacin, las
clulas se centrifugaron sobre los portaobjetos de cristal y
el producto amplificado se detect utilizando la hibridacin in situ (Haase y cols., 1990). Al inicio algunos investigadores utilizaron pedazos de portaobjetos de cristal (con
las clulas de preparaciones citocentrifugadas) en tubos
Eppendorf estndares, incubados directamente en el amortiguador de la reaccin PCR (Spann y cols., 1991). Ms
AMPLIFICACIN DEL DNA EN LA CLULA
recientemente, se han utilizado tcnicas que usan tejidos y

clulas unidas al portaobjetos del microscopio (Bobroski
y cols., 1995; Cheng y Nuovo, 1994).
Para IS-PCR, PCR-IS, IS-LCR, IS-PNA PCR e IS-TaqMan PCR, las clulas y los tejidos fijos, incluyendo el material en parafina, se pueden utilizar para la amplificacin.
Los mejores resultados se obtienen con clulas y tejidos
recin fijados, aunque se ha logrado la amplificacin acertada con material almacenado (hasta 40 aos).
Las extensiones del cromosoma fijo en metafase y los
ncleos interfsicos se pueden utilizar para la deteccin de
regiones subcromosmicas especficas, usando PRINS y
PRINS cclica (Gosden y cols., 1991). Para un citoesqueleto celular rgido debe crearse en un microambiente adecuado que permita el acceso de los reactivos de amplificacin
con fuga mnima del producto amplificado. Los resultados
satisfactorios se obtienen con los tejidos fijados en 1 a 4%
de paraformaldehdo, el formaldehdo amortiguado neutral
(NBF) y 10% formalina (12 a 24 h para biopsia/tejido slido; 10 a 30 min para las preparaciones citolgicas) (Nuovo
y cols., 1993; OLeary y cols., 1994b). Resultados menos
constantes se obtienen con tejidos fijados en etanol y cido
actico (Nuovo y cols., 1993).
La fijacin celular con fijadores de formaldehdo tiene
considerables desventajas. Los grupos aldehdo reaccionan
con el DNA y las protenas de las histonas para formar entrecruzamientos DNA-DNA y protena DNA-histona. La fijacin del formaldehdo tambin corta la plantilla del DNA
(rompimientos aleatorios en el dsDNA), la cual puede no
concluir el inicio (es decir, los extremos no se traslapan).
Estos cortes pueden actuar despus como sitios potenciales
de cebado para la DNA polimerasa Taq, conduciendo a la
incorporacin y elongacin de los nucletidos marcados y
no marcados (es decir, dATP, etc.) anlogo a la marcacin in
situ del extremo terminal del DNA en la apoptosis. Este proceso ocurre a temperatura ambiente y conduce a resultados
falsos con la IS-PCR del DNA. sta es la razn predominante por la que la PCR del DNA y del RNA en la clula (sin un
paso de hibridacin) se ha abandonado en gran parte.
Puesto que los ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento se utilizan durante la amplificacin in situ, las clulas
y los tejidos deben unirse adecuadamente a un soporte slido
(normalmente cristal), de modo que no ocurra la separacin.
Los portaobjetos de cristal se tratan previamente con agentes de recubrimiento para asegurar la adhesin mxima de
la seccin; los ms utilizados son aminopropil-trietoxisilano
(APES), solucin de Denhardt y el pegamento de Elmer.
Permeabilizacin celular y tisular
Las clulas deben digerirse y permeabilizarse adecuadamente para facilitar el acceso de los reactivos. Esto se
509
puede alcanzar por el tratamiento con proteinasa (p. ej.,

proteinasa K, pepsina o tripsina) o hidrlisis ligera cida, o
ambas (0.01 a 0.1 N HCl). Los tiempos de digestin y las
concentraciones mximas de proteasa tienen que optimizarse debidamente para cada preparacin tejido/citolgica
utilizada.
Los tiempos largos de digestin comprometen inevitablemente la morfologa celular. Los tiempos de digestin cortos
producen la disociacin incompleta de los entrecruzamientos protena histona-DNA, que pueden obstaculizar en ltima
instancia el avance de la DNA polimerasa Taq a lo largo de
plantillas nativas del DNA. La hidrlisis cida acta, probablemente, llevando a tales entrecruzamientos a la disociacin
completa. Alternativamente, la irradiacin de microondas de
las clulas y los cortes de tejido pueden utilizarse para exponer las plantillas del cido nucleico. Los pulsos cortos de
irradiacin de microondas (con o sin protelisis) usando un
amortiguador de citrato, anlogo a la recuperacin del antgeno de la inmunohistoqumica, permiten el acceso de los
reactivos de amplificacin a la secuencia objetivo deseada y,
adems, facilitan la posamplificacin inmunohistoqumica.
Despus de esto (si se utiliza un mtodo de marcacin no
isotpico), un paso de bloqueo debe emplearse, dependiendo
del mtodo que se utilice para la deteccin despus de la amplificacin del producto, por ejemplo, sistemas de deteccin
con peroxidasa o fosfatasa alcalina. En el primero, la peroxidasa endgena se extingue por la incubacin en una solucin
de 3% H2O2 con azida de sodio, mientras el cido actico
glacial al 20% bloquea la fosfatasa alcalina intestinal.
Protocolos de la amplificacin del DNA
Una amplificacin acertada se logra con: a) la optimizacin
cuidadosa de los parmetros cclicos; b) el diseo apropiado de los pares de iniciadores (tomando en cuenta su Tm, es
decir, la temperatura de fusin especfica, su capacidad para
formar dmeros del iniciador y estructuras que se pliegan sobre s mismas), y c) la optimizacin de las concentraciones de
Mg2+ necesarias para conducir la reaccin de amplificacin.
Debido al secuestro de reactivo (vase adelante), concentraciones ms altas de los reactivos de amplificacin se requieren durante la amplificacin in situ que para las tcnicas
convencionales solucin-fase, incluyendo los iniciadores,
los dNTP y Mg2+. Las concentraciones de Mg, en particular, tienen que optimizarse cuidadosamente, con la amplificacin satisfactoria en la mayor parte de las aplicaciones a
2.5 a 5.5 mM. Los volmenes del reactivo de amplificacin
normal varan dependiendo del rea de superficie de la preparacin celular/seccin de tejido que se emplee. Esto es
importante, ya que la amplificacin desigual puede ocurrir
sobre la superficie del portaobjetos debido a las variaciones
del volumen consiguientes al fracaso de la amplificacin lo-
510
CAP. 52
calizada. Cuando se usa el sistema Gene Amp in situ PCR

1000, se utilizan volmenes de 25 a 50 l.
La desnaturalizacin inicial del DNA puede alcanzarse antes de la amplificacin, ya sea durante la permeabilizacin celular o despus del proceso de fijacin. Como
alternativa, puede realizarse al principio del protocolo de
amplificacin mismo. La desnaturalizacin se alcanza
usando calor, calor/formamida o lcali (Bagasra y cols.,
1994). Adems, la mayora de los investigadores aboga por
el uso del Hot Start de la PCR (inicio de los ciclos de
PCR a alta temperatura) para reducir el cebado incorrecto y
la oligomerizacin del iniciador y Nuovo (1994) sugiere la
adicin de la protena de unin a la cadena sencilla (SSB)
derivada de E. coli. El modo exacto de la accin de esta
protena es desconocido pero funciona en la replicacin y
la reparacin del DNA previniendo el cebado incorrecto
y la oligomerizacin del iniciador.
La optimizacin de los parmetros cclicos debe realizarse
en cada ensayo particular. La mayor parte de los protocolos
emplea 25 a 30 rondas de amplificacin, excepcionalmente
llega a los 50 ciclos. Algunos investigadores realizan dos
rondas sucesivas de 30 ciclos con la adicin de reactivos nuevos, incluyendo a los iniciadores y la DNA polimerasa entre
cada ronda; una modificacin de esto es la PCR nested o
nidada, donde se agregan los iniciadores internos, anidados dentro del amplicn producido durante la primera ronda. Sin embargo, esto no se recomienda para uso rutinario.
La seleccin del iniciador ha evolucionado a partir de
dos estrategias bsicas: un par del iniciador o mltiples
combinaciones de par del iniciador, con o sin colas complementarias. Los pares mltiples del iniciador se disean para
generar productos que abarcan ms e incluso se pueden
traslapar, con la ventaja obvia de la localizacin de los amplicones y de la difusin mnima del producto. Sin embargo, si el PCR-hot start se emplea, el par nico de iniciadores
es suficiente para asegurar la amplificacin acertada.
Astringencia del lavado, posamplificacin

y fijacin del amplicn
La posfijacin con 4% de paraformaldehdo o etanol, o
ambos, puede emplearse para mantener la localizacin del
producto amplificado. Si uno est realizando PCR-IS, un
oligonucletido o una sonda genmica se aplica en esta etapa. Slo se alcanza la especificidad mxima usando sondas
que hibridan las secuencias internas del producto amplificado. Las sondas genmicas no se restringen a estas secuencias y parecen proporcionar resultados comparables.
Despus de la amplificacin in situ, la mayor parte de los
protocolos incluyen un paso de lavado posamplificacin,
usando cloruro de sodio, citrato de sodio (SSC), formamida
y variando las temperaturas de lavado, para eliminar el producto extracelular difundido, que puede permitir la tincin
no especfica y la generacin de resultados positivos falsos.
La astringencia del lavado se define por el conjunto de
condiciones empleadas (es decir, concentracin del SSC,
del porcentaje de formamida utilizado y la temperatura del
lavado). El investigador intenta alcanzar unas condiciones del lavado donde el cociente seal: el ruido de fondo
es mximo; sin embargo, las condiciones de astringencia
del lavado poshibridacin se derivan empricamente.
Deteccin de los amplicones

Los marcadores no isotpicos (p. ej., biotina, digoxigenina,
fluorescena) son muy utilizados, y cuando se emplean junto
con la tcnica de deteccin inmunohistoqumica sndwich,
parecen aportar grados similares de sensibilidad de deteccin a la de los marcadores isotpicos. stos pueden variar
en sistemas de deteccin de un solo paso hasta los de cinco
pasos, en cuanto a la inmunohistoqumica convencional. El
producto se visualiza finalmente por una reaccin de color
(p. ej., cromgenos NBT/BCIP o AEC) o por fluorescencia.
Nuovo ha descrito en el funcionamiento de la inmunohistoqumica convencional posamplificacin que la ventaja
obvia es la colocalizacin del producto con la clula de
inters, por ejemplo, la clula endotelial o el macrfago.
Sin embargo, los intentos para reproducir esto por varios
grupos, incluyendo los propios autores, han sido decepcionantes y es probable que la mayor parte de los eptopos no
resistan completar un ciclo trmico repetitivo.
Reaccin de amplificacin, controles

y deteccin en el tejido para uso en
ensayos de PCR DNA en la clula
La PCR paralela en fase lquida debe incluir los siguientes
controles: la omisin de iniciadores y/o DNA polimerasa
Taq, iniciadores y/o sondas inaplicables, los controles negativos conocidos y genes de control de referencia. El nmero de los controles realizados depende de la cantidad de
tejido/clulas disponibles para la reaccin.
Los controles siguientes se requieren en PCR-IS: a) el
gen de control de referencia de la PCR-IS, por ejemplo,
-globina, -actina, etc.; b) la digestin con la DNasa de
los tejidos/clulas blanco; c) la digestin con RNasa de los
tejidos/clulas blanco; d) iniciadores con la sonda control;
e) iniciadores control con la sonda objetivo; f) iniciadores
control con la sonda control; g) iniciadores del gen de control de referencia con la sonda blanco; h) slo un iniciador blanco (PCR en la clula asimtrica); i) slo dos iniciadores blanco; j) sin Taq polimerasa; k) sin iniciadores;
PROBLEMAS DE LA AMPLIFICACIN POR PCR EN LA CLULA
l) omitir el paso de la transcriptasa reversa en RT IS-PCR

o RT PCR-IS; m) controles de la hibridacin in situ para
PCR-IS y RT PCR-IS, y n) controles de deteccin para los
sistemas inmunohistoqumicos de deteccin.
Los genes de control de referencia, incluyendo el uso de
una copia del gen mamfero, como PDH, son importantes
para valorar el grado de amplificacin en la preparacin de
la seccin de tejido/seccin de la clula. Al amplificar los
DNA blanco, la adicin de DNAasas debera suprimir la
seal. Si no ocurre esto, la seal pudo haber resultado de
la amplificacin falsa, o puede representar alternativamente cualquier RNA/cDNA. El pretratamiento con RNAasa
es obligatorio en la valoracin de los RNA blanco (PCR
transcriptasa reversa [RT] in situ) y debe incluirse en la
amplificacin de las plantillas del DNA para minimizar las
seales positivas falsas que se originan del RNA celular.
Nuestro grupo ha encontrado que la combinacin de RNAasa A y T1 proporciona resultados superiores.
El uso de un par de iniciadores del gen de control de
referencia junto con la sonda especfica blanco valora el
grado de capacidad de pegado de la secuencia de la sonda blanco y de la creacin de un resultado positivo falso.
La adicin de un iniciador en la mezcla de amplificacin
genera una PCR asimtrica, con una reduccin cuantitativa en la cantidad de producto sintetizado. Los iniciadores
inaplicables con la sonda inaplicable no deben generar una
seal. La especificidad del componente de hibridacin in
situ de la PCR-IS se valora empleando una sonda inaplicable con iniciadores blanco especficos.
El papel de la dimerizacin iniciador-iniciador y la oligomerizacin del iniciador en la generacin de seales positivas falsas se valora excluyendo la DNA polimerasa Taq,
mientras la contribucin de la elongacin no especfica del
DNA fragmentado en cortes de tejido se examina con la
exclusin de los iniciadores. Lo ltimo es un control extremadamente importante para IS-PCR.
En la valoracin de la RT-IS PCR, la omisin del paso de
la transcriptasa reversa es importante. Como en la hibridacin in situ de rutina, los controles de hibridacin y los controles de deteccin son esenciales para excluir los resultados
falsos positivo/negativo debido a la falla del paso de IS o a la
tincin aberrante de los tejidos por el sistema de deteccin.
Amplificacin del RNA en la clula

Preparacin de las clulas y del tejido
Las tcnicas que se disean especficamente para la amplificacin de los RNA blanco son RT IS-PCR y RT PCR-IS.
En general, los RNA blanco son ms fciles de amplificar que los DNA blanco, por el nmero elevado de copias
de inicio del blanco. Una vez que las clulas o los tejidos
511
se remueven del cuerpo, la degradacin del RNA comienza

casi de manera instantnea. Las RNasas se encuentran presentes en el ambiente, los dedos, los guantes y en las reas
superiores tipo terrazas; slo por mencionar algunas de sus
muchas fuentes. Las soluciones del fijador contienen RNasas
especficas que degradan el RNA, y el tejido en proceso, otra
vez contaminado por RNasas, minimiza la cantidad de RNA
blanco que puede amplificarse.
Debe crearse un ambiente libre de RNasa al iniciar la preparacin. Para la preservacin ptima del RNA en los cortes del
tejido, la fijacin inmediata en soluciones libres de RNasa debe
llevarse a cabo. Deben utilizarse alcohol, cido actico:alcohol
y fijadores con formaldehdo amortiguado neutro preparados
en agua esterilizada tratada con DEPC (dietilpirocarbonato).
Todos los protocolos para detectar el cido nucleico deben emplear otra vez, en lo posible, las condiciones libres de RNasa.
Metodologa y qumica de la amplificacin
Al iniciar, se crea una plantilla de cDNA usando una enzima
transcriptasa reversa, por lo general se utiliza la enzima transcriptasa reversa del virus de la leucemia del ratn Moloney
(MMLV), seguido por la amplificacin de la plantilla recin
sintetizada del cDNA. Un paso de hibridacin in situ posamplificacin puede emplearse (RT PCR-IS), en cuanto a la DNA
PCR-IS. Estas tcnicas emplean dos pasos, es decir, la transcripcin reversa y despus la amplificacin. El grupo de trabajo del autor ha descrito una metodologa de un paso usando la
enzima rTth DNA polimerasa que evita la necesidad de dividir
la reaccin. La rTth polimerasa posee actividad tanto de transcriptasa inversa como de DNA polimerasa.
Controles para la amplificacin in situ del RNA
Son los mismos controles que se utilizan en la amplificacin in
situ del DNA. La omisin del paso de la transcriptasa inversa
rinde, obviamente, un resultado dbil o negativo. La digestin
con DNAasa paralela debe llevarse a cabo en todos los ensayos
del RNA en la clula, en particular en la etapa de optimizacin.
Problemas de la amplificacin
por PCR en la clula
Muchos grupos han encontrado problemas con la PCR in situ
(OLeary y cols., 1995, 1996a, 1996b; Teo y Shannak, 1995).
Los factores importantes incluyen la naturaleza del material de
inicio, condiciones de la fijacin y la naturaleza conformacional del blanco que se va a amplificar. La PCR del DNA en la
clula in situ est llena de dificultades, especialmente con
512
CAP. 52
el material embebido en parafina, donde la incorporacin

no especfica de secuencias del nucletido puede ocurrir en
presencia de la DNA polimerasa Taq, y es opinin del autor
que esta tecnologa no debe utilizarse.
La PCR-IS parece ms especfica, en especial si se
emplea una modificacin tipo Hot Start o, de manera alternativa, si se utilizan diferentes pares del iniciador simultneamente. Los protocolos de la PCR-IS, en general, son
ms sensibles pero, en contraste con la PCR en solucin, es
menos eficiente, slo con la evidente amplificacin lineal. El
grado de amplificacin es difcil de valorar. Nuovo y cols.
(1991, 1992, 1993, 1994, 1995) reportan un aumento de 200
a 300 veces en el producto, en contraste con Embretson y colegas (1993), que estiman slo un aumento de 10 a 30 veces.
La experiencia del autor tiende a apoyar al segundo autor.
La limitacin principal con la DNA IS-PCR, como se
menciona antes, es la incorporacin no especfica de nucletidos por medio de la DNA Taq polimerasa en sitios del DNA
fragmentado. sta es ciclo-dependiente y DNA polimerasadependiente y puede ocurrir en ausencia de iniciadores y/o
con una modificacin del tipo Hot Start. Por tanto, el uso
rutinario de la PCR in situ del DNA no es an factible, debido al riesgo de generar seales falsas. Gosden y cols. (1991)
reportan en trabajos previos con cromosomas el uso de mtodos para unir la cadena de DNA, para eliminar la incorporacin falsa durante la PCR in situ del DNA. El pretratamiento
con dideoxi de obstruccin tambin se ha documentado para
eliminar la incorporacin no especfica, pero ste no es siempre acertado. Nuestro grupo ha utilizado la superdesnaturalizacin de la hebra, es decir, donde el dsDNA se desnaturaliza a temperaturas altas. El DNA entonces se mantiene en
un estado desnaturalizado por un periodo extendido (5 a 10
min) pero, otra vez, esto produce resultados inconstantes.
Secuestro de reactivos en el procedimiento
Concentraciones elevadas de reactivos se requieren para que
se logre la amplificacin acertada (del orden de 2 a 5 veces).
Esto se debe al secuestro de reactivo, ya que los reactivos
se adhieren a los cubreobjetos o a los materiales de recubrimiento utilizados. Adems, los reactivos pueden tambin
intercalarse con residuos del fijador que permanecen en los
tejidos. El pretratamiento de los portaobjetos con 0.1 a 1% de
albmina srica bovina (BSA) permite una reduccin en la
concentracin del reactivo, que puede funcionar al bloquear
este secuestro (OLeary y cols., 1995).
Difusin y contradifusin del amplicn
La difusin del producto de amplificacin (amplicn) desde
el sitio de la sntesis, que puede ocurrir como un resultado
del permeabilizado o el corte y exposicin del citoplasma
y ncleo de la clula, o ambos, se encuentra en ensayos

de la PCR en la clula. Un acercamiento se logra al reducir el nmero de ciclos. Otra estrategia que se emplea
con frecuencia es fijar de manera posterior los portaobjetos
en etanol o paraformaldehdo, para ayudar a mantener la
localizacin del producto amplificado. Los acercamientos
alternativos incluyen la fijacin de la seccin del tejido con
agarosa o la incorporacin de nucletidos biotina sustituidos, o ambos (anlogos a PCR in situ). Esta ltima modificacin permite la generacin de productos ms evidentes,
menos probables de difundir.
Amplificacin desigual/amplificacin incompleta
En la amplificacin desigual es frecuente que se localice
30 a 80% de clulas que contienen la secuencia blanco de
inters tindose en cualquier momento. Hay muchas razones para esto, incluyendo la digestin no uniforme con
variaciones en la permeabilidad de la clula, que falla para
disociar por completo los entrecruzamientos DNA-protena histona, y el corte de la clula. Este ltimo factor es una
consecuencia inevitable del corte por micrtomo donde se
crean semiesferas de la clula. Como resultado, el contenido nuclear se expone, dando lugar a dos posibilidades:
a) la secuencia blanco deseada puede no estar presente; b)
la secuencia blanco puede estar presente pero el producto
pudo haber difundido hacia fuera.
Cuadro 52-1 Usos en la clula de las tecnologas de PCR

en patologa celular
Virus DNA y RNA
HIV 1, 2
HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, etc.
HBV, HCV
CMV
Sarampin
HHV 6, 7 y 8
DNA del HSV
LGV (linfogranuloma venreo)
Oncogenes, genes supresores de tumor y marcadores de
malignidad
Mutaciones p53
Mutaciones ras (H-Ki, N-ras)
Rearreglos de gen (t11; 22, t11; 14)
Mapeo del cromosoma (PRINS y PRINS que completan un
ciclo)
Rearreglos del receptor de la clula T
Metaloproteinasas y sus inhibidores
Expresin del factor EGF
xido ntrico sintasa
TRABAJO FUTURO CON LOS ENSAYOS BASADOS EN LA PCR EN LA CLULA
Trabajo futuro con los ensayos

basados en la PCR en la clula
Los desarrollos recientes de la PCR TaqMan en la clula
permiten que los investigadores cuantifiquen directo las
transcripciones dentro de las muestras de clulas y tejidos.
La capacidad de utilizar sistemas de deteccin a dos colores permite la identificacin simultnea de un gen housekeeping y de un gen problema.
La PCR TaqMan celular muestra la cintica clsica de
la sonda TaqMan, con quenching o extincin de la fluorescencia visible despus de determinado nmero de ciclos.
Esto se debe al espacio de volumen limitado del citoplasma/ncleo y a la proximidad de las secuencias de las sondas extintor y del reportero en exceso molar en el estado
libre, que sigue a la hidrlisis de la sonda.
El descubrimiento de la PCR TaqMan en la clula debe,
en teora, hacer posible que se introduzcan matrices de
TaqMan para el anlisis cuantitativo directo. Esto ofrece una
mayor ventaja sobre las plataformas de la matriz de hibridacin del SNP y del cDNA convencionales, y permite, por
primera vez, la cuantificacin de los genes de loci genticos
mltiples simultneamente. El cuadro 52-1 lista el uso actual
de los anlisis de la clula con PCR en la patologa celular.
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53
Anlisis de SNP de alta densidad y de arreglos de cDNA
Orla Sheils, Cara M Martin, Paul Smyth, Jon Sherlock, Stephen Finn,
Esther ORegan, Steve Picton y John OLeary
Introduccin
Cincuenta aos despus del descubrimiento de la doble hlice del DNA, la secuencia de referencia para el Homo sapiens fue presentada (Venter y cols., 2001; Lander y cols.,
2001; Consorcio IHGS, 2001). El esfuerzo internacional
de secuenciar 3 mil millones de letras de DNA dentro el
genoma humano ha llevado a una apasionante nueva era
genmica. Los microarreglos de DNA aportan un adjunto
importante en la explotacin de un territorio genmico desconocido, en particular en el rea de la expresin del gen.
Existe una amplia creencia en que los millares de genes
y sus productos (es decir RNA y protenas) en un organismo viviente dado funcionan de una manera complicada y
orquestada, razonamiento que aloja el potencial para una
variedad de modalidades diagnsticas y teraputicas. Los
mtodos tradicionales en la biologa molecular trabajan por
lo general sobre la base de un gen dentro de un experimento, lo que significa que el rendimiento del procesamiento
es muy limitado y el cuadro completo de la funcin del
gen es difcil obtenerlo.
En los ltimos aos, una nueva tecnologa, llamada microarreglo de DNA, ha cautivado el inters creciente entre
los bilogos. Esta tecnologa abarca ensayos que generan
simultneamente datos pertenecientes a los niveles de expresin de muchos miles de genes. Esta facilidad representa un aumento enorme en el rendimiento del procesamiento
(Elkins y Chu, 1999; Lockhart y Winzeler, 2000; Schena y
cols., 1995).
Un ordenamiento es un arreglo de muestras. Provee un

medio para el emparejamiento de muestras conocidas y desconocidas de DNA, de acuerdo a reglas de apareamiento de
bases, y para la automatizacin del proceso en la identificacin de las muestras desconocidas. Microarreglos de DNA,
o chips de DNA, se fabrican con robtica de alta velocidad,
sobre un microarreglo/sustrato slido, para lo cual se utilizan sondas con identidad conocida para determinar la unin
complementaria, y para permitir masivamente los estudios
en paralelo de la expresin y descubrimiento del gen. Las
dimensiones espaciales de una muestra tpica en microarreglos son menores a 200 m de dimetro, y contienen normalmente miles de espacios.
El mercado de los microarreglos ha crecido con rapidez
alarmante en los ltimos aos. Como el precio de esta tecnologa ha declinado, se presenta una tendencia a cambiar
opciones caseras de Hgalo Usted Mismo (por sus siglas
en ingls DIY) por la gama creciente de dispositivos comerciales actuales disponibles.
Tecnologa Affymetrix GeneChip

Se sintetizan matrices de oligonucletidos de Affymetrix
usando un proceso que combina la fotolitografa y una qumica combinatoria (Pease y cols., 1994). Las matrices se componen de un fragmento de cuarzo, que se hidroxila de manera
natural. Un grupo de mscaras fotolitogrficas se manufactura
permitiendo la adicin secuencial de nucletidos especficos
516
CAP. 53
ANLISIS DE SNP DE ALTA DENSIDAD Y DE ARREGLOS DE cDNA
Luz
(desproteccin)
Mscara
Agua
25-mer
Repetir
GeneChip
Microarreglo
Figura 53-1 Affymetrix utiliza una combinacin de fotolitografa y de qumica combinatoria para fabricar microarreglos GeneChip. Imagen suministrada por cortesa de Affymetrix.
para ubicaciones particulares sobre el chip. Cuando la luz

ultravioleta se dirige sobre la mscara en el primer paso de la
sntesis, los grupos de enlace expuestos se desprotegen y estn disponibles para el acoplamiento nucleotdico. La nica
solucin tipo nucletido es entonces lavada sobre la superficie del fragmento de cuarzo y se une a los grupos de enlace
activados. En el siguiente paso, otra mscara se coloca sobre
el fragmento de cuarzo para otra ronda de desproteccin y
acoplamiento. El proceso se repite secuencialmente hasta que
las sondas alcanzan su longitud completa, como se ilustra
en la figura 53-1.
Los genes individuales se representan sobre el GeneChip
usando una serie (tpicamente 11-20) de oligonucletidos
25-mer diferentes con apareamiento perfecto. El grupo
HG-U133 contiene 11 pares de sondas por grupo. Los gru-
pos de sondas se localizan dentro de 600 bp de secuencia ascendente desde el sitio poli-A, pues esta porcin del mRNA
se convierte ms eficazmente dentro del blanco marcado.
Se seleccionan las sondas con base en su complementariedad con el gen seleccionado o con la marca de secuencia
expresada (EST), individualidad (singularidad especfica)
relativa con otros genes relacionados y sus caractersticas
de hibridacin previstas. Para cada grupo de sondas oligonucletidas con apareamiento perfecto (PM), un grupo
pareado de sondas con apareamiento incorrecto (MM) est
tambin presente sobre el microarreglo. La secuencia oligonucletida que se emplea para las sondas MM es idntica a
la de la sonda PM pero con una sola sustitucin nucleotdica
en la posicin central. La seal de hibridacin especfica se
determina restando la seal de la fluorescencia de las sondas
MM menos la de la fluorescencia de las sondas PM, y se
promedia sobre todos los pares de sondas que representan
un gen particular. Esta seal de la fluorescencia promedio
es una medida de la cantidad de transcripcin.
El algoritmo de deteccin del software Affymetrix usa
intensidades del par sonda para generar un valor p de la
deteccin y determinar un actual/ausente para cada gen
individual. Cada par sonda en un grupo de sonda tiene
un valor de discriminacin, que se calcula para cada par
sonda y se compara a un umbral predefinido, Tau. El valor de discriminacin es una propiedad bsica de un par
sonda que describe su capacidad para detectar su blanco
previsto. Mide la diferencia de la intensidad especfica del
blanco del par sonda (PM-MM) relativa a su intensidad de
hibridacin total. Los pares sonda con valores ms altos
que Tau optan por la presencia de transcripcin. Los pares
sonda con valores ms bajos que Tau optan por la ausencia
de transcripcin. Un valor p tambin se genera cuando se
refleja la confianza en la llamada deteccin. Esta estratecDNA
RNA total
Transcripcin
inversa
GeneChip
Expresin
Microarreglo
Transcripcin
in vitro
Fragmentacin
cRNA
fragmentado
marcado con biotina
Hibridacin
Figura 53-2 Diagrama esquemtico del procedimiento para

el anlisis de la expresin del gen usando GeneChips de Affymetrix. La imagen aparece por cortesa de Affymetrix.
cRNA marcado
con biotina
Lavar y
teir
Escanear y
cuantificar
SISTEMA DE EXPRESIN CON MICROARREGLO DE APPLIED BIOSYSTEMS
gia permite alta sensibilidad a concentraciones bajas del

blanco y preserva la capacidad para discriminar entre las
secuencias con relaciones muy estrechas.
En contraste con las matrices de cDNA, que utilizan una
aproximacin por hibridacin de dos colores en la cual el
blanco marcado y el control se hibridizan para el mismo
microarreglo, cada GeneChip de Affymetrix se disea para
analizar una sola muestra de RNA (fig. 53-2). El mRNA se
convierte a cDNA de doble hebra mediante transcripcin
inversa, usando un cebador oligo d(T) diseado para contener un sitio promotor T7 RNA. Los nucletidos marcados con biotina son incorporados directamente al blanco del
cRNA por transcripcin in vitro con una T7 polimerasa.
El cRNA marcado se corta en fragmentos <200 bp y se hibridiza para GeneChip. La seal fluorescente se obtiene despus de teir el GeneChip con estreptavidina-ficoeritrina.
Perfil de SNP y matrices de DNA

Las enfermedades genticas complejas requieren muchos
miles de marcadores y centenares de muestras para proporcionar suficiente poder para identificar regiones del genoma y genes responsables de un fenotipo mensurable. Se
ha estimado que los polimorfismos de un solo nucletido
(SNP) ocurren en promedio cada 1 000 bases en el genoma
humano. Estos polimorfismos tienen gran potencial para
utilizarse como marcadores genticos en muchas aplicaciones, incluyendo ligamiento, asociacin y prdida de heterocigosidad en el cncer.
La genotipificacin por SNP actual implica el uso de
iniciadores especficos del sitio, una prctica que potencialmente aumenta el costo y limita el nmero de marcadores
del SNP que pueden ensayarse en un solo experimento. Sin
embargo, Affymetrix ha lanzado GeneChip Mapping 10
K Array. Este sistema puede ensayar ms de 10 000 SNP
en un solo experimento escalable que no se basa sobre la
PCR especfica del sitio (Mei y cols., 2000; Sellick y cols.,
2003). La compaa propone lanzar una serie de dos secuencias (Centurion) en un futuro prximo para analizar
ms de 100 000 SNP por muestra, permitiendo estudios
completos de la asociacin del genoma.
GeneChip Mapping 10 K Array, y microarreglos subsecuentes de Centurion, confan en el ensayo del muestreo del
genoma completo (WGSA). Este esquema es una aproximacin genrica para la reduccin de la complejidad del
genoma completo y permitir la hibridacin eficaz a un microarreglo que contiene ms de 10 000 SNP (Cutler y cols.,
2001). El ensayo trabaja en cuatro pasos simples: digestin
por restriccin del DNA genmico; unin de un adaptador
especfico; amplificacin con un cebador de PCR, y fragmentacin del DNA, seguido por el marcaje y la hibridacin
para el microarreglo (Kennedy y cols., 2003).
517
Para las matrices Centurion, la etapa de amplificacin

por PCR usa la enzima Pfx para amplificar fragmentos de
500 a 2 000 bp reduciendo la complejidad del genoma a un
total cercano a 300 Mb. Esta reduccin de la complejidad
permite la genotipificacin exacta por hibridacin del alelo
especfico para ms de 50 000 SNP en cada microarreglo,
con requerimientos de entrada del ensayo de slo 250 ng de
DNA humano por microarreglo, o 500 ng por serie.
Sistema de expresin con microarreglo

de Applied Biosystems
El sistema de expresin con microarreglo de Applied Biosystems se basa en un diseo de microarreglo que representa el genoma humano completo, utiliza datos actuales
de transcripcin y confa totalmente en anotaciones del gen
que han sido validadas por expertos en salud humana. Cada
sonda es parte de una base de datos correlativa que incluye
tanto la informacin de Celera Genomics como aquellas
del dominio pblico. Combinado con qumicos quimioluminiscentes especialmente desarrollados, este sistema
completo aporta mayor sensibilidad de sonda y de deteccin que las generaciones anteriores de sistemas de microarreglo. Adems, la informacin de la anotacin para
todos los 31 097 genes humanos que se representan sobre el microarreglo se incluye en la base de datos Oracle
que se proporciona con el sistema 1700. Los fabricantes
sugieren que el resultado sea un sistema completo capaz
del anlisis rpido y exacto de los datos del microarreglo
para la investigacin de la expresin gnica. Los experimentos continuos de microarreglos pueden lograrse por
unin con ensayos cuantitativos de PCR TaqMan basados
en sondas para tiempo real, que permiten la validacin de
datos del microarreglo, la cuantificacin absoluta de la
produccin de transcripcin y la investigacin de eventos
alternativos que se traslapan.
El sistema expresin con microarreglo de Applied Biosystems (figs. 53-3 a 53-6) consiste de un analizador (analizador quimioluminiscente 1700 de Applied Biosystems)
que puede registrar microarreglos bajo quimioluminiscencia, para examinar y medir la expresin gnica a niveles
muy bajos y en fluorescencia, para localizar caractersticas
puntuales del cuadriculado automtico. Diseado para incorporar una cmara fotogrfica CCD avanzada, el sistema
1700 registra precisamente la seal quimioluminiscente
que se produce cuando las transcripciones marcadas se
hibridan para un microarreglo. Adems, el sistema 1700
registra el microarreglo en un modo fluorescente y lo representa cuadriculado, normaliza e identifica caractersticas con exactitud para localizarlas con precisin, incluso
en ausencia de productos con expresin gnica que se unen
a sondas del microarreglo.
518
CAP. 53
Figura 53-3 Representacin a color de la formacin y

disposicin del cuadriculado 1700 de Applied Biosystems.
seales fluorescentes (usadas para el cuadriculado y la
cuantificacin); control; sonda/blanco.
Figura 53-4 rea magnificada de un microarreglo 1700, mostrando la escala cuantitativa quimioluminiscente (flecha).
Figura 53-5 Sistema Microarreglo 1700 de Applied Biosystems.
Figura 53-6 Microarreglos de Applied Biosystems sellados dentro de un contenedor de plstico desechable.
ILUMINA, MICROARREGLO DE ORDENAMIENTOS
El sistema expresin con microarreglo de Applied

Biosystems utiliza los datos genmicos ms recientes, combinados con qumicas sensibles de deteccin, para proporcionar
un anlisis comprensivo de la expresin gnica. Una variedad
de equipos complementarios est disponible e incluye:
Equipo de etiquetas RT quimioluminiscentes, que convierte el mRNA de las clulas en cDNA marcado con
digoxigenina.
Equipo de etiquetas RT-IVT quimioluminiscentes, que
convierte el mRNA de las clulas en cRNA marcado con
digoxigenina, mientras entra el RNA simultneamente y
amplificando linealmente. El cDNA o el cRNA marcado
con digoxigenina resultante se hibrida especficamente
para el microarreglo Applied Biosystems.
Equipo de deteccin quimioluminiscente, que se utiliza
para visualizar las caractersticas que tiene el cDNA o el
cRNA marcado con digoxigenina acoplada a sondas nucleotdicas. La visualizacin se logra incubando el microarreglo con un conjugado antidigoxigenina-fosfatasa
alcalina. La fosfatasa alcalina hidroliza un sustrato quimioluminiscente y emite la luz a una longitud de onda
de ~ 458 nm. La intensidad de la seal es proporcional
al nivel del mRNA expresado en las clulas.
Los fabricantes afirman que las seales quimioluminiscentes que se producen sobre el microarreglo proporcionan
una sensibilidad ms alta y una mayor gama dinmica que
los microarreglos fluorescentes convencionales anteriores,
y adems sugieren que puedan obtenerse datos de alta calidad con el sistema expresin con microarreglo de Applied
Biosystems a partir de material inicial tan escaso como 100
ng del RNA total.
Los microarreglos para investigar el genoma humano
de Applied Biosystems se disean usando datos pblicos
y de Celera para todos los genes conocidos (31 097). Estos microarreglos contienen oligonucletidos con un dimetro caracterstico <180 m y un espacio >45 m (borde
a borde) entre cada caracterstica. Los oligonucletidos se
disean para evaluar transcripciones de cada gen del genoma humano. Las sondas oligonucleotdicas se sintetizan en
Applied Biosystems y se disean para asegurar la especificidad mxima. Antes de la fabricacin del microarreglo,
todas las sondas se analizan con un anlisis por espectrometra de masas para el control de calidad. Los microarreglos de Applied Biosystems se sellan dentro de un cartucho
preensamblado, que contiene un puerto cargante que pueda
ser resellado fcilmente despus de que se hayan agregado
las muestras del cDNA o del cRNA marcado. Cuando la
hibridacin finaliza, el cartucho se desmonta y se desecha.
Los microarreglos entonces se procesan en lotes y se lavan
las sondas hibridadas.
519
La base de datos Oracle para la anotacin del blanco

(expresin gnica), que es parte del sistema expresin con
microarreglo de Applied Biosystems, contiene datos recientes de informacin gnica esenciales para todos los laboratorios contratados para estudios de expresin gnica
en la actualidad y provee el acceso para el almacenaje y
consulta completos para todos los datos experimentales. La
base de datos incluye, por ejemplo, las siglas del gen, los
nombres del gen, las referencias cruzadas para la identificacin del gen, las ontologas pblicas (GO) y de Celera
(Panther) del gen, y otra informacin relevante. Adems,
los fabricantes prometen poner al da la informacin con los
datos ms recientes sobre transcripciones dirigidas por microarreglos.
Illumina, microarreglo de ordenamientos

Las matrices de expresin ofrecidas por la compaa Illumina son una manera fundamental de matrices: el autoensamblaje aleatorio de perlas dentro de sustratos de micropozos
estandarizados. stas utilizan los avances tecnolgicos en
fibra ptica y las industrias con sistema microelectromecnico (MEMS) para construir los sustratos que contienen
mltiples miles de pozos en sus superficies (fig. 53-7).
Figura 53-7 Diseo de una sonda Illumina e inmovilizacin de

la perla. Imagen cortesa de illumina.com
El almacenaje cuantitativo de las perlas que se colectan

se autoensamblan dentro de sustratos grabados en micropozos para producir una plataforma del microarreglo de
alta densidad. Dos formatos de microarreglo de matrices
diferentes, el microarreglo de ordenamientos de Sentrix,
y BeadChip de Sentrix, estn actualmente disponibles.
El microarreglo de ordenamientos utiliza paquetes fibropticos que contienen casi 50 000 filamentos individuales
de fibras conductoras de luz que estn qumicamente grabadas
para crear un pozo de 3 m en el extremo de cada filamento.
Los paquetes del microarreglo se agrupan en una configuracin de 96 matrices que se emparejan en el pozo espaciando
las placas de microtitulacin estndares. Este formato nico
permite que los usuarios conduzcan experimentos simples y
rpidamente sobre 96 matrices de forma simultnea. Por otra
parte, la plataforma puede incorporarse de manera fcil en
rutinas automticas empleando equipo robtico estndar, que
minimiza los errores, trabajo y requerimientos de recursos.
520
CAP. 53
Extracto de mRNA
Extracto de mRNA
Transcripcin
inversa
para cDNA
Marca verde
Marca roja
Mezcla
Normal
Enfermedad
Oligos marcados sobre el cristal

Oligos sintetizados sobre el cristal
Desnaturalizar
Productos cDNA-PCR
Hibridar
Figura 53-8 Perfil de la expresin gnica usando microarreglos.
El formato BeadChip es una plataforma de tamao especfico sobre un portaobjetos que permite el procesamiento de ocho muestras a la vez y puede examinarse en un
escner de lser estndar.
Independientemente del formato del microarreglo, cada
perla contiene cientos de miles de sondas oligonucleotdicas unidas en forma covalente. Hasta 1 500 tipos nicos de perla que contienen secuencias diferentes de sonda
se representan en cada microarreglo, con un promedio de
30 veces de redundancia de cada tipo de perla. Despus del
ensamble de la perla, un procedimiento basado en hibridacin se utiliza para descifrar el microarreglo, determinndose qu tipo de perla reside en cada pozo. Este proceso
final valida el funcionamiento de cada tipo de perla.
Microarreglos de DNA de doble color (fig. 53-8)
Con esta tecnologa, cantidades pequeas de sondas se tien sobre una laminilla de cristal usando una impresora
robtica. Las sondas pueden consistir en cDNA, oligonucletidos o productos PCR, cada una complementaria de
un gen especfico. El protocolo para el marcaje e hibridacin del blanco para microarreglos es diferente al usado en
la tecnologa GeneChip de Affymetrix. Para comparar la
abundancia relativa de cada gen en dos muestras diferentes de RNA, se realiza un experimento de hibridacin de
dos colores. El RNA total se extrae de las dos muestras, se
marcan empleando dos fluorforos diferentes. Los reporteros fluorescentes se seleccionan con espectros sin traslape, Cy3 (emisin verde a 540 nm) y Cy5 (emisin roja a
650 nm). Estas marcas fluorescentes pueden incorporarse
directamente por transcripcin inversa con un cebador oli-
Figura 53-9 Diseo de la sonda MWG.
go-dT en presencia de los nucletidos fluorescentes Cy3dUTP, o Cy5-dUTP, o en forma indirecta en una etapa de
amplificacin del T7 RNA. El cDNA o el cRNA marcado
de la muestra de la prueba y de la referencia se mezclan,
los colorantes que no se incorporan se eliminan y la mezcla
se hibridiza para el microarreglo. El cociente Cy3:Cy5 se
determina y alterna la abundancia relativa de esa secuencia
especfica en las dos muestras.
Microarreglos de MWG (fig. 53-9)
Los microarreglos MWG se marcan con grupos de oligonucletidos diseados a partir de la base de datos CodeSeq.
La base de datos CodeSeq es una base de datos MWG
REFERENCIAS
relacionada con protenas no redundantes derivada de las

secuencias pblicas para cada gen; las secuencias redundantes y parciales se eliminan para cada transcripcin. Los
genes y las transcripciones especficas en las secuencias se
representan por oligonucletidos de 50-bases especficos,
que son apareados en contenido GC y TM y estn libres de
estructuras secundarias.
Manejo de datos y anlisis secundario

Las cantidades extensas de datos que emanan de investigaciones con microarreglos aplicados al genoma humano
pueden ser impresionantes, pero sin la interpretacin que
todo esto contiene, es una masa de datos. La funcin del
gen es uno de los elementos clave que los investigadores
desean extraer de experimentos con microarreglos, y una
variedad de herramientas analticas secundarias est disponible con este fin.
Quizs debido a la novedad relativa de la tecnologa del
microarreglo, o el paso acelerado al cual la tecnologa
se est expandiendo, la presentacin del anlisis secundario de datos sufre de carencia de estandarizacin. Los estudios de expresin con microarreglos son capaces de producir cantidades inmensas de datos del transcriptoma. Tales
datos pueden generar incursiones en la funcin y la interaccin del gen en las diversas rutas metablicas (Young,
2000; Lockhart y Winzeler, 2000) pero slo si se persigue
una aproximacin estandarizada para la presentacin de los
datos (Simon y cols., 2002; Barrett y Kawasaki, 2003).
Los datos de la expresin del gen son complicados por
su naturaleza. Deben analizarse en el contexto de una serie
de parmetros, tales como el tipo de microarreglo que se
usa, la naturaleza del material biolgico que se examina,
los protocolos empleados con la muestra de RNA y la naturaleza del calibrador elegido. Este ltimo factor es particularmente importante, dado que los microarreglos actuales
no miden ni cuantifican la expresin per se; ms bien se
calculan cambios relativos o dobleces comparados con una
muestra del calibrador. La carencia de estandarizacin entre los genes de referencia o controles usados es una de las
fuentes ms importantes de confusin al intentar comparar
los datos generados por diferentes fuentes. Diversas plataformas del microarreglo y el diseo experimental tambin contribuyen con datos no estandarizados, produciendo
comparaciones directas difciles o imposibles.
Brazma y cols. (2001, 2002) recientemente propusieron
un sistema con objeto de estandarizar los datos del microarreglo. Estos autores aspiraron a definir la informacin mnima que debe reportarse para asegurar la interpretacin de
los resultados generados, as como su potencial validacin
independiente. Su sistema lleva las siglas MIAME (informacin mnima sobre un experimento con microarreglo).
521
Con el sistema MIAME, los datos y las anotaciones de un

experimento con microarreglos necesitan conformarse con
las siguientes restricciones: la informacin registrada sobre cada experimento debe ser suficiente para interpretar el
experimento y con bastantes detalles para permitir comparaciones con experimentos similares y la replicacin, y la
informacin debe estructurarse de una manera que permita
la consulta til y el anlisis y extraccin de los datos automticamente. Otro principio que sostiene MIAME es la concesin de que el rea se desarrolla rpido. Sugiere que los
estndares simplemente requieren la descripcin de datos con detalle y anotaciones suficientes para facilitar que
las partes interesadas entiendan cmo se alcanzaron las
conclusiones. El programa detalla los componentes variables esenciales de un experimento con microarreglo e indica
los puntos que necesitan incluirse en cualquier manuscrito
que se refiera a esta rea. Por ltimo, el sistema reconoce
el uso de la tecnologa con microarreglo para propsitos
diferentes al anlisis de la expresin (p. ej., perfilamiento
de SNP) y otras versiones de los sistemas se planean para
acomodar este aspecto.
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54
Anlisis por microarreglo de la hibridacin
genmica comparativa de los tejidos humanos
Esther ORegan, Paul Smyth, Stephen Finn, Cara M Martin, Orla Sheils y John OLeary
Antecedentes de hibridacin genmica

comparativa (CGH) y de su microarreglo
Histricamente, el anlisis citogentico de tumores slidos
ha resultado difcil, y aunque hay muchas tcnicas que se
usan en la deteccin de cambios genticos implicados en tumores slidos, todas tienen sus limitaciones. La citometra
de imagen, que se utiliza para detectar clones aneuploides, no
es muy sensible para detectar cambios genticos pequeos,
mientras la cariotipificacin presenta sus propias dificultades, es muy especializada, consume tiempo y requiere
cultivos tisulares de tumores slidos, los cuales pueden ser
inestables. Los estudios de prdida de heterocigosidad y de
hibridacin in situ fluorescente (FISH) proveen informacin
muy detallada sobre uno o una cantidad pequea de genes
o regiones cromosmicas especficas a la vez; sin embargo,
impide una apreciacin global del genoma entero.
En 1992, Kallioniemi y cols. desarrollaron un mtodo citogentico molecular, la hibridacin genmica comparativa
capaz de detectar y mapear la variacin relativa de la cantidad de la copia de la secuencia de DNA a travs del genoma
completo en un solo experimento. Esta tcnica revolucionaria, que utiliza una cantidad pequea de DNA, permite que
se investigue el genoma completo y se detecten prdidas y
ganancias en todos los cromosomas de modo simultneo, sin
la necesidad de cultivos celulares (Hermsen y cols. 1996).
El grupo de Kallioniemi en la Universidad de California, San Francisco, us inicialmente CGH para detectar
aberraciones cromosmicas novedosas en 11 variedades de
clulas cancergenas, y desde entonces la literatura sobre el
uso de esta tcnica para detectar alteraciones genticas est

en crecimiento y desarrollo muy rpido (Forozan y cols.,
2000). La ventaja de esta tcnica es su capacidad de tamizaje genmico amplio, que requiere menos tiempo y trabajo que la FISH convencional. Las aplicaciones de CGH en
la investigacin del cncer incluyen el tamizaje de tumores
para aberraciones genticas, y el anlisis de los perfiles
de alteracin gentica dentro de tumores para ampliar la
comprensin de la progresin y el pronstico del tumor.
Aunque es una poderosa herramienta en el diagnstico y
la investigacin, CGH tiene la limitacin de emplear cromosomas metafsicos en estado condensado para la visualizacin, haciendo difcil distinguir las seales traslapadas
de genes en estrecha proximidad uno al otro, dificultando
la localizacin precisa de una secuencia de inters. La resolucin para detectar la prdida del nmero de copias es
mayor o igual a 10 MB, y para las ganancias del nmero de
copias, es no menos de 2 MB. Otra dificultad que se presenta en CGH es la necesidad de personal tcnico experimentado con entrenamiento en citogentica, con capacidad
de identificar y determinar sitios de cambios en el nmero
de copias.
En 1995, Schena y cols. desarrollaron el microarreglo,
en el cual los clones de cDNA de blancos con hibridacin
especfica del gen de plantas se usaron para medir de manera cuantitativa la expresin de los genes correspondientes
de la planta. El xito de esta herramienta cientfica novedosa condujo al uso de los microarreglos para el anlisis del
genoma humano, permitiendo colocar una representacin
completa de ste sobre una sola laminilla. Los microarre-
524
CAP. 54
ANLISIS POR MICROARREGLO DE LA HIBRIDACIN GENMICA COMPARATIVA DE LOS TEJIDOS HUMANOS
glos o chips, como se conocen, son arreglos ordenados

de muestras individuales de cido nucleico, que se inmovilizan bajo la forma de rejilla sobre una superficie slida como el cristal, cromo, silicio, etc. (Maughan y cols.,
2001). El anlisis con microarreglos ahora es una tecnologa elemental que permite el anlisis de la variacin de
la secuencia del DNA, de la expresin gnica, niveles proteicos, tejidos y las clulas en un formato paralelo extenso
(Stears y cols., 2003). Desde el desarrollo de los microarreglos, las limitaciones reconocidas de CGH convencional se
han superado al acoplarlas a la tecnologa del microarreglo.
En vez de usar cromosomas metafsicos, la CGH se aplica
a secuencias genmicas del DNA unido a las laminillas.
Este sistema aumenta de forma significativa la resolucin
para detectar regiones de desequilibrio, y tambin evita que
se requieran citogenetistas experimentados.
Apreciacin global de la hibridacin

genmica comparativa
La CGH implica el uso de DNA especfico de la enfermedad o del tumor marcado con un fluorocromo verde, mezclado (1:1) con DNA normal (diploide) marcado con un
fluorocromo rojo. Esta mezcla se hibrida para preparaciones humanas metafsicas normales sobre una laminilla de
cristal. Los fragmentos de DNA marcados compiten por la
hibridacin hacia su sitio de origen, en la extensin metafsica de los cromosomas; la hibridacin del DNA del tumor
se representa con fluorescencia verde, mientras la del DNA
normal, con fluorescencia roja. Las cantidades relativas
del tumor y del DNA de referencia unidas a cualquier sitio
dado son dependientes de la abundancia relativa de esas
secuencias en las dos muestras de DNA. El cociente de
la fluorescencia verde:roja resultante es la representacin
cuantitativa de la prdida o ganancia del material gentico.
En resumen, la ganancia en el nmero de copias del gen
(amplificacin) produce un cociente verde:rojo elevado, y
la prdida del nmero de copias (disminucin) en un sitio
especfico produce un cociente verde:rojo reducido.
Las laminillas metafsicas normales se preparan a partir
de cultivos linfocticos de sangre perifrica estimulados con
fitohemaglutinina de un humano con un cariotipo normal.
Las clulas se aprisionan dentro de la mitosis, se tratan con
KCl hipotnico, se fijan en metanol o cido actico y se
montan sobre laminillas, prestando atencin para reducir al
mnimo el nmero de cromosomas traslapados. Para preparaciones de alta calidad debe existir poco citoplasma, para
mantener los niveles del fondo a un mnimo; los cromosomas son oscuros cuando se observan bajo un microscopio
de contraste de fases; y tambin deben tener una longitud
adecuada (cerca de 400 a 500 bandas) (Kahru y cols., 1997).
Por supuesto, como alternativa a este trabajo consumidor
de tiempo, existen laminillas con cromosomas en metafase

completamente preparadas disponibles en el comercio.
Ventajas
La CGH permite detectar y mapear incrementos y decrementos en el nmero de copias de la secuencia de DNA en
cualquier lugar del genoma, aportando informacin sobre
la frecuencia total de ganancias y prdidas; cualquier grupo
de stas cambia las subregiones cromosmicas, y el tamao
y el nmero de las regiones afectadas en cualquier muestra dada del tumor. La capacidad para investigar el genoma
completo en un experimento es la ventaja distintiva que posee sobre los estudios de prdida allica, que se dirigen slo
a un sitio a la vez. La CGH no requiere preparacin de extensiones metafsicas de las clulas que se analizan, lo cual
puede resultar muy difcil en el anlisis de bandeo de tumores slidos, as la CGH es ideal para el uso en el anlisis de
tumores slidos, sobre todo desde que se mejor la tcnica
de extraccin de DNA; y la amplificacin de PCR universal
permite la adquisicin de producciones ms altas de DNA a
partir de casi cualquier clase de espcimen clnico, incluso
de tejido fijado en formalina e incluido en parafina.
Como ninguna sonda especfica o conocimiento previo
de alteraciones genmicas son requeridos, la CGH es muy
conveniente para la identificacin y mapeo de las aberraciones desconocidas, las cuales han conducido a localizaciones
de genes muy importantes (Mertens y cols., 1997).
Limitaciones
La CGH ha demostrado ser una herramienta crtica; sin embargo, tiene un nmero de limitaciones. Primero, slo puede detectar ganancia y prdida de copias. No puede detectar
cambios cromosmicos estructurales que no impliquen ganancia o prdida de copias, por ejemplo, translocaciones o
inversiones equilibradas. Es, por tanto, ms conveniente en
el anlisis de tumores epiteliales, en los cuales el tipo principal de inestabilidad gentica es el desequilibrio cromosmico, mientras que no es tan til en anlisis hematolgico
o del tumor mesenquimatoso. En segundo lugar, porque el
DNA blanco dentro del cromosoma est supercompactado,
el tamao mnimo de la aberracin de DNA que puede detectarse presenta un problema, es decir, la resolucin es 10
Mb para la prdida, y porque este nivel de la detectabilidad
es una funcin del tamao de la aberracin y del nmero
de copias excesivas, la resolucin de la ganancia es 2 Mb.
Estas limitaciones evitan la localizacin precisa de secuencias de inters. Debe tambin observarse que en el anlisis del tumor slido es difcil detectar cambios pequeos
del nmero de copias debido a la contaminacin de clulas
MICROARREGLOS
del tumor con clulas normales. El aislamiento de las poblaciones celulares puras por microdiseccin se recomienda
para reducir la contaminacin, y, de esta forma, aumentar la
sensibilidad de la deteccin.
Tambin, debido a un nmero alto de secuencias repetitivas en las regiones cromosmicas 1p32, 16p y 19p, el
anlisis de estas regiones puede ser inestable (Weiss y cols.,
1999). Finalmente, los patrones de tincin no homognea
o granular pueden surgir de preparaciones del DNA de la
muestra contaminada con altas cantidades de protena o de
fragmentos marcados que son demasiado cortos o largos.
Aplicaciones clnicas
Las aplicaciones de la CGH abarcan desde la gentica
del cncer al diagnstico prenatal. En el cncer, las deleciones y amplificaciones contribuyen a alteraciones en la
expresin de genes y oncogenes supresores del tumor. La
alteracin extensa del nmero de copias de DNA, que tiene un efecto directo sobre los patrones de expresin del
gen global, apoya la teora de que existe un grado alto de
expresin dependiente del nmero de copias en tumores
slidos. Los estudios sobre cncer de mama y cncer renal,
entre otros, han demostrado que el nmero de aberraciones
puede relacionarse con tasas de supervivencia total y con
resultados de los pacientes; por tanto, el nivel de inestabilidad gentica puede ser un indicador til del pronstico
(Isola y cols., 1995; Moch y cols., 1996). La CGH es un
mtodo de tamizaje sensible para la deteccin y el mapeo
de estos genes crticos asociados con el cncer; tambin se
le utiliza para identificar los patrones persistentes de las alteraciones genticas de clonas comunes que se encuentran
en muchos tumores, por ejemplo, prdida en el cromosoma
13 y ganancia de 8q (Mertens y cols., 1997).
Las anormalidades de desarrollo, por ejemplo, sndromes de Down, Prader-Willi y cri-du-chat, resultantes de la
ganancia o prdida de una copia de un cromosoma o una
regin cromosmica y, aunque la citogentica convencional se utiliza para identificar aberraciones cromosmicas
en estos desrdenes, una CGH tiene el valor adicional de
permitir la deteccin de material extragentico desconocido o de aberraciones desequilibradas que pueden conducir
a la identificacin de regiones y genes novedosos responsables del fenotipo de los pacientes.
Microarreglos
El desarrollo del microarreglo en 1992 por Schena y cols.
ha revolucionado la aproximacin a la investigacin biolgica y, desde 1992, se ha convertido muy rpido en una
herramienta estndar en muchos laboratorios de investiga-
525
cin genmica, con amplias aplicaciones en reas incluyendo las de tamizaje gentico, protemicas, de valoracin
de la seguridad y de diagnstico (Stears y cols., 2003; Solinas-Toldo y cols., 1997).
En los ltimos aos se introdujo la principal CGH fundamentada sobre microarreglos (Pinkel y cols., 1998) y
refinado (Mantripragada y cols., 2003). En esta tcnica,
los cromosomas metafsicos de la tcnica CGH clsica se
reemplazan por un microarreglo de alta densidad de clones
genmicos en la forma de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC)
o csmidos sobre una superficie slida. Esta combinacin
novedosa de la CGH sobre un chip ha evadido algunas de
las limitaciones de la CGH convencional.
Primero, debido a la carencia de resolucin espacial de
la CGH convencional la resolucin permanece al nivel del
bandeo cromosmico. Sin embargo, combinando CGH y
la tecnologa del microarreglo; esta limitacin se supera,
mejorando la resolucin y permitiendo la identificacin de
desequilibrios genmicos que no se observan al usar CGH
convencional (Mantripragada y cols., 2003). Sin embargo,
es importante anotar que la resolucin se determina por el
tamao de la insercin del DNA clonado y, por tanto, esto
puede variar desde 100 KB hasta 40 MB.
La capacidad para el anlisis simultneo de centenares
de lugares genmicos mejora mucho la precisin de los datos y reduce el costo cuando se compara con mtodos seriales. Los microarreglos de CGH aportan una plataforma
para la deteccin de la aberracin que tiene sensibilidad
mejorada, resolucin mejorada, mejor reproducibilidad y
un rendimiento de procesamiento ms alto.
Un microarreglo es un arreglo ordenado de muestras y
tiene dimensiones del punto que son por lo general menores de 200 m de dimetro. Pueden encargarse (Phimister,
1999) o emplearse los tipos disponibles en el comercio.
El microarreglo se fabrica con robtica de alta velocidad
sobre una superficie que debe permitir la unin estable de
los elementos del microarreglo y minimizar las seales
del fondo. La instrumentacin para el microarreglo y la
proyeccin de imagen pueden ensamblarse en el local o
comprarse entre diversos vendedores.
En la figura 54-1 la plataforma microarreglo 300 de
Vysis Genosensor utiliza la qumica de unin nica que
permite insertar 287 clones grandes como cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas P1-artificiales
(PAC) para que sean teidos sobre una superficie chapada con cromo. Tres puntos representan cada clon y comprenden oncogenes conocidos, genes supresores del tumor,
reas conocidas con prdida de heterocigosidad, microdisminuciones comunes, subtelmeros y clones de marcador.
La resolucin depende del tamao del clon y puede variar
entre 100 kb y 40 Mb.
526
CAP. 54
Figura 54-1 Salida del informe final del sistema matriz 300 de Genosensor.
MICROARREGLOS
El Spectral Genomics SpectralChip se basa en un

acoplador qumico propietario nico de los fragmentos de
DNA en las superficies de cristal sin tratar, eliminando la
unin no especfica de las sondas en las superficies cargadas positivamente. Esto reduce el ruido y la fluorescencia
de fondo. El equipo del microarreglo de SpectralChip incluye dos matrices con 1 003 clones BAC sin traslape que
se extienden sobre al genoma en intervalos cercanos a 3
Mb y se tien por duplicado. Con esto se obtiene una resolucin mayor de 3 Mb.
Es importante observar cierta discrepancia en la nomenclatura literaria respecto a los trminos sonda y blanco.
Se siguen las recomendaciones de Phimister y cols., en que
sonda se refiere al cido nucleico unido a la secuencia
conocida, mientras que blanco implica la muestra libre
del cido nucleico que se trata de identificar (EmmertBuck y cols. 1996).
Material iniciador
Al aislar DNA para el anlisis de la CGH es imprescindible
que el DNA sea de alta calidad. El DNA de tumores slidos
debe obtenerse de tejido fresco o congelado, as se evita
la degradacin extensiva; sin embargo, la adquisicin del
tejido en estos estados no siempre es factible.
El DNA que se extrae de tejido fijado en formalina e
incluido en parafina se entrecruza y consiste de DNA con
elevada fragmentacin, convirtindolo en subptimo para
el marcaje. Para reducir al mnimo la degradacin, un periodo de fijacin en formalina menor a 24 h es recomendable, y preferible el uso de formalina amortiguada con
un pH neutro. La dilucin del DNA tumoral por DNA del
estroma normal/contaminante circundante puede conducir a cambios en el cociente de DNA tumoral entre DNA
normal, produciendo fallas para detectar aberraciones cromosmicas.
Para minimizar el problema de la heterogeneidad en los
tejidos de tumores slidos, es importante obtener una poblacin pura de las clulas tumorales previo a la extraccin del
DNA. Lo anterior se logra por medio de la microdiseccin
de la muestra, ya sea de manera manual o mediante la tcnica de microdiseccin con lser y captura (LCM).
Con el sistema 2 Arcturus PixCell, un lser infrarrojo
no perjudicial funde un polmero con temperatura de fusin baja sobre las clulas elegidas, permitiendo que las
clulas se adhieran, aislando las poblaciones celulares de
inters identificadas por medios morfolgicos (Telenius y
cols., 1992).
Sin embargo, el uso de esta herramienta valiosa para
obtener DNA tumoral puro tiene algunas limitaciones. La
tcnica consume tiempo, requiere la captura lser de las
clulas a partir de secciones mltiples para recoleccionar
527
suficiente nmero de clulas que permitan el aislamiento

adecuado del DNA.
La mayor parte de los estudios de la CGH involucran el
uso de los equipos de extraccin de DNA disponibles en
el comercio, de aislamiento de DNA basados en columnas de afinidad, y extracciones fenol/cloroformo. Al usar
muestras fijadas en formalina e incluidas en parafina como
material de inicio, las modificaciones tendrn que realizarse para protocolos de extraccin genricos. Debido al
entrecruzamiento extenso, es aconsejable un periodo de
incubacin prolongado de hasta tres das en la solucin
de lisis celular y la adicin repetida de proteinasa K durante este periodo (Weiss y cols., 1999).
Para un experimento con microarreglo de CGH, se requieren de 0.1 a 0.5 g de DNA. Esto puede ser difcil de obtener,
sobre todo a partir de muestras pequeas de tejido fijado en
formalina e incluido en parafina. Para mejorar la produccin,
se puede amplificar el genoma completo de manera no especfica. La reaccin en cadena de la polimerasa preparada de
oligonucletido degenerado (DOP-PCR; Speicher y cols.,
1993; Kuukasjarvi y cols., 1997) es una tcnica completa de
amplificacin del genoma eficiente y confiable.
Este tipo de PCR emplea un oligonucletido que contiene iniciadores degenerados. El procedimiento de la amplificacin se divide en dos pasos. La primera parte implica cinco ciclos de PCR realizados a temperaturas bajas
de templado (32C), que permiten la unin frecuente del
iniciador DOP. Esto genera un depsito de secuencias de
DNA a partir de sitios uniformes dispersos dentro de un genoma dado. El segundo paso tiene una temperatura de templado ms rigurosa de 62C para 35 ciclos, ocasionando un
inicio ms especfico. El resultado de este procedimiento
de dos etapas es la amplificacin exponencial de todas las
secuencias que se han sintetizado en el primer paso, produciendo una cantidad grande de DNA. Varios grupos que
ya han publicado sus investigaciones alteraron de alguna
manera el protocolo DOP-PCR original, en un esfuerzo
para mejorar la produccin de DNA y la confiabilidad del
mtodo (Huang y cols. 2000).
Para probar el funcionamiento del mtodo, se puede
usar como control positivo una mezcla de DNA que se extrae a partir de lneas celulares tumorales. Vysis usa CoSH,
una mezcla de las siguientes variedades de clulas: COLO
320 HSR (adenocarcinoma colnico), 35%; SJSA-1 (osteosarcoma), 40%, y BT-474 (carcinoma de mama), 25%,
con ganancias y prdidas conocidas del nmero de copias
en sitios especficos.
Marcaje e hibridacin del DNA
Para obtener hibridacin uniforme, intensa en los microarreglos, el tamao del fragmento de la sonda del DNA
528
CAP. 54
Disminucin de 9p21.3 (MATP)
Amplificacin de
17q21 BRCA1
Figura 54-2 Visualizacin de la micromatriz que

muestra una disminucin de 9p2l.3 (MTAP) (roja) y
una amplificacin de 17q2l (BRCA1) (verde).
debe ser de 200 a 400 bases, y esto se logra con un marcado

aleatorio del DNA y recolectando esta longitud ptima de
fragmento. En el mtodo de marcaje directo recomendado
por Vysis y Spectral Genomics, los fluorforos Cy3 y Cy5
se unen de manera directa al DNA de la muestra y al DNA
genmico de referencia completo respectivamente.
Los DNA se mezclan y se cohibridan en una micromatriz
en presencia del DNA Cot-1 humano sin marcar. El DNA
Cot-1 es DNA placentario de 50 a 100 pares de bases de
longitud, que se enriquece para las secuencias repetidas del
DNA, y su funcin es bloquear la unin del DNA marcado a
las regiones centromricas y heterocromticas, que contienen secuencias de repeticin polimrficas elevadas. El bloqueo de estas regiones previene su inclusin en el anlisis,
permitiendo la amplitud ptima del cociente rojo:verde.
Despus de la hibridacin de 2 a 4 das a 37C en una
incubadora hmeda, los chips se lavan para eliminar cualquier sonda sin hibridar. Despus se aplica 4,6 diamidino2-fenilindol (matriz DAPI) como contratincin.
El tiempo de captura y almacenaje de la imagen para
cada laminilla es cercano a una hora. Un sistema de proyeccin de imagen fluorescente captura una imagen del
chip hibridado en planos de tres colores: Cy3, Cy5 y
azul DAPI. La matriz 300 de Vysis Genosensor utiliza
una cmara fotogrfica CCD y una fuente de iluminacin de xenn de 175 W para capturar tres imgenes de
cada microarreglo, especfica para la contratincin DAPI
(azul), para el DNA de la prueba (verde) y para el DNA
de referencia (rojo). La imagen azul se emplea para identificar y localizar los puntos del blanco en la rejilla. Una
vez identificados, los puntos pueden analizarse de manera
cuantitativa con el software especializado, que integra las
intensidades fluorescentes verdes y rojas, restando el fondo
local, y se calcula el cociente de la intensidad de la prueba
entre la intensidad de la referencia (T:R) para cada punto
(triplicar los puntos para cada gen del blanco). En la figura
54-2, por supuesto, los cocientes T:R promediados tienen
que normalizarse respecto al punto de control o a un grupo

de puntos. El sistema Vysis tambin detecta los puntos que
parecen normales y divide todos los cocientes T:R entre el
cociente T:R de los blancos normales.
Como la representacin sobre microarreglos, en particular arreglos de expresin, se incrementa en densidad, el
almacenaje de los datos y la bioinformtica se convierten
en una recoleccin ms desafiante e impecable; el anlisis
y los mtodos de interpretacin son de suprema importancia si se previenen los datos daados que pudieran conducir
a conclusiones incorrectas. En un esfuerzo para evitar este
suceso, la estadstica y la bioinformtica se estn convirtiendo rpido en los componentes ms prominentes en el
entrenamiento de bilogos moleculares.
Conclusin
Hay un cambio en la biologa molecular desde el desarrollo de la tecnologa del microarreglo, y el acoplamiento de
esta tecnologa con la hibridacin genmica comparativa ha surgido como herramienta poderosa, permitiendo la
evaluacin de mltiples blancos en una sola prueba con
la capacidad de detectar cambios en la copia nica. Esta
tcnica inestimable ha acelerado la deteccin de genes novedosos que pueden desempear un papel en la patognesis
de tumores y en el desarrollo del control de la enfermedad
con perfil genmico.
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55
Secuenciacin de cidos desoxirribonucleicos
Cara M Martin, Steven J Picton, Orla Sheils y John OLeary
Introduccin
La identificacin del cido desoxirribonucleico (DNA) qumico a mediados de la dcada de 1940 por Avery, MacLeod
y McCarty mostr por primera vez que el DNA es el material de la herencia, la tan llamada sustancia de la vida. Este
solo descubrimiento puso el fundamento para permitir a la
ciencia el establecimiento de la gentica molecular, de la terapia de genes, del asesoramiento gentico y de la manipulacin de la expresin gentica in vitro. Ha aportado la base
para las tcnicas que ahora conducen al escndalo de los
peridicos sensacionalistas inspirados por la publicacin de
las ltimas aplicaciones de las tcnicas del DNA recombinante, como la clonacin de la oveja Dolly en el Instituto
Roslin, Edimburgo, en Escocia, y facilitado el esfuerzo internacional para secuenciar los 3 mil millones de bases del
DNA en el genoma humano, a principios de esta dcada.
James Watson y Francis Crick en 1953 desentraan y publican la estructura tridimensional de la molcula del DNA
de doble cadena. El resto es historia. Desde que la identidad
y la estructura de la molcula responsable del cambio heredado se descubrieron, se ha establecido el lenguaje del cdigo gentico, con las cuatro bases, adenina (A), citosina (C),
guanina (G) y timina (T). El flujo de esta informacin desde
la secuencia base del DNA a las protenas ahora est elucidado y clarificado ms all de cualquier duda cientfica.
De los acontecimientos clave crticos para el nacimiento
y la maduracin exitosa de la biologa molecular aplicada, el
descubrimiento de los mtodos para determinar la secuencia
base individual de los cidos nucleicos debe figurar entre los
ms importantes. La tecnologa de secuenciacin se utiliza
en la actualidad a travs de un nmero diverso de disciplinas, comprendiendo desde la ciencia mdica y forense hasta
la gentica de poblacin, la filogentica y la gentica de la

conservacin. Ya que es una era de genmicos comparativos, de descubrimiento de frmacos, y de tamizaje gentico,
la demanda para las tecnologas de alto rendimiento de secuenciacin es mayor que nunca. La capacidad para determinar rpidamente secuencias del DNA ha revolucionado la
ciencia de la gentica molecular. Las secuencias del DNA se
obtienen de diversas fuentes, y los depsitos o bancos de informacin son extensos, como las bases de datos de EMBL,
DDBJ y GenBank, que existen como reservas internacionales
de las secuencias del cido nucleico. Estos bancos de datos
sirven como una biblioteca del cido nucleico a la cual los
cientficos tienen acceso electrnico para estudiar la evolucin, las mutaciones, la filogenia y aplicar, en ltima instancia, la informacin de la secuencia para la caracterizacin de
sistemas biolgicos completos. El propsito de este captulo
es resear esta tecnologa de secuenciacin y sus aplicaciones, particularmente en el Proyecto del Genoma Humano.
Historia de la secuenciacin del cido

desoxirribonucleico
Los intentos iniciales en las tcnicas de secuenciacin fueron realizados sobre plantillas cortas de tRNA por el grupo
de Robert Holley a mediados de la dcada de 1960. Este
mtodo implic digerir el RNA con RNasas de secuencia
especfica y separar los ribonucletidos resultantes por cromatografa de intercambio inico. A principios de la dcada de 1970 la secuenciacin del DNA rutinaria se convirti
en una realidad con el descubrimiento y el aislamiento de
las enzimas de restriccin del DNA, esencialmente tijeras moleculares que cortan hasta plantillas complejas del
532
CAP. 55
SECUENCIACIN DE CIDOS DESOXIRRIBONUCLEICOS
genoma, y las DNA polimerasas que permitieron que los

fragmentos de la plantilla se copiaran in vitro. Estas enzimas hicieron posible que fragmentos pequeos de DNA
se aislaran de secuencias mucho ms grandes y despus se
utilizaran como plantillas para la sntesis in vitro de nuevo
DNA marcado o etiquetado.
En 1980 a tres cientficos se les concedi el premio Nobel
en qumica por el desarrollo independiente de dos mtodos
de secuenciacin del DNA. stos son Maxam & Gilbert,
que desarrollaron un mtodo qumico de secuenciacin del
DNA, y Fred Sanger, quien describi un mtodo enzimtico
para la secuenciacin del DNA. Ambas tcnicas, y las modificaciones de ellas, son la espina dorsal de la mayor parte de
las tecnologas de secuenciacin actuales, con predominio
del mtodo de terminacin de cadena dideoxi (Sanger).
Secuenciacin qumica del cido

desoxirribonucleico
Uno de los mtodos ms tempranos para determinar la secuencia nucleotdica de una seccin de DNA aislada fue la
secuenciacin qumica de la hebra del DNA, referida con
ms frecuencia como la tcnica Maxam-Gilbert, que se public en 1977 (Maxam y Gilbert, 1977). En este mtodo,
un fragmento aislado de DNA se radiomarca en un extremo
y despus se degrada parcialmente sometiendo la plantilla
marcada a una serie de reacciones de divisin especfica de
la base. Estas reacciones de divisin generan cinco poblaciones de molculas radiomarcadas que se extienden desde un
punto comn (el trmino radiomarcado) hasta el sitio de la
divisin qumica. Las condiciones se disean de tal manera
que, en promedio, slo una base blanco en cada molcula se
modifica dentro de una hebra de DNA dada, y estas reacciones se llevan a cabo en dos etapas: a) las bases especficas
o los tipos de bases experimentan modificacin qumica, y
b) la base modificada se remueve de su azcar y los enlaces
fosfodister 5 y 3 de la base modificada se cortan. Cinco
modificaciones qumicas diferentes ocurren en los tubos de
reaccin separados, que dividen el DNA en las bases especficas. Despus de cada una de las reacciones qumicas especficas, la plantilla en el tubo se trata con piperidina, que
divide los enlaces fosfodister adyacentes al DNA daado.
El conjunto resultante de las molculas marcadas del
extremo, cuyas longitudes pueden comprender de uno
hasta varios cientos de nucletidos, pueden utilizarse para
identificar la posicin de las bases individuales proporcionando una escalera de fragmentos que varan de tamao
uno del otro por una sola base. Estos fragmentos se separan
por electroforesis en un gel de poliacrilamida, y la secuencia se lee de una autorradiografa del gel de secuenciacin.
El rango de este mtodo Maxam-Gilbert es menor que el
del mtodo Sanger, con 600 pb de la secuencia, genera-
das a partir de un solo conjunto de reacciones. El uso de

este mtodo se redujo en estos ltimos aos, en gran parte debido a las mejoras enormes en los acercamientos de
secuenciacin enzimtica, incluyendo la automatizacin y
las DNA polimerasas hechas a la medida. No obstante, este
acercamiento contina desempeando un papel crucial en
muchos laboratorios y se utiliza para establecer las secuencias del oligonucletido, y en la diseccin funcional de las
seales del control transcripcional (Carey & Small, 2000).
El mtodo dideoxi de secuenciacin del DNA

El mtodo Sanger (Sanger y cols., 1977) o de terminacin de
cadena de secuenciacin del DNA es el acercamiento utilizado en las principales iniciativas del genoma. El principio
de este mtodo es simple; un fragmento aislado de DNA o
el plsmido entero, el csmido o el producto de PCR es desnaturalizado a su forma de una sola cadena por el calor o
la alcalinizacin. Un cebador oligonucletido sinttico corto
se une a su secuencia complementaria, codificada en una de
las plantillas de una sola cadena. El extremo 3 del dplex
cebador/plantilla entonces se utiliza como el sitio de iniciacin para la accin de la DNA polimerasa y una cadena de
DNA complementaria se sintetiza usando dNTP como pre-
Figura 55-1 Qumica de la secuenciacin Sanger o de terminacin de cadena que emplea iniciadores marcados con colorante
fluorescente. Cuatro diferentes iniciadores marcados con colorante (terminacin A, C, G y T) se utilizan en cuatro reacciones separadas de extensin y de terminacin. En el final de las reacciones,
los contenidos de los cuatro tubos se renen y se cargan sobre
un carril de un gel de poliacrilamida. La escalera de productos
marcados con colorante se separa por electroforesis y se detecta
en tiempo real.
EL MTODO DIDEOXI DE SECUENCIACIN DEL DNA
Figura 55-2 Qumica de la secuenciacin Sanger o de terminacin

de cadena que emplea terminadores dideoxi marcados con colorante. Los terminadores dideoxi, con cada uno de los cuatro ddNTP
posibles que se marquen con un colorante fluorescente diferente, se
incorporan con una polimerasa durante la fase de extensin de la
reaccin de secuenciacin. La escalera de productos marcados con
colorante se separa por electroforesis y se detecta en tiempo real.
cursores. La qumica de la terminacin de cadena se utiliza junto con los cebadores oligonucletidos marcados (fig.
55-1) o por la incorporacin de nucletidos marcados durante
la reaccin de extensin (fig. 55-2). En la secuenciacin con
cebadores con colorante, cuatro reacciones de secuenciacin
separadas se realizan por cada muestra (cada reaccin contiene un cebador marcado con colorante). Este mtodo est
bien adaptado para los proyectos de secuenciacin que utilizan cebadores universales; sin embargo, aquellos que emplean cebadores personalizados llegan a ser ms engorrosos
y costosos, ya que cada cebador debe modificarse en cuatro
reacciones separadas de marcaje con colorante.
En el acercamiento de la secuenciacin de terminacin de
cadena estndar, se requieren cuatro reacciones de sntesis
separadas. Cada una de las reacciones individuales contiene
una cantidad pequea de uno de los cuatro 2,3 dideoxinucletido trifosfato (ddNTP), que difiere de los deoxinucletidos por tener un tomo de hidrgeno unido en vez de un
grupo OH (fig. 55-3). Cuando la hebra de DNA creciente
sintetizada incorpora un ddNTP especfico, la reaccin de
elongacin se termina, puesto que el ddNTP carece del gru-
Figura 55-3 Estructuras qumicas de los dideoxinucletidos y de

los deoxinucletidos. El reemplazo del grupo hidroxilo por un hidrgeno evita que los dideoxinucletidos experimenten extensin
adicional de la cadena durante la sntesis del DNA.
533
po 3-hidroxilo requerido por la polimerasa para formar un

enlace fosfodister con el siguiente dNTP. Por el control cuidadoso del cociente de ddNTP a dNTP en cada una de las
cuatro reacciones, una alcanza una incorporacin aleatoria,
pero baja, de cada uno de los ddNTP en las hebras crecientes
del DNA y crea una matriz de fragmentos con un extremo
5 comn, definido por el cebador, pero terminando en cada
posicin posible donde el ddNTP especfico puede haberse
incorporado. La longitud promedio de tales cadenas puede
manipularse alterando los cocientes ddNTP:dNTP para asegurar que todos los productos puedan resolverse fcilmente
por electroforesis en gel de poliacrilamida o capilar.
Realizando las cuatro reacciones individuales, con cada
uno de los ddNTP presentes, y despus resolviendo las cuatro reacciones, A-, C-, G- y T-terminaciones, una al lado de
la otra en un gel de resolucin o por electroforesis capilar,
se produce otra vez la escalera caracterstica de fragmentos que permite que la secuencia se lea. Las estrategias
de marcaje comunes incluyen la incorporacin de dNTP
fluorescentes o radiomarcados, seguidos por electroforesis
capilar, autorradiografa o deteccin quimioluminiscente
de los productos terminados. Se han logrado avances importantes en esta tcnica, y se debe, en gran parte, a las mejoras en la qumica del fluorforo. Es posible ahora marcar
cada ddNTP, con diferentes colorantes, que permiten que la
reaccin de secuenciacin se lleve a cabo con un cebador
en un solo tubo, ahorrando tiempo y costo considerables.
Hay actualmente dos tipos de terminadores de colorante
disponibles, uno incorpora los colorantes diclororrodamina
(dRhodamine Terminator, Applied Biosystems) y el otro,
BigDyes (BigDye terminator, Applied Biosystems).
Las primeras reacciones qumicas de secuenciacin emplearon polimerasas como el fragmento Klenow de la DNA
polimerasa I, o la DNA polimerasa derivada del bacterifago
T7 o sus variantes. En pocas ms recientes las polimerasas
termoestables, como la DNA polimerasa AmpliTaq y sus variantes, se explotan para llevar a cabo la qumica de la terminacin de cadena por la unin de la terminacin de cadena
y del proceso de PCR. Tal acercamiento se llama secuenciacin de ciclo (fig. 55-4). El enganchamiento de la PCR
al mtodo dideoxi en la secuenciacin de ciclo (Carothers
y cols., 1989) mejor mucho la sensibilidad de la secuenciacin. La secuenciacin de ciclo es, de diversas maneras,
similar a la reaccin de secuenciacin estndar del DNA.
Comienza con una mezcla de reaccin de secuenciacin estndar del amortiguador, de la plantilla, del cebador, de los
dNTP y de los ddNTP. Una DNA polimerasa termoestable
sustituye a la polimerasa estndar. Esta mezcla se somete a
las rondas normales de los pasos de desnaturalizacin, de
alineamiento y extensin de una reaccin de amplificacin.
A diferencia de una amplificacin normal del DNA, que utiliza dos cebadores para amplificar en forma exponencial la
534
CAP. 55
Figura 55-4 Secuenciacin de ciclo de la terminacin de cadena. En una combinacin del mtodo Sanger, terminacin de cadena,
y del proceso de PCR, el DNA original sirve como una plantilla para una reaccin lineal de la PCR. En cada una de las 25 rondas del
ciclo de PCR, una escalera de fragmentos terminados marcados con colorante se produce a partir de las plantillas. Despus del paso de
extensin, la desnaturalizacin subsiguiente entonces permite que las mismas molculas de DNA sirvan otra vez como una plantilla para
la produccin de ms productos marcados con colorante.
plantilla, la secuenciacin de ciclo utiliza un cebador slo

para amplificar de manera lineal los productos de extensin.
Debido al ciclado repetido de la reaccin, menos plantilla se
requiere para la secuenciacin de ciclo que para los mtodos dideoxi ms viejos. Adems, desnaturalizando la plantilla de cadena doble antes de cada paso de alineamiento del
iniciador durante la ronda de temperatura cclica, se elimina
la necesidad de preparar plantillas de una sola cadena para la
secuenciacin del DNA. Las plantillas de doble cadena tienen la ventaja de permitir la secuenciacin de ambas hebras
de DNA. Este acercamiento de secuenciacin es tambin
mucho ms favorable a la automatizacin que los acercamientos de secuenciacin tradicionales.
Secuenciacin automatizada
El rendimiento de la tecnologa de secuenciacin era el
principal paso limitante de la velocidad en los proyectos de
secuenciacin a gran escala, como el Proyecto del Genoma
Humano. El avance ms significativo en las tecnologas de
secuenciacin del DNA es la automatizacin de la tcnica.
Esto parte de tres reas principales, como se menciona antes: las mejoras en las qumicas del fluorforo, el descubrimiento de cada vez ms polimerasas termoestables y el
desarrollo de la tcnica de PCR. Al principio de la secuenciacin de los cidos nucleicos, slo existan los marcadores
radioisotpicos como el nico mtodo para la deteccin de
los fragmentos; estos fragmentos marcados se separaban por
geles de acrilamida y las bandas isotpicas se visualizaban

despus de la autorradiografa. Cuatro reacciones, A, C, G y
T, se requeran por cada plantilla y las reacciones se cargaban
en carriles adyacentes en el gel. Despus de la separacin
y de la autorradiografa, la secuencia se determinaba por la
lectura del patrn de banda desde el fondo hasta la parte
superior de la autorradiografa, representando los fragmentos
de la longitud cada vez mayor hasta que el poder de resolucin del gel llega a ser el limitante. El requisito para utilizar
cuatro carriles para cada reaccin de la plantilla se converta
en una limitacin importante en el nmero de las muestras
que podan procesarse simultneamente en un gel, y los altos
niveles adicionales requeridos de la plantilla. La lectura manual de las autorradiografas, como en los das de la preautomatizacin dieron testimonio de que era un muy largo y
tedioso trabajo. La lectura manual es tambin muy propensa
al error humano, tanto en la interpretacin de los datos sobre
la pelcula de rayos X como en los errores en la transcripcin
de la secuencia sobre la autorradiografa para la secuencia en
una pieza de papel o mecanografiado directamente sobre una
computadora. En muchos casos las pelculas de radiografa
resultantes las leyeron dos personas para hacer la verificacin, y la secuencia del DNA fue requerida y comparada desde las reacciones realizadas en ambas hebras del DNA, dando
tanto la secuencia con sentido hacia adelante como la cadena
reversa para la comparacin.
Los mtodos automticos actuales son capaces de generar hasta 2 millones de bases al da, comparado con un mximo de 300 a 500 bases/da por electroforesis manual en gel
SECUENCIACIN AUTOMATIZADA
de poliacrilamida (PAGE). La qumica de secuenciacin, en

particular la metodologa Sanger por terminacin de cadena,
ha llegado a ser ms importante porque los requisitos de la
plantilla del DNA para las reacciones son menos demandantes. El desarrollo vital para la automatizacin del proceso de
secuenciacin surgi del uso de los colorantes fluorescentes
reporteros como molculas para la deteccin de la escalera
de secuenciacin. Junto con la excitacin lser de los colorantes, cuando emigran a travs del gel, y la deteccin ptica directa de los fragmentos fluorescentes en tiempo real,
la automatizacin completa de la adquisicin de datos lleg
a ser posible.
En este marco surgen dos estrategias principales de automatizacin para la separacin de los fragmentos del DNA;
la electroforesis en gel fino y la capilar en gel. La primera
generacin de secuenciadores automticos consisti de geles de poliacrilamida verticales largos corridos en un tanque de electroforesis con sistemas fluorescentes integrados
de deteccin. Los fragmentos marcados fluorescentemente
son excitados por un rayo lser, que pasa a travs de una
ventana estrecha en el fondo del gel de secuenciacin. Los
datos fluorescentes entonces se colectan y una imagen vir-
535
tual del gel se construye (fig. 55-5). Los tiempos de separacin en la electroforesis en gel pueden reducirse de manera
significativa si se utilizan voltajes ms altos y los geles ultrafinos se emplean como un medio de separacin.
La segunda, y en la actualidad la estrategia ms utilizada, que sustituye la secuenciacin basada en gel, utiliza tubos capilares finos llenos de polmero lquido. Los capilares
de paredes delgadas de dimetros y de longitudes variantes
permiten la separacin rpida de los fragmentos del DNA
marcados, reduciendo los periodos de separacin hasta por
un factor de 25 cuando se comparan con las tcnicas electroforticas estndar en gel. Los secuenciadores capilares
automticos funcionan de la siguiente manera: un conductor automtico de jeringuilla llena lentamente el capilar con
polmero, la bandeja automatizada de la muestra que contiene reacciones de secuenciacin mueve el capilar que est
sumergido en una muestra especfica en la bandeja, y una
alcuota pequea de la reaccin de secuenciacin se aspira
dentro del capilar. Una corriente entonces se aplica hasta
que todos los fragmentos del DNA se resuelven y pasan por
la ventana ptica del extremo del capilar. Un lser excita
los fragmentos marcados fluorescentemente y una cmara
Figura 55-5 Imagen virtual de un gel de secuenciacin. Esta imagen electrnica representa la escalera de secuenciacin fluorescente
de plantillas mltiples que fueron cargadas y separadas de manera simultnea en un instrumento de un carril, con cuatro colorantes.
536
CAP. 55
Figura 55-6 Electroferograma generado sobre un secuenciador capilar del DNA automatizado. Las cuatro bases del DNA estn codificadas con color, con picos que representan cada base. C, azul; A, verde; G, negro; y T, rojo.
CCD colecta los datos de la fluorescencia para su anlisis

subsiguiente (fig. 55-6). Entre las muestras, el capilar se rellena con polmero fresco antes de continuar el proceso para
la reaccin de secuenciacin siguiente.
Los secuenciadores capilares tienen un mayor rendimiento que los de gel plano y eliminan los pasos tediosos
de la preparacin y carga de gel. Los primeros secuenciadores capilares comerciales llegaron a estar disponibles a
principios del ao 2000. Un secuenciador actual tiene 96
capilares, que funcionan en paralelo para el anlisis de secuencia de alto rendimiento. Este sistema es capaz de analizar hasta 2 millones de bp del DNA en 24 horas.
Proyecto del Genoma Humano

Los avances principales en la tecnologa de secuenciacin en
la ltima dcada generaron la terminacin exitosa del Proyecto del Genoma Humano (HGP) en 2003, dos aos antes
de lo programado. Este proyecto representa uno de los principales logros en la historia de la ciencia. El esfuerzo internacional comenz formalmente en 1990 con 3 mil millones
de dlares, esfuerzo de 15 aos, para secuenciar 3 mil millones de pares de bases en el genoma humano. Es considerada
por muchos una de las empresas cientficas ms ambiciosas
de todos los tiempos, incluso se compara con el aterrizaje
sobre la Luna. En el 2001, antes de lo programado, el primer
proyecto del funcionamiento del genoma humano se public
en ediciones especiales de Science (Venter y cols., 2001) y
Nature (Lander y cols., 2001). Desde entonces, los investigadores trabajan para convertir este proyecto de la secuencia
en una terminada, o una con menos de un error por cada 10
000 bases y una contigidad alta.
El acercamiento de la secuenciacin que tom el Consorcio HGP fue adoptar un mtodo de secuenciacin basado en mapeo o escopetazo jerrquico (fig. 55-7). En
este acercamiento, el DNA genmico se fragmenta en
Figura 55-7 Acercamiento de la secuenciacin de escopetazo

jerrquico adoptada por el Consorcio HGP.
segmentos con gran traslape cercanos a 150 Mb y se insertan en un tipo especial de vector, llamado cromosoma
artificial bacteriano (BAC). Esto se logr por la digestin
parcial con enzimas de restriccin, con sitios comunes de
reconocimiento. Los vectores de BAC que se producen se
transforman dentro de E. coli para crear una biblioteca o
(almacn) de BAC. Los clones del BAC individuales son
completamente digeridos, usando enzimas adicionales de
la restriccin, para producir un patrn o una marca digital
nica. Las inserciones del BAC se aslan y mapean posteriormente para determinar el orden de cada fragmento
clonado. Una vez mapeados, los clones del BAC individuales se fragmentan de forma aleatoria en ms pequeos
(~ 2 000 bp de largo), que a su vez se clonaron dentro de un
vector del plsmido (clon de escopetazo) y secuenciados
sobre ambas hebras. Usando programas de computadora
avanzados, estas secuencias se alinean de tal forma que las
REAS QUE AVANZAN EN LA SECUENCIACIN DE LOS CIDOS NUCLEICOS
Figura 55-8 Acercamiento de la secuenciacin por escopetazo

del genoma completo adoptada por Celera Genomics.
idnticas se traslapan, y los fragmentos contiguos se ensamblan en la secuencia terminada, despus de que cada
hebra se ha secuenciado por lo menos cuatro veces.
La estrategia desarrollada por Celera Genomics, quien
inicia su bsqueda mucho antes que el Consorcio HGP, se
conoce como secuenciacin de escopetazo completo del genoma (fig. 55-8). sta involucra el corte aleatorio del DNA
genmico en fragmentos pequeos (2 000 a 10 000 bp de
largo), los cuales se clonan directo en los plsmidos y fueron secuenciados al azar sobre ambas hebras, eliminando la
etapa del BAC utilizada por el acercamiento HGP. El desafo con este acercamiento fue el ensamblaje de las secuencias. Celera puso en servicio superordenadores capaces de
manejar ms de 80 terabytes de datos y de realizar quinientos mil millones de comparaciones secuenciales requeridas
para el ensamblaje inicial. Las ventajas para Celera fue que
ya tena acceso a datos de la secuencia HGP, que aportaron
la secuencia de referencia para trabajar con ella.
La informacin que se tiene a partir de la secuencia del
genoma humano es enorme y algo de la ms relevante se
menciona enseguida. El genoma es ms heterogneo muy
lejos de lo que se buscaba al principio, y el nmero total
de genes humanos es menor de lo que se esperaba, con un
consenso actual cercano a 30 000 genes.
reas que avanzan en la secuenciacin

de los cidos nucleicos
La importancia de la secuencia humana del genoma no puede exagerarse; sin embargo, el genoma humano representa
slo una fuente de informacin que se requiere para aclarar
mecanismos biolgicos complejos. La comprensin de los
genomas de otros organismos debe desempear un papel
enorme en el entendimiento de los genes que causan enfer-
537
medades, sus mecanismos reguladores y la fisiopatologa de

las enfermedades. La secuenciacin reciente del genoma del
ratn, el modelo animal ms importante de la enfermedad
humana, tambin representa un logro significativo en el rea
genmica. En un futuro prximo, la secuenciacin a gran
escala continuar desempeando un papel enorme facilitando el progreso de la comprensin de los cientficos en los
procesos patolgicos. Tambin se estn realizando esfuerzos
para la resecuenciacin de los genomas. Al respecto, se requieren niveles ms altos de automatizacin, que permitan
a los investigadores realizar la preparacin de la muestra, la
secuenciacin y el anlisis de datos en la misma plataforma.
Aparte del requerimiento de sistemas muy automatizados,
otras aproximaciones secuenciales que actualmente estn en
prctica como mtodos alternativos de separacin y deteccin incluyen la espectrometra de masas de tiempo de vuelo
con desorcin/ionizacin por lser asistida por microarreglos
(MALDI-TOF-MS) y la secuenciacin por hibridacin o la
que est basada sobre el chip. Los avances en estas reas sirven para reducir el costo de la secuenciacin y para permitir
que los investigadores centren sus esfuerzos de secuenciacin
en las regiones funcionales ms importantes del genoma.
La secuenciacin por MALDI-TOF-MS es un mtodo
para la separacin de los fragmentos de DNA que se generan al usar la tcnica de Sanger. Los fragmentos de DNA se
mezclan con una matriz portadora, como el cido 3-hidroxipicolnico (Wu y cols., 1993), y se pintan sobre la superficie de desorcin del blanco (una placa de acero inoxidable).
Despus de que el material orgnico pequeo cristaliza, la
placa se coloca dentro de un espectrmetro de masas para el
anlisis. Un lser desorbe y ioniza los fragmentos de DNA,
mientras la aceleracin en un espectrmetro de masas permite la determinacin de la longitud del fragmento mediante la
deteccin del tiempo de vuelo. Las ventajas al usar este tipo
de tcnica incluyen mayor velocidad de secuenciacin y la
secuenciacin de fragmentos ms cortos de DNA. Tambin
es una tcnica de libre marcacin, as que el costo es considerablemente ms bajo que el de las tecnologas de secuenciacin existentes. Con el descubrimiento rpido de genes
nuevos y de mutaciones relacionadas con la enfermedad, la
espectrometra de masas podra ser una herramienta valiosa
y econmica para aplicaciones de resecuenciacin para complementar las tecnologas de secuenciacin existentes.
La otra estrategia que est surgiendo es la secuenciacin
por hibridacin o la secuenciacin basada en el chip. sta
puede realizarse inmovilizando varios miles de fragmentos
cortos de DNA de secuencias conocidas (oligonucletidos)
en una superficie de cristal o de silicn en sitios definidos.
El DNA blanco cuya secuencia ser determinada se marca
fluorescentemente y despus se hibrida en el chip. La secuencia del blanco se deduce a partir del subconjunto de
sondas oligonucleotdicas que se han unido al DNA blanco.
538
CAP. 55
Uno de los contratiempos principales con este acercamiento para la generacin de un chip secuenciador universal es
que el nmero total de variantes combinatorias para un oligonucletido 15 bp de longitud requerido para representar
el genoma entero es demasiado grande para colocarse sobre un solo chip de DNA, el cual en la actualidad es capaz
de sostener cerca de 400 000 oligonucletidos (Fedrigo y
cols., 2004). No obstante, este acercamiento puede ser til
para resecuenciar experimentos o para secuenciar genes individuales con puntos mutantes recientes.
Para concluir, los avances en tecnologas de secuenciacin y anlisis del DNA, a travs de la automatizacin y la
integracin con otras tecnologas relacionadas, continuarn
revolucionando la investigacin biolgica.
Referencias
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Howe CJ, Ward ES (eds). Nucleic Acids Sequencing 1992: IRL
Press, Oxford.
ndice alfabtico
A
absorcin de la luz, 395-7
actividad del agua, 132
adenovirus, 185
Affymetrix GeneChips, 515-17
aglutinacin
ltex, 199
partculas, 199
agregacin plaquetaria inducida por la
ristocetina, 283-4
alanina aminotransferasa, 419-20
aminocidos, cromatografa, 430, 432
amplificacin
16S rRNA, 155
basada en la secuencia del cido
nucleico, 218-19
mediada por transcripcin, 218
por desplazamiento de la cadena,
219
seal de la tiramina, 39
anaerobios, 143-4
anlisis
endonucleasa de restriccin, 286-7
gen por TaqMan PCR, 495-504
secuencia, 531-8
automatizado, 534-5
factor de von Willebrand, 286-7
hibridacin basada en el chip,
537
MALDI-TOF-MS, 537
mtodo dideoxi, 532-4
qumico, 532
tipificacin HLA, 485-6
virologa, 220
analizadores de cuidado crtico, 392-3
anemia
de clulas falciformes, 326
hemolticas, 255, 257
leucoeritroblsticas, 258
megaloblsticas, 254-5
por deficiencia de hierro, 257
anticuerpos
de inclusin, 175
monoclonales, 40-1
policlonales, 40-1
antitrombina III, 340
aplicaciones, 48-54
aspiracin, 97
astrovirus, 185
AutoPix, 490
avidez del anticuerpo, 202
avidina-biotina, 38-9
B
bacilos, 141
cido alcohol-resistentes, 23
aerobios gramnegativos, 142-3
grampositivos, 141
BacT/Alert, 146, 149
bacteriologa
colorantes, 23, 125-8
cultivo, 129-34
identificacin, 135-44
mtodos moleculares, 136, 139-40,
151-7
microscopia, 123-8, 135
pruebas automatizadas, 145-50
bandeo
con quinacrina, (Q) 347-8
DA-DAPI, 350
Giemsa (G), 346-7
heterocromatina constitutiva (C),
348-9
replicacin, 350-2
reverso (R), 348
basfilos, 249, 462
bioterrorismo, 187-8
C
cambios maligos relacionados, 78-9
cncer
citogentica, 360-2, 525
pecho, clasificacin, 77
captura hbrida, 219
carbohidrato
colorantes, 22-3
cromatografa en capa fina, 430

cromatografa lquida de alta
resolucin, 433
metabolismo bacteriano, 138
clulas
asesinas naturales, 461
blancas, 249, 268-70
desgastadas, 96
exfoliadas, 95-6
multinucleadas gigantes, 175
plasmticas, 261
citologa
automatizacin, 119
basada en lquido, 99, 101-3, 118
citodiagnstico, 104-5
citomorfologa, 105-12
colorantes, 103-4
concentracin celular, 99
exactitud y limitaciones, 112-13
fijacin, 99
tipos de espcimen, 95-8
citometra de flujo
hematologa, 303-7
immunologa celular, 231-2, 455-6
plaquetas, 292-3, 307
proliferacin, 87
citoplasma
citologa, 107-9
tincin, 24-5
clasificacin de Lancefield, 138
clonalidad, 308-9
Clostridium spp.,141
cobalamina, 313-17
cociente
internacional normalizado, 334-5
probabilidad, 370
cocos
gramnegativos, 141
grampositivos ,140-1
colorantes, 18-19, 230
amiloideos, 24
fluorescentes, 18-19
para elastina, 22
para fibrina, 24
para lpidos, 24
540
colorantes (continuacin)
Romanowsky, 20, 247
van Gieson, 21
complejos inmunes
agentes ligadores, 163
antgeno-especficos, 162-3
ataque a membrana, 448-9
ensayos, 465-7
principales de histocompatibilidad
(MHC), 481, 482
complemento, 447-53
APH50, 450
CH50, 450
ensayos
especmenes, 449
fijacin, 160, 199-200
hemolticos, 450-2
inmunoqumicos, 449-50
productos de activacin, 449, 452-3
protenas de control, 452
comprobacin en el punto de cuidado,
392-3
concentracin celular, 99
congelar-fracturar/congelar-grabado, 59
control anticoagulante, 334-5
Corynebacteria spp., 141
creatina cinasa, 436
creatinina
electrodo, 392
reactivos secos, 420
crioglobulinemia, 477-80
cromatografa, 163-4, 429
capa fina, 429-30
gas, 433-4
lquida de alta resolucin, 227-8,
431-3
microcolumna, 275-7
cromosoma
bandeo y anlisis, 345-55
Filadelfia, 308
pintura, 358-9
cuenta mittica, 83-4
cultivo
bacteriologa, 129-34
micologa, 235-6
parasitologa, 241-2
virologa, 191-6
D
datos bioqumicos, 365-71
NDICE ALFABTICO
deficiencia
de G6PD, 328
piruvato cinasa, 328
densitometra, 73-4
descalcificacin, 7
desrdenes linfoproliferativos
crnicos, 305-7
detectores electroqumicos, 390
Dextrostix, 419
dicromato de potasio, 6
diferencias crticas, 369
difraccin electrnica, 59
DNA de cadena ramificada 219
E
efecto citoptico, 179, 193-4
efecto de gancho por dosis alta, 380
electrodos
amperomtricos, 388-9
dixido de carbono (pCO2), 390-1
ion-selectivos, 381-94
lactato, 391
oxgeno (pO2), 388, 389
urea, 391
electroforesis, 274-5, 434-6, 440-1
capilar, 436
elementos traza, 413-14
lite de Mastascan, 139, 147-8
elucin, 300
enfermedad
falciforme, 327
HbC, 327
HbSC, 327
hemoltica del recin nacido, 330
Hirschsprung, 33
residual mnima, 309-10
srica, 467-8
ensayo
5nucleasa, 496-8
APH50, 450
CH50, 450
citotxico, 2 31
Crithidia, 473
D-dmero, 339
factor, 339-40
Farr, 473, 474
enterococos, 141
enzimas, 27-34, 137-8
eosinfilos, 25, 249
epidemiologa, 156
eritrocitos, 247-9
cuerpos de inclusin, 278
mediciones, 265-8
eritroleucemia, 257
eritropoyesis, 254
esferocitosis, hereditaria, 327
espectrofluormetros, 401
espectrofotmetros, 395-7
espectrometra
absorcin atmica, 406, 407-11
atmica analtica, 405-15
emisin atmica 406, 411-12
fluorescencia atmica, 406, 412
masas, 140
masas inorgnicas, 407, 412-13
espiroquetas, 24
esputo, 127
estados
aplsicos, 257
hipoplsicos, 257
estafilococos, 141
esteroides, 434
estreptococos, 141
exploracin cervical, 77-8, 113-19
F
factor de von Willebrand, 281-7
frmacos adictivos, 422-3, 430, 432-3,
434
fenotipo de la cromatina, 78-9
feocromocitoma, 432
ferritina, 318, 320
fibringeno, 338-9
fibrinlisis, 340
fijacin en alcohol, 6-7
fluorescencia, 241, 399-401
rayos X, 407, 412
fluormetros, 400-1
folato, 313-17
formaldehdo, 6
fosfatasa alcalina, 38
fotmetros, 395-7
fototipificacin, 484
frotis, 99
vaginales, 128
G
glucosa
electrodos, 389-90
541
NDICE ALFABTICO
glucmetros, 392
reactivos secos, 419
glutaraldehdo, 6
gonadotropina corinica humana,
421-2
grnulos
celulares de Paneth, 25
clulas mastoides, 24-5
grosor del melanoma, 76
H
hemaglutinacin, 198
hemanticos, 313-22
hematoxilina
alumbre, 19
fosfotngstica cida (PTAH), 19, 21
hierro, 19
hemoglobina
cromatografa lquida de alta
resolucin, 227-8, 433
electroforesis, 436
inestable, 278
medicin, 265
hemoglobinopatas, 273-9, 310
hemlisis, 323-32
inmunitaria, 328-30
hemostasis, 333-41
hepatitis, 186
hibridacin, 358
cromosoma Filadelfia, 308
genmica comparada, 523-9
in situ fluorescente (FISH), 354-5,
357-62
oligonucletido especfico del alelo,
287
sondas, 357-8
hierro, 317-21
hiperplasia/carcinoma endometrial, 77
histoqumica ultraestructural, 58
hongos, 24, 233-8
hueso
biopsia, 76
descalcificacin, 7
secciones sin descalcificar, 14
I
iluminacin
campo brillante, 63
Khler, 63
impregnacin con plata, 21
ndice
actividad mittica, 83-4
marcado con timidina, 86-7
marcaje por bromodeoxiuridina,
86-7
infeccin animal, 242
inhibicin de la hemaglutinacin, 198
inmunoabsorbente ligado a enzimas
(ELISA)
anticuerpos, 161-2
complejos inmunitarios antgenoespecficos, 163
dsDNA, 473-4
procesadores automatizados, 207-8,
209
protena, 444-6
virologa, 200-1
inmunodeficiencia, 457-8
inmunodifusin radial, 440, 443-4
inmunoelectroforesis, 442-3
contracorriente, 442
inmunoensayos, 373-80
competitivos/no competitivos, 373
control de calidad, 378-9
en lnea, 202
homogneos, 376
marcadores, 375-6
mtodos de separacin, 376-7
miniaturizacin, 377
inmunoflourescencia, 126, 177-8, 202
inmunohistoqumica, 35-42
cuantitativa, 79-80
proliferacin, 85-6
sistemas reporteros, 37-9
inmunologa celular, 231-2, 455-63
inmunomtrico, 373-4
inmunotransferencia, 227, 472
intervalos de referencia, 367-9
isoelectroenfoque, 275
isoenzimas, 436
K
Koch, R., 129
L
LCM de Arcturus, 489-91
Leica AS LMD, 493

leucemia
linfoblstica aguda, 261, 305
linfoctica crnica, 262
mieloide aguda, 258-9, 304-5
mieloide crnica, 259
leyes
Beer, 396-7
Lambert, 397
lmites de accin, 369
linfocitos, 249, 261
B, 461
subgrupos, 456-9
T, 459-61
linfomas, 262
lquido cefalorraqudeo, 124
Listeria monocytogenes, 141
luminiscencia, 399-403
luminmetros, 401 -2
lupus eritematoso sistmico, 468-77
anticuerpo antinuclear, 469
anti-dsDNA, 473-4
antgenos nucleares extractables,
469-72
ndices de actividad de la enfermedad,
476
neuropsiquitrico, 475-6
sndrome antifosfolpido, 474-5
M
malignidades linfoides, 458
manejo del tejido, 47-8
marcadores de la coagulacin, 340
Matriz de Matrices de Illumina, 519
matriz de Vysis GenosensorTM, 525,
527-8
mediciones
espaciales nucleares, 74-5
HbF, 277
interactivas auxiliadas por
computadora, 70
mdula sea, 249-51
megacariocitos, 260-1
megacariopoyesis, 258
membranas ion-selectivas, 385-6
metacromasia, 18
mtodos
cuantitativos, 69-81
diazo, 30-1
moleculares
542
mtodos, moleculares (continuacin)

amplificacin, 152-3, 213-20
bacteriologa, 136, 139-40, 151-7
hematologa, 307-10
hemoglobinopatas, 278-9, 310
parasitologa, 243
tipificacin HEA, 483-6
virologa, 213-23
Ouchterlony, 440, 441
micobacterias, 149-50
micologa, 24, 233-8
microanlisis de rayos X, 59
microangiopatas, 330-2
microarreglos
Affymetrix GeneChips, 515-17
bacteriologa, 155
doble color, 520
hibridacin genmica comparativa,
525-8
matriz de MatricesTM de IIlumina,
519
matriz de Vysis GenosensorTM, 525,
527-8
MWG, 520
perfil de SNP, 517
sistema expresin con matriz de
Applied Biosystems, 517-19
sistema MIAME, 521
SpectralChip, 525-6
microbiologa cuntica, 134
micrococos, 141
microdiseccin
microrrayo lser, 492-3
por lser y captura, 489-93
microfotografa, 66
microorganismos
colorantes, 23-4
microscopia electrnica, 51
microrrayo PALM, 492-3
microscopia
campo oscuro, 65, 125
confocal, 66
contraste de fase, 65
contraste diferencial de
interferencia de Nomarski, 66
de luz, 61-7
bacteriologa, 123-8, 135
hongos, 234-5
parasitologa, 239-40
polarizada, 65-6
virologa, 175-80
electrnica, 43-60
NDICE ALFABTICO
electrnica de barrido, 54-5, 182

fluorescente, 63-4, 123
inmunoelectrnica, 57-8
microtoma, 11-13
mielomas, 262
mielopoyesis, 258
minerales, 413-14
monitoreo
HIV, 456-7
SIDA, 456-7
monocitos, 249
muestras
bioqumicas, 366-7
histopatolgicas, 3-15
fijacin, 5-6
inclusin, 9
procesamiento del tejido, 7-1 1
recepcin y manejo, 4-5
sistemas de control, 4
msculo
biopsia, 76-7
colorantes, 21-2
enzimas, 31-3
N
nefelometra, 397-9, 444
neuroblastoma, 432
neutralizacin, 200
neutrfilos, 249, 461-2
norovirus, 185-6
O
orina
microscopia, 124-5
tamizaje automatizado, 148-9
urinlisis, 422-3
virus, 187
oro-plata, 38
P
parasitologa, 239-44
parvovirus BI9, 186
PCR en la clula, 505-13
perfil del polimorfismo de un solo
nucletido, 517
peroxidasa del rbano, 37-8
pigmentos, 23
PixCell, 490
plaquetas, 249, 260-1, 289-93
adhesin, 291
agregacin, 291-2
anticuerpos, 291
citometra de flujo, 292-3, 307
conteo, 270-1, 290-1
liberacin, 292
PFA-100, 292
polarografa, 388-9
policitemia, 257
polietilenglicol, 163
polimorfismo en la longitud del
fragmento de restriccin, 483-4
porfirinas, 432
portaobjetos digital, 80-1
potasio, 420-1
principios, 44-8
priones, 225-8
procesador de manejo lquido, 207
proliferacin, 83-92, 231, 459-60
protenas
C, 340
electroforesis, 435-6, 440-1
ensayos, 439-46
ensayos de sntesis, 230
metabolismo bacteriano, 138
S, 340
protoporfirina zinc, 318-19, 320-1
proyeccin de imagen digital, 70-2
Proyecto del Genoma Humano, 536-7
pruebas
aglutinacin, 160
aglutinacin con partcula de
gelatina, 199
anticuerpos, 135-6, 159-62, 297300
anticuerpos fluorescentes, 161
antgenos, 135-6, 138, 162
catalasa, 137
coagulasa, 138
Coombs directa, 328
Elek, 139
embarazo, 421 -2
estabilidad al isopropanol, 278
indirecta de antiglobulina, 298
inestabilidad al calor, 278
optocina, 138
oxidasa, 137-8
precipitacin, 160
respiracin, 164
543
NDICE ALFABTICO
sensibilidad, 168-9
susceptibilidad, 138, 146-8, 149-50,
228-31
ureasa, 138
pus, 127-8
Q
qumica del reactivo seco, 417-27
quimioluminiscencia, 401-3
quimioterapia antimicrobiana
control, 165-71
resistencia, 155-6
R
radioinmunoensayos, 162, 202
rangos normales, 367-9
reaccin
cido perydico de Schiff (PAS), 22
en cadena de la ligasa, 219-20
en cadena de la polimerasa, (PCR)
automatizacin, 217
clonalidad de la clula B, 308-9
en clula, 505-13
hemoglobinopatas, 278-9
identificacin bacteriana, 136
TaqMan, 495-504
tiempo real, 216-17, 495-6
virologa, 213-17
electroqumica, 386, 388-9
receptor de transferrina, 318, 319, 321
reduccin de placa, 228-30
reestructuracin del gen receptor de la
clula, T 309
regin organizadora nucleolar, 84-5,
349-50
reporteros fluorescentes, 37
resistencia antibitica, 166
rotavirus, 185
S
sales de tetrazolio, 31
sangre
agrupamiento, 295-7
compatibilidad cruzada, 300
contadores celulares, 265-71
frotis, 247
morfologa, 247-9
servicio de transfusin hospitalario,
295-301
sistemas de cultivo, 145-6
transfusin incompatible, 330
cortes histolgicos, 14-15, 48, 181-2
cera de parafina, 13
de macrobloques, 13
secciones congeladas, 13-14
secuenciacin de DNA, vase anlisis
secuencial
segmentacin automtica de la
imagen, 72-3
sensibilidad al metronidazol, 138
Sensititre ARIS, 147
serologa
fngica, 237-8
parasitologa, 243
virus, 197-205
serotonina, 432
sndromes
antifosfolpidos, 474-5
mielodisplsicos, 257, 260
sistemas
API, 139
BACTEC, 146, 147, 149-50
expresin con matriz de Applied
Biosystems, 517-19
MIAME, 521
Phoenix, 139, 147
rhesus, 296
Vitek, 139, 147
sntesis de DNA, 230
solubilidad falciforme, 275
SpectralChip, 525-6
susceptibilidad antivrica, 228-31
T
talasemias, 274, 327
tcnicas
especializadas, 54-9
fijacin, 5-6, 99
Mancini, 440, 443-4
Maxam-Gilbert, 532
Sanger, 532-4
separacin, 429-36
terminacin de cadena, 532-4
tetrxido de osmio, 6
textura, 73-4
tiempo
parcial tromboplastina activada,
335, 337
protrombina, 333-5
reptilasa, 338
sangrado, 291
trombina, 337-8
tinciones, 17-25, 103-4, 125-8, 181,
247
Gram, 125
hematoxilina, 19-20
hematoxilina y eosina (H&E),
20
Ziehl-Neelsen, 23, 126
tipificacin, 156
H , 138
HLA, 481-6
O, 138
tira de Fuji, 419
tricromos, 21
trombocitopenia, 260
trombocitosis, 261
tromboelastograma, 293
troponina T, 422
turbidimetra 397-9, 444
U
UF*100, 149
unin VWF/FVIII, 284-5
V
valores
blanco, 369
corte, 369
VDRL, 199
virologa, 181-9
colorantes, 23-4
crecimiento del virus, 193-6
cultivo, 191-6
diagnstico rpido, 176-7
inmunidad mediada por la clula,
231-2
mtodos moleculares, 213-23
microscopia de luz, 175-80
microscopia electrnica,
181-9
muestras, 176
544
virologa (continuacin)
pruebas automatizadas, 207-12
serologa, 197-205
susceptibilidad antivrica,
228-31
virus que emergen nuevamente,
188
viruela, 187-8
vitamina B12, 313-17
NDICE ALFABTICO
W
western blot, 202
X
xenodiagnstico, 242-3

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