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ORIGEN
DESCUBIERTA EN RUSIA EN EL
AO DE 1903 POR EL BOTNICO
MICHAEL TSWETT QUIEN SEPAR
PIGMENTOS DE PLANTAS EN
COLUMNAS DE XIDO DE CALCIO
UTILIZ EL TRMINO
CROMATOGRAFA (color-grfico)
DERIVADO DEL GRIEGO COLORCROMO Y ESCRITO-GRFICO
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
INTRODUCCION
LA HPLC O CROMATOGRAFA
LQUIDA DE ALTA
PERFORMANCE HA TENIDO UNA
CRECIENTE DIFUSIN DESDE
COMIENZOS DE LA DCADA DEL
70.
CROMATOGRAFIA
DEFINICIN
SEGN IUPAC
LA CROMATOGRAFA ES UN
MTODO FSICO DE SEPARACIN
EN EL CUAL LOS COMPONENTES A
SER
SEPARADOS
SON
DISTRUIBUIDOS ENTRE DOS FASES
UNA DE ELLAS ES ESTACIONARIA,
MIENTRAS LA OTRA SE MUEVE EN
UNA DIRECCIN DEFINIDA.
CROMATOGRAFIA
FASE MOVIL
MUESTRA
SEPARACIN
A+B+C
CROMATOGRFICA
FASE
ESTACIONARIA
SEPARACION
DE
COMPONENTES
MOVIMIENTO
DE LA FASE MOVIL
CROMATOGRAMA,
CONCENTRACION,
PERFIL DE BANDA
C
B
A
COMPONENTES
ELUIDOS
DETECTOR
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
INSTRUMENTACION
BOMBA
AUTOMUESTREADOR/
INYECTOR
COLUMNA
RESERVORIOS
DETECTOR
GUARDA
COMPUTADORA
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
RESERVORIO DE LA FASE MOVIL
El RESERVORIO ES EL RECIPIENTE
QUE CONTIENE LA FASE MVIL.
RESERVORIOS DE
VIDRIO CERRADO
DE 1, 2 5 L.
PRESURIZADO CON
HELIO COMO
DEGASIFICADOR
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
FILTRADO DE FASE MOVIL
FILTRADO
SE PUEDE CONSIDERAR COMO PARTE DE
UN TRATAMIENTO PREVENTIVO PARA CUIDAR
EL ADECUADO FUNCIONAMIENTO DEL
EQUIPO DE HPLC
LAS PARTCULAS PRESENTES PUEDEN :
1.- BLOQUEAR LOS FILTROS Y TUBERAS
2.- ACELERAR EL DESGASTE DE SELLOS Y
ROTORES DEL INYECTOR
3.- AFECTAR EL NORMAL MOVIMIENTO DE
LAS VLVULAS DE ENTRADA Y DE SALIDA DE
LAS BOMBAS
TODAS LAS BOMBAS PARA HPLC DEBEN TENER
UN FILTRO EN LNEA DE 0.5-MM
Fase Mvil
Las fases mviles HPLC son usualmente una mezcla de uno o ms
solventes con las siguientes caractersticas:
Propiedades Fsicas Deseables
Alta pureza, bajo costo, transparencia UV, no corrosivo, baja
viscosidad, baja toxicidad, no inflamable, solubilidad de la
muestra
Resistencia
La resistencia est relacionada con la polaridad del solvente; agua
es un solvente fuerte en una fase normal pero dbil en una fase
reversa
La resistencia de solventes en una fase normal est caracterizada
por la escala de Hildebrand (Eo)
Selectividad
Depende del momento dipolar, dipolo inducido enlaces de
hidrgeno y caractersticas dispersivas de los solventes
Los solventes sern filtrados y desgasificarse antes de ser utilizados
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
MEMBRANA
ACUOSO
ACUOSO/ORGANICO
ORGANICO
CELULOSA REGENERADA
ESTER DE CELULOSA
NR
NR
NITRATO DE CELULOSA
NR
CLORURO DE POLIVILIDENO
NYLON
POLITETRAFLUORETILENO
(PTFE)
NR
NR
TEFLON
NR
NR
R = RECOMENDABLE
NR = NO RECOMENDABLE
Fuerza del
Solvente (o)
0.01
bp
(oC)
69
Viscocidad
(cP)
0.31
UV cut off
(nm)
190
Indice de
Refraccin
1.37
Tolueno
0.29
78
0.59
285
1.49
Diclorometano
0.42
40
0.44
233
1.42
Tetrahidrofura
no
Acetonitrilo
0.57
66
0.55
212
1.41
0.65
82
0.30
190
1.34
2-Propanol
0.82
82
2.30
205
1.38
Metanol
0.95
65
0.54
205
1.33
Agua
Large
100
1.00
<190
1.33
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DESGASIFICADO DE FASE MOVIL
DESGASIFICADO
DESGASIFICAR LA FASE MVIL ES
IMPORTANTE PARA LA EXACTITUD DEL
MEZCLADO DE SOLVENTES DE LA BOMBA
LOS GASES DISUELTOS EN LA FASE MVIL
PUEDEN PRODUCIR :
1.- LIBERACIN DE BURBUJAS EN EL CABEZAL
DE LA BOMBA
2.- LIBERACIN O FORMACIN DE BURBUJAS
EN LA CELDA DEL DETECTOR
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HPLC
DESGASIFICACION EN LINEA
EXTRACCION DE GASES DISUELTOS
POR MEDIO DE MEBRANA PERMEABLE
Y BOMBA DE VACIO
DE 3 CANALES PARA BOMBA BINARIA
DE 5 CANALES PARA BOMBA
CUATERNARIA
LINEA EXTRA PARA DESGASIFICAR
SOLVENTE DE LAVADO DE
AUTOMUESTREADOR
C IENTIFICA
A NDINA S.A.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
TUBERIAS
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
UNIONES
HPLC
1/16 FERRULES
1/16 TUERCA
C IENTIFICA
A NDINA S.A.
- UNIONES CONVENCIONALES
- UNIONES UNIVERSALES
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
UNIONES
HPLC
1/16 FERRULE
CARACTERISTICAS
1/16 NUT
1/16 O.D. TUBING
C IENTIFICA
A NDINA S.A.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
UNIONES
HPLC
X
1
ESQUEMA
DE UNION
MACHO-HEMBRA
ESQUEMA
DE UNION
DE VOLUMEN
MUERTO CERO
ESQUEMA
DE UNIONES
CON DEFECTO
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HORNO SERIES 200
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
BOMBA
PURGA
CON LA
JERINGA
PUERTA DE
ACCESO
Bombas Reciprocantes
Esquema
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
Absorbancia
Peak
4
5
6
7
8
11
Compound
% Standard Deviation
No. of
ts
Area
Runs
Benzene
0.05
Toluene
0.05
Ethylbenzene
0.04
Isopropylbenzene0.05
t-butylbenzene 0.05
Dioctylphthalate 0.06
0.25
0.31
0.22
0.27
0.24
0.22
30
30
30
30
30
30
Tiempo (min)
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
INYECTORES
EL INYECTOR,
ES EL DISPOSITIVO
QUE PERMITE
INTRODUCIR LA
MUESTRA EN SOLUCIN,
SIN INTERRUMPIR
EL CAUDAL DE
SOLVENTE A TRAVS DEL
SISTEMA.
* EN LA VISTA EL INYECTOR
RHEODYNE 7725i CON LAZO
DE 6 uL
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
INYECTORES
CARACTERISTICAS :
DEBE SER FCIL DE OPERAR.
DEBE SER INERTE AL ATAQUE
QUMICO Y SOPORTAR ALTAS
PRESIONES.
Automuestreador
Esquema
Sample
Needle
Assembly
Injector
Valve
Assembly
To Flush
Solvent
Sampling
Pump or
Syringe
Flush
Port
Sample Vials
in Tray
Combinatoria 2x96
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
SISTEMAS DE GRADIENTES
DE SOLVENTES.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
SISTEMAS DE GRADIENTES
GRADIENTE DE SOLVENTES
ES COMPARABLE A LA PROGRAMACIN DE
TEMPERATURAS EN CROMATOGRAFA
GASEOSA. EN GC SE VARIA LA TEMPERATURA EN
FUNCIN DEL TIEMPO. EN HPLC SE VARIA LA
COMPOSICION DE LA FASE MVIL,
COMENZANDO LA ELUCIN CON UN SOLVENTE
DBIL Y AUMENTANDO PROGRESIVAMENTE LA
PROPORCIN DEL COMPONENTE FUERTE.
ESTA VARIACIN PUEDE SEGUIR UN PERFIL
LINEAL, CONCAVO, CONVEXO O UNA MEZCLA
DE ESTOS PERFILES EN UN MISMO
CROMATOGRAMA.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
SISTEMAS DE GRADIENTES
1
1 2
4 5
3
10
1
20
min.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
3
6
10
10
20
20
min.
OPTIMIZACIN DE LA SEPARACIN DE UN
SISTEMA DE HPLC (METANOL/THF/AGUA)
25% THF /
17% methanol / water
2
min.
ALCOHOL BENCILICO
FENOL
3-FENILPROPANOL
2,4-DIMETILFENOL
BENCENO
DIETILFTALATO
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DETECTORES
MUESTRA A LA SALIDA DE LA
COLUMNA CROMATOGRFICA.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DETECTORES
CARACTERISTICAS :
TENER UN AMPLIO RANGO DINMICO DE
RESPUESTA.
POSEER UNA RESPUESTA LINEAL.
NO CONTRIBUIR AL ENSANCHAMIENTO DE
BANDA EXTRACOLUMNAR.
RESPONDER A TODOS LOS SOLUTOS.
TENER LA SENSIBILIDAD APROPIADA.
POSEER UNA BUENA RELACION
SEAL/RUIDO.
NO DESTRUIR LA MUESTRA.
DETECTOR UV/Vis
Caractersticas
de un detector UV/VIS
Un detector UV/Vis consiste tpicamente de:
Una fuente de deuterio (190 - 600 nm)
Un monocromador que incluye una rejilla de difraccin movible
controlado por un motor paso a paso, para seleccionar cierta longitud
de onda atravez de una abertura (slit ) de salida hacia una celda de
flujo ( de 8 a 12 ul)
Dos fotodiodos miden las intensidades de los haces de luz de
muestra y referencia
El principio del detector de absorvancia es la Ley de Beer
Absorvancia = absorvitibidad molar x paso de luz x concentracin
A = e b c = - Log I / I0 ,,
I0 = Intensidad de luz inicial
Es el detector ms comn usado en HPLC deteccin en el orden de ng
Son importantes el ruido(noise)/deriva (drift) para la sensibilidad
DETECTOR DE
FLUORESCENCIA
Un compuesto fluorescente
absorve un fotn (ej., p - p *
transicin electrnica) y emite un
foton a otra longitud de onda
ms larga
Los tipos de detectores de
fluorescencia son:
Filtro/filtro
Filtro/monocromador
Doble monocromador
Programable
Fluorecencia is 100-1000 veces
ms sensible que un detector de
absorvancia (pg de deteccion)
Detector de Fluorescencia
Sensibilidad (pg-fg) y selectividad
Muy usado en aplicaciones de medio
ambiente, farmacutica, alimentos y
biomdica.
Aplicable a compuestos con fluorescencia
natural o analitos derivatizados (pre- o postcolumna) con reactivo derivatizante (OPA)
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DERIVATIZACION
OH
COOH
-H2O
OH
+ R-CH
NH2
Ninhidrina
O-
N
O
Producto Azul
- Aminocido
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DETECTORES GENERALES
FRESNEL
DEFLEXIN
INTERFEROMTRICO
DETECTOR DE
ARREGLO DE DIODOS
Lmpara de
Deuterio
Rejilla de
Difraccin
Slit
Fuente
Halgena
de
Espejo
Arreglo de
Diodos
Celda de
Flujo
Tungsteno
Espejo
Espejo
TurboScan200
TurboScan200
Almacena
Pureza de Pico
Relacin de Absorbancia
Mxima Longitud de Onda
Confirmacin Espectral Estndar
Confirmacin Espectral con Bibliotecas
Bsqueda de Picos en Bibliotecas
Archivo de resultados en Turbochrom para su
inclusin en los reportes
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
EL DETECTOR DE ARRANJO
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DISPLAY ALL 3 SPECTRA
EL PROBLEMA:
ES ESTE PICO
PURO?
NO!
NO ES
, PURO
a
c
SOLVENTE
GRADO DE
ADMISION UV
n-HEXANE
CARBONTETRACHLORIDE
BENZENO
CLOROFORMO
METHYLENE CHLORIDE
ACETONE
ACETONITRILE
MATANOL
AGUA
200
250
NANOMETROS
300
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
NOMENCLATURA Y CALCULO
CROMATOGRAMA
LINEA BASE
TIEMPO DE RETENCION (TR)
ANCHO DE PICOS
FACTOR DE CAPACIDAD (K)
FACTOR DE SEPARACION ()
RESOLUCION DE PICO (R)
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
EL CROMATOGRAMA COMIENZA EN EL
MOMENTO QUE LA SOLUCION EN ENSAYO ES
INYECTADA.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
LINEA DE BASE
TIEMPO
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
Tr = tr - to
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
tr
N = 16
2
tr
= 5.54
Wb
W1/2
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
NUMERO DE PLATOS TEORICOS (N)
t
Pico de Soluto
no retenido
Wh
TIEMPO
N = 5.545 (1/Wh)2 BP or
N = 16 (1/Wb)2 USP
Wb
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
L
H=
N
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
K=
Conc. del soluto en f. movil
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
FACTOR DE CAPACIDAD, RAZON DE CAPACIDAD - kLA RAZN ENTRE LA MASA DE SOLUTO EN FASE
ESTACIONARIA Y LA MASA DE SOLUTO EN FASE
MVIL EN CONDICIONES DE EQUILIBRIO. ES LA
RELACION ENTRE EL TIEMPO QUE UN SOLUTO
PERMANECE EN LA FASE ESTACIONARIA Y LA FASE
MVIL.
tr
k =
to
ESTA RELACIONADA CON EL COEFICIENTE DE
REPARTO :
k = K /
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
FACTOR DE CAPACIDAD, K
tR
tM
Picos de Soluto
no retenido
K =
tR -tM
tM
TIEMPO
tM = Tiempo de retencin del pico no retenido
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
tr2
tr1
k2
k1
k2
k1
( 1)
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
FACTOR DE SEPARACION (Retencin Relativa)
tB
tA
tM
KB
KA
KB
WbA
WbB
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
2 (tr2 - tr1)
R=
( Wb1 + Wb2)
DONDE LOS TIEMPOS DE RETENCION Y LOS ANCHOS
DE LOS PICOS SE EXPRESAN EN LAS MISMAS
UNIDADES.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
RESOLUCION DE PICO, R
tb
t
ta
Wh
TIEMPO
RS = 2
(tb- ta)
(Wa+Wb)
USP
(t - t )
RS = 1.18 b a
(Wha+
BP
Wa
Wb
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
FACTOR DE COLA, T
W
PICO
FRONTAL
COLA
DE PICO
W 0.05
f
0.05h
ALTURA MAXIMA
DE PICO
W = Ancho a 5% de la altura del Pico
f = Distancia entre el mximo y el borde de entrada del pico
T=
2f
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ANALISIS CUALITATIVO
1
2
PERMITE LA IDENTIFICACION DE
UN COMPUESTO
0
min.
10
20
COMPARA EL TIEMPO DE
RETENCION DEL ANALITO
EN LA MUESTRA, CON
RESPECTO AL TIEMPO DE
RETENCION DEL ESTANDAR
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ANALISIS CUANTITATIVO
1
2
0
min.
10
20
ESTANDAR AGREGADO
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ANALISIS CUANTITATIVO
NORMALIZACION INTERNA :
1
2
Ai
Pi=
0
min.
10
100
Ai
20
DONDE :
Pi ES EL PORCENTAJE DEL COMPONENTE i EN
LA MEZCLA
Ai ES EL REA DEL COMPONENTE i, y
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ANALISIS CUANTITATIVO
ESTANDAR EXTERNO :
1
2
Am Cs
P=
0
min.
10
20
D100
As
DONDE :
P ES EL PORCENTAJE DEL ANALITO EN LA
MUESTRA
Am y As SON LAS AREAS DE LA MUESTRA Y
ESTANDAR
CS ES LA CONCENTRACION DEL ESTANDAR Y
D ES UN FACTOR DE DILUCION
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ANALISIS CUANTITATIVO
ESTANDAR INTERNO :
1
2
Rm Cs
P=
0
min.
10
20
D100
Rs
DONDE :
P ES EL PORCENTAJE DEL ANALITO EN LA
MUESTRA
Rm y Rs SON LAS RELACIONES DE AREA DEL
ANALITO A ESTANDAR INTERNO EN LA
MUESTRA Y
D ES UN FACTOR DE DILUCION
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ANALISIS CUANTITATIVO
ESTANDAR AGREGADO :
1
2
Am Cs
P=
D100
Ams- Am
0
min.
10
20
DONDE :
P ES EL PORCENTAJE DEL ANALITO EN LA
MUESTRA
Am y As SON LAS AREAS DEL ANALITO EN LA
MUESTRA TAL CUAL Y LA MUESTRA A LA QUE
SE LE HA AGREGADO ESTANDAR
RESPECTIVAMENTE
Cs ES LA CONCENTRACION DEL ESTANDAR Y
D ES UN FACTOR DE DILUCION
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HPLC
PROBLEMAS INSTRUMENTALES
- TEMPERATURA DE TRABAJO
- ES NECESARIO DESTINAR UNA COLUMNA
PARA CADA TIPO DE MUESTRAS
A ANALIZAR.
- SE DEBE LLEVAR UN REGISTRO DE STAS.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HPLC
MODIFICACION DE LA RETENCION O LA
RESOLUCION DEL PICO.
C IENTIFICA
A NDINA S.A.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HPLC
INCOMPATIBILIDAD
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HPLC
C IENTIFICA
A NDINA S.A.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HPLC
PERDIDA DE LA EFICIENCIA
L
A
V
A
D
O
A
C
T
I
V
A
C
I
O
N
SILICAGEL
FASE REVERSA
HEPTANO
50 ml.
Ac. ACETICO 2%
50 ml.
CLOROFORMO
50 ml.
AGUA
50 ml.
METANOL
50 ml.
METANOL
50 ml.
AGUA
50 ml.
CLOROFORMO
50 ml.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HPLC
C IENTIFICA
A NDINA S.A.
VARIABILIDAD EN LA COLUMNA
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
PRECISION DE UN SISTEMA
PRECISION
FACTORES DE CONTROL
TIEMPO DE RETENCION
AUTOMUESTREADOR : MODO DE
INYECCION
BOMBA : FLUJO, PULSACION
DETECTOR : RUIDO Y DRIFT,
RESPUESTA
SISTEMA DE DATOS : VELOCIDAD
DE MUESTREO, PARAMETROS DE
INTEGRACION
Reproducibilidad
Precision
Limite de Deteccion
Limite de Cuantificacion
Selectividad
Rango
Linealidad
Robustez
Nota:
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Categoria I
Categoria II
Categoria III
Categoria II
Cuant.
Limit
Si
Si
No
Si
Si
Si
Si
Si
=
=
=
No
?
Si
No
Si
?
No
Si
Mayor Componente
Menor Componente
Rendimiento
Categoria III
Si
?
?
?
?
?
?
Si
Reproducibilidad
Resumen de picos
Limite de deteccion
Especificidad
Rango lineal
Robustez
Sample
Name
5 ul injection
5 ul injection
5 ul injection
5 ul injection
5 ul injection
5 ul injection
5 ul injection
5 ul injection
Time
[min]
Anthracene
Area
[Vs]
Time
[min]
Area
[Vs]
0.84
0.82
0.84
0.84
0.84
0.84
0.83
0.84
1332838
1330947
1331692
1328473
1319670
1326515
1325539
1328437
1.03
1.03
1.02
1.02
1.02
1.02
1.02
1.02
1111930
1108623
1111280
1108039
1100541
1106971
1105507
1108216
0.84
0.12
1328014
0.32
1.02
0.18
1107639
0.32
: 4.0<4J28>
: 10/21/95 10:05 PM
: Unknown
: test1
:
: BATCH
: 0.250 m
: USP
: Adjacent SUIT Components
: 5% Peak Height
: 0.000 min
: 0.000 min
: 2.000 min
:4
Sample Name
-------------------------------
Acquisition Date
-----------------------4/23/87 02:11 PM
Peak
Ret
Peak
Peak
N Tan
N Foley
Tail
PW
PW
PW
Name
Time
Area
Height [plates / M] [plates / M] Fact
k' Resln Alpha S/N Base
0.05
0.1
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------o,p-DDT
2.316
102725
10386
3550.61
3636.79 1.083
N/A N/A
N/A
4.67 18.655 20.517
18.976
p,p'-DDT
3.915 1090284
100059 10911.16
11661.62 0.996
N/A 5.237 1.691
45 17.991 21.290
18.667
1.00 to
- Tailing Factor
- Tailing Factor
1.80
Component
RT
Area
1
2
3
4
5
6
Comp A
Comp B
Comp C
Comp D
Comp E
Comp F
0.437
0.633
0.890
1.203
1.600
2.213
3016138
5049419
4342001
3550203
3209537
6287826
PEAK #
1
2
3
4
5
6
TIME
Wavelength MAX
PI
0.44
0.63
0.89
1.20
1.60
2.21
254nm
260nm
260nm
259nm
258nm
250nm
4.51
3.05
1.40
1.21
1.06
1.17
Height
1389.5432
1970.0206
1361.9135
904.0825
653.6164
954.6478
Grafica de Linearidad de
Tolueno: r = 0.9997
2
Columnas HPLC
Sistema de la Columna
Dimensin -Longitud (L) y dimetro interno (dc)
Caractersticas del empaquetamiento
Tipo - slica o polmero
Tamao de la partcula (dp)
Tamao de poro(dpore)
Grupo enlazado (determina el modo cromatogrfico)
i.d.
(mm)
Capacidad de
la muestra
(mg)
Velocidad
de Fluljo
(mL/min)
Semipreparativa
8-20
10-50
5-30
Analtica Estndar
4.6
Narrowbore
2.0
0.2
0.2
Microbore
1.0
0.05
0.05
Comparacin de Separaciones
Flexibilidad para optimizar la longitud de la
columna
3 cm
n= 2,500
10 cm
n= 7,000
22 cm
n= 15,000
n = plate count
H=A+B/u+Cu
u: velocidad lineal
Tipos de Soporte
Tipos de Soporte
Slica (o alumina)
Polimrico: poliestireno -DVB,
politeres, polimetacrilatos
Propiedades importantes de los soportes
Fuerza mecnica y estabilidad qumica
Propiedades de la partcula y tamao de poro
Propiedades superficiales
Tipos de Soporte
Silica
Es el soporte predominante de LC con un excelente
rendimiento
Los grupos silanol (Si-OH, siempre presentes en las
superficies de slica) se encuentran tpicamente
enlazados con grupos silanos para modificar la
superficie
Sus lmites de pH se encuentran entre 2.5 - 8
Soportes de materiales polimricos
Se han introducido rpidamente con una alta eficiencia
Muy utilizada en bioseparaciones
Amplio mbito de pH (1-14), buena reproducibilidad y
ausencia de grupos silanol
Enlaces ms comunes
Fase Reversa
C18
Octadecyl
Si- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH3
C8
Octyl
C4
Butyl
Silica
Cyanopropyl
S i - OH
Si- CH2- CH2- CH2- CH2- CN
CH2-
Fase Normal
Si
CN
Intercambio Inico
SP
CM
DEAE
SAX
Sulfo propyl
Si - CH2- CH2- CH2- SO3Carboxymethyl
Si-CH2-CO2Diethylaminoethyl
Si - CH2-CH2-NH+ (C2H5)2
Triethylaminopropyl
Si-CH2-CH2-CH-N+(C2H5)3
C18
Fase enlazada ms utilizada, retiene muy bien y es muy estable
Las columnas C18 de diferentes vendedores tienen diferentes caractersticas de
selectividad y
C8
Se prefiere para fases mviles con bajo contenido de fase orgnica
C4
Se utiliza con frecuencia para separaciones de protenas (C18 se prefiere para
peptidos)
CN
Tanto para NP o RP; Utilizada para algunas aplicacioens especficas (ejm.
antidepressants)
Fenil
Para sepearaciones en RP de compuestos medianamente polares y bsicos,
selectividad nica para aromticos
Amino
Se utiliza para reemplazar la silica en separaciones por NP, anlisis de azcares
Ref.: Column Selection Guides, HPLC Supplies Catalog, Perkin-Elmer, L-1882, Norwalk, p.2-3
Materiales de Empaquetamiento
de
la
Columna
Tipo de Soporte
Desarrollo de mtodos
El mejor desarrollo de mtodo es no desarrollar mtodos...
ms bien adoptar mtodos ya existentes
Sin embargo, consulte primero con sus colegas y luego refirase a
la literatura (USP, AOAC, ASTM, etc). Dse a la tarea de
desarrollar un mtodo slo cuando no exista alguno disponible:
Primeros pasos en el desarrollo de mtodos:
Recolecte toda la informacin posible para su muestra:
Defina el objetivo de la separacin
Recolecte y evale la informacin de la muestra
Considere la preparacin de la muestra y el instrumental
requerido
Desarrolle el mtodo HPLC
Defina el objetivo de la
separacin
Analizar todos componentes o componentes
seleccionados?
Anlisis cuantitativo? Con qu precisin?
Se requiere identificacin y confirmacin de pico?
El mtodo se usar para pocas muestras o para anlisis de
rutina?
Se requiere alguna extraccin o preparacin especial de la
muestra antes del anlisis por HPLC?
Ref.: L.R. Snyder, J. L. Glajch and J.J. Kirkland, Practical HPLC Method
Development, John Wiley & Sons, New York, 1988.
Resuma la informacin
importante acerca de la muestra
Nmero de componentes
Ambito de concentraciones de los analitos
Estructura Qumica
PM, (biopolmero?)
Polaridad, hidrofobicidad, carga
Solubilidad en agua, alcohol, eter, diclorometano y hexano
Acido, neutro, grupos funcionales bsicos, pKa /pKb /p I
Otras consideraciones
Cromforos, forma, estabilidad de la muestra, reactividd de los adsorbentes
Matriz de la muestra
Slida, lquida, tableta, extracto de planta, tejido, ...
Disolvente en que es soluble, volumen de muestra
Interferencias -- sales, lpidos, partculas, hidrocarburos
Ref.: L.R. Snyder, J. L. Glajch and J.J. Kirkland, Practical HPLC Method
Development, John Wiley & Sons, New York, 1988.
Preparacin de la muestra
Tcnicas comunes en la preparacin de la muestra
para separar los analitos de las matrices
Filtracin
Extraccin lquido-lquido
Extraccin en fase slida
Precipitacin
Centrifugacin
pH
deoverview
fuerzaof sample
inica
Ref.y/o
R. E.ajuste
Major, An
preparation, LC.GC 9 (1991) 16.
GPC
Modos de trabajo en
Cromatografa Lquida
Nota: Cromatografa de par inico es una tcnica especial de RPC para compuestos
ionizables
Seleccin de la columna
Muestra
Peso Molecular
Solubilidad
Modo de
Separacin
Particin Liquido-Liquido
Insoluble en Agua
Inico
PM<1000
Soluble en Agua
No Inico
Soluble en Agua
Inico
Muestra
Soluble en Agua
Fase Mvil
Tpica
CHCL3, EtOAc
Fase Normal
(no-polar)
Fase Normal (polar)
Adsorcin Lquido-Slido
Particin Liquido-Lquido
Fase Reversa
Intercambio Catinico
(Bsico)
Intercambio Aninico
(Acido)
Filtracin con Gel
n-C6H6, CHCl3
H2O/MeOH, H2O/CH3CC
Buffers (PO43-, BO2pH2-9 (modificadores
cidos, HOAc, HNO3
H2O, ROH
PM>1000
Insoluble en Agua
Exclusin por
efecto estrico
THF, CHCl3
Configuracin y dimensiones de
la columna
Longitud (L)
Eficiencia (n) es proporcional a L
Resolucin es proporcional a la raz cuadrada de L
La contrapresin es proporcional a L
Dimetro interno (dc)
Volumen de la columna (capacidad de muestra) es
proporcional a L p dc 2
Las categoras de columnas incluyen, preparativa,
analtica (convencional), Fast LC, narrowbore, microbore,
columnas capilares
selectivitidad
(n)0.5
eficiencia
Velocidad
Capacidad