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MicrobiologÍa

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microbiología 2º
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MICROORGANISMOS

Fue el desarrollo de la microscopía lo que permitió conocer un poco más sobre los

organismos.

FUNDAMENTOS DE LA MICROSCOPÍA

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El ojo humano actúa como un instrumento óptico. Mediante la acomodación del ojo,
nos da una idea del tamaño del objeto y la distancia que tiene. Existe una limitación: a partir
de unos 25 cm de distancia, el ojo deja de acomodarse por mucho que se acerque el objeto.
El ojo deja de ver un objeto de 0,1 mm a 25 cm de distancia; el ángulo de entrada
sería de 1º, que sería el ángulo mínimo con el que tiene que entrar un objeto para que se
forme la imagen en la retina. Este ángulo se va perdiendo también cuando se aleja mucho el
objeto.

Por eso, definimos a los microorganismos como entidades vivas con un tamaño inferior
a 0,1 mm durante su ciclo de vida.

Los microscopios operan aumentándonos el ángulo de entrada de los objetos a
estudiar. Éste es el principio básico de todo microscopio.

- CONCEPTOS DEL MICROSCOPIO -

1. Magnificación o aumento: aumento del ángulo de entrada ( ). Se obtiene mediante

procedimientos ópticos.

2. Contraste: sólo podremos ver objetos cuando nos encontramos el objeto en un medio
diferente. Se logra mediante procedimientos ópticos dependiendo del microscopio, o
mediante tinciones para resaltar el objeto del medio.
3. Claridad o nitidez: viene definida por la longitud de onda de la luz que se utiliza y
también por cuestiones ópticas.

- Poder de resolución de un microscopio.
- ´Aumentos que logran que la lente objetivoµ x ´Aumentos que logra la lente ocularµ =
Magnificación o aumento.
El poder de resolución que define la claridad, se define como la capacidad de resolver
entre 2 puntos que se encuentran muy próximos.

PR = PR =

2¨ 2 senC

¨ = apertura numérica. Es igual al índice de refracción entre la lente objetivo y el objeto a estudiar por el ángulo que forma el

foco de luz con los rayos más divergentes.

¨ = senC

C

El aceite de inmersión hace aumentar el denominador PR, disminuyendo el valor de PR.
Podemos ver 2 puntos que están separados entre sí por una distancia muy pequeña. Los
podemos ver de forma clara y nítida.

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Si el PR es muy grande, la claridez y nitidez es muy poca. Si la longitud de onda
disminuye, no llega a ser visible aunque aumente el PR.

El aumento es una propiedad exclusiva de las lentes que forman el microscopio.

TIPOS DE MICROSCOPÍA

Empleamos una =500nm (verde azulada) y una lente objetivo con 55º de semiángulo,
y la observación la hacemos con aire ( =1) o utilizamos aceite de imersión ( =1,5), el PR será
diferente.

Con el aceite de inmersión, en este caso, veremos objetos con un PR de hasta 0,2

m.

- MICROSCOPÍA ÓPTICA -

Utiliza una que entra dentro del espectro visible (400-700nm).
1) Microscopio de fondo claro:
Es el más utilizado rutinariamente. El fondo es claro y la muestra a ver se contrasta
mediante tinciones. Utiliza también aceite de inmersión para disminuir el PR. Está compuesto
por un cuerpo o soporte de metal compacto, compuesto por una base y un brazo, donde se
fija el resto de las partes. En la base hay una fuente de luz. En el brazo hay dos dispositivos
giratorios para enfocar, de ajuste fino (micrométrico) y ajuste grueso (macrométrico), que
pueden mover la platina o portaobjetos para enfocar la imagen. El condensador se monta
dentro o por debajo de la platina, y enfoca un cono de luz sobre el portaobjetos.

2) Microscopio de fondo oscuro:
Se ve todo oscuro menos lo que se quiere observar, que se ve claro. Se basa en el efecto
Tyndall
. Se enfoca un cono hueco de luz sobre la muestra, de manera que no penetren en el
objetivo rayos no reflejados y no refractados. Solamente la luz que haya sido reflejada o
refractada por la muestra puede formar una imagen. De esta forma, el campo que rodea la
muestra aparecerá negro, mientras que el objeto quedará iluminado intensamente. Para
células vivas no teñidas.

3) Microspio de contraste de fases:
Otra alternativa al microscopio de campo oscuro para la observación de células vivas no
teñidas. Tiene un dispositivo óptico llamado Zernicke que logra el contraste haciendo pasar
la luz por el objeto de manera que el microscopio transforma las variaciones de los índices de
refracción y de la densidad celular, en variaciones de intensidad de luz fácilmente
detectables.

Existen otros 3 tipos de microscopía óptica más moderna que dan una imagen

tridimensional:

4) Microscopio de interferencia o de contraste diferencial:
Crea una imagen sobre la base de la detección de diferencias en los índices de refracción
y el espesor de la muestra. Mediante unos prismas se generan 2 ondas de luz polarizada plana
en ángulo recto una respecto de la otra. Una de ellas pasa a través de la muestra, mientras
que la otra sirve de referencia y pasa por una zona clara. Tras atravesar la muestra, las 2
ondas se combinan e interfieren entre sí formando una imagen.

5) Microscopio de fuerza atómica:
Se pone un sensor próximo a las fuerzas y detecta fuerzas atómicas repulsivas
digitalizando un modelo de la imagen.

6) Microscopio confocal:

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Utiliza un rayo láser que analiza la imagen en diferentes planos y luego nos da una

imagen tridimensional.

Con longitudes de onda más pequeña, existe la microscopía ultravioleta.

7) Microscopio ultravioleta:
a) Microscopio de luz ultravioleta: no utiliza lentes de vidrio sino de cuarzo, ya que el
vidrio no deja pasar la luz ultravioleta. Después actúan mecanismos accesorios de
visualización.

b) Microscopio de fluorescencia: expone un espécimen a luz ultravioleta y forma una
imagen del objeto con la luz fluorescente emitida. La luz resultante pasa a través de un filtro
de excitación que transmite sólo la longitud de onda deseada.

- MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA ²

Se emplea haz de e- que actúan como un rayo de luz o fuente de radiación que puede
enfocarse al igual que la luz de un microscopio óptico. Lo que observamos, a diferencia del
microscopio óptico, no es la imagen directa sino una fotografía, que puede ser aumentada.
Esta microscopía presenta mayor poder de resolución en cuanto a capacidad de
nitidez, lo que permite estudiar con mayor detalle la morfología microbiana.

1) Microscopio electrónico de transmisión:
Es un microscopio óptico invertido. El haz de e-, procedente de un filamento de

tungsteno calentado se enfoca sobre la muestra con el condensador. Como los e- no pueden
atravesar una lente de vidrio, se emplean electroimanes para concentrar ese chorro de e-
sobre la muestra. La columna que contiene las lentes y la muestra deben estar en condiciones
de vacío para obtener una imagen clara porque los e- se desvían al chocar con las moléculas
de aire. La muestra dispersa los e- que pasan a su través, y este haz se enfoca con otro grupo
de electroimanes para formar una imagen aumentada y visible sobre una pantalla

flourescente.

Limitaciones: sólo funciona a alto vacío, lo que implica que las muestras a realizar deben
estar deshidratadas anteriormente para evitar la ebullición y evitar formas extrañas llamadas
artefactos que no existen en la realidad, por lo que este tipo de microscopio no sirve para ver
muestras vivas.

2) Microscopio electrónico de barrido o scanner:
Se diferencia de otros microscopios electrónicos en que produce una imagen a partir de e-
emitidos por la superficie de un objeto, en lugar de a partir de e- transmitidos.
Realiza un escáner con un estrecho haz de e- en forma de prisma, de adelante hacia atrás
sobre la muestra. Cuando el haz incide sobre una zona concreta de la muestra, los átomos de
la superficie emiten una nube de e- que son atrapados por un detector especial. Inciden sobre
un centelleador, causando la emisión por éste de centelleos de luz que un fotomultiplicador
transforma en una corriente eléctrica y la amplifica. La señal se envía a un tubo de rayos
catódicos y se produce una imagen como en la pantalla de televisión, que puede verse y
fotografiarse. Sólo permite ver superficies.

TINCIONES

Aunque los microorganismos se pueden examinar directamente con un microscopio
óptico, a menudo hay que fijarlos y teñirlos para aumentar la resolución, acentuar las
características morfológicas y conservarlos para su estudio en el futuro.

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Primero hay que fijar la muestra. La fijación es el proceso por el cual se conservan y
fijan en su posición las estructuras internas y externas de las células de los microorganismos.
Se realiza el frotis del objeto en un porta y se fija, lo que limita el movimiento Browniano de
las partículas de suspensión e inactiva enzimas que podrían alterar la morfología celular.

Para la tinción se emplean colorantes, que son compuestos orgánicos que presentan,
desde el punto de vista funcional, 2 partes en sus moléculas:
- Radicales cromatóforos: le dan color a la molécula y tienen grupos nitro (NO2) o grupos

azo (-N=N-).

- Grupo auxocromo: son las zonas reactivas, que presentan grupos amino (NH3+

),

hidroxilo (OH) o carboxilo (COO-).

- CLASIFICACIÓN DE LOS TINTES POR SUS COMPUESTOS QUÍMICOS ²

a) Colorantes ácidos:
El grupo auxocromo es un anión y su cromóforo será un ácido. Estos colorantes, debido a
su carga negativa, se unen a estructuras celulares cargadas positivamente (elementos
celulares básicos).

Ejemplo: eosina, fucsina, rojo congo, rosa de bengala«

b) Colorantes básicos:
El grupo auxocromo es un catión, por lo que se van a unir a moléculas cargadas
negativamente (elementos celulares ácidos).
Ejemplo: azul de metileno, cristal violeta, safranina, verde malaquita«

c) Colorantes neutros:
Presenta un componente ácido y otro básico, o simplemente uno que no esté cargado.
Ejemplo: negro Sudán, que se disuelve mejor en componentes lipídicos que en el agua.

- MECANISMOS DE TINCIÓN ²

Al teñir una célula se producen reacciones de intercambio iónico.

Existen 3 tipos de tinciones en Microbiología:

1) Tinciones simples o directas:
Utilizan un solo colorante y tiñe por igual a toda la bacteria. Los más utilizados son el
azul de metileno, cristal violeta y carbolfucsina.

2) Tinciones negativas o indirectas:
No son verdaderamente tinciones. Se tiñe todo el fondo pero no la bacteria.
Ejemplo: tinción de Fleming, consistente en utilizar tinta china que se añade al medio
haciéndolo opaco a la luz y no penetra en las bacterias. Equivaldría a la microscopía óptica de
fondo oscuro.

Existen microorganismos que al aplicárseles tinciones mueren por toxicidad. Para
observar organismos vivos a veces hay que utilizar las tinciones negativas o indirectas. Por
ejemplo, Treponema pallidum es difícil de observar en vivo con el fondo claro.

3) Tinciones diferenciales:

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Emplean siempre más de un colorante, y las células se tiñen de manera diferente
dependiendo del tipo de microorganismo. Permite observar y establecer diferencias entre los
microorganismos dependiendo de sus propiedades de tinción.
Ejemplo: tinción de Gram, tinción de ácido alcohol resistente.

y TINCIÓN DE GRAM:

Fue desarrollada por el médico danés Christian Gram en 1884, y es el método de
tinción más ampliamente utilizado en bacteriología. Se trata de un método de tinción
diferencial que divide a las bacterias en dos clases: Gram positivas y Gram negativas. Se
basa en la naturaleza de la pared celular.

En el primer paso de esta tinción, el frotis se tiñe con cristal de violeta durante 2
minutos. Se tira el exceso y se aplica una solución yodoyodurada o Lugol-Yodo (I2-IK) durante
1 minuto, se tira el exceso y se decolora el frotis lavándolo con etanol o acetona. Este paso
produce el aspecto diferencial de la tinción de Gram. Finalmente, el frotis se tiñe de nuevo
con safranina, se aclara con agua y se seca.
Al darle cristal de violeta (CV) se forman complejos de este tinte en el interior de las
células. Luego el Lugol-Yodo hace que se fije más la unión del CV con la célula, formando un
complejo llamado CV-I, que es más insoluble en agua y en alcohol.
Las células se decoloran dependiendo de su porosidad. En unos casos se extrae CV-I y
en otros no. La decoloración de contraste (safranina) se utiliza para células a las que se ha
extraído CV-I.

Gram- Gram+

Cv y Lugol-Yodo Aclarar con etanol-acetona Safranina y aclarado

Se distinguen 2 tipos de células:
- Gram positivas: violetas
- Gram negativas: rosas o rojas

- TINCIÓN DE ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTE ²

Es otro método importante de tinción diferencial. Hay algunas bacterias difíciles de
teñir, pero que una vez teñidos es difícil decolorarlos. Se trata de teñirlas con un tratamiento
más fuerte: calentando una mezcla de fucsina básica y fenol (método de Ziehl-Neelsen). Una
vez que la fucsina básica ha penetrado en la célula con la ayuda del calor y el fenol, las
células ácido-alcohol resistentes no se decoloran fácilmente con una solución acidoalcohólica,
permaneciendo de color rojo. Este método se emplea para identificar Mycobacterium
tuberculosis
y M. leprae.

Se diferencian 2 tipos de células:
- Ziehl-Neelsen positivas: moradas, no se decoloran
- Ziehl-Neelsen negativas: azules

Todas las ZN+ son Gram+, pero no todas las Gram+ son ZN+.

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4) Tinciones específicas o selectivas:
Tiñen partes específicas de las células:
- Tinción para flagelos
- Tinción para paredes celulares: tinción de Wirtz para bacterias esporuladas.

Una determinada tinción simple o directa es el azul de metileno o de Loeffler es
también una tinción específica o selectiva. Hay unos componentes en procariotas que son los
corpúsculos metacromáticos o gránulos de volutina o polifosfatos. Si hacemos que el azul
de metileno entre dentro de las células, nos marcará en determinados puntos de la célula los
acúmulos de polifosfatos. Una tinción simple se utiliza como específica en este caso.

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