UNIVERSIDAD DE CHILE - FACULTAD DE MEDICINA

LABORATORIO BIOLOGIA DE LA REPRODUCCION

fono (2)9786305 - 9786450------------------------------------------------------



AYUDA PRCTICA PARA EL ANLISIS DEL SEMINOGRAMA
Profesor asistente Luis Sarabia Villar
Enero 2005



En la dcada del 50 aparecen las importantes contribuciones de Mac Leod donde
comparaba los resultados obtenidos del anlisis seminal de personas frtiles con los
obtenidos de pacientes con problemas para concebir un hijo. Se comprob una fuerte
correlacin entre la movilidad y fertilidad potencial y que la probabilidad de la concepcin
dependa del porcentaje de clulas activas y de la calidad de la movilidad, Mac Leod y
Gold encontraron que por encima de 20 millones por ml. no haba aumento de la fertilidad
potencial. De sus trabajos surgen las condiciones mnimas que debe reunir un esperma para
ser considerado con capacidad fecundante. Sin embargo en base a estos valores lmites,
debe tenerse en cuenta que si algn resultado es inferior al valor mnimo correspondiente,
debe compensarse con un aumento correlativo de otro y que siempre se habla en trmino de
probabilidad para que un apareja conciba un hijo.

El semen normal es una mezcla de espermatozoides suspendidos en las secreciones que
provienen del testculo y epiddimo, las que se combinan al momento de la eyaculacin con
las secreciones de la prstata, vesculas seminales y glndulas bulbo uretrales.
El anlisis del semen provee informacin sobre la condicin clnica del individuo.

RECOLECCION DE LA MUESTRA Y ENTREGA

Las indicaciones se deben entregar al paciente en forma escrita u oral, de una forma clara,
en lo referente a la recoleccin y transporte del semen. El manejo de la muestra debe ser
muy cuidadoso en el laboratorio, ya que toda muestra biolgica puede ser potencialmente
peligrosa por la presencia de virus y bacterias patgenas.

a. La muestra debe ser recolectada despus de un mnimo de 2 das de abstinencia sexual,
pero no mas all de los 7 das de abstinencia. Se debe procurar que el tiempo de abstinencia
sea registrado en das para estandarizar los protocolos de trabajo. La abstinencia debe ser
valorada de acuerdo a la frecuencia de las relaciones sexuales en la pareja. Con un menor
perodo de abstinencia a la media sexual, se puede producir una disminucin en la densidad
espermtica o del volumen seminal. Con una abstinencia mayor a los 7 das, se puede ver
incrementado el nmero de espermatozoides inmviles y morfolgicamente alterados.
Episodios febriles, intervenciones quirrgicas o tratamientos farmacolgicos recientes
deberan aplazar el espermiograma hasta despus de 70 das (ciclo espermatognico).
b. Dos muestras son necesarias para una evaluacin inicial. El intervalo entre cada toma de
muestra no debe ser menor a 7 das ni mayor a 3 semanas. Si los resultados entre ambas
muestras son marcadamente diferentes, muestras adicionales deben ser evaluadas.



c. Idealmente, la muestra debe ser recolectada en un ambiente privado cerca al laboratorio.
Si no es posible, la muestra debe ser entregada al laboratorio dentro de la primera hora
despus de ser emitida. La movilidad espermtica declina con el tiempo y las variaciones
de temperatura.
d. La muestra se obtiene por masturbacin. El eyaculado se recoge en un frasco limpio,
estril, de boca ancha. Se debe mantener la temperatura entre los 18 y 22C a temperaturas
inferiores a 5 C los espermatozoides experimentan el Schock termico que se caracteriza
por la disminucin de la movilidad de manera irreversible por lo tanto en poca de intenso
fro se le recomienda al paciente que tempere el frasco previamente y lo mantenga entre 18
y 37C (si la muestra se obtiene fuera del laboratorio).
Si se va a realizar un anlisis microbiolgico de la muestra, el paciente debe orinar primero,
luego debe lavarse y secarse las manos y el pene para posteriormente eyacular.
e. Cuando la muestra no se puede recolectar por masturbacin se debe utilizar un condn
especial para recoleccin de semen. Ningn otro tipo de condn es recomendable. El coitus
interruptus no es un medio adecuado para recolectar la muestra.
f. La recoleccin de la muestra debe ser completa. Es importante sealar que la primera
porcin del eyaculado emitido es la que contiene la mayor concentracin de
espermatozoides 75 % aproximadamente, y por esta razn es importante que no se pierda,
de lo contrario se pide una nueva muestra para realizar el anlisis con el mismo rango de
abstinencia antes sealada, las ltimas porciones eyaculadas se caracterizan porque
predominan los espermatozoides inmviles y de mala morfologa.
g. El frasco de recoleccin debe ser adecuadamente rotulado con los datos del paciente, con
la fecha y la hora de recoleccin de la muestra y en presencia del paciente para evitar
posteriores errores de rotulacin.


Los pasos bsicos en el anlisis del semen son los siguientes:

1.- A los 0-5 minutos despus de emitida la muestra, se registran correctamente los datos
del paciente y se coloca en una incubadora a 37C. hasta que lice
2.- A los 20-25 minutos, se evala la licuefaccin, la apariencia visual y el olor.
3.- A los 30-60 minutos, se evala la viscosidad, la movilidad espermtica , la
agregacin/aglutinacin espermtica, otros tipos celulares y el debris. Se realizan los test
para anticuerpos. Se evala la vitalidad espermtica. Se hacen las diluciones para
determinar la concentracin espermtica. Se separan 100 l de semen para evaluar clulas
inflamatorias. Se tien las lminas para evaluar la morfologa espermtica. Se recupera y
centrifuga el semen para el anlisis bioqumico posterior si corresponde.
4.- Mas tarde, se hace el recuento de espermatozoides en una cmara Neubauer. Si hay un
nmero >a 1 x 10
6
clulas redondas/ml en el semen, se hace una evaluacin de clulas
inflamatorias. Se realiza el anlisis bioqumico de las secreciones de la prstata (zinc),
vescula seminal (fructuosa) y epiddimo (-glucosidasa). Se tien los frotis para
evaluacin de la morfologa. Se evala la morfologa.












MANIPULACION DE LA MUESTRA

Las muestras de semen pueden tener agentes infecciosos peligrosos (VIH, hepatitis, herpes,
gonorrea, sfilis, etc.). La utilizacin de vestimenta adecuada, guantes, as como evitar
cualquier contacto directo con la muestra por parte del personal debe ser de estricto
cumplimiento.


EXAMEN MACROSCOPICO
Rango de Valores Normales Segn O.M.S,1999 Entre parntesis se indica el rango de
valores ms frecuentes.


VOLUMEN: 2.0 ml (2.0-6.0 ml.) Se determina una vez finalizado el examen en un tubo
graduado con una aproximacin de 0.1 ml. Cuando el volumen es muy pequeo se informa
sin medirlo, como menor de 0.5 ml. Es frecuente el hallazgo de volmenes aumentados. En
nuestro laboratorio hemos encontrado pacientes con volmenes entre 9 y 13 ml. Y dos
casos de pacientes con 18 y 19 ml de eyaculado.

pH: 7.2 (rango 7.2-8.0, el pH puede ser m.s alcalino y no necesariamente significa
anormalidad). A medida que transcurre el tiempo la muestra se va alcalinizando por prdida
de anhdrido carbnico.

LICUEFACCIN: Tiempo normal entre 15-60 minutos a 37 C. Hacia los 30 minutos la
muestra debera estar licuada. El semen normal puede contener cuerpos gelatinosos que no
se licuan. La presencia de moco puede interferir en el anlisis.
Una vez licuada la muestra, se debe mezclar suavemente el semen con un movimiento
rotatorio para reducir el error en la determinacin de la concentracin espermtica.


APARIENCIA, COLOR, OLOR: Deben ser evaluados a temperatura ambiente, dentro
de la primera hora despus de emitida la muestra. Una muestra normal tiene una apariencia
homognea, un color blanco opalescente a gris amarillento y un olor caracterstico. (Se
informa como normal).

Aspecto: Un aspecto translucido se relaciona con una baja concentracin espermtica y no
hay clulas de la espermatognesis, leucocitos hemates o grmenes y un aspecto
heterogneo se observa cuando queda material sin licuar.
Color: Amarillo intenso en los casos que hay leucocitos (piospermia), herrumbre indica
presencia de sangre hemolizada (vesiculitis o prostatitis), rojo indica presencia de sangre (
hemospermia por traumatismo o neoplasia de las vas seminales). Casi siempre se debe a
una afeccin banal denominada hemosperma cronica y un color verdoso se correlaciona
con infeccin de pseudomonas.
Olor: Un olor fecal indica la presencia de E.coli.






CONSISTENCIA: La viscosidad, est en relacin a cmo fluye la muestra desde una
pipeta. La muestra debe caer en forma de pequeas gotas. Si se forma un hilo al caer la
muestra desde la pipeta se dice que hay una viscosidad anormal (filancia). Cuando el hilo
que se forma es >de 2 cm, se dice que hay una viscosidad elevada.



EXAMEN MICROSCPICO
( 30 a 60 minutos post eyaculacin)


CONCENTRACION DE ESPERMATOZOIDES: 20 x 10
6
espermatozoides/ml.; 40 x
10
6
espermatozoides por eyaculado o ms (OMS, 1999).

MOVILIDAD: >25% con movilidad progresiva (tipo A); 50% de mviles (tipos A ms
B) (OMS, 1999). Se evala la movilidad 60 minutos despus de eyaculada la muestra, se
cuentan al menos 200 espermatozoides.

VITALIDAD: 50% de espermatozoides vivos (no coloreados) (OMS, 1999). Se evala
inmediatamente despus de teir con Eosina. Recuento de 200 espermatozoides.

CELULAS REDONDAS: 5x 10
6
clulas/ml.

LEUCOCITOS: 1 x 10
6
leucocitos/ml

CELULAS GERMINALES INMADURAS: 1-3% con respecto a 100 espermatozoides.

MORFOLOGA: 15 % de formas normales (la tendencia es hacia la disminucin de este
porcentaje). Este valor est sujeto a estudios multicntricos que realiza la OMS. Sin
embargo, se sugiere que cada laboratorio estandarice sus propios valores de referencia.



PREPARACION DE LA MUESTRA PARA EL ANLISIS DEL SEMEN

EXAMEN DENTRO DE LA HORA
La muestra debe ser colocada inmediatamente a una temperatura de 37 C hasta la
licuefaccin de esta. Un volumen de 10 l. de semen es adecuado para ser colocado en una
lmina portaobjeto y cubierto con una lmina cubreobjeto de 22 mm x 22 mm de esta
manera el cubreobjeto queda perfectamente adherido al porta. Se determina la
concentracin de espermatozoides, la calidad de movimiento, la presencia de clulas
redondas, aglutinacin y el debris (que corresponde generalmente a desechos de fragmento
celulares). Esto nos dar una idea de cmo proceder con respecto a las diluciones para los
anlisis, que incluye recuento en cmara, viabilidad espermtica, con qu volumen hacer el
frotis etc. Si la temperatura ambiente es inferior a 22 C debe colocarse previamente los
portaobjetos y cubreobjeto a 37 C durante 15 minutos.
Si en el primer anlisis no se observan espermatozoides ni clulas de la espermatognesis,
se centrfuga el semen y con el sedimento se hacen preparados para teir e identificar la
presencia de espermatozoides o clulas de la espermatognesis. Idealmente se centrfuga a
1500g durante 15 minutos y si an as no se encuentran estas clulas se informa de la
siguiente manera:
En el sedimento de la muestra centrifugada a 1500g durante 15 minutos, no se
observaron espermatozoides o clulas de la espermatognesis.





ANLISIS DE LA VITALIDAD: La vitalidad espermtica est en relacin a la
proporcin de espermatozoides que estn vivos y se determina por la observacin de
aquellos espermatozoides que no se colorean con eosina o que se hinchan en el test hipo-
osmtico. Esta prueba debe ser utilizada si el porcentaje de espermatozoides inmviles
excede el 50%. La proporcin de espermatozoides vivos puede ser determinada utilizando
tcnicas de tincin las que se basan en el principio de que las clulas muertas con una
membrana plasmtica daada toman ciertos colorantes. Para esta evaluacin se utiliza una
solucin de eosina 0.5% en PBS pH 7.1. Se mezcla una gota de eosina con una gota de
muestra de semen y se evala inmediatamente al microscopio. Se deben contar 200
espermatozoides diferenciando los espermatozoides vivos (no teidos) de los
espermatozoides muertos (teidos).

ANLISIS DE LA MOVILIDAD: Se pueden trabajar con volmenes entre los 8-10 l.
Se debe evitar que haya demasiado volumen entre las lminas para que el desplazamiento
de los espermatozoides sea homogneo y en lo posible en una monocapa. La temperatura
de evaluacin ideal es de 37 C, pero se puede trabajar a temperatura ambiente, entre 20 y
24 C. Es importante estandarizar las condiciones de temperatura para el trabajo. Se deben
contar no menos de 200 espermatozoides. Los tipos de movilidad a evaluar son los
siguientes:
Tipo A: Progresivo rpido
Tipo B: Progresivo lento
Tipo C: No progresivo
Tipo D: Inmvil
Los espermatozoides tipo A y B son los que se cuentan primero, los del tipo C y D se
cuentan despus en el mismo campo los valores se informan en porcentajes. El contaje de
las formas mviles debe hacerse rpidamente, de lo contrario hay tendencia de contar ms
mviles, debido a que se cuenta los mviles ms los que van entrando en el campo. En muy
pocas oportunidades hemos observado hipercinesis, que se caracteriza por movimientos
sumamente enrgicos y desordenados de los espermatozoides.











ANALISIS DE LA CONCENTRACION ESPERMTICA: La concentracin se mide
utilizando un hemocitmetro de Neubauer, mejor an con cmara Makler que no requiere
dilucin y se puede determinar la calidad de la movilidad a la vez. Las diluciones pueden
ser 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 (para un volumen final de 100 l). El diluyente es preparado
adicionando al agua destilada 50 g de bicarbonato de sodio, 10 ml 35% (v/v) de formalina y
0.25 g de azul tripn o 5 ml de una solucin saturada de violeta de genciana, para un
volumen final de 1 litro. Otra solucin de dilucin es formalina al 1% con 5 gr. de
bicarbonato de sodio para un volumen final de 100 ml.
Se deben transferir aproximadamente 15 l. de la dilucin hacia la cmara de recuento,
pero lo ms importante es que la cmara quede completamente llena pero no en exceso para
evitar que la lmina que la cubre se mueva por accin de la dilucin transferida. La muestra
se debe dejar sedimentar (2 a 3 minuto), y debe ser conservada en una cmara hmeda para
prevenir la evaporacin, hasta el momento de realizar el recuento. El recuento debe ser de
espermatozoides completos (cabeza y cola). Las cabezas sueltas deben ser contadas por
separado.



El hemocitmetro de Neubauer contiene 25 cuadrculas grandes que se denomina en
conjunto retculo de Thomas, cada cuadrcula grande contiene 16 cuadrculas ms
pequeas. Si un espermatozoide se ubica sobre la lnea que divide dos cuadrculas
adyacentes, debe ser contado solamente si est en la lnea inferior o hacia la lnea del lado
izquierdo de la cuadrcula a ser evaluada, si las retculas tienen lneas triples la misma regla
se conserva pero para la lnea central . Recuentos por duplicado de 200 espermatozoides se
deberan realizar para tener un error de conteo bajo.
A fin de determinar la concentracin de los espermatozoides en la muestra original de
semen en millones/mL, el nmero promedio de espermatozoides es multiplicado por el
factor de conversin apropiado.
Si la dilucin es 1/5, y se han contado las 25 cuadrculas, entonces se multiplica el nmero
de espermatozoides en las 25 cuadrculas, por 5 y por 10.000 (50.000). Si la dilucin es 1/5,
y se han contado solo 5 cuadrculas, entonces se multiplica el nmero de espermatozoides
registrados en las 5 cuadrculas por 5 ( representa los 25 cuadrantes), por 5 ( dilucin) y por
10.000 ( cmara).



Recuento en cmara Makler
La cmara Makler presenta la ventaja de trabajar con muestra sin diluir lo que evita este
factor de error y adems se puede determinar los distintos grados de movilidad a la vez, lo
que ahorra tiempo al personal del laboratorio.
Para determinar la concentracin se cuenta las 100 cuadrculas y se multiplica el resultado
por 100.000, para expresar la concentracin espermtica en millones/mL.








Conteo de otras clulas diferentes a los espermatozoides: La concentracin de estas
clulas (leucocitos, clulas germinales inmaduras, otros tipos celulares) se puede estimar de
la siguiente manera. Se cuentan las clulas en los cuadrados que estn ubicados en las
esquinas del retculo de Thomas. Cada cuadrado tiene un volumen de 0.1ml
3
pero
representan un valor de 1 ml. El conteo que resulta en los 4 cuadrados se divide entre 4 y se
multiplica por el factor de dilucin para obtener el nmero de clulas por ml de muestra. De
otra forma, si N es el nmero de un tipo celular dado en el mismo campo como 100
espermatozoides y S es la concentracin de espermatozoides en millones/ml, entonces la
concentracin C de un tipo celular dado en millones/ml puede ser calculada con la siguiente
frmula:
C=(NxS)/100

As, si el nmero de clulas germinales inmaduras o leucocitos contados es 10 por 100
espermatozoides y el recuento de espermatozoides es 120 x 10
6
/ml, la concentracin de
dichas clulas es 10 x 120x10
6
/ 100 =12 millones /ml.


Determinacin ptima de Leucocitos y clulas redondas

Para la determinacin de leucocitos peroxidasa positivos se utiliza una solucin de agua
oxigenada 10-30% (100 l) mezclada con una solucin de ortotoluidina 0.15% (900 l), en
una relacin 1:10. De esta mezcla, se toman 900 l. a los que se agregan 100 l de muestra
de semen (relacin 1:10). La solucin final se incuba por 30 minutos a temperatura
ambiente. Los leucocitos peroxidasa positivos dan una coloracin marrn, y se registran
como positivos para la reaccin. Este recuento es til para diferenciar los leucocitos
peroxidasa positiva (Macrfagos y Neutrfilos) de otros tipos de clulas redondas y se
cuentan en cmara de Neubauer o Makler.




EVALUACION DE LA MORFOLOGA ESPERMTICA

Al menos dos extendidos deben ser preparados de la muestra de semen. Las lminas deben
ser limpiadas adecuadamente, lavadas en etanol al 100% y secadas al aire, antes de que una
pequea gota de semen (5-20 l.) sea colocada sobre su superficie. Hay que considerar que
la viscosidad del semen puede estar aumentada dificultando as el extendido de la muestra
sobre la lmina. El extendido debe bien delgado para que se seque rpidamente, no debe
emplearse calor para el secado ya que produce el enroscamiento de las colas y alteraciones
de cabeza. Adems, el semen tiene mucus que al exponerse al calor enturbia toda la
muestra haciendo difcil observar los espermatozoides, por ende se deja secar al aire y se
sigue el siguiente protocolo:






TINCIN DE PAPANICOLAOU MODIFICADO

Etanol 50% por 10 segundos
Agua destilada por 10 inmersiones
Hematoxilina de Harris por 10 segundos
Agua corriente por 5 minutos
Etanol cido (0.25% HCl in 70% de etanol) por dos inmersiones
Agua corriente por 5 minutos
Agua destilada por 1 inmersin
Etanol 50% por 10 inmersiones
Etanol 70% por 10 inmersiones
Etanol 80% por 10 inmersiones
Etanol al 95% por 10 inmersiones
Eosina por 2 minutos
Etanol 95% por 10 inmersiones
Etanol 95% por 10 inmersiones
EA-50 por 5 minutos
Etanol 95% por 5 inmersiones
Etanol 95% por 5 inmersiones
Etanol 95% por 5 inmersiones
Etanol 98-99.5% (etanol absoluto) por 2 minutos
Montaje de la lmina

El protocolo tradicional de fijacin y tincin de espermatozoides es de la siguiente manera:
Etanol al 70 - 80 % por 1 minuto
Se fija la muestra para evitar que la exposicin de los espermatozoides al ambiente
(temperatura, humedad, etc.) provoque una deformacin que altere la lectura correcta de la
morfologa.
10 segundos en Hematoxilina
5 - 10 minutos en agua corriente
1 minuto en agua destilada
2 minutos en Eosina
Un enjuague con agua destilada 1 minuto aprox.
Secar, poner cubre objeto, observar al microscopio con aceite de inmersin.
















COLORACION DE MAY-GRUNWALD-GIEMSA

MAY-GRUNWALD : AZUR II- EOSINA
GIEMSA : AZUL DE METILENO-EOSINA


1.-PROCEDIMIENTO PARA ESPERMATOZOIDE
Colocar una capa fina de MAY-GRUNWALD sobre un frotis durante 4 minutos
Enjuagar con agua destilada
Colocar un acapa de Giemsa diluido 1:10 en agua destilada durante 15 minutos
Enjuagar con agua destilada
Secar y montar

2.-PROCEDIMIENTO PARA CELULAS GERMINALES
IDEM SOLO CAMBIAR LA DILUCION DEL GIEMSA A 1:20


NUCLEO : AZUL-VIOLACEO
CITOPLASMA : ROSA

Se cuentan 200 espermatozoides clasificndolos como normales o anormales. Las clulas
de la espermatognesis halladas al contar los espermatozoides se informan aparte.





























Nomenclatura para algunas variables seminales


Normozoospermia: Eyaculado normal definido por los valores de referencia.
Oligozoospermia: Concentracin espermtica menor a los valores de referencia.
Astenozoospermia: Movilidad menor al valor de referencia.
Teratozoospermia Morfologa menor al valor de referencia.
Oligoastenoterato Significa alteraciones en tres variables
zoospermia: (Combinacin de 2 prefijos tambinse usar)
Azoospermia: Ausencia de espermatozoides en el Eyaculado
Aspermia Ausencia de eyaculado





Bibliografa
WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus
interaction Fourth edition 1999