MANUAL PRCTICO DE MICROBIOLOGA - Tomo I: Microbiologa Ambiental I

Manacorda A. M., Cuadros D. P y lvarez A. S. Ao 2007

CAPITULO 4
COLORACIONES
4.1. OBJETIVOS
Interpretar el fundamento de las coloraciones en la prctica microbiolgica.
Ejercitar las tcnicas de coloracin simple y compuesta.
Practicar la preparacin de coloraciones de uso a partir de soluciones madre.

4.2. INTRODUCCIN
En general, las bacterias y otros microorganismos son transparentes, lo que dificulta
su estudio cuando los exmenes se realizan en fresco. Por eso para distinguirlos del
medio es necesario hacer una coloracin (tinciones simples), las cuales tambin sirven
para contrastar o realzar distintas caractersticas morfolgicas o estructurales
(tinciones diferenciales).

La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad
especfica por algn componente celular. Existen varios tipos de colorantes, pero los
ms usados en microbiologa son: las sales colorantes y los colorantes liposolubles

a) Sales colorantes:
Los colorantes ms comnmente usados son sales que pueden ser de tipo cido o
bsico, trminos que no indican necesariamente su pH en solucin, sino que una parte
significativa de la molcula sea aninica o catinica.
Los colorantes bsicos consisten en un catin coloreado unido a un anin incoloro.
Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+).
Los colorantes cidos tienen el catin incoloro unido a un anin coloreado.
Ej: eosinato (-) de sodio (+).
Los colorantes se combinan qumicamente con el protoplasma bacteriano; si la clula
no ha muerto, el proceso de tincin la mata.
La clula bacteriana posee constituyentes celulares cargados negativamente, tales
como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos, y ellos son los ms usados en
citologa bacteriana.
Las bacterias son ricas en cidos nucleicos que poseen cargas negativas en forma de
grupos fosfatos. Los colorantes bsicos tien la clula bacteriana uniformemente, a
menos que antes sea destruido el ARN del citoplasma.
Los colorantes cidos no tien la clula bacteriana, y por lo tanto, pueden usarse para
impartir al fondo un color de contraste (coloracin negativa).
Desde el punto de vista prctico entonces, los colorantes bsicos tien estructuras de
naturaleza cida, como la cromatina nuclear de las clulas eucariotas y procariotas;
los colorantes cidos reaccionan con sustancias bsicas, como las estructuras
citoplasmticas de las clulas eucariotas.

b) Colorantes liposolubles
Los colorantes liposolubles se combinan con los componentes lipdicos de la clula,
usndose a menudo para revelar la localizacin de los depsitos de grasa. Ej. Negro
Sudn.

En algunos casos se usan mordientes con la finalidad de engrosar estructuras muy
finas, con el propsito de hacerlas visibles al microscopio ptico; uno de ellos es el
cido tnico que se emplea en la coloracin de flagelos y espiroquetas.


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4.3. TCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIN COLOREADA
Una preparacin coloreada exige la sucesin de tres pasos: preparacin del extendido,
fijacin y coloracin.

1.- Preparacin del extendido

Debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado.
Si el cultivo proviene de un medio lquido, se transfiere con ansa una gota del mismo y
se extiende hasta formar una fina pelcula que cubra el centro del portaobjetos.

Si el cultivo proviene de un medio slido, se procede as de la siguiente manera:

Con pipeta o ansa se coloca una gota de agua en el centro del portaobjetos
Se quema el exceso de cultivo que queda en el ansa, se deja enfriar y luego se
extiende la suspensin bacteriana hasta formar una fina pelcula sobre el
portaobjetos sin tocar los bordes.
Esperar hasta que el lquido se evapore o bien acelerar el proceso acercando el
portaobjteto al aire caliente de la llama del mechero.

2.- Fijacin

Este segundo paso se efecta para que los microorganismos queden adheridos al
vidrio y no se desprendan del portaobjetos con los lavados a los que hay que
someterlos posteriormente.
La fijacin coagula las sustancias proteicas de las clulas, lo cual hace que los
microorganismos queden pegados al portaobjetos. Con este procedimiento no mueren
todas las bacterias.
Existen dos tipos de fijacin: con calor (o mtodo de Koch) y fijacin qumica.

Mtodo Koch
El procedimiento ideado por Koch consiste en pasar lentamente el preparado por la
llama del mechero 3 veces seguidas, con la precaucin de llevar el extendido hacia
arriba. El inconveniente de este mtodo es que los microorganismos pueden
deformarse demasiado si el calentamiento resulta excesivo. Despus del
procedimiento, el portaobjetos debe notarse caliente pero no debe quemar cuando se
coloca en la parte posterior de la mano.

Fijacin qumica
La coagulacin del protoplasma microbiano con sustancias qumicas es lo ideal pues
las clulas no resultan deformadas. Existen varios mtodos:
- Se inunda el preparado con alcohol metlico, se deja actuar 3 minutos y se lava con
agua. Es el ms usado.
- Idem con formalina al 5 % (v/v).
- Se inunda el extendido con licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y ter
sulfrico) y se deja actuar hasta su evaporacin completa.


3.- Coloracin

En este paso se hacen actuar sobre el preparado ya fijado las soluciones de
colorantes de acuerdo al mtodo de tincin que se realice.


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4.4. TIPOS DE TINCIONES
Para la observacin microscpica existen diferentes tipos de coloraciones segn las
caractersticas morfolgicas o estructuras que quieran ponerse de manifiesto. Se
clasifican en simples y compuestas.

4.4.1. TINCIN SIMPLE
Se entiende por tincin (o coloracin) simple al teido de los microorganismos
aplicando slo una solucin colorante. Este tipo de tinciones pueden ser positivas o
negativas.

La coloracin positiva es la tincin de los microorganismos, efectuada con colorantes
bsicos que, como ya dijimos, poseen afinidad por los constituyentes celulares y se
combinan qumicamente con el citoplasma microbiano.

Tcnica: La coloracin consiste en cubrir el frotis, despus de fijado, con la solucin
colorante y se deja actuar el tiempo preciso. Luego se lava con agua y se deja secar.
Con fucsina bsica: se diluye 1/10 la solucin de uso (fucsina fenicada de
Ziehl) y se deja actuar 30 a 60 segundos.
Con violeta de genciana: se diluye al 1/10 la solucin de uso y se deja actuar
30 a 60 segundos.
Con azul de metileno: se cubre el preparado con la solucin de uso (azul de
metileno alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos.

El azul de metileno es el colorante ms dbil de los tres, razn por la cual se usa ms
concentrado y se deja actuar durante ms tiempo. Tambin a la solucin de azul de
metileno de uso se le agrega un lcali (KOH) como intensificante, que acta haciendo
ms rpida e intensa la reaccin de coloracin. Generalmente como intensificante se
usa un lcali para un colorante bsico y un cido para un colorante cido. Debido a
que el protoplasma bacteriano tiene una dbil carga negativa que aumenta al
aumentar el pH, se explica que en medios alcalinos las coloraciones de bacterias se
hagan ms intensas.

En la coloracin negativa los microorganismos quedan sin teir y se colorea el medio
que los rodea. Por lo tanto, lo que se ve es el perfil de las clulas.

La sustancia usada para la tincin negativa es un colorante opaco que no tiene
afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea a las clulas, tal
como:
Tinta china (suspensin de partculas de Carbono coloidal demasiado grandes
como para penetrar en la bacteria)
Colorantes cidos (no poseen afinidad por los constituyentes celulares). El ms
utilizado es la nigrosina dado que ofrece un mayor contraste por ser negro.

La coloracin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de los
microorganismos en microscopa ptica, pero su mxima utilidad est en revelar
estructuras como cpsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se
observan como cuerpos refringentes y espiroquetas que, por su pequeo dimetro
transversal, resulta difcil ponerlas en evidencia.

Tcnica: Mtodo de Burri (con tinta china o nigrosina). Se coloca en un extremo del
portaobjetos una gota de tinta china o nigrosina y otra de la suspensin microbiana y
se mezclan bien con el ansa. Luego, con otro porta se apoya sobre la mezcla y se
hace un extendido a lo largo del porta. Con este procedimiento el espesor del frotis va
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disminuyendo a medida que se extiende, con lo cual se conseguir una zona donde el
contraste sea el adecuado. Se deja secar bien y se observa con el objetivo de
inmersin.

4.4.2. TINCIN COMPUESTA (O DIFERENCIAL)
Aunque existen mltiples tipos de tinciones, aqu vamos a referirnos a los dos mtodos
de coloracin compuesta ms comnmente empleados en la prctica corriente del
laboratorio de microbiologa: la tincin de Gram y la de Ziehl-Neelsen. Estas
coloraciones permiten diferenciar las bacterias incluso cuando tienen igual forma y
tamao, por esta razn es una tincin diferencial.

TINCIN DE GRAM
Elaborada por Hans Christian Gram en 1884, es la ms empleada en bacteriologa.
Las etapas a seguir se detallan en la Tabla 1.
Aunque no totalmente aclarada, la propiedad de la grampositividad depende de la
naturaleza y composicin qumica de la pared o parte de ella. Se han propuesto varias
teoras para su explicacin, pero la ms aceptada es la que sostiene que las bacterias
gramnegativas son ms permeables al alcohol debido a su alto contenido en lpidos.
Cuando la bacteria se tie con el complejo colorante bsico-mordiente, ste queda
atrapado en las bacterias grampositivas y no puede ser arrastrado por el decolorante a
causa de la naturaleza fsico-qumica de su pared. Por el contrario, en las
gramnegativas es arrastrado debido a su alto contenido lipdico.



Tabla 1 Etapas en la tincin de Gram
Pasos Mtodo GRAM POSITIVA GRAM NEGATIVA
Colorante bsico
Violeta de genciana
(luego de 30 seg. se
lava con agua el
exceso de colorante)
Se tie de violeta Se tie de violeta
Mordiente
Lugol (pasado 1 min.
se lava con agua el
exceso de lugol)
Permanece violeta Permanece violeta
Decoloracin
Alcohol de 95% o
Alcohol-acetona
(durante aprox. 30
seg. y luego lavar
con agua para
eliminar el resto de
disolvente)
Permanece violeta Se decolora
Contraste
Fucsina o Safranina
(luego de 30 seg. se
lava con agua el
exceso de colorante)
Permanece violeta Se tie de rosa
Observar al
microscopios
Colocar sobre el
frotis una gota de
aceite de inmersin.
Violeta Rosa



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TINCIN DE ZIEHL- NEELSEN
El fundamento de esta tcnica diferencial se basa en la propiedad de la pared celular
de algunas bacterias del orden Actinomycetales. Tratndose de la capacidad de
resistir a la decoloracin con un alcohol y un cido fuerte cuando han sido previamente
teidas, lo cual se debe a la presencia de cidos miclicos en su pared celular.
El resto de las estructuras de estas bacterias son similares a los de las bacterias
grampositivas. Existen dos variantes de esta tcnica: una llamada en caliente y la
otra en fro (o de Kinyoun), en este trabajo desarrollaremos la tcnica en caliente.
Cualquiera de las dos tcnicas citadas consiguen, ya sea por el calor o aumentando el
tiempo de contacto, que la fucsina penetre profundamente y pueda resistir la accin
decolorante de una solucin de cido-alcohol, apareciendo los bacilos de color rosa
sobre un fondo azul (tabla 2).
Las bacterias cido alcohol resistentes (BAAR), tras la unin de la fuscina, resisten
la coloracin orgnica posterior y se vern teidas de rosa. El resto de las bacterias
se decolorarn y se teiran con azul de metileno.

Tabla 1 Etapas en la tincin de Ziehl Neelsen
Pasos Mtodo
CIDO ALCOHOL
RESISTENTE
NO CIDO ALCOHOL
RESISTENTE
Colorante bsico Fucsina . .
Calor
Calentar la
preparacin hasta
que aparezcan
humos blancos.
Lavar con abundante
agua el exceso de
colrante
Se tie de rosa Se tie de rosa
Decoloracin
Alcohol clorhidrico
(aprox. 30 seg. y
lavar el resto de
decolorante)
Permanece rosa Se decolora
Contraste
Azul de metileno
(luego de 30 seg. se
lava con agua el
exceso de colorante)
Permanece rosa Se tie de azul
Observar al
microscopios
Colocar sobre el
frotis una gota de
aceite de inmersin.
Rosa Azul

4.5. ANEXO
SOLUCIONES COLORANTES

Soluciones madre
Son soluciones saturadas de colorante, de conservacin indefinida, a partir de las
cuales se preparan las soluciones de uso mediante dilucin en medio acuoso. Las
soluciones madres se preparan en alcohol.
Preparacin: se pueden seguir dos tcnicas:
-Triturar el colorante en el mortero, agregar de a poco el alcohol e ir pasando de a
poco a un frasco color caramelo.
-Colocar el colorante en un frasco color caramelo que contiene perlas de vidrio hasta
1 cm de altura. Agregar posteriormente la cantidad de alcohol necesaria y agitar
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vigorosamente varias veces durante 2 das. Esta tcnica es la ms aconsejable por su
simplicidad y prolijidad.
Antes del uso se deja reposar 24 horas para que el colorante no disuelto sedimente.
Para preparar las soluciones de uso se pipetea del sobrenadante.

Solucin madre de fucsina bsica:
Fucsina bsica................................................ 5g
Etanol 96...................................................... 100 ml

Solucin madre de violeta de genciana:
Violeta de genciana.......................................... 5 g
Etanol 96 .........................................................100 ml

Solucin madre de azul de metileno:
Azul de metileno................................................10 g
Etanol 96............................................................100 ml

Soluciones de uso

La solucin de uso se prepara generalmente con 10 ml de la solucin madre y 90 ml
de agua. Dado que resulta una solucin hidroalcohlica, su duracin es limitada ya
que el colorante precipita al cabo de aproximadamente 2 meses. Por esta razn, los
volmenes que se preparan se deben adecuar al consumo del laboratorio.

Solucin de uso se prepara generalmente con 10 ml de la solucin madre y 90 ml de
agua. Dado que resulta una solucin hidroalcohlica, su duracin es limitada ya que el
colorante precipita al cabo de aproximadamente 2 meses, Por esta razn, los
volmenes que se preparan se deben adecuar al consumo del laboratorio.

Solucin de uso de fucsina bsica: Fucsina fenicada de Ziehl
Solucin madre de fucsina bsica....................10 ml
Fenol (cristales fundidos)...................................5 g
Agua destilada c.s.p.........................................100 ml

Solucin de uso de violeta de genciana:
Solucin madre de violeta de genciana.............10 ml
Agua destilada c.s.p.........................................100 ml

Solucin de uso de azul de metileno: Azul de metileno alcalino de Loeffler
Solucin madre de azul de metileno..................30 ml
Solucin acuosa de KOH 1/10000 c.s.p...........100 ml

Una vez preparadas estas soluciones, se deben filtrar y colocar en frascos color
caramelo.

4.6. BIBLIOGRAFA
- Manual Prctico de Microbiologa. R. Daz, y colaboradores, 2
a
edicin. Ed. Masson,
Barcelona, 1999
- Forbes, B. A.- Sahm D. F. Weissfeld A. S. Bailey y Scott, Diagnstico
Microbiolgico, 11 Edicin. Editorial Mdico Panamericana. 2004