CTEDRA DE BIOLOGA

Apunte Terico:

MICROSCOPA

2007 Dra. Ofelia Naab Ing. Agr. Carmen Torroba Lic. Valeria Caramuti

MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO

Un microscopio ptico es un instrumento que consiste bsicamente en un tubo con lentes de aumento en ambos extremos. El objeto a observar es atravesado con luz visible, que es refractada por las lentes del microscopio y as se amplifica la imagen. Permite visualizar estructuras pequeas, cuyas dimensiones son inferiores al lmite del poder de resolucin del ojo humano. Un microscopio ptico tiene dos caractersticas fundamentales: 1. la amplificacin (aumento) 2. el poder de resolucin, que a su vez depende de: a. la calidad de las lentes b. la longitud de onda de la luz que ilumina Poder de resolucin es la capacidad de separar dos puntos muy prximos y dar de ellos imgenes claras y definidas. El del ojo humano es de 100m y el de un microscopio ptico es de 0.24m. En los microscopios pticos el material biolgico a examinar se observa por transparencia, significa que la luz debe atravesar los tejidos para formar imgenes. La consecuencia de esto es que se hace necesario estudiar: - clulas aplanadas sobre la superficie de un vidrio o, - finos cortes de tejidos suficientemente delgados como para ser atravesados por radiacin luminosa. La gran mayora de los componentes celulares no tienen color debido al gran contenido de agua. Esto plantea la necesidad del uso de colorantes selectivos, los cuales presentan a la vez la dificultad de matar a las clulas, ya que previamente los tejidos deben ser fijados, deshidratados, incluidos en un material endurecible y cortados. Un microscopio ptico consta de una parte mecnica, una parte ptica y un sistema de iluminacin: 1) Parte mecnica: Consta del pie, la columna o brazo, la platina, el tubo y los tornillos macromtrico y micromtrico. El pie se encuentra en la base, suele tener forma de herradura y en l descansa el resto del microscopio. La columna o brazo, ubicada sobre el pie, sirve de soporte a los dems accesorios y debe tomarse de la misma cuando se desea trasladar el microscopio. La platina, ubicada en la parte media, de forma cuadrada o rectangular, soporta la preparacin y presenta un orificio en el centro que permite el paso de la luz; una pinza de sujecin para el preparado y sobrepuesta a ella una platina mecnica que permite mover la preparacin a voluntad en dos direcciones (llamadas Norte-Sur y Este-Oeste), mediante el movimiento de tornillos ortogonales ubicados sobre la platina o pendientes de ella. Estos tornillos pueden funcionar independientemente o ser de comando coaxial (estar sobre el mismo eje). La mayor parte de las platinas presentan una escala y un nonio que facilitan la sealizacin de posiciones 2

determinadas en la preparacin. La escala presenta lneas marcadas a un milmetro de distancia. El nonio es una escala corta que presenta 10 lneas divisorias que se corresponden con 9 divisiones de la escala principal. El tubo sostiene al sistema ptico. En su parte superior se ubican las lentes oculares que pueden ser una (en los microscopios monoculares) o dos (en los microscopios binoculares). En su extremo inferior se ubica el revlver, que es una placa giratoria que sostiene las lentes objetivos de distintos aumentos que pueden cambiarse al girar el revlver. Los tornillos macromtrico y micromtrico se utilizan para efectuar el enfoque movilizando el tubo o la platina segn el tipo de microscopio. El primero efecta un ajuste rpido y grosero, y el segundo realiza un ajuste lento y preciso. Ambos tornillos pueden estar separados o bien ser coaxiales (dispuestos sobre un mismo eje). 2) Parte ptica: Consta de las lentes oculares, los objetivos y el condensador. - Objetivos: Cada objetivo consiste en un conjunto de lentes que en realidad cumplen la funcin de una sola. Este sistema sirve para corregir errores de observacin que derivaran del uso de una sola lente. En los microscopios modernos es comn que los objetivos sean parafocales, es decir, que si se encuentra enfocado uno de ellos, al girar el revlver y cambiar por otro objetivo, ste resulta prcticamente enfocado, siendo suficiente slo una ligera correccin con el micromtrico para lograr el enfoque perfecto. En cada objetivo se pueden observar una serie de numeraciones grabadas que indican: a. Aumento b. Abertura numrica c. Espesor del cubreobjetos a utilizar, en mm.

a. Aumento: puede ser variable (4X, 16X, 20X, 25X, 40X, 45X, 60X, 95X, 100X, stos dos ltimos se utilizan como objetivos de inmersin). Respecto del aumento hay que diferenciar: 1) Aumento primario: es el dado por el objetivo en s. 2) Aumento total: es el que se obtiene multiplicando el aumento del ocular por el del objetivo. Nos dice cuntas veces est amplificada la imagen que obtenemos del material examinado. 3) Aumento til: es el aumento total del microscopio cuando no excede de cierta cantidad condicionada por la abertura numrica del objetivo. Significa que si el aumento total supera el aumento til la imagen obtenida es muy grande, pero borrosa, sin definicin. En los objetivos de tipo acromtico el mayor aumento til posible es de mil veces la abertura numrica (A.N. * 1.000), mientras que en

los objetivos ms perfeccionados, como los apocromticos o los de fluorita, el lmite de aumento til es de 1. 500 veces la abertura numrica (A.N. * 1.500). b. Abertura Numrica (AN): cada objetivo tiene un determinado poder de resolucin que se mide en trminos de abertura numrica del objetivo. Cuando un objeto es iluminado, la luz emerge de l formando un cono que penetra en la lente frontal de un objetivo. Se lo denomina ngulo de abertura; y a la mitad de este ngulo de abertura se lo llama ngulo x. El medio en el que el objetivo trabaja (aire, aceite o agua) tiene un ndice de refraccin determinado al que designamos como N. La abertura numrica se determina entonces del siguiente modo: A.N. (abertura numrica) = seno de x * N

ngulo de abertura y abertura numrica La abertura numrica determina las siguientes caractersticas pticas: 1. Resolucin: es la capacidad que posee un objetivo para separar dos puntos muy prximos entre s. 2. Lmite de resolucin: es la mnima distancia en que dos puntos prximos se ven como separados. Por lo tanto: a menor lmite de resolucin, mayor poder resolutivo

El lmite de resolucin se calcula del siguiente modo: L (lmite de resolucin):

0.61 = constante = longitud de onda de la luz incidente A.N. = abertura numrica Si se pretende poder observar estructuras muy pequeas se requiere el menor lmite de resolucin posible. Deduciendo de la frmula esto se consigue a mayor abertura numrica y a menor longitud de onda de la luz incidente. 0.61 * A.N .

- Oculares: Es un sistema de lentes que aumenta la imagen producida en el objetivo, aumento que est grabado en la parte superior (4X, 5X, 6X, 8X, 10X, 15X y 20X, siendo los ms comnmente usados los de 6X y 10X).

- Condensador: Es el tercer elemento de la parte ptica, constituido por una lente que concentra los rayos de luz iluminando la preparacin en la parte enfocada por el objetivo, de modo que el campo visual presente una iluminacin uniforme. Adems proporciona al objetivo un cono de luz adecuado en tamao y naturaleza, para obtener ptimos resultados en la observacin. El condensador presenta hacia uno o ambos lados un tornillo para subirlo o bajarlo segn las necesidades. Adems presenta un diafragma semejante al de una cmara fotogrfica que deja penetrar slo los rayos tiles y elimina los laterales que generalmente molestan. Antes de enfocar, el diafragma debe estar completamente abierto, gradundose a continuacin su abertura segn los aumentos del objetivo. Con altos aumentos el diafragma debe estar ms abierto que con los bajos aumentos.

3) Sistema de iluminacin: Los microscopios ms antiguos presentan como sistema de iluminacin un espejo con una cara plana y la otra cncava. Este espejo recibe los rayos luminosos de una fuente natural o artificial y los enva hacia la parte ptica. Siempre que se use el condensador, el espejo debe enfocarse en su cara plana ya que la cara cncava acenta demasiado la convergencia de los rayos, cosa que ya cumple el condensador. Actualmente los microscopios presentan un sistema de iluminacin incorporada con una bombilla de bajo voltaje y de intensidad regulable con un transformador.

Tipos de observacin: Segn la forma de iluminacin una observacin con un sistema ptico de aumento puede ser: a. Por reflexin: se realiza cuando la iluminacin se hace desde arriba del objeto. Se utilizan pocos aumentos y el microscopio con el que se efecta se denomina estereoscpico o lupa. b. Por refraccin o transparencia: se realizan con luz transmitida desde abajo. Para ello los objetos a ver deben ser lo suficientemente transparentes. Este es el caso del microscopio ptico. Por otro lado, una observacin tambin puede ser seca o por inmersin: Observacin seca: se realiza sin colocar lquido alguno entre el cubreobjetos del preparado y el objetivo. Observacin por inmersin: en ella se coloca entre el cubreobjetos y el objetivo una gota de aceite de inmersin (con ndice de refraccin de 1.5, que es el del vidrio) que mejora la imagen por aumento de la abertura numrica. De este modo, todos los medios atravesados por la luz tienen un mismo ndice de refraccin. La imagen obtenida es ms luminosa y ms clara. Para hacer inmersin se utiliza el objetivo de mayor aumento (95X o 100X).

Tcnica de la inmersin: Consiste en colocar una gota de aceite de inmersin entre el cubreobjetos y la lente frontal del objetivo de mximo aumento. Para ello, teniendo ya enfocado el objeto en un aumento menor, se gira levemente el revlver, se coloca una pequea gota de aceite sobre el cubreobjetos, luego se sigue girando hasta enfocar el objetivo de mayor aumento y se procede al ajuste con tornillo micromtrico. Terminada la observacin se eleva el tubo o se baja la platina y se limpia el objetivo con papel de seda o gnero suave que puede estar humedecido en un detergente especial para lentes. Nunca debe utilizarse para limpiar la lente alcohol ni xilol, ya que stos deterioran el cemento que aglutina las lentes. Dada la reducida distancia de trabajo que existe cuando se utilizan objetivos de 40X a 100X (que llega a ser tan slo 0.12 mm) puede suceder que la lente frontal tome contacto con el cubreobjetos con lo cual dicha lente puede rayarse o desplazarse hacia atrs. Por ello es necesario evitar todo contacto entre el objetivo y el cubreobjetos. Para evitar estos peligros en la actualidad estos objetivos cuentan con un muelle protector situado en el interior del tubo del objetivo. Sin embargo se debe tener precaucin pues los microscopios antiguos no presentan este mecanismo de seguridad.

MANEJO DEL MICROSCOPIO Procedimiento Levantar el tubo o bajar la platina. Colocar la preparacin microscpica en la platina. Colocar el objetivo de rastreo (menor aumento). Bajar el tubo (o subir la platina), observando por el costado, (no por el ocular), hasta hacer tope o bien hasta que la lente frontal del objetivo se encuentre ms o menos a 1 mm del cubreobjeto. 5. Regular la iluminacin: a. Colocar la lmpara a unos 25 cm. b. Usar el espejo plano y centrarlo mirando por el tubo hasta que el campo quede uniformemente iluminado. c. Abrir completamente el diafragma. d. Subir del todo el condensador. 6. Centrar el objeto debajo del objetivo mirando por el costado. 7. Levantar el tubo con el tornillo macromtrico hasta lograr una observacin lo ms ntida posible, posteriormente ajustar la misma con el tornillo micromtrico. 8. Ajustar la iluminacin: a. bajando levemente el condensador. b. cerrando el diafragma lo necesario. 9. Buscar el mejor lugar para observar (bordes). 10. Cambiar de objetivo, sin levantar el tubo, hasta obtener el aumento deseado. 1. 2. 3. 4.

Recomendaciones para el uso del microscopio ptico 1. Comience siempre las observaciones con el objetivo de menor aumento. Esto le dar una visin integral del preparado y le permitir seleccionar las mejores reas o las de especial inters, que luego observar con mayores aumentos. 2. La iluminacin debe ser homognea y de buena intensidad, pero no excesiva y deber modificarla de acuerdo con el objetivo que est utilizando. 3. Nunca acerque el objetivo al preparado si no est mirando por el costado del microscopio. As evitar la destruccin de muestras y lentes. 4. Siempre que haga una observacin, ajuste el enfoque con el tornillo micromtrico, aun cuando ya haya sido enfocado por otra persona previamente (es usual que existan diferencias de enfoque entre un observador y otro). 5. Recuerde que el microscopio ptico otorga imgenes invertidas del objeto, por lo tanto el movimiento que realice de la platina ser inverso al corrimiento de la imagen. 6. Todo dibujo que realice de la observacin debe ser esquemtico, respetando las proporciones de los elementos que observa. Evite sobrecargarlo de detalles de cuyo origen no est seguro (burbujas de aire, granos de colorante u otras imperfecciones del preparado). Evite sombrearlo. 7. No siempre es ideal el mximo aumento. 8. Los portaobjetos y cubreobjetos deben estar limpios y secos. 9. Debe ser prudente con la cantidad de lquido de montaje que utiliza. 10. Cuando deba realizar un corte hgalo siempre lo ms fino posible, as evitar la superposicin de capas. 11. Luego de su uso, limpie los objetivos con un pao.

VARIANTES EN MICROSCOPA PTICA a. Campo brillante (muestra no coloreada). La luz pasa directamente a travs de la muestra. A menos que la clula est naturalmente pigmentada o teida de forma artificial, la imagen tiene poco contraste. b. Campo brillante (muestra coloreada). La tincin con varios colorantes refuerza el contraste, pero la mayora de los procedimientos de tincin exigen que las clulas sea fijadas (preservadas) lo que implica la muerte celular. c. Contraste de fases. Aumenta el contraste en las clulas no coloreadas amplificando las variaciones en la densidad dentro de la muestra; es especialmente til para examinar clulas vivas, no pigmentadas. d. Contraste de interferencia diferencial (Nomarski). Como el anterior, utiliza modificaciones pticas para exagerar las diferencias de densidad, lo que hace que la imagen parezca casi tridimensional. e. Fluorescencia. Muestra la localizacin de molculas especficas en la clula marcndolas con colorantes o anticuerpos fluorescentes. Estas sustancias fluorescentes absorben la radiacin ultravioleta y emiten luz visible. f. Confocal. Utiliza lseres y pticas especiales para la seccin ptica de muestras teidas con sustancias fluorescentes. Slo se ilumina un nico plano del foco; la fluorescencia fuera de foco por arriba y por debajo de este plano se sustrae mediante ordenador. El resultado es una imagen ms ntida.

Observacin de clulas epiteliales de la mucosa interna de la mejilla humana con distintos tipos de microscopios pticos (*). En b) con campo brillante (luz transmitida), en c) con campo oscuro, en d) con contraste de fases y en e) con interferencia diferencial de Nomarski. Los microscopios de contraste de fases y de interferencia diferencial intensifican las diferencias de densidad ptica en distintas regiones de la clula.
*Extrado de Solomon et al. 2001.

UNIDADES DE USO CORRIENTE EN MICROSCOPIA mm (milmetro)= 0.001 m = 1 * 10-3 m m (micrmetro, micrn o micra) = 0.001 mm = 1 * 10-3 mm = 1 * 10-6 m nm (nanmetro) = 0.001 m = 1 * 10-3 m = 1 * 10-6 mm = 1 * 10-9 m (Angstrm) = 0.l nm = 1 * 10-1 nm = 1 * 10-4 m = 1 * 10-7 mm = 1 * 10-10 m.

MICROSCOPIO SIMPLE, ESTEREOSCPICO O LUPA Consta de dos microscopios completos, cada uno con su objetivo y su ocular, cuyos ejes forman un ngulo de 15. Por tal razn las imgenes de los oculares son distintas, como ocurre con la visin normal de una persona. Con ello se logra una imagen tridimensional, o sea, con longitud, anchura y profundidad (imagen estereoscpica). Produce imgenes derechas, diferencia principal con el microscopio ptico, facilitando la manipulacin del material ya que todo se ve en su posicin real. Los tubos son separables para adaptarlos a las distintas distancias interpupilares de los usuarios. Adems, uno de los tubos posee un tornillo de ajuste del enfoque para compensar las posibles diferencias pticas entre los dos ojos. En cuanto a los aumentos, la gama de ellos es menor que la que se puede lograr con los microscopios corrientes, En general el tenor de aumentos va desde el que se puede lograr con una lupa de mano (2.5X) hasta 100X o 140X. Presenta un lmite de resolucin de 3m. Este instrumento es muy til para observar rganos florales, nervaduras de hojas y, en general, para hacer observaciones referidas a organografa.

Observacin de un caro en una hoja utilizando microscopio estereoscpico

MICROSCOPA ELECTRNICA

En 1924 de Broglie descubri el carcter ondulatorio de los rayos de electrones lo que constituy un prerrequisito para la construccin del microscopio electrnico. El primer microscopio electrnico (ME) fue construido por Knoll & Ruska, en Berln (1932) y uno de los primeros objetos biolgicos descriptos fue el virus del mosaico del tabaco. La primera imagen de una clula fue publicada en 1945. Hacia el 1950 se mejoraron las tcnicas y los microscopios electrnicos y se comenz a estudiar los detalles finos de la estructura celular o ultraestructura. Mientras el MO aumenta un objeto hasta 1.000 veces, el ME lo hace hasta 250.000 veces, siendo su capacidad de resolucin 10.000 veces superior a la del ojo humano. La gran diferencia entre el MO y el ME se estableci cuando se logr modificar la fuente de iluminacin: mientras que para el MO es la luz visible, cuya longitud de onda () va de los 380 nm a los 750 nm, el ME utiliza un haz acelerado de electrones, cuya se reduce a 0,005 nm. Sin embargo, la estrecha apertura numrica impuesta por la gran aberracin de las lentes electromagnticas, fija los valores corrientes para el lmite de resolucin del ME en alrededor de los 0,3 nm. El ME utiliza la propiedad que tienen los haces de electrones de ser desviados por un campo electrosttico o electromagntico, de la misma forma que un rayo de luz es refractado al atravesar una lente. Existen dos tipos de microscopios electrnicos (ME): Microscopio Electrnico de Transmisin (MET), en el cual el preparado est interpuesto en el trayecto electrnico pudindose observar la estructura interna del mismo y sus detalles ulraestructurales. Microscopio Electrnico de Barrido (MEB), en el que un fino haz de electrones recorre la superficie de la preparacin y brinda imgenes de tipo tridimensional.

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Microscopio Electrnico de Transmisin El MET brinda imgenes planas y monocromticas (en distintas tonalidades de gris) de cortes ultradelgados. Por lo tanto, a fin de reconstruir el aspecto tridimensional de una clula, es necesario estudiar muchos cortes transversales consecutivos (llamados cortes seriados) del objeto. Esto constituye el equivalente a reconstruir el contenido de una casa a partir del conjunto de una centena de cortes consecutivos de 5 cm. El funcionamiento de este ME es el siguiente: Si se coloca un filamento de tungsteno en un tubo al vaco y luego se lo calienta, ese filamento emite electrones que pueden ser acelerados por medio de un potencial elctrico. En estas condiciones un haz de electrones tiende a seguir una trayectoria rectilnea y presenta algunas propiedades similares a las de la luz. El filamento de tungsteno (o ctodo) del microscopio electrnico emite una corriente de electrones que acta como fuente termoinica.

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Por medio de una bobina electromagntica, que hace las funciones de condensador, los electrones se concentran en el plano donde se coloca el objeto. La segunda bobina funciona como una lente objetivo y da una imagen agrandada del objeto. Esta es recibida por una tercera lente electromagntica que acta como ocular o lente de proyeccin, que aumenta la imagen que proviene del objetivo. La imagen final se ve sobre una pantalla fluorescente y eventualmente se registra sobre una placa fotogrfica. Una cmara de televisin acoplada puede recoger tambin la imagen y transferirla a un monitor, a una impresora de video o a un analizador digital de imgenes. Una de las diferencias entre el ME y el MO es en cuanto al mecanismo de formacin de la imagen. En el ME la imagen se debe principalmente a la dispersin de los electrones cuando estos chocan con las molculas de la muestra. Generalmente, cuando los electrones se aproximan a los tomos del objeto son desviados por stos porque: son repelidos por la nube de electrones, atrados por la carga positiva de los ncleos atmicos, o dispersados en forma elstica o inelstica por colisiones atmicas. La imagen observada en la pantalla fluorescente es el resultado de la ausencia de esos electrones, que fueron detenidos por caer fuera de la abertura de la lente objetivo o por haber perdido gran parte de su energa en las colisiones. La dispersin de electrones depende del espesor y la densidad molecular del objeto, y en especial del nmero atmico de los tomos que entran en su composicin. A mayor nmero atmico, mayor dispersin. Ahora bien, gran parte de los tomos que componen las estructuras biolgicas son de bajo nmero atmico (como el hidrgeno, el carbono, el oxgeno, el nitrgeno y el fsforo) y contribuyen poco a la formacin de la imagen. Por esta razn se deben agregar tomos pesados a la estructura molecular para aumentar el contraste. Otra diferencia con el MO es que el ME tiene mayor profundidad de foco, lo que se ha usado para desarrollar la microscopa tridimensional de cristales de protena y hasta de organelas celulares, como los ribosomas. Esta propiedad es especialmente importante en el microscopio electrnico de barrido.

Microscopio Electrnico de Barrido Permite el estudio de superficies, otorgando imgenes tridimensionales y monocromticas (en distintas tonalidades de gris). En el MEB el haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que sta es recubierta por una delgada pelcula de oro u oro-paladio. Cuando el haz de electrones se topa con diversos puntos de la superficie de la muestra, se emiten electrones secundarios cuya intensidad vara segn el contorno de la superficie. Los patrones de emisin registrados de los electrones secundarios generan una imagen tridimensional de la superficie de la muestra que es recogida en una pantalla de televisin. Este tipo de micrografa permite obtener informacin respecto de la forma y caractersticas externas de la muestra que no pueden obtenerse con el MET. La utilidad del MEB es similar a la que presenta la lupa o microscopio estereoscpico, pero con un poder de resolucin muy superior, del orden de los 60 , profundidad de campo y magnificacin de la imagen (hasta 150.000 aumentos).

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Consiste en: Un filamento de tungsteno que emite electrones y un nodo que los atrae y acelera. Bobinas deflectoras que desplazan el haz de electrones de manera tal que exploran la superficie de la muestra mediante un barrido horizontal y otro vertical. Los electrones llegan a la superficie de la muestra, interaccionan con tomos de la misma, emitindose electrones secundarios de baja energa. La cantidad de electrones secundarios emitidos por cada punto es proporcional al tipo de superficie (las hendiduras emiten menos electrones que las proyecciones). Un detector colecta los electrones secundarios. Luego se produce una amplificacin y los electrones envan su impulso elctrico a un monitor dando distintos tonos (gris cuando llega regular cantidad de electrones, blanco cuando llegan muchos y negro cuando llegan pocos), pudindose obtener luego fotomicrografas.

Cabe recalcar que los electrones no atraviesan la muestra sino que interaccionan con ella para que emita otros electrones. Por ello la muestra no presenta limitaciones de tamao ni de espesor. Adems, toda la trayectoria de los electrones se cumple en un tubo de alto vaco. En la siguiente ilustracin se muestra una comparacin entre el MO, MET y MEB(*). Las fotomicrografas corresponden al protista Paramecium. En a) observado con un microscopio ptico de contraste de fases. En b) observado mediante MET, se obtiene una imagen de alta resolucin que puede amplificarse mucho; debido a ello, en la micrografa slo se observa una parte de la clula de Paramecium. En c) con el MEB se observan claramente caractersticas superficiales.
*Extrado de Solomon et al. 2001.

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MO MET

Observacin de granos de polen de girasol con MO, MEB y MET

MEB

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ESCALA LOGARITMICA DE LAS DIMENSIONES MICROSCPICAS Cada divisin principal representa un tamao diez veces menor que la precedente. A la izquierda se indica la posicin de las diferentes longitudes de onda del espectro electromagntico y los limites de resolucin del ojo humano, la luz y el microscopio electrnico. A la derecha se da el tamao de diferentes clulas y tomos (segn De Robertis y otros, 1977).

GENERALIDADES DE TCNICAS HISTOLGICAS

PARA MICROSCOPA PTICA: FIJACION DEL MATERIAL A OBSERVAR El material a observar puede ser fresco o encontrarse fijado. La fijacin es una operacin destinada a matar las clulas lo ms rpidamente posible y conservarlas en el estado ms parecido al que tenan mientras estaban vivas. Un fijador debe tener rpido poder de penetracin de modo que la fijacin se efecte tanto en la parte superficial como en los tejidos profundos, y debe ser cido para producir la coagulacin paulatina y total de las protenas a los efectos de que las clulas no sufran contracciones.

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Los fijadores ms comnmente utilizados son: FAA: es una mezcla de formol, alcohol etlico, cido actico y agua. Farmer: es una mezcla de alcohol etlico absoluto y cido actico glacial. Carnoy: es una mezcla de alcohol etlico 96, cido actico glacial y cloroformo. CORTES DE MUESTRAS Orientacin: Los cortes de muestras cilndricas (tallo, raz) pueden realizarse en los siguientes sentidos: a. Transversal: en un plano perpendicular al eje mayor del rgano. b. Longitudinal radial: en un plano paralelo al eje mayor del rgano cuando el plano de corte coincide con un dimetro. c. Longitudinal tangencial: en un plano paralelo al eje mayor del rgano cuando el plano de corte es paralelo a un dimetro.

Tipos de corte: 1. Corte a mano libre o a mano alzada: se realizan con hoja de afeitar o navaja. Se utilizan para observaciones rpidas y sin mucho detalle pues su espesor generalmente es mayor de 20 m. Se puede efectuar directamente sobre el material o bien utilizando mdula de saco o hinojo, o trozos de raz como la zanahoria, que actan como soporte del material acortar. 2. Cortes con micrtomo de mano: poco usado actualmente pues con l se logran cortes semejantes en espesor a los cortes a mano libre. Consta de una platina circular en cuyo interior existe una pinza de sujecin que acta mediante un tornillo exterior y en la que se ubica el elemento a cortar. Mediante otro tornillo se coloca a nivel de platina el objeto a cortar y luego se lo hace sobresalir de acuerdo al espesor que se desea obtener, mediante la escala ubicada en el pie del micrtomo. El corte se efecta con navaja bien afilada, realizando primeramente un corte de limpieza y luego los definitivos. 3. Cortes con micrtomo de cuchilla metlica: se obtienen cortes de entre 5 y 20 m de espesor segn el tipo de micrtomo, pudindose obtener cortes en serie con

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espesor controlado. El material a cortar puede ser fresco o fijado, blando o duro (madera), incluido o no en parafina, segn las caractersticas del micrtomo. Entre ellos se encuentran: a. Micrtomo de deslizamiento. b. Micrtomo de congelacin. c. Micrtomo rotario o Minot. 4. Cortes con ultramicrtomo: emplea cuchillas de vidrio o diamante y permite obtener cortes de 750 a 1m de espesor. Se utilizan para efectuar observaciones con Microscopio Electrnico de Transmisin.

PREPARADOS Para obtener un preparado microscpico se procede, una vez realizado el corte, al montaje. Esto consiste en colocar entre el portaobjetos y el cubreobjetos un medio apropiado para la observacin y conservacin del mismo. Estos medios pueden ser lquidos o slidos y sern ms apropiados cuando su ndice de refraccin sea ms parecido al del vidrio empleado en el instrumental ptico (1.5 -1.6). Los preparados microscpicos se pueden clasificar en: a. Preparados de contraste: son aquellos en los que se utiliza algn colorante que tie las distintas partes del objeto creando entre ellas un gran contraste. b. Preparados de fase: no reciben coloracin y es necesario observarlas con el Microscopio de Contraste de Fase. Segn el tiempo de duracin del preparado, ste puede ser: a. Transitorio: cuando se utiliza como lquido de montaje agua con algn colorante. b. Semipermanente: cuando el medio de montaje es agua glicerinada (al 50%). c. Permanente: cuando el medio de montaje puede ser gelatina-glicerina, blsamo de Canad o resinas artificiales.

COLORACION Colorante es una sustancia que posee color y es capaz de cederlo al combinarse con otra. Puede ser natural (ej.: carmn, hematoxilina, orcena) o artificial (safranina, verde rpido o fast-green, rojo neutro). Si el material teido presenta color semejante al del colorante se dice que este es ortocromtico (ej.: safranina). Si el colorante tie de distinto color estructuras diferentes, se dice que es metacromtico (ej.: violeta de cresilo que tie de verde paredes celulares secundarias y de violeta paredes celulares primarias). Colorantes ms utilizados en estudios de Anatoma Vegetal: Safranina: tie de rojo intenso paredes celulares lignificadas y cutculas, cromosomas y ncleo, y de color rosado el citoplasma. Verde Rpido o Fast Green: tie de color celeste verdoso el citoplasma, las paredes primarias y las paredes secundarias no lignificadas. Carmn: tie cromosomas. Hematoxilina: tie cromosomas y ncleo.

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 Verde Jano: tie mitocondrias de verde brillante y las paredes celulares de verde. Azul de anilina: tie la calosa. Floroglucinol: tie la lignina. Segn su accin sobre el metabolismo celular los colorantes se clasifican en: b. Vitales: permiten la observacin en vivo de la clula, pues no daan su estructura. Entre ellos tenemos los vacuolares, como el azul de metileno soluble en agua y en alcohol, rojo neutro, violeta neutro, azul brillante de cresilo. c. Subletales: daan la clula en un tiempo relativamente largo, permitiendo observarla como en vivo. Son los colorantes como el Verde Jano y el Violeta de metilo que colorean las mitocondrias, el Violeta dalia y el Violeta cristal que colorean el ncleo y la Rodamina que colorea los cloroplastos. d. Letales: permiten la observacin de estructuras una vez muerta la clula. En general son cidos. Ej.: Eosina, Fucsina, Safranina, Hematoxilina y Carmn.

Fotomicrografa de un corte transversal de hoja de Nerium sp, coloreada con tincin doble Safranina Fast Green.

Fotomicrografa de la epidermis de Allium sp (cebolla) en vista superficial.

PARA MICROSCOPA ELECTRNICA DE TRANSMISIN: La preparacin del material biolgico para MET incluye: - Fijacin habitual y refijacin con tetrxido de osmio (que fija la porcin lipdica y a la vez aumenta el contraste posterior) y aldehdos (que fijan la porcin proteica). - Deshidratacin: esto es necesario ya que de lo contrario se calcinara la muestra debido a la exposicin al alto vaco que provoca la ebullicin del agua (principal componente de los materiales biolgicos). - Inclusin en resinas epoxi; de stas la ms utilizada actualmente se llama Spurr. - Curado: es la polimerizacin de la sustancia de inclusin. Esta etapa y la anterior son necesarias para realizar la siguiente, el corte. - Corte con ultramicrtomo provisto de cuchilla de cristal o diamante, que permite obtener cortes de un espesor de los 50 a los 100 nm. Este espesor permite el paso de los electrones. - Montaje de los cortes en una pequea rejilla metlica. - Impregnacin con sales de metales pesados, como plomo y uranio para aumentar el contraste. Estas sales como colorantes electrnicos, comparables con los

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colorantes histolgicos, al combinarse selectivamente con determinadas regiones del espcimen PARA MICROSCOPA ELECTRNICA DE BARRIDO: Para la preparacin del material a observar con MEB, los pasos son: - Fijacin - Deshidratacin: tambin es necesaria para evitar que el alto contenido de agua de los materiales biolgicos entre en ebullicin al colocarlos en el alto vaco. - Secado - Adhesin a un soporte. - Metalizacin de la superficie de la muestra, con una delgada capa de oro-paladio o de oro, efectuado en alto vaco en aparatos de evaporacin. Este paso es necesario ya que el material biolgico no emite electrones al ser irradiado y mediante la metalizacin se logra que la superficie de la muestra quede elctricamente conductora.

Bibliografa: ALBERTS, B.; D. BRAY; J. LEWIS; M. RAFF; K. ROBERTS & J.D. WATSON. 1996. "Biologa Molecular de la Clula". Ediciones Omega S.A., Barcelona. 3 ed. CAMPBELL, REECE. 2007. Biologa. 7 ed. Ed. Mdica Panamericana. Madrid. D AMBROGIO DE ARGUESO, A. 1986. "Manual de Tcnicas en Histologa Vegetal". Editorial Hemisferio Sur S.A. DE ROBERTIS (h.), HIB, PONZIO. 2005. "Biologa Celular y Molecular de De Robertis". El Ateneo. Bs. As. ROBINSON et. al. 1987. Methods of preparation for electron microscopy. An introduction for the biomedical sciences. Springer-Verlag. Berlin. SOLOMON, BERG, MARTIN. 2001. Biologa 5 ed. Mc Graw Hill. Mexico.

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Caractersticas Fuente de iluminacin

MO Lmpara de incandescencia (fotones) Invertidas, planas y policromticas

(dependiendo de la muestra y/o coloracin empleada)

LUPA Lmpara de incandescencia (fotones) Directas, tridimensionales y policromticas

(dependiendo de la muestra y/o coloracin empleada)

MET Filamento de tungsteno (electrones)

MEB Filamento de tungsteno (electrones)

Proporciona imgenes

Directas, Directas, planas tridimensionales y y monocromticas monocromticas Dispersin de electrones 1,4 a 3 0,005 nm Hasta 1.000.000 Muerto Alto vaco Tetrxido de osmio y aldehdos Resinas Epoxi Ultramicrtomo con cuchilla de cristal o de diamante 50 100 nm
(hasta 1000 nm)

Imagen dada por Lmite de resolucin Longitud de onda empleada Aumentos Material biolgico Tubo

Refraccin de rayos luminosos 0,25 m 550 nm 40 a 1500 Vivo o muerto Con aire FAA Faramey Carnoy Gelatinaglicerina Blsamo de Canad Micrtomo

Reflexin de rayos luminosos 3 m 550 nm 100 a 140 Vivo o muerto Con aire

Dispersin de electrones 60 0,005 nm 150.000 Muerto Alto vaco

Fijadores

Medios de inclusin Aparatos para efectuar los cortes Espesor de los cortes

5 20 m

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