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TTULO:

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RESUMEN: Este documento describe las actividades para la validacin de Mtodos de Ensayo no- normalizados, desarrollados o diseados por el Laboratorio, mtodos normalizados empleados fuera d el alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los mtodos normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que un laboratorio puede aplicar correctamente los mtodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos.

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CONTENIDO

1. OBJETIVO ............................................................................................................................ 3 2. ALCANCE ............................................................................................................................ 3 3. DOCUMENTACIN DE REFERENCIA ...........................................................................3 4. ABREVIA TURAS Y DEFINICIONES ................................................................................ 3 5. RESPONSABILIDADES.....................................................................................................5 6. DESCRIPCIN .................................................................................................................... 5

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1. OBJETIVO Establecer una gua para las actividades para la validacin de mtodos de ensayo no normalizados, desarrollados o diseados por el Laboratorio, mtodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los mtodos normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que puede aplicar correctamente los mtodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos. Regular o sistematizar los mtodos para la validacin de las instrucciones de ensayo y de calibracin. El objetivo de la validacin es probar la aptitud de los m todos, as como la capacidad del laboratorio. La validacin se apoya en los parmetros estadsticos del procedimiento. Los procedimientos y el alcance de la validacin no son siempre los mismos y deben ser establecidos individualmente. 2. ALCANCE Esta gua la deben aplicar los laboratorios de ensayo acreditados ante el OAA, los laboratorios que solicitan su acreditacin, y los evaluadores y expertos tcnicos que actan en los procesos de acreditacin, a todos los mtodos de ensayo establecidos. 3. DOCUMENTACIN DE REFERENCIA 3.1. MC -OAA : Manual de la Calidad del OAA: 2003. 3.2. Norma IRAM 301:2000-Norma ISO/IEC 17025: 1999. 3.3. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. EURACHEM Guide. Editor: H. Holcombe, LGC, Teddington: 1998. 3.4. NORMA IRAM 32: : Metrologa. Vocabulario VIM: 1997. 3.5.Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. Guide EURACHEM- CITAC Guide: 2000. 3.6. Norma ISO 9000: 2000. 3.7. IUPAC, Limit of Detection, Spectrochi m. Acta 33 B, 242, 1978. 4. ABREVIA TURAS Y DEFINICIONES 4.1. ABREVIATURAS ISO: International Standardization Organization IRAM: Instituto Argentino de Normalizacin.

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IEC: International Electrotechnical Commission. VIM: International Vocabulary of basic and general terms in Metrology. QUAM: Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. IUPAC: International Union for Pure and Applied Chemistry.

4.2. DEFINICIONES Validacin: Confirmacin mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos para una utilizacin o aplicacin especfica prevista (3.4.) Verificacin : Confirmacin mediante la aportacin de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos especificados. (3.4.). Valor verdadero convencional (de una magnitud): valor atribuido a una magnitud particular, y aceptado a veces por convencin, porque la representa, con una incertidumbre apropiada, para un fin dado (3.4.). Mesurando : magnitud particular sometida a medicin (3.4.). Incertidumbre de medida : Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que caracteriza la dispersin de los valores que podran ser razonablemente atribuidos al mesurando (3.4.). Exactitud de una medicin: proximidad entre el resultado de una medicin y el valor verdadero del mesurando (3.4.). Repetibilidad (de los resultados de las mediciones): proximidad entre los resultados de mediciones sucesivas del mismo mesurando, realizadas bajo las mismas condiciones de medicin. (Aplicacin de un mismo procedimiento, a un mismo objeto, por el mismo operador, en intervalos cortos de tiempo, con el mismo equipamiento instrumental, en el mismo lugar) (3.4.). Reproducibilidad : Proximidad entre los resultados de mediciones de un mismo mesurando, realizadas bajo distintas condiciones de medicin. (3.4.). Precisin intermedia : magnitud que relaciona la variacin en los resultados observados cuando uno o ms factores, tales como tiempo, equipamiento, operador, varan dentro de un mismo laboratorio (3.5.). Lmite de deteccin : es la menor cantidad que puede ser distinguida del fondo con cierto nivel de confianza especificado. Para un resultado analtico que es muy cercano al valor del blanco, se plantea la duda de si el valor corresponde a valores aleatorios del blanco o a la presencia real del analito. La seal del fondo es producida es producida por el blanco y exhibe ruido. El lmite de deteccin (LD) corresponde a una seal k veces la desviacin estndar del ruido del fondo. Tpicamente el valor de k es igual a 3 (LD=3F ). Los valores por

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encima del LD pueden ser atribuidos a la presencia del analito y los valores por debajo del LD son indicativos de la ausencia de analito en cantidades detectables (3.7.). Lmite de cuantificacin : es la menor cantidad que puede ser determinada cuantitativamente con u na incertidumbre asociada, para un dado nivel de confianza. Para el anlisis cuantitativo debe quedar absolutamente claro que slo se emplean valores atribuibles al analito. El lmite de cuantificacin es entre 3 y 10 veces el LD (LD= 3 F), segn cada caso (3.7.). 5. RESPONSABILIDADES La aplicacin de este documento es responsabilidad del personal del OAA involucrado en el proceso de acreditacin y del personal de los laboratorios acreditados y de aquellos que solicitan su acreditacin. 6. DESCRIPCIN La realizacin de actividades de validacin de los mtodos de ensayo utilizados por el propio laboratorio, contemplan la satisfaccin de las necesidades del cliente y la adecuacin para realizar los ensayos previstos. El laboratorio debe confirmar que puede aplicar correctamente los mtodos normalizados previo a su uso en ensayos o calibraciones. Cualquier variacin en el mtodo normalizado implica la repeticin de dicha confirmacin. Para el caso de metodologas de ensayo o de calibracin desarrolladas por el laboratorio los mtodos deben ser adecuada y totalmente validados antes de su uso. Los equipos tambin deben ser calibrados y/ o validados antes de su uso. 6.1. Requisitos Generales El OAA establece las siguientes recomendaciones: 6.1.1. Principio de la validacin Cada validacin de un procedimiento consiste en tres pasos. 1. Establecimientos de las condiciones por cumplir (por ejemplo : lmite de deteccin < 1 mg/L, intervalo lineal mayor a 2 rdenes de magnitud, incertidumbre de los resultados <20% en todo el intervalo de trabajo, para el caso de la validacin de un mtodo analtico general. No puede establecerse como principio de validacin para otros tipos de mtodos de ensayo). 2. Determinacin de los parmetros estadsticos del procedimiento.

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3. Valoracin de los resultados de la validacin por comparacin de los parmetros estadsticos obtenidos con las condiciones y decisin sobre la validez del procedimiento para el propsito establecido. 6.2. Establecimiento de las condiciones y alcance de la validacin 6.2.1. Establecimiento de las condiciones En el caso ms sencillo ya fueron establecidas por el cliente del laboratorio o por alguna instancia oficial. Si ste no es el caso, el responsable del ensayo debe establecerlas lo ms de acuerdo posible con el cliente del laboratorio. Cuando no es posible contactar al cliente del laboratorio, debe definirlas el responsable del ensayo de manera confiable y cientfica. 6.2.2. Establecimiento del alcance de la validacin Se diferencian tres casos, en los que la dificultad de la validacin aumenta del primero al tercero: 1. Se trata de un mtodo de ensayo estandarizado y normalizado, que se aplica exactamente como est descripto en la norma. 2. Se trata de una modificacin a un mtodo de ensayo normalizado, por ejemplo, se hicieron modificaciones a los mtodos descriptos en la norma que pueden tener una repercusin sobre la calidad de los resultados. Ejemplos: un mtodo de extraccin diferente, otra matriz. 3. Se trata de un mtodo de ensayo interno, elaborado en el laboratorio y que no se encuentra en normas u otras colecciones de mtodos. La validacin en los casos descriptos tiene objetivos distintos y, por lo tanto, diferentes puntos esenciales, como muestra la tabla 1. Tabla 1: Objetivos de la validacin segn el tipo de procedimiento de ensayo Mtodo de ensayo Caso 1: normalizado Objetivos de la validacin

mtodo Comprobacin de que el laboratorio domina el ensayo y lo utiliza correctamente.

Caso 2: modificacin Comprobacin de que la repetibilidad, la reproducibilidad, la de un mtodo precisin intermedia y la exactitud del mtodo original no normalizado dependen de la modificacin introducida y que el laboratorio domina el ensayo y lo utiliza correctamente. Caso interno 3: mtodo Comprobacin de que el mtodo tiene la repetibilidad, la reproducibilidad, la precisin intermedia y la exactitud suficientes para el objetivo de aplicacin y que el laboratorio domina el ensayo y lo realiza correctamente.

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Tabla 2: Alcance de la validacin segn el tipo de procedimiento de prueba

Mtodo de ensayo Caso 1: mtodo normalizado

Parmetros estadsticos recomendados / medidas de validacin 1. Comprobacin del cumplimiento de los parmetros estadsticos, p. ej. incertidumbre de los resultados, repetibilidad, exactitud, lmite de deteccin (siempre y cuando se indiquen en la norma). 2. Elaboracin de una carta de control analizando un material de referencia. 3. Participacin en ensayos interlaboratorios.

Caso 2: Modificacin de un 4. Adems de lo indicado para el caso 1 de esta mtodo normalizado Tabla, probar parmetros estadsticos determinados, ver 6.2.2.1. Caso 3: Mtodo interno 5. Adems de lo indicado para el caso 1 de esta Tabla, probar todos los parmetros estadsticos posibles, ver 6.2.2.2

El alcance de la validacin determinado por el responsable del ensayo, o bien los parmetros estadsticos por determinar y, en caso necesario, los principios aplicados deben ponerse por escrito en forma de informe de validacin.

6.2.2.1. Parmetros determinados (adems de los indicados en el caso 1 de la Tabla 2) Los parmetros que vienen al caso determinar, para el caso de qumica analtica, son. Intervalo de trabajo / linealidad Tipo de ajuste Recuperacin Robustez Especificidad Estabilidad Reproducibilidad

Estos deben determinarse solamente cuando a juicio profesional es de esperarse un posible efecto debido a una modificacin del mtodo de ensayo. Ejemplos de lo anterior se encuentran en la tabla 3.

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Tabla 3: Efecto de modificaciones al mtodo de ensayo sobre los parmetros a determinar Modificacin Mtodo de extraccin Matriz de la muestra Cambios en el pH Cambio de operador Deteccin Ejemplos de los posibles efectos sobre: Porcentaje de recuperacin Especificidad, porcentaje de recuperacin Robustez Repetibilidad(sesgo) Lmite de deteccinexactitud

Intervalo de trabajo / linealidad, eventualmente especificidad.

6.2.2.2. Todos los parmetros posibles (adems de los indicados en el caso 1 y 2) Para los mtodos internos no existen indicaciones concretas para validar un procedimiento. Por lo tanto deben ser determinadas todas las aplicables. Especificidad, selectividad, linealidad, Intervalo de trabajo, repetibilidad, reproducibilidad intermedia, estabilidad, reproducibilidad, exactitud, lmite de deteccin, lmite de cuantificacin, recuperacin, robustez a las influencias externas, sensibilidad cruzada frente a las interferencias provenientes de la matriz de la muestra o del objeto de ensayo, incertidumbre de los resultados. 6.3. Informe de Validacin de un Mtodo Cada validacin debe ir acompaada de un informe: Informe de validacin del..... en ....mediante... El mismo debe ser preparado por el analista/operador/ tcnico y revisado por Personal Calificado. En la realizacin del Informe de Validacin debern considerarse los siguientes puntos, cuando corresponda:
Objetivo y alcance del mtodo. Item

a ensayar.

Detalle

de insumos, reactivos, materiales de referencia y acondicionamiento de las muestras. sus resultados.

Lista de equipos , instrumentos y dispositivos. Parmetros de validacin con

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Registro

de las condiciones de los ensayos y grficos representativos ( curva de calibracin, registros de correlacin ) y clculos necesarios. de las mediciones.

Incertidumbres

Resultados obtenidos. Personas

que desarrollaron la validacin del mtodo. criterios de aceptacin o rechazo, criterios de revalidacin.

Conclusiones,

Nota: Evaluacin de los resultados de validacin Al final de un procedimiento de validacin debe tomarse una decisin sobre la aptitud para la aplicacin del mtodo. De esta manera se confrontan los parmetros estadsticos del mtodo obtenidos, o bien las medidas de validacin ( cartas de control, ensayos de intercomparacin) con lo establecido, en forma de informe final (planilla ad hoc). Puede ocurrir que uno de los puntos del informe no concuerde con lo establecido en la instruccin de trabajo correspondiente a ese mtodo de ensayo (por ejemplo repetibilidad del 7% en vez del 5% exigido) y que de todas maneras, se considere el mtodo adecuado. Esto debe ser fundamentado en el mbito de la validacin por el responsable del ensayo.

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ANEXO 1 Ejemplos de determinacin de parmetros estadsticos y realizacin de las medidas de validacin para el caso de mtodos qumicos de anlisis. 1. Incertidumbre de los resultados Es un parmetro de identificacin centrar e inalienable para preparar una acreditacin segn Gua ISO 17025. Incluye los errores sistemticos y aleatorios. Para su determinacin y especificacin existen varias posibilidades: Indicacin acerca de la repetibilidad. Resultados de las cartas de control. Resultado de intercomparaciones. Evaluacin por miembros del personal experimentados, competentes y, por lo tanto, autorizados. 2. Repetibilidad Puede determinarse de una manera interna. Para ello es necesario tener en cuenta que: Deben determinarse suficientes resultados ( recomendacin: n 10 ). Todos los pasos del mtodo ( incluidas la toma y preparacin de la muestra, as como la calibracin ) deben realizarse n-veces. 3. Reproducibilidad Su determinacin tiene sentido y es posible solamente cuando otros laboratorios cercanos utilizan el mtodo de ensayo y es posible una comparacin interlaboratorios o cuando se realiza una ensayo de intercomparacin. 4. Elaboracin de una carta de control analizando un material de referencia La elaboracin de una carta de control es el mtodo de eleccin para el control interno de rutina de mtodos utilizados frecuentemente. Las cartas de control no son adecuadas para mtodos que se utilicen meno s de alrededor de tres veces al mes. Para ellos se analiza una muestra de control (muestra de retencin de una muestra real o un material de referencia certificado o no ) junto con las muestras del anlisis y el resultado se anota en la carta de control. Las variantes ms importantes son: Carta de control de un slo valor

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Carta de control del blanco Carta de control para recuperacin El procedimiento es en principio el mismo para todos los casos. La diferencia se encuentra en el factor que se controla (contenido del analito, blanco o bien porcentaje de recuperacin ). 5. Participacin en intercomparaciones Ver documento CE-LE- 01. Deben tomarse en cuenta los siguientes puntos: Las intercomparaciones dan informacin valiosa solamente cuando las muestras se manejan de la misma manera que las muestras de un anlisis normal. Las intercomparaciones se realizan en intervalos de tiempo largos. De ah que no sean suficientes para el aseguramiento de calidad rutinario, sino que funcionan como complemento de las cartas de control, por ejemplo Entre ms distintas sean las matrices de las muestras de intercomparacin y las del anlisis, menos informacin dan las intercomparaciones para el anlisis rutinario. La interpretacin de los resultados de intercomparaciones debe realizarse con el mayor cuidado, especialmente en el caso de resultados aberrantes o desviaciones, para obtener el mayores posibilidades de mejora. Si no se organizan intercomparaciones oficiales o provenientes de proveedores reconocidos, se pueden realizar en su lugar comparaciones con otros laboratorios (n 7). Para la realizacin y el tratamiento estadstico de las intercomparaciones debe acatarse la Norma ISO 5725-1. 6. Intervalo de trabajo El mbito de trabajo de un mtodo analtico es el intervalo entre los niveles ms bajo y ms alto de concentraciones que ha sido demostrado que puede ser determinados con la precisin y la exactitud requeridas para una determinada matriz. a) Se preparan un blanco y seis concentraciones diferentes del analito a determinar o seis muestras fortificadas a varias concentraciones. Preferiblemente las soluciones se deben preparar independientemente y no a partir de diluciones sucesivas del material de referencia. b) Se representa la seal obtenida en funcin de la concentracin y se determina el mbito lineal y los extremos superior e inferior del intervalo de trabajo.

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c) Se repiten los pasos a y b dentro del mbito lineal y se efecta un estudio estadstico de los resultados obtenidos. d) Es preferible trabajar dentro del mbito lineal. e) Para la curva de calibracin, es conveniente utilizar polinomios de ajuste de grado 2 como mximo. 7. mbito lineal Es la parte de la funcin de calibracin en la que la seal obtenida para el analito responde linealmente a la concentracin. Se verifica mediante la obtencin de coeficientes de correlacin mayores o iguales a 0,995. 8. Recuperacin El porcentaje de recuperacin es el cociente entre la cantidad de analito medida y el contenido en la muestra. En el caso ideal, se obtiene un 100%. En mediciones experimentales puede perderse analito especialmente en el caso de tratamientos complejos de muestras con analito en cantidades traza, dando lugar a porcentajes de recuperacin menores ( importante especialmente en el caso de procedimientos cromatogrficos ). Para calcular la recuperacin se determina la funcin de recuperacin. Para lo cual se agregan a la muestra antes del tratamiento cantidades sucesivas del analito y se determinan contra una calibracin base. Las cantidades encontradas se grafican contra las agregadas. En el caso ideal los valores caen en la bisectriz de la incertidumbre de los resultados. En este caso de recuperacin es del 100% y es suficiente una calibracin base, analito en un disolvente. Si los valores se salen de este marco, debe hacerse una calibracin a partir de matriz y analito en un disolvente para eliminar el efecto de la matriz. Variando el tiempo de adicin del analito ( por ejemplo, antes y despus de un paso de concentracin ) puede determinarse la recuperacin para pasos aislados de un procedimiento. En caso de que la matriz introduzca muchas variaciones debe utilizarse en lugar de una calibracin con la matriz de la muestra el mtodo del agregado patrn (o de las adiciones estndar), el cual consiste en agregar concentraciones sucesivas de analito a la muestra. Al graficar el aumento de la seal contra la cantidad adicionada se obtiene una funcin de calibracin, a partir de la cual puede obtenerse la cantidad de analito presente en la muestra original.

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Este mtodo conduce a un aumento claro en la concentracin del analito. Para mantener el error lo ms pequeo posible, las cantidades aadidas deben ser tales que no sobrepasen el intervalo de trabajo. 9. Lmite de deteccin Es necesario solamente cuando deben tomarse decisiones cualitativas, es decir, si el analito est presente o no. Los procedimientos de determinacin posibles son: 3 veces la dispersin, expresada como desviacin estndar, a partir de mediciones repetidas del blanco ( vlido solamente para procedimientos con blanco ), o de soluciones del analito en agua pura. 2,5 a 5 veces la relacin seal/ruido del instrumento de medida a utilizar. a) Se prepara una solucin del analito de inters que contenga una concentracin entre 2,5 y 5 veces el lmite de deteccin instrumental (informado por el fabricante) y se analiza como mnimo de 7 veces (diez veces consecutivas es lo aconsejable) utilizando el mtodo analtico completo. Tambin puede utilizarse el blanco de reactivos. b) Para los propsitos operativos el LD LOD deber ser determinado multiplicando por el apropiado valor estadstico de t (generalmente para un nivel de confianza de 99%) por la desviacin standard obtenida de un mnimo de 7 lecturas), donde el t estadstico es obtenido de referencias estndares o de la tabla que sigue: N de muestras 3 4 5 6 7 8 9 10 estadstico t 6,96 4,54 3,75 3,36 3,14 3,00 2,90 2,82

c) Determinar la desviacin estndar (s) para cada analito, como sigue:

(xi x) n1 donde:

s = ---------------------

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xi = la medida i de la variable x x = el valor promedio de x. n = es el nmero de anlisis replicados

n

x=

xi
i=1
2

El cuadrado de la desviacin estndar, s , en un valor estadstico denominado varianza. Determinar el LD LOD para cada analito como sigue: LD = t(n-1 . - .99) (s) donde = t(n-1 . - .99) es el t estadstico apropiado para el nmero de muestras usadas para determinar (s), al nivel del 99%. (Ver Tabla).

10. Lmite de cuantificacin Se emplea cuando se realizan determinaciones de analitos a nivel de trazas. En esencia se encuentran en la literatura dos formas para determinarla: de manera anloga al lmite de deteccin, en el cual el lmite de cuantifiacin es como mnimo tres veces el lmite de deteccin, segn cada caso. por determinacin de una incertidumbre de los resultados mxima permisible ( dada como dispersin relativa del 30%, por ejemplo ) por medio de la determinacin de la concentracin ms pequea que se puede medir con este valor mximo. Este lmite de cuantificacin es, por lo tanto, dependiente de las exigencias de la incertidumbre. 11. Robustez El objetivo de la prueba de robustez es optimizar el mtodo analtico y describir que bajo las condiciones establecidas ( incluidas sus tolerancias ) se pueden obtener resultados suficientemente exactos con una alta seguridad, de manera que el procedimiento funcione confiablemente si se utiliza en otros laboratorios o despus de intervalos largos de tiempo. Un mtodo es ms robusto entre menos dependan los resultados del ensayo de una modificacin en las condiciones de ste. Al desarrollar un nuevo mtodo analtico debe determinarse la modificacin de los resultados por el cambio en las condiciones del ensayo. Las condiciones que afectan el mtodo de medicin son por ejemplo, para el caso de cromatografa: Laboratorio, lugar de la medicin.

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Personal. Aparatos. Reactivos, disolventes, estndares, etc. Caudal de las fase mvil. pH de la fase mvil ( p. ej. en HPLC ). Gradiente de temperatura ( p. ej. en GC ).

Modificaciones pequeas a estas condiciones deben afectar muy poco o nada al resultado del anlisis. Para determinar la robustez de un procedimiento analtico pueden modificarse algunas condiciones del anlisis y seguir las afectaciones a los resultados o a los parmetros estadsticos. A menudo se utiliza tambin la evaluacin de espectros o cromatogramas. Un aspecto importa nte de la robustez es la estabilidad de todas las muestras, estndares y reactivos, tanto en el almacenamiento como durante las condiciones de ensayo. En este caso pueden ser parmetros a probar: Sensibilidad a la temperatura. Sensibilidad a la luz. Hidrlisis p. ej. por la humedad del aire. Facilidad de oxidacin. Descomposicin qumica. Efectos catalticos, p. ej. por las paredes del contenedor. Adsorcin, p. ej. durante la filtracin de disoluciones con trazas. Precipitacin, p. ej. al dejar mucho tiempo una disolucin. 12. Especificidad La especificidad sugiere que ningn compuesto excepto el analito contribuye al resultado de un ensayo. Esto se logra casi nicamente con las tcnicas acopladas (por ejemplo, generacin de hidruros- absorcin atmica). Para probar esto hay varias posibilidades. Se agrega el componente que interfiere en cantidades sucesivas y se evala su influencia. Se prueba un estndar certificado de la matriz con cantidades conocidas del analito. Si se encuentra el valor correcto, el procedimiento es especfico. En el caso de separaciones cromatogrficas puede probarse la pureza del pico por mtodos espectroscpicos ( espectrometra de masas, infrarroja o ultravioleta- visible. Puede tambin modificarse el sistema de separacin (fase mvil y/o fase estacionaria) en el caso de la cromatografa. Es muy baja la probabilidad de que la misma interferencia produzca en ambos casos el mismo error en los resultados.

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13. Selectividad La selectividad da una indicacin de cuan fuertemente un re sultado es afectado por otros componentes de la muestra. 14. Exactitud Para la evaluacin de este parmetro se realiza el anlisis de un material de referencia certificado, preferentemente con una matriz semejante a la de la muestra. Slo en el caso de no existir un material adecuado se puede realizar un ensayo de recuperacin. Cuando sea posible, se realizan un mnimo de 10 repeticiones del ensayo tres das consecutivos. Se compara el promedio de los valores obtenidos (X) con el valor de referencia certificado ( ), teniendo en cuenta la incertidumbre asociada a ese material. El mdulo de la diferencia da como resultado el sesgo del mtodo: s = X -