UNIVERSIDAD DEL QUINDIO FACULTAD DE CIENCIAS AGROINDUSTRIALES PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS ANALISIS DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN TEJIDOS ANIMALES, VEGETALES

Y AZUCARES SAAVEDRA MARLYN VANESSA, GOMEZ LUISA MARIA, ARANA LUISA FERNANDA, AGUIRRE FERNANDO RESUMEN Las enzimas en su mayora protenas o RNA (ribo enzimas), son catalizadores qumicos que agilizan una reaccin que envuelve la formacin o rompimiento de enlaces qumicos. Dentro de esta prctica se analizo la presencia de catalasa en tejidos vegetales y animales, de tal forma que se tomo una muestra de zanahoria e hgado para ser analizados unas en su estado natural y otras luego de ser sometidas a una alta temperatura de lo que se pudo ver que solo en aquellas muestras que se mantuvieron en su estado natural hubo la presencia de la catalasa al ser realizada la prueba con perxido de hidrogeno. Luego realizamos la hidrlisis del almidn al recolectar varias muestras con diferentes componentes almidn, saliva, acido clorhdrico para encontrar que las enzimas que se encuentran en la saliva (ptialina) que son aquellas que catalizan el almidn rompindolo y formando glucosa dentro de esta prctica no lo hicieron, pues a realizar la prueba de fehling y lugol a cada muestra se encontr que lo dicho anteriormente no se cumpla. Tambin se realizo la hidrlisis de la sacarosa por la glucosidasa de la levadura para esto en dos tubos en un se agrego sacarosa y agua, en otro sacarosa, almidn y agua, luego a los dos se les realizo la prueba de fehling para lo cual se encontr que los dos dieron negativos ante esta prueba. Al terminar la prctica pudimos reconocer como es la actividad enzimtica de las diferentes enzimas vistas anteriormente en distintos tipos de alimentos. ABSTRACT The enzimas in the main proteins or RNA (ribo enzymes), are chemical catalysts that improve a reaction that wraps the formation or breach of chemical bonds. Inside this practice I analyze the presence of catalasa in vegetable and animal fabrics, in such a way that I take a sample of carrot and liver to be analyzed some in its natural state and others after being submitted to a high temperature of what could see that alone in those samples that were kept in its natural state there was the presence of the catalasa on the test having been realized by peroxide of hydrogen. Then we fulfil the hidrlisis of the starch when several samples gather

with different components starch, saliva, hydrochloric acid to find that the enzimas who think in the saliva (ptyalin) that they are those that catalyze the starch it breaking and forming glucose inside this practice they did not do it, so to realizing the test of fehling and lugol to every sample one thought that the above mentioned thing previously was not fulfilled. Also I fulfil the hidrlisis of the saccharose for the glucosidasa of the yeast for this in two pipes in I add saccharose and water, in other one saccharose, starch and water, then to the two I they realize the test of fehling for which thought that the two gave negatives before this test. On having finished the practice we could recognize since it is the enzymatical activity of different enzymes dress previously in different types of food.

INTRODUCCION Las enzimas son protenas que poseen actividad cataltica. Son sintetizados por clulas vivas y actan en la totalidad de las reacciones qumicas de los organismos, que son de gran importancia dentro del metabolismo. Las reacciones catalizadas por enzimas se verifican en muchos alimentos y pueden actuar positiva o negativamente respecto a la calidad del alimento. Se pueden destacar procesos enzimticos en la maduracin de frutos como en productos crnicos o lcteos, tambin en la preparacin de masas a partir de harinas y pardeamiento de bebidas alcohlicas. Dentro de esta prctica se busco determinar la forma en que actan las diferentes enzimas, para esto se realizaron pruebas a diferentes alimentos vegetales y animales, como el hgado y la zanahoria, en ellos se quiso encontrar cual era la mejor manera para determinar la actividad enzimtica de la catalasa, est en una enzima que

se encuentra en todos los tejidos vivos animales y vegetales, que acta como catalizador del perxido de hidrogeno debido a que este es nocivo para las clulas, de esto pudimos encontrar que la enzima se encuentra activa en los alimentos cuando estn en su estado natural. La hidrlisis del almidn es realizada por la enzima amilasa, sacarasa o ptialina, es una enzima hidrolasa que tiene la funcin de catalizar la reaccin de hidrlisis de los enlaces 1-4 del componente -Amilasa al digerir el glucgeno y el almidn para formar azcares simples. En esto encontramos que no hubo hidrlisis de almidn por medio de la enzima ptialina ya que no fueron encontrados azucares reductores con lo que se determina si hubo o no actividad enzimtica en las muestras, pero si hallamos la presencia de almidn en las diferentes muestras. Tambin se realizo una hidrlisis de la sacarosa por medio de la enzima de la glucosidasa de la levadura, esta enzima cataliza la hidrlisis de

enlaces glucosdicos para generar glcidos menores. Con lo que se observo que no se dio el resultado esperado pues al realizar las pruebas consiguientes a las muestras esto nos dio como resultado negativo ante la presencia de azucares reductores lo que nos demuestra que no se realiza la hidrlisis. MARCO TEORICO CATALASA La catalasa en una enzima hemoproteica, que se caracteriza por poseer una estructura tetramrica, en la cual cada subunidad contiene un grupo Hem (Fe). Esta presente en la mayora de las bacterias aerobias estrictas, facultativas y anaerobias aerotolerantes. La catalasa manifiesta actividad de peroxidasa, cataliza la oxidacin de sustratos acoplada a la reduccin de perxido de hidrogeno, para formar agua y oxigeno molecular. En la prueba de catalasa la reaccin se efectua en dos molculas de perxido de hidrogeno, una de las cuales actua como sustrato reducido y la otra como donador de tomos de hidrgeno; esto resulta en la formacin de agua (sustrato reducido) y oxgeno (donador oxidado). El perxido de hidrogeno es muy toxico para las bacterias. Generalmente los microorganismos que carecen de citocromos tambin carecen de catalasa as la mayora de las

bacterias anaerobias no la poseen. (Evelyn Rodrguez, et al, 2005) HIDRLISIS DEL ALMIDON El almidn es un homopolisacrido de glucosa, cuyos componentes son la amilosa lineal y la amilopectina ramificada. Para utilizarlo, algunas bacterias sintetizan una exoenzima llamada amilasa que hidroliza los enlaces glucosdicos alfa 1-4, liberan maltosa e isomaltosa, que ingresan a la celula y pueden metabolizarse. Para evidenciar la presencia de amilasa, se recurre a que el almidn forma un complejo de color azul intenso con el yodo. Las cadenas de amilopectina solo dan un color caf rojizo y el almidn hidrolizado no da ninguna coloracin. Por lo tanto, la ausencia del color azul indica que el almidn ha sido hidrolizado. La produccin de amilasa es til para diferenciar especies de Bacillus, de Streptococcus y la Lactobacillus. De igual forma, se aplica a esquemas de diferenciacin de algunas bacterias aerobias y anaerobias como Actinomyces, Bacteroides, Clostridium y Fusobacterium. (Evelyn Rodrguez, et al, 2005) GLUCOSIDASAS Son aquellas enzimas que catalizan la hidrlisis de diferentes glcidos para generar glcidos menores. Son enzimas extremadamente comunes con papeles importantes en la naturaleza como en la degradacin

de biomasa, como celulosa y hemicelulosa, en la defensa contra las bacterias, en mecanismos de patognesis y en el normal funcionamiento celular. Las glucosidadas forman la mayor maquinaria cataltica para la sntesis y rotura de enlaces glucosdicos. (Jimenez, L. Horacio, 2003) Felipe, Merchant,

HIDRLISIS DE LA SACAROSA POR LA GLUCOSIDASA DE LA LEVADURA Se disolvi 2.5 g de levadura en 20 ml de agua destilada, se reposo durante 15 minutos y luego se filtro. Se prepararon dos tubos, uno con una cucharada de sacarosa y 2ml de agua luego se agito, otro con una cucharada de sacarosa 2ml de agua y 2ml de extracto de levadura, luego se agito, despus a los dos tubos se les realizo la prueba de fehling, se observaron resultados.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PRESENCIA DE CATALASA EN TEJIDOS ANIMALES Y VEGETALES Se tomo una zanahoria y un hgado los cuales fueron cortados en dos trozos iguales cada uno. Cada muestra se coloco en un tubo de ensayo, se le agrego a cada uno 5ml de agua, luego una muestra de cada alimento en el tubo de ensayo fue sometida a alta temperatura, despus a todas las muestras se les practico la prueba con perxido de hidrogeno y se observaron resultados. HIDRLISIS DEL ALMIDON Se prepararon seis tubos de ensayo as: 2 tubos de ensayo con almidn, 2 tubos de ensayo con almidn mas 5ml de saliva, y 2 tubos de ensayo con almidn, mas 5ml de saliva y 2ml de acido clorhdrico. Luego de pasados treinta minutos a cada uno se le realizo la prueba de fehling y lugol, despus se observaron resultados.

RESULTADOS Y DISCUSIN

1. Presencia de catalasa en tejidos animales y vegetales

Tabla 1. Presencia de catalasa en hgado y zanahoria.

Muestra Hgado hervido

Reaccin con H2O2 -

Hgado sin hervir

Zanahoria hervida

Zanahoria sin hervir

Los

proceso

enzimticos

en

la

desnaturalizada porque se someti al altas temperaturas. Esta enzima es obtenida a partir de hgado y de microorganismos, tiene importancia como enzima auxiliar : para la

preparacin y conservacin de los alimentos son controlados en la

mayor parte de los casos por la temperatura. En aquellos en los que tiene consecuencias negativas sobre aroma, color textura o valor nutritivo, son, bien frenados por el uso de temperaturas bajas, o bien eliminados por inactivacin trmica de las

destruccin de

Dieter&Grosch). De esta manera el perxido de hidrogeno (

produce dos molculas de agua (2H2O) ms una molecula de oxigeno (O2) de esta forma hay liberacin de oxgeno debido a que la catalasa est actuando hidrogeno. sobre el perxido de

enzimas (Dieter&Grosch, 1988). Al hervir el hgado y agregarle perxido de hidrogeno se pudo observar que no hubo ningn reaccin, es decir fue negativa, debido a que la enzima fue

Por lo tanto como al enzima es la encargada de catalizar el perxido de hidrogeno esta se inactivo y no hubo catlisis del agua oxigenada, es decir la reaccin fue negativa. Por lo tanto no hubo desprendimiento de oxgeno. Por consiguiente al agregarle agua oxigenada al hgado sin hervir se pudo observar burbujeo siendo la reaccin positiva debido a que la catalasa hgado, estaba como presente se en el

agregarle el perxido de hidrogeno no se observ burbujeo por tanto no hubo catlisis por parte de la catalasa frente al reactivo , en tanto no

hubo desprendimiento de oxgeno, esto quiere decir que la reaccin fue negativa. El hecho de que el tratamiento trmico inhiba total o parcialmente la reaccin, sugiere que es de

naturaleza enzimtica (Hart& Fisher, 1991). Cuando se llev a cabo el anlisis perxido de de hacer reaccionar con el la

explic

anteriormente esta enzima se puede obtener de este tejido animal, por esto la enzima realiza la oxidacin del perxido formando agua y liberando oxgeno, as se pudo observar que el burbujeo es debido al

hidrogeno

zanahoria sin hervir se pudo observar que hubo burbujeo porque la enzima esta activa pues es su estado natural, por lo cual hubo desprendimiento de oxgeno dando positiva la reaccin frente al perxido, aunque en menor proporcin que en el hgado, ya que este es una fuente de obtencin de la enzima y esto nos indica que tiene un alto contenido de catalasa respecto a la zanahoria.

desprendimiento de oxgeno. El pre-tratamiento para habitualmente proceso

utilizado

detener

enzimtico en frutas y hortalizas consiste en escaldado con agua caliente o con vapor vivo. Las

temperaturas de escaldado suelen oscilar entre 77 y 82 C en aunque ocasionalmente temperaturas hasta se 96C utilizan (Hart&

Fisher, 1991). Cuando se someti la zanahoria a altas temperaturas hubo una destruccin enzimtica ya que al

2. Hidrlisis del almidn por enzimas hidroliticas de la saliva:

Tabla 2. Hidrlisis del almidn por enzimas hidroliticas de la saliva.

Lugol Tubo nmero. 1 +

Benedit

Tubo nmero. 1

Tubo nmero. 2

Tubo nmero. 2

Tubo nmero. 3

Tubo nmero. 3

Se prepararon dos (2) tubos numero uno (1) con solucin de almidn, al primero se le agrego el reactivo lugol para determinar presencia de

que la molcula absorbe ms luz visible excepto azul, (Olivas. E. & Alarcn L. R., 2004). Al siguiente tubo numero uno (1) que tambin era una solucin de almidn se le realizo la prueba de benedit para determinar la presencia de azucares el resultado fue negativo debido a que la prueba de benedit es para y determinar no para de la

almidones este dio un resultado positivo. Esto es debido a que el almidn reacciona qumicamente con iodo para producir un color azul oscuro cuando las molculas de iodo se insertan en los huecos de las molculas espiralada del almidn (amilosa). Este resultado es debido a

azucares

reductores porque de

polisacridos, determinacin

azucares

reductores se debe realizar la prueba de benedit por lo tanto en el almidn debe dar negativo si no ah sido hidrolizado (Maraculla. M. J & Goi M. F., 1994). Se prepararon dos tubos numero dos (2), uno con una solucin de almidn con adiccin de saliva, este tubo se dejo en reposo despus treinta de minutos haber

como no hubo hidrlisis del almidn por parte de la ptialina el resultado fue negativo, sin embargo el

resultado debi ser positivo por lo explicado anteriormente. Se prepararon dos tubos nmero (3) los cuales tenan solucin de almidn mas saliva mas adicin de acido clorhdrico (HCl), el primer tubo tres (3) se le realizo la prueba de lugol para determinar la presencia de almidones el resultado fue positivo, debido a que el HCl inactiva las enzimas (protenas), desestabilizando su estructura terciaria y cuaternaria (Pertierra. G. A. & Rivera T. J. M., 2006). Por presentar un pH acido ya que las enzimas son inactivadas a cambios bruscos de pH y

(30min),

transcurrido ese tiempo se le agrega lugol para determinar almidones y el resultado es positivo, esto pudo

haberse dado debido a la cantidad de adiccin de saliva a la muestra ya que esta es el la encargada por de estar

hidrolizar

almidn

presente la enzima responsable de dicha reaccin, por lo tanto debi presentar una hidrlisis y arrojar un resultado negativo, ya que la amilasa salival (o ptialina) hidroliza el almidn, transformndolo en maltosa, pasando previamente por unos compuestos intermedios denominados dextrinas (Maraculla. M. J & Goi M. F., 1994). El otro tubo dos (2) se le agrego el reactivo de benedit para la

temperatura. As pues al adicionarle el reactivo de benedit se obtuvo el resultado negativo, debido a que no hubo una hidrlisis del almidn en maltosa, que es u azcar reductor que se puede identificar con dicho reactivo, (Maraculla. M. J & Goi M. F., 1994).

identificacin de azucares reductores como se dijo anteriormente por esto

3. Hidrlisis de la sacarosa por la glucosidasa de la levadura.

Tabla 3. Hidrlisis de la sacarosa por la glucosidasa de la levadura.

Muestra

Benedit

Tubo A

Tubo B

En el Tubo A se tena una muestra de sacarosa diluida en agua, se le adiciono reactivo de benedit se

a la cantidad de reactivo utilizado y al tiempo de calentamiento del tubo ya que deba ser mas prolonga entre 2-4 minutos para que se produjera el cambio de coloracin de azul a marrn indicando la presencia de glucosa. Las aldosas y tambin las cetosas capaces en de medio alcalino, a son

obtuvo un resultado negativo puesto que este reactivo es para determinar azucares reductores y este disacrido no tiene poder reductor por carecer de carbonos anomericos, adems la sacarosa para pasar a ser reductor debe ser hidrolizada para que se rompa en sus monmeros fructuosa y glucosa que al agregarle benedit y calentar durante aproximadamente unos minutos se pudo observar que arrojaron valores negativos, . Por consiguiente en el tubo B que tenia la misma solucin mas adiccin de la enzima glucosidasa, se obtuvo un valor negativo, esto pudo ser debido

oxidarse

cidos

adnicos, con lo que pueden reducir determinados reactivos. Entre las mltiples posibilidades, son muy

comunes las reacciones de reduccin del ion cprico (azul intenso en medio alcalino) a ion cuproso (rojo ladrillo, insoluble). Las conocidas reacciones de Fehling y de benedit siguen este esquema. Por sus propiedades

qumicas se clasifican en reductores,

cuando conservan un grupo aldehdo o cetona libre, y no reductores si no les queda libre ningn grupo aldehdo o cetona, (Maraculla. M. J & Goi M. F., 1994). Conclusiones Las enzimas a altas Los procesos enzimticos se llevan a cabo en presencia de oxigeno de lo contrario su actividad disminuye La catalasa se encuentra en los tejidos vegetal y animal estando en su estado natural

temperaturas mayores de 77c se desnaturalizan y se vuelven inactivas en cambios bruscos de PH Las enzimas funcionan dentro un

correctamente

limitado rango de temperatura y pH.

BIBLIOGRAFIA Evelyn Rodrguez Cavallini, et all, 2005, Bacteriologa General: Principios Y Prcticas de Laboratorio, Editorial Universidad de Costa Rica, pg. 195, 196,197 Jimenez, L. Felipe, Merchant, Horacio, 2003,biologa celular y molecular, person educacin de Mxico, pg. 23 Hart. L.F & Fisher J.H, 1991, Anlisis modernos de los alimento, Editorial Tipo Lnea S.A, Zaragoza, pag. 117, 124, 528. Farr. H. C, 1996, Terapias de oxgeno para una optima salud y vitalidad, Lasser Pres Mexicana. S.A de C.V., pag. 61-71. Olivas. E. & Alarcn L. R., 2004, Manual de prcticas de Microbiologa bsica y Microbiologa de alimentos, Universidad Autnoma de Ciudad Jurez, Mxico, pag. 35-36. Maraculla. M. J & Goi. M. F., 1994, Bioqumica humana, segunda edicin, Editorial Reverte, S.A, Barcelona, Pag. 76,195. Pertierra. G. A. & Rivera T. J. M., 2006, Segunda edicin, Fundamentos de bioqumica metablica, Madrid, pag. 161.

ANEXOS

Qu tejidos presentan desprendimiento de oxigeno?

El tejido animal sin hervir y el tejido vegetal sin hervir debido a que las enzimas estn activas pues en su estado natural se encuentra la catalasa.

Cul de los tejidos presenta mayor actividad?

Los tejidos que mayor actividad presentaron fueron el hgado porque es una fuente de obtencin de la enzima como tambin se puede obtener de microorganismo, en el tejido vegetal hube menor actividad enzimtica.

Por qu la reaccin es negativa cuando cocemos las muestras?

La reaccin es negativa cundo sometemos a altas temperaturas las muestras debido a que las enzimas por ser protenas se desnaturalizan cuando son sometidas a temperaturas entre 77 y 96C.

Frecuentemente utilizamos agua oxigenada como antisptico y se observa que al aplicarla a una herida se produce un burbujeo, qu est ocurriendo? Por qu se utiliza el agua oxigenada como antisptico?

El perxido de hidrgeno en bajo grado (3 por ciento) es muy conocido por la mayora de nosotros. Cuando lo aplicamos de manera externa, en una herida hace burbujas, esto se debe al oxgeno que sale de la solucin. El perxido de hidrogeno no slo oxigena el cuerpo el cuerpo produciendo modestas cantidades de oxigena sino que tambin tiene una extraordinaria capacidad de estimular las enzimas oxidantes, que a su vez pueden cambiar la composicin qumica de otras sustancias (como virus y bacterias) sin que aquellas mismas cambien. En vez de proporcionar ms oxigeno a las clulas, la presencia del perxido de hidrogeno

aumenta el proceso de oxidacin celular natural, el cual incrementa la capacidad de usar el oxigeno disponible. Cuando el xido de hierro no est presente, lo cual sucede la mayor parte del tiempo, el Dr. Farr ha encontrado que el perxido de hidrogeno se convierte normalmente en oxigeno por la enzima catalasa, lo que produce el perxido de hidrogeno beneficioso para el cuerpo. La accin de la catalasa sobre el perxido de hidrgeno es aadir un electrn en presencia de hidrogeno, el agua pura y el oxigeno diatnico. El oxigeno se reduce de nuevo a superxido y despus a perxido de hidrgeno y otra vez comienza la reaccin. Una molcula de catalasa puede convertir millones de molculas de perxido en oxigeno y agua en cuestin de segundos y es la primera lnea de defensa del cuerpo contra la formacin de radicales libres hidroxilo (Farr, H. C, 1996).

En qu tubo se demuestra la actividad de la enzima de la saliva? Cmo se demostr? En los tubos 2 y 3 por el mtodo de tincin con el lugol al haber presencia de almidones En qu tubo se ha inactivado la enzima? Por qu no ha actuado? Por presentar un pH acido ya que las enzimas son inactivadas a cambios bruscos de pH y temperatura. As pues al adicionarle el reactivo de benedict se obtuvo el resultado negativo. Qu reaccin qumica se ha producido en el tubo B? Se obtuvo un valor negativo, esto pudo ser debido a la cantidad de reactivo utilizado y al tiempo de calentamiento del tubo ya que deba ser mas prolonga entre 2-4 minutos para que se produjera el cambio de coloracin de azul a marrn indicando la presencia de glucosa. Imagine que se preparo un tubo C que contenga: sacarosa, agua, extracto de levadura y calientas manteniendo la ebullicin 10 minutos. Formula una hiptesis de lo que crees que ocurrir en ese tubo. Cmo comprobaras tu hiptesis? El oxgeno al ser sometido al calor disminuye su cantidad por lo que es inevitable que la levadura pierda su capacidad de propagarse y asi se detenga el proceso del consumo de la sacarosa no permitiendo la produccin de alcohol . en el caso de la cerveza es muy susceptible a sufrir mutaciones. Particularmente en su

capacidad de flocular y de utilizar la maltosa azcar que constituye alrededor del 15% de los azucares fermentables por lo que en este caso la levadura deja de ser adecuada para el proceso y no puede ser recirculable.