EXTRACCIN DE MITOCONDRIAS

PREPARACIN DE SOLUCIONES Buffer de fosfatos: Solucin 1. Pesar 13.8 g de NaH2PO4 y disolverlo en 250 ml de agua destilada. Solucin 2: Pesar 35.85 g de Na2HPO4 y disolverlo en 500 ml de agua destilada. Mezclar 212.5 ml de solucin 1, y agregarle 37.5 ml de la solucin dos y aforar a 500 ml con agua destilada. Buffer de separacin: Se prepara con el buffer de fosfatos 10mM y de cloruro de sodio 0.15M, KCl 3.3 mM y MgCl 2.6 mM a pH 7.4). PROCEDIMIENTO 1. Enjuagar el hgado de un ave con agua y colocarla en un vaso de precipitado de 50ml, que contenga 20ml del medio de extraccin. Posteriormente se desmenuzar con tijera reemplazando de dos a tres veces el medio. 2. Se verter el contenido del vaso de precipitado en una licuadora para molerse. Posteriormente se pasar 500 L a los tubos eppendorf y se centrifugar a 2000 rpm durante 10 minutos. Se retira el sobrenadante y se transfiere a un tubo eppendorf limpio (mximo 200 L).

3. Al sobrenadante obtenido en el paso dos, se le agregar el buffer en proporcin 1:4, es decir colocar cuatro veces el volumen de la fraccin obtenida de buffer y se guarda para hacer la observacin de los organelos. 4. Para la observacin de mitocondrias El sobrenadante que se obtuvo en la centrifugacin anterior (paso tres), se pondr a centrifugar a 5000 rpm durante 15 minutos. Se elimina el sobrenadante. El sedimento va a contener a las mitocondrias y se resuspende con 10 L de verde de Janus para teirlo durante 10 minutos. Se observar al microscopio, buscando una estructura de sacos color verde. Se recomienda observarlo con el objetivo de 100X.