Conocimientos bsicos para la tincin de citologa cervicovaginal

Cit. Claudia Elizabeth Mares Alatorre. Ao 2010

Polticas de operacin, normas y lineamientos.

La vigilancia para la aplicacin de los lineamientos respecto a la tincin y montaje en los laboratorios de citologa crvicouterina corresponde a la Secretaria de Salud tanto del nivel federal, como estatal, en sus respectivos mbitos de competencia. El director o coordinador del laboratorio deber verificar que el personal encargado de la tincin y montaje de las muestras citolgicas realice las actividades correspondientes. El incumplimiento de estas polticas y normas se sancionar conforme a la Ley Federal de Responsabilidades de los Servicios Pblicos.

Propsito.
Realizar un proceso de calidad, el tcnico en tincin o el citotecnlogo capacitado para la tincin y montaje de las muestras citolgicas.

Campo de aplicacin.
La coloracin descrita se aplica a las laminillas portadoras de muestras de frotis crvico-vaginal para realizar el diagnstico citolgico.

Requisitos para una tincin de calidad.

El procesamiento manual de las muestras de frotis cervical fijado comprende los siguientes subpasos: Reparacin ocasional de las lminas quebradas aceptadas. Preparacin y manejo de la batera de tincin. Tincin de las muestras. Montaje de las muestras. Distribucin de las lminas en las bandejas.

La tcnica ser exitosa si:

Todas las lminas aceptadas son procesadas en el tiempo establecido y se mantiene su integridad (no se quiebran) e identificacin durante el procesamiento.

 Todas las lminas estn teidas en forma apropiada lo que significa:

I.

Una buena definicin del detalle nuclear.

II. Una transparencia del citoplasma. III. Una diferenciacin celular.

 Todas las lminas estn montadas adecuadamente, lo que significa que el frotis est protegido de la sequedad del aire, encogimiento y de desteirse por la oxidacin y, adems, proporciona una imagen transparente en el microscopio.

 Las bandejas para los citotecnlogos estn preparadas correctamente lo que significa que contienen el nmero de lminas que corresponde, estn libres entre s (no pegadas), y colocadas en el orden correlativo del nmero de registro citolgico. Los insumos involucrados en el procesamiento de las muestras se usan eficientemente. El personal se mantiene libre de problemas de salud asociada al trabajo en la sala de procesamiento de muestras.

Los recursos de una sala de procesamiento manual se clasifica en:

a. Mobiliario. b. Equipos. c. Insumos.

rea de tincin.
Caractersticas:
Fsicamente separada de otros espacios. Con una excelente ventilacin hacia el exterior, ya que debido a los contaminantes qumicos, es un rea de alto riesgo. Sealizadas las medidas a tomar en caso de siniestro. Con regadera antiincendios y extintores. Campana de extraccin de gases tanto para la tincin, como para el montaje. Se recomienda que los insumos sean de buena calidad. Contar con un rea de bodega protegida de incendios para los reactivos y tinciones inflamables. La sala debe contar con un sector de lavado, equipado con lavadero.

Principio del mtodo de tincin de Papanicolaou.

La tincin de Papanicolaou es un mtodo de tincin poli-crmico que consta de una tincin nuclear y un contraste citoplasmtico.

La tincin de Papanicolaou tiene cuatros pasos principales:

Fijacin (realizada al momento de tomar la muestra). Tincin del ncleo con la hematoxilina. Tincin del citoplasma con Orange G y EA. Aclaramiento.

La tincin de Papanicolaou usa tres colorantes:

Hematoxilina. OG 6 EA 50 Los pasos de la tincin estn entremezclados con soluciones que hidratan, deshidratan y enjuagan las clulas.

Enjuague.
El enjuague se realiza con agua corriente y/o agua destilada, pero siempre hay que verificar que el pH del agua se encuentre entre 6.5 y 7.

Hidratacin.
La hidratacin antes del colorante de hematoxilina puede ser:

Gradual usando alcohol en concentraciones decrecientes 807050 %

Abrupta, sumergiendo el material celular desde altas concentraciones de alcohol y al agua directamente.

Tincin del ncleo.

Existen dos mtodos para teir el ncleo: Mtodo progresivo. Se tie el ncleo con la intensidad de color deseada. Mtodo regresivo. Se sobretie con hematoxilina no acidificada, luego se remueve el exceso de tincin con cido clorhdrico diluido. Despus de la hematoxilina, las laminillas se lavan en agua.

Tincin del citoplasma.

Orange G 6, es una tincin monocromtica y EA 50, es una tincin policroma compuesta.

Colorante. Hematoxilina de Harris.

Elementos celulares. Afinidad por la cromatina. Tie el ncleo. Tie la queratina. Penetra rpidamente al citoplasma. Tie el citoplasma de las clulas escamosas cianoflas y eosinoflas. Nuclolos y cilios.

OG 6

EA 50

Aclaramiento.
Es el paso final de la tincin y produce transparencia celular. Se suele usar Xilol como solucin aclaradora.

Montaje.
Objetivo del montaje. Es la unin del portaobjetos mediante un medio de montaje que cubre el rea bajo el cubreobjetos para: Obtener una muestra cubierta. Proteger la muestra contra el secado y arrugamiento del material celular. Sellar, evitando as la oxidacin de la muestra.

Caractersticas del medio de montaje.

1. Debe ser soluble en el agente aclarante.

2. Debe tener un ndice de refraccin que coincida con la muestra y el cubreobjetos, logrando una imagen lo ms transparente posible.
3. Debe tener un pH neutro.

Preparacin de soluciones.
Fundamentos.
Las soluciones son mezclas homogneas de dos o mas sustancias.
Una solucin es una mezcla de un soluto en un disolvente, entendindose por soluto la sustancia que esta en menor proporcin y disolvente la sustancia que esta en mayor proporcin. Existen soluciones solidas, liquidas y gaseosas.

Tipos de soluciones:
Para conocer la cantidad de soluto que hay en un volumen dado de solucin es necesario conocer la concentracin de nuestra solucin: las cantidades relativas de soluto y disolvente.

Una solucin saturada permite definir con precisin la solubilidad de un slido en un liquido. La solubilidad es la capacidad de una determinada sustancia para disolverse en un liquido. Puede expresarse en: moles por litro. Gramos por litro. Porcentaje de soluto/disolvente. Cuando se mezclan un soluto y un disolvente se libera energa porque las partculas del soluto y del disolvente se atraen.

Soluciones de concentracin conocida.

Son aquellas en las que se conoce el contenido del soluto respecto a la cantidad del disolvente o de solucin. Este tipo de soluciones se utilizan en anlisis cuantitativo y dentro de estas se encuentran: Solucin porcentual. Solucin formal. Solucin molar. Solucin normal. Partes por milln. Fraccin mol. Solucin titulo. % F M N ppm X T

SOLUCIN PORCENTUAL.
El porcentaje normalmente se utiliza para especificar la concentracin de la solucin preparada al diluir un liquido puro en otro liquido.

Fundamento.
En la tcnica de tincin de Papanicolaou se utilizan soluciones puras, saturadas, y porcentuales

Preparacin de colorantes

Hematoxilina de Harris.
Reactivos para preparar 1000 ml de hematoxilina de Harris. Hematoxilina cristales obscuros 5 g Etanol 100% CH3CH2OH 50 ml Sulfato de amonio y aluminio 100 g Agua destilada 1000 ml Oxido de mercurio (HgO) 2.5 g

Hematoxilina. El componente activo es la hematena (tiene cargas negativas) que se obtiene de la oxidacin (maduracin) Una vez que se da la maduracin toma un color rojo vinoso, tonalidad que toman los ncleos.

Sulfato de potasio y aluminio. *Mordiente. Piedra alumbre. Color mbar claro. Con esta sustancia se da color a la hematoxilina. Suministra cargas positivas, que actan como puentes qumicos para unirse a las cargas negativas de la hematena y del cido fosfrico de las cadenas de DNA nuclear. Graba el color en las clulas.

HgO. Oxido de mercurio. (Rojo o amarillo). Activa la hematoxilina para obtener POR OXIDACIN la hematena. (Maduracin). LA HEMATEINA da la tonalidad a los ncleos.

CH3COOH glacial. Acido actico glacial. Diferenciador. Estabiliza el colorante. Previene la oxidacin. Incrementa la precisin de la tincin nuclear.

Orange G 6
Existen al menos dos frmulas para la tincin Orange G, una de las cuales es OG 6 y la otra OG modificado. Se detallara a continuacin la frmula OG 6. Reactivos para preparar 1000 ml de Orange 6. Cristales de Orange G 10 g Agua destilada 100 ml Etanol al 95% 1000 ml Acido fosfotngstico 0.15 g Se prepara partiendo de soluciones madre.

Orange G Cristales. Colorante especifico para teir clulas queratinizadas. Penetra rpidamente al citoplasma. Tie el citoplasma del epitelio escamoso simple maduro y queratinizado.

 Eosina Alcohol 50
Existen varias formas para preparar el colorante EA 50.
Reactivos para preparar 2000 ml de EA 50 Eosina amarillenta 10 g Pardo Bismark amarillento 10 g Verde luz SF amarillento 10 g Agua destilada 300 ml Etanol al 95% 2000 ml Acido fosfotngstico 4 g Carbonato de litio saturado 20 g Se prepara partiendo de soluciones madre.

Acido fosfotngstico. *Mordiente. Graba el color en la clula.

Eosina amarillenta. Colorante de fondo o contraste. En unin con el colorante nuclear da tono rosa al citoplasma. Colorea el citoplasma de las clulas escamosas, nuclolos y eritrocitos.

Verde luz SF amarillento. Colorante diferencial. Da tono verde azul a los citoplasmas de: Clulas intermedias. Clulas de la capa profunda. Clulas columnares. Histiocitos. Leucocitos.

Acido fosfotngstico. *Mordiente Une el light green con las protenas de la clula. Graba el color en la clula.

Vesuvina o Pardo Bismark amarillento. Reactivo de contraste. Determina los colores verdeazul o rosa de los citoplasmas.

Alcohol 96% Evita la contaminacin con hongos.

Agua destilada. Medio de transporte. Bsico para soluciones madre. Disolver reactivos. Como solucin acuosa saturada en combinacin con el carbonato de litio.

 Solucin amoniacal al 0.5 %

Preparar una solucin al 5% de hidrxido de amonio agregando 5 ml de hidrxido de amonio y completar un volumen de 1000 ml.

Solucin de cido clorhdrico al 0.5 %

Reactivos Acido clorhdrico 1N

HCL Agua destilada

60 ml Completar a 1000 ml

Acido clorhdrico 12N (fumante) 5 ml Completar a 1000 ml

Solucin de cido clorhdrico al 0.5 %

Reactivos HCL Agua destilada Acido clorhdrico 1N 60 ml Completar a 1000 ml Acido clorhdrico 12N (fumante) 5 ml Completar a 1000 ml

Cuidados a los colorantes.

1. Verificar que las soluciones estn rotuladas indicando:

A. Fecha de preparacin. B. Nombre de la solucin. C. Titulacin. D. Concentracin. E. Requisitos para almacenar. F. Advertencias para su manejo. G. Fecha de vencimiento.

OG-6 COLORANTE PAPANICOLAU Solucin colorante utilizada en laboratorios de histopatologa para tincin celular segn procedimiento de Papanicolaou. OG-500 Envase con 500 ml. Se complementa con la Hematoxilina de Harris y con el EA-50 OG-1000 Envase con 1000 ml. de Papanicolaou. C16H10N2O7S2Na2 P.M. 452. 38 CAS: 1936-15-8

2. Conservar los colorantes en:

A. Envases oscuros
B. Bien tapados porque son sensibles a la luz. C. Se * oxidan a temperatura ambiente. D. Almacenar las soluciones inflamables en un rea aprobada antifuego. E. No manejar los colorantes cerca de estufas o fuentes oxidantes. F. Almacenar las soluciones de tincin entre 15C Y 25C. despus de abrir el frasco si es almacenado entre 15C y 25C es utilizable hasta la fecha de caducidad indicada. *oxidacin. Corrosin seca, reaccin de un material con el medio ambiente. Reaccin de un material con el oxigeno, si este oxido es estable se formara una capa en la superficie, el material aumenta su peso y volumen.

3. El tren de tincin se cambiara:

A. Cada 2000 laminillas teidas.

B. Cada 6 u 8 semanas.

4. Batera de tincin:
A. Preparar una batera de tincin exclusiva para las muestras de examen de Papanicolaou.

B. Rotular las cubetas.

C. Los colorantes se deben filtrar inmediatamente antes de llenar las cubetas, usando un embudo y papel filtro.

D. La batera de tincin requiere estar bajo campana de extraccin de gases.

E. La batera de tincin debe encontrarse en una sala con buena ventilacin.

5. Si el laboratorio procesa muestras no ginecolgicas, ests deben teirse en una batera diferente, pera prevenir el riesgo de contaminacin cruzada.

6. Se deber realizar dos tipos de mantenimiento en los colorantes: A. Mantenimiento general.

Filtrar los colorantes cada 8 das para remover cualquier material celular que se haya desprendido usando papel filtro. Limpiar las cajas de todo residuo de colorante y verificar que estn libres de sedimentos. Controlar diariamente el nivel de las soluciones de la batera de tincin. Tapar las cubetas con soluciones y colorantes cuando no se usen y el mayor tiempo posible cuando estn en uso, para evitar evaporacin.

B. Mantenimiento especfico.
En la hematoxilina, se debe retirar la capa de aspecto metlico que se forma sobre el colorante con papel absorbente o filtracin. El Orange G y EA deben ser remplazados cada semana. El HCl al 0.5 % debe ser remplazado diariamente. El etanol es altamente *higroscpico. Es indispensable mantenerlo bien tapado.

*higroscpico. Todos los compuestos que atraen agua, estos compuestos son utilizados como desecantes.

 Los alcoholes para re hidratar y deshidratar usados antes de la tincin del citoplasma, deberan remplazarse semanalmente.

Descartar los alcoholes de enjuague si estn muy teidos.

Los alcoholes usados despus de la tincin del citoplasma se cambian generalmente de un modo rotatorio, es decir, se descarta el alcohol que sigue a la tincin y los otros dos se mueven a la 1ra y 2da posicin. Los alcoholes absolutos deben ser mantenidos libres de agua con el agregado de pellets de Silica Gel con esto se puede disminuir el riesgo de la contaminacin acuosa del xilol. El xilol debe cambiarse si aparece teido con colorantes del citoplasma. Si tiene agua la solucin aparece como lechosa y se puede alterar el aclaramiento.

Resultados de tincin.
Componente. Ncleo. Cromatina. Coloracin. Coloracin perfecta. Color azul o prpura. Funcin. Colorante nuclear. Dar coloracin perfecta a todos los componentes del ncleo.

Membrana nuclear. Nuclolo.

Color azul o prpura. Color rojo, rosado o naranja.

Citoplasma.

Color eosinfilo y/o cianfilo. Color amarillo o naranja, si hay presencia de queratina. Coloracin homognea, estable y transparente. Colorante citoplasmtico. Permitir la diferenciacin entre las clulas

Observaciones.

Cada inmersin de la canastilla debe durar 1 o 2 segundos. Se efecta suavemente sin llegar a tocar la base de la cubeta para que no se desprendan las clulas y para evitar el quebrar la cubeta o alguna laminilla.

Algunos mtodos de tincin proponen el uso de una solucin amoniacal al 5%, tambin se puede utilizar una solucin saturada de carbonato de litio o agua caliente, si el agua es alta en su concentracin mineral se puede utilizar a temperatura ambiente. Se utiliza para obtener un cambio abrupto del pH cido obtenido y provocar un viraje celular o azulamiento, gracias a la descolorizacin controlada, para llegar a una tincin nuclear que sea ptima.

Para madurar la hematoxilina se puede utilizar como agente oxidante el oxido de mercurio o el yodatato de sodio, en algunos manuales indican la utilizacin de 1 ml de cido actico por cada 200 ml de colorante para intensificar la tincin nuclear.
24 hrs antes de usar, (para la conservacin del colorante).

Para madurar el OG 6 y EA 50 se puede agregar 0.5 g de cido fosfotngstico en una solucin de 5ml. 24 hrs antes de usar.

Si el xilol se nota blanco pero sin burbujas se pude agregar unas gotas de alcohol absoluto para que disminuir lo turbio del xilol.

Para retirar todo el fijador se puede agregar unas gotas de la solucin de HCL 5% al primer alcohol antes de la hematoxilina. 1ml de acido actico al ultimo alcohol antes de la hematoxilina para un lavado de fondo celular mucoltico y hemoltico similar al vial de CBL

Se pueden utilizar concentrados de EA 36 (eosina original en la tincin de Papanicolaou porque la diferenciacin entre las clulas basofilas o acidofilas es mejor), EA 50 o EA 65.

Eliminacin del fijador. Para iniciar el proceso de tincin nuclear es necesario eliminar el fijador de las laminillas, que usualmente es en base a polietilenglicol. Para ello se realiza un lavado con agua destilada o sumergiendo las lminas en etanol al 95%, seguido por un lavado con agua destilada.

Evitar problemas con los alcoholes o colorantes.

Los carros de tincin deben ser completamente escurridos entre una y otra cubeta para evitar la dilucin de los colorantes o la alteracin de los alcoholes, sin llegar al secado del frotis lo que producira una coloracin irregular.
Se recomienda que el carro de tincin repose por unos segundos en papel absorbente despus que ha sido retirado de una cubeta.

Intentar mantener las cubetas tapadas el mayor tiempo posible durante el proceso de tincin.

Las lminas teidas se deben mantener en una cubeta con xilol hasta el momento del montaje.

UNA VEZ HECHO EL MONTAJE COLOCAR LAS LAMINILLAS EN EL HORNO DE SACADO O DEJAR SECAR

Asear cuidadosamente los materiales ocupados y la superficie de trabajo una vez terminada la tincin de un conjunto de lminas.

Lavarse cuidadosamente las manos.

COMO ES MEJOR?