Inmunologa. Curso 2009-10.

Tema 13

TEMA 13: TCNICAS INMUNOLGICAS IV. Reacciones secundarias.

Precipitacin. Inmunodifusin. Aglutinacin. Inhibicin de la hemaglutinacin. Fijacin del complemento. Neutralizacin y seroneutralizacin.
OBJETIVOS - Distinguir las reacciones Ag-Ac primarias y secundarias. - Conocer los factores que influyen en la interaccin Ag-Ac en las reacciones secundarias. - Comprender los fundamentos de las tcnicas inmunolgicas basadas en reacciones secundarias y su aplicacin en el diagnstico veterinario. REACCIONES SECUNDARIAS Las reacciones secundarias valoran los cambios fsicos de la interaccin AgAc tras la formacin del inmunocomplejo. PRECIPITACIN: Se produce cuando el Ag es soluble. Se emplea como ensayo cualitativo o semicuantitativo para medir la cantidad de Ac. Tipos: a. Inmunoprecipitacin en medio lquido. b. Inmunoprecipitacin en medio slido b.1.) Inmunodifusin Simple en tubo Doble en placa Simple en placa a. Inmunoprecipitacin en medio lquido:

Curva de precipitacin cuantitativa

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Efecto prozona: Ausencia de reaccin inmune cuando hay altas concentraciones de Ac. Zona de equivalencia: Todo el Ag y Ac se encuentran formando complejos macromoleculares insolubles (teora del retculo). Consecuencias biolgicas: slo se dan determinadas actividades (p.ej. fagocitosis) cuando hay un equilibrio entre las concentraciones de Ag y de Ac (en la zona de equivalencia). b. Inmunoprecipitacin en medio slido: Utiliza un soporte slido gelificado en el que difunden el Ag y Ac. Se agrupan dentro de dos categoras: inmunodifusin y tcnicas inmunoelectroforticas. b.1. Inmunodifusin: Utiliza un soporte de agar en el que difunden el Ag y Ac. Donde se establece el equilibrio entre las concentraciones de Ag y de Ac se observa una banda de precipitado. La difusin puede realizarse en una o dos dimensiones y adems en tubo y en placa: Doble en placa: Ac y Ag difunden en el gel. Pueden observarse 3 patrones: Anti- AB Anti-B

Anti- AB

Ag AB Identidad total

Ag AB

Ag AB no identidad

identidad parcial

Inmunodifusin simple en placa (radial): El Ac es incorporado en el gel de agar. El Ag de los pocillos difunde formando anillosde precipitacin:

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Difusin simple en tubo: Se establece un gradiente de concentracin slo para uno de los reactivos (Ej. Ac). Difusin doble en tubo: El gradiente de concentraciones es para el Ac y el Ag.

AGLUTINACIN Ms sensible que la precipitacin. Se utiliza cuando bacteria). En el caso concreto de Ag ligados a hemoaglutinacin. Adems, algunos virus pueden eritrocitos de mamferos y aves, lo que puede usarse aglutinacin puede utilizarse como ensayo cualitativo cantidad de Ac. el Ag es particulado (ej. eritrocitos, se habla de aglutinar especficamente para su identificacin. La o semicuantitativo de la

a. Test de aglutinacin cualitativa (aglutinacin rpida): Consiste en mezclar Ag y Ac y observar la aglutinacin. Ej. Prueba de aglutinacin rpida para la brucelosis, test de determinacin de grupos sanguneos, test de Coombs para la anemia hemoltica autoinmune, etc. b. Test de aglutinacin cuantitativa (aglutinacin lenta): Para la titulacin de un suero: se diluye el suero y se enfrenta a una cantidad fija de Ag. TITULO: corresponde a la mxima dilucin del suero en el que la aglutinacin es positiva. Efecto Prozona: Debido al exceso de Ac no se forma la red que permite la aglutinacin. Puede tambin deberse a la presencia de Ac no aglutinantes.

1/8 1/16 1/32 1/64 1/128

... (dilucin suero)

TITULO

Figura 14. Titulacin de sueros

Efecto prozona

c. Aglutinacin pasiva: Conversin de una prueba de precipitacin en una de aglutinacin, uniendo qumicamente Ag solubles a partculas inertes como bacterias, ltex o eritrocitos (se habla de hemaglutinacin pasiva). d. Inhibicin de la hemaglutinacin: Algunos virus pueden aglutinar glbulos rojos (p.ej. los de la gripe o el de Newcastle). Para evidenciar su presencia se aaden Ac especficos para los mismos y se determina la inhibicin de la hemaglutinacin por bloqueo de los virus. Tambin se pueden emplear para titular sueros.

PRUEBAS DE FIJACIN DEL COMPLEMENTO

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Medida indirecta de Ac que no dan reacciones visibles. Se basan en que la unin Ag-Ac y formacin del inmunocomplejo activa el complemento y produce complejos que lesionan membranas celulares (eritrocitos y otras clulas). Exige que todos los reactivos estn bien cuantificados y usar controles de cada uno. Son pruebas que se realizan en dos fases: 1. Se incuba el suero problema con el Ag y el complemento. 2. Se aade un sistema indicador, como eritrocitos de oveja recubiertos de Ac especficos (hemolisinas). Si se lisan los eritrocitos indica que hay complemento libre que no se fij en la 1 reaccin y, por tanto, no hay Ac en el suero. Ej: diagnstico serolgico de brucelosis y perineumona contagiosa bovina (micoplasma), coccidioidomicosis, histoplasmosis, etc. REACCIONES DE NEUTRALIZACION Reacciones Ag-Ac que inactivan una exotoxina bacteriana o un microorganismo (generalmente un virus). Ej. -toxina de Clostridium perfringens o -toxina de Staphylococcus aureus. Se emplean frecuentemente para la identificacin de virus desconocidos y medir el ttulo de Ac especficos en sueros (Seroneutralizacin vrica) mediante diluciones. PREGUNTAS:

1.- Crees que el resultado de las pruebas de aglutinacin rpida (o cualitativa) puede ser siempre determinante en el diagnstico de una enfermedad infecciosa? Razona tu respuesta. 2.- Con qu criterios elegiras una tcnica inmunolgica sobre otras, como test de diagnstico? 3.- Qu tipo de ensayo podras emplear en la valoracin de la eficacia de una vacuna frente a una bacteria toxignica? 4- Sabemos que un virus determinado aglutina hemates (hemaglutinacin) y queremos determinar el ttulo de Ac especficos frente a ese virus en un animal. Crees que podramos hacerlo mediante una tcnica de aglutinacin cuantitativa? Razona tu respuesta. 5- Por qu se necesita realizar la tcnica de fijacin de complemento en 2 fases?

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