ENDURECIMIENTO

DE MATERIAL
VEGETAL IN VITRO
CÉSAR SALES C.
 Proceso de endurecimiento de
“vitroplantas ”
• Etapa 1.
1 Actividades pre-operativas 
En el desarrollo normal de un PE (proceso de
endurecimiento) exige una planeación previa que incluye
un cronograma detallado de todas las actividades que
integran el proceso a saber, la selección del personal que
lo ejecuta; la selección y adecuación de las instalaciones;
los análisis de laboratorio; la adquisición de equipos,
materiales e insumos; el envío por parte del laboratorio de
las plántulas a endurecer.
 
2. área de trabajo.
Consta de los siguientes
espacios: un depósito para
almacenar la turba y la
cascarilla de arroz. Una mini
bodega para los materiales e
insumos, un patio para hacer las
mezclas de la turba con la
cascarilla de arroz un sitio
fresco para la operación de
trasplante; este último debe
estar protegido de los rayos
solares y de los vientos fuertes,
debe tener, además un lavadero
y una mesa
3. Casa de malla. 
Esta instalación Debe tener techo. Se debe adecuar luego con
sistema de aclimatación automático que tenga microaspersores,
tanto suspendidos sobre las mesas o del techo como dispuestos
en el piso, con el fin de controlar la temperatura y la humedad
relativa, especialmente en los primeros días del proceso.
Aunque se requiere alta luminosidad para favorecer el desarrollo
de las plántulas, hay que evitar que estas reciban directamente
los rayos solares de la mañana, del medio día y de la tarde en los
primeros ocho días de aclimatación; por tanto debe instalarse
una pantalla protectora que puede ser una polisombra.
4. Invernadero:
 
Esta es una instalación
convencional, en la cual
debe colocarse un sistema
automático de riego con
microaspersores. Tanto en el
invernadero como en la casa
de malla, el sistema debe
estar controlado por una
válvula solenoide y un reloj
de control. Este sistema
ahorra el 90% del costo de la
mano de obra que se necesita
para regar las plántulas.
 
4 Equipos, materiales e insumos:
 
• El proceso de aclimatación de plántulas in vitro requiere los siguientes elementos:
 
• Probeta, frasco lavador, balanza, tijeras, bandejas plásticas o metálicas.
• Recipiente amplio (bandeja) para recibir las plántulas con agar extraídas de sus
frascos.
• Balde, pala, carreta, y palines; manguera y regadera.
• Bolsas plásticas negras (14 X 7cm) con perforaciones para el drenaje, bolsas
plásticas transparentes (1X 1m).
• Libro de campo, hojas de registro, marcador indeleble, lápiz; miniestacas plásticas
de identificación.
 
• Para evitar una posible contaminación de las plantas, se deben desinfectar todos
los implementos que se utilicen. Por ejemplo, si se cortan raíces u hojas con
tijeras, éstas deben desinfectarse en una solución jabonosa cada vez que se haga
un corte.
Etapa 2

1 Actividades operativas o técnicas.

 
El éxito de un PE depende del manejo integral de
una serie de operaciones que van desde la
recepción de las vitroplantas hasta su trasplante.
 
2. Recepción de vitroplantas:
 
Del laboratorio de biotecnología llegan cajas que
contienen los frascos con las vitroplantas. Estos
se retiran de las cajas y se colocan, dejando
espacio entre ellos, en un lugar fresco que tenga
luz artificial o luz indirecta del sol. Allí se
cuentan las vitroplantas y se registra el número de
individuos por variedad
En este paso se hace una preselección, que
consiste en separar los frascos según la altura y el
vigor de las vitroplantas y en eliminar aquellos
que se observan contaminados, quebrados o
maltratados, o que contienen plántulas
malformadas.
3. Preparación del
sustrato:
 
Para preparar el sustrato
en que se plantarán las
plántulas, se mezcla una
parte de turba, y tres
partes de cascarilla de
arroz, esterilizado por
vapor y distribuido en
contenedores con alvéolos
premoldeados de 5cm3 de
capacidad.
4. Preparación del trasplante:
 
Las actividades previas al trasplante son las siguientes: desinfectar las
instalaciones, llenar las bolsas pequeñas, preparar la mezcla de fertilizante y el
fungicida, y alistar las bandejas y las bolsas grandes que se emplearán en las
minicámaras húmedas.
 
4.1 Desinfección y limpieza del sitio:

Todas las instalaciones deben desinfectarse con hipoclorito de sodio en forma

rigurosa; además, los enseres y elementos que contienen deben colocarse
ordenadamente. Esta operación de limpieza se extenderá al sitio en que se hace el
transplante al área de la casa de malla o del invernadero donde se llevará a cabo
el endurecimiento de las plántulas.
 Preparación de las bolsas:
Las bolsas plásticas negras (7 X 14cm) se llenan con la mezcla turba y cascarilla de arroz en los ¾ de su
volumen.
 
La mezcla se comprime fuertemente en la bolsa para obtener un sustrato compacto. Esta compactación
estimulará más tarde la producción de rizomas y las hará más largas y más gruesas.
 
Preparación de las bandejas:

Sobre ellas se colocan las bolsas que contienen el sustrato ya compactado. Se prepara luego la siguiente
solución:
 
En un litro de agua desionizada se mezcla 1g de fungicida y 2g de un fertilizante rico en fósforo (por ejemplo
de la formula 10-52-10).
 
Enseguida se riega la bolsa con 10cc. De la mezcla anterior (primer riego).

Preparación de cámaras húmedas:

 
Se introduce luego la base de cada bandeja en una bolsa de plástico transparente (1 x 1m, doblada) que ha sido
plegada y recogida hasta su base, en todo su entorno. Más tarde, la bolsa se extenderá hacia arriba deshaciendo
los pliegues circulares, sus bordes se atarán firmemente y el conjunto hará entonces la función de una cámara
húmeda.
Etapa 3

1 Actividades del proceso de trasplante

 
El trasplante es un proceso “traumático” para las plántulas, especialmente cuando la mano de obra
que lo ejecuta no es calificada o carece de experiencia. Las plántulas sufren un estrés
microclimático cuando pasan de los frascos a las minicámaras húmedas, debido a los siguientes
factores: Deshidratación, paso de un sustrato rico en nutrientes a otro muy pobre en ellos (mezcla
de turba y cascarilla de arroz), daños mecánicos casi inevitables en varias partes de la plántula
(cofia, pelos absorbentes, raíces, tallo y hojas). Del cuidado con que se hagan las actividades del
trasplante depende el éxito de la climatización de las plántulas y su supervivencia.
 
El trasplante debe hacerse inmediatamente después de extraídas las vitroplantas de sus frascos.
Cuando este proceso se realiza por primera vez y no se conocen muy bien las condiciones
ambientales de las instalaciones en que se realizará, se sugiere que se inicie a las 17:00h todos los
días con el fin de evitar la deshidratación de las plántulas. Las actividades más importantes del
proceso son las siguientes:
2 Selección:
 
Se inicia el proceso con una primera selección de los frascos que contengan las plántulas más
vigorosas, o sea, las de color verde intenso que estén erguidas y cuyo tamaño oscile entre 5 y 7 cm.
 
Extracción de las vitroplantas:

Esta operación consta de los siguientes pasos:

 
• Retirar la cinta plástica y la tapa de los frascos. (fig. E8)
• Agregar agua desionizada al frasco para humedecer el sustrato de agar y facilitar la extracción del
conjunto (plántula + agar). (Fig. E9)
• Sostener el frasco con una mano y golpearlo con la otra suavemente hasta desprender el agar de las
paredes del frasco. Si así no despega, se usa una espátula teniendo cuidado de no dañar las raíces.
• Extraer delicadamente la plántula, inclinando el frasco; no se utilizan pinzas para reducir el riesgo
de causar daño al tallo.
• Colocar la plántula en un recipiente amplio (bandeja onda) con agua desionizada, donde puedan
moverse libremente las manos para retirar el agar.
• Retirar suavemente con el frasco lavador, las partículas de agar que sigan adheridos a las raíces.
• Hacer la segunda selección de plantas vigorosas, eliminando las pequeñas, las mal formadas y las
débiles.
Trasplante 
Con una mano se lleva la plántula,
introduciendo en esta su raíz y la
parte inferior del tallito; esta mano
debe mantenerse rígida para evitar la
rotura de pelos absorbentes y de
raíces de la plántula, con la otra mano
se agrega la cuarta parte de sustrato
que no se había añadido, procurando
que las raíces queden en posición
normal, o sea, como se encontraban
en el frasco: así se evitará que sufran
algún efecto adverso (mecánico o
fisiológico) debido al cambio de
posición.
 
Una vez hecho el trasplante en todas
las bolsas de la bandeja, las plántulas
reciben el segundo riego con 10cc.
De la mezcla de fertilizante y
fungicida usada antes.
Cámara húmeda y endurecimiento:
 
Los siguientes pasos dan comienzo al proceso real de endurecimiento de las plántulas:
 
• La bandeja se marca con una etiqueta en que figuren el nombre de la variedad, la
cantidad de bolsas que contiene, la fecha y hora de trasplante, y el nombre del
operario que hizo el trasplante.
• Se desenrolla entonces la bolsa transparente grande (1m X 1m) en cuyo fondo se
había colocado la bandeja y se sierran sus bordes arriba atándolos con un cordel. En
este momento, cada bolsa grande se convierte en una cámara húmeda.
• Las cámaras húmedas se trasladan finalmente al sitio de la instalación en el que se
llevará a cabo el PE. para evitar que la parte superior de cada cámara se doble sobre
las plántulas y las dañe se sugiere que se sujete el cordel a un alambre tutor que se
tiende por encima de las cámaras. (Fig. E10).
Mantenimiento de las plantas trasplantadas:
 
En esta etapa se debe prestar mucha atención a los cambios microclimáticos que
ocurran dentro de las instalaciones, al riego que requieran las plántulas, a su nutrición,
y a la presencia en ellas de plagas y enfermedades.
 
Se recomienda, además, no mover las bolsas con las plántulas durante el primer mes
después del trasplante para no causar daño en las raíces (especialmente en la cofia, y
en los pelos absorbentes). Estas partes de la planta son frágiles y quebradizas en esta
etapa temprana de su desarrollo. Los daños o roturas en los tejidos radicales aumentan
la probabilidad de que entre en la planta un organismo patógeno o de que se retrase su
crecimiento y desarrollo (o de que ocurran ambas cosas).

 
Microclima y cámara húmeda:

Entre el día 8 y el día 12 después del día de trasplante se retira a ser posible
en las horas de la tarde, el cordel que cierra la cámara húmeda y ésta (la
bolsa grande transparente) se abre completamente.

El objetivo de esta operación es permitir que las plántulas se adapten al

microambiente de las instalaciones.

Si se observa que tienden a marchitarse, se debe cerrar de nuevo la bolsa y

continuar con el tratamiento de cámara húmeda.

Si las plántulas se han adaptado bien al microambiente al segundo o tercer

día después de abrir la bolsa grande (8 a 12 días después del trasplante),
ésta se enrolla hasta la base de la bandeja o se retira para dejar sólo la
bandeja con las plántulas. En este paso se debe evitar que un viento fuerte
deshidrate las plántulas.
Riego:

Si se han regado las plántulas con la cantidad correcta de solución nutritiva (ver antes) y se
ha formado bien el ambiente de la minicámara húmeda, las plántulas no necesitan riego
en esta etapa.

Si se presentan (y sólo entonces) los primeros síntomas de marchites fisiológica de las

plántulas una vez retirada la bolsa grande de la cámara húmeda, el sustrato recibe el tercer
riego. Se procura no humedecer las hojas para alejar el riesgo del ataque de algún
patógeno. Cada plántula se riega con 10cc. De una solución nutritiva que consiste en una
mezcla de 2g de fertilizante rico en fósforo para promover la formación de raíces (10-52-
10), y 1g de agrimins (un fertilizante rico en elementos menores) por litro de agua
desionizada.

Según las condiciones microclimáticas de las instalaciones y según el estado de turgencia

de las plántulas, se pueden programar luego uno o dos riegos diarios, cada uno con 10cc.
Del agua que se utiliza normalmente en el riego de otras plantas.

Se recomienda que entre los 21 y 25 días después del trasplante, se implemente en la casa
de malla un riego por microaspersión (RMA), con el cual se reduce mucho el costo de la
mano de obra. Se recomienda dar a las plántulas de 2 a 3 minutos de RMA en la mañana, y
si es necesario, otros 2 0 3 minutos en la tarde.

Cuando se aplica el RMA, es indispensable hacer inspecciones rigurosas para detectar

cualquier problema fitológico en las plántulas.
Etapa 4

Separación de las plántulas:

De 30 a 34 días después de
haber trasplantado, las plántulas
necesitan más luminosidad y
mayor temperatura para
estimular su crecimiento y
desarrollo. Por tanto se colocan
las plantas más separadas en un
área que sea el doble o el triple
de la que ocupaban inicialmente.

Finalmente las plantas

permanecen en la casa de malla
durante un lapso de 70 a 90 días;
transcurrido este tiempo son
llevadas a campo.