La enzima unidora de polinucleótidos tie- ne la capacidad de reparar

mellas en la cadena de ADN. La enzima puede únicamente reparar una

rotura cuando todos los nucleótidos están intactos y cuando lo que falta El ADN molde se obtuvo del X174 y se marcó con tritio, el isotopo
es el enlace covalente entre un azúcar y su fosfato vecino en el espinazo radiactivo del hidrógeno. El tritio serviría después continuamente En nuestro laboratorio de la Facultad de Medicina de
del ADN. Ahora, al disponer de la enzima unidora, estábamos en como señal para identificar al molde. " Se añadieron al molde, junto
la Univer- sidad de Standford hemos logrado la síntesis de
condiciones de demostrar si esta enzima podía funcionar en con A, T, G y C", ADN polimerasa, enzima unidora purificada y un El material de que partimos fue
cofactor . El fósforo radiactivo serviria, pues, para el marcaje del Copias de ADN de cadena sencilla del ADN viral y, finalmente, una forma rara de ADN de
colaboración con la ADN polimerasa en la sintesis de un ADN viral una doble hélice completamente sintética.
material sintético, igual que el tritio pata el molde. cadena sencilla del virus bacte-
completamente circular y biologicamente activo. La utilizacion del ADN
del OX174 como molde representaba una ventaja importante respecto riano conocido como DX174.
a los experimentos basados en la capacidad transformante. La cadena sencilla forma un
lazo cerrado. Cuando el OX174
in- fecta las células de la
bacteria Escherichia coli, el
En 1964 se nos ocurrió pensar que el lazo de la cadena sencilla de
problema de la síntesis de ADN
ADN actúa de mol- de
biológicamente activo podría resolverse
utilizando una forma más simple de dirigiendo la síntesis
ADN que tuviera también genética, tal enzimática de un segundo lazo
como el del virus X174, cuyo núcleo de
ADN es un lazo de cadena sencilla. Este
EL VIRUS SINTESIS de ADN sintético. Los dos lazos
forman una doble hélice
cromosoma no sólo es más simple en 0X174 DEL ADN anular, similar a las hélices de
es- tructura, sino además tan pequeño
ADN que se encuentran en las
que es bastante fácil extraerlo sin
romperlo. Sabíamos también, por el células bacterianas y
trabajo de Robert L. Sinsheimer, del en los organismos superiores.
Instituto de Tecnología de California,
que cuando el ADN del 0X174 invade al
Escherichia coli, el primer estadio de la
infección implica la «subversión» de
una de las enzimas del huésped para
convertir el lazo de cadena sencilla en

ADN
otro de doble cadena helicoidal.

Después de aislar el ADN sintético se le

somete a la degradación por una enzima
que rompe todos los enlaces entre el
fosfato y el carbono 5 de la
desoxirribosa, dejando el átomo de
fósforo radiac- tivo combinado con
nucleótido vecino en lugar del que había
estado originariamente unido . El
análisis de la radiactividad establece el ANÁLISIS Esperábamos que los extractos
contenido en fósforo radiactivo de cada
nucleótido e indica en seguida la DEL EL ADN de Escherichia coli fueran capaces
frecuencia con que A se une a A. Este de incorporar
segundo experimento nos da la VECINO POLIMERA desoxitimi- dina en ácido nucleico,
convirtiendo pri- mero el
frecuencia de los dinucleótidos GA, GG,
GT y GC. Dos experimentos más con Ty
MAS SA desoxinucleósido en el 5'-des-
C radiactivos completan el análisis que PRÓXIMO oxinucleótido y activando éste
después
establece las 15 frecuencias posibles de
vecinos más próximos. Es más, cuando a la forma de trifosfato. En los
un ADN sin- tético se utilizó para una meses siguientes, Ernest Sims y yo
nueva replicación dio lugar a un ADN pudimos
con una distribución de frecuencia de preparar separadamente
vecinos más próximos, idéntica a la suya desoxitimidina 5'-trifosfato y los
propia. otros
desoxinucleosidos trifosfatos,
utilizando enzimas o rutas
El análisis del vecino más cercano, ideado en 1959 por John Josse, A. Dabe Kaisery yo mis- mo, determina químicas sintéticas. En lo que
la frecuencia relativa con que dos nucleótidos resultan unidos lateralmente en una molécula de ADN sigue designaremos a los diversos
De este análisis se dedujo, entre otras cosas, el reconocimiento de un hecho sintético. Hay en total 16 combinaciones posibles y, de ellas, cuatro secuencias posibles de vecinos más desoxinucleo- sidos en sus formas
Se demostró que el ADN sintético era una molécula con la estructura quimica típica del 5'-trifosfato por la letra inicial de
básico sobre la estructura de la doble hélice. La dirección de la cadena de próximos de A , cuatro de G y, análogamente, cuatro de T y cuatro de C. El procedimiento consiste en
ADN sintetizada durante la replicación era opuesta a la de su molde. La utilizar primero, durante la síntesis, un trifosfato marcado con un átomo de fósforo radiactivo y tratar ADN y con la misma proporción de pares A-T y G-C que el ADN utilizado como patrón la base marcada con un asterisco.
exactitud del análisis de la frecuencia de vecinos más próximos no puede ser, después el ADN sintetizado con una enzima especifica que rompa el ADN, dejando el átomo de fósforo para dirigir la reacción. Las cantidades relativas utilizadas de los cuatro Lo que todavía no sabiamos era si
aunque éste se efectúe con el máximo cuidado, superior al 98%. Parte de la radiactivo unido a su vecino más inmediato. Por ejemplo, se realiza la síntesis del ADN con marcado en el desoxinucleosidos trifosfatos no tenían ninguna influencia en la composición del el ADN sintético era una molécula
dificultad en conseguir la síntesis de ADN biológicamente activo se debía a la nueva o una ex- tensión de una
grupo fosfato más interno, es decir, en el grupo que habrá de quedar incorpo- rado en el ADN al nuevo ADN. La composición del ADN sintético estaba determinada
persistencia de trazas de nucleasas en nuestras preparaciones de ADN sintetizarse éste. Este grupo de fosfato marcado forma, entonces, un enlace normal con su nucleótido preexistente.
exclusiva- mente por la composición del ADN que servia de patrón.
polimerasa. vecino en la cadena.