MÉTODOS D E

DIAGNÓSTICO E N
MICROBIOLOGÍA
César Mauricio Ayala
Tatiana Marcela Cáceres
Jose Manuel Caro
Laura María Chaparro
 Métodos basados en criterios morfológicos
- Microscopía ( Tinción de Gram)

Forma Cápsula Endóspora Tamaño Bordes

cocos, presente o ovales, cortos abultados,

bacilos, ausente esféricas, largos paralelos,
cocobacilos terminales, cóncavos,
filamentosos subterminales irregulares
, bacilos
curvos, etc
Extremos Disposición Formas Tinción

redondeados, parejas, variación en forma uniforme

puntiagudos cadenas, y tamaño irregular,
ramificados, bipolar,
tétradas, fusiformes, etc.
etc
racimos,
etc.
- Macroscopía
 Métodos basados en tinción diferencial

Tinción de
Gram
Ziehl
Neelse
n
Tinción de
esporas
Tinción de estructuras específicas

La tinción negativa revela la presencia de cápsulas

alrededor de la bacteria.

Se mezclan las bacterias con tinta china o

nigrosina y se extiende en una capa fina sobre un
portaobjeto, en el microscopio se podrá observar
que aparecen cuerpos más claros debido a que la
tinta no penetra ni la célula ni la cápsula.
Tinción de flagelos

Tinción de Leifson. Tiene 3 colorantes:

→ F ucsina básica en Alcoholetílico

al 95%, en 1.27%.

→ Ácido tánico en agua destilada, en 3%.

→ Clorurodesodio en agua
destilada, 1.5%.

Se deja por 1 0 minutos.

 Métodos basados en pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias,
estas pruebas se fundamentan en demostra r:

Degradación de compuestos.
Fermentación de azúcares.
Producción de compuestos
Presencia de enzimas.
coloreados.
Existen flujogramas para la identificación bacteriana, mediante pruebas bioquímicas
de microorganismos. Por ejemplo, la presencia de un cocobacilo gram negativo,
facultativo, fermentador de glucosa y oxidasa negativo, nos indica la presencia de
una enterobacteria, para determinar su género podemos seguir el siguiente esquema.
 Sistemas miniaturizados

El tiempo necesario para la identificación de bacterias puede reducirse

considerablemente con el uso de sistemas miniaturizados basados en pruebas
bioquímicas, estos sistemas han sido diseñados para realizar varias pruebas
bioquímicas simultáneamente y permitir la identificación en un menor tiempo.
BBL Crystal
 Lectura de las pruebas
Manual Computarizada
SISTEMAS MINIATURIZADOS API
Consisten en un dispositivo de plástico con
varios microtubos que contienen diferentes
medios de cultivo deshidratados o
diferentes sustratos de enzimas de acuerdo
al tipo de prueba requerida.

Algunas pruebas bioquímicas que pueden

realizarse con estossistemas son: de
fermentación carbohidratos,
determinación de la producción de H 2 S,
determinación de la hidrólisis de la
gelatina, entre otras.
 API® 2 0 E

Permite la identificación de enterobacterias y de

otros bacilos gram negativos. Es una galería
conformada por 2 0 microtubos.
 API® 2 0 N E
Permite identificar bacilos gram negativos no pertenecientes al grupo de las
enterobacterias como por ejemplo Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium,
Moraxella, Vibrio, Aeromonas, entre otros. Galería conformada por 2 0 microtubos.
 API® 2 0 A
Permiten identificar bacterias anaerobias. Galería conformada por 2 0 microtubos.
Una vez inoculada la galería con la suspensión del microorganismo a identificar, el
sistema requiere ser incubado en una jarra Gaspak® u otro sistema que provea
condiciones de anaerobiosis.
 API® S T A P H
Este sistema permite la identificación de microorganismos pertenecientes al género
Staphylococcus, Micrococcus y Kocuria. Es una galería conformada por 2 0
microtubos.
 OTROS SISTEMAS API®

Existen otros sistemas miniaturizados API®;

entre ellos podemos señalar el A PI® 2 0
STR E P, A PI® CAMPY, el API®
el el A PI® CANDIDA.
CORYNE,
En la figura podemos observar el A PI® 5 0 –
CHL utilizado para la identificación de
Lactobacilos. Es una galería conformada por
5 0 microtubos.
 Procedimiento
1. Tomar 3-4 colonias aisladas y disolver en 5mL de
solución salina o agua estéril.

2. Llenar con la solución bacteriana los tubos de todos

los pocillos.

3. Llenar hasta la cúpula los pocillos CIT, V P, GEL...

4. Tapar con parafina líquida las cúpulas de los pozos

ADH, LDC, ODC, URE, H 2 S... para obtener una
ambiente de anaerobiosis.

5. Poner la tira de pruebas en una cámara húmeda de

incubación a 3 7 ° C de 18-24 horas.
 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Se basa en la observación de las coloraciones desarrolladas. Se compara el color

obtenido en cada microtubo con el que muestra la carta de colores y se establece un
resultado positivo ( + ) o negativo (-).
Se obtiene un código de 7 dígitos denominado “perfil numérico” que resulta de la
suma de los valores correspondientes a las pruebas positivas asignados
previamente en la planilla. En algunos sistemas miniaturizados se recomienda la
realización de pruebas bioquímicas adicionales, que permiten obtener dos
dígitos más. El código obtenido se corresponderá a un determinado género o
especie de acuerdo a la información contenida en las bases de datos
suministradas por el fabricante y que pueden encontrarse disponibles en forma
impresa y/o electrónica.
 Información importante
Con fines de control microbiológico, la USP(estándares de referencia) indica
cuales son las pruebas bioquímicas mínimas que se requieren para la identificación
de los microorganismos objetables, pero no descarta que se utilicen sistemas
miniaturizados donde se realizan un número mayor de pruebas bioquímicas.

Cada casa fabricante tiene su propia presentación, cálculos, manuales, etc.

Una limitación de este tipo de método de identificación es la aparición de cepas

mutantes y la adquisición de plásmidos que pueden dar origen a cepas con
características diferentes.

Este método también ha sido desarrollado para la identificación de levaduras y de

otros hongos.
 Métodos basados en tipificación de fagos
La interacción entre un virus bacteriano
(fago) y su célula bacteriana sensible es
sumamente específica, ya que el proceso
de adsorción se encuentra mediado por
receptores específicos tanto en el virus
como en la célula bacteriana.

El uso de fagos permite

específicos identificar y
subclasificar dentro de una bacterias
misma especie.
En un agar se inocula un cultivo puro de una determinada bacteria y se añade
una alícuota de un fago específico. Éste puede ocasionar la lisis de las bacterias,
hecho que se evidencia en el cultivo como zonas claras definidas, denominadas
placas, que indican que hubo infección y lisis celular.
Métodos basados en pruebas inmunológicas

1. Pruebas serológicas

2. Detección de Antígenos
Pruebas
serológicas
Las pruebas serológicas constituyen un método
indirecto de diagnóstico al detectar en el suero del
paciente los anticuerpos formados frente al
microorganismo causante de la infección.

Se utilizan como diagnóstico confirmatorio después de

la identificación por diferentes métodos, como los
bioquímicos.
Cada uno de los métodos tiene su
fundamento particular, pero en
general, todos se basan en la
reacción de un antígeno presente
en el agente microbiano con su
anticuerpo correspondiente.

Pueden ser de gran utilidad en la

identificación microbiana en
muestras puras o en muestras
biológicas.
➔ Aglutinación directa

Se basan en la unión de antígenos particulados a los

anticuerpos. Son pruebas sensibles pero poco
específicas.

Se prepara una suspensión del microorganismo

(antígeno), y se le agrega al suero del paciente, si
hay anticuerpos, se producirá la aglutinación. Puede
realizarse sobre un portaobjetos, en tubos de
ensayo o en placas de microtitulación.

Se hacen diluciones del suero para ver el título de

anticuerpos.
→ Aglutinación

Con anticuerpos particulados se permite la

detección de antígenos
solubles.
Prueba rápida.
 Aglutinación con rosa de
Bengala empleada en el
diagnóstico de la
brucelosis.

En casos de meningitis, se puede detectar en el LCR la presencia de antígenos

de Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningiditis
y de Streptococcus beta hemolítico grupo B.
➔ Inmunofluorescencia
Pueden utilizarse para detectar anticuerpos o para detectar la presencia de un
patógeno. En ambos casos la reacción finaliza mediante la adición de un anticuerpo
conjugado a una sustancia fluorescente.

Se usa en la detección Bordetella

pertussis, Rickettsia y Chlamydia
trachomatis.

Rickettsia typhi IFA