TEMA 28.

- EXPLORACIÓN DE LA
RESPUESTA MEDIADA POR
CÉLULAS: BASES DE LAS TÉCNICAS
CELULARES. MEDIDA DE LA
RESPUESTA EFECTORA
CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE
 Ejemplos de CD

CD8

Cytotoxic
T-Lymphocyte
Ficoll Citometría de flujo Magnética Captura celular
(“Panning”)
TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS
Aislamiento de linfocitos: Gradiente sobre Ficoll/Hypaque (Boyum 1968)
Humanos: Sangre Periférica – Organos
Modelo experimental (ratón): bazo, NL, timo
Separar linfocitos de monocitos
en gradiente de Percoll
 ESQUEMA DE CITOMETRO DE FLUJO

DISPERSIÓN DE LUZ
EMISIÓN DE FLUORESCENCIA

CARACTERIZACIÓN

Tamaño/Granularidad citoplasmática
 Citometría de flujo
• Principio:
• Sobre células individuales en movimiento
marcadas con sondas fluorescentes, se hace
incidir una fuente de luz láser.
• Ocurren dos fenómenos simultáneos:

Emisión de luz por

Dispersión de luz fluorescencia

Para cada partícula individual que pasa por la fuente de

excitación se miden ambas componentes
caracterización
 FACS:
“Fluorescence Activated Cell Sorter”
• La citometría de flujo cuantifica diferentes parámetros
en las células. En unos pocos segundos procesa miles de
células
• Cada célula pasa mediante flujo continuo a través de un
láser, emite fluorescencia y lo dispersa
• El citómetro detecta:
1. Diámetro de las células
2. Estructuras granulares dentro de las células
3. Intensidades de fluorescencia a diferentes λ
• Distingue células vivas y muertas, y separa en comparti-
mentos según fluorescencia
 FACS
FLUOROCROMOS
Fluoresceína Naranja acridina
Rodamina DAPI
R-ficoeritrina PI

Separa células por:

• Tamaño
• Complejidad celular (estructura granular)
Ag superficie • Marcadores (fluorocromos o anticuerpos
conjugados con fluorocromos)
Pigmentos
Proteínas
Contenido en ADN/ARN
Citoesqueleto
Citómetro para separación de células (FACS)
¿Como se ubican espacialmente las poblaciones de
leucocitos de sangre periférica?
COMPLEJIDAD

TAMAÑO
APLICACIONES CLÍNICAS DE LA CITOMETRÍA
Hematología: Contaje celular, fórmula leucocitaria, contaje
reticulocitario, análisis de médula ósea.
Farmacología: Estudios de cinética celular.
Inmunología: Subpoblaciones de linfocitos, estimulación
linfocitaria. Medida de la “explosión respiratoria”
Oncología: Diagnóstico/pronóstico de leucemias, detección de
oncoproteínas, monitorizar tratamiento.
Microbiología: Diagnóstico bacteriano y vírico (cuantificación
LTCD4+ en SIDA), sensibilidad a antibióticos.

FACS

Separación celular y clonación

Otras aplicaciones: separación de espermatozoides X e Y en
inseminación artificial
SEPARACIÓN INMUNOMAGNÉTICA
 Captura celular (“panning”)
Rendimiento: > 90% pureza y viabilidad

Ag -
Ag -
Población negativa Ag+ Ag -
Ag -

Ag -
Ag -

Ag+ Ag+ Ag+

Población positiva

Placa sensibilizada (Ac)

 MEDIDA DE LA RESPUESTA EFECTORA (I)

MEDIDA DE LA ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS

Proliferación celular de linfocitos “in vitro”

Activación por mitógenos Activación dependiente de Ag

PROLIFERACIÓN POLICLONAL
 MEDIDA DE LA RESPUESTA EFECTORA (II)

1.- Medida de la actividad citotóxica

2.- Determinación y cuantificación

de citoquinas
ELISA sandwich
RT-PCR
Citometría de flujo

Tinción Giemsa y examen microscópico

3.- Fagocitosis

Citometría de flujo