Métodos de

medición
analítica en
Bioquímica
Clínica
Bioquímica
 “Ciencia que
estudia las bases
químicas de la
vida”

Pilar fundamental de la biotecnología, y se ha

consolidado como una disciplina esencial para
abordar los grandes problemas y enfermedades
actuales y del futuro
Utilidad
 Diagnóstico
 Valoración del pronóstico y del
tratamiento
 Investigación
 Ensayos clínicos de fármacos.
Fase Analítica
Comprende:

 Técnicas analíticas

Procedimientos de análisis basados en

el comportamiento de la materia.

 Espectrometría  Electroforesis
 Cromatografía  Electroquímica
 Química seca  Inmunoensayos
 Métodos Analíticos

Son aplicaciones de las técnicas, con

parámetros y protocolos concretos.

 Características analíticas: punto final, cinético,

colorimétrico, enzimático, métodos de curva de
calibración.

 Reactivos usados: glucosa oxidasa, verde de

bromocresol
Fase Post-analítica
 Desde la obtención de resultados hasta
que el clínico solicitante tiene el informe.

 “Fase decisiva para cumplir una calidad

total”.
 Validación de resultados

 Valoración técnica: es la aceptación de los

resultados obtenidos por las distintas
técnicas.
 Valoración clínica: los resultados deben ser
coherentes con la clínica.

 Informe de resultados
 Tiempo de respuesta
 Teoría de los valores de referencia

 Variaciones analíticas
 Variaciones extraanalíticas
MÉTODOS DE ANÁLISIS
 Método químico

Se emplean en la determinación de una

molécula o de un elemento
determinado, que se halla inmerso en
una mezcla con otras moléculas o
elementos

Los bioelementos poseen una capacidad para

Requieren de la utilización
emitir y absorber luz de una determinada
de alguna característica
longitud, siendo la longitud de onda de
diferencial
emisión característica de cada elemento.
Métodos físicos
Compuestos bioquímicos, es
que son muy parecidos en
cuanto a propiedades solubilidad
químicas

polaridad

Requieren de un
procedimiento previo punto isoeléctrico

Basados en las propiedades físicas de

Métodos separativos
los compuestos.
Métodos enzimáticos
La mayoría de las veces las técnicas separativas
no permiten determinar la presencia de una
determinada proteína en presencia de otras

Las enzimas son específicas de reacción y sustrato, y los elementos que

intervienen en la reacción pueden determinarse, bien porque presentan
una característica que puede medirse o bien porque pueden determinarse
por medios químicos.
 Métodos inmunológicos

No todas la proteínas poseen

actividad enzimática o una función
que pudiera medirse

Embargo la gran diferencia entre

proteínas radica en su gran y única
configuración tridimensional
Métodos de hibridación

Ácidos nucleicos son difíciles de determinar Las

diferencias en tamaño de las especies de ARN
o de fragmento de ADN no lo permiten

+
Secuencia de nucleótidos.
Método para el
reconocimiento de una
secuencia específica.
Este método emplea sondas que
son específicas y complementarias
a determinada zona de la cadena
de ADN o ARN dependiendo lo que
se quiera determinar. Es
importante recordar que es
necesario un sistema de marcaje
que permita cuantificar la cantidad
de ácido nucleico presente, ya que
la hibridación sólo induce la
especificidad del método.
Métodos Fotométricos
Espectro Electromagnético: cubre un
amplio intervalo de E radiante, desde
los rayos   de longitud de onda corta
hasta las ondas de radio, de longitud de
onda larga.

 Región Ultravioleta:   = 10-380 nm

 Región Visible:   = 380-780 nm
 Región Infrarroja:   = 780-30.000 nm
 Ley de Beer:

 “LaAbsorbancia de una solución es

directamente proporcional ala
concentración y a la longitud del paso de la
luz”.
 Espectrofotómetro

 Fotómetro o Colorímetro: se caracterizan

porque utilizan filtros que solo permiten el
paso de una determinada longitud de onda.

 Espectrofotómetros: utilizan cromadores. Con

ellos se obtiene un haz de luz monocromático
cuya longitud de onda se varía a voluntad.
 Fluorimetría o Fluorimetría

 Luminiscencia
 Fluorescencia

Tiene una alta sensibilidad de 100 a 1000

veces mas sensibles q técnicas colorimétricas
normales.

FLUOROINMUNOANÁLISIS: son anticuerpos marcados

con una sustancia fluorescente, específicos de la
sustancia que se va a estudiar.

DETERMINACIÓN de vitaminas, fármacos, algunas

enzimas, etc.
 Fotometría de llama

La intensidad luminosa es directamente

proporcional al número de átomos que
emiten energía, que a su vez es
directamente proporcional a la concentración
del ión de la muestra.

Se utiliza para la determinación de Sodio,

Litio y Potasio (Na, Li, k) en líquidos
biológicos.
 Espectrofotometría de absorción atómica

Se utiliza para la determinación de Calcio,

Magnesio, Cobre, Zinc, Plomo y otros metales

 Nefelometría y turbidimetría

Cuando un haz de luz choca contra una

partícula en suspensión sufre una serie de
fenómenos:

- dispersión de la luz
- reflexión
- absorción
- transmisión
 LaDISPERSIÓN de la luz depende de
varios factores, que son:

 Tamaño y peso molecular de las partículas

 Longitud de onda de la luz incidente
 Distancia del detector a la cubeta
 Concentración de partículas 
Métodos para medir la []
de una sustancia por
Espectrofotometría
 Punto final o de equilibrio

Se incuba la muestra y el reactivo durante un

tiempo determinado y a una temperatura
determinada para que se complete totalmente
la reacción, de tal forma que la sustancia que
buscamos debe consumirse totalmente. Si no
fuera así y quedase parte de la sustancia sin
consumir, al medir el producto, estaríamos
midiendo menos cantidad de la que realmente
hay. Por lo tanto se mide al final de un tiempo
fijo de incubación.
 Métodos cinéticos

En ellos se mide la velocidad de la reacción

mediante la medida de la variación de la
Absorbancia en el tiempo y esto se relaciona
con la concentración. Es una medición
continua, a diferencia de la del punto final, se
mide en tiempos regulares. Se puede medir la
cantidad de sustrato no transformado ó la
cantidad de producto formado
Lectur
a
Bicromático
Esta técnica está basada en la premisa que aunque un
compuesto puede dar una interferencia espectral, la
absorbancia máxima del interferente será diferente de
la de la reacción analítica verdadera

El uso de este procedimiento permite

también que cada muestra sea
utilizada como su propio blanco para
el color endógeno.
Esta técnica involucra la medición de la absorbancia de una mezcla
de reacción a dos longitudes de onda diferentes simultáneamente.
Estas son:

- la longitud de onda principal (1‫)ג‬

- la longitud de onda cercana 2‫ ג‬.

1‫ ג‬es la longitud de onda a la cual el cromógeno tiene la máxima

absorción. En 2 ‫ ג‬hay un mínimo de absorción del cromógeno. Como
la reacción es monitoreada simultáneamente a dos longitudes de
onda, ésta es conocida como análisis bicromático.
Otro método similar para la corrección de la
interferencia de fondo es la medición de la
absorbancia a la longitud de onda primaria Amax
y a dos longitudes de onda adicional,
generalmente equidistante del pico, A1 y A2. Las
lecturas de absorbancia a estas dos últimas
longitudes de onda son promediadas para dar la
absorbancia de fondo promedio en la muestra.
Esta técnica para la corrección de la absorbancia
de fondo de las sustancias interferentes es
conocida como la corrección de Allen.
Curva de calibración
 Enrelación a los equipos automatizados
y su correcto funcionamiento para
realizar una lectura hay que tener bien
en claro que no se puede procesar un
método si no ha programado
previamente el equipo analizador
Calibración por curva-Calibración por grafica analítica

Se preparan varias soluciones estándares que contienen concentraciones

conocidas del analito, dichas soluciones deben cubrir el intervalo de
concentraciones de interés

Así como tener una composición matricial, tan parecida como se pueda
a la de las soluciones de la muestra

Si se obtiene una grafica no lineal, como ocurre con frecuencia, puede usarse equipo electrónico o
programas computacionales para compensar la curvatura y producir una salida que sea una función
lineal de la concentración, en regiones no lineales el numero de soluciones estándares analizadas
debe aumentarse para obtener la exactitud del análisis de las muestras problema
Calibración por el método de adiciones estándares:

Cuando es imposible
suprimir interferencias
físicas o químicas en la
matriz de la muestra
La respuesta del
instrumento debe ser
función lineal de la
concentración del analito,
en el intervalo de
concentraciones y también
debe tener una ordenada al
origen en cero (señal cero
para concentración   cero).

Una pequeña cantidad de solución del analito de

concentración conocida se añade a una alícuota de una
solución de muestra analizada previamente y el análisis se
repite usando reactivos, parámetros del instrumento y
procedimientos idénticos.
 Calibración por el Método del Estándar Interno

Una cantidad fija de El cociente de

Se emplea un una sustancia pura
estándar interno respuestas ( del
se añade tanto a las
para minimizar las soluciones muestra analito al
diferencias en las como a las estándar
propiedades físicas soluciones interno)
de un conjunto de estándares, se depende
soluciones muestra determinan luego
solamente de la
que contiene el las respuestas del
analito y del concentración
mismo analito
estándar interno del analito

Si se controlan los parámetros que afectan las respuestas medidas, la

respuesta de la línea del estándar interno será constante, por supuesto que la
concentración del estándar interno no es fija, sin embargo, si varia uno o mas
de los parámetros que afectan las respuestas medidas, dichas respuestas del
analito y del estándar interno deben ser afectada por igual.
Gracias