Instructivo Practica 2 - Biología de Organismos Acuáticos

PRACTICA 2: EL MICROSCOPIO, PARTES, FUNCIONAMIENTO, USO Y CUIDADO

I. INTRODUCCION
El conocimiento de la estructura celular está basado en el examen microscópico. El microscopio
(mikros = pequeño y skopium = observar) es un equipo óptico que permite la observación de objetos y
detalles de estructuras tan pequeñas que no podrían ser observadas a simple vista. Con él, nuestro grado
de visibilidad se amplía en cientos o miles de veces, gracias a un conjunto de lentes, dispuestos
convenientemente. Las dificultades en la observación de estructuras celulares e histológicas son su
reducido tamaño y transparencia a la luz visible, las que son superadas con el microscopio, por lo que es
necesario conocer los principios y técnicas de microscopía.

El microscopio fue inventado en 1610 por Galileo, según los italianos o por Jansen, en opinión
de los holandeses. La palabra microscopio fue utilizada por primera vez por la Academia dei Lincei,
una sociedad científica a la que pertenecía Galileo y que publicaron un trabajo sobre la observación
microscópica de la abeja. Jeab Faber (1624), diseña un instrumento formado por un objetivo y un
ocular, el mismo que se hizo extensivo a otros instrumentos simples y compuestos. Los primeros
microscopios simples fueron construidos por Anton von Leeuwenhoek (1654) y Nicolaas Hartsoeker
(1662) que constaban de una lente sostenida con la mano y dirigida hacia una fuente de luz. Las
primeras publicaciones importantes en el campo de la microscopía aparecen en 1660 y 1665, cuando
Malpighi prueba la teoría de Harvey sobre la circulación sanguínea al observar usando el microscopio
los capilares sanguíneos; por su parte Hooke publica su obra Micrographia.

En el siglo XVII el microscopio sufre modificaciones en la parte mecánica y óptica;

construyéndose en 1667 el microscopio de Hooke con una esfera de vidrio condensadora de los rayos
luminosos; el microscopio de trípode de Griendl Von Asch (1687), con columna de Bonnani (1691), el
microscopio de tornillo de Wilson (1702); microscopio con diafragma de campo de Joblot (1716), etc.
Todos estos microscopios a pesar de lograr buenas amplificaciones daban imágenes defectuosas a causa
de las aberraciones cromáticas y esféricas. Pero con el invento del objetivo apocromático de Dolland
constituidos por dos lentes superpuestos, una convergente y otra divergente, se lograron corregir estos
defectos y mejoraron las observaciones.

En el mismo siglo el sistema mecánico del microscopio, mejoró su estabilidad, facilitando su uso,
aunque no se perfeccionó el sistema óptico. Las mejoras más importantes del sistema óptico surgieron
en 1877 cuando Abbe publica su teoría del microscopio y, por encargo de Carl Zeiss, mejora la
microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de
2000X. En 1930 se alcanza el límite teórico para los microscopios ópticos, no consiguiendo aumentos
superiores a 500X o 1000X. Sin embargo, existía un interés científico por observar los detalles de la
estructura celular (núcleo, mitocondria, etc.).

Durante el siglo XIX se descubre que la dispersión y la refracción se podían modificar con
combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos, apareciendo en el mercado objetivos
acromáticos excelentes. En los últimos años, el microscopio compuesto no ha cesado de perfeccionarse
gracias al aporte de técnicos de Alemania, Inglaterra, Japón, Francia y USA, quienes mejoraron y
adicionaron nuevos accesorios al microscopio: visión binocular, ultramicroscopio, revolver, porta
objetivo, microscopio polarizante, etc.; hasta lograr el microscopio electrónico y la criomicroscopía
electrónica.

El microscopio electrónico de transmisión (TEM) fue el primer tipo de microscopio electrónico

desarrollado en 1931 por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania; el que utiliza un haz de electrones en
lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100 000X. Manfred von Ardenne
inventa el microscopio electrónico de barrido (MEB) en 1937 con el que un haz de electrones barría la
superficie de la muestra observada y reemitía algunas partículas para ser analizadas por los diferentes
sensores, reconstruyendo una imagen tridimensional de la superficie. En 2017, Dubochet Frank y

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Henderson, ganan el Premio Nobel de Química al crear la criomicroscopía electrónica, una forma de
microscopía electrónica en la que la muestra se estudia temperaturas criogénicas.
II. COMPETENCIAS
a) Identifica los sistemas y sus componentes de un microscopio compuesto de luz visible;
b) Opera correctamente los componentes del microscopio compuesto de luz visible;
c) Conoce y ejecuta las recomendaciones para el buen uso y conservación del microscopio
compuesto de luz visible
III. MATERIAL A UTILIZAR
Microscopio compuesto de luz visible
Instructivo
IV. METODOLOGIA
Para el desarrollo de la presente práctica cada estudiante tendrá a disposición un microscopio
compuesto, de tal forma que podrán observar, reconocer y usar cada una de sus sistemas y componentes;
denominarlos y manipularlos tomando en cuenta las recomendaciones para su operación, mantenimiento
y almacenaje. Al finalizar los estudiantes utilizando imágenes de un microscopio compuesto
consignarán sus sistemas y componentes de cada sistema.
4.1 Competencia: Identifica los sistemas y componentes del microscopio compuesto
El microscopio compuesto es un equipo óptico, pues cuenta con dos juegos de lentes que
corresponden al ocular y el objetivo que incrementan las imágenes de objetos que a simple vista no se
ven. También cuenta con una serie de accesorios que sostienen y protegen las lentes, desplazan la
muestra para un buen enfoque y proporcionan una adecuada fuente de luz. En consecuencia, el
microscopio compuesto está conformado por tres sistemas: mecánico, óptico y de iluminación.
4.1.1 Sistema mecánico
Constituido por accesorios que sostienen la parte óptica y de iluminación, además
permite el desplazamiento de la muestra para su enfoque correcto. Comprende:
• Base: Es una plataforma sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general
forma rectangular.
• Tubo ocular: De forma cilíndrica y ennegrecida internamente para evitar los reflejos de
la luz. En su extremo superior se colocan los oculares;
• Revólver: Pieza giratoria ubicada en el extremo inferior del tubo óptico, provista de
orificios donde se enroscan los objetivos. Al girar el revólver, los objetivos pasan por el
eje óptico, colocándose en posición de trabajo, luego de un sonido de fijación
característico;
• Columna: Pieza perpendicular o curva de ubicación posterior que sostiene el tubo en su
extremo superior y se adapta al pie en el extremo inferior.
• Platina: Pieza metálica plana rectangular o cuadrangular en la que se coloca el preparado
a observar. Presenta un orificio en el eje óptico que permite el paso de los rayos
luminosos hacia el preparado. La platina tiene movimiento de derecha a izquierda y de
adelante hacia atrás, dispone de tornillos laterales para realizar tales movimientos.
• Carro móvil: Dispositivo metálico con doble escala de medición y colocado sobre la
platina para sujetar la lámina portaobjeto con el preparado.
• Tornillo macrométrico: Permite que el tubo del microscopio ascienda o descienda en
sentido vertical con movimientos amplios para un enfoque rápido del preparado.
• Tornillo micrométrico: Permite movimientos imperceptibles del tubo o la platina para
lograr el enfoque exacto y nítido del preparado. Lleva acoplado un tambor graduado en
divisiones de 0,001 mm para precisar sus movimientos.

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4.1.2 Sistema Óptico
Encargado de producir una imagen doblemente ampliada e inversa de la muestra
mediante los dos sistemas de lentes (ocular y objetivo) ubicados en los extremos del tubo óptico. El
objetivo proyecta una primera imagen de la muestra que el ocular luego amplía; esta producción de la
imagen en dos fases es la que justifica la denominación de microscopio compuesto.
Los Oculares cuentan con dos lentes dispuestos dentro de un tubo corto. Se usan
oculares de: 8X, 10X, 12.5X, 15X aumentos. Los objetivos producen aumento de la imagen que se
observa; por lo tanto, se hallan cerca de la muestra o preparado. Los objetivos pueden ser acromáticos
(transmite la luz blanca sin descomponerla en los colores del arco iris), de fluorita (semi apocromático)
y apocromáticos (corrigen mejor la aberración cromática y esférica); están ubicados en una pieza
giratoria denominada revólver y generalmente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de
inmersión.
Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos
y la muestra. Externamente llevan una serie de anotaciones que indican el aumento que producen, la
abertura numérica y otros datos. Por ejemplo, si observamos en un objetivo: plan 40/0,65 y 160/0,17,
significa que es plan acromático, 40 aumentos, abertura numérica 0,65, calculada para una longitud de
tubo de 160 mm y grosor del cubreobjetos de 0.17. El número de objetivos varía con el tipo de
microscopio y su uso. Los aumentos de los objetivos secos más utilizados son: 6X, 10X, 20X, 45X y
60X. Los objetivos de inmersión disponen de un complicado sistema de lentes y requieren para su uso
de una gota de aceite de cedro entre el objetivo y el preparado, de manera que la lente frontal entre en
contacto con dicha sustancia. Generalmente son de 100X y se distingue por uno o dos anillos de color
negro en su extremo inferior.

Figura 1: Componentes del sistema mecánico de un microscopio óptico compuesto

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A B

C D

F G

E
Figura 2: Componentes del sistema mecánico y óptico de un microscopio compuesto: A) revólver, objetivo,
platina, carro móvil; B) tornillo macrométrico y tornillo micrométrico; C) oculares; D) anotaciones en oculares; E)
anotaciones en objetivos; F) objetivo seco; G) objetivo de inmersión

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4.1.3 Sistema de Iluminación
Este sistema tiene como finalidad generar y dirigir la luz de una lámpara eléctrica
de tal manera que ilumine el preparado u objeto que se va a observar en el microscopio compuesto.
Comprende los siguientes accesorios:
• Lámpara: El microscopio compuesto es eléctrico y cuenta con una lámpara luminosa
en el eje óptico. Suele ser una lámpara halógena de intensidad graduable ubicada por
encima del pie o base y es accionada por un interruptor
• Condensador: Está formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los
rayos luminosos sobre el plano del preparado. El condensador se halla debajo de la
platina y se desplaza verticalmente sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo.
• Diafragma: conocido como el iris, es un disco giratorio que regula su abertura y
controla la calidad de luz que llega al objetivo. Dispone de una palanca que se desplaza
de un lado al otro para abrirlo cerrarlo

Lámpara

interruptor

Figura 3: Componentes del sistema de iluminación de un microscopio óptico compuesto

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4.2 Recomendaciones para la conservación del microscopio compuesto
El microscopio compuesto es un equipo óptico delicado y costoso por lo que se debe
manipular con mucho cuidado, pues su uso dependerá de su buen estado, limpieza de sus lentes y buen
ajuste de sus componentes. Por tales motivos se deben tener presente las siguientes recomendaciones:
a) Al transportar el microscopio compuesto debe emplearse siempre con ambas manos,
sujetando con una de ellas la base y con la otra la columna o asa, manteniéndolo siempre en
posición vertical para evitar la caída de oculares.
b) No colocar el microscopio compuesto en el borde de la mesa a fin de prevenir accidentes
que ocasionen su caída.
c) Antes de conectar el microscopio compuesto al tomacorriente, verificar el voltaje.
d) No derramar sustancias liquidas o sólidas en la platina. Si esto ocurriera, limpiar con papel
toalla o tela suave, procurando no tocar la lente del condensador.
e) Cuando se realizan preparados para observar con el microscopio compuesto, cubrir la
muestra con una laminilla cubreobjetos, para evitar que el agua u otro líquido del preparado
se derrame sobre la platina.
f) Al finalizar la práctica de debe guardar el microscopio completamente limpio y seco,
especialmente cuando ha caído líquido sobre la platina.
g) Evitar tocar con las manos las lentes oculares y objetivos, pero si esto ocurriera, limpiar
con un líquido limpia lentes y papel especial. Por ningún motivo se utilizará papel
higiénico o papel filtro, pues rayan las lentes.
h) No utilizar líquidos fuertes o solventes (alcohol, bencina o xilol) para limpiar las lentes,
pues estas sustancias disuelven la película anti reflexión de color azulado o verdoso que
tiene toda lente en buen estado. Usar soluciones indicadas por el fabricante, alcohol
isopropílico o una solución de ¼ shampoo + ¾ agua destilada.
i) El objetivo de 100X es una lente de inmersión que para enfocar requiere el uso de una o
dos gotas de aceite cedro colocadas entre la lente y el preparado. Luego que se ha utilizado
este lente, el aceite será limpiado tal como se indicó en el numeral anterior.
j) No desarmar las lentes o los cabezales para limpiar los prismas o lentes internos. Este
trabajo lo debe realizar un técnico especializado.
k) Al finalizar el trabajo con el microscopio compuesto, verificar que el objetivo de menor
aumento (4X) esté seleccionado, esto evita que las lentes de los objetivos de mayor
aumento rocen con la platina y se rayen.
l) Después de usar el microscopio compuesto y antes de guardarlo cubrirlo con una funda
para protegerlo de la humedad y del polvo.

4.3 Recomendaciones para el uso del microscopio compuesto

a) Seleccionar el objetivo de menor aumento y colocarlo en el eje óptico y bajar la platina
completamente.
a) Colocar el preparado sobre la platina sujetándola con los brazos metálicos del carro móvil.
b) Iniciar la observación con el objetivo de 4X y luego cambiar al objetivo de 10X.
c) Para realizar un buen enfoque acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación,
empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través
del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación y dañarlo.
d) Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la
preparación con el macrométrico y, cuando observe algo nítido la muestra, girar el
micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
e) Girar el revolver para ubicar el siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada
y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si se
pierde la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la
operación desde el paso b).
f) El objetivo de 40X enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que
ocurran los siguientes percances: introducirlo en el preparado si no se toman en cuenta las
precauciones anteriores, mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparado
que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

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g) Para emplear el objetivo de inmersión seguir el siguiente procedimiento:
• Bajar totalmente la platina.
• Subir el condensador para ver el círculo de luz que nos indica la zona que se va a
visualizar y donde habrá que echar el aceite.
• Girar el revólver colocándolo entre el objetivo de inmersión y el de 40X.
• Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
• Terminar de girar el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
• Mirando al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente tenga contacto con la
gota de aceite.
• Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo
de inmersión y la preparación es mínima, por lo que el riesgo de accidente es alto.
• No usar el objetivo 40X sobre esa zona, pues se mancharía de aceite.
• Finalizada la observación se baja la platina, se coloca el objetivo de menor aumento, se
retira la preparación de la platina.
• Limpiar el objetivo de inmersión empleando líquido y papel especiales recomendados
por el fabricante.

Figura 4: Observación de un preparado con microscopio óptico compuesto

4.4 Reconoce algunos tipos de microscopio

a) Utilizando los equipos ópticos disponibles en el laboratorio o los mostrados en
diapositivas, reconocer algunos tipos de microscopio
b) Caracterizar cada uno de los tipos de microscopio mostrados

• Microscopio simple
Dispone de una lente de aumento. El ejemplo más clásico de microscopio simple es la
lupa. Es una lente positiva y el objeto por observar se coloca entre el foco y la superficie de la
lente, lo que determina la formación de una imagen real, derecha y tanto mayor.
• Microscopio compuesto
Tiene una sola lente de cristal de distancia focal corta para el objetivo y otra lente de
cristal para el ocular. También existen más complejos pues cuentan con varias lentes en el objetivo
y ocular. Estas lentes reducen las aberraciones cromática y esférica. En microscopios modernos el
espejo se sustituye por una lámpara de luz estable y controlable que atraviesa la muestra desde
abajo y usualmente son necesarias técnicas especiales para aumentar el contraste de la imagen.

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Microscopio simple (lupa)

Microscopio compuesto
binocular con lámpara
Microscopio compuesto
unilocular con espejo

• Microscopio estereoscópico
El diseño y utilidad son diferentes, pues ofrece una imagen estereoscópica (3D) de la
muestra. Para ello, y como ocurre en la visión binocular convencional, es necesario que los dos
ojos observen la imagen con ángulos ligeramente distintos. El microscopio estereoscópico es
apropiado para observar objetos de tamaños relativamente grandes o para manipular objetos
visualizados, por lo que no es necesario modificar los objetos a ver ni que la luz pase a través de
la muestra.

Microscopio Estereoscopio

• Microscopio electrónico
El microscopio electrónico supera en resolución al microscopio compuesto pues utiliza
un flujo de electrones en lugar de luz. Consta fundamentalmente de un tubo de rayos catódicos, en
el cual debe mantenerse el vacío. El cátodo está constituido por un filamento de tungsteno, que al
calentarse eléctricamente emite los electrones, los cuales son atraídos hacia el ánodo por una
diferencia de potencial de 50.000 a 100.000 voltios. La lente del condensador enfoca este haz y lo
dirige hacia el objeto que se observa, cuya preparación exige técnicas especiales. Los electrones
chocan contra la preparación, sobre la cual se desvían de manera desigual.

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Los microscopios electrónicos tienen un aumento de hasta 2 000 000X debido a que la
longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones. Existen tres tipos de
microscopios electrónicos: de transmisión, de barrido y mixto. El primero utiliza un haz de
electrones acelerados por un alto voltaje que ilumina una sección muy pequeña de la muestra. El
segundo se utiliza para el estudio de la morfología y topografía de los elementos; se compone de
lentes magnéticas que usan un haz de electrones que penetran varias veces a la muestra y
producen una imagen ampliada de la superficie que se observa.

Microscopio eletrônico de barrido

V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
ARRAIZA, N., P. VIGURIA, J. NAVARRO y A. AINCIBURO. 2000.- Manual de Microscopía: Historia,
descripción y uso del microscopio óptico. AUXILAB, S.L. Navarra, España. 56 pp.
BELTRAN. R .- 2006. Manual de Prácticas de Biología General y Celular. Univ. Nac.
Trujillo. D.A. Ciencias Biológicas.80 pp. Trujillo
KARP, G.- 2001. Biología Celular y Molecular. Conceptos y experimentos. Editorial Mc
Graw-Hill Interamericana. México. 800 pp
MARTINEZ, A. 2008.- Microscopia láser confocal. Servicio de proceso de imágenes. Univ. Oviedo,
España. 20 pp
VILLAVICENCIO. E.- 2000. Manual de Prácticas de Biología. Univ. Nac. Trujillo. D.A.
Ciencias Biológicas.117 pp. Trujillo

Tumbes, 10 de setiembre del 2023