Laboratorio en Inmunologia

ELISA
HISTORIA
• 1959 Yalowy Berson, precursor de los ensayos inmunoenzimáticos que fueron
descritos originalmente en 1971 por Engvall y Perlmann, y Van Wemeny y Schuurs.
• El uso de material radiactivo ha limitado el uso del radioinmunoensayo, y a la vez a
popularizado el empleo del inmunoensayo enzimático (EIA), del que hay dos
técnicas principales:
• El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

• El ensayo inmunológico multiplicado por enzimas.

 ELISA
Fácilmente será revelada mediante la
Uso de Ag o Ac marcados con una
adicion de un sustrato especifico que al
ENZIMA, de forma que los
actuar la enzima producirá un color
resultantes tengan actividad tanto
observable a simple vista o cuantificable
inmunológica como enzimatica
(espectrofotómetro o colimetro)

Al estar uno de los componentes (Ag o Ac)

marcado con una enzima e insolubilizado
sobre un soporte (inmunoadsorbente) la rx
Ag-Ac quedara inmovilizada
 ELISA
• Los métodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimática se dividen
en dos tipos:
Ag
Ac marcados
marcados
ELISA directo ELISA competitivo

ELISA indirecto
ELISA sándwich
- Doble (DAS)
- Heterologo (HADAS)
Fundamento
• La prueba de ELISA se basa en la reacción antígeno-anticuerpo, uno de los
cuales debe ser de reactividad conocida.
• El color se genera por la interacción de un sustrato cromogénico y una
enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector.
• Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antígeno en la fase sólida,
como una capa de captura.
• Después de la reacción del antígeno con el suero del paciente, la capa de
detección puede ser un reactivo antiinmunoglobulina clase específica
(IgM o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase específicos
• FASE SÓLIDA
• Antígeno o Anticuerpo
• Conjugado: ENZIMA
• SUBSTRATO
SE PUEDEN UTILIZAR DOS TIPOS DE SUSTANCIAS
• Las que favorecen la adsorción física (por fuerzas electroestáticas) de las
moléculas de Ags o Acs: poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, nylon y
silicona.
• Las que permiten la fijación covalente de esos reactivos: acrilamida, celulosa y
isoticianato
• Los mejores resultados se obtienen con el peliestireno y el polvinilo, por su
rigidez, transparencia y propiedades adsortivas.
La enzima escogida como marcador debe:
• Unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos,
• Encontrarse en estado puro a un precio razonable y
• Tener un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y
de fácil preparación.

Las enzimas
más utilizadas
son fosfatas
alcalina,
peroxidasa de
rábano y ß-
galactosidas
La elección del substrato es de gran importancia para la estandarización del
método ELISA y hay que tener varios factores en cuenta, como son
sensibilidad, especificidad, facilidad de lectura, así como estabilidad
después de la reacción.

Requerimientos del sustrato

• Solubles en agua
• Fácil de manipular
• No tóxicos, no mutagénicos
• Bajo costo
 Los métodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimática se dividen
en dos tipos:
Competitivos
• No competitivos

• ELISA COMPETITIVO:

En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el

conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá
ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará
a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente
en la muestra.
• ELISA NO COMPETITIVO:

Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la

fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-
anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato
desarrollando color

Dentro de los no competitivos tenemos:

• Los directos que detectan antígenos

• Los indirectos que detectan anticuerpos
• Si la prueba se diseña para detectar un
antígeno, es un ELISA DIRECTO porque
esta buscando directamente, como su
nombre lo dice, la sustancia extraña.
• En cambio, un ELISA INDIRECTO, por su
parte, se diseña para detectar los
anticuerpos que el paciente ha creado
contra el antígeno
 El sistema de detección emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el antígeno y
uno secundario marcado contra el primario.
La detección tiene mayor sensibilidad por
presentar una amplificación de señal debida a
la unión de dos o más anticuerpos secundarios
por cada primario.
 Materiales Orgánicos
• Las Muestras del Paciente (Saliva, orina, heces, sangre, etc.)

• Antígenos

• Anticuerpos

• Enzimas

Materiales No Orgánicos
• Microplacas de 96 pocillos de plástico con fondos de pocillo ópticamente
claros, pipeta multicanal, pipeta de 100µ.
• Espectrofotómetros de lectura de placas (lectores ELISA).
Pasos generales…
El primero es el
ELISA directo,
1. Tapizado del pocillo con el Ag o Ac. seguido del indirecto

2. Adición de la muestra problema con

la mezcla de Ags o Acs.
3. Unión del Ag o Ac específico al Ag o
Ac tapizado en el pocillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el
exceso de Ag o Ac no unido.
5. Adición del Ac secundario marcado
con la enzima.
6. Unión del Ac secundario al Ag o Ac.
7. Lavado del pocillo para eliminar el
exceso de enzima no unida.
8. Adición del sustrato.
9. Unión del sustrato a la enzima.
10. Coloración.
 ELISA directo
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Acs específicos.

2. Lavado con solución salinaTween 20 como agente tensioactivo (ph-

7,2) para eliminar los Acs fijados deficientemente o no fijados.
3. Adición de Ags marcados (“conjugados”) con una enzima; si los Acs
reaccionan con los Ags, el complejo quedará solubilizado.

4. Lavado para eliminar los Ags marcados que no hayan reaccionado.

 ELISA directo
5. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de
actuar la enzima marcadora.

6. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

Los lectores ELISA
se llaman
espectrofómetros!!
• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los
anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos
fijados deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos
reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte.
Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales
reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y
que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado
 Prueba ELISA Indirecta

Leyenda
Anticuerpo
Antígeno
Ligado a Enzima
Anticuerpo
Sustrato
Primario
 LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

Una de las grandes ventajas de la técnica

ELISA es la posible automatización de la
lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha
automatización se puede conseguir con un
simple colorímetro o espectrofotómetro de
cubeta o con sofisticados equipos de lectura
automática de microplacas.

Los resultados finales de la lectura

colorimétrica se reflejan numéricamente
mediante valores de absorbancia o densidad
óptica que se obtendrán a la longitud de onda
más adecuada para la coloración final
alcanzada.
 APLICACIONES CLÍNICAS:
Enfermedades producidas por parásitos
 Toxoplasmosis, Triquinosis, Tripanosomas…

Enfermedades producidas por Micoplasmas

Enfermedades producidas por bacterias
 Mycobacterium tuberculosis, brucelas, Estreptococos, Salmonelas…

Enfermedades producidas por virus

 Enfermedad de Newcastle, Peste porcina, Rotavirus, artritis vírica, Leucemia
felina…

Otras aplicaciones
Hormonas (GCH, Progesterona, Testosterona..)
Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA)
Inmunopatología (Ac anti-DNA, Factor reumatoide, Inmunocomplejos
circulantes)
Western blotting,
inmunoblotting o SDS-PAGE
Tecnica para detectar proteinas especificas separadas por electroforesis
utilizando anticuerpos marcados.
DEFINICION

• Es una técnica analítica usada para

detectarproteínasespecíficas en una
muestra determinada (una mezcla
compleja de proteínas, como un extracto
tisular).
FUNDAMENTO
• El western blotes una técnica que se utiliza para identificar y localizar
proteínas basada en la capacidad de unión a anticuerpos específicos.
• Luego de separar las proteínas en un gel de SDS-poliacrilamida(SDS-
PAGE), las bandas de proteínas se transfieren a una membrana de
nitrocelulosa (electro transferencia),
• las bandas individuales de proteína (proteína de interés) se identifican al
inundar la membrana de nitrocelulosa con anticuerpo policlonal o
monoclonal radio marcado o unido a enzimas específicas para la proteína
de interés.
 PREPARACION DE LA MUESTRA

• Las muestras pueden ser tomadas de un tejidoentero o de un cultivo

celular: Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un buffer de
extracción.
• Después se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para
grandes volúmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras
pequeñas) o porsonicación.
• Por último se centrifuga para obtener las proteínas en el sobrenadante, la
fracción no precipitada.
• Las células pueden lisarse por uno de esos métodos mecánicos.
• También pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la
lisis y solubilicen las proteínas.
• A veces se añaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la
digestión por las enzimas celulares de las proteínas y de las fosfoproteínas,
respectivamente.
 Secuencia del Western blot
Electroforesis de la muestra con las proteinas

Transferir las proteinas desde el gel a membrana de nitrocelulosa

Coloracion de las proteinas para confirmar transferencia

Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en la membrana de nitrocelulosa

Incubacion con el anticuerpo especifico primario

Lavados del anticuerpo no unido

Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados a perroxidasa de rabano picante (HRP)

Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccion con placas radiograficas

Secuencia del Western blot – Paso 1
Paso 1
Electroforesis de las muestras de
proteínas:

-Las proteínas se desnaturalizan con calor, SDS y

sustancias como beta mercaptoetanol o ditiotreitol que
rompen puentes -S-S-
-El SDS aporta cargas negativas
-Las proteínas corren hacia el ánodo (+) y se distribuyen en
el gel de acuerdo a su peso molecular Fuente de poder

Muestra de proteínas
Proteínas ya
para cargar en el gel corriendo en el gel
 Secuencia del Western blot – Paso 2
Paso 2 - Transferencia a la membrana de nitrocelulosa:
-Las proteínas separadas por tamaño se transfieren desde el gel a una membrana de
nitrocelulosa
-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las proteínas

Se detiene la corrida electroforetica

El gel con las proteínas se coloca
Se desarma con cuidado la cuba
electroforetica para liberar en el cassette de transferencia
el gel con las proteinas separadas
por masa

Se quitan las burbujas para asegurar

Cassette listo para iniciar
la correcta transferencia Armado del cassette de
transferencia
transferencia
Paso 3
Incubación con anticuerpos específicos y revelado:

Bloqueo de los sitios no ocupados en la

membrana con proteína inerte (ej.
Albúmina) Paso 4
Revelado y análisis:
Fundamento de la tecnica de revelado
quimioluminiscente

-El anticuerpo secundario esta

marcado con HRP (peroxidasa)
que en presencia de agua
oxigenada degrada el luminol
con emisión de luz

-La emisión de luz (fotones)

se revela en oscuridad
sobre una placa radiográfica
sensible a la luz

-Las bandas se obtienen en el film

en la misma posición donde
se encontraba la proteína

-Alta sensibilidad
 Existen otras tecnicas de revelado de
WB
sustrato enzima H2O2 producto quimioLum Obs
coloreado
luminol HRP si no si muy sensible

3,3´diaminobencidina HRP si marrón no toxico

DAB+niquel HRP si negro no toxico, mas

sensible que
DAB
3,3´,5, 5´ HRP si azul no producto
tetrametilbencidina semisoluble
4 cloro naftol HRP si azul-negro no poco
sensible
Bromocloroindolil FAL no azul no reaccion
fostato +NBT lenta y
progresiva
Naftol-AS-MX fosfato FAL no rojo no poco
+ Fast red sensible
AP/misty purple FAL no purpura no muy estable
HRP = peroxidasa / FAL = fosfatasa alcalina
Utilizacion de WB en la clinica:
Confirmacion de diagnostico de HIV
env gp160
gp120 -Se corren proteínas de HIV
gp 41
-Se transfieren a nitrocelulosa

gag p55 -Se incuba la membrana con suero

del paciente
p18
p24 -Se revela con anticuerpos secundarios

pol p65
p51
p31
Utilizacion de WB en la clinica:
Confirmacion de diagnostico de HIV
Criterio de la OMS:
env gp160
-Negativo: Ninguna banda presente
gp120 -Positivo: Dos bandas ENV presentes
gp 41 -Indeterminado: Cualquier banda que no alcance criterio
de positividad

gag p55
p18
p24

pol p65
p51
p31
Utilizacion de WB en la clinica:
Confirmacion de diagnostico de HIV
Seroconversion de un paciente

gp160/120

p66
p55/51
gp41

p32

p24

p17
APLICACIONES
• Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el
Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un
resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una población donde
la prevalencia del virus es muy baja. Mediante el Western blot se buscan los
anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se transfieren a una
membrana las proteínas de células que, se sabe, están infectadas por el VIH.
Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este
paso es equivalente a la incubación con el anticuerpo primario; si hay
anticuerpos anti-VIH en el suero, serán estos los que realicen el papel de
anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la
membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario anti-humano
unido a una enzima-señal. La aparición de bandas indica la presencia de
proteínas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir,
el paciente es seropositivo.
• Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina,
comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".
• Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.
PCR
DEFINICION

• Técnica que nos permite amplificar

selectivamente un segmento específico
de DNA, hasta obtener una cantidad
suficiente para su posterior
manipulación
FUNDAMENTO

• Esta técnica se fundamenta en la

propiedad natural de los ADN
polimerasas para replicar hebras de ADN,
para lo cual se emplean ciclos de altas y
bajas temperaturas alternadas para
separarlas hebras de ADN recién
formadas entre sí tras cada fase de
replicación.
FIN