Estudio in vitro de viabilidad por inmunohistoquímica,

ensayo de Azul de tripano y ensayo MTT para

nanopartículas de plata.

Camila Benítez Cruz

Jean Paul Fabra Ruiz
Manuela Gaviria Sarabia
María Camila Oviedo Narváez
 Introducción

Avances tecnológicos (Nanotecnología) Efecto de nanopartículas en el cuerpo.

Nanopartículas de plata

Buenas propiedades:

¿Qué pasa al Biomédica Físicas

interactuar con Gran interés
un modelo Medicina Químicas
biológico?
Alimentos Biológicas
 ENSAYOS

Inmunohistoquímica Azul de tripano MTT

Detectar, amplificar y visualizar Colorante azoico utilizado en Ensayo utilizado para

antígeno especifico para tinciones histológicas para posible efecto citotóxico
identificar localización exacta ensayo de viabilidad celular, de algún agente sobre
de una sustancia tisular o que permite diferenciar células líneas celulares.
citológica. vivas y muertas

Inmunohistoquímica
Sembrado fibroblastos de ratón NIH
3T3 y cardiomiocitos RL14
Fijación química
Permeabilización en frío
Bloqueo
Inmunofluorescencia directa
Microscopio invertido de
fluorescencia
METODOLOGÍA
Azul de tripano
Sembrado fibroblastos de ratón
NIH 3T3
Retirar cultivo y adicionar tripsina
EDTA.
Resuspender e inactivar con medio
completo.
Centrifugar, retirar sobrenadante
Adicionar Azul de tripano
Depositar cámara de Neubauer
MTT
Sembrado fibroblastos de ratón
NIH 3T3
Síntesis de nanoparticulas de plata
Realizar 10 tratamientos con 3
replicas, adicción de nanoparticulas.
Adición de MTT
Adicionar isopropanol ácido frio
Lector Elisa
 Resultados
1. Inmunohistoquímica
450
412
400 376

350
303
300

Frecuencia
250

200
161
150
119
100

50 34 25
3 4 3 0
0
2.77 4.64 6.51 8.38 10.25 12.12 13.99 15.86 17.73 19.60 21.47
Marca de clase

Figura 1. Ensayo inmunohistoquímico de fibroblastos NIH 3T3 Figura 2. Histograma de la distribución de tamaños de
marcados con Hoechst. Micrografías por microscopio óptico de núcleos de fibroblastos NIH 3T3 marcados por Hoechst a un
fluorescencia invertido a una magnificación de 10x aumento de 10x
 25

21
20

Frecuencia
15

11
10

5 4
2
1
0 0
0
14.45 27.86 41.27 54.68 68.09 81.50 94.91
Marca de clase

Figura 3. Ensayo inmunohistoquímico de cardiomiocitos RL14 Figura 4. Histograma de la distribución de tamaños de

marcados con Vimentina. Micrografías por microscopio filamentos intermedios de cardiomiocitos RL14 marcados
óptico de fluorescencia a una magnificación de 10x. por Vimentina a un aumento de 10x.

Figura 5. Sobreposición de núcleos y filamentos

intermedios.
2. Azul de tripano

𝑁° 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑣𝑎𝑠
% 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 = ∙ 100
(𝑁° 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑣𝑎𝑠 + 𝑁° 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑢𝑒𝑟𝑡𝑎𝑠)

𝑁° 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑣𝑎𝑠
𝑁°𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿 = ∙ 105
4
2. Azul de tripano

CÉLULAS POR POZO 50.000 80.000 100.000

% Viabilidad
88.89 95.01 97.09
N° Células/ml
625.000 1.125.000 837.500
Figura 6. Viabilidad y número de células por ml para 50.000,
80.000 y 100.000 células sembradas.

Figura 7. Celdas de Neubauer.

Figura 8. Cámara de Neubauer.

3. Ensayo MTT
Concentración (ml/ml) Absorbancia % Viabilidad % Citotoxicidad
Control células 0.356 100 0
Control solvente 0.251 70.53 29.47
0.10 0.238 66.79 33.21
0.20 0.279 78.30 21.70
0.30 0.145 40.60 59.40
0.40 0.485 136.11 -36.11
0.50 0.233 65.48 34.52
0.60 0.264 74.18 25.82
0.70 0.273 76.61 23.39
0.80 0.274 76.89 23.11
0.90 0.275 77.27 22.73
1.00 0.287 80.45 19.55
Figura 9. Resultados obtenidos para evaluar la citotoxicidad de
nanopartículas de plata en fibroblastos 3T3, a partir del ensayo de MTT.
 3. Ensayo MTT
% Viabilidad vs tratamiento o control % Citotoxicidad vs tratamiento o control
160 80.00

140 60.00
120
40.00
% de viabilidad

% Citotoxicidad
100
20.00
80

60 0.00
Control Control D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9
40 -20.00 células solvente

20
-40.00
0
Control Control D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 -60.00
células solvente Tratamiento o control
Tratamiento o control
Figura 10. %Viabilidad vs tratamiento o control. Absorbancia vs Concentración Figura 11. % Citotoxicidad vs tratamiento o control.
0,001

0,001
Absorbancia a 570 nm

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
Concentración (ml/ml)

Figura 12. Absorbancia vs concentración

Conclusiones
• El tamaño de las nanopartículas de plata sintetizadas, es fundamental a la hora de determinar de qué
manera se da la interacción de estas con el modelo biológico, ya que de su tamaño depende que se
atraviese la membrana porosa y se presente influencia de estas en el medio intracelular.
• Los ensayos realizados para determinar la viabilidad en cultivos celulares sembrados previamente,
por los métodos de exclusión de azul de tripano y MTT permiten determinar de qué manera afecta la
interacción de un material con un modelo biológico y de este modo establecer si este presenta
toxicidad en el medio.
• Es necesario realizar un tratamiento estadístico de los datos con el fin de reducir las posibles
desviaciones que se presenten por causa del sesgo de investigación, como errores al realizar los
procedimientos de desprendimiento y descarte, al manipular y agregar los reactivos o al momento de
contabilizar las células.
• Los ensayos inmunohistoquímicos permiten visualizar diferentes componentes celulares, de acuerdo al
anticuerpo implementado; de los realizados puede decirse que las variaciones que surgen en los
núcleos y filamentos se encuentran asociadas a las distintas fases en las que se encuentre la célula.
 Referencias.
Ilustración vectorial de inmunoglobulina molécula de anticuerpo en interacción con antígeno. Tomado de:
https://www.google.com.co/url?sa=i&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=2ahUKEwiGjv6u8tXeAhUSjVkKHYXbB3EQjRx6B
AgBEAQ&url=https%3A%2F%2Fes.123rf.com%2Fphoto_24529676_ilustraci%25C3%25B3n-vectorial-de-inmunoglobulina-
mol%25C3%25A9cula-de-anticuerpo-con-el-ant%25C3%25ADgeno-
unido.html&psig=AOvVaw1rSHoLv6GaMylcjORjT3bb&ust=1542351442144302
Esquimed. Cultivo celular. Tomado de: http://www.equimed.com.co/img/fotos/banner-cult-linea-celular.jpg
CLAVIJO, M., GÓMEZ CAMARGO, D. and GÓMEZ ALEGRÍA, C. (2018). IN VITRO ADIPOGENESIS OF 3T3-L1 CELLS. [online]
Scielo.org.co. (.2007)
Google Books. (2018). Revista Medicina. [online] Available at:
https://books.google.com.co/books?id=2w5KIyoRYyEC&pg=PA68&lpg=PA68&dq=fibroblastos+3t3+inmortalizados&source=bl&o
ts=yqNQ6Wrjv_&sig=KlOR69lWheVUVMMjHY7nh3rDU5E&hl=es-
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ortalizados&f=false [Accessed 9 Nov. 2018].
Martínez, A., Reyes, I. and Reyes, N. (2018). Cytotoxicity of the herbicide glyphosate in human peripheral blood mononuclear cells.
(2007).
¡Gracias!