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261-2014-10-13-Cuaderno Genética Molecular Humana
261-2014-10-13-Cuaderno Genética Molecular Humana
FACULTAD DE MEDICINA
CUADERNO DE PRÁCTICAS
Grado en Medicina
1.
Práctica #1:
2.
Práctica #2:
La Técnica de la PCR
AISLAMIENTO DE DNA PLASMIDICO
INTRODUCCIÓN
MÉTODO
Esta preparación la llevara a cabo el Profesor como una demostración a los alumnos. El
gel una vez enfriado se utilizara en esta misma práctica para cargar el DNA plasmídico.
2) Se calienta hasta ebullición el tiempo necesario para que se forme una solución
transparente, y se deja enfriar durante unos minutos.
4) Se deja transcurrir un tiempo hasta que la solución se hace un gel por enfriamiento,
Se retirará el peine del gel creando así unos pocillos donde se cargarán las muestras en
una solución de carga más densa que el TBE y que además contiene un colorante, azul
de bromofenol, que nos marcará el frente de la carrera.
Obtención de DNA plasmídico.
5) Recoger la fase acuosa (superior, unos 200 µl), que es la que contiene los ácidos
nucleicos, y transferirla a un tubo eppendorf limpio.
6) Añadir 1 mL de etanol absoluto frío y mezclar agitando. Los ácidos nucleicos son
insolubles en etanol y esto permite su precipitación.
2) Cargar esta muestra en el gel de agarosa y hacerla migrar a 100 voltios durante 30
minutos.
(Durante este tiempo se llevara a cabo el cálculo de la concentración y pureza de una
muestra de DNA según se indica en este guión).
En nuestro caso, dado que es un DNA circular obtendremos una imagen en la que se
observarán más de una banda. Ello se debe a que el DNA circular puede estar relajado o
superenrollado. El superenrollado migra con mayor rapidez que el relajado y el relajado
a su vez dado que es un DNA circular migra un poco más lento que un DNA de igual
tamaño pero lineal. La razón de todo ello es fácil de comprender si se tiene en cuenta
que, por ejemplo, la molécula de DNA superenrollado es más compacta que la misma
molécula relajada y por tanto puede penetrar más fácilmente a través de la trama de la
agarosa. Aparte de las formas mencionadas también se observan con cierta frecuencia
formas enlazadas o diméricas del plásmido. Estas serán las bandas correspondientes al
plásmido y además aparecerá una banda que migra con mayor rapidez que está formada
por fragmentos de degradación del RNA.
Preguntas.
1) Indicar el signo de la carga de los ácidos nucleicos y hacia que polo migrarán en un
campo eléctrico.
2) ¿Por qué un ácido nucleico de un tamaño único puede separarse en varias bandas en
un gel de agarosa? Haga un esquema de las bandas que observa en el gel e interprete los
resultados.
a) Fase de desnaturalización:
Para poder iniciar la replicación se requiere que las dos hebras del DNA molde
se encuentren separadas, lo que puede conseguirse aumentando la
temperatura del medio entre 90-95 ºC durante 3-5 min.
c) Fase de extensión:
Se incrementará la temperatura del medio hasta alcanzar la temperatura
óptima de funcionamiento de la Taq polimerasa (alrededor de los 72ºC). Los
tiempos de elongación pueden estar entre 20 seg para fragmentos de 500 pb,
hasta el doble para fragmentos de >1,2 Kb.
d) Fase de desnaturalización:
Las hélices de DNA formadas se separaran por aumento de la temperatura a
(90-95ºC) usando tiempos más cortos que la primera desnaturalización.
Las fases b) c) y d) se repiten n veces hasta alcanzar la amplificación deseada. Hay que
tener en cuenta la vida media de la Taq polimerasa a altas temperaturas. También
deben añadirse en cantidad suficiente los cebadores y los dNTPs.
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
Cada pareja preparará 1 sólo tubo de PCR con el fin de identificar si la muestra
amplificada contiene el DNA normal o el mutado.
Ciclos Tª Tiempo
1 94 ºC 5 min Desnaturalización inicial
94 ºC 30 seg Desnaturalización
33 62 ºC 30 seg Hibridación
72 ºC 60 seg Extensión
1 72 ºC 10 min Extensión final
Hold 4 ºC Hold Conservación de la muestra
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
3. Incubar 5 minutos a 37 ºC
4. Incubar 5 minutos a 80 ºC, para desactivar el enzima
PASO 3: VISUALIZAR LOS RESULTADOS
MATERIAL
PROCEDIMIENTO
2.- Diga para qué se desnaturaliza la muestra inicial de DNA y como se hace.