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BIOTECNOLOGA

EN REPRODUCCIN
BOVINA
Yael Filipiak y Clara Larocca

Universidad de la Repblica
Facultad de Veterinaria
rea de Biotecnologa de la Reproduccin Animal
Montevideo , Uruguay

BIOTECNOLOGA EN REPRODUCCIN
BOVINA
MANUAL TERICO-PRCTICO
Dras. Yael Filipiak y Clara Larocca, MsC.

Proyecto apoyado por MEAAP-UDELAR

(Mtodos Alternativos de Aprendizaje, Universidad de la Repblica)


Facultad de Veterinaria Universidad de la Repblica
Departamento de Reproduccin Animal
rea de Biotecnologa
Montevideo, Repblica Oriental del Uruguay
Julio de 2012

Biotecnologa en Reproduccin Bovina


Tabla de Contenidos:
FERTILIZACIN IN VITRO EN BOVINOS ........................................................................ 1

INTRODUCCIN......................................................................................................................... 1
TECNICA Y METODOLOGIA DE LA FECUNDACION IN VITRO EN EL BOVINO ............................. 2
CULTIVO Y MEDIOS ................................................................................................................... 2
RECUPERACION DE LOS COMPLEJOS CUMULUS-OVOCITOS (COC) .......................................... 3
MADURACIN IN VITRO............................................................................................................ 7
FERTILIZACIN IN VITRO O INSEMINACIN.............................................................................. 9
DESARROLLO IN VITRO:........................................................................................................... 11
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN BOVINOS ........................................................ 15

INTRODUCCIN....................................................................................................................... 15
BASES FISIOLGICAS DEL FUNCIONAMIENTO OVRICO: ....................................................... 16
PREMISAS Y DESCRIPCIN DE LA TCNICA ............................................................................. 17
SUPEROVULACION DE LAS DONANTES DE EMBRIONES: ........................................................ 17
RECOLECCIN DE EMBRIONES................................................................................................ 18
AISLAMIENTO Y EVALUACION DE EMBRIONES ....................................................................... 21
IMPLANTE DE EMBRIONES...................................................................................................... 23
CRIOPRESERVACIN DE EMBRIONES ....................................................................... 25

INTRODUCCIN....................................................................................................................... 25
AGENTES CRIPROTECTORES: ................................................................................................... 27
MTODO CONVENCIONAL ...................................................................................................... 28
METODO DE LEIBO .................................................................................................................. 31
METODO CON ETILENGLICOL.................................................................................................. 31
ANEXO ........................................................................................................................ 33
PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES STOCK ............................................................ 33

D-PBS (SOLUCIN STOCK) ....................................................................................................... 33


PBS BUFFER ............................................................................................................................. 33
M-PBS MEDIO DE ASPIRACIN Y LAVADO DE OVOCITOS .................................................... 34
M-TCM-199 MEDIO DE MADURACIN ........................................................................ 34
PREPARACIN DEL LICOR FOLICULAR: .................................................................................... 34
SOLUCIN BO (BRACKETT AND OLIPHANT) (SOLUCIN STOCK) .............................. 34
D-TCM-199 MEDIO DE DESARROLLO ................................................................................... 36
CR1AA (MEDIO DE DESARROLLO) (SOLUCIN STOCK) ........................................................... 36
CR1AA MEDIO DE DESARROLLO........................................................................................... 37
SOLUCIONES PARA CRIOPRESERVACIN ................................................................................ 38
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS: .............................................................................. 39

Biotecnologa en Reproduccin Bovina

FERTILIZACIN IN VITRO EN
BOVINOS
INTRODUCCIN
El trmino Fecundacin In Vitro (FIV), implica que esta se realiza en un laboratorio, ella involucra el
control de los mecanismos de maduracin e interaccin de los gametos femeninos y masculinos en
un ambiente artificial con el fin de producir embriones.
El objetivo de este manual es proporcionar tcnicas bsicas de la FIV y su aplicacin en el bovino.

Han pasado ms de 100 aos que Hermann Fol, un Zoologista suizo, observ por primera vez un
espermatozoide penetrando a un ovum de estrella de mar y la formacin de la primera clula del
futuro embrin (Fol, H, 1877). Las primeras investigaciones se hicieron en especies de
invertebrados marinos. La razn de esto, es que la fecundacin ocurre afuera de la hembra (en agua
de mar), al contrario de los mamferos, en los que ocurre dentro del organismo.
Desde 1950, las tcnicas de FIV han sido desarrolladas y perfeccionadas de tal forma que el cultivo,
la fecundacin y el desarrollo embrionario se lleva a cabo in vitro. Esto ha permitido estudiar y
entender en mejor forma las interacciones ovum-espermatozoide en los animales mamferos
(Iritani A y Niwa K, 1997; Benau DA y Storey BT, 1988).

La primera cra nacida por FIV fue reportada en el conejo en 1959 (Barros C y col, 1993) y en 1968
en ratn de laboratorio (Del Campo MR y col, 1990). En 1977, se obtuvo el primer bovino por FIV,
con semen capacitado en el oviducto de la vaca o tero de la coneja (McKinnon AO y col, 1992). El
primer ternero resultado de un ovocito madurado y fecundado in vitro naci en 1986 despus que
el embrin fue cultivado en el oviducto de una oveja por 5 das (Del Campo MR, 1995). Sin embargo,
los primeros terneros nacidos de ovocitos madurados in vitro, fecundados in vitro y cultivados
(desarrollo temprano) in vitro se report en 1987 (Kruip AM y Dieleman SJ, 1982). Un ao ms
tarde en Latinoamrica, se produjo en Uruguay, el primer nacimiento de dos terneros obtenidos de
FIV, en el Laboratorio de Biotecnologa de la Reproduccin, dirigido por la Dra Clara Larocca,
apoyado por JICA, Japn.

Primeros terneros nacidos por FIV en Uruguay

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TECNICA Y METODOLOGIA DE LA FECUNDACION IN VITRO EN EL BOVINO


La FIV en el bovino, se efecta en varias etapas, ellas comprenden:

1) Recuperacin y clasificacin de los complejos cmulus ovocitos (COC) obtenidos de los ovarios,
ya sea de especmenes colectados en el matadero o recuperados de hembras vivas.
2) Maduracin de los COC
3) Fertilizacin

4) Cultivo de desarrollo de los cigotos

Los embriones as producidos pueden ser transferidos inmediatamente a receptoras, congelados o


destinados a la investigacin.

Hay que distinguir que en la tcnica de FIV desarrollada rutinariamente en los laboratorios de
investigacin se usan ovarios (para la recuperacin de ovocitos) de hembras que han sido faenadas
en el matadero, que no tienen prcticamente ningn valor gentico.
Por supuesto, en programas reproductivos, los embriones producidos in vitro provienen de
hembras de alto valor gentico.

Con el desarrollo de la tcnica de aspiracin y coleccin de ovocitos in vivo utilizando la


ultrasonografa transvaginal (OPU, ovum pick up), surge la necesidad de aumentar la eficiencia de
las tcnicas de FIV, haciendo una realidad su aplicacin directa a la produccin, utilizando animales
de alto valor gentico.

CULTIVO Y MEDIOS
En la produccin in vitro de embriones, los elementos constitutivos de los medios, son de
importancia capital.

El mayor componente de los medios de cultivo es el agua, conteniendo tambin iones inorgnicos
(con funciones catalticas y fisiolgicas) (Palasz AT y col, 2000); aminocidos, implicados en la
sntesis proteica y vitaminas, que juegan un papel importante como coenzimas en el metabolismo
(Lehninger AL, 1975).

Diversos autores han estudiado el efecto de la adicin de hormonas, tales como LH, FSH y 17
estradiol, en los medios de maduracin y desarrollo. Como alternativa, se pueden emplear suero de
vaca en celo (SVC) y/o licor folicular bovino (LFb), componentes biolgicos, ms econmicos
(Larocca y col; 1993; 1997). Se ha estudiado el efecto de adicionar LFb a diferentes concentraciones
y proveniente de diferentes fuentes al medio de maduracin y/o de desarrollo, encontrndose
efectos positivos (Larocca y col, 2004). El LFb contiene esteroides, glucosaminoglicanos y muchos
otros metabolitos sintetizados por las clulas de la teca folicular (Romero y Sidel, 1994; Sirard y col,
1995).

Una forma de suplementar protenas a los embriones in vitro es mediante la adicin al medio de
suero fetal bovino (SFb) o de albmina de suero bovino (BSA). (Palasz AT y col, 2000). El SFb y la
BSA afectan al pH del medio y actan como quelantes de iones metlicos, contienen factores de
crecimiento y ciertas cantidades variables de hormonas que inciden el la diferenciacin y
proliferacin celular (Ball y col, 1985).
Los medios de cultivo suelen ser complementados de forma estandarizada con antibiticos para
suprimir el crecimiento de microorganismos contaminantes.

Otros requerimientos de cultivo son la temperatura, el pH, dixido de carbono y tensin de oxgeno,
osmolaridad y humedad relativa.

La osmolaridad ptima en medios de cultivo de embriones bovinos est en el rango de 275 a 285
mOsm. (Gordon, 1994).
El pH del medio de cultivo debe estar entre 7,2 y 7,4, mientras que en los medios de fecundacin, se
recomienda ligeramente superior (7,6-7,8) (Palasz AT y col, 2000).

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Las condiciones habituales de las distintas etapas de cultivo de embriones son 5% de CO2 y 95% de
aire. El dixido de carbono resulta necesario para la regulacin del pH intracelular (Carner y
Bavister, 1986).

La temperatura de cultivo utilizada en general por los investigadores es de 38,5C con 100% de
humedad.

RECUPERACION DE LOS COMPLEJOS CUMULUS-OVOCITOS (COC)


Existen diferentes tcnicas de recuperacin de COCs segn se trate de material de matadero o de
hembras vivas.
De hembras vivas:

OPU. Aspiracin con agujas especiales y bomba de vaco, guiada por ultrasonografa. Las tcnicas de
recuperacin de ovocitos in vivo se han desarrollado recientemente. La "calidad" de los COCs
recuperados de folculos de tamao mediano y grande (>5 mm) es muy buena. El nmero que se
recupera es bastante menor que el que se obtiene de los ovarios de frigorfico. (Critser, ES y col,
1986).
La recuperacin de los ovocitos se realiza mediante puncin in vivo de los folculos ovricos, siendo
este procedimiento guiado por ultrasonografa transvaginal. La ablacin de todos los folculos de >5
mm induce la emergenciad de una nueva onda folicular dos das despus, por esta metodologa se
puede aspirar con frecuencias de 1 o dos veces por semana (Van der Schans y col, 1991)
De material de matadero:

Los ovarios, colectados de hembras faenadas son transportados en termos que contienen suero
isotnico a 35-37 C. La aspiracin de los COCs, se realiza aproximadamente dentro de 4 a 6 horas
despus de faenados los animales.

Todos los folculos que no presentan indicios de atresia folicular, entre 2 y 8 mm de dimetro, son
aspirados (Parrish JJ y col, 1986; Bielanski A y col, 1993). La recuperacin es moderada y la
"calidad" (capacidad de los ovocitos de completar la meiosis) es "buena", en comparacin con la
tcnica de desmenuzamiento (con una hoja de afeitar, se corta la superficie del ovario) en la cual la
recuperacin es alta, pero la calidad de los ovocitos es baja. Esto se debe ms que nada a que se
recuperan ovocitos de folculos muy pequeos no antrales que no han alcanzado el tamao
adecuado para ser madurados in vitro (Brogliatti GM y col, 1995).

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Metodologa de trabajo
Primer da (se reciben los ovarios)
Preparar las soluciones de trabajo (entre 3 y 12 horas antes):

Medio de aspiracin de ovocitos (m-PBS, 50 ml) (Norio S, 1994).


Medio de maduracin (M-TCM-199, 20 ml) (Norio S, 1994).

Medio de desarrollo (CR1aa, 50 ml) o (D-TCM-199, 10 ml) (Norio S, 1994).


Las soluciones stock se preparan como se explica en el anexo a partir de la pg 32.

El aceite mineral y los medios de cultivo se coloca en la estufa a 38 C, con 5% de CO2 en aire, para
se equilibre en temperatura y el pH (por lo menos 3 horas antes de su uso)
Metodologa para la obtencin y clasificacin de COCs (complejo ovocito
cmulus)
El laboratorio debe estar asptico y con los equipos preparados, previamente al ingreso del
material de trabajo. Se limpia y desinfectan las superficies de trabajo con alcohol 70 y se verifica
que estn todos los materiales necesarios.
Se preparan los medios y se colocan en estufa para que se templen y equilibren.
Se enciende el bao mara.

1) Se lavan los ovarios en un colador con sol de NaCl isotnico a 38C

2) Se colocan en vaso de bohemia al bao Mara (38C), con sol isotnica


3) Se seca con gasa estril la superficie del ovario

4) Se carga una jeringa con 1 ml de m-PBS (medio de aspiracin)

5) Se aspiran todos los folculos de 2 a 8 mm de dimetro (No aspirar folculos de ms de 8 mm de


dimetro).

6) Cuando el lquido llena la jeringa, se transfiere suavemente a cajas de Petri de 90 mm con fondo
cuadriculado, sobre la platina caliente.

7) Se Prepara una placa de Petri pequea con medio m-PBS para colocar los COC obtenidos y
seleccionarlos bajo microscopio estereoscpico.
8) Se colectan los COCs con una pipeta Pasteur de dimetro adecuado, clasificndolos segn
calidad (A, B, C, D) y seleccionar los de calidad A o los A y B, segn el criterio del experimento.

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Ovarios de Vaca

Recuperacin de ovocitos

Bsqueda bajo microscopio estereoscpico

Clasificacin y evaluacin de los COCs


Los COCs se categorizan de acuerdo a la morfologa de las clulas del cumulus oophorus y a las
caractersticas del ovoplasma.
Clasificacin de los COCs:
Clasificacin

Calidad

Caractersticas a evaluar

Bueno

Completamente rodeado por ms de 3 capas de


clulas del cmulus y citoplasma homogneo
Rodeado parcialmente por clulas del cmulus o
con citoplasma irregular.
Desnudo.
Rodeado por fibrina (con aspecto de tela de
araa)

B
C
D

Regular

Malo
Degenerado

(Liebfried L and First N L, 1979; Sato E y col, 1990)

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COCs de calidades A y B

Es bastante difcil seguir una regla fija en lo que se refiere a la clasificacin morfolgica bajo un
microscopio estereoscpico, ya que por un lado, hay una gran variabilidad entre los COCs y por
otro, la cantidad de COCs que un tcnico debe manipular hace difcil categorizarlos adecuadamente.
A continuacin se muestra un esquema de las diferentes categoras de COCs.
Esquema de Clasificacin de los COCs

Los COCs seleccionados, se lavan dos o tres veces en placas de Petri de 40 mm con medio m-PBS.
Se utilizan diferentes medios para el cultivo de desarrollo. Los ms utilizados son el
CR1aa y el TCM-199.

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En caso de que el cultivo de desarrollo se realice en medio TCM-199, ser necesario
realizar cocultivo con clulas de la granulosa. En una caja de Petri se coloca medio de
cultivo M-TCM-199 cubierto con aceite mineral y se cultivan clulas de la granulosa en
estufa 37C con 5% de CO2.
Se preparan las cajas de Petri para la maduracin y se colocan en estufa a 38C y 5% de
CO2 como se explica en la etapa siguiente de maduracin in vitro.

MADURACIN IN VITRO
La maduracin del ovocito in vitro que incluye la maduracin nuclear y citoplasmtica fue
reportada en 1965 en diferentes especies (Del Campo y col, 1995; Hinrichs K, 1993).

La meiosis permanece detenida en los ovocitos que se encuentran en los folculos hasta que estos
son expuestos a gonadotrofinas que permiten su continuacin. La meiosis in vivo es detenida por
sustancias foliculares que an no estn bien definidas. Sin embargo, los COCs que son removidos
desde los folculos, comienzan la meiosis espontneamente.

En el proceso de maduracin in vivo de los ovocitos, intervienen la hormona folculo estimulante


(FSH) en el crecimiento folicular, la hormona luteinizante (LH), que induce la maduracin final y la
ovulacin del ovocito seleccionado. Varios autores han indicado que para que el proceso de
maduracin se lleve a cabo debe existir un balance hormonal en el folculo (particularmente de los
esteroides). En un sistema in vitro, este balance natural es imitado agregando las hormonas FSH, LH
y estradiol 17 al medio de maduracin (TCM-199). En algunos laboratorios la adicin directa de
estas hormonas ha sido substituida agregando suero de vacas en celo (SVC) y licor folicular bovino
(LFb). Estos componentes biolgicos son suficientes para producir maduracin (nuclear y
citoplasmtica), expansin de las clulas del cmulus y futuro desarrollo del cigoto.

Maduracin de los COCs:


Estructura

Tiempo de maduracin in vitro de COC


bovinos (hs)

Vescula germinativa (GV)


0.0-6.6
Ruptura de la membrana de la GV
6.6-8.0
Condensacin de la cromatina
8.0-10.3
Metafase I
10.3-15.4
Anafase I
15.4-16.6
Telofase I
16.6-18.0
Metafase II
18.0-24.0
Adaptado de Sirard, MA y col, 1989 y Sato E y col, 1990.

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Metodologa para la Maduracin


Los ovocitos se lavan dos o tres veces en gotas grandes de 300 l o en cajas de Petri pequeas con
M-TCM-199 y se transfieren a las cajas de Petri con gotas de maduracin (M-TCM-199) cubiertas
con aceite mineral (previamente equilibrado en estufa).
Segn la cantidad de COCs o de grupos de COCs se determinar el mtodo a utilizar para la
maduracin:

En el mtodo de una gota, se transfieren 60 COCs juntos a una sola gota de 600 l.

En el mtodo de gotas mltiples, segn la cantidad de grupos, se transfieren a gotas de 100


l, grupos de 10 COCs o grupos de 20-25 COCs se colocan en gotas de 200 l

El rango de COCs a madurar es de unos 10 ovocitos por cada 100 l de medio M-TCM-199.

Para la maduracin se preparan cajas de Petri numeradas en la parte inferior para identificar los
grupos de ovocitos mantenindolos siempre en gotas separadas.

Gotas de Maduracin en 3 gotas de 100 l

Esquema de lavado y maduracin de los COCs :

m-PBS

m-PBS

M-TCM-199

1
C

2
3

Caja de Petri numerada con


gotas de maduracin,
cubiertas con aceite mineral
(4 gotas de 100 )

M-TCM-199

GOTAS DE
MADURACIN
M-TCM-199
CUBIERTAS
CON ACEITE
MINERAL

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Las cajas de Petri preparadas con las gotas de maduracin y los ovocitos, cubiertas con aceite
mineral, se colocan en estufa a 38C y 5% de CO2 por 22 hs.

Cajas de maduracin en la estufa incubando en la estufa

Una vez puestos a madurar los ovocitos, el da anterior a la fertilizacin, componemos las
soluciones de BO lavado de semen, BO lavado de ovocitos y BO dilucin de semen. Se explica en el
anexo.

FERTILIZACIN IN VITRO O INSEMINACIN


Para que tenga lugar la fertilizacin del ovocito, los espermatozoides deben ser previamente
capacitados. La capacitacin espermtica es la reaccin donde son retiradas las glucoprotenas de la
membrana del espermatozoide y que le permiten adquirir su capacidad para poder fecundar al
ovocito. In vivo, la capacitacin del espermatozoide ocurre durante su pasaje por los rganos
reproductores de la hembra. Durante la capacitacin ocurren varios fenmenos: los
espermatozoides adquieren hipermotilidad progresiva, la capacidad de penetrar el cumulus y se
preparan para para que tenga lugar la reaccin acrosmica.

Ovocitos siendo fecundados por espermatozoides

El ovocito maduro, detenido en la Metafase de la meiosis II, permanece en este estado hasta su
fertilizacin. Al ser fecundado por el espermatozoide capacitado, completa la Meiosis II y extrude el
2 cuerpo polar. La cabeza del espermatozoide forma el proncleo masculino y el ncleo del vulo
el proncleo femenino, los cuales se fusionan para completar el nmero diploide de cromosomas en
el embrin. Este proceso fisiolgico se puede realizar in vitro.
Una vez madurados los COCs, se lavan y se colocan en gotas de inseminacin que contengan la
concentracin de espermatozoides por ml. deseada. La relacin es de 10 COCs / 100 l de medio de
fecundacin.

El medio que utilizamos para inseminar se conoce como medio Brackett and Oliphant (Brackett BG
y Oliphant G, 1975), el cual contiene heparina y cafena que son necesarias para la capacitacin
espermtica.

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Biotecnologa en Reproduccin Bovina


Metodologa de inseminacin
Preparacin de los COCs
Antes de comenzar con la inseminacin, se preparan los COCs.

Los ovocitos se lavan en solucin BO de lavado de ovocitos 2 3 veces y se dejan en gotas de BO en


estufa (a 37C y 5% CO2), mientras se realiza la manipulacin del semen. (La preparacin de la
solucin BO se explica en el anexo).
En caso de que vayamos a utilizar el medio TCM-199, es necesario realizar cocultivo con
clulas de la granulosa, presentes durante la maduracin. En ese caso, guardamos la
caja con las gotas de M-TCM-199 nuevamente en la incubadora para que las clulas del
cmulus que hayan quedado se sigan desarrollando. En esta etapa hay que tener
especial precaucin para que no ocurra contaminacin del medio de cultivo.
Si se utiliza el medio CR1aa, no es necesario el cocultivo.
Preparacin del semen - capacitacin
1) Se coloca en la platina caliente (35C) un tubo cnico de centrfuga y portaobjetos estriles para
que se templen.
2) Se saca la pajuela del termo de nitrgeno, se mantiene a temperatura ambiente durante 10
segundos y se coloca en Bao Mara a 35C por 30 seg.
3) Se seca con gasa mojada en alcohol.
4) Se corta el tapn con tijera, se invierte sobre el tubo de centrfuga inclinado y se corta el otro
extremo, el semen baja por la pared del tubo. Se pone el tubo en Bao Mara a 35C.
5) Se toca con una gota de la pajuela un portaobjetos caliente.
6) Al tubo con semen, se le agregan 6 ml de medio de lavado de semen y se centrifuga a 500 G
(1.800 rpm, dependiendo del radio de la centrfuga) durante 5 minutos (equilibrar la centrfuga con
otro tubo que contenga la misma cantidad de agua).
Mientras tanto, observar al microscopio el portaobjetos con el semen para evaluar su calidad segn
su vitalidad, motilidad y concentracin (400x).

Tubo con semen en BO de dilucin luego de centrifugado.


Se aprecia el pellet en el extremo cnico del tubo

7) Se toma el tubo de la centrfuga y se aspira el lquido sobrenadante, el pellet que queda en el


fondo del tubo se diluye nuevamente en 6 ml de medio de lavado de semen y se repite el
procedimiento centrifugando nuevamente a 500 G por 5 minutos.
8) Se toma el tubo de la centrfuga, se vuelve a aspirar el lquido sobrenadante, el pellet que queda
en el fondo del tubo se diluye enrazando al volumen final.

Biotecnologa en Reproduccin Bovina


Clculo de dilucin:

Se averigua la concentracin de espermatozoides que contiene la pajuela para calcular la


dilucin necesaria para la concentracin deseada.
Aplicamos la siguiente frmula:
Vol i x [ i ] = Vol f
[ f ]
Inseminacin:
Se prepara una caja de Petri y con el semen ya capacitado y diluido a la concentracin deseada, se
preparan gotas para la inseminacin, cubiertas con aceite mineral.
Se sacan los ovocitos del medio BO, que estaban en la estufa y se colocan por grupos en las gotas de
semen, en una proporcin de 10 ovocitos en 100 l aproximadamente.
1
C

2
3

Caja de petri numerada con


gotas de semen,
cubiertas con aceite mineral
(4 gotas de 100 )

Se coloca la caja con los ovocitos y el semen en la estufa a incubar por 5 hs (mtodo japons) (Norio
S, 1994) o 24 hs (Uruguay y Argentina) (Cabbio, 2006).

Despus de la inseminacin, preparamos el medio de desarrollo, que consiste en CR1aa (o TCM199) adicionado, como se explica:
Se coloca en estufa el aceite mineral, con 5% de CO2, para se equilibre la temperatura y el pH.

DESARROLLO IN VITRO:
Una vez finalizada la etapa de inseminacin, se remueven los cmulos de los ovocitos y se lavan en
el medio seleccionado para el cultivo (CR1aa), luego se incluyen en gotas con este medio, cubiertas
de aceite mineral y se colocan en la estufa.

Para realizar la remocin de los cmulus se forma una gota de 300 l del medio TCM-199 con
Hepes suplementado con 5% de SFb, en una caja pequea y se pipetea 40 veces con micropipeta
automtica de 100 l, cuidando que no se formen burbujas.
Luego se lavan los ovocitos en el medio CR1aa dos veces y se pasan a las gotas de cultivo. Se coloca
la caja de Petri en la incubadora a 38C, con 5% CO2.
A las 48 a 72 horas se realiza la primera evaluacin de divisin celular. Posteriormente cada 48
horas hasta los das 9-10 en los cuales los ovocitos fecundados deben encontrarse en el estado de
blastocisto y/o blastocisto expandido.

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Biotecnologa en Reproduccin Bovina

12

El estado de desarrollo embrionario se clasifica segn los cdigos de clasificacin de las normas
IETS (International Embryo Transfer Society), en manera numrica del 1 al 9:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Embrin de 1 clula
2 clulas
4 clulas
8 clulas
16 clulas
Mrula temprana
Mrula compacta
Blastocisto temprano
Blastocistos
Blastocisto expandido
Blastocisto protrudo
Blastocisto protrudo expandido

das 0-2
das 1-3
das 2-3
das 3-5
das 3-5
das 5-6
das 6-7
das 6-8
das 6-8
das 8-9
das 9-11
das 10-11

Se consideran para implante los estados de desarrollo desde mrula compacta hasta blastocisto
expandido, estados de desarrollo 4, 5, 6 y 7. Los resultados de preez con mrulas compactas son
menores que implantando blastocistos. Los blastocistos eclosionados o protrudos no se implantan.
Clasificacin de embriones segn su desarrollo:

Biotecnologa en Reproduccin Bovina

Embriones en desarrollo a las 48-72 horas

Blastocistos y blastocistos eclosionando

Mrulas compactas

13

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Desarrollo in vitro utilizando TCM como medio de desarrollo:


Al retirar los ovocitos de las gotas de inseminacin, una vez equilibradas las soluciones, se forman
gotas de cultivo y se colocan los ovocitos de acuerdo a los grupos en las gotas correspondientes y
clulas del cmulus de manera alternada con los ovocitos.
1
C

2
3

Caja de petri numerada con los ovocitos


fertilizados y clulas de la granulosa,
en gotas de M-TCM-199, cubiertas con
aceite mineral (4 gotas de 100 )

Otra forma en que se puede proceder es conservando la caja de petri en la que hicimos la
maduracin, como se propuso en esa etapa, la cual tiene algunas clulas del cmulus que han
quedado al retirar los ovocitos. Si optamos por este mtodo, debemos cambiar el medio de las gotas
para renovarlo con medio nuevo, pero usando la misma caja de Petri. Siempre cuidando que no se
produzca contaminacin.
Las clulas de la granulosa crecen y se extienden sobre la superficie del fondo de la gota como una
red.
Cada 48 horas se chequea para evaluar desarrollo de los embriones y se realizan cambios parciales
del medio de cultivo.

Biotecnologa en Reproduccin Bovina

TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN
BOVINOS
INTRODUCCIN
La Transferencia de Embriones (TE) consiste en el transplante de embriones provenientes de una
vaca donadora del valor deseado, al tero de vaquillonas o vacas receptoras, de menor inters,
sincronizadas.
Los programas de TE tienen la capacidad de diseminar la riqueza de la gentica superior en el
ganado y acortar los intervalos generacionales en los programas de seleccin.
Permite difundir los genes de una hembra valiosa en mayor medida que la reproduccin fisiolgica,
esto hace de la tcnica un instrumento de seleccin tanto para la creacin de lneas genticas como
para la difusin del progreso gentico. Por ejemplo de una vaca se obtienen un promedio de 5
terneros en su vida reproductiva. Si superovulamos y realizamos la transferencia de embriones se
puede aumentar como mnimo 5 veces por ao, lo que es muy importante sobre todo en madres de
toros.
En las razas productoras de carne, se puede incrementar la productividad, en trminos de calidad y
kilogramos de carne por animal, seleccionando un ganado eficiente para las condiciones de
explotacin y mercado, as como en ganado de carne, permite producir gemelos y con ello aumentar
el ndice de procreo.
En razas lecheras es posible incrementear la produccin de leche, grasa y protenas lcteas que
requiere la industria y prolongar la vida til de vacas mediante mejoras en la fortaleza y tipo
funcional, adpatadas al sistema de manejo.
La TE combinada con OPU y aplicando la FIV disminuye los costos de los embriones y aumenta
significativamente su nmero.
Por otra parte la TE es una herramienta para salvaguardar genotipos en extincin, de especies
silvestres, de especies de inters zootcnico, as como la introduccin de nuevas razas.
Avance gentico:
- Aumento de la presin de seleccin. Debido a que se produce un aumento en el nmero de
descendientes por hembra, se reduce el nmero de madres seleccionadas de una
generacin para dar lugar la generacin siguiente de reproductores que renovarn el
rebao.
- Reduccin del Intervalo Intergeneracional. Al aumentar en forma rpida las hembras
jvenes, se reduce el intervalo entre las generaciones, se difunden los reproductores de
alto valor gentico y por tanto se acelera el progreso gentico.
- Difusin de la mejora gentica. Aumentando la descendencia de hembras de alto valor
gentico el TE es un medio eficaz para la difusin del potencial gentico por va materna.
Vientres inferiores producirn terneros superiores.
- Ganancia gentica: Para los ndices de ganancia gentica, en produccin de leche, medidos
en porcentaje/ao, es posible evaluar el impacto de sta tecnologa. Con los test de
progenie, a travs de un sistema eficiente, la ganancia gentica vara de 1,5 a 2,0% al ao.
Con un esquema de Transplante de Embriones (TE) con hembras seleccionadas, este ndice
vara entre 1,8 a 2,4%. Si se utilizan vaquillonas seleccionadas por el pedigree, el ndice
sube de 2,6 a 3,5%.

Seguridad sanitaria.
- Numerosos estudios han demostrado que mediante el TE logramos impedir la transmisin
de enfermedades vricas o bacterianas siguiendo las normas de la IETS. La zona pelcida es
una barrera natural (Stringfellow y col.1991). Desde el punto de vista comercial esto es
fundamental en el comercio de embriones congelados.

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Proteccin de especies productivas y silvestres en extincin.


- El mantenimiento de los genotipos en extincin de inters zootcnico, as como de especies
en extincin permite mantener y conservar la biodiversidad.

Los beneficios ms importantes se pueden resumir en:


- Mayor y ms rpido avance gentico. Multiplicacin rpida de progenitores excelentes.
Mayor presin de seleccin.
- Riesgo insignificante de transmisin de enfermedades.
- Crias con anticuerpos zonales.
- Introduccin de nuevas razas en una zona o pas.
- Amortizacin del capital de vacas donadoras.
- Amortizacin y eficiencia en la utilizacin de semen de alto valor gentico y econmico.
- Reduccin del capital por vaca y del nmero de vientres de registro.
- Hembras de reemplazo provenientes del ncleo gentico.
- Mejoramiento de la calidad de los toros para la venta.
- Disponibilidad de hembras para la venta que de otra menera hubieran sido de reemplazo.

Las desventajas estaran dadas bsicamente por una mayor inversin en equipos, insumos y
recursos humanos.

BASES FISIOLGICAS DEL FUNCIONAMIENTO OVRICO:


La regulacin neurohormonal del funcionamiento ovrico en la vaca ocurre en diferentes niveles
interrelacionados (Dcke, 1981). Las neuronas de la porcin craneal del hipotlamo producen una
neurohormona, la gonadotropin-releasing-hormon (GnRH), la cual va axnica llega a la eminencia
media dnde es almacenada o liberada. Cuando se libera va a la adenohipfisis va portahipofisiario (Dcke, 1984). La adenohipfisis secreta las gonadotrofinas, hormonas
folculoestimulante y luteinizante (FSH/LH) en respuesta a la GnRH. La FSH es responsable del
reclutamiento folicular que se produce durante cada onda folicular (Hafez, 2000). La liberacin de
la FSH y la LH en la sangre perifrica es el producto de la interaccin entre hipotlamo, hipfisis y
ovarios a travs de mecanismos de Feed-back positivos/negativos y el sistema vegetativo. El total
de los folculos que maduran en la vida de una vaca estn predeterminados desde el nacimiento,
son los folculos primarios. En la etapa de la pre-pubertad comienzan a crecer, las clulas planas
pasan a cbicas (clulas de la granulosa), induciendo la formacin de la zona pelcida (ZP), se
forma la teca externa y se forman los folculos secundarios que ya poseen receptores para la FSH
(Dcke, 1984), las clulas de la granulosa se multiplican y se comienza a formar el antro folicular
(folculo de Graaf).
El crecimiento folicular ocurre en ondas de folculos antrales (4-5 mm) seguida por la seleccin de
un folculo dominante y la regresin de los otros subordinados. Cuando no se produce la regresin
del Cuerpo Lteo (CL), el folculo dominante puede ir a la atresia y comienza una nueva onda
folicular (Mapletoft y Pierson, 1995). La mayora de las vacas presentan dos o tres ondas foliculares
durante el ciclo estral. La primera se inicia casi enseguida de la ovulacin (en un corto perodo
posterior), la segunda se inicia entre los 8 a 10 das, la tercera cuyo folculo dominante est
destinado a ovular se inicia aproximadamente en el da 18 (Ginter y col.,1989).
En el proceso de maduracin de los folculos hasta la ovulacin intervienen los estrgenos y se
forman receptores para la LH en las clulas de la granulosa. La alta concentracin de estrgenos en
la sangre perifrica bloquea la liberacin de FSH por parte de la adenohipfisis. La produccin de
estrgenos preovulatoria induce un pico de LH que induce la ovulacin del folculo maduro.
Despus de la ovulacin las clulas de la granulosa se luteinizan. Despus del pico de LH el ovocito
necesita estar entre 6-8 horas en el folculo para su total maduracin (Thibault, 1977).

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PREMISAS Y DESCRIPCIN DE LA TCNICA


-

Seleccin y manejo de donantes y receptoras


Seleccin de los toros padres, calidad del semen y fertilidad
Sincronizacin de los ciclos estrales entre donadoras y receptoras
Tratamientos superovulatorios
Inseminacin artificial de donadoras
Recuperacin de embriones
Aislamiento, evaluacin y conservacin de embriones (criopreservacin)
Implante de embriones en las receptoras
Diagnstico precoz de gestacin

SUPEROVULACION DE LAS DONANTES DE EMBRIONES:


La vaca es un animal unparo que generalmente ovula un solo vulo en un ciclo estral. A veces dos.
Una aplicacin efectiva de la tcnica de transferencia de embriones se realiza con el objetivo de
inducir una ovulacin mltiple, recuperar y transferir varios embriones, uno por receptora en
ganado para leche y dos en ganado comercial para carne para obtener muchos terneros.
Para ingresar a un programa de TE, las donantes seleccionadas deben cumplir los siguientes
requisitos:
- Tener un perodo post parto no menor a 60 das, habindose estudiado 2 ciclos previos de
duracin normal.
- Haber transcurrido ms de 50 das de un tratamiento superovulatorio anterior.
- Es conveniente que al efectuar el tratamiento la donante no se encuentre con cra al pie. Nos
referimos anteriormente a que la mayor limitante en la respuesta a los tratamientos de
superovulacin se debe a la variabilidad individual adems de los otros factores que afectan la
respuesta. Varios investigadores (Hasler y col., 1983), reportaron que el rango de embriones
transferibles por donante es de 5 a 7.
Se han utilizado para la superovulacin diferentes tipos de gonadotropinas con diferentes
presentaciones y dosis comerciales (Casida y col, 1940, 1943; Gordon, 1975; Betteridge, 1977), las
ms utilizadas son tres:

a) Gonadotropinas extradas de la hipfisis del suino (p-FSH). La mejor relacin de


FSH/LH, depende de la pureza del preparado que contenga la menor cantidad posible de
LH, ya que la FSH es la hormona responsable de la superovulacin (crecimiento de
numerosos folculos hasta estado preovulatorio). Se ha estimado que la FSH tiene una vida
media en sangre en la vaca como mximo de 5 h (Lerner y col., 1986), debido a esto la dosis
total (mximo 50 Unidades ARMOUR), se debe fraccionar e inyectar i.m. dos veces al da (45 das), en dosis decrecientes. A las 72 h. de iniciado el tratamiento se inyecta 500
microgramos de PGF2 en la maana y 250 en la tarde. Se insemina a celo visto con dos
servicios con 12 horas de intervalo. La coleccin de embriones se realiza en los das 7-8 al
estado de blastocisto y blastocisto expandido implantndose en vaquillonas sincronizadas
respecto al celo de la donante (12/0/+12 h.). El tratamiento de superovulacin se inicia
preferentemente entre los das 9-10 del ciclo. Se puede partir contando desde un celo
natural o sincronizando con PG o con mtodos que combinan la progesterona o
progestgenos con estrgenos y permiten iniciar la sincronizacin de las donantes en
cualquier da del estro.
b) Gonadotropina de yegua preada (PMSG, actualmente eCG). En la vaca no tena gran
difusin debido a que tiene una vida media en sangre de 40 h y persiste durante 10 das en
la sangre perifrica, esto causa problemas porque mantiene la estimulacin ovrica,
resultando una escasa coleccin de embriones transferibles y muchos folculos que no
ovulan. En los ltimos aos se administra en combinacin con un anticuerpo monoclonal
(ANTI-eCG), que resuelve stos problemas (Crister y col., 1980; Mapletoft y col., 1990). Se
administran 3000 UI i.m. (vaca) o 1500-1700 (vaquillonas), preferentemente en los das 910 despus del celo. A las 48 h se inyecta a las donantes con PGF2, 500 microgramos en la

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Biotecnologa en Reproduccin Bovina


maana y 250 en la tarde. El celo se presenta a las 48 h., y las vacas se inseminan a celo
visto a las 12 y a las 24 h despus de detectado y se da una inyeccin i.v. de un equivalente
en unidades internacionales de anti-eCG con la primera inseminacin. Entre los das 7-8 se
realiza la colecta de embriones y se transfieren a receptoras sincronizadas o se congelan.
Los rangos son similares a los obtenidos con tratamientos con FSH, con la ventaja de que es
un tratamiento ms prctico en condiciones de campo (Larocca y col., 1996; Larocca y col,
1998), pero es ms costoso.

c) Gonadotropina de la menopausia humana (hMG). Su uso a nivel de la produccin no


est difundido por lo elevado de su costo.

RECOLECCIN DE EMBRIONES
Actualmente, la recoleccin transcervical, no quirrgica es la tcnica utilizada.
Las vacas donantes deben ser manejadas de forma de evitarles cualquier factor de estrs.
Se las coloca en un cepo en el que se realizar la operacin. La base de la cola es rasurada, lavada
con jabn antisptico y enjuagada con alcohol al 70; luego, se administra una inyeccin epidural de
5ml de lidocana al 2%. Se comprueba la buena administracin de la inyeccin, observando la
flacidez de la cola. El rea alrededor de la vulva es lavada y esterilizada. Mediante palpacin rectal,
se detecta el nmero de cuerpos lteos que tiene cada ovario.
El paso siguiente es apartar los labios vulvares y si es necesario, introducir un dilatador, a travs de
la vagina y colocarlo en el lmen del crvix. Ejerciendo poca presin, el dilatador se pasa a travs
del crvix, con sumo cuidado, para facilitar ms tarde, el paso del baln catter.
Una sonda con baln inflable (baln catter) de calibre francs 18 24 (dependiendo del tamao
del tero), con una varilla de acero inoxidable en su interior, se introduce por la vagina y se pasa a
travs del lmen del crvix dilatado. El catter, luego, es manipulado en el cuerno uterino
seleccionando el lugar adecuado y as el baln inflable es situado lo ms craneal posible.
El baln deber estar ajustado a la pared del cuerno uterino, para evitar cualquier escape del medio
que se va a inyectar. Sin embargo, si el baln est muy ajustado, el endometrio, fcilmente, es
daado y dificultar la bsqueda de los embriones.
Generalmente, 10 a 15 ml de aire son necesarios para vaquillonas y 18 a 22 ml para vacas. Para el
lavado uterino se utiliza 1 litro (500 ml para cada cuerno uterino) de medio PBS (fosfato buffer
salino) o solucin Ringer lactato. Se calienta a 37 C y se acondiciona en un transfusor de suero y se
le adapta a un tubo de drenaje. Este tubo se conecta con el tubo de entrada del baln catter y un
adaptador en forma de Y. Una parte del tubo de goma de 0,5 m de largo se conecta al tubo de salida
del baln catter a travs del adaptador en Y y se conecta a un dispositivo con filtro Em-Com que
permite pasar el lquido, reteniendo los embriones.
Mediante la palpacin rectal se hace un masaje en la unin tero tubrica con los dedos ndice y
pulgar y se controla el ingreso y salida de medio, lo que se repite de 6 a 10 veces utilizando entre
500 a 800 ml por cada cuerno uterino. La entrada y salida del medio utilizado para la colecta se
regula mediante el uso de pinzas de Mohr o similares (hemostticas, etc).
Despus que se lava un cuerno uterino, se retira el baln catter, se higieniza bien y se desinfecta
con alcohol 70 y se cambia al cuerno opuesto repitiendo el mismo procedimiento realizado en el
primer cuerno.
El filtro Em-Com, se lleva a un laboratorio que cuente con una lupa estereoscpica.

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Baln catter para Transferencia de Embriones

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Filtro
Em Com

Esquema de lavado uterino para recoleccin de emriones

Canulacin de la donante

Recuperacin de los embriones desde el Filtro Em-Com

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AISLAMIENTO Y EVALUACION DE EMBRIONES


El contenido del filtro Em-Com se vuelca en placas de Petri de 90 mm con fondo cuadriculado.
Para localizar, identificar, aislar, manipular y clasificar ovocitos infrtiles y embriones se requiere
considerable experiencia. Los embriones fcilmente pueden pasar desapercibidos as que cada caja
de Petri debe ser examinada y chequeada dos veces para ratificar el nmero de embriones
encontrados.
Las cajas de Petri de fondo plano y cuadriculadas son muy eficientes en la bsqueda de embriones
utilizando lupas estereoscpicas.
La mayora de los embriones colectados debern estar en un mismo estado de desarrollo, en el dia
5 y 6 se encuentran en un estado de mrula y mrula compacta y aquellos recolectados el dia 7 o
ms tarde los encontraremos en estado de blastocisto. Los embriones transferibles son blastocistos
o mrulas compactas, siendo mejor el resultado cuando se transfieren en estado de blastocisto.
Solamente se transfieren embriones que tengan intacta la zona pelcida.
Debido al hecho de que los folculos de un ovario sometido a un tratamiento hormonal ovulan en
un determinado tiempo, un considerable rango de desarrollo se encuentra normalmente.
La morfologa embrionaria esta correlacionada con las tasas de prenez, por lo tanto embriones que
estan retardados en su desarrollo por dos o ms das no deberan ser transferidos.
Los embriones se evalan y as las receptoras apropiadas debern ser seleccionadas. En general los
mejores embriones deben ser transferidos a buenas receptoras, en adiccion la edad del embrion
puede hacerse coincidir hasta cierto punto con el ambiente uterino de la receptora. El embrin
debe ser esfrico, compacto, con blastmeros del mismo tamao con color, textura y citoplasma
uniforme; el espacio perivitelino debe estar vaco y de dimetro regular y la zona pelcida simtrica
y sin arrugas o pliegues, no debe existir ningn tipo de detrito celular.
Algunas caracteristicas que pueden ser evaluadas incluyen: compactacin de las clulas,
regularidad de la forma del embrin, variacin en el tamao de las clulas, color y textura de
citoplasma, presencia de grandes vesculas, presencia de celulas extrudas, dimetro y regularidad
de la zona pelcida, presencia de detritus celulares.
Clasificacin de los embriones

Cdigo

Calidad

Descripcin

Excelente

Masa embrionaria esfrica y simtrica, clulas uniformes


en tamao, color, densidad. Consistente con estado de
desarrollo. Irregularidades menores. Pelcida esfrica, sin
deformaciones 85% de material celular intacto y viable (sin
clulas extrudidas en espacio perivitelino)

Bueno

Irregularidades moderadas en aspecto, forma, tamao,


color y densidad de clulas. 50% material celular intacto y
viable

Regular

Irregularidades mayores en forma y tamao de masa


embrionaria y en tamao, color y densidad de clulas
individuales. 25% material celular intacto y viable

Malo

Degenerado, muerto o de 1 clula no viables

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Blstocistos de diferentes calidades y estado de desarrollo

Mrulas compactas de calidad excelente y buena

Blastocistos

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IMPLANTE DE EMBRIONES
Transferencia no quirrgica:
Es la tcnica de eleccin en la actualidad. Hasta los aos 60 el implante se haca por va quirrgica.
La primera transferencia no quirrgica con xito en bovinos fue lograda por Mutter y col. en 1964,
atravesando el cervix con una pipeta de inseminacin. Al comienzo de la dcada del 80 se estableci
como lugar ptimo para la transferencia quirrgica del embrin el tercio anterior del cuerno
uterino, basado en que los embriones del da 7 y 8 se localizan en el tero a 56 cm de la unin
tero tubrica (Strabberger, 1982). Esto no es posible en la transferencia no quirrgica con un
catter rgido, como consecuencia de la curvatura uterina (Newcomb, 1982). Trabajos posteriores
no encontraron diferencias en el xito de la transferencia comparando el tercio anterior con el
medio y estimaron que el intento de transferir los embriones por delante del tercio medio con un
catter rgido poda conducir a traumatismos de la mucosa uterina con muerte embrionaria
(Sreenan y Diskin, 1987). El lugar de eleccin para obtener resultados aceptables es por delante del
ligamento intercornual, a la altura de la curvatura del cuerno. (Mitchell, West y Donaldson, 1984).
El procedimiento de transferencia no quirrgica tiene la desventaja de requerir destreza,
experiencia y particularmente mucho cuidado en la manipulacin del catter en el cuerno y el
cuerpo del tero. El trauma provocado provoca liberacin de prostaglandinas, respuesta
inflamatoria, descenso de los niveles de progesterona, que finalmente intervienen en la sobrevida
del embrin. Esto provoca que la receptora retorne al celo entre los 24 y 39 das post transferencia.
Para evitar el efecto traumtico de la manipulacin sobre el endometrio se pusieron a prueba
drogas para inducir la relajacin de la musculatura lisa del tero (relajantes uterinos) y/o
anestsicos locales (anestesia epidural); sobre los primeros hay opiniones contradictorias acerca de
su efectividad.

Procedimiento:
El embrin se carga en la pajuela de 0.25 ml. La pajuela es cargada en primer lugar con medio de
cultivo (m-PBS) (aprox. 3.5 cm de su longitud), se deja un espacio con aire (1 cm) y luego se carga el
embrin contenido en el medio. Posteriormente una nueva columna de aire y otra con medio. La
columna con medio de cultivo ubicada en el extremo abierto de la pajuela, limpia a esta en el
momento de la descarga. La presencia de las columnas con aire impiden el desplazamiento de la
columna central que contiene el embrin. La ltima garantiza la descarga del embrin por efecto de
arrastre. La pajuela es colocada en el catter de transferencia estril, que ser cubierto
posteriormente por una camisa sanitaria o vaina protectora plstica. Esto representa una ventaja ya
que permite mantener el catter libre del contacto con secreciones que puedan contaminarlo
cuando lo introducimos hasta la porcin cervical del tero.
Hasta la transferencia el catter puede ser conservado a temperatura ambiente (20C). El traslado
al lugar de transferencia debe hacerse evitando cambios de temperatura y en posicin horizontal.
Antes de la transferencia deber ser evaluada la presencia del cuerpo lteo y su calidad.
Una vez realizada la palpacin genital y el vaciado del recto, un asistente deber lavar y secar la
vulva y la zona perineal. Para los animales indciles se recomienda la administracin de anestesia
epidural (Lidocana 2%, 4 7 ml), para impedir las contracciones rectales y poder manipular el
tero eficazmente.
Para introducir el catter en la vagina se deben separar los labios de la vulva a fin de colocar ste
directamente en el vestbulo. Cuando la punta del catter est frente al cervix es importante que el
asistente tome los bordes de la camisa sanitaria y tire hacia atrs para liberar el catter. Si se
emplea vaina protectora plstica, el procedimiento puede realizarlo el mismo operador. E catter es
introducido en el cervix, su penetracin debe hacerse manipulando el rgano siempre por delante
del instrumento. Los movimientos son similares a los de IA, de dorsal a ventral y viceversa y a
ambos lados mientras se empuja, simultneamente, el catter.
La presin debe ser suave y sobre todo controlable, ya que si no corremos el riesgo de perforar el
cuerpo del tero.
Con los cuernos en posicin adecuada, el operador podr atravesar el ltimo anillo cervical e
ingresar al cuerno uterino ipsilateral a la ovulacin. Para ello se deber tomar suavemente el
cuerno y presentarlo frente a la punta del instrumento, algo ms levantado que el cervix.
Luego fijamos el cuerno uterino y estirando y empujando ligeramente el catter avanzamos hacia
craneal.

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Biotecnologa en Reproduccin Bovina

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La operacin debe repetirse introduciendo el catter en el cuerno lo necesario para superar la lnea
transversal que establece el ligamento ancho y tan profundamente como sea posible sin resistencia
alguna. Por ltimo depositamos el embrin y retiramos el catter.

TASA DE PREEZ:

La tasa de preez con esta tcnica vara entre 60 y 70% con embriones frescos y de buena calidad
(Schneider y col., 1980; Mc Evoy y Sreenan, 1990), 5060% con embriones producidos in vitro
(Liebrich, 1991) y obtenidos in vivo congelados/descongelados.
Infecciones provocadas al introducir el catter de transferencia, via vagina, en el tero,
particularmente susceptible de infecciones entre el da 6 8 del ciclo (Wright, 1981) y el grado de
sincronizacin que se establece entre la donante y las receptoras se suman a la lista de factores que
condicionan el xito de una transferencia. La probabilidad de gestacin depende tambin del
estadio en que se encuentra el embrin en el momento de la recoleccin. La transferencia de
mrulas tempranas, por ejemplo, alcanz una tasa de preez significativamente inferior (p< 0,05)
frente a otros estadios ms desarrollados (Schneider y col., 1980).
La transferencia de un solo embrin se lleva a cabo en el cuerno ipsilateral de acuerdo a la relacin
establecida entre el cuerpo lteo y el cuerno uterino adyacente. La transferencia de ms de un
embrin es posible llevarla a cabo en forma bilateral. Esto significa que un embrin debe ser
colocado siempre en el cuerno ipsilateral a la ovulacin.
La transferencia de un solo embrin en el cuerno contralateral provoca una alta mortalidad
embrionaria dado que las seales luteotrficas y antiluteolticas del embrin fallan en alcanzar el
CL del lado opuesto a la transferencia (Sreenan y Diskin, 1987).
El empleo reiterado de receptoras abre el interrogante sobre cuntas veces puede repetirse la
transferencia a una misma receptora.
La transferencia de los embriones obtenidos o producidos constituye el ltimo paso de la tcnica,
su xito depender del grado de idoneidad y experiencia requeridos tambin para el resto de las
actividades. La tasa de preez obtenida no ser solo el producto de la transferencia por s sino de la
suma de las actividades realizadas hasta el momento y de los factores dependientes de la donante,
el semen, el embrin, la receptora. La competencia profesional en ejecutar con xito cada uno de los
diferentes pasos permitir alcanzar resultados ptimos y repetibles.
El mayor costo de un porgrama de transferencia de embriones est dado por el mantenimiento de
las receptoras (lugar, alimentacin, cuidados sanitarios y manejo), hasta que queden preadas.
Los resultados dependern de diversos factores, entre ellos: un correcto manejo de las donantes y
de las receptoras, la cantidad de embriones obtenidos por donante y su calidad y el porcentaje de
preez. Estos resultados se pueden ver afectados por las prdidas embrionarias.
La TE conduce a que vientres inferiores produzcan terneros superiores.

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CRIOPRESERVACIN DE EMBRIONES
INTRODUCCIN
Es tambin mal llamada congelacin de embriones (simple paso de la fase lquida a slida).
Ha adquirido importancia debido a la libre importacin de embriones y a la difusin de esta
tecnologa con embriones nacionales, as como para transportar los embriones producidos por FIV
y por OPU-FIV.
Se destaca la importancia que tiene el hecho de conocer la teoria y los diferentes mtodos de
congelacin embrionaria.
Existen 2 elementos fundamentales a tener en cuenta con referencia al embrin:
1) Tiene un contenido de 80 % de H20.
2) Se comporta como una membrana semi-permeable, por tanto reacciona a las diferencias
de concentraciones osmticas que hay en el medio en el cual se encuentra.
Por ej. tenemos un blastocisto excelente y lo sometemos a un proceso de congelacin ultrarpido
(de temperatura de laboratorio directamente a N2 lquido), debido al alto contenido de H20 en su
interior, hay cristalizacin y muerte de la unidad embrionaria como tal.

Si lo sometemos a un proceso ultralento (con una disminucin lenta de


temperatura hasta -40 o -50 C, tambin se produce muerte celular debido al llamado EFECTO
SOLUCION, cuando el embrin se congela lentamente en el medio extracelular hay
cristalizacin. El cristal de hielo se comporta como secuestro de agua, en el medio extracelular
aumenta la concentracin del mismo y el embrin reacciona perdiendo agua para equilibrar, como
esta deshidratacin es tan brusca, se produce la muerte embrionaria.
Hay sustancias o agentes en la naturaleza, que tienen la propiedad de disminuir (no eliminar), la
accin deletrea del efecto solucin cuando sometemos al embrin a una disminucin lenta de
temperatura; son los llamados agentes crioprotectores.
Debemos tener en cuenta que para someter a los embriones a las diferentes tcnicas de
criopreservacin estos deben ser mrulas compactas o blastocistos de buena o excelente calidad
(entre los das 6 y 8).

Mrula compacta de excelente calidad

Blastocisto expandido de excelente calidad

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Biotecnologa en Reproduccin Bovina


Habitualmente los embriones congelados son descongelados y evaluados luego de la remocin de la
sustancia crioprotectora antes de ser transferidos.
En los ltimos aos se han desarrollado sistemas ms simples que permiten la transferencia directa
de los embriones descongelados sin extraerlos de la pajuela en la que han sido congelados, en
forma similar al procedimiento de inseminacin artificial (Leibo 1984, 1986; Massip y Van der
Zwalmen, 1984; Massip y col., 1987; Suzuki y col.; 1990; Voelkel y Hu, 1992; Dochi y col. 1995).

Por otro lado, el mtodo de vitrificacin, an en experimentacin, permite la preservacin de los


embriones a travs de una extrema elevacin de la viscosidad con altas concentraciones de
sustancias crioprotectoras que solidifican sin permitir la formacin de cristales de hielo
intracelular.
Este mtodo tiene la ventaja de que no es necesario utilizar congeladores automticos
programables (Ishimori, H. Y col. 1992).
Se pueden esperar altas tasas de gestacin cuando los embriones bovinos son mantenidos a
temperatura de laboratorio durante 12 a 18 horas antes de ser transferidos; no as cuando los
embriones son mantenidos a temperatura de laboratorio durante 4 a 6 horas antes de la
congelacin, debido a que luego de la descongelacin las tasas de sobrevivencia disminuyen
notablemente. Si los embriones son recuperados para ser sometidos a la criopreservacin, estos
tienen que ser procesados lo ms temprano posible posterior a la coleccin, o refrigerados
hasta que sea posible congelarlos.

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AGENTES CRIPROTECTORES:
Permeables:
Glicerol - D.M.S.O. - Etilenglicol
Accin: reducen el efecto solucin
reducen la cristalizacin intracelular
Condiciones:
para actuar deben permanecer en fase lquida cuando la temperatura
disminuya
no deben cristalizar cuando se formen los primeros cristales de hielo en el
medio extracelular.
No permeables:
Sucrosa (sacarosa)
Accin: modifican el balance osmtico del embrin
Condiciones:
concentracin= 1 - 2 M
son efectivos en congelacin lenta controlada
no son efectivos en congelacin rpida

La utilizacin de agentes cricprctectores, es esencial para el xito de la tcnica.


Otro factor clave para el xito es la deshidratacin, con lo cual disminuye la formacin de cristales
intracelulares.
No se hace una deshidratacin completa y en funcin de los diferentes grados de deshidratacin, se
clasifican los distintos mtodos de criopreservacin.
A) METODO CONVENCIONAL:
- Impide la cristalizacin intracelular mediante un proceso de deshidratacin osmtica del embrin,
durante un proceso de enfriamiento lento y controlado.
- Una vez parcialmente deshidratado, se sumerge en N2 lquido.
B) MTODOS ALTERNATIVOS:
- Reducen o eliminan la deshidratacin durante el proceso de congelacin.
- La deshidratacin se hace antes del proceso.
Hay diferentes mtodos en funcin de grado de deshidratacin y cristalizacin:
Mtodo Takeda-Elsden-Seidel:
- Deshidratacin con alta concentracin de glicerol y sucrosa.
- Se sumerge en N2 liquido directamente.
Mtodo de Vitrificacin:
- Grado mximo de deshidratacin con 1-2 Propanediol
- Sin cristalizacin
- Directamente a N2 lquido.

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Biotecnologa en Reproduccin Bovina

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MTODO CONVENCIONAL
Proceso de GLICEROLIZACION (incorporacin del glicerol o DMSO al embrin):
Se coloca el embrin en una solucin de PBS-glicerol 1.36 M (es el mejor agente crioprotector). El
embrin en PBS y SFb tiene una osmolaridad de aproximadamente 300 miliosmoles. Si colocamos
el embrin en el lquido, pasa de 300 a 2300 a una solucin hiperconcentrada. Como el embrin se
comporta como una membrana semipermeable, pierde agua y entra glicerol. A la temperatura (T)
ambiente (20-25 C), la velocidad de difusin del H20 es mucho mayor que la del glicerol y el
coefeciente de permeabilidad del H20 es tambin mayor.
A mayor T mayor velocidad de difusin del H20.
A menor T menor velocidad de difusin del H20.
La velocidad de difusin del agua a travs de la membrana embrionaria es directamente
proporcional a la temperatura.
Primero sale mucha H20 y entra poco glicerol pero como va a tender al equilibrio vuelve a entrar
H20 al embrin para equilibrar. De todos modos se logra que entre glicerol.
Tcnica:

1- Seleccin del embrin por Score

2- Adicin del agente crioprotector:

La deshidratacin que se produce en la glicerolizacin puede ser tan grande que disminuya la
vitalidad del embrin, por eso en un principio se recomienda hacerla en 3 etapas:
- PBS-Glicerol (PBS-G) 0.4 M hasta el equilibrio 5 minutos
- PBS-G 0.8 M hasta el equilibrio - 4 a 10 minutos
- PBS-G 1.36 M 10 minutos (9 ml de PBS - 1 ml glicerol)

Esto significa que debemos realizar varias concentraciones de PBS-G y pipetear el embrion en cada
una de ellas y dejarlo tiempo para que equilibre, maniobra que se hace laboriosa cuando hay que
preparar las soluciones y ms an cuando trabajamos con varios embriones.
Este paso se puede realizar mediante la adicin a una solucin de m-PBS de Glicerol (G) a 1,36 M,
durante 15 minutos a temperatura ambiente de laboratorio.

3- Colocacin del embrin en pajuela de 0.25 ml (Francia). El embrin est en la columna central de
solucin de PBS - G. La pajuela tendr tres columnas separadas por burbujas de aire, 2 solamente
de solucin y la central con el embrin en la solucin crioprotectora.
Disposicion de las columnas en metodo convencional:

tapn

PBS-G

PBS-G + embrin

4- Descenso a T de SEEDING (descenso de la T a 1 C/minuto)

PBS-G

sello

5- SEEDING (induccin de la cristalizacin extracelular), se realiza a los -7 C, manteniendo las


pajuelas 10 minutos. Induccin manual de cristales de hielo, en el medio extracelular, tocando la
pajuela con un forceps previamente enfriado en nitrgeno lquido.

Biotecnologa en Reproduccin Bovina


Curva programada de congelacin de embriones:

Por qu se realiza el seeding?


La solucin PBS-Glicerol, con el embrin en su interior, tiene un punto real de congelacin entre -3
a -4 C, por tanto debera cristalizar a esta temperatura, pero como trabajamos con volumenes
chicos (0.25 de la pajuela) y disminucin lenta de temperatura (1 C/min), se produce un fenmeno
en el cual se observa que cuando esa solucin llega al punto real de congelacin, an permanece en
fase lquida. Este fenmeno se conoce como SUPER-ENFRIAMIENTO O SUPER-COOLING.
Debemos producir la cristalizacin del H20 extracelular para producir el secuestro de H20 en dicho
compartimiento y por tanto hacerlo progresivamente ms concentrado para que el embrin,
respondiendo osmoticamente a un medio hipertnico pierda agua y se deshidrate. Esta induccin
de la cristalizacin extracelular se denomina SEEDING. Por medio de l evitamos el
superenfriamiento.
La velocidad de difusin del H20 a temperaturas sub-cero es lenta (recordemos que la velocidad de
difusin del agua a travs de la membrana es directamente proporcional a la temperatura), por lo
que se necesita tiempo, se disminuye la T a razn de slo 0.3 C/min para que exista el tiempo
necesario para que el agua salga del embrin.
Si no hacemos seeding, el medio permanece lquido y no hay deshidratacin. La cristalizacin
espontnea se produce entre -15 C y -17 C.
Debido a la energa liberada por el pasaje de una fase lquida a una fase slida, hay un aumento
brusco de temperatura que tiende a acercarse al punto real de congelacin de la solucin en
cuestin (-3 o -4 C) seguida por un nuevo y rpido descenso a la temperatura anterior.
Este aumento/descenso de temperatura es letal para el embrin. Significa entonces que al llegar a
17 C se produce la cristalizacin espontnea la que genera un aumento de temperatura de casi 12
C para luego bajar nuevamente a -17 C. Adems se modifica la curva de enfriamiento de tal modo
que de 0.3 C/minuto (que es lo que pretendemos) se pasa una velocidad de descenso de casi 10
C/minuto.
Al inducir el Seeding, tambin pasa lo mismo, pero como estamos cerca del punto de congelacin
real, ese aumento no es tan brusco y el pasaje a la normalidad es tambin gradual. Por eso el
Seeding se hace entre los -5 C y -7 C, manteniendo la temperatura durante 10 minutos. El seeding
se realiza con en frceps introducido en N2 lquido que se pone en contacto con la pajuela, en un
extremo de la columna de medio, lo ms lejos posible del embrin. La columna de hielo que
inducimos va a avanzar sola por la pajuela, lo que demora entre 4 y 5 minutos.
6- Velocidad de descenso de T (curva de enfriamiento). Se desciende la temperatura a una
velocidad de 0,3C/minuto hasta llegar a 35 C. La disminucin se hace lenta para que el embrin
se deshidrate. Esto se hace con un equipo de enfriamiento programable.

7- A los -35 C la deshidratacin es del 90% y se introduce la pajuela en N2 lquido porque la


congelacin intracelular va a ser mnima.

29

Biotecnologa en Reproduccin Bovina

30

Proceso de criopreservacin de embriones en mquina programable (a); seeding (b) e inmersin en nitrgeno lquido (c)

8- Descongelacin:
Se descongelan las pajuelas al aire a la temperatura de laboratorio, pero no menor de 25 C. Se
coloca en Bao Mara, no menos de 25 C, 30 segundos.
Luego secamos la pajuela, cortamos los extremos y ponemos su contenido en una caja de Petri.
Si colocamos el embrin directamente en PBS isotnico, al estar el medio extracelular hipotnico,
sucede lo inverso a cuando se gliceroliza, es decir que entra agua al embrin y como lo hace en
forma rpida el embrin se rompe. Esto se evita lavando el embrin en baos sucesivos de
concentraciones decrecientes de PBS-Glicerol, para controlar la entrada de agua y que no "estalle"
el embrin.
9- Extraccin del Crio-protector:
Se introduce el embrin en concentraciones decrecientes de PBS-Glicerol:
- 0.5 M PBS Glicerol 6 minutos
- 0.3 M PBS Glicerol 6 minutos
- PBS + 10% de SFb.

Tambin se puede poner en una solucin de PBS-SUCROSA 1M de 10 a 15 minutos. La sucrosa no


entra al embrin dado que es un agente crioprotector que no pasa las membranas biolgicas,
entonces hace al medio extracelular hiperosmtico: el embrin pierde agua y glicerol (se deshidrata
nuevamente) y despes lo ponemos en PBS-SFb, para rehidratarlo antes de implantarlo.
10- Implante: Se sincronizan las vacas receptoras segn morfologa y cronologa del embrin y se
realiza el implante en el cuerno uterino ipsilateral al CL segn la tcnica de implante de embriones
descrita en el captulo anterior (de Transferencia de Embriones).

Biotecnologa en Reproduccin Bovina

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METODO DE LEIBO
A travs de este mtodo, se evita la manipulacin en el laboratorio para extraer el glicerol. Su
objetivo final es que este proceso ocurra dentro de la misma pajuela donde se congela el embrin.
Se realiza la extraccin del glicerol dentro de la propia pajuela mezclando las columnas mediante
un pequeo golpe con los dedos en las burbujas de aire o agitndolas y se coloca la pajuela
directamente en la pistola para implantar.
Tiene la desventaja de disminuir los porcentajes de gestacin a un 30%, en tanto que con el otro
sistema es del 45 al 50%.
Ventajas:
- No utiliza lupa
- Transferencia similar a la inseminacin artificial practicable a condiciones de campo

Tcnica:
Se carga la pajuela con una gran columna de PBS-Sucrosa 1,08 M, luego una pequea columna de
aire seguida de otra columna con PBS-Glicerol con el embrin, otra columna de aire y una pequea
de PBS-Glicerol 1,5 M.
Disposicion de las columnas en metodo de leibo:

tapn

PBS-Sucrosa 1,08 M

PBS-G + embrin

PBS-G

sello

Para el implante, cuando la pajuela est pronta (descongelada), se da un golpecito con 2 dedos en
las burbujas de aire para mezclar las columnas y la ponemos vertical con el tapn hacia abajo para
que el embrin descienda. Abajo queda la sucrosa y arriba el glicerol, el embrin queda en contacto
con PBS-Sucrosa y pierde el glicerol que tiene en su interior. Se debe dejar 20 minutos para que se
realice el proceso.
La rehidratacin se da directamente en el tero, que le aporta agua.

METODO CON ETILENGLICOL


La utilizacin del etilenglicol como crioprotector es una alternativa prctica. Este posee un alto
coeficiente de permeabilidad celular de tal forma que los embriones despus de descongelada la
pajuela se implantan directamente, por tanto no existe la expansin por sobrehidratacin con
posterior muerte embrionaria que se observa en el caso del glicerol o del DMSO.
La posibilidad de estandarizar un mtodo de criopreservacin con una tasa aceptable de
gestacin, que permita transferir los embriones congelados directamente a las receptoras luego de
la descongelacin constituira sin duda alguna en el mtodo de eleccin universal.
El mtodo con etilenglicol tendra la ventaja de una mayor practicidad a nivel de la produccin ya
que permite implantar en forma directa el embrin una vez descongelada la pajuela a 30 grados, a
condicin de que la transferencia se realice dentro de los 10 minutos siguientes a la descongelacin.
Tcnica:
1- El embrin una vez lavado por sucesivos pasos en PBS con 20% de SFb, se mantiene 20 minutos
en una concentracin de 1.8 M de etilenglicol (10% v/v), en PBS + 20% de SFb.
2- Se aspira en una pajuela de 0,25 ml de manera que quede una columna de PBS-EG separada de 2
columnas de PBS isotnico a travs de 2 pequeas burbujas de aire.

Biotecnologa en Reproduccin Bovina

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Disposicion de las columnas en metodo con etilenglicol:

tapn

PBS

PBS-EG + embrin

PBS

sello

3- Inmersin de la pajuela directamente a 7C utilizando la mquina programable con alcohol


metlico.
4- Induccin manual de cristales de hielo en el medio extracelular (seeding) a -7C manteniendo
10 minutos a esa temperatura para permitir el equilibrio de las soluciones.
5- Descenso de la temperatura a una velocidad de 0,3 C/min hasta alcanzar los 30 C.
6- Se equilibra 15 minutos.
7- Se sumerge la pajuela en N2 lquido.
8 Descongelacin: Se descongela la pajuela a bao mara a 30C durante 20 segundos.

9 Implante: Se realiza la transferencia por el mtodo no quirrgico inmediatamente en receptoras


sincronizadas al estado del desarrollo del embrin a implantar. No deben pasar ms de 10 minutos
entre la descongelacin de la pajuela y el implante en la receptora. El mximo es 20 minutos, debido
a que el Etilenglicol es ms txico que el Glicerol. Son de destacar los resultados de nuestro
laboratorio (Larocca y col., 1997).

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ANEXO
Preparacin de las soluciones stock
Las soluciones stock servirn para componer los medios para las respectivas etapas.
Las soluciones a preparar son:

SOLUCIONES STOCK

MEDIOS DE CULTIVO

PBS (+) (Buffer Fosfato Salino)

m-PBS Medio de aspiracin y lavado de


ovocitos

TCM-199 (medio de maduracin con sales de Earl)

M-TCM-199 Medio de maduracin


D-TCM-199 Medio de desarrollo

BO Stock (Soluciones A y B) (Brackett and Oliphant)

BO de lavado de semen

BO de lavado de ovocitos
BO de dilucin de semen

CR1aa (Soluciones A y B)

CR1aa Medio de desarrollo

D-PBS (Sol uci n Stoc k)


Se describe la preparacin de 1 litro de solucin en base los sobres Nissui Co Ltd, que vienen prontos para
constituir las soluciones. En caso de preparar la mitad (500 ml) utilizar la mitad de todos los reactivos.
1) Disolver el sobre A (PBS (-), piruvato de sodio y glucosa en 800 ml (o 400 ml) de agua ultra pura.
Para preparar:

1 ltr

500 ml

Agua BD, aforar a

800 ml

400 ml

PBS (-) (sobre A, Nissui Co Ltd)

10,6 g

5,3 g

2) Aparte disolver el sobre B de sales metlicas (CaCl 2) en agua bidestilada.


Sales metlicas, CaCl2 (sobre B)
Agua BD, aforar a

0,1 g

200 ml

0,05 g

100 ml

3) Mezclar ambas soluciones.


4) Filtrar con filtros 0.22

Conservar refrigerado (4 5 C) por 30 a 45 das.

PBS Buffe r

Para preparar la solucin a partir de los reactivos (en caso de no haber sobres de PBS); PBS Buffer de fosfatos pH
7.4 (1%) (para 500 ml).
1). Agua ultra pura

400 ml

3). KCl

0.1 g

2). NaCl

4). Na2HPO4
5). KH2PO4

6). Aforar hasta


7). Ajustar pH

8). Conservar a 4 - 5 C

Es estable por 2 meses.

4g

0.72 g
0.12 g

500 ml

7.4 con HCl

Desechar estas soluciones si aparecen cambios de coloracin o precipitados.

33

Biotecnologa en Reproduccin Bovina

34

m -PBS Medio de aspirac in y lavad o de ovocitos


Para preparar

50 ml

Penicilina

5.000 UI

D-PBS (+) (Sol Stock)


Estreptomicina

SFb (suero fetal bov) (3%)

Aclaracin:
Dosificacin del
antibitico: partiendo
de una solucin
Penicilina-Estrepto de
10.000 UI/ml de
Penicilina y 10 mg/ml
de Estreptomicina,
usar 500 l

48.50 ml
5 mg

1.5 ml

A 48.50 ml de la solucin stock se le agregan los antibiticos y el suero.


Se filtra (0,22 ).

Esta preparacin debe utilizarse dentro de las 24 hs de preparado, lo que no se usa en este perodo se descarta. Se
guarda en heladera sellado con parafilm hasta el momento de la obtencin de los COCs, se pone en bao Mara
antes del trabajo para templarlo.
M-TCM-199 Medio de mad uraci n
Para preparar

20 ml

40 ml

Penicilina

2.000 UI

4.000 UI

TCM-199 (c/sales de Earl, 0.25 Mm Hepes)


Estreptomicina

Suero fetal bovino (5%)

Licor Folicular bovino (10%)

17 ml
2 mg
1 ml
2 ml

34 ml
4 mg
2 ml
4 ml

Filtrar (0.22 )

Colocar en estufa con tapa floja (38C y 5% de CO 2 y 100% de humedad)

Antes de llevarlo a estufa se puede preparar las cajas de Petri con solucin para lavado y las gotas para
maduracin cubiertas con aceite mineral y se colocan de inmediato en la estufa con atmsfera controlada.
Preparac in del l icor folicular:
Se puncionan folculos preovulatorios de ms de 8 mm de dimetro y se transfiere a tubos de centrfuga. Se
centrifuga a 800 G (2.500 rpm) durante 30 minutos. Se decanta. El lquido sobrenadante se inactiva en bao Mara
a 56 C durante 30 minutos; se fracciona en tubos pequeos o crioviales y se almacena congelado.

Soluci n BO (Brac kett a nd Ol ipha nt) (Sol ucin Stock) (Brackett and Oliphant, 1975)
Soluci n A (250 ml)
Se disuelven en orden los siguientes componentes:
Agua ultra pura

200 ml aprox

KCl

0,0987 g

NaCl

CaCl2-2H2O

NaH2PO4-2H2O
MgCl2-6H2O

Rojo Fenol (solucin 0,5%)


Agua ultra pura

Filtrar con filtro 0,22

El lquido queda de color amarillo.


Se conserva refrigerado.

2,1546 g
0,1085 g
0,0420 g

0,03485 g
50 l

enrazar a 250 ml

Biotecnologa en Reproduccin Bovina

35

Soluci n B (100 ml)


Agua ultra pura

80 ml aprox

Rojo Fenol (solucin 0,5 %)

20 l

NaHCO3

Agua ultra pura

Filtrar con filtro 0,22

1,2937 g

enrazar a 100 ml

Luego de componer la solucin se burbujea con CO2 hasta que adquiera un color salmn, se sella con parafilm y se
guarda en heladera.
Las soluciones A y B, son soluciones stock, al igual que todas las soluciones almacenadas, se guardan selladas con
parafilm y refrigeradas, se pueden conservar hasta 30 45 das en esas condiciones.
Preparac in de las Soluc iones BO (Norio S, 1994 ).
Soluci n BO inicial ( 60 ml) (no stoc k):
Solucin A

46 ml

Penicilina

6.000 UI

Piruvato de Sodio
Estreptomicina
Solucin B

0,0083 g
6 mg

14 ml

Para la preparacin se agrega a la solucin A el piruvato de sodio y los antibiticos, luego se agrega la solucin B y
se homogeiniza.

De esta solucin se preparan los medios de lavado de semen, de lavado de ovocitos y de dilucin de semen, como
se explica a continuacin:
BO de lavado de semen (5 0 ml):
Solucin BO

20 ml

Heparina (sol. de 1.000 UI/ml)

100 l (o 100 UI)

Cafena benzoato de Na

Filtrar con filtros de 0,22

0,0777 g

El lquido queda de color rosado plido


BO de lavado de ovocitos ( 25 ml):
Solucin BO

Albmina cristalizada de suero bovino


Filtrar con filtros de 0,22

20 ml

200 mg

El lquido queda amarillo plido


BO de diluci n de seme n (25 ml):
Solucin BO

Albmina cristalizada de suero bovino


Filtrar con filtros de 0,22

20 ml

400 mg

Para preparar una solucin


de Heparina, disolver 50
mg de Heparina en 2,5 ml
de solucin BO. Colocar en
crioviales de 50 l en el
freezer. Cada criovial
proporciona las 250 UI

El lquido queda amarillo plido


Las tres soluciones se almacenan en refrigerador hasta su uso (se pueden conservar hasta 24 hs)

Estos medios se colocan en la estufa con tapa floja para equilibrar con el CO2 y la temperatura, por lo menos 60
minutos antes de la fertilizacin.

Biotecnologa en Reproduccin Bovina

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D-TCM-199 Medio de desarroll o


En caso de utilizar este medio de cultivo, el desarrollo se debe realizar en cocultivo con clulas de la granulosa que
cultivamos en la etapa de obtencin de ovocitos como lo describimos anteriormente.
Preparar entre 3 y 12 horas antes.
Para preparar 20 ml de medio:

TCM-199 (c/sales de Earl, 0.25 Mm Hepes)

15 ml

Estreptomicina

2 mg

Penicilina

Suero fetal bovino (5%)


Licor Folicular (15%)

2.000 UI
1 ml

Aclaracin:
Dosificacin del antibitico:
partiendo de una solucin
Penicilina-Estrepto de
10.000 UI/ml de Penicilina
y 10 mg/ml de
Estreptomicina, usar 200 l

3 ml

1) Disolver 17 ml de solucin TCM-199 con los antibiticos


2) Filtrar (0.22 ) (antes de agregar los sueros)
3) Agregar el SFB y el LF

4) Colocar en estufa con tapa floja (38C y 5% de CO2 y 90-100% de humedad)


CR1aa (medio de desa rrol lo) (S oluc in Stock)
Soluci n A (385 ml)
NaCl

3.3505 g

Na Pyruvate

0.0220 g

KCl

NaHCO3

Rojo Fenol (solucin al 0,5%)


Agua ultra pura

Filtrar con filtro 0,22

0.1155 g
1.1005 g
250 l

enrazar a 385 ml

El lquido queda de color rosado.


Se conserva refrigerado.

Soluci n B (100 ml)


Hemicalcium Lactate
Agua ultra pura

Esterilizar por filtracin

0.2998 g

enrazar a 100 ml

El lquido queda traslcido.

Las soluciones A y B pueden ser almacenadas por un mes en el refrigerador.

Las soluciones A y B, son soluciones stock, se guardan selladas con parafilm y refrigeradas, se pueden conservar
hasta 30 45 das en esas condiciones.

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CR1aa Medio de desarroll o


Se prepara el medio CR1aa a partir de las soluciones stock (A y B).

Se adicionan y se mezclan uno por uno los siguientes componentes:


Para 50 ml:

Para 20 ml:

Solucin A

38.5 ml

15 ml

BME aminocidos esenciales

0.5 ml

0,2 ml

Solucin B

MEM aminocidos no esenciales


cido L Glutmico (20 mg/ml)
Penicilina G

Estreptomicina Sulfato

Albmina de suero bovino


Se filtra (0.22 )

10 ml

0.5 ml
0.5 ml

5.000 UI
5 mg

150 mg

4 ml

0,2 ml
0,2 ml

2.000 UI
2 mg

60 mg

El lquido es amarillo.

Se puede almacenar en el refrigerador por 1 semana.

Antes de su uso se adiciona con 5% de SFb y se forman las gotas de maduracin previo remocin de los cmulus.

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Biotecnologa en Reproduccin Bovina

38

Soluci ones para criop reservaci n

MTODO CONVENCIONAL

Glicerol (G) 1,36 M en m-PBS:

0,99 ml de G, enrasar a 10 ml con m-PBS (con 20% de SFb)


Glicerol 0,8 M en m-PBS

0,58 ml de G, enrasar a 10 ml con m-PBS (con 20% de SFb)


Glicerol 0,5 M en m-PBS

0,36 ml de G, enrasar a 10 ml con m-PBS (con 20% de SFb)


Glicerol 0,4 M en m-PBS

0,29 ml de G, enrasar a 10 ml con m-PBS (con 20% de SFb)


Glicerol 0,3 M en m-PBS

0,22 ml de G, enrasar a 10 ml con m-PBS (con 20% de SFb)


Sucrosa 1 M en m-PBS

3,42 g de Sucrosa, enrasar a 10 ml con m-PBS (con 20% de SFb)


MTODO DE LEIBO

Glicerol 1,5 M en m-PBS

1,1 ml de G, enrasar a 10 ml con m-PBS (con 20% de SFb)


Sucrosa 1,08 M en m-PBS

3,7 g de Sucrosa, enrasar a 10 ml con m-PBS (con 20% de SFb)


MTODO DEL ETILENGLICOL

Etilenglicol (EG) 1,8 M en m-PBS:

1 ml de EG, enrasar a 10 ml con m-PBS (con 20% de SFb)

Biotecnologa en Reproduccin Bovina

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Biotecnologa en Reproduccin Bovina

Biotecnologa en Reproduccin Bovina

Reservados los derechos de todas las imgenes.

Prohibida su reproduccin sin autorizacin de los autores.


Publicacin financiada por MEAAP-UDELAR

(Mtodos Alternativos de Aprendizaje, Universidad de la Repblica)

Facultad de Veterinaria Universidad de la Repblica


Departamento de Reproduccin Animal
rea de Biotecnologa

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