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Transferencia de Embriones en Bovinos

INTRODUCCI N La Transferencia de Embriones (T.E.) era ya una realidad a principios de los aos 70s, cuando la Recuperacin de Embriones como la Transferencia era en forma quirrgica y por lo mismo era imposible aplicarla en Mxico, por los altos costos del equipo y del personal. La Transferencia de Embriones, tiene ms de 100 aos de antigedad ya que en 1980 se realiz la primera T.E. en conejos; en bovinos se obtuvo la primer cra hace ms de 50 aos (1951), pero su uso comercial empez entre los aos (19751976); al principio todo fue de forma quirrgica. Los primeros trabajos realizados en Mxico fueron en 1979, con el equipo del Dr. Cesar Soto trabajando con ganado cebuino y suizo. Yo tuve la oportunidad de tomar un curso de T.E., invitado por la compaa Carnation Genetic en el estado de California (7/junio/1979), que era entonces la pionera en T.E., el cual recordar toda mi vida. Se trabajaba 5 a 6 donadoras diarias de lunes a viernes, la gran mayora eran de raza Hostien, y un poco de ganado de carne (Simmental, Chianina y unas cuantas de raza Beefalo que eran cruza de Bisonte Americano con Brahaman o Charolais), esta ltima cruza era de un temperamento sumamente bravo, como si fuera ganado de lidia; as mismo, contaban con un grupo de excelentes receptoras, eran puras novillas de 15 a 17 meses de edad y eran aproximadamente 300 receptoras. Se empezaba a trabajar desde las 7 de la maana y se terminaba entre 5 y 7 de la noche. Afortunadamente la coleccin de Embriones era con el mtodo no quirrgico que se acababa de implementar. Con el uso de probetas para decantar los embriones no se utilizaban filtros para concentrar los embriones, ya que anteriormente se haca con el mtodo quirrgico. Sin embargo la aplicacin o transferencia de embriones se haca por el mtodo quirrgico en una sala estril como un quirfano vestidos con bata, gorro, cubre boca y se utilizaba anestesia entubada, as mismo se contaba con mesas porttiles e hidrulicas por cada vaca

operada, la incisin se haca delante de la ubre, sobre la lnea media de 12 a 15 cm de longitud. El embrin era implantado a la mitad o en el ltimo tercio del cuerno uterino que tena el cuerpo lteo (+/- 7-8 das de haber presentado el celo). Todo me pareci maravilloso, aprend toda la tcnica de superovulacin, sincronizacin de donadoras con receptoras, preparacin de medios de lavado e implante, lavado o recoleccin de embriones, bsqueda y clasificacin de embriones, esterilizacin y manejo de equipo, etc. Lo que no me pareci prctico fue que se necesitaba todo un equipo de anestesia intubada, mesa quirrgica entre otros; por lo cual se me haca imposible llevarla a cabo en Mxico por el alto costo. Platiqu con mi instructor y jefe de la clnica que todo estaba muy bien, pero se me haca imposible hacerlo por el mtodo quirrgico con anestesia intubada en Mxico, por el alto costo de todo el material y equipo que se necesitaba; por lo que le coment que por que no lo hacamos con la vaca de pi, metida en una prensa con tranquilizante, con anestesia local y con un bloqueo epdural por el flanco izquierdo o derecho, ya que esto se me haca ms factible realizarlo en Mxico. Me comento que era una buena opcin, siempre y cuando yo anestesiara a la vaca. Operamos dos vacas al da siguiente sin problemas y descubr que esta era la solucin para realizar la T.E. en Mxico, nicamente teniendo una prensa o chut y un cuarto cerrado que sirviera como cuarto de operaciones, y teniendo la vaca tranquilizada. As como un pequeo laboratorio para bsqueda y manejo de embriones. Regres a Mxico y realizamos la primer Transferencia en el Rancho La Cotera en Ixtapaluca, Estado de Mxico (4/octubre/1979). Al principio convencer a los ganaderos de la Transferencia de Embriones (T.E.) era muy difcil, afortunadamente nuestros resultados eran muy buenos, por lo cual esto se comenz a difundir en todo el pas, se trabajaba con mucho ganado cebuino que estaba de moda (gyr, indobrasil, nelore y guzerat) y obtuvimos la primer cra gyr por transplante de embriones en Tizimin, Yucatn (18/septiembre/1985). Llegamos a operar 6000 vacas. Cuando empezaba la tcnica no quirrgica facilit mas las cosas. Tenamos un promedio de 58% de fertilidad; que era un promedio muy estable, en diferentes estados del pas. Al principio combinamos el mtodo quirrgico y el no quirrgico para comprobar resultados. En 1994 todos los implantes se realizaron en forma no quirrgica hasta la fecha. En mayo del 85 tom un curso de congelacin de embriones, utilizando glicerol, por que muchas veces nos sobraban embriones y tenamos que tirarlos. Han pasado ms de 30 aos y la tcnica se ha simplificado tanto que ya se realiza en diversos ranchos de forma rutinaria casi en todo el pas.

Contamos con veterinarios de mucha experiencia en varios Estados de la Repblica, lo que antes era imposible. Nuevas tcnicas se han implementado a la Transferencia de Embriones (T.E.), como la aplicacin no quirrgica de embriones, la congelacin y descongelacin directa de embriones con etilenglicol (1992) sin necesidad de un microscopio que un tcnico con experiencia en Inseminacin artificial lo puede realizar. La fertilizacin in vitro que es otra maravilla de la tecnologa y que ya se trabaja en el pas en por lo menos 3 laboratorios comerciales. Tambin se est realizando la biparticin de embriones para sacar el mximo provecho. El sexaje de embriones por DNA. El semen sexado para la Inseminacin Artificial o para la fertilizacin in vitro. En Mxico ya existen compaas que venden todo el material necesario para la Transferencia de Embriones (procows@prodigy.net.mx). La tecnologa est a nuestro alcance, lo que hace 30 aos era imposible, est ya en nuestras manos. La investigacin sigue y el futuro es muy alentador. El futuro nos est alcanzando.

IMPORTANCIA DE DONADORAS Y RECEPTORAS

FUNCIN DE LAS RECEPTORAS La principal funcin es incubar el embrin y alimentarlo hasta el parto, mediante los anticuerpos del calostro, protegerlo y amamantarlo durante los primeros meses de vida. El principal objetivo es obtener el mayor nmero de preeces por donadora, las receptoras tiene que ser muy frtiles. SELECCIN DE RECEPTORAS.
Para la seleccin de receptoras debemos de considerar diversos factores como son:

1) Sanidad: que se encuentren libres de enfermedades contagiosas y vacunadas contra todas las enfermedades que causen aborto, as como otras enfermedades que afecten en la zona. 2) Reproductivo: revisin ginecolgica rectal y vaginal en el cual solo los animales normales sern escogidos para estos programas. Las vacas viejas y las vacas o novillas repetidoras sern excluidas de este programa. 3) Aptitud materna: que sean buenas productoras de leche, as como mantener sano y fuerte un ternero de alto valor gentico.

4) Estructura plvica: que sea ptima y amplia para evitar partos difciles. 5) Identificacin de receptoras: con aretes de color en ambas orejas o marcado con fuego o nitrgeno lquido en las piernas o costillas, es muy importante su identificacin, para tener un mayor control de celos, preeces y manejo.

FACTORES IMPORTANTES EN LA SELECCIN Y MANEJO DE RECEPTORAS.


1.- Raza 2.- Biotipo. 3.- Funcionabilidad y adaptacin.

4.- Origen. 5.- Examen clnico. 6.- Nmero e identificacin. 7.- Sincronizacin de celos. 8.- Combinacin de Transferencia Embrionaria e Inseminacin Artificial.

Los factores ms importantes que afectan el costo de la T.E. son: el grupo de receptoras, porcentaje de preez, abortos y prdidas perinatales por partos distcicos. Para el ganadero el mayor costo de la transferencia embrionaria T.E., es el mantenimiento de receptoras hasta que queden preadas. Este es el factor econmico ms importante de todo el programa; as mismo el nmero de receptoras implican un capital, ocupan campo y se alimentan. El porcentaje de preeces depende en gran parte del manejo y la fertilidad de las receptoras, as como tambin de la experiencia y la habilidad de los tcnicos. La inversin en hormonas, materiales, as como los honorarios profesionales ocupan un menor costo dentro del programa de Transferencia de Embriones.
Nmero de receptoras En zonas templadas el nmero de receptoras por cada embrin disponible es de 1.5 a 2 receptoras. En zonas tropicales se necesitan 2 a 2.5 receptoras cruzadas de razas bos ndicus con bos taurus por cada embrin disponible, debido a que el porcentaje de sincronizacin del celo es 60% en zonas tropicales, pero el ndice de aprovechamiento es de un 52%, se desecha a la palpacin +/- un 15%, por que no ovularon, por que no tienen un cuerpo lteo palpable, por que sali con quistes, etc. Oportunidad de las receptoras. Como una norma, las receptoras 2 oportunidades para quedar preadas, se envan con el toro para monta directa o se inseminan si salen vacas a la palpacin; posteriormente se revisan entre 35 a 40 das de preez y se vuelven a rechecar entre 60 a 90 das de gestacin. Edad de las receptoras. Las novillonas o vaquillas vrgenes tienen una gran ventaja, debido a que consumen menos alimento, responden mejor a la sincronizacin y se obtiene un porcentaje 5 a 10% superior a las vacas adultas, la nica desventaja contra las vacas adultas, es que pueden tener mayores problemas durante el parto y menor produccin de leche. Sincronizacin de receptoras. Es importante que las receptoras estn recibiendo una racin bien balanceada con minerales, que estn en balance energtico positivo, con una buena ganancia diaria de peso, desparasitadas y vacunadas contra todas las enfermedades que producen aborto. Es importante sincronizar el grupo de receptoras para que salga en celo (+/-) 24 horas antes o (+/-) 24 horas despus del celo de la donadora.

Lo ideal es que salgan a la misma hora que la donadora, sin embargo esto es muy difcil. Altas preeces son adquiridas cuando la sincronizacin es muy exacta. Embriones colectados de una donadora al da 7 de su ciclo, debern ser transferidos en receptoras del da 6, 7 u 8 de su ciclo, tenemos varias opciones que puede ser a calor natural que coincida con el ciclo de la donadora. Otra opcin es a base de implantes en la oreja conteniendo Norgestomet, combinado con 2 ml de Norgestomet (Valerato de Estradiol) inyectados. Aproximadamente un 80% de los animales implantados demuestran celo 36 horas despus de haber removido el implante de la oreja. A los 9 o 10 das de su implante se retiran 48 horas antes del celo esperado de la donadora. Algunos veterinarios aplican prostaglandina conjuntamente en el retiro del implante. Otra eleccin puede ser el uso de prostaglandinas, con una o doble inyeccin, con un lapso de 10 a 13 das, aplicado la 2 inyeccin 30 o 48 horas antes del celo esperado de la donadora, para que se aglutinen los celos muy cerca de la donadora. Los resultados de fertilidad, son muy similares entre prostaglandinas y progestgenos (implantes) cuando el porcentaje de los celos observados es bajo, coincide con ciertos inconvenientes como: lluvias, nortes, tormentas y viento, bajo estas condiciones los animales sufren estrs y no manifiestan la conducta estral, as mismo, el propio porcentaje de las receptoras que se llegan a implantar son muy bajos. Como recomendacin final, se sugiere tener el doble de receptoras disponibles, sobre el nmero de embriones que se van a transferir, para escoger las ms aptas y obtener ms alto el porcentaje de preez.

ESQUEMAS DE LA SUPEROVULACIN Y NUEVAS ESTRATEGIAS APLICADAS A LA SUPEROVULACIN Y TRANSFERENCIA DE EMBRIONES


El objetivo de los tratamientos superovulatorios en las vacas es obtener el mximo de embriones fertilizados y de la calidad transferible con alta probabilidad de producir gestaciones. Sin embargo la asicrona ovrica y las variaciones en las respuestas al tratamiento utilizado para la super estimulacin ovrica, es el principal factor limitante en la transferencia embrionaria para obtener una mejor produccin de embriones transferibles para hacer costeable esta prctica. Existen varios ejemplos de las respuestas superovulatorias de revisiones de programas experimentales y comerciales de transferencia embrionaria (T.E.) y su reporte incluye el ganado de carne 6.2 embriones transferibles colectados de cada vaca donadora; sin embargo, 24% de las colectas no producen embriones viables, 64% de las donadoras producen pocos embriones transferibles y solo el 30% de las colectas o lavados producen 70% de los embriones. Estos resultados reportados, revelan que existe un alto grado de valores impredecibles en la respuesta superovulatoria. El control de las ondas foliculares presenta una nueva alternativa y una nueva luz para mejorar y reducir estas variaciones. Tradicionalmente, en los programas de superovulacin en los bovinos de ha utilizado la deteccin del celo seguido por tratamientos de F.S.H. los das 9 a 11 del ciclo estral aproximadamente la mitad del ciclo estral.

P R O G R AM A P ARA S U P E R O VUL A C I N C O N F O LLT R O D S I NCRO N I Z AC I N D E CE L O S DE D O NAD O RA S P I N a

9 11 12 9 1 0 D a s 21 22 23 24

Po ne r im p la nte SM B + iny e cc in SM B pro s ta g la ndina CRE S T AR Q uita r im pla nte p ros ta g la n dina y ap lic a r 10 c c . D e V it E Se le n io e rv a r c a lore s. O bs

S U P E R O VU L A CI N
2 .4 m l. 2 .0 m l. 1 .6 m l. 1 .2 m l. (a .m .) FSH (a .m .) FSH (a .m .) FSH (a .m .) F S H + 5 cc . L u ta ly s e

2 .4 m l. FSH (p .m .) 2 .0 m l. FSH (p .m .) 1 .6 m l. FSH (p .m .) 1 .2 m l. de F S H + 5 c c. L u ta lys e (p .m .) 2 D a s D E T E C CI N DE CE L O S DE DO N ADO RA S 26 I.A . (p .m .) 27 I.A . (a .m .) 7 D as des p u s L av ad o y T ran s feren cia o C o ng elac in de E m b rio ne s. N o ta : 4 D a d e la s upe rov ulac in a p lic a r pr os ta g la nd inas a.m . y p .m .

Da 1 Da 2 Da 3 Da 4

Tabla de dosis para FOLLTROPIN (VETREPHARM, 35 mg/20ml) 14 mg. 20 mg. 24.5 mg. 30.8 mg. 35 mg. cc. cc. cc. cc. cc. a.m. 1.6 2.0 2.5 2.8 3.0 p.m. 1.6 2.0 2.5 2.8 3.0 a.m. 1.2 1.6 2.0 2.4 2.6 p.m. 1.2 1.6 2.0 2.4 2.6 a.m. .8 1.2 1.5 2.0 2.4 p.m. .8 1.2 1.5 2.0 2.4 a.m. .4 .8 1.0 1.6 2.0 p.m. .4 .8 1.0 1.6 2.0 Nota: Aplicar Prostaglandina a.m. en el da 4. Dosis para diferentes razas, pesos y edades (FOLLTROPIN). Novillas Novillas y ganado cebuino Vacas adultas (Holstein) Vacas adultas muy grandes y pesadas.

14 a 20 mg 20 a 24.5 mg 30 mg 35 mg

Estos programas requieren de gran tiempo invertido y un control ineficiente de las ondas foliculares de los bovinos. Las variaciones de las respuestas ovricas al tratamiento superovulatorio se responsabiliza al estatus de la onda folicular al tiempo del tratamiento. Existe suficiente evidencia que indica que el tratamiento superovulatorio iniciado al tiempo de la emergencia de la onda folicular (espontnea o inducida) se obtiene la mxima respuesta superovulatoria.

En la sincronizacin de las ondas foliculares se ha utilizado el ultrasonido para romper y aspirar el folculo dominante o un rgimen de combinacin de progesteronas y estrgenos como tratamiento. La ruptura o puncin de todos los folculos (+/-) 5mm de dimetro en novillas de un desconocido ciclo estral induce a la emergencia de una nueva onda folicular 1.5 das despus de la puncin. El tratamiento con progesteronas y estradiol, administrados en combinacin resulto en supresin del folculo dominante y a la emergencia de una nueva onda folicular. El intervalo del inicio del tratamiento superovulatorio de la emergencia de una nueva onda folicular. El intervalo del inicio del tratamiento superovulatorio de la emergencia de una nueva onda folicular. El intervalo del inicio del tratamiento superovulatorio de la emergencia de la onda folicular depende del tipo de estradiol usado: 4.3 das en terneras tratadas con estradiol - 17b. 5.3 das con benzoato de estradiol 5.0 das con valerato de estradiol. Los tratamientos superovulatorios son iniciados al tiempo esperando de la onda folicular inducida, en cualquier fase del ciclo estral, resultando en respuestas comparables o superior al sistema tradicional administrado de 8 a 12 das despus del celo detectado. El propsito de este artculo es comparar aspectos tericos y aspectos prcticos de la foliculognesis del bovino, para manipular el incremento de los folculos o del propsito de una mejor respuesta superovulatoria. La sincronizacin de las ondas foliculares en animales ciclando, elimina la necesidad de la sincronizacin de los celos antes de la superovulacin y facilita el manejo de las donadoras en gran escala y los programas de campo de la transferencia embrionaria. INTRODUCCIN Los tratamientos superovulatorios en los bovinos han sido imprescindibles, se han utilizado diferentes tipos de hormonas como el suero de yegua preada (PMSG) sola o combinada con Anti-PMSG. Se utiliza la hormona F.S.H. con cantidades de LH hormona leutinizante como contaminante, algunas ms purificadas con una proporcin ms o menos de 5 a 1, de F.S.H. y L.H. Se ha reportado que este tipo de hormonas produce una gran nmero de embriones que son colectado si la relacin FSH a LH es baja. Sin embargo, los resultados no son concluyentes, existe mucha variaciones en las investigaciones y reportes con respecto a las diferentes hormonas para superovular, muchos factores pueden contribuir en la variacin en las respuestas de las donadoras, los resultados no demuestran una diferencia significativa en las preparaciones de F.S.H para superovular.

Existen muchos factores que afectan la superovulacin en la vaca, algunos pueden ser controlados y existen otras variables que tienen poco o ningn control, la habilidad de responder al tratamiento es a veces muy desalentado, sin embargo, controlando los principales factores que pueden afectar, los resultados son buenos.

FACTORES QUE AFECTAN LA SUPEROVULACIN Controlables 1. Nutricin 2. Ciclando regularmente 3. C.L. palpable 4. Historia de la buena fertilidad 5. Haber parido 6. Semen probado 7. Tcnico experimentado en I.A. 8. Deteccin de celos 9. Previas superovulaciones 10.Excelentes hormonas superovulatorias 11.Rgimen de tratamiento 12. Condicin corporal. Poco o ningn control 1. Poca habilidad para responder a las hormonas 2. Factores climticos 3. Factores no conocidos Desde 1970 muchos tratamientos han sido experimentados, incrementando o disminuyendo la dosis de hormonas, por 4 5 das de tratamiento 2 veces al da, algunos utilizan una vez al da duplicando la dosis por 4 das, otros han experimentado en una sola dosis va subcutnea el total de la dosis. Reportes frecuentes son publicados, mencionando o reportando mejores respuestas, y hasta la fecha ningn tratamiento ha sido claramente superior. Desde 1981 trabajamos muchas vacas para la superovulacin y el ptimo de F.S.H: L.H, la relacin era de 5:1, nuestro promedio era 5.3 embriones transferibles por vaca muy similar al actual promedio con hormonas ms modernas, ms purificadas y libres de L.H. Existen muchos reportes en la literatura que dicen que mucha contaminacin de L.H disminuye la ovulacin, resultando pocos cuerpos lteos y ms folculos, y con la disminucin de nmero de embriones transferibles. Herrier et al compar F.S.H purificada contra F.S.H suplementada con 40% de L.H, otra con 20 % y otra tercera contaminada con 80% de L.H y no observ una gran diferencia en los resultados.
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ONDAS FOLICULARES EN LA VACA El desarrollo de los folculos ovricos de la vaca es una secuencia dinmica de eventos organizados. EL desarrollo de una onda folicular ha sido definido ha sido definido como el crecimiento sincronizado de un gran nmero de folculos de 4 a 5mm de dimetro, seguido por seleccin y desarrollo de un folculo dominante y supresin de los subordinados. Durante cada ciclo estral, las vacas pueden presentar de 2 a 3 ondas de crecimiento folicular. Existe una gran variacin n la proporcin de animales demostrado 2 o 3 ondas de ciclo estral, algunas pueden presentar una sola onda, estas variaciones en las ondas foliculares han sido atribuidas a: nutricin, balance energtico, medio ambiente y posible gentica. El folculo dominante de una onda folicular es ms grande que los otros folculos y produce esteroides y sustancias no esteroidales, sustancia que suprimen el desarrollo de folculos subordinados y previene la emergencia de la siguiente onda folicular. Ha sido demostrado recientemente el tiempo de seleccin del folculo dominante, concurre una baja concentracin de F.S.H. La emergencia de una onda folicular es precedida por un incremento en las concentraciones de F.S.H. de uno a 2 das antes. El conocimiento de factores que inhiben la secrecin de gonadotropinas o interfiere con la foliculognesis debe ser aprovechada para el control exgeno del desarrollo folicular. La primera onda folicular aparece de 2 a 3 das despus del estro, la segunda onda folicular aparece de 8 a 10 das de la ovulacin y la tercera onda aproximadamente a los 18 das. Se ha demostrado que el folculo dominante inhibe a los folculos subordinados por una inadecuada recepcin de gonadotropinas sobre todo F.S.H. Estradiol e inhibina son producidas por clulas de la granulosa y ambos disminuyen o suprimen la concentracin de F.S.H. necesaria para estimular el crecimiento de folculos subordinados. SUPEROVULACIN Lo ideal en una superovulacin es suprimir la atresia de un gran nmero de folculos. Por ms de dos dcadas muchas investigaciones para obtener una mejor respuesta a la superovulacin y mejorar los resultados de la transferencia embrionaria as como simplificar la tcnica, muchos productos han sido utilizadas y los resultados no han sido halagadores. La variacin en la respuesta ovrica ha sido relacionada con tratamientos diferentes, lotes de hormonas, duracin de los tratamientos, tiempo de tratamiento en relacin al estro, total de dosis de gonadotropinas, relacin F.S.H y L.H otros factores identifican al animal y su medio ambiente.

Muchos factores pueden incluir estratos nutricional bajo, edad, raza. Los tratamientos superovulatorios han sido utilizados el da 8 al 12 despus del celo por 4 5 das seguidos. Otras investigaciones superovulatorias han demostrado altas respuestas en terneras 10 das despus del celo, son embargo, ninguno de estos estudios valor el crecimiento folicular de estos animales al tiempo de la superovulacin. A travs de la informacin generada por el ultrasonido es ahora conocido que 8 a 12 das despus del estro, emerge la segunda onda folicular y que en este tipo de tratamientos superovulatorios son un factor muy importante en la respuesta, durante la mitad de la onda folicular el folculo dominante induce atresia de otros folculos que estn desarrollndose. Tratamientos iniciados por la presencia de un ultra sonido y detectando un folculo dominante disminuye la respuesta superovulatoria. En otros estudios cuando los tratamientos estn iniciados en una onda folicular temprana, sin la presencia de un folculo dominante los resultados fueron halagadores, sobre todo con la presencia de un gran nmero de folculos, esta es una gran alternativa para aprovechar la evaluacin de la onda folicular a travs del ultrasonido. Tal vez mejor alternativa es tratar de controlar el desarrollo de la onda folicular y destruir el folculo dominante a travs de hormonas o puncin del folculo dominante para permitir la emergencia de una nueva onda folicular. CONTROL DEL DESARROLLO SUPEROVULACIN DE LAS ONDAS FOLICULARES Y LA

El efecto supresor del folculo dominante en el desarrollo de otros folculos ha sido demostrado en varios experimentos. La inhibicin es posible por la disminucin de la concentracin de F.S.H en el plasma. El valerato de estradiol e inhibina son producidas por clulas de la granulosa y ambas disminuyen la liberacin de la F.S.H, necesaria para el desarrollo de folculos subordinados. Estrgenos endgenos son conocidos que inducen la liberacin de hormona luteinizante (L.H) de 16 a 20 horas despus de su administracin. Ahora es posible obtener una nueva onda folicular por alteracin experimental por puncin de folculo dominante o por tratamiento hormonal. TRATAMIENTO: 1) Puncin folicular. Consiste en la puncin y aspiracin de todos los folculos de 5 mm de dimetro, sin conocer el da del ciclo estral, esto resulta en una nueva onda folicular 1-5 das, los animales as tratados pueden ser superovulados de 1 a 2 das despus de la ruptura de los folculos dominantes, la respuesta fue muy similar a los controles tratados a mitad del ciclo estral. En otro estudio los folculos fueron aspirados 2 das

antes de la superovulacin en la vaca o novilla a la mitad de su ciclo estral, los resultados fue una mejor respuesta sin la influencia del folculo dominante. TRATAMIENTO: 2) Estradiol y Progesterona Algunas hormonas han sido utilizadas para alterar el desarrollo folicular. Progesterona exgena ha demostrado en varios experimentos que suprime el desarrollo de folculos. El estradiol tambin induce atresia folicular. El efecto de la combinacin de estradiol-progesterona potencializa suprimiendo el desarrollo de folculos sobre todo el folculo dominante, y emergiendo una nueva onda folicular (+/-) 4 a 5 das despus de la aplicacin del estradiolprogesterona La superovulacin puede ser iniciada 4 das despus implantes en la oreja o implantes vaginales (CIDR) combinada progesterona intramuscular, la respuesta similar o superior iniciados a mitad del ciclo estral. La sincronizacin de las ondas deteccin de celos y sincronizacin previa a la superovulacin. de la aplicacin de con 50 o 100mg de a los tratamientos foliculares elimina la

Ejemplo: Da 0. Inserte CIDR Vaginal+ 2.5mg de B.de Estradiol+50mg de progesterona. DIA 4 5 6 7 8 RESUMEN Los implantes de norgestomet, como el CIDR son de gran valor, para reemplazar el cuerpo lteo del ciclo, en programas de superovulacin y como una ayuda la incorporacin de valerato de estradiol o benzoato de estradiol produce atresia de folculos antrales, en las vacas con implantes, induciendo una nueva onda folicular 4 a 5 das despus e iniciado la superovulacin en ese momento. EL resultado son menos fallas, embriones de mejor calidad. La sincronizacin de las ondas foliculares, eliminan las necesidades de detectar celos, antes de la superovulacin, mejorando el tiempo y disminuyendo el trabajo de campo. 7 am 7pm 2.5ml Folltropin 2.5ml Folltropin 2.0ml Folltropin 2.0ml Folltropin 1.5ml Folltropin 1.5ml Folltropin 1.0mlFolltropin + 2 ml. 1.0mlFolltropin + 2 ml. Prosolvin o 5 ml. Lutalyse Prosolvin + retiro CIDR I.A. I.A.

LITERATURA CONSULTADA
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TCNICA DE COLECCIN Y RECUPERACIN DE EMBRIONES

Los embriones pueden ser recuperados quirrgicamente, lo ideal es recuperarlo del 7 al 8 da despus del celo, embriones recuperados del 9 al 14 da despus del estro ya no tienen zona pelcida, son difciles de localizar ya que se confunden con dendritus celulares y son ms susceptibles a infectarse, todos los procesos para congelacin y biparticin estn entre los das 6, 7 u 8 despus del celo, un pequeo porcentaje se puede quedar en el oviducto si se hace la colecta del 5 al 6 despus del estro. MTODO NO QUIRURGICO DE RECUPARAR EMBRIONES El primer paso en la recuperacin no quirrgica es palpar los ovarios va rectal y estimar el nmero de cuerpos lteos. Es muy difcil acatar el nmero de cuerpos lteos, sobre todo cuando la donadora est sper estimulada, ovarios del tamao de una naranja, el mejor estmulo es el tamao de una mandarina o el tamao de un huevo de gallina, cuando existen 2- 3 cuerpos lteos por ovario se pueden palpar y predecir el nmero de embriones que se puede colectar. La ULTRASONOGRAFA da un resultado ms acertado de la respuesta en los ovarios. Las DONADORAS se recomienda AYUNARLAS 12 horas antes de la colecta, para evitar, que estn defecando y contaminando mangueras y sondas. ANESTESIA EPIDURAL. Es recomendado para este procedimiento, la cola el sacro y la zona vulvar, son lavadas y desinfectadas con yodo-povidona y luego con alcohol al 70% para disminuir el estrs del animal y la presin del esfnter anal sobre el brazo del operador, se aplican de 5 a 7 ml de xilocana al 2% en el espacio epidural, as como una dosis de tranquilizante de Promacina, 10mg intravenosa, ya que la cola est flcida, es el momento de empezar. El crvix uterino, est cerrado, se cateteriza con un dilatador cervical metlico atraumtico hasta llegar al cuerpo del tero (bifurcacin de los cuernos). Se introduce una sonda Foley de calibres (14-16-18) segn el tamao, la edad de donadoras- 14 para novillas,- 16 para vacas o vaquillas y del nmero 18 hasta el 20 para vacas muy grandes y de cuernos gruesos, el globo del catter es inflado con 5 a 12cc de solucin salina fisiolgica estril o bien aire, cuando la punta de la sonda, est a la mitad del cuerno uterino. Algunas veces se encuentra dificultad para pasar el crvix,

sobre todo en novillas de algunas razas. Es necesario hacerlo con todo cuidado y paciencia, es muy importante para no lastimar un crvix o la mucosa uterina. Un error muy comn es sper inflar el globo del catter, causando rotura del endometrio, o del tero. El lquido del lavado, saldr sanguinolento o se perder dentro del tero, o caer en la cavidad abdominal. Se utiliza una manguera estril larga que est en circuito cerrado, un extremo penetra en el frasco o bolsa, que contiene medio lavado, otro extremo penetra en la sonda Foley y el otro extremo es conectado a un filtro, colector de embriones. La bolsa o frasco, que contiene 1 o 2 litros de medio de colecta, se coloca a una altura de 80 a 100cm sobre el nivel de la vaca, para que el lquido pueda penetrar por gravedad. FILTRO COLECTOR. Al reflujo del lquido que penetro al tero 30 a 80cc de lquido por cada lavado, a la palpacin en el tero, es aproximadamente una preez de 35 a 40 das, se da un ligero masaje al cuerno, que contiene el lquido del lavado, para tratar de desprender los embriones, que estn en la mucosa uterina, estos van a caer a un FILTRO COLECTOR Y CONCENTRADOR de embriones, este filtro posee una malla de 70 micras y retiene embriones ya que estos miden de 140 a 160 micras. Este lavado se repite de 5 a 8 veces en cada cuerno uterino, utilizando 500cc a 1000cc por cuerno uterino, la solucin es Dulbecco (PBS-modificado) con 2% de suero fetal o 4 gramos de Albmina Bovina por litro de lavado, adicionado de antibiticos y antimicticos. El tiempo promedio para hacer una colecta de embriones 30 minutos esto depende de la prctica y la experiencia. TRATAMIENTO COLECTA? QUE RECIBEN LAS DONADORAS DESPUS DE LA

Una vez terminado de lavar los cuernos uterinos, las donadoras, son inyectadas con una dosis doble de prostaglandina y se repite de 12 a 14 das despus. El objetivo de esto es evitar procesos inflamatorios uterinos o gestacionales mltiples ya que algunos embriones pueden permanecer an en los oviductos. Se puede aplicar un antibitico no irritante, como preventivo de alguna contaminacin. RECUPERACIN DE LOS EMBRIONES DEL FILTRO Al terminar el lavado de ambos cuernos, el filtro es llevado al LABORATORIO. El contenido es lavado y filtrado, varias veces hasta que queda 20 a 30cc de medio y esto es depositado en una caja de Petri de 150 x 25mm con cuadrcula para su revisin al microscopio esteroscpico a 15x. Si el contenido tiene moco o dendritus

celulares conviene hacer un lavado con jeringa de 30cc con medio y una aguja pequea, hacer lavados a presin sobre la malla del filtro, esto es depositando en la misma caja de Petri o en otra, para evaluar la tcnica es mejor con un lavado o con 2 algunos embriones se pueden quedar pegados con moco a la pequea malla. La bsqueda e identificacin, se realiza con la ayuda de la zona pelcida que rodea a la masa embrionaria, tambin de la forma esfrica y la tendencia a rodar sobre el fondo de la placa. Los embriones u vulos son recolectados con una micropipeta de cristal, adaptada a una pequea jeringa de 1cc y son colectados en una caja de Petri muy pequea de 35 X 10mm para su aislamiento en P.B.S ya enriquecido con 10% de suero fetal o con albmina bovina al 4% as como antibiticos. La temperatura en el laboratorio debe ser de 20 a 30C. CLASIFICACIN DE EMBRIONES Los embriones son evaluados al microscopio esteroscpico a 50x y clasificados segn las normas de IETS de acuerdo a su aspecto morfolgico, estadio y calidad en cinco CATEGORAS: Estadio Ovulo fertilizado, 1 clula Embrin de 2 clulas Embrin de 4 clulas Embrin de 8 clulas Embrin de 16 clulas Estadio Mrula temprana Mrula compactada Blastocisto temprano Blastocisto mediano Blastocisto expandido Blastocisto saliendo de la zona Blastocisto expandido fuera de la zona Edad(Das) 0a2 1a3 2a3 3a5 4a5 (Estadios Transferibles) Edad(Das) 5a6 6a7 7 a 7.5 7.5 a 8 8 a 8.5 8.5 a 9 9 a 10 Cdigo 1-1 cel 2-2 cel 2-4 cel 2-8 cel 2-16 cel Cdigo 3 4 5 6 7 8 9

TRANSFERIBLES: 1) EXCELENTES Y BUENOS, 2) REGULARES, 3) POBRES NO VIABLES: 4)HUEVOS FERTILIZADOS DEGENERADOS O MUERTOS 5) HUEVOS SIN FERTILIZAR U-OOCITOS. Las principales caractersticas morfolgicas evaluadas para clasificar los embriones fueron: Estado de desarrollo acorde con la edad; tamao normal (150 a 200) micras forma esfrica y su contenido: Integridad de la zona pelcida, compactacin celular color

mbar, picnocis, vesculas, tamao de las vesculas, presencia de Dentritus celulares o blastmeros excluidos de la masa embrionaria en el espacio previtelino.

TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

En la vaca los embriones son rutinariamente transferidos al cuerno uterino, esto es porque los embriones son recuperados no quirrgicamente del tero y deben ser transferidos al mismo sitio. PRIMER PASO: Es necesario palpar los ovarios en forma acertada, para seleccionar el que tiene el cuerpo lteo (cuerpo amarillo) SEGUNDO PASO: Es pasar el aplicador con el embrin, a travs del crvix. Recordemos que la aplicacin o transferencia se hace del da 6-7 u 8 del ciclo estral cuando est en fase ltea; el crvix puede estar ocluido y con presencia de mucosidad. Las novillas presentan un reto por su pequeo crvix, algunas razas son ms difciles que otras. El mejor entrenamiento es tener mucha experiencia en Inseminacin Artificial. TERCER PASO: Es colocar el embrin, a la mitad del cuerno uterino o al ltimo tercio, esto debe ser muy gentil y en forma rpida. Los tcnicos inseminadores generalmente requieren 100 a200 transferencias para adquirir experiencia. TIEMPO TRANSCURRIDO ENTRE LA COLECTA Y LA TRANSFERENCIA Es mejor transferir los embriones tan pronto como sea posible. Normalmente son transferidos entre 1 a 4 horas del fin de la colecta de embriones. CMO CARGAR LOS EMBRIONES PARA TRANSFERIRLOS? Se utilizan pajillas de I.A. de 0.25cc, una jeringa de 1cc, se enjuaga la pajilla con medio de implante varias veces, no importa que la pajilla este estril, es para eliminar cualquier txico de la pajilla. Los embriones fueron cargados en la pajuela, primero medio de implante, luego un espacio de aire, luego medio, aire, medio con embrin, aire y luego medio, hasta que el algodn de la pajilla se humedezca y solidifique el PVC, de esta manera aseguramos que el embrin es expelido de la pajilla.

INSTRUMENTAL PARA TRANSFERIR EN FORMA NO QUIRRGICA El aplicador de embriones ms utilizado al principio del mtodo no quirrgico fue la pistola de inseminacin de CASSOU con pajilla de 0.25 cc francesa, esto es muy barato. Sin embargo son cortas y gruesas en su punta para novillas receptoras o vacas con cuernos largos o pelvis grandes no sirven. Fue hecha la vaina azul miniaturizada desechable, especialmente para bovinos y novillas con crvix pequeo, fue diseada con punta roma y ciega, con dos orificios laterales. Es ms largo que el aplicador de Inseminacin Artificial. El cateterismo cervical y uterino, el sitio de depsito del embrin y el tiempo empleado en depositar el embrin en el cuerno uterino (mitad del cuerno o el ltimo terco del cuerno uterino) dependen mucho del instrumento utilizado, de la anestesia epidural, de un animal tranquilizado, as como la habilidad y experiencia del tcnico o Mdico Veterinario. Existen otros catteres metlicos, que trabajen muy bien, se deslizan muy rpido dentro del cuerno uterino. QU RECEPTORAS SON TILES PARA RECIBIR UN EMBRIN? Las receptoras son seleccionadas por 2 cosas: a) Tener un cuerpo lteo palpable. b) Estar sincronizadas con las donadoras en +/- 24 horas con el embrin a la donadora. Las receptoras son tranquilizadas hora antes de la transferencia, la anestesia local es recomendable 10 minutos antes de la transferencia de preferencia xilocana o lidocana al 2%, cuando la cola est flcida, es el momento de transferir. Los embriones deben ser depositados lo ms profundo posible en el tercio medio anterior del cuerno uterino que tiene el cuerpo lteo. El tcnico que palpa con el brazo izquierdo, se facilita mucho cuando la transferencia es del cuerno derecho, pero es poco difcil cuando hay que depositar en el cuerno izquierdo, por eso es muy importante, que la anestesia epidural est bien puesta (+/-) 8 cc de xilocana es la dosis. La colocacin debe ser lo ms profundo posible, de la mitad del cuerno hacia delante. Es necesario que sea realizado con mucha destreza y calma para no lastimar el endometrio.

EVALUACIN Y MANIPULACIN EMBRIONARIA EN BOVINOS


EVALUACIN EMBRIONARIA INTRODUCCIN La evaluacin precisa del embrin es uno de los pasos ms importantes para que la TE sea exitosa. Aunque existen muchos mtodos alternativos para determinar la viabilidad embrionaria, la evaluacin basada en criterios morfolgicos continua siendo la ms simple, rpida, y confiable. La evaluacin morfolgica realizada con el microscopio estereoscpico es la ms comnmente utilizada y generalmente se realiza despus de la bsqueda y localizacin de los mismos. Se tiene que reconocer que la evaluacin visual de los embriones es una evaluacin subjetiva de algo biolgico y por lo tanto no es una ciencia exacta (Robertson and Nelson, 1998). Tiene la desventaja de ser subjetiva. Diferentes tcnicos solo han coincidido en el 68% de las observaciones, difiriendo principalmente entre los de calidad buena y regular (Farin et al. 1995). Tambin se ha demostrado que existe un 30% de fallas a nivel de campo cuando los mismos embriones han sido evaluados posteriormente al microscopio electrnico (Aguilar et al. 2002). La evaluacin morfolgica se relaciona con el porcentaje de gestacin posterior a su transferencia, sin embargo este parmetro depende tambin de la calidad de la receptora, del tcnico y condiciones ambientales (Robertson and Nelson, 1998). La capacidad para predecir la tasa de preez a alcanzar entre grupos de embriones, sin embargo tiene limitaciones cuando se requiere determinar la viabilidad de un embrin en particular, es decir para demostrar que est vivo (Overstrm, 1996). Debido a lo anterior se han desarrollado algunas tcnicas metablicas y de evaluacin morfo-funcional, como las de tincin de exclusin y de fluorescencia, de actividad enzimtica, de consumo de oxgeno, de toma y utilizacin de substratos, que estn correlacionadas con la morfologa y la sobrevivencia de los embriones posterior a la transferencia (Lindner et al, 1983; Buttler and Biggers, 1989; Overstrm, 1996). Sin embargo, estos mtodos requieren de equipo complejo y aumentan el periodo de cultivo in vitro, por lo que son de escaso valor bajo condiciones campo (Lindner et al, 1983). El cultivo in vitro de los embriones durante 12 a 24 horas permite distinguir un embrin no viable basndose en el retraso en su desarrollo, pero requiere de equipo especial, eleva el costo y el tiempo de la evaluacin, y lo que es ms importante, altera el crecimiento normal del producto (Overstrm, 1996). Por lo mismo, la evaluacin morfolgica de los embriones, a pesar de ser subjetiva y poco precisa sigue siendo ms accesible, inocua y de aplicacin a nivel de campo, para seleccionar los embriones transferibles.

EVALUACIN MORFOLGICA EMBRIONARIA La evaluacin morfolgica de los embriones mediante el microscopio estereoscpico es simple, rpida y de resultados inmediatos que permite en cierta medida tomar una decisin acerca del destino de cada embrin y la viabilidad de los mismos. Se realiza con el microscopio estereoscpico a 40 o 50 aumentos. Los embriones de los rumiantes miden de 130 a 140 , excepto los blastocistos expandidos, que son 30% ms grandes. La zona pelcida mide 15 y debe estar ntegra, pues su funcin es proteger al embrin de microorganismos y otros contaminantes. La integridad de la zona pelcida es indispensable cuando los embriones van a ser congelados y es un requisito para su exportacin. Se requiere girar al embrin, para observarlo perfectamente desde diferentes ngulos. Para la evaluacin embrionaria se consideran dos criterios: a) Grado de desarrollo b) Calidad morfolgica Grado de desarrollo Representa las divisiones celulares del cigoto, o blastmeros. Cada divisin mittica se lleva a cabo a partir de la misma cantidad de material celular, por lo que las clulas resultantes tendrn la mitad del tamao o volumen de la que le dio origen, lo que implica que cada vez se van haciendo ms pequeas; a este tipo de divisin se le denomina segmentacin para diferenciarla de la mitosis normal. El grado de desarrollo deber ser acorde a la edad del embrin, es decir, al da en que se llev a cabo la colecta embrionaria tomando como da 0 al da del inicio del estro. La Figura 1 muestra el desarrollo cronolgico del embrin y su localizacin en el aparato genital. El grado de desarrollo del embrin con relacin a la edad del mismo parece ser un mejor indicador de la viabilidad que la apariencia morfolgica. Los embriones tempranos se clasifican por el nmero de blastmeros presentes: 2, 4, 8, 16 clulas; posteriormente reciben la denominacin de: Mrula temprana Agrupacin o masa de clulas. Los blastmeros son difciles de diferenciar individualmente debido a sus uniones (compactacin). El embrin recibe este nombre por su semejanza a la fruta mora. Mrula compacta El nmero de blastmeros ha aumentado y la masa celular ocupa entre el 60 y 70% del espacio perivitelino. A partir de esta etapa el embrin es transferible. Blastocisto temprano Se caracteriza por presentar una cavidad llamada "blastocele".En este estadio las clulas han sufrido su primera diferenciacin, dando lugar a las clulas del botn o

tabique embrionario y las del trofoblasto. La masa celular ocupa el 70% del espacio perivitelino. Blastocisto maduro El embrin tiene la apariencia de un anillo y ocupa el 90% del espacio perivitelino. El embrin ocupa la totalidad del espacio perivitelino. Blastocisto expandido El tamao del embrin aumenta un 20 o 30% y la zona pelcida sufre un adelgazamiento. Estos embriones en ocasiones se colapsan sin que se aprecie el blastocele, sin embargo la zona pelcida permanece adelgazada y en alguna zona su contorno puede ser irregular. Blastocisto eclosionado Se identifica como una masa compactada de pequeos blastmeros y slo ocasionalmente se observa el blastocele. En ocasiones se encuentran zonas pelcidas vacas, sobretodo cuando la coleccin se lleva a cabo despus del da 8. En ese caso, es necesario revisar cualquier acmulo de clulas. Calidad morfolgica Este criterio ha consistido tradicionalmente en asignar una calificacin al embrin, de acuerdo a sus caractersticas morfolgicas, al observarlo al microscopio, como un indicador de su salud o viabilidad, como son el color, la homogeneidad en el tamao de los blastmeros, la granulacin del citoplasma o la fragmentacin de los blastmeros (Overstrm, 1996). De esta forma, el embrin se clasifica como: excelente, bueno, regular y no transferible o degenerado. La correlacin entre la calificacin que se le da a un embrin y la habilidad de este para transformarse en una cra no ha sido alta. Esta correlacin aumenta sustancialmente slo cuando se separan los embriones con defectos morfolgicos graves del resto o normales (Buttler and Biggers, 1989). Por otro lado, el examen visual no es un buen indicador de viabilidad, ya que embriones que parece anormales, pueden resultar en una preez (Killen and Moore, 1971; Shea, 1981). Calidad del embrin Excelente o calidad 1 Embrin con desarrollo de acuerdo a su edad, compactado, esfrico, perfectamente simtrico, con granulacin uniforme, color mbar, sin blastmeros extruidos y con la zona pelcida intacta. Bueno o calidad 2 Embrin con desarrollo de acuerdo a su edad, compactado o con leve descompactacin, ligera asimetra, algunas imperfecciones leves, granulacin uniforme o presencia de vesculas, pero no abundantes, de color uniforme (tal vez con algunas zonas obscuras), zona pelcida intacta, con algn blastmero excluido.

Regular o calidad 3 Descompactacin marcada, blastmeros extruidos y con signos de degeneracin (vesculas), de color obscuro, masa celular pequea, pero no menor al 50% de lo normal, con zona pelcida intacta. No transferible o degenerado, calidad 4 Signos marcados de degeneracin, como retraso en el desarrollo (ms de dos das), descompactacin, color obscuro, granulacin no uniforme (vesculas), muchos blastmeros extruidos o irregulares. (Elsden RP and Seidel, 1988; Lindner and Wright, 1983) (Ver Cuadro 1). Dado que la fertilidad de los embriones excelentes y buenos es semejante, algunos autores han considerado clasificar al embrin simplemente como a) bueno, b) regular y c) malo o no transferible (Lindner y Wright, 1983).

DESARROLLO Y LOCALIZACIN DEL EMBRIN EN EL APARATO GENITAL BOVINO

*DIAS 1 2 3 4 cel 2 cel

4 5 6 7

8 cel

Mc y Bt

16 cel Mt

8 9

B, Be

Be 1 0 Be

*Da de inicio del celo (da 0) ADAPTADO DE: Palma, 2001;

Tomada de Killen & Moore., 1971 Figura 2. Embrin ovino de 4 clulas, con partculas anucleadas (1); embrin de 7 clulas, con partculas anucleadas (2); embrin de 4 clulas teido con orcena (3). Las flechas indican las partculas anucleadas.

Tomada de Lindner et al., 1983

Figura 3. Mrula temprana (a); mrula compacta (b); blastocisto temprano (c); Blastocisto (c); blastocisto expandido (e) y blastocisto eclosionado (f)

Tomada de Lindner et al, 1983 Figura 4. Cuatro mrulas compactas de calidad: excelente (a); buena, se nota un blastmero extruido y el contorno irregular (b); regular, con blastmeros extruidos y algunas clulas degeneradas (c) y no transferible, numerosos blastmeros extruidos y signos de degeneracin celular, pero con una masa aparentemente viable (d).

Tomadas de Palma, 2001

Figura 5. a) Muestra un blastocisto en eclosin (izquierdo) y un blastocisto expandido (derecho); b) un blastocisto eclosionado con su zona pelcida vaca; c) blastocisto eclosionado.

Cuadro 1
EVALUACIN MORFOLGICA CRITERIOS

a) Grado de desarrollo. Acorde al da posterior a la inseminacin


Grado de desarrollo vulo 2 a 16 blastmeros mrula temprana mrula compacta blastocisto temprano blastocisto maduro blastocisto expandido blastocisto en eclosin embrin eclosionado Clave 2 3 4 5 6 7 8 9
Elsden and Seidel, 1988

Edad del embrin 2-4 das 5 das 6 das 7 das 7 das 8 das 9 das

Nm. de clulas 2-16 >16 32-64 160 180 200 >200

b) Calidad embrionaria
Calidad embrionaria Clave Excelente 1 Bueno 2 Pobre o regular No transferible 3 4 Morfologa Esfrico, simtrico, clulas uniformes, buen color Imperfecciones ligeras, blastmeros extruidos, vesculas Alteraciones ms severas, vesculas, clulas degeneradas Alteraciones graves, signos de degeneracin, vesculas
Elsden Seidel, 1988 and

MANIPULACIN EMBRIONARIA La manipulacin embrionaria comprende en una serie de tcnicas, generalmente invasivas mediante la micromanipulacin o microciruga, con diferentes finalidades como son la biparticin o produccin de gemelos idnticos y la toma de biopsias para producir quimeras o determinar el sexo el embrin. La mayora se realizan con el micromanipulador que es un sistema que consta de un microscopio estereoscpico adaptado a un equipo que permite manejar micropipetas para fijar al embrin o tomar

muestras de blastmeros, micronavajas y otros utensilios, todo ello con movimientos microscpicos. Biparticin o produccin de gemelos idnticos Consiste en partir a un embrin (mrula o blastocisto) en dos mitades y obtener una cra de cada mitad. Esto sera especialmente importante cuando slo se obtiene uno o dos embriones (Seidel and Elsden, Smith et al, 2007). Dado que cada mitad proviene del mismo embrin se consideran como clonas. La tcnica permite aumentar el nmero de cras nacidas a 0.9-1.2, comparado con 0.6-0.7 de un programa de transferencia convencional. Tambin permite reducir el nmero de animales experimentales para la investigacin (Palma, 2001). Cuando se utilizan blastocistos es necesario que cada mitad tenga parte de las masa de clulas internas ya que de otra manera se formar una vescula trofoblstica, no un embrin. El procedimiento se realiza generalmente con el micromanipulador, sin embargo tambin es posible realizarlo con el microscopio estereoscpico comn usando un medio especial (Vigro splitting media) que permite que el embrin se adhiera al piso de la caja de Petri, lo que facilita su biseccin. La divisin del embrin en ms partes no ha tenido xito debido a la baja tasa de desarrollo. La proporcin de hemiembriones incluidos dentro de la zona pelcida que se transforman en fetos es de 38% (40/105), de 42.2% (46/109) sin zona pelcida y de 36% al ser embebidos en gelatina al 7% . No existi diferencia en la tasa de gestacin al transferir uno o dos hemiembriones por cada receptora (Warfield et al, 1987). En otra investigacin reciente, de once pares de hemiembriones transferidos a 11 receptoras, nueve se transformaron en blastocistos (Albihn et al, 2007). La biparticin del embrin no llen las expectativas que se haban previsto debido a que: la microciruga requiere tiempo, la divisin conduce a menores tasas de preez (50 vs 60% de embriones intactos) y la congelacin de hemiembriones tambin reduce las tasas de preez (Seidel 1995). Una posibilidad futura sera el combinar la biseccin con el sexado pues la biopsia que implica el sexado del embrin afecta la tasa de preez, pero esta se vera compensada al obtener un mayor nmero de cras de los hemiembriones (Palma, 2005). Sexado de embriones La preseleccin del sexo ofrece mltiples ventajas en la produccin animal y una de las formas de hacerlo es determinando el sexo de los embriones. Para sexar los embriones se han intentado diversas tcnicas como son los anlisis citogenticos, ensayos para determinar actividad enzimtica ligada al cromosoma X, la tasa diferencial de desarrollo, la deteccin de antgenos especficos del macho y el uso de sondas de ADN especficas del cromosoma Y (Lopatarova et al, 2007). Esta ltima, junto con el desarrollo de la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es el enfoque ms utilizado. La tcnica es invasiva pues implica la toma de biopsia del embrin, es decir la obtencin de algunos blastmeros con una micronavaja o aspirandolos con una micropipeta a travs de la zona pelcida. La amplificacin por PCR de secuencias especficas de genes del cromosoma Y por PCR es el mtodo

ms prctico para determinar el sexo del embrin (Herr et al, 1990, Herr and Reed, 1991). Las sondas utilizadas son especficas para el gen SRY (Chen et al, 2004).

Fotografas tomadas de Lopatarova et al, 2007

Figura 1 Se muestra la biopsia de un embrin por medio de una micronavaja para el sexado.

LITERATURA CITADA
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BIOTECNOLOGIA APLICADA A LA REPRODUCCIN ANIMAL


INTRODUCCIN En los ltimos aos se ha generado el desarrollo de una serie de tcnicas en la biotecnologa reproductiva, se han logrado avances genticos e incrementado poblaciones ms rpidamente que con los esquemas convencionales de cruzamiento utilizados tradicionalmente en los sistemas de produccin en bovinos y otras especies. En la especie bovina la tcnica de inseminacin artificial y de la transferencia de embriones se han visto beneficiadas con el desarrollo de la fertilizacin in vitro y aspiracin folicular OPU-FIV, determinacin del sexo, biparticin de embriones. La tendencia actual de este tipo de tecnologas est encaminada al desarrollo de razas de animales altamente productivos, resistentes a enfermedades y a condiciones ecolgicas propias de la regin geogrfica de su produccin, a travs del aprovechamiento del material gentico de animales con una gran capacidad productiva y eficiencia reproductiva. FERTILIZACIN IN VITRO - ASPIRACIN FOLICULAR OPU-FIV La tcnica de fertilizacin in vitro permite realizar una serie de manipulaciones con gametos (vulos y espermatozoides), bajo condiciones de laboratorio siendo posible el desarrollo embrionario hasta la etapa de mrula o blastocisto, etapa en la que el embrin puede ser transferido a una receptora congelado. Los embriones producidos in vitro, se producen a partir de vulos recuperados de ovarios que pueden provenir de animales sacrificados o de animales vivos (aspiracin folicular OPU), estos vulos se maduran, fertilizan y cultivan los ovocitos fertilizados. Con OPU se colectan ovocitos a travs de una sonda especial, provista de una aguja adaptada a un equipo de ultrasonido que permite la puncin directa de los folculos presentes en los ovarios, este mtodo tambin puede ser usado en combinacin con la ovulacin mltiple cuando se desea obtener vulos madurados. Esta tcnica facilita tambin el aprovechamiento de ovocitos que son reclutados en las oleadas foliculares que se presentan en cada ciclo estral de la vaca. Se colectan ovocitos de folculos de 2 a 6mm de dimetro, posteriormente con el apoyo de un microscopio estereoscpico se buscan y clasifican de acuerdo a sus caractersticas morfolgicas, para seleccionar los que renen las condiciones para ser madurados (18 a 24 hrs), fertilizados (18 a 24 hrs) y cultivados bajo condiciones in vitro durante siete das. Finalizado este perodo, los embriones producidos estn en condiciones de ser transferidos a una vaca receptora, o congelados para ser transferidos en el momento apropiado. Las condiciones de cultivo a las que son sometidos los ovocitos con medios especficos para cada etapa (maduracin, fertilizacin y desarrollo embrionario) en la incubadora son: 39 C de temperatura, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa. La produccin de embriones in vitro ha avanzado considerablemente, hoy en da algunas empresas producen un 40 a 60% de embriones con sus protocolos de FIV. Los porcentajes de gestaciones que se han logrado con embriones producidos mediante esta tcnica son relativamente altos y

oscilan entre un 50 a 55%. La produccin de embriones de manera comercial mediante esta tcnica se realiza ya en varios pases. VENTAJAS DE OPU-FIV Una vez que la OPU-FIV no requiere tratamiento hormonal para su xito, se puede aprovechar de forma ms eficiente en animales que no responden a superovulacin, ya sea por anomalas adquiridas (resistencia a las hormonas) o por ser refractarias a la superovulacin. Vacas que poseen gran potencial gentico pueden ser donadoras de vulos, sin importar su respuesta a la superovulacin. Son muchos los casos de animales infrtiles o subfrtiles por problemas adquiridos. Son frecuentes los casos de adherencias del ovario y del tero, metritis crnicas, infecciones tubaricas y otras patologas. La OPU-FIV permite la produccin de progenie de animales con estas patologas, una vez que ella no necesita del total del aparato reproductivo, basta con que el ovario produzca folculos de tamao suficiente para su aspiracin. Produccin de un mayor nmero de embriones Actualmente los promedios de produccin estn en 9 embriones por sesin de OPU, generando un promedio de 3.5 preeces por trabajo en cada hembra. En general una hembra esta produciendo un promedio de 80 a 120 preeces por ao. Produccin de embriones de vacas gestantes Donadoras gestantes hasta los 120 das de preez poseen tasas de produccin iguales o superiores a los animales no preados. Los riesgos para la prees son muy pequeos, pero es importante resaltar, que pueden pasar absorciones. Utilizacin en novillas pre pberes Es posible obtener gestaciones de animales mucho antes de su primer ciclo estral. Esta puede ser una estrategia para diagnostico precoz de la calidad de la produccin de un animal. Aprovechamiento del semen Una vez que el semen es descongelado y diluido para a su utilizacin, una pajilla puede ser suficiente para fertilizar los ovocitos de hasta 10 donadoras dependiendo de la calidad del semen y de la cantidad de ovocitos. Utilizacin de animales con problemas reproductivos Es importante tener en consideracin que problemas reproductivos congnitos o hereditarios pueden ser transmitidos a las cras. Por lo que no es recomendable la utilizacin de animales con este tipo de alteraciones. Pueden ser utilizadas donadoras sacrificadas, siempre respetando un intervalo de mximo 40 minutos para retirar los ovarios de la canal, y un mximo de 8 horas de transporte hasta el laboratorio de FIV.

DESVENTAJAS DE LA OPU-FIV La principal desventaja de la tcnica de OPU-FIV es la gran variacin dependiente de factores biolgicos, independiente de la metodologa utilizada en la produccin de los embriones. Las variaciones corresponden a factores individuales, tanto del macho como de la hembra. Esto sin contar los factores intrnsecos de la interaccin entre el macho y la hembra en la produccin de embriones. Es necesario desarrollar y aplicar estas tcnicas en el sector ganadero del pas, para la produccin de animales de excelente calidad gentica que sirvan de base para el pie de cra. DETERMINACIN DEL SEXO El inters que existe en el desarrollo de tcnicas que posibiliten la determinacin de los cromosomas (XX HY) que portan los embriones espermatozoides, de manera rpida, econmica y eficaz, que no pongan en riesgo la viabilidad de estos al momento de su manipulacin, ha generado una serie de investigaciones sobre este tema, para establecer un mtodo que pueda hacer esto posible a nivel comercial en la produccin animal. Sexado de semen Las tcnicas que se han aplicado para la separacin de las poblaciones de espermatozoides con cromosoma XX XY, se han apoyado en las caractersticas fisicoqumicas (peso, densidad, y motilidad) de este gameto. Tambin se han intentado implementar mtodos inmunolgicos dirigidos a inactivar el cromosoma Y con antgenos H-Y especficos de superficie. Sin embargo los resultados obtenidos con estos protocolos realizados no han proporcionado resultados consistentes y confiables. La tcnica que actualmente provee la mayor confiabilidad (85 a 97%) en la separacin de espermatozoides, es mediante citometra de flujo, el cual mediante un sorteador de clulas determina el peso del ADN de los cromosomas XX XY. Una desventaja de este procedimiento es que los equipos empleados para la separacin de espermatozoides son lentos y la cantidad de estructuras obtenidas son bajas, se obtienen 20 millones de espermatozoides por hora, adems del alto costo del equipo utilizado. Las dosis que se comercializan tienen una concentracin de 2 millones y estn recomendadas para novillas. La inseminacin con semen sexado para la produccin de hembras en el ganado bovino lechero ha tenido gran aplicacin en muchos pases del mundo, en el ao 2008 se reporto que se vendieron 4 millones de dosis. Los datos de fertilidad logrados con semen sexado en novillas oscilan del 47 al 53% a primer servicio y en vacas en lactacin del 27 al 35 %. Para la produccin de embriones por FIV el semen sexado se utiliza de manera eficiente se aplica una concentracin de 500 mil espermatozoides para 20 0 50 ovocitos. Con la tcnica se inyeccin intracitoplasmatica (ICSI) el semen sexado podr tener su maximo aprovechamiento. En vacas o novillas superovuladas para la produccin de embriones no se recomienda su utilizacin, algunos lo han empleado y han obtenido resultados muy variables con muy baja fertilidad.

Sexado de embriones Diversas investigaciones se han generado para el sexado de embriones pero ninguno de estos ha logrado obtener resultados aceptables, pues son poco confiables y eficientes, ponen en riesgo la viabilidad del embrin. La ingeniera gentica para la identificacin de fragmentos especficos de DNA ha aportado un gran impulso a la metodologa del sexado embrionario en ganado bovino, a travs de la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa PCR, que es capaz de identificar una secuencia particular repetida de ADN, en una cantidad diminuta de muestra de material gentico. Actualmente se conocen diferentes secuencias especficas localizadas en los cromosomas sexuales como el SRY (Sexing Region YChromosome) y el ZFY (Zinc Finger Y-Chromosome) en diferentes especies, estas secuencias han sido empleadas con la PCR para determinar el sexo de los embriones. El sexado de embriones bovinos se realiza en forma rutinaria en varios pases, empleando una sonda de ADN en combinacin de la PCR. Los datos reportados indican una exactitud del 95 % de los embriones sexados mediante este procedimiento, con un 58 a 65 % de gestaciones obtenidas. Se recomienda que solamente los embriones de buena calidad puedan ser congelados despus del procedimiento de sexado. BISECCIN DE EMBRIONES La Biseccin de Embriones (BE) es una tcnica que permite la produccin de gemelos idnticos al dividir a un embrin usando tcnicas de micro manipulacin. Este mtodo es una forma de clonacin, porque hace posible la produccin de individuos genticamente iguales. La cantidad de cras idnticas que se pueden producir por esta tcnica es limitada, pues si el embrin se divide en ms de dos partes, disminuye la viabilidad del embrin seccionado. El mtodo ms prctico para realizar la biseccin es con embriones obtenidos en la etapa de desarrollo de mrula blastocisto inicial, esto se realiza con embriones frescos o congelados. Para realizar este procedimiento se utiliza un microscopio adaptado con un equipo de micro manipulacin para cortar los embriones por la mitad. Los porcentajes de preez obtenidos con esta tcnica son entre el 50 a 60% para cada mitad. A partir de la divisin de 100 embriones se obtienen 200 a 240 "medios" embriones, de esta cantidad si se logra un porcentaje de gestaciones del 50 al 60%, se obtendra una cantidad total de 100 a 120 cras. Comercialmente esta tcnica se emplea para incrementar la produccin de cras de alto valor gentico, para determinar el sexo del embrin, y para mejorar la eficiencia de la investigacin con animales modelos animales idnticos. LITERATURA CONSULTADA
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TCNICAS DE CRIOPRESERVACION DE EMBRIONES EN BOVINOS


INTRODUCCIN La conservacin de clulas y embriones mediante la criopreservacin se aplica actualmente de manera rutinaria en programas de mejoramiento y rescate gentico en diferentes especies. En las especies domesticas estas tcnicas permiten la creacin de bancos de germoplasma (clulas y embriones) y facilita el intercambio y mantenimiento de lneas de alto valor gentico. Este material se puede mantener congelado por tiempo indefinido en nitrgeno lquido (a 196 grados centgrados bajo cero). En la produccin de embriones bovinos por superovulacin o mediante la tcnica de fertilizacin in vitro, la criopreservacin ha sido el medio mas empleado para mantener la viabilidad de los embriones en el proceso de congelacin y descongelacin para su futuro desarrollo. En las distintas especies, la supervivencia de embriones congelados se obtuvo por los siguientes investigadores: Bovinos: Wilmut y Rowson, 1973; Ratas: Whittingham y col., 1975; Caprinos: Bilton y Moore, 1976; Conejos: Bank y Maurer, 1974; Ovinos: Willadsen y col., 1976. El proceso de criopreservacin de material biolgico en general, ya sean clulas o congregaciones de ellas (embriones, tejidos, rganos), se fundamenta en los efectos fsico-qumicos que la disminucin de temperatura ejerce sobre estos sistemas vivos. La membrana celular se puede definir como una bicapa lipdica con una distribucin asimtrica de protenas en su interior. Esta estructura celular no slo acta como barrera fsica, sino que tambin ejerce un papel muy importante en el transporte inico y de macromolculas, as como en el reconocimiento de hormonas y neurotransmisores. Es un sistema heterogneo complejo, cuyo comportamiento est determinado por la distribucin de sus componentes y por el ambiente externo. La temperatura es un factor clave, ya que de ella depende tanto la velocidad o cintica de las reacciones bioqumicas, para que se realicen. La fluidez de los componentes de la membrana es dependiente de la temperatura, y esto afecta a la permeabilidad de su estructura, incluso cuando an no se han producido cambios de estado inducidos por la variacin de temperatura. Bajo estas condiciones, todas las reacciones bioqumicas, excepto algunos procesos de transferencia inica estn detenidas. En el proceso de criopreservacin es esencial eliminar la mayor parte del agua intracelular antes de que el congelamiento se realice. De lo contrario, se formarn cristales intracelulares que causan dao mecnico y, frecuentemente, la muerte celular. El agua puede ser eliminada de las clulas osmticamente, mediante crioprotectores con curvas de enfriamiento determinadas. El proceso de congelacin comienza en el espacio extracelular, con la formacin de cristales de agua pura (hielo). Esto causa un aumento en la concentracin (hipertonicidad) de la solucin lquida extracelular restante respecto al medio intracelular, lo que perturba el equilibrio osmtico atrayendo agua intracelular al exterior, y la clula queda

parcialmente deshidratada. Mientras siga la disminucin de la temperatura, ms hielo extracelular se forma, ms agua abandona la clula, y el grado de deshidratacin celular aumenta. La solucin extracelular contina aumentando de concentracin, y el punto de congelacin desciende considerablemente. En estas condiciones de sobresaturacin, la solucin es capaz de seguir enfrindose sin lmite. El efecto general de un descenso de temperatura es el retardamiento de todos los procesos dinmicos, como son las tasas de difusin y reaccin. Este retardamiento es bastante independiente de la congelacin en s, pero est muy influenciada por el aumento en la concentracin de la solucin que tiene lugar durante el proceso. El uso de nitrgeno lquido (-196 C) permite hoy en da, el almacenamiento indefinido de la mayora de las clulas tras su congelacin. El mecanismo preciso para la criopreservacin convencional (congelacin lenta) ptima ha sido establecido tras el estudio de los efectos producidos por diferentes protocolos de congelacin y descongelacin. La mayora de las clulas deben ser enfriadas lentamente, de -1 a 3 C/min., en el caso de los embriones se controlan curvas de congelacin de - 0.3 a - 0.5 C/min, y descongeladas rpidamente para alcanzar el mximo de viabilidad. La tasa de enfriamiento (velocidad a la que disminuye la temperatura), debe ser optimizada para dar tiempo a que el agua intracelular salga al exterior de la clula, y consiguientemente, reducir la cantidad de hielo intracelular formado. Existen congeladores controlados por programas con los que se consiguen perfiles de enfriamiento individuales, alcanzando una viabilidad mxima durante el proceso de criopreservacin. Todos estos procesos tienen cierto grado de efectos lesivos sobre el material biolgico que se est criopreservando. Se ha reportado que cuando disminuye la temperatura y el agua se congela en el espacio extracelular, tanto el estrs osmtico producido, como el incremento en las concentraciones de los solutos intracelulares, pueden dar lugar a daos irreversibles. Por lo tanto, no necesariamente es el hielo el que directamente causa el dao, sino que ste puede ser producido de modo indirecto. Existe el llamado "efecto de solucin", que es el dao que puede producir la solucin de congelacin en las clulas debido a las diferencias osmticas a que stas son expuestas. Por otro lado, el efecto de congelacin", es el dao celular debido a las bajas temperaturas que se alcanzan y a la formacin de cristales de hielo. En todo proceso de criopreservacin, la temperatura y el tiempo de exposicin son dos factores fundamentales que hay que controlar. El principio bsico de la congelacin de embriones, es la de inducir una deshidratacin parcial a fin de evitar la formacin de cristales que lesionen las estructuras citoplasmticas. Este evento se logra incorporando un agente crioprotector al medio de congelacin. En la congelacin de embriones se utilizan dos tipos de crioprotectores: Permeables o intracelulares Son de bajo peso molecular (menor a 100), Glicerol (G), Dimetilsulfxido (DMSO), 12 propanodiol, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG), polietilenglicol (PEG), etanol y otros alcoholes; todos estos compuestos deshidratan la clula penetrando a sta para ayudar a proteger el citoplasma.

Impermeables o extracelulares Estos son de alto peso molecular, polivinilpirrolidona (PVP), glucosa, fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sacarosa, lactosa, trealosa, rafinosa y otros azucares, estos compuestos extraen el agua libre intracelular utilizando la diferencia de presin osmtica sin penetrar a la clula; son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de las membranas a baja actividad de agua; deshidratan junto con el crioprotector las clulas de los embriones. Los crioprotectores mas comnmente utilizados en la actualidad en los procedimientos tradicionales de congelacin lenta son. El Glicerol y Etilenglicol El glicerol (G) que se emplea para la congelacin de embriones debe tener una concentracin de 1.4 Molar (M) o estar al 10% en una solucin de fosfato buferado salino (PBS), en combinacin de albmina srica bovina al 0.4% (BSA). El Etilenglicol se utiliza a una concentracin de 1.5 M. El procedimiento de congelacin tradicional consiste en: A). La exposicin de los embriones al medio de congelacin (glicerol o etilenglicol) debe realizarse a temperatura ambiente (20 - 22 C) en un solo paso, de 10 a 30 minutos de duracin. Este perodo incluye el envasado de los embriones en pajillas de punto 0.5 0.25 ml (el empajillado convencional se realiza depositando una columna de medio de trasferencia, aire, columna de medio de congelacin con el embrin, aire, columna de medio de transferencia, aire y sellado de la pajilla), previamente identificadas de acuerdo a los criterios empleados por la Sociedad Internacional en Trasferencia de Embriones (IETS pos sus siglas en ingles). El envasado permite realizar ms rpidamente y con mayor precisin la induccin de la cristalizacin o "seeding". B). Las pajillas deben ser colocadas en un equipo de congelacin a 6 -7 C durante 2 a 5 minutos para equilibrar la temperatura de las pajillas con la del equipo; el seeding se realiza poniendo en contacto la superficie de la pajilla con un objeto metlico o un hisopo enfriado en nitrgeno lquido (NL2), en la parte superior de la columna donde se localiza el embrin; el agente refrigerante del equipo puede ser nitrgeno lquido alcohol o etanol enfriado dependiendo del equipo de congelacin disponible. El no inducir la cristalizacin conduce la formacin de cristales de hielo bajo un estado de sper enfriamiento y a una elevacin repentina de temperatura (se genera calor latente de 10 a 15 C), resultando en un severo trauma fsico que puede daar las clulas. Una vez efectuado el seeding, se mantiene la temperatura estable durante 10 minutos (perodo de estabilizacin o equilibrio) y luego se desciende a una velocidad de entre 0.3 a 0.5 C hasta -30 -35 C para establecer un adecuado balance entre deshidratacin y formacin de hielo intracelular, en este momento las pajillas pueden ser retiradas del equipo de congelacin y sumergidas en nitrgeno lquido.

C). La descongelacin se realiza de manera rpida, los embriones empajillados son sacados del termo de almacenamiento y expuestos al medio ambiente durante 10 segundos, inmediatamente despus son sumergidos en agua a 30 35C durante 2530 segundos. Este procedimiento es el empleado para embriones criopreservados en G, los embriones conservados en EG se descongelan a 25 30 C durante 15 a 20 segundos. Una de las mayores ventajas de los embriones congelados con EG es el de poder ser transferidos de manera directa a las receptoras, sin la necesidad de utilizar diluyentes para su descongelacin ni el microscopio para observar los embriones. Hay dos mtodos para descongelar los embriones cuando son congelados en glicerol, esto es con la finalidad de que la hidratacin del embrin se realice de manera paulatina para evitar el choque osmtico. 1) Tres pasos, se utiliza medio que contiene PBS+BSA+Sacarosa y glicerol en diferentes concentraciones. En cada uno de los medios el embrin debe permanecer durante 5 min. Posteriormente es depositado en el medio de mantenimiento hasta su transferencia. Medio 1: PBS+BSA+Sacarosa + 6% glicerol Medio 2: PBS+BSA+Sacarosa + 3% glicerol Medio 3: PBS+BSA+Sacarosa Medio de mantenimiento PBS+BSA 2) Descongelacin en un paso Medio 1: PBS+Sacarosa 0.25% Medio de mantenimiento PBS+BSA Los embriones de calidad 1 y 2 segn la clasificacin de la IETS son los destinados a ser congelados. La fertilidad lograda de acuerdo a la calidad y grado de desarrollo (mrula o blastocisto) de los embriones congelados en G EG es muy controversial, en algunos trabajos se reportan diferencias significativas en los porcentajes de gestacin, mientras que otros investigadores no han encontrado diferencias. Los porcentajes de gestaciones logrados en la actualidad con embriones congelados producidos in vivo en bovinos oscilan en el rango del 40 al 50% y con embriones obtenidos in vitro es de un 15 a un 30%. VITRIFICACIN El mximo dao en el embrin durante el enfriamiento ocurre de -15 a -16 C debido a la fase de transicin de la membrana lipdica. Esta fase se ve afectada por la fusin de los liposomas afectando el termo comportamiento de las membranas en la transicin de lquido a hielo y la velocidad de penetracin de los crioprotectores. El dao celular incluye prdida de microvellosidades, disrupcin de la membrana plasmtica, cambios mitocondriales, hinchamiento del retculo endoplsmico, prdida de uniones entre clulas as como fractura de zona pelcida. Estas alteraciones se pueden presentar en un alto grado en los procedimientos de congelacin lenta. Con el ultra enfriamiento (se logran temperaturas de -1000 a -2000 C/min) obtenido con la vitrificacin estos daos se pueden evitar de manera importante. La

vitrificacin es un metodo de enfriamiento rpido, con descenso brusco de temperatura, tras el tiempo de equilibrio de los embriones en los medios a temperatura ambiente, estas clulas son sumergidas directamente en nitrgeno lquido. No hay tiempo para la deshidratacin. Se fundamenta en que estos medios poseen unas concentraciones altas de crioprotectores (molaridad entre 4 y 7), que hace imposible la formacin de cristales de hielo. Se produce una sobresaturacin, y el paso a un estado altamente viscoso similar al vidrio (vtreo, de ah su nombre), que sin llegar a slido reduce el movimiento molecular casi totalmente. El mejoramiento del proceso de la vitrificacin con el mtodo Open Pulled Straw (OPS), ha proporcionado altas tasas de gestacin. La vitrificacin se realiza a temperatura ambiente y el procedimiento planteado por Seidel and Walter 2006, donde se utiliza la pajilla para conservar el embrin con el medio comercial de Syngro- Bioniche es el siguiente: A). Se lavan 2 veces, clasifican segn criterio de la IETS y se mantienen los embriones en el medio H (Medio base: Syngro-Bioniche 0.1% alcohol polivinilico) B). Posteriormente los embriones se colocan en 0.5 ml del medio V1 durante 3 minutos (5 M de Etilenglicol + medio base) C). Se depositan los embriones en gotas de 15 del medio V2 (7 M de Etilenglicol, 18% de Ficoll 70, 0.5 M de galactosa + medio base) por 45 segundos. D). Los embriones se cargan en pajillas de 0.25 ml identificadas segn la IETS. Se carga un 1cm del medio D, 0.5 cm de aire, 7 cm de medio D, 0.5cm de aire, gota del medio V2 con los embriones, 0.5 cm aire y al final 1cm de medio D y se sella la pajilla. E). Las pajillas se coloca en un goblens suspendido sobre nitrgeno lquido previamente a la introduccin de la pajilla. La pajilla se mantiene en vapores de nitrgeno lquido durante 1 minuto y luego es introducido directamente al nitrgeno. Todo este proceso tiene una duracin de 10 min. Calentamiento o revitalizacin Las pajillas se exponen 8 segundos en el aire 15 segundos en bao Mara a 35 37 C Los embriones pueden ser transferidos directamente o colocados en medio Hepes-Talp + 10 % suero fetal o BSA (Sero Albumina Bovina), para su evaluacin y posterior transferencia. Existen una gran variedad de protocolos para vitrificar embriones en las diversas especies, por el momento no hay uno estandarizado para bovinos, la mayora de estos varan en la concentracin de los crioprotectores, material de almacn del embrin. El mtodo OPS y el de la pajilla de 0.25 ml son los ms utilizados en bovinos, en algunos estudios han logrado un 40 a 70 % de gestaciones

con embriones producidos in vivo e in vitro arriba del 40 %. Otra de las ventajas que brinda esta tcnica en bovinos, es que no se requiere de equipo de congelacin para realizarlo. El resultado de la vitrificacin est condicionado previamente por la calidad del embrin y el estado de desarrollo embrionario. Cuando se vitrifican embriones de calidades 1 y 2 se obtienen mejores resultados que con aquellos de calidad regular. La etapa del desarrollo ms apropiada para la vitrificacin de embriones es mrula compacta a blastocisto expandido, siendo ms sensibles a las bajas temperaturas los embriones producidos in vitro. LITERATURA CONSULTADA
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