Las plantas

como
biorreactores.

EQUIPO 3
En los ltimos aos, la demanda y uso de pptidos y protenas
teraputicos en la medicina humana y veterinaria han
experimentado un marcado incremento.
Diversos tipos de productos que actualmente se producen en plantas incluyen antgenos
vacnales, protenas de diagnstico mdico, protenas industriales y farmacuticas,
suplementos nutricionales como minerales, vitaminas, hidratos de carbono y biopolmeros.

Como el rendimiento y la concentracin de un producto es crucial para la viabilidad

comercial, se han desarrollado varias estrategias para aumentar la expresin de protenas
en plantas transgnicas
 Ventajas
El uso de plantas como biorreactores ofrece varias ventajas sobre otros mtodos biolgicos de
produccin de protenas.

Cultivos sustentables

Los sistemas de plantas como biorreactores pueden ser fcilmente adaptados a operaciones a
larga escala simplemente incrementando el nmero de plantas.

Existe un riesgo mnimo de contaminacin por toxinas o patgenos humanos.

 Objetivos
Usar plantas como medio de produccin de pptidos bioactivos, antgenos
vacnales, anticuerpos, protenas, suplementos nutricionales, enzimas y
plsticos biodegradables mediante el uso de tcnicas biotecnolgicas.

6 Temas selectos de Biotecnologa

 Metodologa Los pasos que constituyen el proceso de la
produccin de protenas recombinantes en
plantas incluye:
I. Seleccin de la especie hospedante y
optimizacin de la secuencia codificante
del gen en relacin al hospedante.
II. Creacin del vector de expresin.
III. Integracin del gen construido en el
genoma de la planta y regeneracin de la
misma para la expresin de la protena de
inters.
IV. Identificacin y estabilizacin de la lnea
de produccin de la planta.
V. Purificacin y caracterizacin de la
protena recombinante.

7 Footer text here

 Conclusiones
Las plantas presentan caractersticas muy atractivas para ser utilizadas en la
produccin de protenas recombinantes, entre otras, fcil cultivo, bajo costo,
aumento fcil de la escala de produccin por extensin de la superficie
cultivada si crece la demanda. Adems, la posibilidad de almacenar
establemente las protenas recombinantes en semillas y tubrculos facilita su
transporte.

8 July 22, 2012 Footer text here

 Molecular Pharming- VLPs made in Plants
Introduccin
VLPs---Virus-like particles

Molecular Pharming o cultivo molecular es un termino relativamente

nuevo que hace referencia a la expresin recombinante de compuestos
farmacuticos tiles como protenas en plantas.
Los VLPs son versiones de partculas virales que mantienen su
morfologa pero carecen del material gentico infeccioso.
Por lo que los VLPs retienen la conformacin antignica nativa de las
protenas inmunognicas y la secuencia repetitiva del virus.

9 Temas selectos de Biotecnologa

 Objetivos
Describir mtodos de expresin en plantas de las VLPs.
Analizar los mtodos mas recientes de la obtencin de VLPs vegetales.

10 July 22, 2012 Footer text here

 Expresin de productos farmacuticos
Existen 2 tipos de expresin de productos farmacuticos considerando VLPs en plantas.

Tipo de expresin Caractersticas

Utilizada en los comienzos de la farmacologa molecular
Requiere mucho tiempo para concluirse
Estable No viable para cribacin rpida de constructos o respuesta rpida a
una epidemia.
Al formar parte del genoma dicha expresin es heredable.
Utiliza a la bacteria Agrobacterium tumefaciens debido a que puede
transferir parte de su plsmido Ti (inductor tumoral).
Insercin del gen de inters en la regin T-DNA de un plsmido
Transitoria binario para luego ser expresado en la clula vegetal.
Permite una cribacin y produccin en un menor tiempo.
No forma parte definitiva del genoma y por lo tanto no es heredable.

11 July 22, 2012 Footer text here

 Vectores virales para la produccin de VLP
Dichos vectores estn basados en genomas virales completos o vectores
deconstruidos.

Vector viral Ventajas Desventaja

Completo Expresin de protenas heterlogas. El vector mantiene todos sus genes ya
sea esenciales o no esenciales.
Biocontencin en la expresin de
protenas.

Deconstruido Eliminacin de genes virales no

esenciales.
Expresin rpida y de alta nivel de
protenas recombinantes.
No genera una biocontencin.

12 July 22, 2012 Footer text here

 Descripcin esquemtica de la expresin transitoria

13 July 22, 2012 Footer text here

 VLPs expresadas transitoriamente
Virus papiloma (PVs)
Son virus de ADN inducidos por tumores no
envueltos
Expresaron LV de HPV-8 de longitud completa y
una versin truncada, producida por la supresin
de la seal de terminacin nuclear C-terminal,
utilizando tres expresiones de plantas diferentes
Vectores. El pEAQ-HT total indujo la expresin
ms alta de protenas de capcide.
N. benthaminana
Virus de lengua azul
Tiene un genoma de ARN bicatenario
multicomponente encapsidado en un virin
complejo.
se han producido en plantas utilizando pEAQ-HT.
El enfoque para su produccin implic la co-
expresin de las cuatro protenas estructurales
vricas diferentes con el fin de obtener grandes
cantidades de VLP correctamente ensambladas.
 Norovirus El virus Norwalk (NV)
Las investigaciones se han centrado
recientemente en la expresin
transitoria de la protena de la cpside
del virus Narita 104 (NaVCP) en
Nicotianabenthamiana utilizando el
sistema magnICON1.
La produccin de NaVCP VLP que
generan una respuesta importante de
la mucosa y del anticuerpo srico
demostrando que los autores han
hecho una potencial vacuna candidata
contra NV.
Virus de la gripe
Las vacunas actuales se basan en las
protenas de superficie hemaglutinina
y neuraminidasa
Medicago USA Inc. adapt la
expresin VLP de la influenza a base
de plantas en la produccin se mostr
que las plantas son capaces de
producir VLP envuelto gripe que
contiene HA que provocan una
respuesta inmune protectora en
ratones.
 Virus del mosaico del caup
El objetivo de producir VLPs basadas en CPMV fue hacer VLPs libres de ARN
(eVLPs) para su uso en bionanotecnologa en lugar de producir una vacuna
candidata.
Tales VLPs fueron generados por la co-expresin transitoria del precursor de
las dos protenas de la cubierta viral, VP60, y la proteinasa viral, 24K en N.
benthamiana utilizando el sistema de expresin pEAQ-HT.
 Agroinfiltracin

I. Se cultiv A. tumefaciens LBA4404 en un medio especializado.

II. Los cultivos preincubados se infiltraron por medio de una jeringa sin aguja a
las hojas de N. benthamiana, despus fueron incubadas en un invernadero
por aproximadamente de 3 a 7 das.
III. Los tejidos foliares agroinfiltrados se trituraron con un mortero en nitrgeno
lquido. Se aadi el polvo fino resultante a un volumen igual de tampn de
extraccin (Tris-Cl 200 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, sacarosa 400 mM, EDTA
10 mM, 2-mercaptoetanol 14 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, Tween
20 al 0,05% ).
IV. Las muestras se centrifugaron dos veces a 13.000 x g durante 10 min a 4 C.

17 July 22, 2012 Footer text here

 V. 30 microgramos de protena soluble fueron separados por medio de un gel
de electroforesis.
VI. Las bandas de protenas separadas se transfirieron a una membrana
Hybond C. La membrana se incub por 2 horas en un anticuerpo de conejo
resistente a la glicoprotena VHSV.
VII. Finalmente la fusin de las protenas agroinfiltradas fue determinada va
Gm1-ELISA.

18 July 22, 2012 Footer text here

 Conclusiones
La produccin de frmacos en plantas es una tecnologa prometedora con un
inters creciente para el desarrollo de vacunas.

Se ha demostrado que una amplia variedad de VLPs los cuales se pueden

producir rutinariamente en las plantas.

Las plantas son una plataforma econmica y segura para la vacuna debido a la
facilidad de escalabilidad y un bajo riesgo de contaminacin con endotoxinas o
patgenos humanos.

19 July 22, 2012 Footer text here

 Produccin de glicoprotenas virales del virus de la
septicemia hemorrgica en el tabaco
El virus de la septicemia hemorrgica (VHSV) causa la muerte de
numerosas especies de peces de agua dulce y salada, ocasionando
grandes prdidas en la pesca.
El gen de la glicoprotena del VHSV se fusion con la subunidad B de la
toxina del clera (CTB) y se expres en tejidos foliares de Nicotiana
benthamiana mediante el mtodo de la agroinfiltracin.

20 Temas selectos de Biotecnologa

 Produccin de glicoprotenas virales del virus de la
septicemia hemorrgica en el tabaco
El gen de la glicoprotena se dividi en dos partes para mejorar el
ensamblaje de protenas de fusin CTB (CTB-VHSV99-235 y CTB-
VHSV258-417).
El nivel de expresin de las protenas de fusin CTB-VHSV fue de 0,86%
(CTB-VHSV99-235) y 0,93% (CTB-VHSV258-417).
Estos resultados demuestran la viabilidad de usar tejidos de hojas de
plantas agroinfiltrados que expresan antgenos de fusin CTB como una
vacuna basada en plantas para prevenir la infeccin por VHSV.

21 Temas selectos de Biotecnologa

 Metodologa
Preparacin de la planta
Las semillas de N. benthamiana fueron esterilizadas
por 10 minutos en una solucin al 2% de hidroclorito de
sodio con unas gotas de Tween 20, posteriormente
lavadas cinco veces en agua destilada y puestas a
germinar en condiciones de esterilidad.
Medio MS basal: 3% sucrose y 0.8 % agar planta a
25C

22 July 22, 2012 Footer text here

 Bibliografa
Marsian J., Lomonossoff G.P. Molecular pharming-VLPs in plants. Current
Opinion in Biotechnology (2016). . ELSEVIER, 201-206.
Quang D. N., Jung K. T., Geum K. T. Viral hemorrhagic septicemia virus
glycoprotein production in tobacco. Protein expression and purification
(2017).

23 July 22, 2012 Footer text here