Universidad Tcnica de Ambato

ultad de Ciencia E Ingeniera en Aliment

Ingeniera en Alimentos
ANALISIS DE LOS ALIMENTOS II

VITAMINAS LIPOSOLUBLES
A,D,E,K
Integrantes:
ANDREA CAGUANA
DAVID LARA
WENDY SUAREZ

Abril- Septiembre

VITAMINA A

Se presenta principalmente bajo la forma

de alcohol (retinol) y esteres (palmito de
retinol) y secundariamente en forma de
aldehdo (retinal) y de acido (retinoico)

Para que las molculas sean eficaces

deben contener solo enlaces insaturados
del tipo trans

En todas sus formas la vitamina A es fcilmente

oxidable y por ello es necesario operar en
presencia de un antioxidante (BHT o acido
ascrbico) o una atmosfera inerte y protegida de
la radiacin UV y visible

EXTRACCIN
Puede
realizarse
directamente
con
un
solvente apolar como el
hexano,
que
permite
diferenciar entre la forma
libre y los esteres del retinol

La muestra es homognea
con un volumen de agua a
la que se adiciona un
volumen de etanol y un
antioxidante.

Las protenas se precipitan

a 60C y la saponificacin
se realiza a la misma
temperatura con hidrxido
potsico
alcohlico
al
menos durante 10 minutos
a reflujo

El retinol se extrae con 3

alcuotas de hexano los
extractos se lavan con agua
y se llevan a un volumen
conocido con hexano

Una alcuota se lleva a

sequedad (al vaco o con
nitrgeno) y el residuo se
redisuelve en la mnima
cantidad de un solvente
apropiado
para
su

La
norma
AFNOR
recomienda que no se
utilice la extraccin directa
liquido-liquido para que sea
completa la extraccin del
retinol

MTODOS DE DETERMINACIN
MTODO COLORIMTRICO
Carr y Price (1926) pusieron a punto un mtodo basado en la
coloracin azul que se forma en la reaccin de los
carotenoides con el tricloruro de antimonio, leda a 620 nm.
Para obtener una especificidad satisfactoria, suele
recomendarse reextraer el extracto bruto con acido
trifluoroactico que elimina algunas interferencias.
Inmediatamente, se precede a realizar una cromatografa en
capa fina sobre almina para fraccionar el retinol

MTODOS
CROMATOGRFICOS
El mas utilizado es el HPLC
con detector UV de longitud
de onda fija o variable,
permite la separacin de 3
formas vitamnicas (retinol,
retinal y acido retinoico)

Fases estacionarias
normales de slice en la
que los compuestos mas
hidrfobos son eluidos con
eluyentes apolares del tipo
hexano: los elementos mas
apolares se separan
rpidamente aplicando un
gradiente de elucin, estas
columnas se recomiendan
para la separacin de los

Fases estacionarias
inversas de slice, la
elucin se realiza con
mezclas de solventes
polares siendo las
sustancias menos
hidrfobas las que
eluyen en primer lugar.
Este tipo de columna es
adecuada para la
separacin de los
esteres del retinol que

CAROTENOIDES

Esta
familia
esta
constituida
por
un
centenar de molculas
que tienen un gran
inters en el sector
agroalimentario
Una
docena
de
compuestos
son
provitaminas A (carotenos), cuya actividad
es, en general, la doceava parte del retinol.
Desde el punto de vista qumico, se trata
de hidrocarburos caracterizados por una
serie de dobles enlaces conjugados.
Actualmente se reconocen las propiedades
antioxidantes de algunos carotenoides que
desempean un papel favorable en la
prevencin de tumores y en la potenciacin
de la respuesta inmunitaria

EXTRACCIN
Estos
compuestos
son tan sensibles
como el retinol a la
oxidacin, a la luz, a
la radiacin UV y a
la acidez

Por
lo
que
manipulaciones
deben realizarse
condiciones
rigurosamente
controladas
y
abrigo
de
factores
desfavorables

las

Los lpidos polares y

otras
sustancias
anlogas
se
eliminan por lavados
con agua salada.
Los
carotenos,
liposolubles,
se
extraen con hexano

Para
la
determinacin
de
los carotenos, la
muestra
se
homogeneiza
en
presencia
de
un
solvente
miscible
con el agua

en
al
los

MTODOS DE DETERMINACIN
Los mtodos clsicos recurren a
columnas abiertas con lechos de
adsorcin muy polares para purificar
los carotenos y separar xantofilas

Mtodos
de
cromatogr
afa de
adsorcin
y de capa
fina

Esta analtica no permite llegar a la

separacin individual de los diversos
carotenoides. La medida de los
compuestos mayoritarios se realizan
por espectrofotometra a 432 nm para
los carotenos y a 474 nm para las
xantofilas
La CCF se utiliza sobre todo como
etapa
preparativa
previa
a
la
determinacin
de
HPLC.
Las
manipulaciones son en todos los
puntos comparables a las que se han
descrito en el caso de la cromatografa
en columna.

Cuando se desea separar y cuantificar

los carotenoides de forma individual y
precisa, el mtodo de eleccin es la
HPLC. Con esta tcnica instrumental,
los riesgos de alteracin son mnimos

Mtodo
de
Cromatog
rafa
Liquida
de Alta
Resoluci
n

Adems ofrece un poder de

resolucin
elevado
para
los
carotenos y las xantofila, as como
entre los propios ismeros
La mayora de las tcnicas se
emplean columnas de la fase
inversa C18, aunque se consiguen
una mayor selectividad con fases
C30
La eleccin de un patrn interno
satisfactorio supone una dificultad
cuando
se
requiere
la
cuantificacin de los picos

VITAMINA D
La vitamina D de efecto antirraqutico se encuentra en
diversas formas; las dos ms importantes son la
vitamina D2, ergocalciferol, previamente conocida como
calciferol y la vitamina D3, colecalciferol. La vitamina
D2se encuentra en pequeas cantidades en los aceites
de hgado de pescado.
La vitamina D3est ms ampliamente distribuida en la
naturaleza y se encuentra en cantidades relativamente
grandes en los aceites de hgado de pescado, y en
cantidades ms pequeas en pescados tales como
arenque, caballa, salmones y sardinas, en huevos,
mantequilla y queso crema.

SAPONIFICACIN Y EXTRACCIN
Si ha de determinarse la
vitamina D3, se agrega D2como
estndar interno

La vitamina D2y la vitamina D3son extradas de los alimentos

mediante saponificacin utilizando una solucin alcohlica de
hidrxido de potasio seguida de una extraccin del solvente.

Si ha de determinarse la
vitamina D2, se agrega D3como
estndar interno.

La determinacin de vitamina D2y D3en una solucin apropiada

del extracto de la muestra se realiza mediante HPLC de fase
normal semipreparativa seguida por HPLC de fase reversa
analtica.
La cromatografa se monitorea por UV y se logra la
identificacin de los picos de acuerdo a los tiempos de
retencin y la cuantificacin se realiza por el mtodo de
estndar interno utilizando las reas o las alturas de los picos.

De 10 a 30g de la muestra se
saponifican
preferentemente
bajo nitrgeno utilizando una
mezcla de etanol o metanol,
agua, un antioxidante tal como
cido ascrbico, hidroquinona,
pirogalol o BHT e, hidrxido de
potasio acuoso.

El antioxidante debera agregarse

a la muestra antes de la adicin
de la solucin de hidrxido de
potasio
necesaria
para
la
saponificacin.

Si ha de determinarse vitamina D3, se pipetea

una cantidad apropiada de estndar de vitamina
D2en la solucin alcohlica dentro del frasco de
saponificacin. La cantidad de estndar interno
de vitamina D2agregada deber ser similar a la
cantidad de vitamina D3esperada en la muestra
y viceversa.

La vitamina D2y D3son extradas de la mezcla

enfriada de saponificacin por medio de un solvente
adecuado, como ter dietlico, tertbutil metil ter, nhexano, ter de petrleo o mezclas, de 3 a 4 veces
con volmenes que fluctan de 50-150 ml. Los
extractos combinados son lavados a pH neutro con
agua (2-4 veces, 50-150 ml).

El tiempo normal de
saponificacin es de
20-45 minutos con
temperaturas
que
fluctan de 80 a
100C (reflujo).

EVAPORACIN Y DILUCIN
Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto
antes de la evaporacin utilizando un evaporador
rotatorio bajo un vaco parcial y a una temperatura que
no exceda 50C. Deben tomarse medidas para remover
restos de agua tales como secar con sulfato de sodio, o
destilacin azeotrpica con etanol o tolueno o el uso de
papel filtro para separacin de fases.
El residuo es redisuelto utilizando de preferencia la fase
mvil del sistema HPLC semipreparativo u otro solvente
compatible con HPLC de tal modo de obtener una
concentracin apropiada para la inyeccin dentro de la
columna de HPLC

HPLC
Condiciones y cuantificacin deHPLC
Una alcuota del extracto de la muestra concentrada se inyecta
en el sistema HPLC semipreparativo y la fraccin de la vitamina
D es recogida va corte de bandas. La ventana de tiempo para
el corte de banda debe haberse determinado previamente
utilizando una mezcla estndar de vitamina D y debera ser lo
ms angosta posible.
La fraccin del corte de banda obtenida en la HPLC
semipreparativa debe llevarse a sequedad y redisolverse en un
solvente compatible con la fase mvil del sistema analticode
HPLC analtico. Se inyectan alcuotas de la solucin obtenida y
se identifican y cuantifican los picos de vitamina D2y
D3utilizando el mtodo estndar interno.

Sistema
normal)

semipreparativo (fase

Un estndar mixto de vitamina D2y

D3es
cromatografiado
en
el
sistema HPLC semipreparativo y la
condiciones optimizadas de tal
manera de obtener con un tiempo
de retencin reproducible un slo
pico de vitamina D y tambin tener
una ptima separacin de otros
componentes que interfieren. Esto
permite una recoleccin precisa de
la banda de la fraccin de vitamina

Sistema analtico (fase

reversa)
Un estndar mixto de vitamina
D2y
D3deber
ser
cromatografiado en el sistema
analtico de HPLC ajustando las
condiciones
cromatogrficas
hasta que la resolucin de la
vitamina D2y D3est al menos
completada en un 98% y las
vitaminas sean resueltas de
todas las interferencias de
matriz de los alimentos.

VITAMINA K
La vitamina K de efecto antihemorrgico, que tiene un
rol importante en regular la coagulacin sangunea se
encuentra en una serie de formas.
Est presente en plantas verdes, vegetales verdes
(repollo, espinaca), papas, frutas (tomates, frutillas),
escaramujos y tambin en aceites de hgado.
La suplementacin de las frmulas infantiles con
vitamina Kha recibido alguna atencin dado que ayuda
a proteger a los recin nacidos en contra de la muerte
por hemorragia.

DIGESTIN ENZIMTICA Y
EXTRACCIN

Dado que la vitamina K1no

es estable bajo condiciones
alcalinas, el material lipdico
por lo general presente en
frmulas infantiles y leche
en polvo es removido por
una digestin con lipasa.
La
determinacin
de
la
vitamina K1en la solucin del
extracto de la muestra se
realiza mediante HPLC semipreparativa de fase normal
seguida por HPLC analtico de
fase reversa.

Se agrega fenilacetato de
colesterol como estndar
interno y la vitamina es
extrada con hexano.

La deteccin de la vitamina K se
realiza mediante UV a 269 nm y se
logra la identificacin del pico sobre
la base de tiempos de retencin. La
cuanti-ficacin se realiza mediante el
mtodo
de
estndar
interno
utilizando las reas o alturas del pico.

Tres gramos de la muestra (frmula infantil o leche en polvo) o

15,0 g de frmula "lista para usar" se suspenden en agua, buffer
fosfato y 1 g de lipasa. La mezcla es incubada durante 120 min. a
37C. Se agrega 10 ml de etanol, el estndar interno y 1 g de
carbonato de potasio y se extrae la vitamina 2 veces con 15 ml
de hexano.

EVAPORACIN Y DILUCIN
Los extractos combinados son concentrados utilizando un evaporador rotatorio
bajo vaco parcial y a una temperatura que no exceda 40C.
Deben tomarse medidas para remover restos de agua tales como secar con
sulfato de sodio, o destilacin azeotrpica con etanol o tolueno o el uso de
papel filtro para separacin de fases.
El residuo es re disuelto en un pequeo volumen de n-hexano (1,5-2,0 ml).

HPLC
Condiciones y cuantificacin deHPLC
Una alcuota del extracto concentrado de la muestra se inyecta
dentro del sistema HPLC semipreparativo y la fraccin que
contiene la vitamina K1es recolectada va corte de bandas. La
ventana de tiempo para el corte de bandas debe haber sido
previamente determinada utilizando una mezcla estndar de
vitamina K1y deber serlo ms angosta posible.
La fracciin de corte de banda del HPLC semipreparativo debe
llevarse a sequedad y redisolverse en 500 l de 2-propanol. Las
alcuotas de la solucin obtenida se inyectan en el HPLC
analtico y se identifican los picos de la vitamina K1:y
fenilacetato de colesterol como estndar interno.

Sistema
normal)

semipreparativo (fase

Un estndar de vitamina K1es

cromatografiado en el sistema HPLC
semipreparativo y las condiciones
optimizadas de tal manera de
obtener un tiempo de retencin
reproducible para el pico de
vitamina K1y el pico de fenilacetato
de colesterol en el rango de 2,0-4,5
minutos.

Sistema analtico (fase

reversa)
Una mezcla de estndar de
vitamina K1y fenilacetato de
colesterol debe ser
cromatografada en el sistema
HPLC analtico y las condiciones
cromatogrficas ajustadas hasta
que se obtenga una resolucin
completa de los compuestos de
inters

VITAMINA E
La vitamina E que se encuentra en la naturaleza abarca una serie
de compuestos denominados tocoferoles y tocotrienoles.
Estos compuestos tienen diferentes actividades biolgicas y por lo
tanto es importante que sean cuantificados individualmente si ha de
determinarse la actividad biolgica de la vitamina E.
Entre las fuentes ms ricas de vitamina E estn los cereales,
germen de cereales y la mayora de las semillas oleaginosas,
nueces y aceites a partir de ellos. La vitamina E tambin se
encuentra en los vegetales con hojas (lechuga, espinaca, repollo,
puerro), en la grasa animal y tambin en la leche, mantequilla y
queso. El representante ms importante del grupo de la vitamina E
es -tocoferol.

Muestras de aceites y grasas que

contienen tocoferoles no esterificados

Muestras de aceites y grasas con

bajo contenido de agua y que
contienen
tocoferoles
no
esterificados pueden procesarse
muy fcilmente: Aproximadamente
2 g de muestra son pesados
exactamente hasta el mg ms
cercano dentro de un matraz
aforado de 25 ml.
Esta solucin de la muestra
puede utilizarse slo en el
sistema cromatogrfico de fase
normal. Puede ser necesario
diluir ms esta solucin antes de
la cromatografa o utilizar un
menor peso de la muestra.

Se agrega hexano u otro solvente

apropiado y se disuelve con
agitacin. La sonicacin de la
solucin puede apoyar el proceso
de disolucin. El volumen es
completado hasta el aforo con el
mismo solvente.
La margarina o mantequilla se tratan
de una manera similar. Es necesario
separar la grasa de estas muestras
antes de la etapa de dilucin. Esto
puede
realizarse
por
ejemplo:
mezclando la muestra con sulfato de
sodio anhidro, agregando n-hexano
y, tratando la mezcla en un bao
ultrasnico.

Los slidos son filtrados y lavados extensamente con n-hexano.

Se remueve el solvente utilizando un evaporador rotatorio y un
vaco parcial a una temperatura que no exceda 50C, y el residuo
es disuelto en un volumen definido de n-hexano y cuantificado
por HPLC de fase normal.

SAPONIFICACIN Y EXTRACCIN

El procedimiento ms comn para

la determinacin de tocoferoles
incluye la saponificacin alcalina
de las muestras seguida por la
extraccin
del
material
no
saponificable con un solvente
orgnico apropiado.

Cualquier ster de a-tocoferol que pueda haberse agregado

como un suplemento a los alimentos ser convertido a ttocoferol por este procedimiento. Se saponifica 2-10 g de la
muestra preferentemente bajo nitrgeno utilizando una mezcla
de etanol o metanol, agua, un antioxidante tal como el cido
ascrbico, hidroquinona, piro-galol o BHT e hidrxido de potasio
acuoso.

Los tocoferoles son muy sensibles al

oxgeno en un ambiente alcalino. Por lo
tanto, el alcohol y el antioxidante deberan
agregarse a la muestra antes de la adicin
de la solucin de hidrxido de potasio
necesario para la saponificacin y tiene
que tenerse cuidado en remover todo el
oxgeno del recipiente de reaccin.

EVAPORACIN Y DILUCIN

Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al

extracto antes de la evaporacin utilizando un
evaporador rotatorio bajo un vaco parcial y a una
temperatura que no exceda 50C. Deben tomarse
medidas para remover restos de agua tales como
secar con sulfato de sodio, o destilacin
azeotrpica con etanol o tolueno o el uso de papel
filtro para separacin de fases.
El residuo es redisuelto utilizando de preferencia
la fase mvil u otro solvente compatible con HPLC
de tal modo de obtener una concentracin
apropiada para la inyeccin dentro de la columna
de HPLC. Esta la solucin final de la muestra.

HPLC

Principalmente,
pueden
utilizarse
dos
modos
de
cromatografa (fase normal y fase reversa) para la
cuantificacin de los tocoferoles. El sistema de fase normal
tiene claras ventajas dado que todos los vitmeros son
separados mientras que los sistemas de fase reversa no
separan -tocoferol de y-tocoferol.

La deteccin se realiza preferentemente mediante

fluorescencia debido a su mayor selectividad as
como tambin por los menores lmites de
deteccin obtenidos si se compara con UV.

BIBLIOGRAFA:
Depsito de documentos de la FAO ; Anlisis de vitaminas liposolubles
en alimentos; disponible en
:http://www.fao.org/docrep/010/ah833s/ah833s19.htm ultimo acceso:
29/07/2016 a las 17:58