MTODOS DE OBSERVACIN

EN MICROBIOLOGA

Alex Gabriel Tapia Torres

INTRODUCCIN

Las clulas bacterianas no se pueden

observar a simple vista, sino tan solo la
consecuencia de su crecimiento y
divisin, es decir, un cultivo de
bacterias.

MICROSCOPIO PTICO ACTUAL

A) Lente ocular
B) Lente objetivo
C) Platina
D) Condensador
E) Pinzas para sujetar el
objeto
F) Espejo

ESQUEMA DEL MICROSCOPIO

Un tubo cilndrico aloja
el sistema ptico
ocular/objetivo.
Una platina permite
observar las
preparaciones, que son
iluminadas por un
espejo cncavo que
concentra la luz sobre el
objeto a estudiar.

TUBO O CAN Y CREMALLERA

Tubo

Cremallera

BRAZO Y TORNILLOS MACROMTRICO Y

MICROMTRICO

Tornillo macromtrico

Tornillo micromtrico

TAMBOR O REVLVER PORTAOBJETIVOS

Tambor

Objetivos

PLATINA Y PIE

Platina

Base o pie

LENTES OCULARES

Aumento

LENTES: OBJETIVOS

Estn colocados en
el revlver
Tienen un sistema
de amortiguacin
Un anillo coloreado
indica los
aumentos
Son de 4, 10, 20,
40, 60, y 100
(inmersin)
aumentos

Cdigo de
color de
inmersin
Negro

Medio de inmersin
Aceite

Naranja

Glicerol

Blanco

Agua

Rojo

Especial o multiuso

Cdigo de
color de
aumento

Aumento

Negro

1x, 2.5x

Marrn

2x, 2.5x

Rojo

4x, 5x

Amarillo

10x

Verde

16x, 20x

Azul turquesa

25x, 32x

Azul celeste

40x, 50x

Azul cobalto

60x, 63x

Blanco, crema

100x, 250x, 200x

DIAFRAGMA Y CONDENSADOR
Condensador:
concentra la luz de la
lmpara en un punto
de la preparacin

Diafragma o iris
(est dentro del
condensador):si se
cierra mejora el
contraste.

Lunes

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCPICAS

1. Observacin en fresco
Son preferibles en las situaciones siguientes:
La morfologa de las bacterias se altera cuando se desecan y
tien.
Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad
Para observar los cambios citolgicos que ocurren durante la
divisin celular
Por este mtodo se observan fcilmente algunas inclusiones
celulares como vacuolas y materias grasa.

2. Observacin con tinciones

Para observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias
Identificacin y diferenciacin de microbios entre especie y
dentro de la misma especie (tincin diferencial o selectiva).

Lunes

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCPICAS

1. Observacin en fresco
preparacin en fresco simple
preparacin en gota pendiente
2. Observacin con tinciones
Tincin simple: un solo colorante.
Tincin diferencial: ms de un colorante
Tincin especial
Tincin negativa: colorea el medio que rodea
a la bacteria permaneciendo sta sin teir.

Procedimiento para un preparado en

fresco
("entre porta y cubre")

1. Colocar una gota

2.- Tomar la muestra

de agua en un porta

con el asa de siembra o

un gotero

Muestra

Porta objeto

OBSERVACIN MICROSCPICA
1.

Observacin en fresco
Bacterias: Leptospiras,
treponemas (M. campo oscuro)

OBSERVACIN MICROSCPICA
1.

Observacin en fresco :
Parsitos : Trofozoitos, larvas.

OBSERVACIN MICROSCPICA
1.

Observacin en fresco
Hongos: Levaduras

Procedimiento para un preparado en

fresco
en gota pendiente

COLORANTE: DEFINICIN

Son compuestos orgnicos que

tienen alguna afinidad especfica
por algn componente.

Los colorantes son compuestos

qumicos utilizados para aumentar
el contraste

COLORANTES: TIPOS
a) Sales colorantes: ms comnmente usados
bsicos: Consisten en un catin coloreado unido a un

anin incoloro. Tien la clula bacteriana uniformemente

(cidos nucleicos y los polisacridos cidos )

(cromatina nuclear de pro y eucariotas)

(ms usados en citologa bacteriana).
Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la
fucsina bsica, el cristal violeta

cidos: Tienen el catin incoloro unido a un anin

coloreado. No tien la clula bacteriana, pueden usarse

como color de contraste (coloracin negativa). Tien
estructuras citoplasmticas de las clulas eucariotas(Rx
bsicas)
Ej:

eosinato (-) de sodio (+),la fucsina cida y el rojo Congo.

COLORANTES: TIPOS
b) Colorantes liposolubles
Se combinan con los componentes
lipdicos de la clula, usados para
revelar la localizacin de los depsitos
de grasa. Ej. Negro Sudn.

COLORACIONES : TIPOS

Vitales

Supravitales

Son aquellas que se practican sobre clulas que

estn vivas, mediante la introduccin de un
colorante en la circulacin de un organismo vivo.
Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos
vivos, pero que estn aislados del organismo del
que proceden.

No vitales

se realizan sobre clulas muertas.

TCNICAS PARA REALIZAR UNA

PREPARACIN COLOREADA
a)

Frotis o pelcula (extensin)

b)

La fijacin

c)

Coloracin.

Tincin de clulas para la observacin

microscpica

Extensin de una fina capa

de clulas sobre el porta

Adicin del colorante

lavado y secado
Secado al aire

Fijacin por flameado del porta

Se coloca una gota de aceite

de inmersin sobre el porta y
se observa con el objetivo de
100X

TCNICAS PARA REALIZAR UNA

PREPARACIN COLOREADA
b) La fijacin:
Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula
las sustancias proteicas)

TIPOS

CON CALOR (O MTODO DE KOCH)

FIJACIN QUMICA: alcohol metlico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman
(partes iguales de etanol absoluto y ter)

Metanol

TCNICAS PARA REALIZAR UNA

PREPARACIN COLOREADA

c) Coloracin. SIMPLE :
o negativa

Positiva

Tincin simple de azul de metileno.

Frotis y fijacin

1.- Poner una gota de

agua en un porta

2.- Tomar la muestra con

el asa de siembra

3.-Extender sobre el
agua y fijar a la llama
del mechero

Tincin

1.- Cubrir la
preparacin con Azul
de Metileno 5

2.- Lavar con agua,

dejar
secar
y
observar
al
microscopio

Micrococcus luteus

Lunes

Lunes

Tincin negativa.

1.- Colocar una gota de

Nigrosina en un porta

2.- Tomar muestra del

microorganismo con el
asa, flamear el tubo y
tapar

3.- Mezclar con la

Nigrosina
y
extender por todo el
porta. Secar al aire
y observar

cpsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos
refringentes y espiroquetas

TCNICAS PARA REALIZAR UNA

PREPARACIN COLOREADA
c) Coloracin. Diferencial o
compuesta
se

utilizan para distinguir

microorganismos

entre

tipos

de

Etapas :
1. tincin primaria
2. Tincin de contraste o secundaria

Ejemplo.:

COLORACION

COLORACION

DE

ZIEHL-

GRAM,
NEELSEN,

TERMINOS
Los

mordientes, aunque no son

colorantes, intensifican la tincin
porque aumentan la afinidad de la
clula por el colorante. Tambin se
pueden utilizar para producir un
engrosamiento de ciertas estructuras
celulares externas, como los flagelos,
que debido a su delgadez no podran
ser visualizados de otra forma.

COLORACIN DE ZIEHL- NEELSEN

fundamento de esta tcnica diferencial se basa en la
propiedad de la pared celular que contienen cidos
grasos (cidos miclicos) (50-90 tomos de carbono)
Resiste la decoloracin con alcohol y un cido fuerte
cuando
VARIANTES
Caliente : Mycobacterium
En fro (o de Kinyoun) : Cryptosporidium, Cyclospora
E

Miercoles

Tincin de cido-alcohol-resistente.
Tincin

Frotis y fijacin

1.-Poner una gota

agua en un porta

de

2.-Calentar con un hisopo

de algodn empapado en
alcohol y prendido con la
llama del mechero hasta
la emisin de vapores.
Mantener
durante
5
minutos.

2.- Tomar la muestra de

un
cultivo
de
Mycobacterium

3.-Lavar con agua

y decolorar con
alcohol cido

5.-Lavar con agua,

dejar
secar
y
observar
al
microscopio

3.-Extender sobre el
agua y fijar a la llama
del mechero

4.-Teir con Azul

de Metileno 1

1.-Cubrir la
preparacin con
Fuchina fenicada

Tincin de esporas.

Miercoles
Tincin

Frotis y fijacin

1.-Poner una gota

de agua en un
porta

2.-Calentar, con un
hisopo de algodn
empapado
en
alcohol y prendido
con la llama del
mechero, hasta la
emisin
de
vapores. Mantener
caliente durante 5
minutos.

2.-Tomar la muestra
de un cultivo de
Bacillus

3.-Lavar con agua

Espora
s

Bacteria
s

3.-Extender sobre
el agua y fijar a la
llama del mechero

4.-Teir con Safranina 1

1.-Cubrir la
preparacin con
Verde Malaquita

5.-Lavar con agua,

dejar
secar
y
observar
al
microscopio

LA TINCIN DE FLAGELOS DE
LEIFSON

1.Se fija qumicamente la suspensin bacteriana,

mediante formol, y se hace la extensin en un
portaobjetos.
2.Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno.
3.Se cubre la preparacin con una mezcla de cido
tnico y el colorante rosanilina, de preparacin
extempornea. El cido tnico engruesa los flagelos y la
rosanilina los tie.
4.Se retira el exceso de colorante con agua.
5. Por ltimo, se deja secar al aire, antes de su
observacin al microscopio.

Figura 3.11Tinciones especficas. (a) La tincin de Wirtz-Conklin se utiliza

para observar endosporas. Bacilius cereus (b) La tincin de Leifson revela
que este microorganismo posee flagelos, lo cual contribuye a su
identificacin como Spirillum volutans..(c) La tincin negativa con tinta
china permite observar que esta bacteria posee cpsula, lo que facilita su
identiticacin como Klebsiella pneumoniae, agente causal de la neumona.

HONGOS

AZUL DE LACTOFENOL
T. MENTAGROPHYTES