R.

ALEGRA
CONACYT 2002
JOS ROBERTO ALEGRA COTO
Depto. de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico
ralegria@conacyt.gob.sv
San Andrs, CENTA
Auditorio 2
Martes 10 de
Diciembre 2002.
INTRODUCCIN AL USO DE MARCADORES
MOLECULARES PARA CARACTERIZACIN DE
BIODIVERSIDAD
(39) GENMA, GEN Y
ADN RECOMBINANTE
OBJETIVO
Presentar informacin bsica de
manera comprensible sobre la
Biologa Molecular y sus aplicaciones
tcnicas.
INTRODUCCIN
GENMA Y GEN
ADN RECOMBINANTE
Tcnicas del ADN recombinante
Modelos Vegetales
Nuevas: protenas, plantas,
animales, alimentos, frmacos
Biotecnologas promisorias
CONTENIDO:
R. ALEGRA
CONACYT 2002
AVANCES HISTRICOS DE
BIOLOGA MOLECULAR
1941 Genes codifican las protenas
1944 Prueba que el ADN porta la informacin gentica
1953 Determinacin de estructura del ADN
1961 Cdigo Gentico, ARN mensajero, regulacin gnica
1967 Wise y Richardson aislaron ADN ligasa
1970 Smith y colegas aislaron y caracterizaron la Hind III
1972 Janet Mertz y Ron Davis cortaron y pegaron mol de ADN
1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr en bacterias
1974 Demostracin directa de deleccin gnica humana
1975 Southern Blotting
1977 Fred Sanger secuenci el virus de ADN X174
1978 Biblioteca gnica humana
1979 RFPL para diagnstico prenatal, oncogenes celulares
R. ALEGRA
CONACYT 2002
AVANCES HISTRICOS DE
BIOLOGA MOLECULAR
1979-81 genes humanos clonados y secuenciados
1982 Tabaco, la primera planta modificada genticamente
1983 Kary Mullis concibe el PCR / Fred Sanger y colegas
publican la secuencia del lambda
1986 La secuenciacin del ADN es automatizada
1987 Inicia el Proyecto del Genoma Humano
1995 Es secuenciado la bacteria Haemophillus influenzae
1996 Es secuenciada la levadura Saccharomyces cerevisiae
1998 Es secuenciado el nemtodo Caenorhabditis elegans
1999 Es secuenciado el cromosoma 22 humano
2000 Es secuenciada la mosca de la fruta D. melanogaster /
26 de junio se presenta 90% borrador genoma humano
2000 14 de dic. secuencia de Arabidopsis thaliana
2001 26 de enero borrador genma del arroz Oriza sativa

.
Marcadores
Ingeniera Gentica
Tecnologa
del ADN
Frmacos
Anti-cncer
Diagnsticos
Cultivo de
Clulas
Vegetales
Transferencia
de genes en
animales
Sntesis
de Sondas
de ADN
Localizacin
desrdenes
genticos
Clonacin
Solucin de
crimenes
Produccin de
Protenas humanas
Terapia
Gnica
Bancos de
ADN, ARN
Protenas
Mapas de
Genomas
completos
Biologa
Molecular
Sntesis de Nuevas
Protenas
Nuevos
Antibiticos
Nuevas
Plantas y
Animales
Nuevos
Alimentos
Recursos humanos
qumicos raros
BIOTECNOLOGA
Es el estudio del
genoma y su accin.
El genoma es la suma total del material
gentico presente en un organismo
particular, incluye el ADN presente en los
cromosomas y en los organelos
subcelulares (ej., mitocondrias) y el
genoma de ARN de algunos virus.
El anuncio el 26 de junio de 2000, del borrador
del genoma humano en un 90%, marc un hito
histrico para la humanidad.
Tecnologa del ADN
GENMICA
IBM SP Supercomputadora
Mtodos utilizados en la genmica incluyen:
Genmica Estructural. Estudio de que secuencias de
genes estn presentes dentro del ADN de un organismo.
Genmica Funcional. El estudio de que funciones son
conferidas a un organismo por una secuencia gnica dada.
Genmica Qumica. Se usa para comparar dos
organismos de la misma especie (uno de los cuales tiene un
gen o genes inactivados por un qumico especfico o una
mutacin puntual.
Anlisis de la Expresin Gnica. Se usa para
determinar el producto o productos producidos (tales como
una enzima u otra protena crtica). Cuando un determinado
gen es activado, se mide la fluorescencia de las molculas
de ARN mensajero (ARNm) individual, cuando este ARNm
hibridiza (con piezas de ADN correspondientes a las
protenas producidas/analizadas, que estn adheridas a la
superficie de hibridizacin sobre un biochip).
Tecnologa del ADN: GENMICA
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Humanos
30,000
genes
GENOMAS
Chimpanc
30,000
genes
A. thaliana
25,000
genes
Ratn
30,000
genes
C. elegans
19,000
genes
D. melanogaster
13,000
genes
95% idntico
70%
20%
60%
De 289 genes
humanos
implicados en
enfermedades,
hay 177
cercanamente
similares a los
genes de
Drosophila.
Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%
El genoma de un organismo es el juego completo de ADN.
La planificacin del Proyecto Genoma Humano se inici en
1986, previsto para el 2007. En Junio de 2000 se present el 90% del borrador con la
secuenciacin de unos 30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb). Los
genes son secuencias especficas de bases que codifican instrucciones para hacer
protenas. Los genes son un 2% del genoma humano.
IDENTIDAD GENTICA
Tecnologa del ADN
El 14 de diciembre de 2000, se
present la secuencia del genoma
completo de la primera especie vegetal
la Arabidopsis thaliana.
El 26 de enero de 2001, el borrador de la
secuencia del arroz (Orizae sativa). El
funcionamiento de los genes en el arroz se
aplicara a cultivos principales, tales como trigo
(Triticum spp) y maz (Zea mays) con genomas
mas grandes y ms dificiles de secuenciar.
El arroz es el genoma mas simple y pequeo de
los genomas de todos los cereales, tiene 50,000
genes, dos veces el de Arabidopsis, y 12
cromosomas comparado con cinco de
Arabidopsis.
Tecnologa del ADN: GENOMAS VEGETALES
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Un punto rojo significa expresin
incrementada, un punto amarillo igual
expresin, uno verde expresin
disminuida y uno negro ausencia de
expresin. Unos 70a genes han variado
su nivel de expresin luego del ataque
del patgeno. La informacin ser usada
para comprender los mecanismos de
defensa involucrados. El anlisis se
realiza mediante computadoras que
identifican los genes candidatos y
proveen toda la informacin disponible
sobre los mismos. El microordenamiento
ha sido impreso en vidrio cuyo tamao
real es de 22 x 40mm. El inserto muestra
una ampliacin de tres bloques del
microordenamiento conteniendo 360
genes cada uno (www.cienciahoy.org)
Microarreglo o Biochip con secuencias de 11.500 genes hibridados con
ARNm de Arabidopsis thaliana obtenidas antes (fluorescencia verde) y despus
(fluorescencia roja) del ataque del hongo Erysiphe cichoracearum. Las flechas indican
genes que se han expresado en respuesta al patgeno.
Tecnologa del ADN: GENOMAS VEGETALES
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La Compaa SYNGENTA (suiza), ha demostrado
la utilidad de la genomica al utilizar la secuencia
QTL 21 del cromosoma 1 del genoma del maz (el
cual fomenta la produccin de la planta),
encontrando un arreglo y orden de genes bastante
similar con el existente en la variedad japonica o
Nipponbare del arroz que ellos secuenciaron.

Pamela Ronald, Fitopatloga Vegetal de la Universidad
Davis de California, usando una secuencia de la variedad de
arroz indica, secuenciada por el Instituto de Genmica de
Beijing y el Centro de Genoma de la Universidad de
Washington, identific un gen de resistencia a las
enfermedades en arroz, cuya caracterstica fenotpica ha
sido usada por cientos de aos por los fitomejoradores sin
conocer su procedencia gentica.
Tecnologa del ADN: GENOMAS VEGETALES
Tecnologa del ADN: GENMICA FUTURA
En la 14th International Genome
Secuencing and Analysis Conferen-
ce (oct. 2002), US Genomics Inc.,
present un aparato que lee la doble hlice de
ADN sin cortarlo. Abre la doble hlice espiral de
ADN, la lineariza y la pasa por un escaner para
leerla en un lector fijo (como una plicula de
carrete pasa por un proyector), las molculas se
mueven a 30 M de bases por minuto. En 40
minutos se pueden Leer 3 mil M de bases.
Si el sistema se logra pasar a un biochip el tiempo
bajar a menos de cinco minutos, por la habilidad
de capturar un Terabyte (1024 o 1000 gigabites,
un gigabite = 1024 o 1000 Megabites) de
informacin cada pocos segundos.(Uehling, M. D, Bio-
It World Nov. 12 2002).
genoma
Clula
cromosomas
genes
los genes
contienen
instrucciones
para hacer
protenas
ADN
protenas
las protenas actan
solas o en complejos
para realizar las
funciones celulares
ADN ADN

ARN

PROTENAS
BASES MOLECULARES
DE LA VIDA
R. ALEGRA CONACYT 2002
ESTRUCTURA DE UN GEN
Tradicionalmente, un gen se ha
definido como un segmento de
ADN que codifica para un
polipptido o para una molcula
funcional de ARN.
Recientemente, los nuevos descubrimientos han
alterado radicalmente esta visin, para adoptar una
definicin ms vaga. De acuerdo con ello, un gen es
una secuencia de ADN genmico o de ARN que es
esencial para especificar una determinada funcin.
Para llevar a cabo su funcin el gen no necesita ser
traducido a protena, y a veces ni siquiera necesita
ser transcrito.

Molcula
de
ADN
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ESTRUCTURA DE UN GEN
Elementos tpicos:

1) regin reguladora
o promotor basal (caja TATA).
o sitios de unin de proteinas
reguladoras (upstream promoter).
o Realzadores (enhancers)
o Silenciadores

2) sitio de inicio de transcripcin.
3) 5'UTR.
4) codn de inicio.
5) intrones y exones alternados, con
sitios de procesamiento aceptores y
donadores
6) Codn de paro.
7) 3'UTR.
8) seal de poli-adenilacin.
ESTRUCTURA DE UN GEN
Promotores
Exones
Sitio de inicio de
la Transcripcin
Sitio de terminacin
de la Transcripcin
Realzadores
< 100 Kb
Los promotores pueden ser genricos o tejido especfico

La funcin del gen depende de los FACTORES de TRANSCRIPCIN (FT) que activan a las
ARN pol. Los FT son: los Factores de Transcripcin General (se unen a secuencias promotoras
genricas) y los Activadores de Transcripcin (se unen a secuencias promotoras especficas).
Los FT pueden activarse o desactivarse en respuesta a estmulos del entorno del organismo.
Intrones
La Ingeniera Gentica o tecnologa del
ADNr se inici en la dcada de los 70s.
Se refiere a un grupo de tecnologas
usadas para cambiar la composicin
gentica de las clulas y mover genes a
travs de las fronteras de las especies
para producir nuevos organismos.
Se pueden aislar genes, modificarlos,
introducirlos a nuevos hospederos, y
clonarlos para obtener una ventaja
novedosa sobre el organismo natural.
INGENIERA GENTICA O ADNr
INGENIERA GENTICA: TCNICAS DEL
ADN RECOMBINANTE (ADNr)

TCNICA

PROPSITO
Enzimas de Restriccin Cortan ADN en puntos especficos, hacen fragmentos de ADN
ADN Ligasa Une fragmentos de ADN
Vectores Virus o fagos: llevan ADN a las clulas y aseguran replicacin
Plasmidos Clase comn de vector
Marcadores Genticos Identifican a las clulas que han sido transformadas
PCR Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeas
ADNc Hace una copia de ADN de ARN mensajero
Sondas de ADN Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta
secuencia
Sntesis Gnica Para hacer un gen de una base de datos
Gel Electroforsis Para separar fragmentos de ADN
Secuenciacin de ADN Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN
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Enzimas
de restriccin
ADN polimerasas
ARN polimerasas
Nucleasa
ADN ligasa
Kinasa
Fosfatasa
Transcriptasa reversa
TCNICAS DEL ADNr: ENZIMAS PARA
LA MANIPULACIN DEL ADN
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1. Agrobacterium. Uso de la bacteria
Como "Ingeniero Gentico". La bacteria
conteniendo el inserto, infecta las clulas
de la planta produciendo la recombinacin gentica.
2. Acelerador de Partculas (Gene Gun). Un can
artificial bombardea micropartculas con el inserto,
sobre la clula.
3. Electroporacin. Uso de carga elctrica para que
el ADN atraviese la membrana nuclear.
4. Polietilenglicol. Exposicin de las membranas al
PEG, facilita el movimiento de las molculas de ADN.
5. Silicon Wiskers. Inyeccin con fibras microscpi-
cas, que atraviesan las membranas con los insertos.
Tcnicas del ADNr: SISTEMAS
DE TRANSFERENCIA GENTICA
R. ALEGRA
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6. Microinyeccin. Una clula
es adherida a una pipeta bajo un
microscopio y el ADN forneo es
inyectado directamente en el
ncleo usando una micropipeta
muy fina. Se usa cuando hay pocas clulas disponibles,
tales como clulas fertilizadas de huevo animal.
7. Liposomas. Los vectores pueden ser
encapsulados en
pequeas vesculas
de membrana para
introducir el ADN in vivo
en la clula.
Tcnicas del ADNr: SISTEMAS
DE TRANSFERENCIA GENTICA
En 1999 se usaron agujas de vidrio huecas con
puntas de 1m de dimetro, bajo la gua de un
microscopio para inyectar ADN directamente en
cloroplastos. Dichas puntas finas no daan la
membrana del cloroplasto, pero es requerida una
alta presin para sacar el ADN de la aguja. El
control del flujo de ADN bajo alta presin es un
problema prctico significativo, que ha sido
superado introduciendo un metal lquido en la
aguja atrs del ADN. Cuando la aguja es calentada
el metal se expande forzando al ADN a salir de
manera controlada. Los investigadores tambin han
usado esta misma tcnica para introducir ADN en
bacterias individuales y ncleos de clulas
eucariticas (www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/PROTOCOLS/DNA/PDF/DNA 01).
Tcnicas del ADNr: SISTEMAS
DE TRANSFERENCIA GENTICA
R. ALEGRA CONACYT 2002
Las plantas que se usan como modelos de
aprendizaje en Ingeniera Gentica Vegetal
son: Arabidopsis thaliana,
Nicotiana tabacum (tabaco),
Orizae sativa (arroz) y
Solanum tuberosum (papa).

Estos modelos son tiles para aprender haciendo
y ayudar a resolver problemas identificados por los
agricultores nacionales, mientras se capacitan los
miembros de los Centros o Unidades de
Investigacin que se quieran preparar.
Ingeniera Gentica:
MODELOS VEGETALES
ARROZ con altos niveles de tolerancia a
diferentes condiciones ambientales de estrs.
Se insertaron dos genes fusionados de trehalosa
de E. Coli y un promotor tejido especfico
dependiente del estrs. Los genes de trehalosa
permiten la produccin de arroz an si est
estresado por frio, sequa o altos niveles de
salinidad e incrementa la produccin en 20%. La
composicin qumica de los granos no cambia.
El azcar trehalosa ayuda a estabilizar
molculas biolgicas: lpidos, enzimas y otras
protenas, en organismos en condiciones de
estrs (PNAS Online, 27 nov. 2002).
Ingeniera Gentica NUEVAS PLANTAS
1987 secrecin de Beta-lactoglobulina
en leche de ratn.
Produccin de protena C humana en
leche de cerdos, para desrdenes
como hemofilia.
Hormonas de crecimiento humano en
tejido seminal de cerdo.
Antitrombina humana III, anti-
coagulante sanguneo secretada en
leche de cabras transgnicas.
Cabras transgnicas para producir
BioSteel fibra hecha por el hombre
con propiedades de tela de araa.
Ingeniera Gentica
NUEVOS ANIMALES
Salmn transgnico por
hormona de crecimiento. Producido por AF Protein Inc.
cuenta con el promotor de la protena de anticongelamiento de
otra especie de pez. Crece de 4 a 6 veces ms rpido que un
salmn no transgnico. Tiene un 20% en mejoramiento de la
eficiencia de conversin del alimento.

ARROZ DORADO con beta caroteno de
genes de narciso y de Erwinia uredovora,
pigmentos que se transforman en pro-
vitamina A al ser ingeridos.
ARROZ fortificado con un gen de la ferritina.
ARROZ con aa esenciales.
Ingeniera Gentica
NUEVOS ALIMENTOS
(ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).
PAPA con la vacuna que previene la
insulina dependencia de la diabetes
mellitus 100 veces ms poderosa que la
actual vacuna. PAPA con la sub-unidad B
antignica de la enterotoxina del Vibrio
cholerae causante del clera). FRIJOL de
SOYA con anticuerpos que protegen
contra el virus 2 de Herpes simplex
(HSV). TABACO con anticuerpos que
previenen la caries dental producida por
Streptococcus mutans.
Ingeniera Gentica
NUEVOS FRMACOS
R. ALEGRIA CONACYT 2002
Ingeniera Gentica
CLONACION
Trmino genrico para la
replicacin en un laboratorio
de genes, clulas u organismos
de una entidad original, con
copias genticas exactas del
gen, clula u organismo
original. Esta tcnica ha
producido avances
sensacionales en medicinas y
vacunas. Tambin hay
investigacin en clonacin de
clulas humanas, rganos y
otros tejidos. Esto puede
producir el reemplazo de piel,
cartilagos y hueso para
victimas de quemaduras y
accidentes, o de rganos.
BIOTECNOLOGAS
PROMISORIAS
Entre las Biotecnologas
promisorias para el desarrollo
productivo de El Salvador estn:
i) Tecnologas Moleculares para
diagnstico de enfermedades infecciosas,
ii) Bioinformtica, iii) Genmica,
iv) Modificacin Gentica de Cultivos,
v) Tecnologas recombinantes para hacer
productos terapeticos, vi) Bioremediacin,
vii) Qumica combinatoria (COMBICHEM) ,
viii) Bio-nanotecnologa.
(Top 10 Biotechnologies for Improving Health in Developing Countries: www.utoronto.ca/jcb)
www.conacyt.gob.sv
MUCHAS GRACIAS
POR SU ATENCION
Atentamente:
ROBERTO ALEGRIA
ralegria@conacyt.gob.sv