Genética y Bioquímica

Ricardo Fujita, Ph.D.

Instituto de Genética y Biología
Molecular
1014 células
Gregor Mendel, 1866
Experimentos de
segregación de caracteres
en alverja

Segregacion de entes materiales, hereditarios para

caracteres en pares (uno paterno y el otro materno).
Segregacion independiente.

Características hereditarias => GENES

 Caracterización del material
genético (Historia)
• Teoría celular, 1870
• Teoría cromosómica de la herencia, 1901
• Composición química del núcleo, 1869, 1920
• Transformación de bacterias, 1928
• Transducciòn de fagos, 1952
• Proporcion de bases nitrogenadas, 1940
• Difracción de rayos X, 1952
 Analisis químico del núcleo
• F.Miescher, 1869: núcleos, esperma de salmón: sustancia
fosfórica no proteica.
• P.A. Levene, 1920’s
– [P] = [D-ribosa] = [4 bases nitrogenadas]
– P:D-ribosa:base => nucleotido
– Extraccion fibrilar => cadena.
• R. Feulgen, 1920, tinción nuclear especifica, cuantitativa.
 Colonias de neumococos: 2 cepas

Lisas (normal), Encapsuladas, Rugosas (mutantes)

Patógenas virulenta. Protege Sin cápsula, inocuas
contra fagocitiosis, neutrófilos y
macrófagos)
 Transformación (Griffiths, 1928)

Lisas (encapsuladas) Virulenta

Rugosas no encapsuladas inocua

Lisas muertas inocua

(hervidas)

virulenta
Mezcla rugosas vivas + lisas muertas
Avery, McLeod y McCarty (1944)
Lisis enzimática del agente transformante a
partir de extractos bacterianos de L+R vivas:

Tratamiento lítico (destrucción) a:

Carbohidratos L +R => PATÓGENO

Lipidos L +R => PATÓGENO
Proteinas L +R => PATÓGENO
ARN L +R => PATÓGENO
ADN L +R => INOCUO
 Es ADN

En la época (1928) se pensaba que por su complejidad,

solo las proteínas (combinación de 20 aa) podrían ser el
material genético. ADN solo 4 bases (A, C, G y T)
 35
Alfred Hershey y Martha 32
P (rojo) S (rojo)
Chase (1952)

Virus: Proteína (cápside) + ácido

nucleico: Información genética =>
producir mas virus dentro de las
bacterias

¿Cuál es el material genético?

¿Qué entra a la bacteria?

-Marcación con radioactividad de

proteínas (35 S) o ácido nucleico
(32 P)

- Análisis de interior bacteriano

Azúcares ribosa y desoxirribosa (pentosas)

5’
1’
4’

3’ 2’

Grupo fosfato P=O

 Carbonos de la desoxi/oxi ribosa
• 1’ Base nitrogenada
• 2’ H (ADN) / OH (ARN)
• 3’ OH-Interaccion con P
(5’) de otro nucleotido
• 4’
• 5’ – PPP- interaccion con
OH (3’) de otro nucleotido
 La formación de nucleótidos de DNA

fosfato + desoxirribosa + base nitrogenada = Deoxinucleótido

5’
1’

3’
 Bases Nitrogenadas
6
1 5 7
23 4 98

4
5
3
2 16
Análisis químico de nucleótidos en diferentes especies
Erwin Chargaff (1940) = frecuencia constante
• La composición de bases es idéntica en todos los órganos de un individuo
• La composición de bases no varía con la edad ni estado nutricional
• La composición varía de una especie a otra
•#T=#A y #G=C
R. Franklin y M. Wilkins, 1953
Estudios de Difraccion de rayos X

- Hélice
- bases perpendiculares al eje
- 0.34 nanometros (nm)/base-peldaño
- 1 vuelta completa ~ 3.4 nm => 10 bases / vuelta
- 2 nm (20 Amstrong) de ancho
 ADN

Difracción de Rayos X

•Hélice (forma de X)
•Diámetro 2 nm (20Å)
•Distancia entre bases 3.4 Å
•Una vuelta de hélice 34 Å
• Química del ADN
• Distancias (rayos X)
• Helice (1, 2, 3?)
• Esqueleto ribosa-
fosfato
• Bases perpendiculares
• Chargaff [A]=[T],
[C]=[G]

Modelos moleculares
(Rompecabezas con
fierros y cartulinas)
doble cadena
No se puede aparear las bases de cualquier manera...

Me causas
repulsión

AC
GT

Mucho más de 2 Å
No corresponde a modelo
Solo se puede arreglar
de una forma
para tener 2 nm de
ancho, sino
distorsion:

A frente a T (2 enlaces
de Hidrógeno)
G frente a C (3 enlaces
de hidrógeno)

DOBLE CADENA
ANTIPARALELA
Las 2 bases complementarias son
coplanares: pares de bases

Los esqueletos azucar-fosfato estan

al exterior-”barandas”- (ácido) y
las bases al interior-”peldaños”.

Las cadenas complementarias,

antiparalelas forman la
doble hélice

Cada cromosoma cientos de

millones de pares de bases.
“Barandas” repeticiones idénticas,
secuencia de bases: información
genética
 5’ P semidesarrollada
T
desarrollada T
5’ 3’
A P

5’ A
3’
C P
C
5’ 3’
G P

G
5’ 3’
3’ P
5’ TACG 3’
Direccionalidad 5’ -> 3’ OJO, no es lo mismo
que 5´ GCAT 3´
Probablemente el artículo
más importante de las
ciencias biomédicas del
siglo XX
 Denaturación
`3’ 5

5’ 3’

Se rompen los enlaces de hidrógeno

y se separan las cadenas

Agentes químicos (hidróxidos), alta temperatura (> 90°C), baja salinidad

Secuencias ricas en AT (doble enlace) más fáciles de denaturar que las

ricas en GC (triple enlace)
 HIBRIDACIÓN

Hibridación

Dos cadenas se aparean por reconocimiento

de bases y vuelven a formar enlaces de
hidrógeno
Hibridación en presencia de otras moléculas de DNA

Hay competencia dpendiendo de la cantidad de moléculas

 Apareamiento 1 vs. ?
1
5’ ACCCTAATTTAACAAAC 3’
2

5’ GGCCACCACGGCCC 3’
3

5’ GTTTGTTAAATTAGGGT 3’
4

5’ TGGGATTAAATTGTTTG 3’
Apareamientos perfectos e imperfectos

3’CAAACAATTTAATCCCA 5’

5’ GTTTGTTATTAGGGT 3’

5’ GTTTGTTAAATTAGGGT 3’

5’ GTTTGTTAAATTACAGC 3’
 Replicación
• Objetivo: 2 copias exactas para 2 células hijas.
Provisión genética a las siguientes generaciones
• Fase S del ciclo celular
• Alta fidelidad, verificación y reparación: estabilidad
genética individuo y especie
• Fallas en replicación: enfermedades degenerativas,
cáncer
• Semiconservativa, bidireccional
• Varios orígenes de replicación (eucariotes)
• Una cadena continua y la otra discontinua
 Replicación necesita:

• Deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs): dATP. dCTP,

dGTP, dTTP
• Origen de replicación (secuencia específica), en
levaduras ≈ 200 bp una cadena rica en T.
• DNA polimerasa (DNA pol): siempre sintetiza 5’ ->
3’, necesita 3’OH libre.
• RNA cebador (Primer): pequeño segmento de RNA,
donador de extremo 3’OH iniciador para DNA pol
• Complejo con otras proteínas: helicasa, SSB,
primasa, etc.
 Características de la replicación del DNA

E. Coli 4.5 Mb, 30’

Bidireccional a ambos lados del

origen de replicación)
Semiconservativa (una hebra
antigua con una nueva)
 Esquema de las burbujas de
replicación en eucariotas
(E. coli) 1 sola horquilla de replicación 30’) Genoma
4.5 millones bp (4.5 Mb)
Genoma humano (3, 200 millones de pares de bases),
cuanto tiempo? 500 horas (20 días?). Linfocitos en
cultivo 20 horas => varios puntos a la vez, ≈ 20,000
puntos, ≈ 150 kb c/u
Problemas de la DNA polim. en una horquilla de replicación:
A B C D

D
C
A B

a) En una sola tira continua

b) inicio D
B C
A

?
 Fragmentos de Okazaki

E
D
C
B
BB A
A
A
 Ori
identificación disociación

Tira líder (contínua)

Esquema de la
replicación en
E. coli

horquilla

Tira retrasada
(fragmentos de Okazaki)
Esquema general de la replicación

Dirección del
desenrrollamiento

topoisomerasas
helicasas
SSB (RP-A) primer RNA

(cadena discontínua)
(cadena contínua)
 Antibióticos y replicación
• Fluoroquinolonas: inhiben topoisomerasas
• Norfloxacina, lomefloxacina, fleroxacina,
ciprofloxacina, enoxacina, trovafloxacina,
etc
• Co-trimoxazol, combinación de
sulfametoxazol y trimetoprim:inhibe ácido
fólico: cofactor indispensable para fabricar
nucleótidos
 Reparación
• Integridad de la información genética
– Funcionamiento normal
– Transmisión de los caracteres
• Chequeo:
– Replicación: DNA polimerasa 3’endonucleassa
– Reparación de daño
• Problemas de reparación: enfermedades
degenerativas (envejecimiento celular) y cáncer
 Sistema de reparación

• Más de 130 genes conocidos

• Varios complejos proteicos en sistema de
recombinación (sensores moleculares)
• Homología de genes de reparación en
diferentes especies
Funciones de la reparación del DNA
 Errores en la replicación
Tipos de errores: 2da división celular
Sustituciones
Deleciones GATCGATA
1ra división celular CTAGCTAT
Inserciones

normales
Repeticiones GATCGATA
CTAGCTAT GATCGATA
5’…GATCGATA…3’ CTAGCTAT
(normal)
3’…CTAGCTAT…5’
UV, quím,etc
GATCTATA

consecuencias
DNA parental CTAGATAT

funcionales
GATCTATA
CTAGCTAT

(mutación) GATCTATA
CTAGATAT
(mutantes)
 Desplazamientos en la replicación
 Alineamiento incorrecto de las dos cadenas (molde y
la nueva replicada) puede ocasionar inserción o deleción.
 Inestabilidad de repeticiones asociadas a cáncer y
enfermedades neuromusculares.
Inserción
(GATA)3 (GATA)4
GATAGATAGATAGATA
normal
GATAGATAGATA CTATCTATCTAT

CTATCTATCTAT

GATAGATAGATA (GATA)2
CTATCTATCTAT GATAGATAGATA
Desplazamiento CTATCTATCTAT
hacia adelante Desplazamiento
hacia atrás Deleción
Reparación por desigualdad

Si la nueva hebra está

equivocada, cómo reconocemos
la correcta, (antigua?)

5’ CCATTGATTATT 3’
3’ GGTACCTAATAA 5’

Defecto de apareamiento

hebra antigua es metilado, nueva

todavía
Escisión de 1 base

-Depurinación (rotura de
enlace glucosídico) espontánea
-Desaminación de A y C y
remoción por N-glucosidadasa
Reparación por escición de nucleótidos

- Daño a varias bases

(hasta ~ 30)
-UV: dímeros de timina,
- Daño con distorsión física
- Xeroderma pigmentosa
Síndrome de Cockayne
Síndromes debidos a reparación de escisión de
nucleótidos
Mutaciones asociadas a XP, CS y TTD

9q22.3

3p25

11

13q22

5q12.3
 Curva CoT en genoma eucariote
Cot = coficiente Conc. X Tiempo
100 % “ La velocidad con la que se reasocia cada
hebra sencilla depende de que encuentre una
Reasociación de ADN ss

hebra complementaria. Por eso, a mayor

contenido de repeticiones, mayor rapidez de
reasociación ”
50 Altamente
Repetitivo
Medianamente
Repetitivo
Único
0
10-3 10 103 Cot
Log Cot
 Secuencias únicas y repetitivas
• El DNA se encuentra en diferentes grados de repetición.
• Secuencia única: exones de genes únicos, ejm. gen de distrofina,
insulina
• Medianamente repetida:
– Algunas copias-decenas: familia de genes : origen común y
conservación de secuencias (poca variación), ejm. Globinas de
sangre (α ,β ,γ ,δ ,ε ), actinas, colágenos
– Cientos de copias: rRNA, histonas (necesidad de muchas
copias en poco tiempo)
• Altamente repetidas
– Miles de copias: Telómero, Centrómeros
– Cientos de miles: SINE, LINE, microsatélites.
 (ejm: distrofina,insulina)

(ejm: globinas,colágenos)

(long interspersed nuclear elements)

(short interspersed nuclear elements)

 Familias de genes

Genes originados por duplicación y mutación: histonas, globinas,

CYP450, queratinas, PKAs, etc.
Familias originadas por duplicación,
diversificación, recombinación

Crom 16 Crom 11
 Secuencias altamente
repetitivas en tandem

• DNA satélite: concepto bioquímico,

diferente densidad que el resto. Localizado
en centrómeros, rico en repeticiones A:T
• Telómeros repeticiones (TTAGGG)n,
polimerizados por TELOMERASA
• Minisatélites: secuencias de 6 - 200 bp,
repetidas 2 a 10 veces y en tandem
• Microsatélites: secuencias de 2 a 5 bp,
repetidas de 2 a 20 veces y en tandem
 DNA repetitivo agrupados en tandem más
comunes en los cromosomas
Telómeros Heterocromatina Centrómeros
constitutiva α -satélites

MINISATÉLITES
MICROSATÉLITES

Centrómeros, Telómeros, heterocromatina constitutiva (sitio restringido)

Microsatélites y minisatélites (en todas las demás regiones cromosómicas)
 DNA satélites y polimorfismos
• Número de repeticiones son variables dentro de la
población.
• Satélites, mini y microsatélites.
• Hay algunos genes con secuencias repetidas con
expansiones, enf neurológicas (Huntington, X Frágil,
Ataxia de Friedreich, etc).
• Variaciones individuales en los números de unidades del
tandem (marcadores polimórficos)
• Repeticiones microsatelite (TG) alrededor de 100,000
sitios esparcidos en genoma.
• Alelos paternos y maternos para identidad genética
(paternidad) y mapeo de genes
 Esquema de un microsatélite

La región flanqueante es idéntica en todos los humanos, el número de

unidades del tandem es variable y heredado
 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 11 12 19 1
15/II/06:
Marcadores
Q12 D2SCATTO1,
D2SCATTO2
D2SCATTO3

Marcadores
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 14 21 2 22
generados en el
Instituto de
Q11
Genética USMP
en el Genome
Database

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

P14
 Análisis de un microsatélite

Alelos A B origen

1= 112 Separación electroforética

Las moléculas más pequeñas

2= 108 migran más lejos del origen

Individuo A = 1,3
3 = 102 Individuo B = 2,4
4 = 98
Segregación de alelos de microsatélites en una familia

Usado para identidad genética (patermidad) y mapeo de genes

 Uso de marcador (*) de cromosoma 2cen-q13 para mapeo de genes:
en familia con glaucoma PGAA (Chincha) GLC1B
G85 G86

G87 G77 G88 G78

G70 G82 G67 G79 G68

* *
*

*
* * * * *

M.L. Guevara, R. Perez G., R. Fujita (IGBM, USMP, Instituto de

Oftalmología) Am. J. Hum Genet Oct. 2002 A756
 Secuencias altamente
repetitivas esparcidas
• “Cicatrices” (?) de retrovirus y transposones
• No están repetidos en tandem
• SINE (short interspersed nuclear elements):
– Secuencia recuerda transpsón
– Consenso ~ secuencia de 300 bp o menos
– Más conocida familia Alu ~ 500,000 copias
• LINE
– Secuencia recuerda transposon
– consenso algunos cientos de bp de~ 6-7 kb
– Más conocida familia Kpn
Alu (bandas R) L1 (Kpn) (bandas G)

DNA repetitivo esparcidos

mas comunes en los cromosomas
Origen del Polimorfismo I/D de la Enzima Convertidora de
Angiotensina (ECA/ACE)

Inserción 289 pb (Alu)

Alelo I (479 pb)

Alelo D (190 pb)

Homocigoto DD elevado ECA circulante (HTA?, cardiovasculares?)

Fig. 1b. Análisis del Polimorfismo I/D en 19 individuos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Origen
electroforesis

479 bp

190 bp

DD II ID
Lizaraso, Medina, Salazar, Armas, Diestéfano, Hurtado y Fujita (2003) Diagnóstico 42:7-16.
ORGANIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS
CROMOSOMAS DE EUCARIOTES

•DNA (1.98 mt) necesita entrar en el núcleo

en interfase

•Compactación para división celular

• Histonas: H2A, H2B, H3, H4 y H1

• Niveles: Nucleosoma, solenoide y fibras

cromatínicas (35 % de DNA, 60 % de
proteínas y 5 % de RNA)
 Histonas
• Proteínas pequeñas con carga positiva: ricas en lisina, arginina.
DNA carga negativa
• Familia de genes (cientos de genes)
• Conservadas en evolución (hongos, plantas, animales)
• 5 tipos:
– H1
– H2A
– H2B
– H3
– H4
> lisina

> arginina
 Nucleosoma

Cromatosoma

Nucleosoma: DNA enrrollado en un disco (octámero)

de histonas ~10 nm de ancho, ~1.75 vueltas ~ 146 bp
H1 menos interacción física
 I A
Electroforesis de células

I= intactas (el ADN tiene

miles de bases)
A= apoptóticas (el ADN
está fragmentado en
paquetes de 180-200 Pares de bases
bases
1000
800
600
400

200
Empaquetamiento
del DNA DNA (1)
Nucleosoma (~8)

Superenrrollamiento
de 34 nm (~50)

Asas de DNA
(~8,000)

Cromosomas Armazón proteico

metafásicos
(50,000-100,000)
 Condensación de ADN a cromosomas

Cromosoma 17
 Esquema de un cromosoma X a distinta
resolución y características de las bandas
Banda G (Giemsa) tel
• > [AT]
• pobre en genes
• replicación tardía

cen
Banda C (Centrómero)
• >>[AT]
• No genes
• replicacion > tardía

Banda R (reversa)
• relativamente rico en GC
• rico en genes
• replicación temprana tel
Actividad génica de la cromatina
• Genes activos e inactivos (transcripción)
• Coloración Giemsa:
– Eucromatina: clara, activa
– Heterocromatina: oscura, inactiva
• Digestión con DNasaI en cromatina:
– Activa: corta DNA (desnudo)
– Inactiva: NO corta (protegidos)
 XX

XXX

Corpúsculo de Barr, cromatina sexual, heterocromatina

facultativa (compensación de dosis del cromosoma X)
 Electroforesis
Separación de moléculas por carga eléctrica
Ácidos nucleicos más o menos uniforme en carga (negativa)
Ácidos nucleicos separados por tamaño

Condiciones
-
•Nativas (no denaturantes)
•Denaturantes (se rompe
estructura secundaria y terciaria)
•Proteínas SDS
•DNA formamida, úrea

+
 Electroforesis: Separación de segmentos de
DNA por carga y tamaño)

-
Origen
Grande

pequeño
+
Secuenciacion: insumo principal

Deoxinucleótido

Dideoxinucleótido
 P C N

AGA
TGA (Val
(Stop) * *

Choroideremia exon 14
 Secuenciacion con fluorescencia

Capilar, simultaneo
Fig.2 Sequence of MYOC exon 3 in a POAG patient of family. N
indicates a double reading (C and G) in nucleotide position 1440 of
gen MYOC. Normal sequence 1438-1440 (AAC) corresponds to
codon Asn, whereas mutation changes codon to AAG, Lys. This
transversion yields a MYOC Asn480Lys mutation (charge).

T G A T T G A C T A C A A N C C C C T G G A C A A

nt1440 (aa 480)

Fujita-Guevara, Perez Grossman, Estrada, Vargas, Richards y Fujita (en preparacion)

Polymerase chain reaction (PCR)
• Duplicación in vitro de un segmento de genoma (100-1,000
bp)
• Exponencial
• Termociclador: máquina que cambia de temperaturas
cíclicamente
• Taq polymerase Thermophylus aquaticcus (Pfu, Pfg, etc)
• Primer: especificidad
• dNTPs
• Buffer
• Mg++
 Algunos usos
• Comparar segmentos para mutaciones
• Marcadores genéticos
• DNA de una especie en otra: infecciones
• DNA de una especie en otra: bancos
genómicos
 PCR

Máquina:Termociclador
92-95C denat.

50-65C hibrid.

72C polimeriz.
PCR (continuación)

1 ciclo 21
2 ciclos 22
3 ciclos 23…

30 ciclos 230
 PCR product of RPGR exon 11

Normal

Mutation

19 bp deletion in family XLRP-236

PCR product of RPGR exon 11
XLRP - RPGR exon 2 (G52X)
Mutación detectada por
desaparición de sitio de
restricción AgeI

RE: AgeI A CCGGT

Normal: A CCGGT
Mutante: A CCTGT

M
N
 Expansión en el gen de la Corea de Huntington
n
(CAG)
n
40
36

1 2 3 67

Figura 2. Diagrama del gen HD (IT15) que tiene 67 exones y está ubicado en el
brazo corto del cromosoma 4 (4p16). Su proteína producto (huntingtina) es rica
en glutaminas Una mutación en el exón 1 causa la enfermedad de Huntington, la
región rica en el trinucleótido (CAG) provoca la enfermedad siempre que pasa de
40 repeticiones. Fujita, 2000. Revista Diagnóstico 39 (6): 3113-20.
 Análisis del gen de corea de P N N N N
Huntington (cromosoma 4)
Expansión de tandem (CAG)n
Poli (Glu) en exón 1
*

Umbral afectados (> 40)

Umbral normal (< 40)

*
P= Paciente 1 alelo > 40 *
y otro < 40 * *
N = Normal (todos < 40) *
* *
* *

urtado, Zambrano,Guevara, Fujita

003) Horizonte Médico Vol 3: 43-47.
Técnica Fluorescence in
situ hybridization
FISH (localizar genes en
regiones cromosómicas)
Ejemplo: localización de
genes humanos en perro
Gen CKMM

Ref.:Guevara-Fujita et al (1996)
Mamm. Genome 7, 268-270
 Genoma Humano 2001-2006
• Nuclear:

– 22 pares autosomas + XX/XY

– 3.2 X 109 pares de bases (bp) haploide
– Probablemente menos de 25,000 genes traducidos a proteínas (vs 120,000 a
70,000 inicial); pero > de 300,000 proteínas.
– Genes segmentados => Splicing alternativo: 1 gen varias proteínas según
tejido¡¡¡
– Solo 1.3-1.2 % traducido¡¡¡ (vs 5% inicial)
– Desarrollo de databases genómicas y de expresión en otras especies
– Conservación en secuencias codantes (>>) y no codantes (<)
– Varios segmentos de varios Mb del genoma repetidos en diferentes
regiones